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Rôle de l’autophagie (ATG8) lors de la Transi9on Épithélio-­‐Mésenchymateuse (TEM) des cellules cancéreuses Jacquet Marine, Hervouet Eric, Boyer-Guittaut Michaël, Fraichard Annick, Despouy Gilles
INSERM UMR1098, TIM-C, groupe « Autophagy, EMT and antitumor T-cell immunity »
Université Bourgogne Franche-Comté, Besançon
Introduc9on : TEM -­‐ Autophagie TEM Des inducteurs de l’autophagie (EBSS) induiraient la TEM de manière autophagie dépendante Li et al., 2013 AUTOPHAGIE Des inducteurs de la TEM (TGFβ) induiraient l’autophagie de manière TEM dépendante Kiyono et al., 2009 L’autophagie permeFrait la dégradaGon des acteurs de la TEM Grassi et al., 2015 Introduc9on : TEM, Autophagie & Cancer Phénotype épithélial TGFβ/TNFα TEM + TEM Gènes cibles EMT-­‐ATFs TWIST SNAIL ZEB + Phénotype mésenchymateux Associé au cancer : ✧  métastases ✧  résistance aux traitements But : ? Etudier l’implicaGon de GABARAPL1 (ATG8) dans la dégradaGon de TWIST par autophagie sélecGve AUTOPHAGIE !"#"$"%&'()*+*%,
Protéine ATG8 GABARAPL1 !"#"$"%&'())
EBSS ./,%,%-(
-
+ !"#$%&"%'(
Baf A1 )*+%&"#$%,%-(
²  DégradaGon sélecGve ²  MainGen de l’homéostasie )*+%&"#$%0/,%,%-(
Adaptateur + EMT-­‐ATFs? Résultats Introduc9on 1. Induc9on de l’autophagie (EBSS) A549 (lignée de carcinome de poumon) 2. Inhibi9on de la dégrada9on autophagique (Baf A1) TWIST ? 3. Invalida9on de GABARAPL1 (Crispr/Cas9) ConfirmaGon dans d’autres modèles : Modèle cellulaire d’ex9nc9on de GL1 : MDA-­‐MB-­‐436 (cancer sein) Modèle cellulaire de surexpression de GL1 : MCF-­‐7 (cancer sein) Résultats : 1. Induc9on de l’autophagie Introduc9on !"#"$"%&'()*+*%,
Protéine ATG8 GABARAPL1 !"#"$"%&'())
EBSS (Milieu appauvrit en acides aminés) ./,%,%-(
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A549 (carcinome de poumon) Analyse taux protéique de TWIST par Western Blot *
15
10
***
5
***
1
0
6
1
0
0
6
Autophagie induite (EBSS) TWIST 20
TWIST/AcGne • 
0 1 6 0 1 6 TGF/TNF (h) EBSS Contrôle Etude de la dégradation de TWIST par l'autophagie.
L'autophagie a été induite par EBSS 1h avant l'induction en TEM des cellules par un
traitement TGF! 5ng/ml TNF" 20ng/ml
⇒  L’induc9on de l’autophagie induit une diminu9on du taux de TWIST Introduc9on Résultats : 2. Inhibi9on de la dégrada9on autophagique Baf A1 LC3-II = marqueur des
autophagosomes
A549 (carcinome de poumon) Analyse taux protéique de TWIST par Western Blot TWIST LC3-­‐II AcGne 6
TWIST/AcGne • 
TWIST 4
2
0
⇒  L’inhibi9on de la dégrada9on autophagique induit une accumula9on de TWIST Résultats : 3. Invalida9on de GABARAPL1 Introduc9on GABARAPL1-­‐II Autophagie sélecGve GABARAPL1-­‐I (ATG8) adaptateur PE TWIST GABARAPL1 GABARAPL1 AcGne AcGne TWIST TWIST AcGne AcGne 1.5
TWIST 1.0
0.5
0.0
A5
49 A
5
A5 KO 49
49 G C
KO L1
c
G 1
L1
c3
• 
• 
•  Technologie shRNA •  Analyse taux protéique de TWIST par Western Blot TWIST/AcGne !"#$!%&'()*+
TWIST/Actine
Modèle cellulaire d’invalida9on de GL1 : A549 (carcinome poumon) Technologie crispr/cas9 TWIST
Modèle cellulaire d’ex9nc9on de GL1 : MDA-­‐MB-­‐436 (cancer sein) Analyse taux protéique de TWIST par Western Blot ⇒  L’invalida9on de GL1 restaurerait la protéine TWIST Introduc9on Résultats : Surexpression de GABARAPL1 GABARAPL1-­‐II Autophagie sélecGve GABARAPL1-­‐I adaptateur PE Mutants GABARAPL1-­‐I TWIST ? X Modèle cellulaire de surexpression de GL1 : MCF-­‐7 (cancer sein) Analyse taux protéique de TWIST par Western Blot 15
AcGne TWIST AcGne TWIST 10
5
0
G
L1
G G GC
L1 11 L
G 6A 1
11 c
6A 1
c2
GL1 TWIST/AcGne TWIST/Actine
• 
⇒  La surexpression de GL1 WT diminue le taux de la protéine TWIST ⇒  La surexpression des mutants G116A ne diminue pas le taux de TWIST Introduc9on • 
Résultats Conclusion / Perspec9ves TWIST serait dégradé par autophagie sélec9ve via GABARAPL1 –  InteracGon directe GABARAPL1-­‐TWIST –  Qu’en est-­‐il des autres EMT-­‐ATFs : SNAIL et ZEB? • 
Valida9on dans d’autres modèles cellulaires en cours : –  ACHN (carcinome de rein) –  MDA-­‐MB-­‐468 (cancer du sein) –  MCF10A (cellules immortalisées mammaires) • 
Implica9on de GABARAPL1 dans la TEM in vivo : –  Progression tumorale –  Processus métastaGque –  Résistance aux traitements • 
• 
Corréla9on inverse chez les pa9ents du taux de GABARAPL1 avec le taux des EMT-­‐ATFs (TMA) : –  Cancer du sein (cohorte de 80 paGentes) –  Cancer des poumons (cohorte de 80 paGents) Etude étendue aux autres membres de la famille ATG8 Merci de votre aFenGon 10