évaluation de l`impact de la mutation de résistance à l`oseltamivir

LADY TATIANA PINILLA
ÉVALUATION DE L'IMPACT DE LA MUTATION DE
RÉSISTANCE À L'OSELTAMIVIR (H275Y) SUR LES
CAPACITÉS RÉPLICATIVES ET LA VIRULENCE
DU VIRUS PANDÉMIQUE A(H1N1)pdm09
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en microbiologie- immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
© Lady Tatiana Pinilla, 2012
RÉSUMÉ
Les inhibiteurs de neuraminidase (INAs) sont présentement la seule classe
d’antiviral disponible commercialement pour traiter et prévenir les infections à virus
influenza saisonnières et pandémiques. Le virus pandémique de 2009 était naturellement
résistant aux adamantanes, mais sensible à l’oseltamivir et au zanamivir. Toutefois, plus de
1.5% de cas de résistance à l’oseltamivir ont été recensés suite à l’utilisation de l’antiviral
en traitement ou en prophylaxie. La plupart d’entre eux possèdent une mutation ponctuelle
(cytosine par thymidine) à la position 823, qui est à l’origine de la substitution d’une
histidine par une tyrosine à la position 275 dans la séquence d'acides aminés de la
neuraminidase (H275Y).
Étant donné que le nombre d'antiviraux disponibles pour traiter et prévenir les
infections à virus influenza est très limité (le zanamivir est le seul antiviral disponible
commercialement pour traiter les souches pandémiques résistantes aux adamantanes et à
l'oseltamivir), il est très important de comprendre les mécanismes qui causent la résistance
aux INAs et d'établir un programme qui permet de surveiller l'évolution des souches
résistantes aux antiviraux.
II
ABSTRACT
One class of anti-influenza agents; the neuraminidases inhibitors (NAIs), is the only
choice commercially available for treatment and prophylaxis of seasonal and pandemic
influenza infections. The pandemic 2009 Influenza virus, A(H1N1)pdm09, was naturally
resistant to adamantanes but susceptible to the NAI: oseltamivir and zanamivir. However,
more than 1.5% of cases of oseltamivir resistance have been reported during treatment and
prophylaxis and most of them carried a single nucleotide mutation (cytosine to thymidine)
at position 823 that resulted in a histidine to tyrosine mutation at position 275 in the
neuraminidase sequence (H275Y).
Considering that the number of available anti-influenza drugs is very restricted
(zanamivir is now the only commercially available drug for treatment of the adamantaneand
oseltamivir-resistant
A(H1N1)pdm09
strains),
it
is
important
to
understand
mechanisms of resistance to NAIs and to perform a surveillance program for evolution of
such drug-resistant variants.
III
AVANT-PROPOS
Dans le cadre de ce mémoire, je présente une revue de littérature du virus de
l’influenza en abordant des sujets généraux telle que l'histoire de son évolution, le cycle
réplicatif, les aspects cliniques, etc. Une attention particulière a été portée aux moyens de
traiter et de prévenir les infections à virus influenza, car elles représentent un problème de
santé publique, qui rend difficile la tâche du corps médical et qui est au cœur de ce projet
de maîtrise.
Je présente également deux articles qui résument les résultats de mes recherches. Le
premier s’intitule The H275Y neuraminidase mutation of the pandemic A/H1N1 virus
lengthens the eclipse phase and reduces viral output of infected cells compromising fitness
in vitro and in ferrets. Cet article est le fruit d'une collaboration avec une équipe de
physiciens de l'université de Ryerson de Toronto, qui s'intéressent particulièrement à la
modélisation mathématique. J'ai participé activement à la production de cet article en
effectuant les expériences in vitro et in vivo, en analysant les données en et rédigeant
partiellement l'article. Le Dr Benjamin Holder a contribué de manière équivalente à cet
article en développant le modèle
mathématique et en rédigeant l'article. D'autres auteurs
ont contribué à cette réalisation: Dr Yacine Abed, Dr Guy Boivin et Dr Catherine A.A.
Beauchemin. L’article a été soumis à la revue scientifique Journal of Virology (JVI) le 21
avril 2012.
Le deuxième article s’intitule Presence of oseltamivir-resistant pandemic A/H1N1
minor variants before drug therapy with subsequent selection and transmission. Ma
contribution dans cet article a été d’effectuer les expériences de PCR en temps réel,
d’analyser les données et de participer à la rédaction de l’article, dont je suis la co-auteure.
Elodie Guedin et Edward C. Holmes ont participé en effectuant les expériences de
séquençage à haut débit ainsi que dans l’analyse des résultats et la rédaction de l’article. Jay
V. DePasse, Adam Fitch, Marie-Ève Hamelin, Jesse Papenburg et Guy Boivin ont
également contribué à l’écriture de cet article qui a été soumis à la revue scientifique
Journal of Infectious Diseases (JID) le 01 mai 2012.
IV
REMERCIEMENTS
L'élaboration de ce mémoire ainsi que la réussite de ma maîtrise ont été possibles
grâce à de nombreuses personnes à qui je souhaite adresser mes remerciements les plus
sincères.
Avant tout, je tiens à remercier mon copain Mathieu pour son appui inconditionnel.
Merci de toujours m'avoir encouragé à continuer dans les moments où je ne croyais plus
pouvoir y arriver. Merci de m’avoir offert ce support moral dont j’ai tant eu besoin, surtout
lorsque je devais quitter la maison à des horaires très inhabituels pour faire des expériences.
Je tiens à te remercier d’avoir été si patient et à l’écoute, particulièrement lorsque je tentais,
dans ma naïveté, de te faire comprendre mon projet, mes expériences et mes blagues de
microbiologiste. Merci tout simplement d’avoir parcouru ce bout de chemin avec moi.
Quiero agradecer a mis padres, Carlos y Esperanza, et à Ita porque siempre
creyeron en mi y porque me sacaron adelante, dándome ejemplos dignos de superación y
entrega, porque en gran parte gracias a ustedes, hoy puedo realizar mi sueño, ya que
siempre estuvieron impulsándome en los momentos más difíciles de mi vida y de mi
carrera, y porque el orgullo que sienten por mí, fue lo que me hizo ir hasta el final. Esta
victoria es para ustedes, por lo que valen, porque admiro su fortaleza y por lo que han
hecho de mí y por mí.
Je voudrais également exprimer ma reconnaissance au Dr Guy Boivin, en tant que
Directeur de recherche, pour m’avoir donné l’opportunité de m’épanouir au sein de son
équipe de recherche et de bien avoir voulu partager ses connaissances et son expérience
professionnelle avec moi.
Je tiens à remercier sincèrement mon chargé de projet, Dr Yacine Abed, qui s’est
toujours montré à l'écoute et très disponible tout au long de la réalisation de ma maîtrise et
de ce mémoire. Merci d’avoir ajouté une touche d’humour dans tes commentaires et
suggestions!
V
Mes remerciements s’adressent également au Dr Yves Longtin et au Dr Jacques
Corbeil d’avoir accepté de participer à la lecture et à la correction de ce mémoire de
maîtrise.
Un remerciement tout particulier à mes deux amis Julie Ann et Lotfi Bounaadja
pour m’avoir changé les idées lorsque j’en avais le plus besoin, et de m’avoir souvent
brindé de nombreux conseils judicieux tant sur le plan professionnel que personnel. Lotfi, il
a été très plaisant de partager (et de gagner) de nombreuses parties de master mind ou de
bataille navale entre deux prélèvements. J’aurais bien aimé qu’on se lance en politique
ensemble suite à nos interminables discussions de société dans lesquelles on aurait voulu
changer le monde. Julie, j’ai vécu une très belle expérience en tant qu’auxiliaire
d’enseignement et ce grâce à toi. Dorénavant tu vas devoir manger tous les chocolats et les
bonbons de l’équipe à toi toute seule. Il faudrait une Julie dans chaque laboratoire de
recherche!
J’ai travaillé au sein d’une équipe formidable et très dynamique. Merci à tous les
membres de l’équipe GB. Particulièrement à Julie Carbonneau et à Xavier Bouhy (mes
parents adoptifs) qui m’ont beaucoup appris lors de mon séjour au CRI, entre autres que les
araignées ont 8 pattes et 8 yeux et qu’on peut être encore très jeune à 35 ans. Merci d’avoir
répondu à mes nombreuses questions avec gentillesse.
Enfin, j'adresse mes plus sincères remerciements à tous mes proches et amis qui
m’ont
soutenue
et
encouragée
au
cours
de
la
réalisation
de
ce
mémoire.
