rôle du facteur de transcripiton myb14 dans la réponse de défense

ELISE FORTIN
RÔLE DU FACTEUR DE TRANSCRIPITON MYB14
DANS LA RÉPONSE DE DÉFENSE CHEZ
L’ÉPINETTE BLANCHE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Sciences forestières
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)
DÉPARTEMENT DE SCIENCES DU BOIS ET LA FORET
FACULTÉ DE FORESTERIE, DE GEOGRAPHIE ET DE GEOMATIQUE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
© Elise Fortin, 2012
ii
Résumé
Lors d’une blessure chez l’épinette blanche, le facteur de transcription MYB14 et
certains gènes de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes (voie MVA) sont surexprimés. De
plus, des plantules d’épinette blanche transgéniques surexprimant le gène PtMYB14
accumulent elles aussi des transcrits de gènes faisant partie de la voie MVA. Ainsi, MYB14
pourrait être un régulateur transcriptionnel potentiel de cette voie métabolique (Bedon et al.
2010).
Ce mémoire cible la régulation potentielle du gène de la 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA synthétase (HMGS), une enzyme de la voie MVA, par MYB14. Nous
avons 1) isolé et caractérisé la région promotrice de Hmgs, 2) testé si MYB14 se lie
directement au site découvert dans ce promoteur et 3) vérifié si MYB14 peut influencer
positivement la transcription de Hmgs.
Ce projet de maîtrise a permis de découvrir une nouvelle fonction pour un facteur de
transcription de la famille des R2R3-MYB soit la régulation de la voie de biosynthèse des
isoprénoïdes.
iii
Avant-Propos
Le projet contenu dans ce mémoire a été financé par le CRSNG, Génome Québec et
Génome Canada dans le cadre du projet ARBOREA II sous la direction du Dr John
Mackay et en co-direction avec le Dr Armand Séguin.
Ce mémoire est présenté sous forme de trois chapitres. Le premier chapitre présente
une revue bibliographique décrivant la réponse au stress chez les plantes, plus précisément
chez les conifères. Il relate l’implication de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes
(terpènes) ainsi que le rôle des facteurs de transcription de type R2R3-MYBs dans cette
réponse de défense. Ce chapitre fait aussi part des hypothèses et objectifs de recherche
discutés au cours de ce mémoire.
Le deuxième chapitre a été rédigé en anglais et sous forme de manuscrit puisqu’il
sera soumis dans un avenir proche à une revue scientifique. Dans ce chapitre, l’isolement
de la région promotrice du gène Hmgs et les essais transitoires dans des cellules d’épinette
blanche ont été réalisés par l’auteur (Elise Fortin) en collaboration avec l’équipe du Dr
Armand Séguin au Service canadien des forêts qui a fourni la banque génomique (Genome
Walking), a préparé les constructions géniques et a mis en place la plateforme d’expression
transitoire. La purification de la protéine recombinante PgMYB14, les gels-retard (EMSA)
et les RT-qPCR ainsi que leur analyse ont quant à eux été réalisés par l’auteur.
Enfin, le troisième chapitre contient un bref résumé des conclusions de ce mémoire
et propose des perspectives de recherche possibles suite à ce projet de maîtrise.
iv
Remerciements
Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche, John Mackay pour m’avoir
donné la chance et l’opportunité d’entreprendre un projet de maîtrise dans son laboratoire.
Ce projet m’as permis de développer mes connaissances et mon expertise scientifique et de
m’épanouir dans un environnement de travail agréable et enrichissant.
Je veux aussi remercier les professionnels de recherche du laboratoire Isabelle,
Brian, Sébastien et Claude qui ont grandement contribué à mon apprentissage en répondant
patiemment à mes questions et en me transmettant avec plaisir leur bagage de
connaissances ainsi que leur grande expérience de travail.
J’exprime ma reconnaissance envers Armand Séguin et son équipe au Service
canadien des forêts qui ont grandement participé à la production des résultats contenus dans
ce mémoire. Merci particulièrement à Isabelle Duval, qui m’a généreusement accueillie
dans son environnement de travail et a eu la patience de m’enseigner de nouvelles
techniques.
Je remercie aussi mon compagnon de bureau et de salle informatique, Guillaume,
avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à travailler et à discuter. Ta présence a été essentielle au
maintien de ma santé mentale et m’as permis de décompresser lorsque nécessaire.
Je ne veux surtout pas oublier mon ami Alexandre et mon compagnon de vie,
Mikael, tous deux de grand amoureux des sciences, qui ont toujours été présents pour aller
boire un café et discuter de nos projets. Vous m’avez permis de me défouler lorsque les
résultats étaient décevants soit, tout le monde le sait, les trois quarts du temps et m’avez
aidée à trouver de nouvelles solutions qui se sont parfois avérées fructueuses.
Finalement, il ne faut surtout pas oublier mes parents pour leur soutien et leur
amour. Vous êtes mes plus grands admirateurs et je vous en suis reconnaissante.
v
À tous ceux qui ont cru en moi et m’ont
encouragée à persévérer.
vi
Table des matières
Résumé................................................................................................................................... ii
Table des matières .................................................................................................................vi
Liste des figures ................................................................................................................... vii
Chapitre 1 - Introduction......................................................................................................... 1
1.1
La réponse aux stress chez les plantes .................................................................... 1
1.2
Le métabolisme des terpènes .................................................................................. 4
1.3
La régulation génique ............................................................................................. 7
1.4
Les facteurs de transcription ................................................................................... 9
1.5
Les facteurs de transcription de type MYB .......................................................... 10
1.6
Les MYB de type R2R3........................................................................................ 10
1.7
Le facteur de transcription MYB14 ...................................................................... 17
1.8
Hypothèses et objectifs ......................................................................................... 17
Chapitre 2 – Regulation of the isoprenoid biosynthesis enzyme HMGS by an R2R3-MYB
transcription factor in white spruce. ..................................................................................... 19
2.1
Résumé.................................................................................................................. 20
2.2
Abstract ................................................................................................................. 21
2.3
Introduction ........................................................................................................... 21
2.4
Materials and methods .......................................................................................... 23
2.4.1 Isolation and analysis of putative Hmgs promoter from white spruce ................ 23
2.4.2 Expression and purification of recombinant PgMYB14 protein ......................... 24
2.4.3 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ...................................................... 25
2.4.4 Transient expression in spruce embryogenic cells .............................................. 25
2.4.5 RNA extractions and quality control ................................................................... 26
2.4.6 cDNA preparation and quantitative PCR............................................................. 27
2.5
Results ................................................................................................................... 30
2.5.1 Isolation and characterization of the white spruce Hmgs promoter .................... 30
2.5.2 DNA binding activity of recombinant protein PgMYB14 to PgHmgspro .......... 32
2.5.3 Transcriptional activity of recombinant protein PgMYB14 in white spruce
embryogenic cells ......................................................................................................... 35
2.6
Discussion and conclusion ................................................................................... 38
2.6.1 Isoprenoid biosynthesis and its regulation ........................................................... 38
2.6.2 Transcriptional control of HMGS by MYB14 ..................................................... 39
2.6.3 Functional and evolutionary diversification of R2R3-MYBs in conifers............ 41
2.6.4 Concluding remarks ............................................................................................. 42
2.7
Acknowledgements ............................................................................................... 42
Chapitre 3 - Conclusion et perspectives ............................................................................... 43
3.1 Discussion des résultats .............................................................................................. 43
3.2 Perspectives de recherche et retombées ...................................................................... 49
Bibliographie ........................................................................................................................ 51
vii
Liste des figures
Figure 1.1: Schéma des voies de signalisation induites par les stress abiotiques et biotiques.
........................................................................................................................................ 3
Figure 1.2 : Voie de biosynthèse des isoprénoïdes. ................................................................ 6
Figure 1.3 : Complexe d’initiation de la transcription. ........................................................... 8
Figure 1.4: Classes de facteurs de transcription MYBs chez les plantes. ............................. 12
Figure 1.5: Structure en ruban typique du domaine de liaison à l'ADN d'un R2R3-MYB
associé à l'ADN. ............................................................................................................ 12
Figure 1.6: Représentation schématique de la relation entre les différents sous-groupes de
R2R3-MYBs chez Arabidopsis. ................................................................................... 13
Figure 1.7 : Alignement de séquences du domaine de liaison à l’ADN des MYB chez les
conifères. ....................................................................................................................... 16
Figure 2.1: Schematic representation of HMGS and HMGR enzymes in the cytosolic
isoprenoid pathway. ...................................................................................................... 29
Figure 2.2 : Nucleotide and amino acid sequences of a genomic fragment of upstream
coding sequence for HMGS. ......................................................................................... 31
Figure 2.3 : Coomassie blue staining of the expression and purification of recombinant
PgMYB14. .................................................................................................................... 33
Figure 2.4 : Electrophoretic mobility shift assay showing binding of the PgMYB14
recombinant protein to a fragment of the upstream Hmgs region containing an AC
element. ......................................................................................................................... 34
Figure 2.5 : Quantitative analysis of GUS transcript accumulation in white spruce
embryogenic cells following transformation. ............................................................... 37
Figure 3.1 : Régulation des voies de biosynthèse des isoprénoïdes ..................................... 48
1
Chapitre 1 - Introduction
1.1 La réponse aux stress chez les plantes
Les conifères font partie des organismes les plus grands et les plus anciens sur terre.
Durant leur longue existence, ces arbres, dont l’épinette blanche (Picea glauca (Moench)
Voss) sont exposés à différents stress environnementaux. Ces stress peuvent être divisés en
deux grandes catégories soit les stress abiotiques provenant de facteur environnementaux
comme l’approvisionnement en eau, la température, la luminosité et la salinité et les stress
biotiques apportés par d’autres êtres vivants comme les pathogènes, les insectes et les
herbivores. Les stress abiotiques peuvent affecter la croissance et le développement des
plantes en altérant la morphologie et la physiologie de l’organisme (Vickers et al. 2009).
De leur côté, les stress biotiques peuvent générer des maladies à des endroits localisés de la
plante affectant aussi la croissance optimale de l’organisme. Les forêts sont des cibles pour
les insectes herbivores comme les coléoptères de l’écorce, les charançons, les lépidoptères
comme la tordeuse des bourgeons de l’épinette, les vers et les pathogènes fongiques qui
dévastent ou qui affectent la croissance de millions d’hectares de conifères annuellement
(Godard et al. 2007). En revanche, les conifères affichent une résilience aux stress par le
développement de mécanismes de résistance leur permettant de survivre aux conditions
environnementales et de se défendre contre les attaquants. Un exemple d’adaptation des
conifères aux stress abiotiques est l’ouverture des cônes suite à un feu de forêt. Ce
phénomène permet de régénérer la population suite à une telle catastrophe naturelle. La
défense contre les attaquants peut se manifester quant à elle sous forme de produits excrétés
par les conifères pour repousser ou tuer les insectes ravageurs.
Au niveau moléculaire, les mécanismes de défense des conifères impliquent entres
autres l’activation des voies du métabolisme secondaire et des barrières de défense
physique et biochimiques présentes au sein de l’arbre (Huber et al. 2004; Franceschi et al.