VI
À mes parents…
VII
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ...............................................................................................................................II
ABSTRACT ........................................................................................................................ III
AVANT-PROPOS .............................................................................................................. IV
REMERCIEMENTS ........................................................................................................... V
LISTE DE TABLEAUX .................................................................................................... XI
LISTE DE FIGURES ....................................................................................................... XII
LISTE DES ABREVIATIONS .......................................................................................XIV
CHAPITRE I : L’INFLUENZA ..........................................................................................1
SECTION 1 : INTRODUCTION SUR LE VIRUS DE L’INFLUENZA...............................1
1.1 Historique..................................................................................................................1
1.2 Structure et classification ..........................................................................................3
1.2.1 Segments 1, 2 et 3 : polymérases .......................................................................5
1.2.2 Segment 4: Hémagglutinine (HA) ....................................................................6
1.2.3 Segment 5: Nucléoprotéine (NP) ......................................................................8
1.2.4 Segment 6: Neuraminidase (NA) ......................................................................9
1.2.5 Segment 7: Matrice (M1 et M2) .....................................................................10
1.2.6 Segment 8: NS1 et NS2 ..................................................................................11
1.3 Cycle réplicatif ........................................................................................................13
1.3.1 Attachement et entrée du virus dans la cellule hôte.......................................13
1.3.2 Fusion et décapsidation ....................................................................................14
1.3.4 Synthèse d’ARN viral ......................................................................................14
1.3.5 Synthèse de protéines virales ...........................................................................15
1.3.6 Assemblage et sortie ........................................................................................16
1.4 Génétique du virus ..................................................................................................17
1.4.1 Glissement antigénique ....................................................................................17
1.4.2 Cassure antigénique (réassortiment) ................................................................18
1.5 Aspects cliniques.....................................................................................................19
1.6 Réponse immunitaire ..............................................................................................20
1.7 A(H1N1)pdm09 : Première pandémie du XXIème siècle .....................................21
SECTION 2 : Traitement et prévention ............................................................................26
1.8 Traitement et prévention ........................................................................................26
1.8.1 Vaccin ..............................................................................................................26
1.8.1.1 Vaccin inactivé..............................................................................................26
1.8.1.2 Vaccin atténué...............................................................................................27
1.8.2 Antiviraux ........................................................................................................28
1.8.2.1 Adamantanes .................................................................................................29
VIII
1.8.2.2 Inhibiteurs de neuraminidase ........................................................................30
1.8.2.2.1 Zanamivir (Relenza©) ...............................................................................34
1.8.2.2.2 Oseltamivir (Tamiflu©) .............................................................................35
1.9 Résistance................................................................................................................36
1.10 Antiviraux en développement ...............................................................................42
CHAPITRE II : HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS .........................................................45
2.1 Hypothèse................................................................................................................45
2.2 Objectifs ..................................................................................................................45
CHAPITRE III : ARTICLE I............................................................................................46
3.1 Abstract ...................................................................................................................47
3.2 Résumé....................................................................................................................48
3.3 Introduction .............................................................................................................49
3.4 Materials and Methods............................................................................................51
3.4.1 Ethics Statement...............................................................................................51
3.4.2 Viruses .............................................................................................................51
3.4.3 In vitro replication experiments .......................................................................52
3.4.4 RNA extraction ................................................................................................53
3.4.5 NA gene H275Y discriminatory real- time RT-PCR assay ..............................53
3.4.6 Ferret experiments............................................................................................54
3.4.7 Mathematical model.........................................................................................54
3.4.8 Regression and statistics ..................................................................................57
3.5 Results .....................................................................................................................58
3.5.1 Quantification of the H1N1pdm09 replication cycle in vitro ..........................58
3.5.2 Comparative analysis to seasonal strain A/Brisbane/59/2007 .........................60
3.5.3 Competitive mixed- infection experiments in vitro ..........................................61
3.5.4 Pure and competitive infections in ferrets .......................................................62
3.6 Discussion ...............................................................................................................63
3.7 Acknowledgments...................................................................................................66
3.8 Tables ......................................................................................................................67
3.9 Figures.....................................................................................................................69
3.10 References .............................................................................................................75
CHAPITRE IV : ARTICLE II ..........................................................................................79
4.1 Abstract ...................................................................................................................80
4.2 Résumé....................................................................................................................81
4.3 Introduction .............................................................................................................82
4.4 Materials and Methods............................................................................................83
4.5 Results .....................................................................................................................86
4.5.1 Presence of drug-resistant viruses before drug treatment in an
immunocompromised child (study 1) ...........................................................86
4.5.2 Evidence for transmission of drug-resistant viruses in household (study2) ....88
4.6 Discussion ...............................................................................................................89
4.7 Tables ......................................................................................................................92
4.8 Figures.....................................................................................................................93
IX
4.9 References ...............................................................................................................96
CHAPITRE V : DISCUSSION ..........................................................................................98
CHAPITRE VI : CONCLUSION ET PERSPECTIVES ..............................................108
BIBLIOGRAPHIE............................................................................................................111
X
LISTE DE TABLEAUX
CHAPITRE 1
Tableau 1. Comparaison des pandémies les plus récentes et des épidémies saisonnières ......3
Tableau 2. Protéines codées par les segments d’ARN du virus de type A. ............................6
Tableau 3. Principaux évènements survenus lors de la pandémie A/H1N1 de 2009. ..........23
Tableau 4. Principales mutations chez les virus influenza de type A et B conférant la
résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase .............................................................40
Tableau 5. Molécules en développement contre les virus influenza. ....................................44
CHAPITRE 3
Table 1: Best- fit viral kinetics parameters for H1N1pdm09. ..............................................67
Table 2: Best- fit viral kinetics parameters for A/Brisbane/59/2007. ...................................68
CHAPITRE 4
Table 1. Virological testing of nasopharyngeal aspirates sampled from a young boy
undergoing autologous bone marrow transplantation and infected with
A(H1N1)pdm09 influenza ............................................................................................92
XI
LISTE DE FIGURES
CHAPITRE 1
Figure 1. Structure du virus de l’Influenza. ............................................................................4
Figure 2. Représentation du trimère d'hémagglutinine HA0 du virus influenza A/H1N1 de
1918.................................................................................................................................7
Figure 3. Schéma du canal ionique M2 ................................................................................11
Figure 4. Illustration du segment d'ARN 8 et les ARNm NS1 et NS2 des virus influenza. .12
Figure 5. Cycle réplicatif du virus de l’influenza A .............................................................13
Figure 6. Illustration de la relation des trois types d’ARN synthétisés lors de la réplication
du virus de l’influenza dans la cellule hôte...................................................................15
Figure 7. Glissement et cassure antigénique des virus influenza ..........................................19
Figure 8. Événements de cassure antigénique qui sont à l’origine de la souche
A/H1N1pdm09..............................................................................................................24
Figure 9. Sites de liaison de la rimantadine et de l'amantadine au canal ionique M2 ..........30
Figure 10. Comparaison entre les molécules des inhibiteurs de la neuraminidase et l'acide
sialique ..........................................................................................................................32
Figure 11. Image en microscopie électronique des cellules MDCK infectées avec le virus de
l'influenza A ..................................................................................................................33
Figure 12. Molécule d'oseltamivir sous la forme de prodrogue (oseltamivir phosphate) et
sous sa forme active (oseltamivir carboxylate).............................................................36
CHAPITRE 3
Figure 13. Mécanisme d’action de l’oseltamivir et du zanamivir. .......................................38
Figure 1: Mock infection experiment to determine viral infectivity loss rate ....................69
Figure 2: Single-cycle and multiple-cycle viral yield experiments. ...................................70
Figure 3: Single-cycle and multiple-cycle viral yield experiments for a second pair of
H1N1pdm09 strains. .....................................................................................................71
Figure 4: Comparison of H1N1pdm09 and A/Brisbane/59/2007 viral kinetics parameter
values. ...........................................................................................................................72
Figure 5: Competitive mixed-infection experiments with H1N1pdm09-WT and
H1N1pdm09-MUT in vitro. ..........................................................................................73
Figure 6: Pure and competitive mixture infections of H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09MUT in ferrets. .............................................................................................................74
CHAPITRE 4
Figure 1. Outline of studies indicating day of onset, day when oseltamivir treatment was
started, and sampling timeline. .....................................................................................93
Figure 2. Longitudinal study of variant codon prevalence across multiple time-points in an
infected immunocompromised child.............................................................................94
XII
Figure 3. Transmission study of variant codon prevalence compared between son and father
specimens. .....................................................................................................................95
XIII
LISTE DES ABREVIATIONS
Â
Angström
a.a
acide aminé
ARN
acide ribonucléique
ARNc
acide ribonucléique complémentaire
ARNm
acide ribonucléique messager
ARNv
acide ribonucléique viral
AS
Acide sialique
a.v. J.-C.
Avant Jésus-Christ
CAV
Cold attenuated vaccine/ Vaccin atténué au froid
FDA
Food and Drug Administration
HA
Hémagglutinine
IC50
Concentration inhibitrice médiane
IL
Interleukine
IFN
Interféron
IV
Inactivated Vaccine/Vaccin inactivé
MDCK
Madin-Darby Canine Kidney
NA
Neuraminidase
INA
Inhibiteurs de neuraminidase
LNA
Locked Nucleic Acids/ Acides nucléiques modifiés
NEP
Nuclear Export Protein/Protéine d’exportation nucléaire
NP
Nucleoprotéine
nt
nucléotide
OMS
Organisation mondiale de la santé
PA
Polymérase acide
pARNv
petit acide ribonucléique viral
XIV
PB1
Polymérase basique 1
PB2
Polymérase basique 2
RBS
Receptor binding site/Site de fixation au récepteur
RNP
Ribonucléoprotéine
TNF
Tumor necrosis factor/Factor de nécrose tumorale
VLP
Virus like particles/Pseudo particules virales
XV
CHAPITRE I : L’INFLUENZA
SECTION 1 : INTRODUCTION SUR LE VIRUS DE
L’INFLUENZA
1.1 Historique
L’influenza, ou plus communément appelée grippe, est la maladie respiratoire la
plus importante en termes de morbidité et de mortalité, en plus de son impact non
négligeable au niveau économique. En effet, les épidémies saisonnières d’influenza A et B
affectent 5 à 20% de la population humaine causant une maladie sévère chez 3 à 5 millions
de personnes et 250 000 à 500 000 décès à travers le monde chaque année (Schirmer et al.,
2009). Il a été estimé que l’impact cumulatif des épidémies du 20ème siècle dépasse
largement l’impact cumulatif des trois grandes pandémies (Wang et al., 2010). Au Canada,
le virus affecte annuellement 10 à 20% de la population, causant jusqu’à 8000 décès chaque
année, entre 30000 et 60000 hospitalisations et 29,5 millions d’heures d’absentéisme au
travail (Statistiques Canada, 2009). Ces données font de l’influenza et de la pneumonie la
6ème cause de décès du pays (Stiver, 2003).
Bien que Hypocrates ait décrit la propagation d’une maladie respiratoire semblant
être une épidémie d’influenza en 410 av. J.-C. et que plus de 1500 descriptions semblables
ont été rapportées au cours de l’histoire, ce n’est qu’en 1580 en Asie qu’on a décrit de
façon officielle la première épidémie d’influenza (Martin et al., 2006). Les épidémies
subséquentes ont été décrites principalement en Europe, puis en Afrique et en Asie pour
finalement traverser l’océan Atlantique jusqu’en Amérique (Thacker, 1987). Même si le
virus de l’influenza a fait des ravages importants à travers l’histoire, c’est la pandémie de
1918-1919 ou grippe espagnole (causée par un virus influenza A/H1N1) qui a été
considérée comme la maladie infectieuse la plus dévastatrice des temps modernes. Le bilan
1
des décès a été estimé entre 40 et 50 millions de personnes et 25% de la population
mondiale a souffert d’une infection clinique (Potter, 2001). Cette pandémie est dénommée
la grippe espagnole parce que les journaux espagnols ont publié un grand nombre de
données et de descriptions sur la maladie; l’origine de la pandémie n’est cependant pas
encore connue avec certitude. En effet, certaines publications décrivent la Chine comme le
lieu d’éclosion, alors que d’autres citent les États-Unis (Potter, 2001). Le taux de mortalité
associé à cette souche virale est expliqué par une infectivité considérable (50% de la
population a été exposée) ainsi que par la sévérité des symptômes causés par l’induction
d’une production massive de cytokines (Patterson et al., 1991). Il est important de noter
qu’à cette époque les antibiotiques n’avaient pas encore été découverts pour contrer les
surinfections bactériennes.
La pandémie de la grippe espagnole a été suivie de deux autres pandémies moins
dévastatrices : la grippe asiatique en 1957 (A/H2N2) et la grippe de Hong Kong en 1968
(A/H3N2), qui ont causé malgré tout des millions de morts dans le monde. Le
développement d’antibiotiques a possiblement joué un rôle crucial en diminuant le nombre
de surinfections (Taubenberger et al., 2001). Le tableau 1 compare les pandémies les plus
récentes ainsi que leurs principaux impacts.
Au mois d’avril 2009, une nouvelle souche du virus influenza A/H1N1 est apparue
au Mexique et s’est transmise rapidement à travers le monde devenant ainsi la première
pandémie du 21ème siècle. Elle a touché 214 pays et plus de 18 000 cas d’infection ont été
rapportés (Chan, 2009). Cette pandémie est décrite de façon plus détaillée à la section 1.7.
2
Tableau 1. Comparaison des pandémies les plus récentes et des épidémies saisonnières. Tiré
de Donaldson et al., 2009, World Health, 2003, Patterson et al., 1991, Taubenberger et al.,
2006 et Potter, 2001.