2005; Keeling and Bohlmann 2006). Une des premières étapes de la cascade métabolique
enclenchée pour mener à la réponse aux stress implique la production de messagers
2
secondaires comme le calcium (Wayne and Hepler 1985) et la production de molécules
réactives dérivées de l’oxygène et de l’acide phosphatidique (Walley et al. 2007). Il y a
aussi production de phytohormones comme l’acide jasmonique (JA), l’acide salicylique
(SA), l’éthylène (ET) et l’acide abscicique (ABA), les trois premiers étant surtout produits
lors de stress biotiques et le dernier lors de stress abiotiques (Walley et al. 2007; Fujita et
al. 2006). Ces métabolites secondaires envoient notamment des signaux au noyau
permettant d’activer les cascades de kinases, des enzymes régulatrices. Celles-ci pourront
par la suite entrainer l’activation de facteurs de transcription (FT) qui eux activeront la
transcription de gènes spécifiques de la réponse aux stress. Les changements
physiologiques et biochimiques observés chez un organisme sont ultimement reliés à une
variation dans l’expression des gènes causée par les FT. L’activation de ces cascades
métaboliques amènera finalement la production de protéines importantes à la défense et à la
récupération de l’organisme (Qureshi et al. 2007). (Figure 1.1)
Chez les conifères, la réponse aux stress tels que les stress abiotiques, la blessure
mécanique, l’attaque par les insectes, l’invasion par les pathogènes et le traitement à l’acide
jasmonique qui mime la production d’hormones lors d’un stress biotique engendre la
formation de barrières physiques comme la formation de conduits résineux traumatiques et
de cristaux d’oxalate de calcium ainsi que la lignification des parois cellulaires (Croteau et
al. 1987; Martin et al. 2002). Ces stress peuvent aussi amener la production de composés
phénoliques et de terpènes volatiles et non-volatiles par l’induction des voies de
biosynthèse des phénylpropanoïdes et isoprénoïdes (terpénoïdes). Un exemple de composés
terpéniques produits sont les oléorésines, un mélange complexe de mono- et sesquiterpènes
volatiles et diterpènes non-volatiles (résines)(Huber et al. 2004; Zulak and Bohlmann
2010). Les terpènes volatiles contribuent à la défense indirecte contre les herbivores tandis
que les terpènes non-volatiles apportent une barrière physique directe contre les insectes
(Byun-McKay et al. 2006). Les oléorésines sont produites suite à l’augmentation de
l’expression de gènes codant pour des enzymes de synthèse des terpènes, les terpènes
synthétases. Chaque type de stress apporte l’expression de plusieurs terpènes synthétases ce
qui amène la production de différents terpènes. Ainsi, la composition des oléorésines peut
varier en fonction du type de stress environnemental et permettre la défense contre
différents stress (Zulak and Bohlmann 2010).
3
Figure 1.1: Schéma des voies de signalisation induites par les stress abiotiques et
biotiques.
Les divers stress abiotiques et biotiques engendrent la production d’hormones et de
messagers secondaires qui envoient notamment des signaux pour activer les kinases qui
pourront à leur tour activer certains facteurs de transcription permettant la réponse aux
stress (basée sur (Fujita et al. 2006)).
4
1.2 Le métabolisme des terpènes
Les isoprénoïdes (ou terpénoïdes) sont une grande famille de produits naturels
diversifiés retrouvés dans la nature. Un petit pourcentage de ces substances est impliqué
dans le métabolisme primaire des plantes mais la grande majorité est qualifiée de
métabolites secondaires ayant une fonction dans les voies de signalisation et la défense
(Trapp and Croteau 2001).
Les terpénoïdes sont produits dans les cellules des plantes par l’entremise de deux
voies, une dans le cytoplasme et l’autre dans les chloroplastes. Ces voies se nomment
respectivement voie des mévalonates (MVA) et voie méthylerythritol 4-phosphate (MEP)
(Lichtenthaler et al. 1997). La voie MEP produit les isopentenyls diphosphates (IPP) et les
diphosphates de diméthylallyle (DMAPP), des précurseurs pour la synthèse des géranyl
diphosphate (GPP) et géranyl-géranyl diphosphate (GGPP) qui sont eux même précurseurs
des mono- et diterpènes, des isoprènes, des caroténoïdes, des phytohormones gibberellines
et acide abscisique, des phytols, des chaînes latérales de la chlorophylle, des tocophérols,
des phylloquinones et des plastoquinones. De son côté, la voie MVA fournit les IPP,
précurseurs des GGPP et farnesyl diphosphate (FPP) précurseurs de la synthèse des
sesquiterpènes, des stérols, des brassinostéroïdes, des polyprénols et des molécules utilisées
pour la prénylation des protéines (Pateraki and Kanellis 2010; Zulak and Bohlmann 2010).
(Figure 1.2)
Deux types d’enzyme sont impliquées dans la synthèse des terpènes soit les terpènes
synthétases et les monooxygénases dépendantes du cytochrome P450 (Zulak and Bohlmann
2010). Les terpènes synthétases utilisent trois précurseurs différents soit le GPP, le FPP et
le GGPP pour synthétiser respectivement les divers monoterpènes, sesquiterpènes et
diterpènes (Trapp and Croteau 2001). Les monooxygénases dépendantes du cytochrome
P450, quant à elles, oxydent les diterpènes pour former les acides des résines diterpéniques
qui s’accumulent dans les oléorésines (Keeling and Bohlmann 2006). Les transcrits des
terpènes synthétases et des monooxygénases dépendantes du cytochrome P450 ainsi que
leur produits enzymatiques augmentent en abondance lors d’attaque par les insectes ou lors
d’un traitement à l’acide jasmonique (Byun-McKay et al. 2003). Les charançons amènent
5
particulièrement la surexpression d’une sesquiterpène synthétase qui n’est pas observée lors
d’un traitement au methyljasmonate. Il pourrait donc y avoir un rôle particulier des
sesquiterpènes dans la défense contre les insectes (Miller et al. 2005).
L’hydroxyméthylglutaryl CoA synthétase (HMGS) est un catalyseur important de la
voie des mévalonates menant à la synthèse des stérols et des isoprénoïdes. C’est une
enzyme qui catalyse la condensation de l’acétyl-CoA avec l’acétoacetyl-CoA en 3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (Campobasso et al. 2004). Ce produit est ensuite
transformé en acide mévalonique par l’HMG réductase pour devenir éventuellement l’IPP,
le précurseur de la formation des terpènes de la voie des mévalonates. (Figure 1.2)
Il a été démontré que le gène Hmgs est surexprimé lors d’une réponse à la blessure
chez des plantules d’épinette blanche (Bedon et al. 2010). L’augmentation de la quantité
d’ARNm du gène Hmgs indique que cette enzyme est requise de façon plus importante lors
d’un stress pour produire la quantité nécessaire d’isoprénoïdes. Étant une des premières
enzymes de la voie, elle pourrait donc être un acteur majeur dans l’activation de la voie de
synthèse des isoprénoïdes lors de la réponse à la blessure.
6
Figure 1.2 : Voie de biosynthèse des isoprénoïdes.
HMG-CoA, Hydroxyméthylglutaryl- CoA; MVP, 5-phosphomévalonate; MVPP, 5diphosphomévalonate; HBMPP, hydroxyméthylbutényl 4-diphosphate; FPP, farnésyl
diphosphate; ABA, acide abscisique. Le premier intermédiaire spécifique de chaque voie
sont encadrés. Les enzymes sont indiquées en gras: AACT, acétoacétyl-CoA thiolase;
HMGS, HMG-CoA synthétase; HMGR, HMG-CoA réductase; MVK, MVA kinase;
PMK, MVP kinase; PMD, MVPP décarboxylase; IDI, IPP isomérase; GPS, GPP
synthétase; FPS, FPP synthétase; GGPS, GGPP synthétase; DXS; DXR, DXP
réductoisomérase;CMS; CMK ;MCS; HDS; IDS, IPP/DMAPP synthétase.(RodriguezConcepcion and Boronat 2002)
7
1.3 La régulation génique
La régulation de l’expression des gènes est un mécanisme essentiel au bon
fonctionnement d’un organisme vivant. Elle sert à exprimer les gènes au moment opportun
pour permettre le développement, la différentiation et la croissance des cellules. Cette
régulation permet aussi aux organismes d’ajuster leur machinerie enzymatique pour pallier
aux changements d’environnement.
Un des points de contrôle majeur de la régulation de l’expression des gènes est situé
au niveau de la transcription, la première étape nécessaire à la production des protéines. La
plupart du temps, le contrôle de l’expression génique se fait au niveau de l’étape
d’initiation de la transcription, ce qui permet de produire les ARNm particuliers qui
coderont pour les protéines nécessaires. La régulation de la transcription peut être négative
ou positive selon les besoins et se fait par l’intermédiaire de protéines se liant à des
séquences spécifiques d’ADN. Cette liaison permet, selon le cas, d’activer ou de réprimer
la transcription d’un gène. Parmi ces protéines régulatrices se trouvent le complexe
multiprotéique de l’ARN polymérases, la protéine liant la boîte TATA (TBP), les facteurs
de transcription généraux (TAFs ou protéines associées à la boîte TATA), les facteurs de
transcription spécifiques ainsi que les cofacteurs (voir figure 1.3). Certains complexes
multiprotéiques peuvent aussi modifier la conformation de l’ADN (complexe
multiprotéique remodeleur de la chromatine) pour empêcher ou permettre l’accès aux ARN
polymérases et aux facteurs de transcription.
Les régions régulatrices des gènes se situent en amont du site d’initiation de la
transcription et sont appelées le promoteur. Le cœur du promoteur est constitué d’environ
70-80 paires de bases (pb) situées immédiatement en amont du site d’initiation de la
transcription (TSS) et contient les séquences nécessaires à la reconnaissance par la
machinerie transcriptionnelle basale. Il contient entre autres une séquence connue, située à
environ 25-30 pb du TSS, la boîte TATA à laquelle se lie la TBP qui est responsable du
bon positionnement de l’ARN polymérase II. Ensuite viennent se lier les facteurs de
transcription généraux pour former le complexe de pré-initiation de la transcription (PIC).
Le PIC se lie ensuite au le complexe médiateur, impliqué dans la régulation temporelle et
8
structurale de l’initiation de la transcription. Plus en amont du cœur du promoteur,
généralement dans les 250 pb mais parfois à plusieurs kilobases en amont du TSS, se
trouvent d’autres séquences promotrices ou inhibitrices auxquelles peuvent se lier des
facteurs de transcription spécifiques d’un tissu ou d’une situation particulière et ainsi
permettre une régulation plus précise de la transcription (Heintzman and Ren 2007).
Figure 1.3 : Complexe d’initiation de la transcription.
L’initiation de la transcription nécessite plusieurs protéines différentes qui interagissent les
unes avec les autres de façon spécifiques. Ces protéines incluent le complexe
multiprotéique de l’ARN polymérase II (~ 15 protéines); la protéine liante de la boîte
TATA (TBP), les protéines associées à la boîte TATA ou facteurs de transcription
généraux (TAFs, ~ 8 protéines, A, B, E, F, H); les facteurs de transcription (activateurs ou
répresseurs, la nature et le nombre de facteurs de transcription diffèrent d’un promoteur ou
éléments régulateur à l’autre et selon les conditions environnementales); les cofacteurs (en
bleu pâle, dont la nature et le nombre diffère aussi). Figure basée sur (Tjian 1995)
9
1.4 Les facteurs de transcription
Les facteurs de transcription sont des protéines qui jouent un rôle central dans la
biologie d’une cellule. Ils sont responsables de la régulation de l’expression génique au
niveau de la transcription (Pabo and Sauer 1992). Ils sont composés d’au moins deux
domaines soit un domaine de liaison à l’ADN (DBD) et un domaine d’activation de la
transcription. Ils possèdent aussi une séquence spécifique appelée signal de localisation
nucléaire (NLS) qui leur permet d’être transportés au noyau pour exercer leur fonction. Ces
domaines agissent ensemble pour réguler plusieurs processus physiologiques et biologiques
en modulant l’initiation de la transcription de gènes cibles (Du et al. 2009). Leur domaine
de liaison à l’ADN leur permet de se lier spécifiquement à une séquence unique appelée
élément cis, située dans le promoteur de leurs gènes cibles. Les FT peuvent aussi interagir
avec d’autres types de FT et la machinerie transcriptionnelle basale pour l’activation de
leurs cibles (Priest et al. 2009). Les FT peuvent être classifiés en groupes selon leur motif
conservé de liaison à l’ADN ; par exemple, les domaines hélice-boucle-hélice (HLH), doigt
de zinc, hélice-tour-hélice (HTH), leucine zipper, etc. (Riechmann et al. 2000; Luscombe et
al. 2000).
Chez les plantes, la régulation transcriptionnelle est réalisée par l’intermédiaire de
plus de 1500 FT, chaque FT contrôlant l’expression d’environ 10-1000 gènes cibles
(Riechmann et al. 2000; Guo et al. 2008). Parmi cette multitude de FT cinq grandes
familles sont reconnues pour être impliquées dans la réponse aux stress. Notamment on
retrouve les AP2/ERF (APETALA2 et ethylene-responsive-element-binding factors), des
bZIP (basic-domain leucine-zipper), des WRKY, des MYB et des bHLH (dont les MYC)
(Singh et al. 2002; van Verk et al. 2009). On peut aussi considérer les NAC (Olsen et al.
2005), les FT DOF (Yanagisawa 2002), les Whirly et les NPR1 (Eulgem 2005) ainsi que
les JAZ (Chico et al. 2008) qui sont également impliqués dans la régulation des gènes de
réponse de défense.
10
1.5 Les facteurs de transcription de type MYB
Le premier gène Myb a été découvert chez le virus de la myéloblastose aviaire et est
nommée v-MYB (Klempnauer et al. 1982). Trois autres MYB ont ensuite été découverts
chez les vertébrés (C-MYB, A-MYB et B-MYB) et plusieurs autres chez les insectes, les
plantes et les algues. Les FT MYB possèdent deux domaines distincts : un domaine
conservé de liaison à l’ADN (DBD) situé en N-terminal et un domaine de régulation de la
transcription présent en C-terminal (Avila et al. 1993). Le DBD des MYB est conservé
parmi les eucaryotes. Il est habituellement constitué de une à trois répétitions imparfaites
du domaine Myb soit un motif constitué de trois hélices α. Récemment, un MYB avec
quatre répétitions du domaine Myb a été découvert (Stracke et al. 2001). Les hélices deux
et trois de ce domaine forment un motif hélice-tour-hélice stabilisé par une poche
hydrophobe créée par des tryptophanes également espacées (18 ou 19 acides aminés
d’espacement) sur une longueur d’environ 53 acides aminés (Ogata et al. 1992; Romero et
al. 1998). La troisième hélice est la plus conservée et est celle qui fera le contact avec
l’ADN en s’intercalant dans son sillon majeur (voir figure 1.5) (Jia et al. 2004; Ogata et al.
1994). Selon le nombre et la nature de leur motif Myb, ces facteurs de transcription seront
appelés R1, R2 ou R3 MYB ou une combinaison de ces noms (voir figure 1.4). Ces FT se
lient aux séquences nucléotidiques spécifiques qui peuvent être une ou l’autre des
séquences suivantes : type I (T/C)AAC(T/G)G ou type II G(G/T)T(A/T)G(G/T)T (van
Verk et al. 2009).
1.6 Les MYB de type R2R3
Les facteurs R2R3-MYBs sont spécifiques aux plantes, où ils forment une des plus
grande famille de facteurs de transcription (Du et al. 2009). Chez Arabidopsis thaliana, il
en existe plus d’une centaine (Riechmann et al. 2000), divisés en trois groupes (A, B et C)
sur la base de la séquence de leur domaine de liaison à l’ADN et de la position de leur
intron dans cette région (Romero et al. 1998). Une autre classification, celle-ci basée sur
des motifs conservés retrouvés dans le C-terminal de la protéine, permet de subdiviser
l’ensemble des R2R3-MYBs en 25 sous-groupes. Ceux-ci regroupent les MYBs ayant des
fonctions similaires puisque la partie C-terminale d’un facteur de transcription dicte la
11
spécificité de fonction (Kranz et al. 1998). À titre d’exemple le sous-groupe 4 (Kranz et al.
1998) qui rassemble des R2R3-MYBs contenant un motif répresseur D/ELNLD/NL ayant
un rôle dans la réponse de stress (Ohta et al. 2001). (Figure 1.6)
12
Figure 1.4: Classes de facteurs de transcription MYBs chez les plantes.
La figure illustre les différentes classes de protéines MYB selon le nombre de répétitions
adjacentes du motif Myb (R). Les structures primaires et secondaires d’un R2R3-MYB
typique sont indiquées. H : hélice, T : tour, W : Tryptophane, X : acide aminé (X). (Dubos
et al. 2010)
Figure 1.5: Structure en ruban typique du domaine de liaison à l'ADN d'un R2R3MYB associé à l'ADN.
L’hélice R3 de chaque motif Myb se fixe dans le sillon majeur de l’ADN. Représenté sur
cette figure, MYB1 de Trichomonas Vaginalis en complexe avec l’ADN MRE-1/MRE-2R.
(Lou et al. 2009)
13
C
B
A
Figure 1.6: Représentation schématique de la relation entre les différents sous-groupes
de R2R3-MYBs chez Arabidopsis.
Les lettres A, B et C représentent les trois groupes principaux qui sont ensuite subdivisés en
25 sous-groupes, ici identifiés de S1 à S25.L’encandré rouge met en évidence le sousgroupe 4 mentionné dans le texte. (Dubos et al. 2010)
14
Chez les végétaux, les facteurs de transcription MYB sont impliqués dans plusieurs
processus biologiques importants comme le contrôle de la morphogénèse et de la
différentiation cellulaire (Noda et al. 1994; Oppenheimer et al. 1991), la gestion des voies
de transduction du signal comme pour la réponse de stress et la réponse aux
phytohormones(Gubler et al. 1995; Yang and Klessig 1996) et le contrôle du métabolisme
secondaire, notamment la régulation de la synthèse de la lignine et des phénylpropanoïdes
(Cone et al. 1993; Franken et al. 1994; Grotewold et al. 1994; Moyano et al. 1996;
Quattrocchio et al. 1993; Solano et al. 1995). Pour l’instant, la plupart des MYB sont
caractérisés comme des activateurs de la transcription quoique quelques-uns appartenant au
sous-groupe 4, sont des répresseurs (Jin et al. 2000). Il a aussi été démontré que la
surexpression d’un MYB produit des plantes transgéniques résistantes aux stress
environnementaux (Vannini et al. 2004). Certains MYB sont reconnus pour former des
complexes protéiques avec d’autres types de facteurs de transcription comme les bHLH et
WD40. Cette interaction serait essentielle pour permettre la régulation de la transcription de
certains gènes comme ceux de la voie des phénylpropanoïdes (Quattrocchio et al. 1999;
Aharoni et al. 2001) et des flavonoïdes (Quattrocchio et al. 2006; Hartmann et al. 2005;
Zimmermann et al. 2004) et aussi pour la régulation de la différentiation cellulaire
épidermique, de l’assemblage des cellules dans les racines et dans le développement du
trichome (Zhang et al. 2003).
Chez les gymnospermes, 38 séquences de facteurs de transcription MYB ont été
découvertes, soit 13 chez Pinus taeda, 20 chez Picea glauca (Bedon et al. 2007; Bedon et
al. 2010), une chez Picea mariana (Xue et al. 2003) et quatre chez Pinus pinaster
(Lepoittevin et Plomion non-publié, Craven-Bartle et al. non publié). Ces MYB possèdent
eux aussi la structure secondaire caractéristique du domaine de liaison à l’ADN des MYB
et affichent des similarités de séquence avec la séquence consensus en acides aminés de ce
domaine chez Arabidopsis thaliana (voir figure 1.7). Les R2R3-MYBs des conifères sont
semblables à ceux des autres plantes en ce qui concerne la position des introns qui diffèrent
par contre quant à leur nombre et leur taille. Leurs fonctions sont aussi semblables à celles
des R2R3-MYBs des végétaux en général. Par exemple, PtMYB1 (Patzlaff et al. 2003b;
Bomal et al. 2008), PtMYB4 (Patzlaff et al. 2003a) et PtMYB8 (Bomal et al. 2008) sont
impliqués dans la régulation du métabolisme des phénylpropanoïdes et de la synthèse de la
15
lignine. PtMYB1 et PtMYB4 seraient aussi impliqués dans l’assimilation de l’ammonium
(Gómez-Maldonado et al. 2004).
Figure 1.7 (page suivante). Les alignements de séquences en acides aminés des 38
séquences de R2R3-MYB ont été obtenus avec Clustal W. Les acides aminés surlignés en
noir indiquent une identité et ceux surlignés en gris indiquent une similarité. Les séquences
avec un astérisque sont incomplètes en 5’. Le schéma situé au-dessus des séquences
représente la structure secondaire du domaine de liaison à l’ADN. Les étoiles montrent les
tryptophanes conservées dans la séquence primaire. La séquence située au-dessus de
l’alignement est une séquence consensus des R2R3-MYBs chez Arabidopsis thaliana
Schéma adapté de (Stracke et al. 2001) Symboles : +, acides aminés basiques; - acides
aminés acides; #, acides aminés hydrophobes; @, acides aminés aromatiques; Pg, Picea
glauca; Pt, Pinus taeda; Pm, Picea mariana; Pp, Pinus pinaster.
16
Figure 1.7 : Alignement de séquences du domaine de liaison à l’ADN des MYB chez
les conifères.
17
1.7 Le facteur de transcription MYB14
Le facteur de transcription MYB14 fait partie du sous-groupe Sg4C récemment
défini chez les conifères (Bedon et al. 2010). Le sous-groupe correspondant chez les
angiospermes comme Arabidopsis thaliana contient notamment des protéines agissant
comme régulateurs négatifs de la biosynthèse des phénylpropanoïdes. MYB14 est présent
chez Pinus taeda (Pt) et chez Picea glauca (Pg). On observe 87 % d’identité en acides
aminés entre les deux espèces. Ce facteur de transcription pourrait être impliqué dans la
réponse de défense chez les conifères puisqu’il a été démontré qu’il est surexprimé lors
d’une blessure mécanique et lors d’un traitement à l’acide jasmonique (mimant l’attaque
par des insectes) chez des plantules d’épinette blanche (Bedon et al. 2010). D’autre part, la
surexpression constitutive de PtMYB14 dans des plantules d’épinettes blanches conduit à
l’accumulation d’anthocyanines, d’amidon et de terpènes (mono- et sesquiterpènes)
comparativement à des plantules témoins. De plus, la surexpression de PtMYB14 à l’aide
d’un promoteur spécifique des tissus vasculaires montre aussi une accumulation de
sesquiterpènes. Des expériences de microarray et de RT-qPCR (real-time quantitative
polymerase chain reaction) ont montré que la surexpression de PtMYB14 chez l’épinette
blanche augmente l’expression de gènes reliés au mécanisme de défense et à la synthèse
des isoprénoïdes. Ces observations permettent de supposer que PtMYB14 est impliqué
dans la régulation de gènes menant à la synthèse des stérols et sesquiterpènes (Bedon et al.
2010).