Nom commun
Année
Type
Décès
Taux de mortalité
Grippe espagnole
Grippe Asiatique
Grippe de Hong Kong
Grippe porcine
1918-1919
1957-1958
1968-1969
2009-2010
40 - 50 millions
2 millions
1 million
> 18 000
2 –3 %
0,2 %
0,2 %
0,01 - 0,03 %
Grippe saisonnière
chaque année
A/H1N1
A/H2N2
A/H3N2
A/H1N1
A/H1N1,
A/H3N2 et B
250 000 - 500 000
0,2 %
1.2 Structure et classification
Les trois types du virus de l’influenza A, B et C font partie de la famille des
Orthomyxoviridae, qui regroupe les virus possédant un génome à ARN segmenté, simple
brin et de polarité négative.
Les virus influenza de type A et B possèdent 8 segments
différents d’ARN codant pour 12 et 11 protéines, respectivement, alors que le type C ne
possède que 9 protéines codées par 7 segments différents (Richman et al., 2002). Les virus
du type A et B sont responsables des épidémies annuelles, alors que les virus de type C
causent des cas sporadiques. Seuls les virus de type A peuvent causer de pandémies, car ils
sont capables d’infecter différents hôtes (les oiseaux,
les humains et d’autres mammifères)
avec la possibilité d’échange de segments entre différentes souches virales.
La particule virale, de forme sphérique ou pléomorphe, possède un diamètre de 80
à 120 nm (plus petit que celui de la rage, mais trois fois plus grand que celui du virus de la
poliomyélite) (Richman et al.,
2002). Ces particules enveloppées possèdent deux
glycoprotéines de surface : l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), qui ont des
propriétés antigéniques permettant de classifier les virus de type A. Actuellement on
connaît seize sous-types antigéniques différents d'HA (H1-H16) et neuf sous-types de NA
(N1-N9) (Wright et al., 2001). En plus des glycoprotéines de surface (HA et NA),
l'enveloppe virale contient aussi la protéine M2, qui joue le rôle de canal ionique pour les
3
virus de type A. Pour les virus de type B, une protéine de surface NB assurerait les
fonctions équivalentes.
À l’intérieur de la particule, l’ARN viral est associé à une nucléoprotéine NP, qui
fait partie des antigènes internes du virus et permet de distinguer, avec la protéine de la
matrice (M1), les trois types de virus influenza (Palese et al., 2007). Finalement, les
protéines PB2, PB1 et PA forment un complexe de polymérase et sont associées à chaque
nucléocapside (Complexe ARN-NP), formant ainsi la ribonucléoprotéine (RNP) (Figure 1).
Les propriétés de chaque segment d’ARN de type A ainsi que les protéines encodées sont
décrites dans les pages qui suivent (Tableau 2).
Figure 1. Structure du virus de l’Influenza. Traduit de Medina et al., 2011.
4
1.2.1 Segments 1, 2 et 3 : polymérases
Les segments 1, 2 et 3 codent pour les protéines PB2, PB1 et PA respectivement. De
plus, le segment 2 code pour une protéine supplémentaire (PB1-F2). Découverte
récemment, PB1-F2 (87 a.a.) est une protéine qui augmente spécifiquement l'apoptose des
monocytes, limitant son action aux cellules immunitaires de l'hôte (Noah et al., 2005). Cette
protéine pro-apoptotique perméabilise la mitochondrie, causant la perte du potentiel de la
membrane et la libération du cytochrome c (Chen et al., 2001). Des études chez le modèle
murin ont montré que PB1-F2 est impliquée dans la virulence de virus de type A (les virus
de type B et C n'expriment pas cette protéine) (Zamarin et al., 2006).
Une découverte très récente, nous présente une troisième protéine dérivée du
deuxième segment; PB1-N40, une protéine tronquée et fonctionnelle qui n'est pas
complétement essentielle à la réplication virale, mais dont l’absence diminue la capacité
réplicative virale. En effet, il a été démontré que les virus qui n’expriment pas les protéines
PB1-N40 et PB1-F2 se répliquent en culture cellulaire et dans les œufs embryonnés.
Cependant, l’unique absence de PB1-N40 (PB1-F2 fonctionnelle) cause un ralentissement
de la réplication virale en culture cellulaire. Sa fonction n’est pas encore élucidée (Wise et
al., 2009).
Les protéines PB2, PB1 et PA ont été nommées ainsi à cause de leurs propriétés
isoélectriques sur gel : basique (PB2 et PB1) ou acide (PA). Elles forment un complexe
polymérase dépendant de l’ARN et sont responsables de la réplication et la transcription de
l'ARNv (-). Lors de la réplication, l’ARNv (-) est transcrit en ARN complémentaire
(ARNc) de sens positif, qui servira de matrice pour la production des nouveaux ARNv (-).
Ceux-ci seront exportés dans le cytoplasme et assemblés dans les nouvelles particules
virales. L’ARNv (-) sert également de gabarit pour la transcription en ARNm, qui sera par
la suite traduit en protéine (Figure 5). PB2 initie la synthèse d’ARNm et possède une
activité endonucléase (Detjen et al., 1987), alors que la protéine PB1 assure l’élongation.
De son côté, la protéine PA intervient principalement dans la réplication de l’ARNv en
5
formant de nouveaux brins d'ARN de polarité négative, qui sont incorporés dans les
nouveaux virions (Inglis et al., 1976).
Tableau 2. Protéines codées par les segments d’ARN du virus de type A. Modifié et traduit de
Bouvier et al., 2008.
Segment
D’ARN
Longueur
(nt)
1
2341
2
2341
3
Polypeptide
Longueur de Nombre de
la protéine molécules
(a. a)
par virion
2233
PB2
PB1
PB1-F2
PA
759
757
87
716
30-60
30-60
30-60
30-60
4
1778
HA
550
500
5
1565
NP
498
1000
6
1413
NA
454
100
7
1027
M1
252
3000
M2
97
20-60
NS1
230
-
NS2
121
130-200
8
890
Fonction de la protéine
Sous-unité polymérase
Sous-unité polymérase, activité endonucléase
Activité pro-apoptotique
Sous-unité polymérase, activité protéase
Glycoprotéine de surface, principal antigène,
lie le récepteur et permet la fusion
Protège le matériel génétique, importation des
gènes viraux dans le noyau de la cellule hôte
Glycoprotéine de surface, activité sialidase,
libération du virion
Protéine de structure virale, exportation de
l'ARN virale hors du noyau, bourgeonnement
du virus
Canal ionique, assemblage du virus
Régulation de l'expression de gènes de la
cellule hôte, protéine antagoniste de
l'interféron
Permet l'exportation d'ARN viral hors du noyau
1.2.2 Segment 4: Hémagglutinine (HA)
L’hémagglutinine (HA), glycoprotéine antigénique présente à la surface du virus de
l'influenza, est responsable de la fixation de la particule virale au récepteur [acide sialique
(AS)] de la cellule cible. Le nom hémagglutinine provient de la faculté de la protéine à
agglutiner les érythrocytes. De forme cylindrique, la protéine mesure environ 135 Å de
long et est constituée de trois monomères identiques qui sont groupés en une spirale
centrale alpha-hélicoïdale (Figure 2).
6
Figure 2. Représentation du trimère d'hémagglutinine HA0 du virus influenza A/H1N1 de
1918. La zone bleue représente le site de liaison de la protéine au récepteur d'acide sialique.
Le précurseur HA0 est clivé au site de clivage donnant lieu aux protéines HA1 (en rouge) et
HA2 (en vert). Les zones orange indiquent les séquences polybasiques proches du site de
clivage, augme ntant la virulence de la souche (Stevens et al., 2006).
Les monomères HA sont d’abord synthétisés comme précurseurs HA0, puis sont
glycosylés et clivés en deux polypeptides plus petits : les sous-unités HA1 et HA2. La
partie extracellulaire globulaire ou HA1 présente le site de liaison, appelé site RBS
(receptor binding site), au récepteur des cellules cibles comportant une molécule d'AS. La
partie formant une tige ou HA2 permet la fusion de la membrane phospholipidique qui
recouvre la particule virale avec la membrane de l'endosome de la cellule hôte lors du
processus d'assemblage et de libération des virions. Une fois attachées à la surface de la
7
cellule hôte, les regions HA1 et HA2 doivent être séparées l'une de l'autre grâce à un
clivage au niveau d'un peptide reliant les deux sous-unités (Figure 2). Tant que la coupure
n'a pas eu lieu, les virus ne sont pas capables d'infecter une cellule.
Les souches hautement pathogènes H5 et H7, présentent des séries d’acides aminés
basiques adjacents au site de clivage, alors que les souches peu pathogènes ne contiennent
qu'un seul acide aminé: l'arginine. (Puthavathana et al., 2005) (Govorkova et al., 2005). La
présence de plusieurs acides aminés permet le clivage de la HA par des protéases
intracellulaires ubiquitaires telles la furine; en conséquence, le processus de clivage est plus
efficace et peut s'effectuer dans un grand nombre de cellules (Horimoto et al., 1994). Une
substitution de la sérine par l'isoleucine, à la position 227 de la HA, diminue la virulence de
la souche A/H5N1 hautement pathogène isolée chez l'homme à Hong Kong en 1997 (Hatta
et al., 2001). Les virus recombinants H5N1 ne possédant pas d’acides aminés basiques au
niveau de la protéine HA ne sont pas virulents chez la souris (Hatta et al., 2001). Toutefois,
il a été démontré que la présence d'une séquence polybasique au site de clivage n'est pas
toujours associée à la virulence; certains virus H5N1 sont peu pathogènes même s'ils
possèdent des acides aminés basiques au niveau de la HA et une glycosylation additionnelle
au niveau de la protéine NA (Hulse et al., 2004). Ceci appuie des études précédentes qui
suggèrent que l'activité des protéines NA et HA est reliée.
1.2.3 Segment 5: Nucléoprotéine (NP)
Bien que l'extrémité C-terminale de la protéine NP possède une trentaine d'a.a. à
caractère acide, la charge nette de la protéine est positive à pH neutre en raison de sa
composition riche en arginine, glycine et sérine (a.a. basiques). Cette caractéristique est à la
base d’interactions électrostatiques de NP avec le squelette de phosphate chargé
négativement de l’ARN. Une étude des différentes séquences d'a.a. de NP (de types A, B et
C) montre une homologie très importante avec une différence inférieure à 11% (Shu et al.,
1993).
La protéine interagit principalement avec l’ARNv et l’ARNc, afin qu’ils soient
reconnus comme gabarit par le complexe polymérase (PB1, PB2 et PA). Chacun des
monomères de NP interagit avec 24 nucléotides de l’ARNv sur la surface externe de NP ce
8
qui fait en sorte que l’ARN n’est pas protégé de la digestion des ribonucléases. En plus de
lier l'ARN viral simple brin, NP interagit avec elle-même, avec les sous-unités de
polymérase PB1 et PB2, ainsi qu'avec la protéine de la matrice M1 (Portela et al., 2002).
1.2.4 Segment 6: Neuraminidase (NA)
Une attention marquée sera portée à cette protéine, car elle est la cible d’une classe
d’antiviraux : les inhibiteurs de neuraminidase, qui sont l’objet d’étude dans le cadre de ce
projet de maîtrise. La neuraminidase se trouve ancrée à la membrane virale par une
séquence hydrophobique de 29 a.a. proche du site N-terminal de la protéine. Bien qu’elle
constitue une protéine majeure de surface du virus de l’influenza, sa concentration est
moindre que celle de la HA.
La spicule de la NA possède une forme de champignon, avec une tige et une tête,
formée de quatre monomères identiques liés par de ponts disulfure et composés de six
feuillets B arrangés en hélice, ce qui lui confère une forme globulaire. La protéine est dotée
d’une activité enzymatique, qui permet le clivage des liaisons covalentes formées entre la
HA et les résidus d’AS, dans le but de libérer les virions nouvellement formés et encore
attachés à la surface de la cellule infectée (Palese et al., 1974). De plus, la protéine joue un
rôle dans l’initiation de l’infection virale en facilitant le détachement des virions du mucus
présent au niveau de l’épithélium respiratoire, qui est très riche en AS (Matrosovich et al.,
2004a) (Burnet et al., 1947).
Les sous-types NA (N1-N9) connus de nos jours sont classés en deux groupes: le
groupe N1 composé des NA des sous-types 1, 4, 5 et 8 ainsi que le groupe N2 composé des
NA des sous-types 2, 3, 6, 7, 9. Les deux groupes partagent un site catalytique très bien
conservé. Toutefois, les NA du groupe 1 possèdent une poche située entre les résidus 147 et
152 et ce même si les deux groupes possèdent les mêmes a.a. au site catalytique. Ceci
s’explique par la présence d’un a.a. tyrosine à la position 347 chez le groupe N1 qui devient
une asparagine chez le deuxième groupe, ce qui change le nombre de ponts hydrogène avec
les a.a. du site catalytique (Russell et al., 2006). La liaison directe et le clivage du substrat
9
font appel principalement à 8 acides aminés (R-118, D-151, R-152, R-224, E-276, R-292,
R-371, and Y-406; numérotation N2), qui jouent un rôle purement fonctionnel, tandis que
11 résidus supplémentaires (E-119, R-156, W-178, S-179, D-198, I-222, E-227, E-277, N294 et E-425 ; numérotation N2) stabilisent la structure du site actif (Colman et al., 1983).
Dans le cadre de ce mémoire on fera référence à la numérotation de la neuraminidase du
groupe N1 à moins que le contraire soit indiqué.
La NA est la cible des inhibiteurs de neuraminidase (INAs), car elle joue un rôle
important dans la propagation du virus et parce que les a.a. constituant le site actif de la
protéine sont très conservés chez les virus de type A et B (Varghese et al., 1998). Les
antiviraux seront décrits de façon plus détaillée à la section 1.8.2.
1.2.5 Segment 7: Matrice (M1 et M2)
Trois molécules d'ARNm sont produites à partir du segment 7, dont seulement deux
sont codantes: M1 et M2. La protéine M1 est la protéine interne la plus abondante du virion
et forme une coquille sous l'enveloppe virale. En plus de jouer un rôle structural, la protéine
M1 induit à elle seule le bourgeonnement. C’est le constat réalisé par une équipe de
scientifiques, qui a réussi à demontrer in vitro que la protéine M1, en l’absence d'autres
gènes viraux, est capable de produire des pseudo-particules virales ou VLPs qui sont
libérées dans le milieu extracellulaire (Gomez-Puertas et al., 2000).
La deuxième protéine codée par le segment 7, M2, possède un domaine
extracellulaire composée de 23 a.a. à l'extrémité N, un domaine transmembranaire formé de
19 a.a. et un domaine cytoplasmique (extrémité C) constitué de 54 a.a. Le canal d'ions M2
est un homotétramère constitué de deux dimères liés par des ponts disulfure (Holsinger et
al., 1991) (Figure 3).
Le canal permet l'entrée des ions H+ dans la particule virale, une fois que celle-ci
se trouve dans l'endosome, causant un abaissement du pH interne et ainsi la dissociation des
liens entre la protéine M1 et les RNPs. Bien que la protéine M2 soit exprimée de façon
10
abondante à la surface de la cellule hôte, seulement une faible concentration de celle-ci se
trouve dans le virion, soit environ 15 tétramères par virion. L'activité de la protéine M2 est
la cible des adamantanes, une classe d'antiviraux qui sera présentée de façon détaillée à la
section 1.8.2.1.
Figure 3. Schéma du canal ionique M2. Les résidus hautement conservés His37 et Trp41 se
situent dans le canal de protons et jouent un rôle crucial dans le transport d’ions. À un pH
élevé, les quatre hélices transmembranaires sont très proches les unes des autres et la barrière
de tryptophane à la position 41 limite les interactions. À faible pH, la protonation des résidus
histidine à la position 37 déstabilise le tétramère et la barrière de tryptophane permettant
ainsi l'hydratation du canal et le passage de protons (Schnell et al., 2008).
1.2.6 Segment 8: NS1 et NS2
Le plus petit segment d'ARN, le segment 8, code pour deux protéines: NS1 et NS2
(Figure 4). La protéine NS1 est présente en grandes quantités dans la cellule infectée, mais
elle n'a jamais été détectée dans le virion. Parmi ses nombreuses fonctions, il est important
de noter qu'elle joue un rôle majeur en déjouant le système immunitaire inné.
Effectivement, il a été démontré in vitro (St. Jude porcine lung epithelial cells, SJPL) et in
11
vivo (porc) que le gène NS est le responsable de la résistance de la souche A/H5N1/97 à
l’activité antivirale des interférons (IFN) et du facteur de nécrose tumorale (TNFα) sécrétés
par l'hôte (Seo et al., 2002). Une analyse génétique a permis de constater que les souches
létales A/H5N1/97 et A/H5N1/2001 possèdent un acide glutamique (D) à la position 92,
alors que les souches sensibles aux cytokines ont un acide aspartique (E) à cette position
(Seo et al., 2002).
Pendant longtemps, la communauté scientifique a cru que, tout comme la protéine
NS1, la protéine NS2 ne se trouvait que dans la cellule infectée. Plus tard, il a été démontré
que la protéine NS2 se trouve dans les particules virales purifiées et qu'elle interagit avec la
protéine de la matrice M1 (Robb et al., 2009). Dans le noyau, l'association de ses deux
molécules permet l'exportation des RNPs vers le cytoplasme. Suite à cette découverte, il a
été proposé de remplacer le nom de la protéine NS2 par NEP (nuclear export protein)
(O'Neill et al., 1998).
Figure 4. Illustration du segment d'ARN 8 et les ARNm NS1 et NS2 des virus influenza. Le
segment NS est représenté en blanc. Les lignes simples à la fin de chaque ARNm représentent
les régions non codantes. Les cercles noirs représentent les coiffes à l'extrémité 5'. Le cadre de
lecture ouvert n'est pas le même pour NS1 et NS2 (Lin et al., 2007).
12
1.3 Cycle réplicatif
Le cycle réplicatif du virus de l’Influenza a une importance capitale pour mieux
comprendre le comportement du virus dans la cellule hôte ainsi que l’action des différentes
classes d’antiviraux. Ce cycle sera décrit ici en 6 étapes : attachement et entrée du virus
dans la cellule hôte, fusion et décapsidation, synthèse d’ARN viral, synthèse de protéines
virales ainsi qu’assemblage et sortie. La figure 5 permet d’avoir une vue d’ensemble du
cycle réplicatif.
Figure 5. Cycle réplicatif du virus de l’influenza A. Traduit de Medina et al., 2011.
1.3.1 Attachement et entrée du virus dans la cellule hôte
L’attachement du virus de l’influenza à la cellule hôte est assuré par la
glycoprotéine HA, qui reconnaît les récepteurs cellulaires contenant des AS liés soit de
façon α 2,3 ou α 2,6 à une molécule de galactose sur les glycoprotéines de l'hôte. Les virus
humains se lient de préférence aux récepteurs contenant des liens α 2,6, alors que les virus
aviaires et équins ont tendance à se lier aux récepteurs α 2,3. Les porcs possèdent les deux
types de récepteurs et peuvent être infectés par différents virus simultanément, cela favorise
13
donc les réassortiments et le saut de la barrière d’espèces, qui peut être à l’origine de
pandémies (Ito et al., 1998). Suite à l’attachement, le virus est internalisé par endocytose
clathrine-dépendante par le biais du récepteur (Matlin et al., 1981).
1.3.2 Fusion et décapsidation
Une fois dans l’endosome, le pH (entre 5 et 6) de celui-ci induit un changement
conformationnel de la protéine HA ainsi que son clivage permettant la fusion de la
bicouche lipidique virale et de la membrane de l’endosome. La libération du matériel
génétique fait appel au canal ionique M2, qui permet l’entrée des ions H+ dans la particule
virale, permettant la dissociation de la protéine M1 des complexes RNPs afin que ceux-ci
soient libérés dans le cytoplasme et puissent par la suite être transportés vers le noyau
grâce à un signal de localisation contenu dans le complexe RNP (PB1, PB2, NP et PA)
(O'Neill et al., 1995) (Bui et al., 1996).
1.3.4 Synthèse d’ARN viral
La transcription et la réplication de l’ARN viral ont lieu dans le noyau, fait
inhabituel pour un virus à ARN. Il est important de noter que le virus possède 12
nucléotides à l’extrémité 3’ et 13 nucléotides à l’extrémité 5’, qui sont hautement conservés
chez les 8 segments d’ARN (Fig. 6) et qui montrent une complémentarité partielle entre
eux (Neumann et al., 1999).Ces nt sont non codants et serviraient principalement de
promoteur pour la réplication et la transcription des ARNv.
La stratégie de réplication débute par la transcription d’ARNv en ARNm par le
complexe de polymérase virale ainsi que la polymérase cellulaire (Pol II) (Plotch et al.,
1981). Afin que les ARNm puissent être utilisés comme gabarit pour la production des
protéines, un ajout de 9 à 17 nucléotides à l’extrémité 5’ ainsi qu’une queue poly-A à
l’extrémité 3’ sont nécessaires (Bouloy et al., 1979) (Caton et al., 1980) (Dhar et al., 1980;
Krug et al., 1979; Plotch et al., 1979) (Li et al., 1994). L’ARNv sert également comme
14
gabarit pour synthétiser les ARNc (ou de sens positif). Ces derniers serviront à leur tour de
gabarit
pour
amplifier
les
ARN
viraux,
permettant
supplémentaires de l’ARNv ou des petits ARNv
ainsi d’obtenir
des
copies
(pARNv) qui régulent le passage de
l’étape de transcription à la réplication (Perez et al., 2010) (Umbach et al., 2010). La
relation entre les trois types de molécules d’ARN synthétisées lors de la réplication est
illustrée à la figure 6. À noter que le complexe de la polymérase virale est impliqué dans la
synthèse de trois types de molécules d’ARN.
Figure 6. Illustration de la relation des trois types d’ARN synthétisés lors de la réplication du
virus de l’influenza dans la cellule hôte. Les 13 nt à l’extrémité 5’ et les 12 nt à l’extrémité 3’
hautement conservés chez les 8 segments d’ARN sont présentés ici. La coiffe et les nucléotides
(N9-17) à l’extrémité 5’ des ARNm proviennent des preARNm de la cellule hôte (Mikulasova
et al., 2000).