1.8 Hypothèses et objectifs
L’objectif global de mon projet de maîtrise était de mettre en évidence l’interaction
possible entre le facteur de transcription MYB14 et le promoteur du gène de la 3-hydroxy3-methylglutaryl-CoA synthétase (HMGS) chez l’épinette blanche (Picea glauca (Moench)
Voss). Comme il a été mentionné plus haut, les transcrits des gènes Myb14 et Hmgs
augmentent en abondance lors de la réponse de défense suite à une blessure mécanique.
Ceci laisse donc croire que ces deux gènes sont impliqués dans la réponse aux stress et que
l’expression de Hmgs pourrait être régulée par le facteur de transcription MYB14 par
l’intermédiaire d’une interaction facteur de transcription et promoteur.
18
La première hypothèse testée au cours de l’étude est que MYB14 se lie directement
à une séquence spécifique située dans le promoteur du gène Hmgs. Pour vérifier cette
hypothèse il fallait d’abord 1) isoler et caractériser la séquence du promoteur du gène Hmgs
et identifier des sites de liaison caractéristiques aux facteurs de transcription de type R2R3MYBs et ensuite 2) tester si le facteur de transcription MYB14 est capable de se lier aux
séquences découvertes.
La deuxième hypothèse testée est que MYB14 active la transcription du gène Hmgs.
Pour vérifier cette hypothèse il fallait confirmer que la surexpression du facteur de
transcription MYB14 modifie l’expression du gène Hmgs et ce dans un système différent
de celui testé au cours de l’étude de Bedon et al. (2010) soit des plantules d’épinette
blanche.
Les résultats obtenus ont permis d’affirmer que le promoteur du gène Hmgs contient
un site de liaison caractéristique des facteurs de transcription de type R2R3-MYBs qui est
lié par le facteur de transcription MYB14. L’étude a aussi permis de confirmer que la
surexpression du facteur de transcription MYB14 mène à l’activation de la transcription du
gène Hmgs. Finalement, il est impossible de conclure si l’activation de la transcription du
gène Hmgs se fait directement par la liaison de MYB14 à son promoteur puisque les
expériences réalisées ne constituent qu’une évidence indirecte indiquant que cette
interaction est possible.
.
19
Chapitre 2 – Regulation of the isoprenoid biosynthesis
enzyme HMGS by an R2R3-MYB transcription factor in
white spruce.
Authors: Élise Fortin1, Isabelle Duval2, Claude Bomal1, Brian Boyle1, Armand Séguin2,
John MacKay1*
Affiliations
1. Arborea, Centre d’Étude de la Forêt, Institut de biologie intégrative et des systèmes,
Pavillon Charles-Eugène Marchand, Université Laval, Québec, Québec, G1V 0A6, Canada
2. Natural Ressources Canada, Canadian Forest Service, Laurentian Forestry Centre, 1055
Rue du P.E.P.S., Québec City, Québec, G1V 4C7, Canada
*Corresponding author: John MacKay, [email protected]
20
2.1 Résumé
Chez les plantes, quelques facteurs de transcription de type R2R3-MYB, comme
MYB14, sont surexprimés suite à une blessure mécanique ou à un traitement à l’acide
jasmonique. Ces stress engendrent aussi une accumulation de transcrits de gènes codant
pour des enzymes de la voie des mévalonates (MVA) menant à la biosynthèse des
isoprénoïdes. Lors de cette réponse, le gène de la 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A
synthétase (HMGS), une enzyme clé de cette voie métabolique, est fortement régulé. En
plus, des plantules d’épinettes blanches transgéniques surexprimant MYB14 de Pinus taeda
(PtMYB14) affichent une surexpression significative du gène Hmgs. Considérant toutes ces
observations, il est suggéré que MYB14 pourrait avoir un rôle dans la régulation de la voie
MVA. Dans cette étude, nous avons isolé la région 5’ en amont du gène Hmgs de Picea
glauca (PgHmgs) afin de déterminer si MYB14 de Picea glauca (PgMYB14) peut
contrôler sa transcription. Des analyses de gels-retard ont démontré que la protéine
recombinante PgMYB14 se lie spécifiquement à un élément AC découvert dans le
promoteur de PgHmgs (PgHmgspro). De plus, des analyses RT-qPCR de l’expression du
gène rapporteur de la β-glucoronidase (GUS) dans des essais transitoires ont montré que la
transcription du gène PgHmgs est positivement régulée par la surexpression du facteur de
transcription PgMYB14. En conclusion, ces résultats indiquent qu’en réponse à un stress,
les conifères pourraient réguler le métabolisme des isoprénoïdes par le contrôle
transcriptionnel de ce R2R3-MYB. Jusqu’à maintenant, aucun équivalent n’a été trouvé
chez les angiospermes.
21
2.2 Abstract
In plants, some R2R3-MYB TFs, like MYB14, are upregulated after mechanical
wounding or treatment with jasmonic acid (JA). These stresses also causes a transcripts
accumulation of genes encoding enzymes of the mevalonate pathway (MVA) leading to
biosynthesis of isoprenoids. The gene for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A
synthase (HMGS), a key enzyme of this pathway, is tightly regulated in this response.
Moreover, transgenic white spruce plantlets overexpressing Pinus taeda MYB14
(PtMYB14) demonstrated a significant up regulation of the Hmgs gene. Put together, those
observations suggest a role of MYB14 in the regulation of the MVA pathway. Here we
isolated the 5’ upstream region of Picea glauca Hmgs (PgHmgs) in order to determine if
MYB14 of Picea glauca (PgMYB14) can regulate its transcription. Electrophoretic
mobility shift assays demonstrated that recombinant PgMYB14 bound specifically to an
AC element found in PgHmgs promoter (PgHmgspro) region. Furthermore, RT-qPCR
analysis of β-glucoronidase (GUS) reporter gene expression in transient expression assays
showed that the transcription of PgHmgs gene was positively regulated by overexpression
of PgMYB14 TF. Together, these findings indicate that conifers may regulate isoprenoid
metabolism in response to stress through transcription control of this R2R3-MYB, whereas
the equivalent has not been found in angiosperm plants.
2.3 Introduction
Owing to their life history, perennial plants and trees have been exposed to a wide
range of different environmental stresses caused by a variety of factors. They can be
summarized in two broad categories: climate variations and competing living organisms.
Some of the stress agents including insects and pathogens may have significant impacts on
the crop health and performance, as well as on ecosystem dynamics. Plants have adapted to
stresses by developing mechanisms of defense that lead to a variety of inducible responses
with localized and systemic effects. Gene regulation is an important process in plant
defenses ranging from the secretion of toxic or deterrent compounds to the modification of
growth or cellular structures. Many different transcription factors (TFs) have been
implicated in key steps that lead to the de novo expression of proteins and enzymes
22
required for these processes. Five families of TFs are well known to regulate stress
responses and include AP2/ERF (APETALA2 and ethylene-responsive-element-binding
factors), bZIP (basic-domain leucine-zipper), WRKY, MYB and bHLH (like MYC) (Singh
et al. 2002; van Verk et al. 2009).
In plants, most MYB genes encode proteins of the R2R3-MYBs class and play a
central role in several important biological processes (Dubos et al. 2010). These processes
include control of morphogenesis and cell differentiation (Oppenheimer et al. 1991; Noda
et al. 1994), management of signal transduction pathways such as the stress response and
the response to phytohormones (Gubler et al. 1995; Yang and Klessig 1996) and control of
secondary metabolism, including regulation of the synthesis of lignin and phenylpropanoids
(Cone et al. 1993; Quattrocchio et al. 1993; Franken et al. 1994; Grotewold et al. 1994;
Solano et al. 1995; Moyano et al. 1996). Several R2R3-MYB TFs have been shown to
regulate genes by directly binding specific cis-regulatory elements called AC sites,
abundant in adenosine and cytosine (Ma et al. 2011; Fornalé et al. 2010; Liu et al. 2009;
Mellway et al. 2009; Osakabe et al. 2009b; Osakabe et al. 2009a).
R2R3 MYBs have been divided into 3 main groups and 22 subgroups (Kranz et al.
1998; Romero et al. 1998). It was shown that subgroup 4 in group C) of conifers contains a
sub-clade (named Sg4C) with a relatively large number of recently duplicated gene
members (Bedon et al. 2010). The Sg4C sub-clade appears to be unique to conifers and
expression of several genes of this subgroup was linked to different stress responses based
on transcript accumulation profiling in white spruce (Picea glauca (Moench) Voss) and
loblolly pine (Pinus taeda) (Bedon et al. 2010). It was shown that MYB14 transcripts
accumulate most strongly and rapidly in both species after mechanical wounding and
jasmonic acid treatment. Overexpression of the loblolly pine PtMYB14 in transgenic white
spruce plantlets was shown to alter the terpenoids profile and result in the up regulation of
isoprenoid metabolism. Up regulated transcripts included sequences encoding enzymes
from the mevalonate (MVA) pathway, which were also accumulated after wounding
(Bedon et al. 2010). It was hypothesized that MYB14 could be a regulator of the defense
response and could target MVA pathway genes that lead to the accumulation of isoprenoids
in conifers.
23
The stress response of many plants involves the production of volatile and nonvolatile terpenes. In conifers, they may accumulate in oleoresin, a substance acting as a
physical barrier against invaders (Zulak and Bohlmann 2010). Terpenes can come from two
different pathways: the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) and the MVA pathway
occurring in the chloroplast and the cytosol, respectively (Rohmer 1999; RodriguezConcepcion and Boronat 2002). One of the first enzymatic steps of the MVA pathway is 3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase (HMGS), which catalyzes the condensation of
acetyl-coA with acetoacetyl-CoA to form 3-hydroxy-methyl-glutaryl (Campobasso et al.
2004). This product is then converted in mevalonate by 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
reductase (HMGR). Further transformations lead to the production of isopentenyl
diphosphate (IPP) or dimethylallyl diphosphate (DMAPP), the main precursors of terpenes
biosynthesis.
The regulation of Hmgs expression and its potential role in the defense response has
not yet been elucidated. In the present study, we aimed to test the hypothesis that MYB14
could be a regulator of MVA pathway genes such as Hmgs, and thus, play a role in the
accumulation of isoprenoids. We isolated the 5’ upstream flanking sequence of the white
spruce gene (PgHmgs) and tested whether putative cis-elements could be specifically
bound by recombinant PgMYB14 protein using gel shift assays (EMSAs). We also used
homologous transient assays to compare the potential role of different Myb genes in
transcriptional activation.
2.4 Materials and methods
2.4.1 Isolation and analysis of putative Hmgs promoter from white spruce
Isolation of the Hmgs promoter was conducted by genome walking (Genome
Walker Universal Kit, Clontech, Mountain View, CA, USA) as described (Bedon et al.
2009) with the following modifications. The two gene specific primers (HMGS GSP1:5’GCATAAATACCTGCTGGACACATGTAGTAGGG-3’
and
HMGS
GSP2
5’-
AAAGCCCAACATTCTGTGGACGAGATTC-3’) were designed based on the Hmgs
cDNA sequence obtained from the white spruce gene catalogue described by Rigault et al.
24
(2011). The PCR products were ligated to the pCR4 cloning vector with the TA cloning Kit
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and sequenced. The Genome walking method gave a
fragment of 745 base pairs (bp). Based on this sequence we used the high fidelity Taq DNA
polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to amplify the Hmgspro from white spruce
genomic DNA with forward and reverse primers containing restrictions sites (forward
HMGS-XbaI: 5’-GCTAGGAAGTTCTAGATTGAAATCACAACC-3’, reverse HMGSBamHI: 5’-GACGAGATTGGATCCTTTTGAAAAACT-3’). The PCR used a reaction
volume of 50 uL with the following steps: pre-denaturation at 94 C for 2 min, followed by
40 cycles of 94°C for 15 sec, 62°C for 1 min, 68°C for 3 min, and finishing with 68°C for 4
min. This produced a 671 bp fragment used in transient assay experiments.