1.3.5 Synthèse de protéines virales
Les systèmes de réplication d’ARN, de transcription ainsi que de traduction sont
hautement régulés, de façon à ce que des produits ou des sous-produits soient exprimés au
bon moment et au bon endroit dans le cycle réplicatif. Par exemple, la production de la
protéine NP libre (non-associé aux RNPs) est nécessaire afin que le complexe polymérase
passe de l’étape de transcription à celle de la réplication (Shapiro et al., 1988). Également,
la protéine NS1 inhibe la production des ARNm cellulaires en empêchant leur épissage
15
(Qiu et al., 1995). NS1 est synthétisée très tôt dans le cycle réplicatif dans le but de prendre
le contrôle de la machinerie enzymatique cellulaire et de la détourner
au service de la
réplication virale.
L’expression des protéines est affectée par deux mécanismes : 1- L’épissage
alternatif d’un ARNm (i.e. : segment 8 : NS et 7 : M) résulte dans la production de deux
ARNm, qui coderont pour deux protéines différentes. 2- Les codons d’initiation sont situés
dans différents cadres de lecture, tel qu’il est le cas pour le segment 2, qui peut coder pour
deux protéines différentes : PB1 et PB1-F2 (Palese et al., 2007). Contrairement aux autres
protéines virales, les protéines HA, NA et M2 ne doivent pas retourner dans le noyau et
sont dirigées directement vers la membrane cellulaire (côté apical de la cellule) après leur
synthèse. Les protéines M1 et NS2 jouent un rôle dans l’exportation des complexes RNP.
1.3.6 Assemblage et sortie
Pour être produites, les particules virales infectieuses doivent contenir un génome
complet, soit les huit segments nécessaires à un cycle infectieux complet. Au départ, il a été
établi que l’incorporation de huit segments était un phénomène aléatoire, puisqu’il a été
observé que les virus de l’influenza pouvaient contenir plus que huit segments (Enami et
al., 1991).
Des études récentes ont montré qu’il existe des séquences spécifiques sur
chacun de huit segments d’ARN permettant l’incorporation d’un groupe de huit segments
différents nécessaires dans le virion (Fujii et al., 2003).
Une fois le complexe RNPs - M1 et NS2 dans le cytoplasme, il migre vers les
radeaux lipidiques, où les glycoprotéines de surface NA et HA ont été concentrées.
La
protéine M2 est exclue de radeaux lipidiques, car elle est capable de lier le cholestérol, ce
qui expliquerait pourquoi une si faible concentration de cette protéine est retrouvée dans le
virion. Des études biochimiques ont suggéré que la protéine M1 serait la responsable du
processus de bourgeonnement du virion à cause de son habilité à lier les lipides et la
membrane cytoplasmique (Gomez-Puertas et al., 2000).
16
La dernière étape fait appel à la protéine NA afin de libérer la particule virale des
AS de la cellule hôte, qui autrement resteraient liés à la protéine HA suite au
bourgeonnement. La protéine NA clive le lien entre l’AS et HA empêchant les particules
virales de s’agglutiner entre elles (Figure 5).
1.4 Génétique du virus
Pour les virus de l’influenza, peu de cas de «vraie» recombinaison d’ARN
homologue ou non-homologue ont été documentés. Parmi des rares cas de recombinaison
non homologue on compte l’exemple d’une équipe de chercheurs qui a sélectionné un virus
peu pathogène, capable de se reproduire en culture cellulaire en absence des protéases
nécessaires au clivage de la protéine HA, une étape essentielle à la réplication virale. Après
avoir étudié le génome viral, il a été constaté que le segment codant pour le site de clivage
de la HA avait acquis, par recombinaison, une insertion de 54 nt provenant de l’ARN
ribosomal 28s. La nouvelle insertion, étant clivée par les protéases intracellulaires, a permis
au virus de devenir plus pathogène que le virus parental (Khatchikian et al., 1989).
Contrairement à la recombinaison d’ARN, le glissement (drift) et le réassortiment (shift)
antigénique sont deux mécanismes très bien documentés chez les virus influenza et ils
expliquent très bien pourquoi le taux de changements dans le génome du virus est si
important. La figure 7 montre clairement les deux événements antigéniques possibles pour
les virus influenza.
1.4.1 Glissement antigénique
Le
glissement
antigénique
est
dû
aux
mutations
ponctuelles
produites
particulièrement lors de la synthèse de l’ARNv des segments HA et NA (codant pour des
protéines antigéniques) en raison du taux élevé d’erreurs associé à l’ARN polymérase
(1/105 mutations/cycle viral) (Drake, 1993). L’accumulation de ces mutations dans la
séquence d’acides aminés peut altérer les épitopes ou déterminants antigéniques, qui ne
seront plus reconnus par le système immunitaire. Les mutations dans les séquences HA ou
17
NA de virus humains ont lieu à une fréquence de ≤ 1 % par an (Abed et al., 2002). Les
souches virales qui ne sont plus reconnues par l’immunité préexistante sont plus faciles à
propager et résultent en épidémies. Le glissement antigénique est observé chez les virus de
type A et B, mais il est plus fréquent chez les virus de type A. Ce phénomène est la raison
principale du besoin de modifier le vaccin contre l’influenza sur une période annuelle (Voir
section 1.8.1).
1.4.2 Cassure antigénique (réassortiment)
Le réassortiment est un évènement unique aux virus du type A. Ce changement
majeur a lieu lors d’une infection d’une cellule par deux sous-types viraux différents,
souvent un virus humain et un virus aviaire. Ces réassortiments aboutissent notamment au
remplacement d'un type HA et/ou NA humain par un autre (ex. : aviaire). L'immunité
préexistante est inefficace contre la nouvelle souche et, advenant une bonne transmission,
cela conduit à une pandémie, comme ça a été le cas lors des éclosions de 1957 et 1968. Il a
été estimé qu'en moyenne il y a trois pandémies par cent ans, soit une pandémie à tous les
33 ans (Potter, 2001). Il est important de noter que le réassortiment n’est pas nécessaire à
l’éclosion d’une pandémie. En effet, le virus qui a causé la pandémie de 1918 s’est avéré
être un virus complètement aviaire et non un réassortant (Reid et al., 2004). De façon
générale, les virus aviaires ne se répliquent pas bien chez les humains et vice versa (Beare
et al., 1991), il est donc possible que le réassortiment entre ces deux espèces ait lieu dans
un animal intermédiaire. Les porcs ont été proposés comme les réservoirs du réassortiment,
car autant les virus aviaires et les virus humains peuvent se répliquer chez le porc. Ceci
s’explique par le fait que les cellules de la trachée des porcs possèdent les récepteurs d’AS
α 2,3, préférés par les virus aviaires, et les récepteurs α 2,6, favorisés par les souches
humaines (Ito et al., 1998).
18
Figure 7. Glissement et cassure antigénique des virus influenza. Les protéines HA et NA (bleu)
subissent des mutations ponctuelles (glissement antigénique) générant des nouvelles variantes
d’un virus (points rouges), qui déjouent le sys tème immunitaire de l’hôte caus ant des
épidémies. La cassure antigénique est observée lorsque des segments provenant de deux
espèces différentes se retrouvent dans la même particule virale , causant une pandémie
(Doherty et al., 2009).
1.5 Aspects cliniques
Le virus de l'influenza cause une maladie respiratoire transmisse par des gouttelettes
provenant de la toux. La transmission est également possible par des surfaces inanimées
contaminées, car le virus peut survivre un ou deux jours sur les surfaces dures et lisses, 15
minutes sur des feuilles de papier et 5 minutes sur la peau (Bean et al., 1982).
19
La grippe est caractérisée par des symptômes non spécifiques tels la fièvre présente
en >90% des cas, la toux (>80%), la congestion nasale (>80%), l’asthénie, la céphalée, la
myalgie et l’anorexie (Whitley et al., 2006) (Boivin et al., 2000). Les symptômes
apparaissent normalement deux jours après l'infection et ils sont parfois accompagnés des
nausées et des vomissements. Chez les adultes en santé et en absence de traitement, les
symptômes disparaissent après cinq
ou sept jours, mais des complications dont
principalement les pneumonies virales ou bactériennes peuvent survenir principalement
chez les groupes à haut risque. Le virus de l'influenza est plus souvent létal chez les jeunes
enfants ainsi que chez les personnes âgées. Chez les femmes enceintes les infections
sévères surviennent principalement pendant le 2ème
et 3ème trimestre de grossesse et les
risques pour le fœtus sont plutôt associés à la réponse inflammatoire de la mère qu’à
l’infection virale elle-même (Shi et al., 2005).
Dans l'hémisphère nord, les épidémies d'influenza ont lieu principalement entre les
mois d’octobre et février alors qu’elles ont lieu entre les mois de mars et septembre dans
l’hémisphère sud (Viboud et al., 2006). Deux facteurs semblent être les principaux
responsables du phénomène saisonnier du virus, soit la température et l'humidité. En effet,
dans un air sec et froid, le virus serait plus stable et infectieux pendant plus longtemps. Il a
été demontré que l'air froid (5o C) favorise la transmission du virus, alors qu'une
température de 20o C ou de 30o C semble freiner, voire inhiber la propagation du virus. De
plus, un air sec ou une humidité relative de 20 % à 35 % favorise la transmission du virus
(Shi et al., 2005).
1.6 Réponse immunitaire
Afin de contrôler ou d’éliminer l’infection causée par les virus influenza, l’hôte fait
appel à l’immunité cellulaire et humorale, en plus de la réponse non-spécifique mise en
place bien avant l’infection. La première réponse contre le virus est celle de l’immunité
innée, qui se caractérise par la production d’IL-6 (Interleukine-6) et d’IFN-α (Interféron
alpha) par les cellules épithéliales. L’existence de la protéine NS1, capable d’inhiber
20
l’activité de l’IFN-α, témoigne de l’importance de l’IFN-α dans la réponse immunitaire de
l’hôte.
La réponse cellulaire est initiée par les cellules T cytotoxiques CD8+, qui détectent
et lysent les cellules infectées. La première réponse des cellules cytotoxiques est détectable
dans le sang 6 à 14 jours après l’infection et disparaît vers le jour 21 (Cox et al., 2004b). La
spécificité des cellules CD8+ est dirigée principalement contre les protéines HA, NP, M et
PB2, qui possèdent des épitopes hautement conservés. Les cellules T CD4+, quant à elles,
lysent les cellules infectées de façon moins efficace que les cellules T CD8+ et facilitent la
réponse cellulaire et humorale (Karzon, 1996). Il est évident que la réponse cellulaire est
importante afin de contrôler l’infection, car elle permet de détruire les cellules infectées et
de produire un relâchement de cytokines.