Sequence analysis of the putative Hmgs promoter were conducted with PLACE
software (Higo et al. 1999) and PlantCare software (Rombauts et al. 1999).
2.4.2 Expression and purification of recombinant PgMYB14 protein
PCR
with
gene
specific
TCGCCCATATGGGGAGATCTC-3’
primers
and
PgMyb14
PgMyb14
NdeI
XhoI
5’5’-
GAGATCTCGAGAATAAGCAATCCATTAATC-3’ amplified the PgMYB14 full-length
coding sequence. The PCR product was cloned into NdeI and XhoI restriction sites (New
England Biolabs, Beverly, MA, USA) of the pET-30a (+) vector (EMD Chemicals,
Gibbstown, NJ, USA). The construct was confirmed by DNA sequencing and transformed
into the E. coli Rosetta strain (EMD chemicals). Bacterial growth and protein induction
were performed at 37 C in LB containing kanamycin (30ug/mL) and chloramphenicol
(100ug/mL). Protein induction used a bacterial culture (at an O.D. 600nm of 0.6) to which
isopropyl-beta-D-thiogalacto-pyranoside (IPTG) was added to a concentration of 0.4 mM
and incubated for 3h. The preparation and denaturation of inclusion bodies were based on
(Haneskog 2006). The cells were harvested by centrifugation (9000xg, 10 min, 4 C), and
the pellet was resuspended in cold lysis buffer (20mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 5mM
imidazole and one tablet of Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Basel,
Switzerland). The cells were lysed by high pressure homogenization (Emulsiflex C3,
Avestin, Ottawa, ON, Canada) and the inclusion bodies were harvested by centrifugation
25
(20000xg, 20min, 4 C) and washed with wash buffer (20mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl,
2M urea, 2% Triton X-100) until the protein was pure. Inclusion bodies were denatured in
Urea buffer (20mM Tris pH 8.0, 500mM NaCl, 8M urea, 20mM imidazole, 1mM βmercaptoethanol) 1h at RT and then centrifuged (35000xg, 30min., 4 C). Recombinant
protein was renatured gradually by dialysis in dialysis buffer (20mM Tris, 50mM NaCl,
1mM β-mercaptoethanol) and conserved at -20 C in 20% glycerol. The purification was
verified by SDS-PAGE analysis and Coomassie blue staining.
2.4.3 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
The double-stranded oligonucleotides (sequences are given in Fig. 2.4a) were endlabeled with 50 uCi of [γ-32P] using T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs) and
purified with Illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns (GE Healthcare, Little Chalfont,
United Kingdom). The DNA-protein interaction was performed by incubating 375 ng of
purified recombinant protein PgMYB14 with 0.2 ng of labelled probe and 100 ng poly dIdC as an unspecific competitor in a 20 uL reaction with a final concentration of 20 mM Tris
pH 8.0, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 10% glycerol. Specific competitions
were carried out in the presence of a 20-fold and 200-fold excess of unlabeled doublestranded probes. The reactions were incubated at RT for 30 min and then DNA-protein
complexes were resolved by electrophoresis through 6% native polyacrylamide gel in 1X
Tris-glycine buffer at 35 mA and 4 C. The gels were autoradiographed with a Typhoon
9400 imaging system (GE Healthcare).
Autoradiography of the EMSA was analysed with ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/)
in order to quantify the intensity of each shifted band. Results presented in figure 2.4 are all
relative to the intensity of PgMyb14 with HMGS-ACI radiolabeled probe (lane 4).
2.4.4 Transient expression in spruce embryogenic cells
Effector constructs were prepared by inserting the complete coding sequences of
PgMyb8 and PgMyb14 into the pCAMBIA2300MGMGW expression vector (Cambia,
Brisbane, Australia) and the construction was transferred to A. tumefaciens strain AGL-1
26
for transient expression assays. The control was the same vector but without any Myb
sequence.
Reporter constructs were prepared with the PgHmgs promoter used to drive GUS
gene expression as follows. The 671 bp spruce promoter fragment cloned into pCR4
(Invitrogen) was digested with XbaI and BamHI (New England Biolabs) and ligated with
pRT vector, containing GUS reporter gene and digested with the same enzymes. Then the
pRT-HMGS-GUS fragment was obtained by digestion with SbfI enzyme (New England
Biolabs) and ligated into pCAMBIAp19.0300 (Cambia) digested with SbfI and
dephosphorylated. The resulting vector was transferred to A. tumefaciens strain AGL-1for
transient expression assays. To verify the effectiveness of the transformation, a “positive
control” was also prepared by replacing PgHmgspro with UBIpro, a constitutive promoter
known to drive the expression of GUS reporter gene (Bedon et al., 2009). Two
Agrobacterium cultures incubated overnight, one transformed with an effector construct
and the other transformed with a reporter construct, were diluted to an O.D. of 1.0. Then,
these to strains were co-cultured with white spruce embryogenic cells (ECs) for 1h hour at
RT, at 125 rpm in the dark in specific growth medium (HLM1 with 2% sucrose, glutamine
and 50 μM acetosyringone as antibiotic). The cells were filtrated and then dispensed onto
filter paper disks overlaid onto a petri dish containing the same growth medium. The petri
dishes were conserved at RT in the dark for 2, 4 or 6 days, after which the cells from each
replicate were harvested separately, put into 2 mL tubes and immediately freeze at -80°C
for RNA extractions. (Duval et al., manuscript in preparation)
2.4.5 RNA extractions and quality control
Frozen ECs were ground in extraction buffer at 65°C using a MixerMill 300
(Retsch, Haan, Germany) and steel grinding balls. Total RNA was extracted following the
method of Chang and al.(1993) with some modifications previously described in (Pavy et
al. 2008). The total RNA concentration was determined spectrophotometrically using a
NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) and the quality of the total
RNA was assessed using the Agilent 2100 Bioanalyzer with RNA 6000 Nano LabChips
(Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA, USA).
27
2.4.6 cDNA preparation and quantitative PCR
To measure transcript accumulation in co-transfected cells, quantitative PCR were
carried on. The number of transcripts was determined at 2, 4 and 6 days after cotransformation, by using four independent technical replicates per analysis.
Complementary DNA (cDNA) synthesis was carried out using the First Strand
cDNA synthesis system (Invitrogen) according to the manufacturer’s instruction with
minor modifications. Briefly, 500 ng of total RNA was reverse transcribed using an
anchored oligo d(T) and a GFP spike-in was added as an internal control of the reverse
transcription. Complementary DNAs were diluted 1:4 in RNase-free nanopure water before
PCR quantification. RT-qPCRs were carried out with gene specific primers designed with
Primer3Plus software (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)
and
Oligonucleotide
Properties
Calculator
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) was used to verify the
complementarity of the primers. PCR mixtures contained Quantitect SYBR Green PCR kit
(QIAGEN, Germantown, MD, USA) and were composed of 1X master mix, 300 nM of
gene specific 5’ and 3’ primers and 5µL of diluted cDNAs in a final volume of 15 µL.
Polymerase chain reactions were carried out as previously described in Boyle et al. (2009).
Melting curve analysis was performed to ensure the amplification of a single product. The
numbers of molecules (transcripts) were calculated using the LRE methodology (Rutledge
and Stewart 2008) adapted for Excel (Boyle et al. 2009). The number of molecules
obtained for each sample were first normalized by a ratio calculated using the geometric
mean of three reference genes: Elongation factor 1a (EF1-α) (BT102965), Cell division
cycle two (CDC2) (BT106071) and Ribosomal protein L3A (BT115036) and the GFP
spike-in. The choice of the reference genes will be discuss in Bomal et al. submitted for
publication. Second, the number of GUS transcript molecules was normalized with the
number of p19 transcripts molecules to account for variation of the reporter construct
caused by the transformation rate. After normalization, the number of molecules was
transformed to a log scale for analysis. A student t-test was used to test for significance of
the accumulation of GUS transcripts at the different time points following transformation.
28
Correlations between the overexpression of the TF and the accumulation of GUS
transcripts were determined based on Pearson correlation coefficient.
29
Figure 2.1: Schematic representation of HMGS and HMGR enzymes in the cytosolic
isoprenoid pathway.
Schematic representation of the cytosolic isoprenoid pathway. HMGS, 3-hydroxy-3methylglutaryl-CoA synthase; HMGR, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase;
DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPP, isopentenyl diphosphate; FPP, farnesyl
diphosphate; 2X, two IPP.
30
2.5 Results
The position of the HMGS enzyme in the MVA pathway leading to the synthesis of
isoprenoids is shown in Fig. 2.1. The following experiments were aimed at investigating its
transcriptional regulation by the R2R3-MYB MYB14 of white spruce, as it may represent
an important step to control the production of isoprenoids such as the sesquiterpenes
involved in the plant defense response.
2.5.1 Isolation and characterization of the white spruce Hmgs promoter
The first step toward isolating the PgHmgs promoter was to obtain and verify its
RNA coding sequence. The complete mRNA sequence of the Hmgs gene was determined
in white spruce from EST assembly and FL-cDNA sequencing (Rigault et al. 2011). Its
identity was confirmed by comparison with known Hmgs gene sequences of other
organisms. The sequence was predicted to contain 449 amino acids. It is most similar to the
sequences CAA58763.1 from Arabidopsis thaliana (73 % of identity) and CAA65250.1
from Pinus sylvestris (95% of identity). The amino acid motifs responsible for the function
of decarboxylation condensation were conserved. This motif is always found in enzymes
that use CoA compounds as a substrate. Thus, the comparison of the sequence obtained
with other known sequences indicated it is likely to encode a 3-hydroxy-3-methylglutarylCoA synthase.
Aiming to identify potential cis-acting regulatory sequences upstream of the
PgHmgs gene, we isolated a 745 bp genomic DNA fragment from a GenomeWalker DNA
library with gene specific primers (Fig. 2.2). The sequence was analysed with PLACE
(Higo et al. 1999) and PlantCARE (Rombauts et al. 1999) databank to identify cisregulatory elements and common transcriptional binding sites. The transcription start site
was deduced to be located at 172 bp upstream the first ATG codon, based on the cDNA
fragment with the longest upstream sequence. The most proximal putative TATA-box was
located at -38 bp, a few different CAAT elements were identified further upstream and one
CAAT sequence was located downstream of the putative TATA-box (at -22 bp).
31
Figure 2.2 : Nucleotide and amino acid sequences of a genomic fragment of upstream
coding sequence for HMGS.
+1 indicates the transcriptional start site and the 5’ UTR is in italics. The numbers indicate
the distance from the transcriptional start site. Putative cis-regulatory elements were
identified by PlantCARE and PLACE software and are boxed. Full line boxes are for
putative CAAT-boxes and dotted lined boxes are for other cis-regulatory elements. Putative
TATA boxes are in bold.
32
The potential cis-regulatory elements matched sequences for the binding of
transcription factors including WRKY (5 sites), MYC (3 sites) and MYB (1 site). The
MYB site was identical to a conserved ACI element (ACCTACC) recognized to interact
with group C of the R2R3 MYBs (Romero et al. 1998).
2.5.2 DNA binding activity of recombinant protein PgMYB14 to
PgHmgspro
Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) with the PgMYB14 (Bedon et al.
2010) recombinant protein and radiolabelled DNA fragments were used to verify for
binding to AC elements found in PgHGMSpro. A PgMYB14-his fusion protein containing
the complete coding sequence of PgMYB14 was expressed in recombinant E. coli cells
(see Methods). After IPTG induction and cell lysis, a ~35kDa product accumulated in the
insoluble fraction; therefore, the recombinant protein was purified under denaturing
conditions (Fig. 2.3). The recombinant PgMYB14 was renatured by dialysis and mixed
with labeled probes containing an AC element for the EMSAs (shown in Fig. 2.4a).
The recombinant PgMYB14 protein was found to bind specifically to an ACI
element in the context of PgHGMSpro (Fig. 2.4b). The specificity was shown by
competition with unlabelled oligonucleotides with type I, II or III AC elements or without
AC element. On the one hand, competition with excess of the intact ACI (unlabelled)
effectively decreased the radioactive signal proportionally to the amount of cold
competitor. The densitometry quantification demonstrated that the signal decrease of 40%
with 20 fold excess of cold probes and 70% with 200 fold excess. The cold competitors
used in the EMSAs also showed that PgMYB14 has the ability to bind to other common
AC elements (ACII and ACIII), which differ from ACI by one nucleotide, although with
less efficiency. This was shown by a smaller decrease in the signal when HMGS-ACII or
HMGS-ACIII cold probes were added to the reaction with HMGS-ACI radiolabeled probes
(Fig. 2.4b). These results show that PgMYB14 can directly and specifically bind the ACI
element contained in the PgHmgspro and provide evidence that PgMYB14 could control
its transcription.
33
kDa
Figure 2.3 : Coomassie blue staining of the expression and purification of recombinant
PgMYB14.
M, molecular weight markers (kDa), lane 1, crude E.coli extract, lane 2, recombinant
protein induction with 0,4 mM IPTG, lane 3, surnatant after lysis, lane 4, pellet after lysis,
lane 5, surnatant after denaturation, lane 6, purified recombinant protein used in EMSA.
34
Figure 2.4 : Electrophoretic mobility shift assay showing binding of the PgMYB14
recombinant protein to a fragment of the upstream Hmgs region containing an AC
element.
A) The sequences of the probes used in EMSA. Each probe represents the sequence of the
Hmgs promoter with a different binding site. HMGS-ACI is the site found in Hmgs
promoter, HMGS-ACII and HMGS-ACIII include the other types of common AC sites, and
HMGS-NBS contain a non-binding site. Putative binding sites are in bold and underlined.
B) Upper panel: EMSA of the radiolabeled HMGS-ACI and HMGS-NBS probes (*) and
competition with unlabeled probes shown in A. Lower panel: Densitometry quantification
of shifted band was performed in order to see the conservation of the signal when cold
competitor is added. Intensities presented are relative to binding of PgMYB14 with
radiolabeled HMGS-ACI.
35
2.5.3 Transcriptional activity of recombinant protein PgMYB14 in white
spruce embryogenic cells
The hypothesis that PgMYB14 expression positively regulates the transcription of
the PgHmgs gene was tested using a homologous transient assay system based on cotransfection of embryogenic cells (EC) with Agrobacterium tumefaciens (described by
Duval et al., non-published (Fig. 2.5). The experiments involved testing the white spruce
coding sequence of MYB14 as a putative effector (Fig. 2.5a). The coding sequence of
PgMYB8 (Bomal et al. 2008) was also tested as a MYB control, not expected to regulate
the expression of PgHmgs (Fig. 2.5a). Promoter constructs were prepared with the GUS
reporter gene, driven by the white spruce Hmgs promoter (HmgsproGUS) or by the maize
ubiquitin promoter (UBIproGUS) as a constitutive control for the reporter gene (Bedon et
al. 2009) (Fig. 2.5a). Each promoter construct was co-transformed into EC in combination
with one of the MYB effector constructs or with an empty vector (as a negative control).
Transcript accumulation levels of the reporter gene, the effectors and control
sequences were monitored by RT-qPCR at day 2, 4 and 6 after co-transformation to obtain
a direct assessment of the impact of the effectors (Fig. 2.5b-d). The RT-qPCR data were
normalized following two criteria (see methods). First, normalization based on the
geometric mean of three white spruce references genes was used to adjust for the variation
in cellular transcriptional activity in the different experiments and technical replicates.
Second, normalization based on transcripts levels of the p19 gene under the control of the
35S promoter, which is present in the reporter constructs, was used to adjust for variation in
transformation efficiency.
The co-transfections with the different effectors and reporter constructs showed that
expression of PgMYB14 specifically enhanced the transcription of the GUS reporter gene
driven by the PgHmgspro. The EC co-transformed with PgMYB14 produced a more than
two-fold increase in the number of GUS transcripts between day 2 and day 6 after cotransformation (p < 0.05). In contrast, no increase in the number of GUS transcripts was
observed in the negative controls transformed with an empty TF expression vector.
36
Similarly, co-transformation with PgMYB8 did not produce an increase in reporter
transcripts (Fig. 2.5b).
The embryogenic spruce cells provided a homologous system for transient expression
assays but significant variation was observed between replicates and transformation
experiments (not shown). The relatively large and heterogeneous variation levels (large
error bars in Fig. 2.2b) likely resulted from a lack of uniformity in the size and stage of
differentiation of the embryonic masses that is characteristic of EC. Despite the overall
variation in GUS reporter transcript levels, a strong correlation was observed between
PgMYB14 and GUS transcripts accumulation considering all of the data from day 2 to day
6 (R2=0.7586)(Fig. 2.5c) and only weak correlations were found with PgMYB8 (not
shown). Together, these results clearly indicate that the expression of PgMYB14
specifically results in the transcriptional activation of the PgHmgs gene.
It appeared that the increase in the number of GUS transcripts was relatively
modest, at approximately 2.3 fold (log2 fold difference = 1.2). Interestingly, we found that
the fold increase was larger than that observed with constitutive promoter (UBIpro) which
is known to drive GUS reporter expression both in transient and stable transgenic white
spruce EC. The increase in the level of Hmgs transcripts is slightly higher than that
obtained by Bedon et al. (2010), that was 1.4 times higher in transgenic white spruce
plantlets overexpressing PtMYB14 transcription factor compared to the control.
37
Figure 2.5 : Quantitative analysis of GUS transcript accumulation in white spruce
embryogenic cells following transformation.
A) Schematic representation of the effectors and reporters used in the transient expression
assay. B) Effect of the MYB effector constructs on GUS transcripts accumulation in
embryogenic cells. Error bars represent standard deviations of the four replicates.
Activation by the PgMYB14 protein was found to be significantly different between day 2
and day 6 by Student t-test (p < 0.05). Transcript normalisation was carried out as described
in materials and methods. C) Correlation between PgMYB14 and GUS transcripts
accumulation. D) Constitutive expression of the GUS reporter transcripts transformed into
EC without TF effectors.
38
2.6
Discussion and conclusion
In this study, experimental evidences indicate that the PgMYB14 transcription
factor has a potential role in the regulation of the Hmgs gene. We showed that this
transcription factor could bind to a cis-regulatory element in the Hmgspro and that it could
positively regulates the production of Hmgs transcripts. Our findings bring new insight into
the transcriptional regulation of the cytosolic MVA pathway.
2.6.1 Isoprenoid biosynthesis and its regulation
In plants, the MVA pathway plays a central role in secondary metabolism and
represents one of the two possible routes for the synthesis of isoprenoids. The alternative
pathway is present in chloroplasts and provides the same precursors for the biosynthesis of
isoprenoids. These two pathways are compartmentalized and independent but some
crosstalk between them also exist (Laule et al. 2003). They lead to many specific and
different terpenes and likely require a fine regulation in order to produce needed
isoprenoids at the right moment.
The biosynthesis of isoprenoids is thought to be regulated at two main steps: before
the biosynthesis of IPP and DMAPP, the principal precursors of isoprenoid, and at the step
just before the biosynthesis of specific terpenes, through terpenes synthases (Lane et al.
2010). Several distinct studies have shown the key role of HMGR, an enzyme preceding
the synthesis of IPP and DMAPP in the MVA pathway, as a rate-limiting enzyme for the
synthesis of isoprenoids (Ohyama et al. 2007; Dai et al. 2011; Kato-Emori 2001; Cao et al.
2010; Suzuki et al. 2004). Several evidences have been obtained showing both the
transcriptional and post-transcriptional regulation of HMGR, consistent with the important
regulatory function that has been assigned to the gene (Muñoz-Bertomeu et al. 2007; Nieto
et al. 2009; Korth et al. 2000).
The enzyme that catalyzes the step preceding HMGR is HMGS. In contrast to the
latter, the role of the HMGS enzyme in controlling isoprenoid synthesis has yet to be
elucidated and little is known of its regulation. This may be viewed as surprising
39
considering that HMGR and HMGS are co-ordinately regulated in mammals for cholesterol
biosynthesis. In Brassica juncea, the two enzymes were also shown to be co-ordinately
regulated upon germination and in response to salicylic acid (Mehrabian et al. 1986; Rosser
et al. 1989; Alex et al. 2000).
The first plant HMGS protein was characterized in 2004 by Nagegowda and his
colleagues (Nagegowda et al. 2004). It is required for normal plant development and in
stress responses because it maintains a mevalonate pool for the formation of various
isoprenoid compounds. The overexpression of HMGS in B. juncea led to an accumulation
of sterol suggesting a role in sterol biosynthesis and thus in defense response (Wang et al.
2011). HMGS could also be a control point in rubber synthesis (Suvachittanont and
Wititsuwannakul 1995). Its transcriptional control is of interest because it is likely to play a
role in the regulation of isoprenoids biosynthesis and thereby in several stress responses. In
B. juncea, HMGS is developmentally regulated in flowers, seeds and seedlings; the highest
transcript accumulation level was observed during the early stages of development (Alex et
al. 2000).
In Sitka spruce, Hmgs transcripts accumulate after mechanical wounding of bark
after 24h, weevils feeding on bark after 24h and budworm feeding of green shoot tips after
52h. Other gene transcripts of the MVA pathway leading to biosynthesis of isoprenoid also
accumulate (Ralph et al. 2006). In Picea glauca, Hmgs transcripts accumulate after
mechanical wounding. It was proposed as a potential target for regulation by PgMYB14
because of their coordinated transcriptional accumulation in response to wounding (Bedon
et al. 2010). Our study provided evidence in support of this hypothesis by showing that the
PgHmgs promoter region contains an ACI element, which represents a putative binding site
required for the transcriptional regulation by a R2R3-MYB transcription factor (Fig. 2).
2.6.2 Transcriptional control of HMGS by MYB14
To test whether PgMYB14 is an R2R3-MYB protein that binds to the ACI element
in the PgHmgs promoter, EMSA analyses were carried out with recombinant PgMYB14
and a radiolabeled oligonucleotide DNA fragment representing the AC site found in the
PgHmgs promoter region. The EMSA clearly showed that PgMYB14 can specifically bind
40
the region of PgHmgspro sequence containing the ACI element (Fig. 4). Furthermore,
transcripts from the GUS reporter PgHmgspro construct increased significantly upon
expression of PgMYB14 and not with another recombinant MYB protein (PgMYB8), in
transient assays using spruce ECs (Fig. 2.5). The results were reinforced by the observation
that GUS transcripts levels were strongly and uniquely correlated with PgMyb14 transcript
levels within the individual experimental repeats of the EC transient assay.
The findings reported here provide clear evidence that PgMYB14 could be a
transcriptional regulator of MVA pathway by the direct binding to PgHmgspro and
activating the transcription of Hmgs. As such, PgMYB14 represents one of the few
transcription factors that have been implicated in the regulation of isoprenoid synthesis
pathways. The already known regulators are WRKY1 from Gossypium arboreum (Xu et al.