De façon complémentaire, la réponse humorale permet de diminuer la charge virale
et de prévenir une deuxième infection. Cette réponse est menée par les anticorps secrétés
dans les muqueuses des voies respiratoires : les IgA, qui protègent principalement les voies
respiratoires supérieures ainsi que les IgM et les IgG qui neutralisent les antigènes dans les
voies respiratoires inférieures. Les principaux anticorps neutralisants IgM, IgG et IgA sont
dirigés contre la protéine HA et ils se trouvent dans le sérum des adultes après la première
semaine du début de l’infection. Les anticorps anti-HA jouent un rôle important dans la
neutralisation du virus et la prévention de la maladie. Ils sont un outil important qui permet
de mesurer la protection immunitaire (titre d’inhibition d’hémagglutination ≥ 40) contre le
virus de l’influenza. En effet, une telle réponse est détectée chez 80% des personnes ayant
été infectées par ce virus ou en post-vaccination (Couch et al., 1983).
1.7 A(H1N1)pdm09 : Première pandémie du XXIème siècle
Dans la dernière décennie, les épidémies d’influenza étaient majoritairement
causées par les virus A/H3N2, A/H1N1 et A/H1N2. Le virus pandémique de 2009 a été
identifié pour la première fois dans la petite ville de La Gloria, Vera Cruz, au Mexique en
avril 2009. Par la suite, deux cas de A(H1N1)pdm09 chez des enfants âgés de 9 et 10 ans
ont été identifiés en Californie aux États-Unis, ces deux cas ont nécessité une
21
hospitalisation suite à l’infection. Le 26 avril, 26 cas d’influenza causés par la souche
pandémique ont été recensés au Mexique, dont 7 décès. Dans les jours qui ont suivi, le
nombre de cas n’a cessé d’augmenter et des nombreux pays ont été touchés à travers le
monde.
Puisque
la
preuve
de
la
transmissibilité
humain-humain
de
la
souche
A(H1N1)pdm09 était plus que tangible, l’organisation mondiale de la santé (OMS) a
déclaré le 11 juin 2009 la première pandémie du XXIème siècle. Vers la fin de la pandémie,
en août 2010, la pandémie avait causé > 600 000 cas d’infection confirmés en laboratoire et
près de 4500 décès (Jayaraman et al., 2011). Le tableau 3 résume les principaux
évènements survenus lors de l’éclosion et de la propagation de la souche pandémique
A(H1N1)pdm09.
La particularité de la souche pandémique du 2009 est qu’elle a affecté
particulièrement les jeunes adultes qui sont normalement épargnés par les souches
saisonnières. En effet, il a été estimé que 90% des décès liés aux souches saisonnières sont
observés chez les personnes âgées de plus de 65 ans, alors que pendant la pandémie de
2009 seulement 14% de décès ont été observés pour le même groupe d’âge. Ce qui est
particulièrement surprenant est que 69% des décès ont été rapportés chez les adultes âgés
entre 25-64 ans (Fowlkes et al., 2011). Cette particularité a été décrite également dans la
pandémie de la grippe espagnole. Ainsi 99 % des décès sont survenus chez les personnes de
<65 ans et plus de la moitié entre 20 et 40 ans (Simonsen et al., 1998). La distribution d’âge
qui caractérise la pandémie de 2009, suggère qu’il existait, chez la population âgée, une
immunité partielle contre le virus pandémique (Rothberg et al., 2010).
Chez les femmes enceintes, les infections avec la souche pandémique ont été
particulièrement sévères durant le second et le troisième trimestre de grossesse (Jamieson et
al., 2009) (Lapinsky, 2010) et il a été estimé que plus du tiers de femmes enceinte infectées
par le virus A(H1N1)pdm09 aux États-Unis ont été hospitalisées (Satpathy et al., 2009).
De façon générale, la souche pandémique a touché principalement les jeunes enfants
âgés de moins d’un an, les adultes entre 25 et 64 ans, les femmes enceinte, les personnes
souffrant d’un surplus de poids (indice de poids corporel > 35) ainsi que les individus
22
atteints de maladies respiratoires et cardiaques sous-jacentes. Le taux de mortalité chez les
patients
hospitalisés
(Mashonganyika
et
ayant
al.,
été
2009).
infectés par le virus pandémique était de 16%
Contrairement
aux
souches saisonnières,
le virus
A(H1N1)pdm09 est capable de lier les récepteurs d’AS contenant des liens α 2-3 (en plus
de α 2-6) qui se trouvent principalement dans le tractus respiratoire inférieur, ce qui
explique pourquoi les personnes infectées par la souche pandémique présentent des
symptômes pulmonaires plus sévères qu’avec les souches saisonnières
(Childs et al.,
2009).
Tableau 3. Principaux évènements survenus lors de la pandémie A/H1N1 de 2009. Traduit de
Schnitzler et al., 2009.
23
Figure 8. Événements de cassure antigénique qui sont à l’origine de la souche A/H1N1pdm09.
Les huit gènes du virus pandémique proviennent de quatre virus différents de type A
(Trifonov et al., 2009b).
24
Une étude détaillée du génome du nouveau virus a permis de détecter une
recombinaison d’éléments génétiques provenant de quatre virus différents : un virus porcin
nord-américain, un virus aviaire nord-américain, un virus humain (H3N2) ainsi qu’un virus
porcin trouvé principalement en Europe et en Asie. Effectivement, au début des années 90
en Amérique du Nord circulaient trois souches différentes de virus de type A : H1N1
porcin, H3N2 humain saisonnier et un virus aviaire lesquels, suite aux événements de
réassortiment, sont à l’origine du triple réassortant A/H3N2 Nord-Américain. Par la suite ce
nouveau virus s’est réassorti avec un virus H1N1 porcin classique qui circulait de façon
saisonnière, créant le virus H3N2 porcin nord-américain, qui à son tour s’est réassorti avec
le virus de type A porcin provenant de l’Eurasie générant ainsi la souche pandémique
A/H1N1 (Nava et al., 2009) (Trifonov et al., 2009a). Un schéma qui explique l’origine de
la souche pandémique 2009 est présenté à la figure 8.
L’infection par le virus A(H1N1)pdm09 cause une maladie respiratoire caractérisée
par des symptômes similaires à ceux de l’infection saisonnière, tels la fièvre (94%), toux
(92%), congestion nasale (66%), maux de tête et douleur musculaire. Également, 25% des
personnes infectées souffrent en plus des nausées et de la diarrhée, ces symptômes ne
faisant pas partie des symptômes grippaux caractéristiques (Ong et al., 2009).
25
SECTION 2 : Traitement et prévention
1.8 Traitement et prévention
Le virus de l’Influenza cause des épidémies annuelles et environ trois pandémies
par cent ans causant des millions de décès chaque année et devenant ainsi la sixième cause
de décès au Canada (Stiver, 2003). Les constants changements antigéniques du virus posent
un défi de taille au sein de la communauté scientifique et des institutions de santé publique
lorsqu’il s’agit de prévenir et traiter l’infection.
À ce sujet, deux types d’intervention sont
disponibles : les vaccins et les antiviraux.
1.8.1 Vaccin
Le vaccin est un moyen de prévention très utile pour protéger les populations à
risque, soit les personnes âgées de ≥ 65 ans, les jeunes enfants (6 à 59 mois), les personnes
susceptibles de développer des complications suite à une infection d’influenza (asthme,
immunodéficience, immunosuppression, etc.) ainsi que les personnes qui fréquentent des
centres hospitaliers ou des personnes à risque. Deux vaccins ont fait leurs preuves en
démontrant une bonne efficacité et innocuité: le vaccin inactivé et le vaccin atténué. Ces
deux vaccins sont actuellement commercialisés et ils doivent être renouvelés chaque année
afin d’inclure les souches virales susceptibles de circuler dans la population.
1.8.1.1 Vaccin inactivé
Le vaccin saisonnier inactivé ou IV (Inactivated Vaccine) contient 15 µg de trois
antigènes provenant chacun d’un sous-type viral (A/H1N1, A/H3N2 et B). Le vaccin est
produit par la réplication des virus dans des œufs embryonnés de poule. Le liquide
allantoïque ou fœtal est récolté, concentré, purifié et par la suite inactivé avec la
formaldéhyde ou la β-propiolactone (Burnet, 1941). Chez les enfants et les jeunes adultes,
le vaccin semble avoir une efficacité de 60-80% (si l’appariement des souches est optimal),
ce qui n’est pas le cas pour les personnes âgées, pour qui le ratio d’efficacité varie entre 30
26
et 70% (Gross et al., 1995). Parmi les inconvénients associés à ce vaccin on compte le
temps de production du vaccin qui peut varier entre 3 et 6 mois, ce qui est suffisamment
long pour qu’une souche pandémique se propage à travers le monde. De plus, les souches
qui seront contenues dans le vaccin sont choisies 9 mois avant la saison grippale, ce qui
laisse suffisamment de temps aux souches virales de muter (glissement antigénique) et de
ne plus être reconnues par le système immunitaire stimulé par le vaccin. C’est également à
cause du glissement antigénique que le vaccin doit être changé à chaque année. Pour
terminer, le vaccin n’est pas administré aux personnes allergiques aux œufs, étant donné
que le vaccin, de par son mode de production, peut en contenir des traces. Une avenue
intéressante, afin de pallier au temps de production du vaccin et l’allergie aux œufs, serait
de produire le vaccin inactivé sur des cellules MDCK (Madin-Darby Canine Kidney),
réduisant ainsi la durée de production du vaccin (Halperin et al., 2002).
1.8.1.2 Vaccin atténué
Le but de produire un vaccin atténué ou CAV (Cold Attenuated Vaccine) est de
solliciter une réponse immunitaire humorale et cellulaire, qui mimerait de façon plus fidèle
la réponse immunitaire naturelle. Le vaccin atténué est administré par voie intranasale (0,25
mL dans chaque narine) sous forme d’aérosol. Le procédé de production du vaccin est
similaire à celui du vaccin inactivé dans ce sens qu’il est cultivé sur des œufs de poule
embryonnés. L’astuce du procédé consiste à produire un virus réassortant à partir d’un
virus sauvage et un virus atténué (à une température de 25o C), qui se caractérise par une
faible réplication aux températures chaudes comme celle qu’on retrouve dans le tractus
respiratoire inférieur. Le virus réassortant contient donc six segments du virus atténué
(PB1, PB2, PA, M, NP et NS) et les segments NA et HA du virus sauvage. Les virus
atténuées
utilisés
couramment
pour
la
production
de
ce
type de vaccin sont
A/Ann/Arbor/6/60 (H2N2) pour les virus de type A et B/Ann/Arbor/1/66 pour les virus de
type B (Cox et al., 2004a). Il est recommandé d’administrer le vaccin aux personnes âgées
entre 2 et 59 ans en bonne santé, toutefois des nombreuses précautions doivent être
considérées. Entre autres, il est contre-indiqué de vacciner les très jeunes enfants (réactions
asthmatiques), les personnes âgées (faible immunogénicité), les femmes enceintes, les
27
personnes ayant un système immunitaire affaibli ainsi que les personnes ayant des maladies
respiratoires (asthme) (Santé et services sociaux du Québec, 2011). Ceci représente un
souci de taille, si l’on considère que les populations les plus susceptibles d’avoir des
complications ne sont pas visées par ce vaccin. Bien que les inconvénients liés au vaccin
inactivé soient aussi associés au vaccin atténué, il est important de noter que l’efficacité de
ce dernier est supérieure que celle du IV, soit entre 78 et 100% dans les 8 mois suivant la
vaccination surtout chez les enfants et jeunes adultes (Mendelman et al., 2001) (Halloran et
al., 2000) (Belshe et al., 2000).
De nombreux vaccins très prometteurs sont à différents niveaux de développement.
C’est le cas d’un vaccin universel ciblant la protéine M2 qui est conservée chez toutes les
sous-types viraux, un vaccin utilisant des pseudo-particules virales exprimant les protéines
HA et NA ou en combinaison avec la protéine M1 ou M2 et enfin l’utilisation de vecteurs
(par exemple les adénovirus) comme moyen de livrer les antigènes.
1.8.2 Antiviraux
La majorité de la population n’a pas besoin d’un traitement contre l’influenza pour
guérir la maladie ou diminuer les risques des complications qui y sont associés. Toutefois,
les antiviraux représentent un bénéfice sûr pour les personnes qui risquent de développer
des complications suite à l’infection et ceux présentant d’emblée une maladie sévère.
Il
existe deux classes d’antiviraux : les adamantanes dont l’amantadine (Symmetrel©) et la
rimantadine (Flumadine©) ainsi que
les inhibiteurs de neuraminidase ou INAs dont
l’oseltamivir et le zanamivir connus sous le nom commercial de Tamiflu© et Relenza©,
respectivement. Les deux classes d’antiviraux différent principalement par leur mode
d’action, leur toxicité et leur pharmacocinétique (Abed et al., 2006). Une attention
particulière sera portée à cette section, car elle représente le cœur de ce projet.
28
1.8.2.1 Adamantanes
La première classe d’antiviraux développés pour le traitement des virus influenza
sont les adamantanes; l’amantadine (1-adamantamine hydrochloride) approuvée en 1967 et
la rimantadine (α-methyl-1-adamantaneme thylamine) approuvée en 1993. Ils inhibent
l’action du canal ionique M2, qui permet la libération du matériel génétique du virus dans
le cytoplasme de la cellule hôte lors de la réplication virale (voir section 1.2.5). Puisque les
virus de type B ne possèdent pas de protéine M2, les adamantanes sont efficaces seulement
contre les virus de type A. Les adamantanes sont associés aux effets secondaires
neurologiques tels l’insomnie, la confusion, les hallucinations et la dépression, entre autres.
Des nausées et des vomissements peuvent également apparaître suite à l’utilisation des
adamantanes (Jefferson et al., 2006).
Des études ont attribué une efficacité de 61% et de 71% à l’amantadine et à la
rimantadine, respectivement, pour prévenir les infections des virus A. Lorsque utilisés en
traitement, les adamantanes réduisent la fièvre d’environ une journée (Jefferson et al.,
2006). L’amantadine et la rimantadine sont administrés sous forme de tablettes ou de sirop
à une dose de 5 mg/kg pour les enfants et jusqu’à 200 mg une fois par jour chez les adultes
(Moscona, 2005a). Les concentrations maximales de la molécule dans le sang sont atteintes
2 h après l’administration de l’amantadine et 4 h après celle de la rimantadine. Les deux
molécules sont excrétées dans l’urine. La demi-vie de l’amantadine est de 15 h chez les
jeunes adultes, alors qu’elle double chez les personnes âgées. Pour la rimantadine la demivie est estimée à 30 h (Wood et al., 2000). Puisque l’amantadine possède une activité sur le
système nerveux central (il est utilisé pour traiter la maladie de Parkinson), ce n’est pas
surprenant de constater les effets secondaires de type neurologique suite à son utilisation
pour le traitement de l’influenza. La concentration d’amantadine qui inhibe 50% de la
population virale (valeur IC50) est de 0.1 to 0.4 g/ml. La molécule de l’amantadine exerce
son activité inhibitrice sur les résidus 22 à 46 de la protéine M2, qui sont impliqués dans le
transport de protons (Hay et al., 1985), alors que la rimantadine se lie plutôt aux résidus 18
à 60 (Figure 9). Les adamantanes ne sont pas actuellement recommandés pour l’utilisation
29
clinique à cause de la transmission globale des souches A/H3N2 et A(H1N1)pdm09
résistantes à cette classe d’antiviraux (voir section 1.10).
Figure 9. Sites de liaison de la rimantadine et de l'amantadine au canal ionique M2. Tiré de
Pielak et al., 2009.
1.8.2.2 Inhibiteurs de neuraminidase
À présent, les inhibiteurs de la neuraminidase (INAs) sont les seuls antiviraux
utilisés comme moyen de traitement et de prévention contre les virus influenza. De façon
générale, ces molécules présentent moins d'effets secondaires et de toxicité que les
adamantanes et, contrairement à ceux-ci, les INAs sont efficaces contre les virus de type A
et B. Deux molécules appartenant à cette classe d'antiviraux ont été approuvées pour
utilisation clinique par la FDA (Food and Drug Administration) depuis près de 12 ans: le
zanamivir commercialisée sous le nom de Relenza© par la compagnie GlaxoSmithKline et
l'oseltamivir ou Tamiflu© (Hoffman LaRoche). Une molécule en développement, le
peramivir, a obtenu son approbation pour utilisation clinique au Japon et en Corée du Sud,
alors qu’aux États-Unis son utilisation a été limitée à la durée de la pandémie 2009.
Les INAs miment l'acide sialique qui est reconnu sur la cellule hôte par la protéine
NA et leur structure est basée sur celle de la molécule DANA (2,3-dehydro-2-deoxy-Nacetylneuraminic acid) (Figure 10). Par
compétition avec l’AS, les antiviraux se lient au
30
site actif de la protéine NA de ce fait inhibent la libération des particules virales et ainsi
l'infection d'autres cellules cibles (Figure 11). Il est également connu que les INAs inhibent
le clivage de l'acide sialique des muqueuses, empêchant l'invasion de l'épithélium
respiratoire (Matrosovich et al., 2004b). Étant donné que la réplication virale atteint son
niveau le plus élevé entre 24 et 72 h après le début de symptômes, il est recommandé que
les antiviraux soient administrés dans les deux jours qui suivent le début de la maladie
(Aoki et al., 2003). L'utilisation des antiviraux n'affecte pas l'efficacité du vaccin inactivé,
contrairement au vaccin atténué. En effet, l'utilisation d'antiviraux est à proscrire pendant
les deux semaines qui suivent l'administration du vaccin atténué.
31
Figure 10. Comparaison entre les molécules des inhibiteurs de la neuraminidase et l'acide
sialique. Tiré et traduit de Ferraris et al., 2008.
32
Figure 11. Image en microscopie électronique des cellules MDCK infectées avec le virus de
l'influenza A. A) Assemblage et bourgeonnement normal du virus en absence des INAs
(inhibiteurs de neuraminidase). B) Agrégation de particules virales à la surface de la cellule
hôte en présence des INAs, qui occupent le site active de la protéine NA en inhibant le clivage
entre le protéine NA et le récepteur AS sur la cellule hôte. Barre = 1 µM (Gubareva et al.,
2000).
33
1.8.2.2.1 Zanamivir (Relenza©)
Le zanamivir (4-guanidino-Neu5Ac2en, GG167) est disponible sous forme de
poudre inhalable et la dose recommandée pour traitement est de 10 mg deux fois par jour
pendant 5 jours, alors qu'en prophylaxie il est recommandé d'utiliser 10 mg une fois par
jour pendant plus de 28 jours. Son utilisation réduit la durée des symptômes grippaux de 1
à 2,5 jours chez les adultes et les enfants âgées de >5 ans (Hayden et al., 2005) (Hayden et
al., 2006).
Le zanamivir est une molécule à fort caractère polaire, ce qui diminue
considérablement son absorption par l’organisme lorsqu’il est administré par voie orale
(2%) (Cass et al., 1999). Bien que par administration inhalable seulement 20% de la dose
initiale rejoint les poumons (la dose restante se dépose dans l’oropharynx), ceci semble être
largement suffisant pour combattre l’infection, car il a été estimé que cette dose représente
1000 fois la valeur de la IC50 (0.00064-0.0079 M) (Peng et al., 2000). Suite à
l’administration inhalée, la concentration maximale de l’antiviral (97 ug/L) est atteinte
après 2 h et elle a une demi-vie de 4 h (Cass et al., 1999). Finalement la molécule ne subit
pas de transformations dans l'organisme et est excrétée par l'urine. Puisque la molécule est
éliminée majoritairement par le rein, il est conseillé d’ajuster la dose pour les patients ayant
des défaillances rénales importantes.
L'utilisation
du
zanamivir
réduit
de
40%
la
fréquence
de
prescriptions
d'antibiotiques pour les complications du tract respiratoire inférieur (Hayden et al., 2005)
(Hayden et al., 2006) et il semble être plus efficace que l'oseltamivir contre les virus de
type B (valeur de la IC50 de 4.19 nM vs. 13 nM) (Sugaya et al., 2007). De plus son
utilisation est associée à une efficacité de 67% à 84% chez les adultes en santé. Un des
avantages remarquables à l’utilisation de cet antiviral est l’absence d’événements
indésirables lors des essais cliniques, ceci peut facilement s’expliquer par sa forme
d’administration (Keyser et al., 2000). Cependant, quelques cas de bronchospasmes ont été
associés à l’utilisation du médicament, pour la plupart survenant chez des individus
souffrant d’asthme.
L’utilisation clinique du zanamivir est limitée,
car son mode
34
administration est quelque peu complexe chez les jeunes enfants et les personnes âgées. À
cela s’ajoute l’absence du médicament ailleurs que dans le tractus respiratoire.
1.8.2.2.2 Oseltamivir (Tamiflu©)
L'oseltamivir (GS4071 ethyl ester, GS4104, Ro64-0769) est administré par voie
orale et il est disponible en capsule ou sous forme de poudre pour suspension liquide. La
dose recommandée pour le traitement est de 75 mg deux fois par jour pendant 5 jours et de
75 mg quotidiennement pendant 1 à 6 semaines en prophylaxie.
L'oseltamivir phosphate
est un ethyl-ester qui nécessite une hydrolyse du
groupement ester par des estérases qui se trouvent principalement dans le foie afin d'obtenir
une molécule active: l'oseltamivir carboxylate (Figure 12). L'oseltamivir phosphate est
absorbé rapidement par le système gastro-intestinal et il est éliminé (90%) par
transformation en oseltamivir carboxylate avec une demie vie de 1 à 3 h. Près de 75% de la
dose rejoint la circulation sanguine sous forme d'oseltamivir carboxylate, qui a une demie
vie de 6 à 10 h dans le sang. Pour terminer, la molécule active est éliminée à 80% par le
système rénal, alors que le 20% restant sera éliminé dans les fèces (He et al., 1999).
Des nombreuses études ont permis de déterminer que l'efficacité de l'antiviral (en
termes de réduction de la durée de l’épisode grippal) se situe entre 70 et 90% chez les
adultes en santé suivant un traitement ou une prophylaxie. En plus de son efficacité,
l'oseltamivir est bien toléré chez l'humain, bien que 10% des patients utilisant la molécule
présentent des nausées et des vomissements. De plus, l'oseltamivir carboxylate possède une
liaison très faible aux protéines (3%), ce qui est insuffisant pour causer des interactions
importantes avec d'autres médicaments (Lindegardh et al., 2006).