2004) and Artemisia annua (Ma et al. 2009) that regulates biosynthesis of sesquiterpenes,
phytochrome-interacting factor 1 (PIF1) that down-regulates carotenoids biosynthesis
(Toledo-Ortiz et al. 2010) and ORCA (Octadecanoid-responsive Catharanthus AP2domain) proteins from Catharanthus roseus that contribute to the transcriptional regulation
of terpenoid indole alkaloid (Memelink and Gantet 2007).
Several R2R3-MYBs have been reported to regulate aspects of secondary
metabolism, including the phenylpropanoid or more specifically the flavonoid, benzenoid
or anthocyanin pathways (Dubos et al. 2010; Allan et al. 2008; Du et al. 2009). R2R3-MYB
regulating phenylpropanoid and/or lignin biosynthesis is frequent. These included
Arabidopsis thaliana MYB58, MYB63 (Zhou et al. 2009) and MYB75 (Bhargava et al.
2010), eucalyptus EgMYB1(Legay et al. 2010) and EgMYB2 (Goicoechea et al. 2005) and
poplar PtrMYB3 and PtrMYB20 (McCarthy et al. 2010) that are most specific to the
secondary cell wall formation. In Pinus taeda, PtMYB1, PtMYB4 and PtMYB8 participate
in the regulation of phenylpropanoid metabolism leading to lignin synthesis (Patzlaff et al.
2003b; Patzlaff et al. 2003a; Gómez-Maldonado et al. 2004; Bomal et al. 2008). An
example of a R2R3-MYB that regulates production of volatile benzenoids is ODORANT1
in Petunia hybrida. The down regulation or suppression of this transcription factor
decreased the accumulation of precursors of the shikimate pathway (Verdonk et al.
2005).There are also many examples of R2R3-MYB regulating flavonoids like maize C1
41
(Goff et al. 1990) and Arabidopsis thaliana MYBL2 (Dubos et al. 2008) and
proanthocyanidins such as poplar MYB134 (Mellway et al. 2009).
To our knowledge, our results represent the first evidence for the regulation of
isoprenoid biosynthesis by R2R3-MYB TF.
2.6.3 Functional and evolutionary diversification of R2R3-MYBs in
conifers.
We report the potential involvement of an R2R3-MYB in the regulation of
isoprenoids in conifer trees (pine and spruce). One possibility is that MYB14 has been
recruited to play this role specifically in conifers such as spruce and pine, and that none of
the R2R3-MYBs has a homologous function in angiosperms. The acquisition of such a
function could result from neo-functionalization following gene duplication. In support of
this hypothesis, there is considerable functional diversification in the large gene family of
R2R3-MYBs in plants (Dubos et al. 2010; Du et al. 2009; Jin and Martin 1999) . Moreover,
the subgroup 4 (Sg4) of R2R3-MYBs was shown to harbour more numerous genes in
conifers compared to most angiosperms (Bedon et al. 2010). A relatively high level of
sequence similarity was observed among the nine to ten members of Sg4 found in white
spruce. This led to the designation of a conifer specific subclade called Sg4C. It also
suggested that several duplication events have occurred after the evolutionary split of
gymnosperm and angiosperm lineages. Considering these different observations, it stands
to reason that, some of R2R3-MYBs of Sg4C subgroup could have acquired novel and
unique functions not found in angiosperms.
The expression profiles in Bedon et al. 2010 suggest that many Sg4C sequences
could play a role in defense responses and adaptation to environment. More specifically,
the functional characterization of PgMYB14 links it to isoprenoid metabolism and the
production of terpenes. Owing to their life history and persistence across diverse climates
over the last hundred thousand years, conifers are thought to have acquired durable
resistance mechanisms to allow them to adapt to changing environments (Saxe et al. 2001;
Yakovlev et al. 2011; Davis and Shaw 2001; Savolainen et al. 2011). Members of the Sg4C
42
such as MYB14 are thus proposed to have contributed to evolutionary adaptation and the
long-term resilience of conifer and gymnosperm lineages.
2.6.4 Concluding remarks
In view of their proposed role in conifer adaptation, it would be of interest to
investigate the function of other Sg4C MYBs. Exploring the evolution of this gene family
through phylogenetic analysis among gymnosperm lineages may also be a key to shedding
light onto their origin and diversification. Concerning the putative role of PgMYB14 in the
regulation of secondary metabolism, we may ask whether it regulates other genes of the
cytosolic isoprenoid pathway, such as those identified by Bedon et al. (2010) as being up
regulated upon the overexpression of PtMYB14 in transgenic white spruce plants. A
thorough analysis of the function of PtMYB14 may more clearly resolve its role in the
production of specific types of plant products derived from the isoprenoid pathway.
2.7 Acknowledgements
The authors thank I. Giguère and S. Caron (Université Laval) for technical
assistance and D. Lachance and M.-J. Morency (Canadian Forest Service) for assistance in
cell culture and constructs preparation. We also thank Y. Bourbonnais, S. Gagné and M.
Vincent laboratories (Université Laval) for access to equipment for production and
purification of proteins. Funding was received from Genome Canada and Génome Québec
(JM and AS) for the Arborea II project, and from NSERC of Canada to JM.
43
Chapitre 3 - Conclusion et perspectives
3.1 Discussion des résultats
Le principal objectif de cette étude était d’établir le rôle possible du facteur de
transcription PgMYB14 dans la réponse de défense chez l’épinette blanche. Il avait déjà été
démontré que le FT MYB14 pourrait avoir un rôle particulier dans la réponse de défense à
une blessure mécanique puisqu’il y avait une accumulation de ses transcrits dans une telle
condition. De plus, ce FT pourrait avoir une implication plus spécifique dans la régulation
de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes puisque sa surexpression amène l’accumulation
de transcrits de gène de cette voie ainsi qu’une accumulation de composés terpéniques
(Bedon et al. 2010). Sachant que les facteurs de transcription ont la capacité de lier une
séquence spécifique dans le promoteur d’un ou plusieurs gènes et qu’il peuvent en réguler
leur transcription, il était donc d’un intérêt particulier de déterminer si le facteur de
transcription MYB14 pourrait se lier directement à un promoteur d’un gène impliqué dans
la voie de biosynthèse des isoprénoïdes et augmenter ainsi sa transcription pour permettre
une réponse de défense plus efficace.
La réponse aux stress chez les conifères implique l’activation d’une cascade
métabolique comprenant l’activation de facteurs de transcription (Fujita et al. 2006). Ces
protéines ont la capacité d’augmenter la quantité de transcrits de gènes spécifiques incluant
les enzymes de différentes voies métaboliques, permettant de ce fait la réponse de défense.
Il serait donc utile de connaître quels facteurs de transcription sont impliqués dans
l’activation des gènes prenant part à ce processus. L’implication de certains facteurs de
transcription de type R2R3-MYB dans la réponse de défense chez les plantes est un
phénomène largement discuté dans la littérature (Singh et al. 2002; van Verk et al. 2009).
Certains membres de cette famille de facteurs de transcription ont été découverts chez
l’épinette blanche et quelques-uns ont été étudiés plus particulièrement (Bedon et al. 2007).
Parmi ceux-ci on retrouve le facteur de transcription MYB14 qui présente une forte
augmentation de transcrits suite à une blessure mécanique et après l’application d’acide
jasmonique, un inducteur de la réponse de défense chez les plantes (Bedon et al. 2010).
L’accumulation de transcrits de cette protéine suggère son implication dans la cascade de
44
réponse de défense chez les conifères. L’hypothèse a été émise qu’il serait surexprimé pour
pallier au type de changement environnemental mentionné (Bedon et al. 2010).
Lors d’une blessure, il y a aussi une augmentation de la production de composés
terpéniques. Chez les plantes, ces substances peuvent être produites par l’intermédiaire de
deux voies indépendantes soit la voie des mévalonates (MVA) et la voie méthylerythritol 4phosphate (MEP) menant chacune à la synthèse de divers terpènes (Lichtenthaler et al.
1997). Afin de produire les isoprénoïdes nécessaires aux stimuli environnementaux
imposés, ces deux voies doivent être précisément et adéquatement régulées. Jusqu’à
maintenant, ces voies semblent être contrôlées à deux niveaux soit avant la synthèse des
précurseurs IPP et DMAPP et au niveau des terpènes synthétases (Lane et al. 2010). Chez
l’épinette blanche, la blessure mécanique entraîne l’accumulation de transcrits de certaines
enzymes précurseurs de la voie MVA ainsi que de quelques terpènes synthétases (Bedon et
al. 2010). L’augmentation de la quantité d’isoprénoïdes pourrait donc être causée par une
régulation positive au niveau de ces gènes.
Une récente étude a montré que la surexpression du facteur de transcription MYB14
chez des plantules d’épinette blanche amenait elle aussi l’augmentation du nombre de
transcrits de gènes de la voie cytosolique de biosynthèse des isoprénoïdes. Cette recherche
concluait que MYB14 pourrait être impliqué dans la réponse de défense en activant la
transcription de ces gènes (Bedon et al. 2010). Le principal objectif des expériences
réalisées dans ce mémoire allait dans la continuité de cette conclusion et proposait
d’élucider le rôle présumé du facteur de transcription PgMYB14 dans la réponse de défense
chez l’épinette blanche.
Sachant que les facteurs de transcription ont la capacité de lier une séquence
spécifique dans le promoteur d’un ou plusieurs gènes et qu’ils peuvent réguler leur
transcription, un des objectif était de déterminer si le facteur de transcription MYB14 peut
se lier directement à un promoteur d’un gène impliqué dans la voie de biosynthèse des
isoprénoïdes et augmenter ainsi sa transcription pour permettre une réponse de défense plus
efficace.
45
Nous avons ciblé le gène de la HMGS appartenant à cette voie métabolique,
puisqu’il démontrait une forte augmentation de transcrits suite à blessure mécanique et dans
des plantules d’épinettes transgéniques surexprimant le facteur de transcription PtMYB14
(Bedon et al. 2010). De plus, une autre étude réalisée chez l’épinette de sitka démontre
aussi que le gène HMGS accumule ses transcrits suite à une blessure mécanique et une
attaque par les charançons et la tordeuse des bourgeons de l’épinette (Ralph et al. 2006).
Ainsi il a été proposé que la HMGS puisse être une cible de la régulation transcriptionnelle
par MYB14.
La première hypothèse testée dans le cadre de ce mémoire était que MYB14 serait
capable de se lier directement à une séquence spécifique dans la région promotrice du gène
Hmgs. Les résultats ont montré que la région promotrice du gène Hmgs contient un site de
liaison AC (ACCTACC) de type II (van Verk et al. 2009) fréquemment lié par des facteurs
de transcription de type R2R3-MYB. Il n’a toutefois pas été possible de déterminer avec
certitude si toute la région promotrice du gène a été isolée puisque les nombreuses
tentatives de genome walking n’ont pas donné de fragment d’ADN de taille plus grande. Il
est envisageable que cette région soit plus longue et contienne d’autres sites MYB ayant
une plus ou moins grande affinité pour MYB14 ou d’autres facteurs de transcription de
type R2R3-MYB. L’utilisation d’une nouvelle banque d’ADN génomique digérée à l’aide
d’une enzyme de restriction différente pourrait potentiellement permettre d’isoler un
fragment de promoteur plus long. La nouvelle séquence obtenue pourrait alors être testée
afin de vérifier si l’efficacité transcriptionnelle du gène est différente. Une des façons les
plus fiables de savoir si la séquence promotrice est complète serait d’avoir déjà séquencé la
portion environnante du génome afin de pouvoir les comparer. Néanmoins, nos résultats
ont démontré que la protéine recombinante PgMYB14 a la capacité de se lier
spécifiquement à ce site. Cette observation concorde avec l’hypothèse d’une régulation
transcriptionnelle par cette protéine.
La deuxième hypothèse du projet supposait que le facteur de transcription MYB14
est un activateur de la transcription du gène Hmgs. Les résultats ont montré que ce facteur
de transcription est en effet capable d’augmenter le nombre de transcrits d’un gène
rapporteur qui est en fusion avec le promoteur du gène Hmgs. Pour cette partie, une
46
approche de quantification de transcrits dans un système d’expression transitoire a été
utilisée. Cette technique était très pertinente puisqu’elle permettait de faire plusieurs
répétitions en même temps et ce dans une période de temps raisonnable. Par contre, cette
technique semble donner une grande variabilité du nombre de transcrits entre les différentes
répétitions, ce qui a entrainé un écart-type élevé. Pour réduire cet écart-type, il aurait peutêtre été souhaitable d’augmenter le nombre de répétitions pour chaque interaction. Comme
approche complémentaire, il serait pertinent de tester la même interaction entre MYB14 et
Hmgspro dans un système de simple hybride chez la levure ce qui aurait permis de
renforcer la validité des résultats (Ouwerkerk and Meijer 2001).
À la lumière de ces résultats, il n’est pas possible de conclure que l’activation du
gène Hmgs se fait effectivement par l’interaction directe entre le facteur de transcription
MYB14 et le promoteur du gène Hmgs. Il arrive que l’activation s’accomplisse par
l’intermédiaire d’une cascade de facteurs de transcription. Dans cette ligne de pensée,
MYB14 ne serait pas nécessairement la protéine qui contrôle la transcription du gène Hmgs
bien qu’elle ait la capacité de se lier au promoteur. Elle pourrait être située en aval dans la
cascade et activer un autre facteur de transcription qui activerait le promoteur du gène
Hmgs. Il est de même envisageable que ce FT ait un partenaire protéique indispensable à
l’activation de la transcription de ce gène. À titre d’exemple, MYB14 contient dans sa
séquence en acides aminés un motif étant reconnu pour être lié par des FT de type bHLH
(Bedon et al. 2007). Ainsi, ces deux protéines pourraient agir de concert dans l’activation
de la transcription du gène Hmgs. Ces hypothèses pourraient d’ailleurs fournir une
explication de la faible augmentation du nombre de transcrits GUS suite à la surexpression
de MYB14 dans le système d’expression transitoire. Sans une quantité suffisante des autres
facteurs de transcription de la cascade ou de partenaires protéiques, il n’est peut-être pas
possible de voir une forte augmentation du nombre de transcrits rapporteurs. Pour
démontrer hors de tout doute une interaction directe entre Myb14 et le promoteur du gène
Hmgs on aurait pu utiliser la technique d’immunoprécipitation de chromatine (ChIP). Cette
méthode permet de faire précipiter une protéine avec l’ADN et/ou les facteurs liés à l’aide
d’un anticorps spécifique dans un environnement cellulaire, puis d’analyser par PCR si le
précipité contient un enrichissement en ADN représentant le promoteur du gène cible. Une
méthode semblable suivie d’un immunobuvardage aurait aussi pu permettre de détecter des
47
partenaires protéiques associés à l’aide d’anticorps ciblant les domaines conservés de
facteur de transcription comme les bHLH.
Jusqu’à maintenant, seulement quelques facteurs de transcription ont été identifiés
comme modulateurs dans la régulation de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes (Broun et
al. 2006). La figure 3.1 présente une synthèse de ces facteurs et des enzymes soumises à
leur régulation. Parmi ces facteurs on retrouve WRKY1 chez Artemisia annua qui régule le
gène amorpha-4,11-diène synthétase. Ce dernier produit une enzyme qui catalyse
la
conversion du farnesyl diphosphate en amorpha-4,11-diène ce qui est la première étape
dans la biosynthèse de l’artémisine, une lactone sesquiterpénique (Ma et al. 2009). Un autre
facteur de transcription de la famille des WRKY, WRKY1 chez Gossypium arboreum est
aussi un régulateur de cette voie. Il a pour cible le gène d’une sesquiterpène synthétase, (+)-cadinène synthétase-A (CAD1), qui catalyse une étape de la biosynthèse des
phytoalexines sesquiterpéniques. Ce facteur de transcription serait un régulateur d’une des
premières étapes des voies du gossypol et des sesquiterpènes associés. La séquence
promotrice d’un gène CAD1 contient aussi un élément cis régulateur de type MYB, ce qui
suggère qu’un facteur de transcription de cette famille pourrait aussi réguler ce gène (Xu et
al. 2004). Les facteurs de transcription PIF (phytochrome-interacting factor) une sous
familles des facteurs de transcription bHLH sont impliquées dans la régulation des
caroténoïdes, des isoprénoïdes essentiel chez les plantes. Ces facteurs de transcription se
lient directement au promoteur du gène PSY (phytoene synthase), l’enzyme limitante de la
voie des caroténoïdes pour réprimer la synthèse des caroténoïdes (Toledo-Ortiz et al. 2010).
Chez Catharantus roseus la régulation de la voie de biosynthèse des terpénoïdes indole
alkaloïdes (TIA) a été bien étudiée (Memelink and Gantet 2007). Les facteurs de
transcription ORCA2 et ORCA3 (octadecanoid-responsive Catharanthus AP2-domain)
régulent positivement l’expression de plusieurs gènes de cette voie métaboliques. Quelques
autres familles pourraient aussi être des régulateurs potentiels de cette voie mais il manque
encore des évidences pour le confirmer. Cette liste inclut CrBPF1(MYB-like), les CrGBF
(bZIP) et les MYC. Les ZCT (sous famille EPF des TFIIIA) pourraient aussi réguler
négativement la voie de biosynthèse des TIA. On constate donc qu’encore aucun gène de la
famille des R2R3-Myb n’a été impliqué dans la régulation de la voie de biosynthèse des
isoprénoïdes.
48
Figure 3.1 : Régulation des voies de biosynthèse des isoprénoïdes
Représentation simplifiée de la régulation transcriptionnelle des voies de biosynthèse des
isoprénoïdes. En rouge, le nom des facteurs de transcription impliqués : En gras, les
enzymes régulées : ADS, amorpha-4,11-diène synthétase, CAD1, (+)-delta-cadinène
synthétase HMGS, hydroxy-méthylglutaryl CoA synthétase, PSY, phytoène synthétase,
STR, strictosidine synthétase, TDC, tryptophane décarboxylase. Les flèches avec une ligne
pleine représentent une seule étape enzymatique et la flèches avec une ligne pointillée,
plusieurs étapes enzymatiques.
49
Les R2R3-MYB ont abondamment été impliqués dans la régulation d’autres voies
du métabolisme secondaire, le plus souvent dans la régulation de la voie de biosynthèse des
phénylpropanoïdes et parfois plus spécifiquement dans les voies de biosynthèse des
benzenoïdes, flavonoïdes ou anthocyanines. De nombreuses recherches ont été axées sur la
régulation de la voie des phenylpropanoïdes et/ou de la lignine. À titre d’exemple,
mentionnons MYB58, MYB63 (Zhou et al. 2009) et MYB75 (Bhargava et al. 2010) chez
Arabidopsis thaliana, EgMYB1(Legay et al. 2010) et EgMYB2 (Goicoechea et al. 2005)
chez l’eucalyptus. Chez le pin, PtMYB1, PtMYB4 et PtMYB8 sont aussi impliqués dans la
régulation de cette voie (Patzlaff et al. 2003b; Patzlaff et al. 2003a; Gómez-Maldonado et
al. 2004; Bomal et al. 2008). Pour la voie de biosynthèse des benzenoïdes, ODORANT1
chez Petunia hybrida régule l’expression de gènes de précurseurs provenant de la voie des
shikimates (Verdonk et al. 2005). Beaucoup d’étude ciblent aussi la régulation de la voie
des flavonoïdes et des anthocyanines comme C1 chez le maïs, un des premiers MYB
caractérisés pour la régulation de cette voie (Goff et al. 1990) et MYB134 chez le peuplier
qui quant à lui est plus spécifique à la voie des proanthocyanidines (Mellway et al. 2009).
Ainsi nous concluons que notre étude démontre pour la première fois l’implication
d’un facteur de transcription de type R2R3-MYB dans la régulation transcriptionnelle d’un
gène de la voie de biosynthèse des isoprénoïdes.
3.2 Perspectives de recherche et retombées
Pour la suite de ce projet, il serait d’intérêt d’identifier d’autres cibles potentielles
du facteur de transcription MYB14 puisqu’un seul facteur de transcription peut avoir
plusieurs cibles permettant ainsi d’augmenter encore plus fortement la réponse de défense.
Il serait aussi intéressant d’évaluer si d’autres facteurs de transcription de type R2R3-MYB,
appartenant au même sous-groupe, ont un rôle semblable et peuvent exécuter la même
fonction que MYB14 au sein d’un organisme comme l’épinette blanche. On pourrait ainsi
caractériser si cette régulation transcriptionnelle est spécifique ou si elle peut être comblée
par d’autres protéines régulatrices avec des fonctions plus ou moins redondantes.
Suite à ces découvertes il nous serait possible de mieux comprendre la cascade de
régulation transcriptionnelle qui se déroule au sein de la voie de biosynthèse des
50
isoprénoïdes. Les processus de régulation transcriptionnelle sont extrêmement complexes à
comprendre en raison des multiples possibilités qui peuvent survenir lors de l’interaction
des facteurs de transcription et de leur promoteur cible. Par contre, chaque découverte à ce
niveau permet d’ajouter un morceau au casse-tête et permet d’augmenter notre
compréhension de ces mécanismes lors d’un stress chez l’épinette blanche.
En ayant bien établi le rôle du facteur de transcription MYB14 il serait par la suite
possible d’en faire un gène candidat dans le processus de sélection des nouvelles
générations d’épinettes blanches. En effet, une nouvelle technologie envisagée pour
l’exploitation de ce conifère est la sélection génétique par l’intermédiaire de marqueurs
associés à une croissance et une qualité de bois supérieure. Cette technique pourrait
permettre aux producteurs forestiers de sélectionner des arbres résineux possédant des
caractéristiques particulières dans le but de réduire le temps du cycle de sélection d’une
nouvelle génération d’épinettes. Pour mettre en pratique cette méthode, il faut d’abord
identifier des marqueurs génétiques c’est-à-dire des gènes dont les fonctions sont liées à
une meilleure croissance, aux propriétés du bois, ou encore à la résistance contre les
insectes et les maladies. Ainsi, certains gènes liés à la réponse aux stress pourraient aussi
être de bons marqueurs génétiques puisqu’il permettrait de choisir des arbres avec des
prédispositions de résistance aux stress environnementaux. Parmi la multitude de gènes
présents chez un organisme, les facteurs de transcription sont souvent des acteurs clés dans
le déclenchement de processus métaboliques. Ainsi, ils peuvent être de bonnes cibles pour
devenir des marqueurs génétiques permettant d’investiguer le contrôle génétique.
Éventuellement ils pourront servir lors de la sélection génétique si on détecte une variation
naturelle chez ceux-ci. Il est donc pertinent de découvrir quels FTs sont impliqués dans la
régulation des processus de la croissance, de la formation du bois ainsi que la réponse de
défense. En conséquence, les arbres exprimant une plus grande quantité de transcrits du
gène MYB14 seraient potentiellement plus résistants aux stress, ainsi qu’aux insectes
ravageurs ou encore à certains pathogènes.
51
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