L'activité inhibitrice de la molécule est quantifiée par la valeur de la IC50
(concentration qui inhibe 50% de la population virale) qui est de 2.50 nM pour les virus
A/H1N1, de 0.96 nM pour les virus A/H3N2 et de 60 nM pour les virus B. (Genentech
35
USA, 2011). Bien que l'antiviral ne résulte pas en une amélioration très importante des
symptômes cliniques chez les adultes en santé (diminution de la maladie de 1 ou 2 jours),
l'oseltamivir
reste un moyen très efficace pour traiter et prévenir la maladie chez les
populations à haut risque en diminuant les complications associées à la grippe. À ce sujet,
l'administration d'oseltamivir est déconseillée chez les enfants âgés de moins d’un an et
pour certaines personnes présentant des pathologies particulières des ajustements de dose
sont parfois nécessaires.
Figure 12. Molécule d'oseltamivir sous la forme de prodrogue (oseltamivir phosphate) et sous
sa forme active (oseltamivir carboxylate). Adapté de Fick et al., 2007.
1.9 Résistance
Puisque l’efficacité clinique des traitements antiviraux est meilleure lorsqu’ils sont
administrés très tôt après le début des symptômes, il serait beaucoup plus avantageux s’ils
étaient disponibles en vente libre pour administration immédiate. Cependant, cette
possibilité est très dangereuse, car une large utilisation d’un antiviral peut créer une
pression sélective pour les virus contenant des mutations qui confèrent une résistance à
l’antiviral en question, le rendant inutilisable en traitement clinique.
36
La résistance aux adamantanes en est un exemple car la résistance virale a été
décrite 2 à 3 jours après le début du traitement. Les premiers cas de résistance aux
adamantanes ont été décrits en 2003 (<1% des isolats) et deux ans plus tard 100% des virus
A/H3N2 avaient développé un phénotype de résistance et leur utilisation clinique a été
déconseillée. La résistance aux adamantanes est associée à une substitution ponctuelle aux
a.a. 26, 27, 30, 31 et 34 de la protéine M2, principalement dans la région transmembranaire
de la protéine (Saito et al., 2003). La substitution d'une serine à la position 31 par une
asparagine (S31N) est la mutation identifiée communément dans les isolats cliniques
résistants aux adamantanes (Pielak et al., 2009). Les adamantanes ne sont pas utilisés pour
le contrôle de la souche pandémique, car cette dernière possède «naturellement» la
mutation S31N qui lui confère la résistance à cette classe d'antiviraux. Les souches
résistantes se répliquent bien in vitro et sont facilement transmissibles in vivo (Sweet et al.,
1991) (Abed et al., 2005).
Bien que les INAs soient moins permissifs à la sélection des virus résistants que les
adamantanes (Bright et al., 2005) (Zambon et al., 2001), la fréquence de résistance à
l’oseltamivir n’a cessé d’augmenter entre 2004 et 2009. Bien avant la mise en marché de
l’oseltamivir, des études ont prédit que la structure conformationnelle de la molécule
favoriserait le développement des virus résistants à l’antiviral, particulièrement pour les
virus A/H1N1. En effet, afin d’accueillir la chaîne latérale de la molécule d’oseltamivir, la
NA doit subir un ré-arrangement, créant ainsi une poche. Ce changement de la part de la
protéine NA n’est pas nécessaire pour la liaison du zanamivir (Figure 13, C) (Varghese et
al., 1998). Donc, des mutations dans un des acides aminés impliqués dans le réarrangement de la NA et la création de la poche (N294, R292, E276 et H274; numérotation
N2) diminuent la liaison à l’oseltamivir, conférant un phénotype de résistance à celui-ci et
non au zanamivir.
Les mutations reconnues pour causer la résistance à l’oseltamivir les plus
communes chez le sous-type N2 (E119V, R292K) et chez le sous-type N1 (N294S,
H275Y, qui est équivalent à H274Y dans la nomenclature N2) sont associées aux acides
aminés impliqués dans la liaison de l’oseltamivir et le ré-arrangement du site actif de la NA
37
(Figure 13, A et B). Il est important de noter que des mutations ponctuelles dans le site actif
de la HA peuvent également être associées à la résistance aux INAs, car ces deux protéines
sont fortement inter-reliées. Toutefois, seulement des mutations dans la NA ont été
identifiées dans les isolats cliniques résistants aux INAs.
Figure 13. Mécanisme d’action de l’oseltamivir et du zanamivir. Adapté et traduit de
Moscona, 2005b.
De façon générale, les mutations R292K et E119V sont associées le plus souvent au
virus A/H3N2 résistants à l'oseltamivir, alors que la mutation H274Y (H275Y en utilisant
la numérotation N1) est trouvée fréquemment chez les virus A/H1N1 résistants à
l'oseltamivir (Ives et al., 2002) et au peramivir (Baz et al., 2007). Chez les virus de type B,
la substitution D197N a été décrite comme conférant la résistance à l'oseltamivir chez un
patient immunosupprimé (Gubareva, 2004).
Les cas de résistance associés à l'utilisation du
zanamivir sont beaucoup plus rares que pour l'oseltamivir. Ainsi, In vitro, il a été possible
de caractériser la mutation E116G chez les virus de type B, suite aux passages cellulaires en
présence de l'antiviral. In vivo la mutation R150K a été isolée chez un jeune patient
immunosupprimé, ayant suivi un traitement prolongé au zanamivir (Gubareva et al., 1998).
38
Les cas de résistance associés au zanamivir sont moins nombreux que ceux associés
à l’oseltamivir. Deux raisons expliqueraient ce phénomène : 1- Comme il a été mentionné
précédemment, le zanamivir présente une structure quasi identique à celle de l’AS,
contrairement à l'oseltamivir et sa portion hydrophobe. On peut donc assumer que les
mutations empêchant la liaison du zanamivir dans le site actif de NA empêcheraient aussi la
liaison de l'AS et auraient donc un effet important sur la capacité de réplication de ces virus.
2- Par son mode d’administration simple, l’oseltamivir est devenu l’antiviral de choix,
lorsqu’il s’agit
de
traiter
et
prévenir les infections d’influenza,
augmentant ainsi
l’exposition de l’antiviral et la sélection de virus résistants.
Il est très important de noter que généralement, les mutations qui confèrent la
résistance aux INAs sont sous-type spécifique et inhibiteur spécifique. Par exemple, la
mutation la plus commune chez le sous-type N2, R292K, cause une diminution de la
sensibilité à l’oseltamivir de 1000 à 10000 fois, mais elle n’a jamais été isolée chez des
patients ayant été traités au zanamivir (Kiso et al., 2004). Au contraire, la mutation Q136K
cause une diminution de la sensibilité au zanamivir (300 fois) et du peramivir (70 fois),
mais elle ne confère pas de résistance à l’oseltamivir (Hurt et al., 2009b). Le tableau 4
résume les principales mutations conférant la résistance aux inhibiteurs de neuraminidase.
Avant l'utilisation clinique des INAs, les isolats d'influenza testés montraient une
sensibilité naturelle aux INAs (Ferraris et al., 2005). Lors des premières années d’utilisation
de l’oseltamivir, le taux de résistance se situait entre 0.4 et 1.0% chez les adultes (Monto et
al., 2006), et entre 4.0 et 18% chez les enfants (Kiso et al., 2004). Une étude de surveillance
des isolats d'influenza de l'hémisphère Nord durant la saison infectieuse 2007-8 en Europe
et aux USA a montré une augmentation de la fréquence des virus A/H1N1 saisonniers
résistants à l'oseltamivir (souche A/Brisbane/59/2007), pour la grande majorité associée à la
mutation H275Y. Fait inquiétant, un grand nombre de virus résistants à l'antiviral ont été
isolés chez des patients qui ne recevaient pas de traitement à l'oseltamivir et dans les pays
où le médicament était très peu utilisé, permettant de croire que leur émergence était
indépendante de l'utilisation de l'antiviral. Dans l'hémisphère sud, la fréquence de virus
résistants à l'oseltamivir a passé de <1 à >90% en moins de 12 mois. La transmission
39
globale de la souche résistante à l'oseltamivir a été confirmée la session hivernale suivante
(2008-9), au cours de laquelle 99 à 100% des isolats en Amérique du Nord étaient résistants
à l'oseltamivir ((Dharan et al., 2009).
Tableau 4. Principales mutations chez les virus influenza de type A et B conférant la
résistance aux inhibiteurs de la neuraminidase . Tiré et traduit de Pizzorno et al., 2011a.
40
La raison pour laquelle la souche résistante à l'oseltamivir possédait une capacité
réplicative supérieure à celle des virus sensibles n'est pas encore élucidée complétement,
mais il est possible que des mutations compensatrices au sein de la NA (V234M et R222Q)
soient en cause (Bloom et al., 2010) (Abed et al., 2011). La mutation H275Y cause une
réduction de la sensibilité à l'oseltamivir d'environ 400 fois ou plus si on la compare aux
virus sensibles (Baz et al., 2010). Elle confère également une réduction d’environ 130 fois
au peramivir, alors qu'elle n'a pas d'effet sur la sensibilité au zanamivir (Nguyen et al.,
2010b).
Les virus A/H1N1 saisonniers résistants à l'oseltamivir (H275Y) ont été remplacés
par la souche A(H1N1)pdm09, qui est naturellement sensible aux INAs. Cependant,
environ 1.5% des virus isolés à travers le monde se sont avérés résistants à l'oseltamivir et
possédaient la mutation H275Y. D'autres substitutions en a.a. ont été décrites comme
conférant un phénotype résistant chez la souche pandémique, entre autres les mutations
I223V/K/R (Nguyen et al., 2010a) (Eshaghi et al., 2011). Des nombreuses études in vitro
et in vivo suggèrent que la souche pandémique A/H1N1 portant la mutation H275Y possède
une capacité réplicative et une transmissibilité inférieures ou équivalentes à celle de la
souche sensible à l'oseltamivir (Hamelin et al., 2010a) (Brookes et al., 2011) (Duan et al.,
2010). La transmission inter-humaine de la souche portant la mutation H275Y est jusqu'à
aujourd'hui plutôt rare (Moore et al., 2011). Cependant, il a été rapporté que 16% des
souches isolées dans une communauté en Australie possédaient la mutation H275Y et
étaient résistantes à l’oseltamivir (valeur de la IC50 513 fois plus élevée). Fait étonnant, ces
souches avaient une similitude en a.a. de 99-100% pour la HA et de 99,6-100% pour la NA,
ce qui suggère la transmission d’un seul variant (Hurt et al., 2011).
Donc, il est très important de continuer de surveiller de près l'évolution de la
résistance des virus influenza aux antiviraux étant donné le choix limité d'antiviraux
disponibles pour traiter et prévenir l'infection ainsi que le phénomène antérieur de
résistance à l'oseltamivir observé lors de la saison grippale 2007-8.
Étant donné
l'importance de l'impact de la résistance des virus de l'influenza aux antiviraux, ce sujet sera
abordé dans le cadre de mon projet de maîtrise.
41
1.10 Antiviraux en développement
Le principal inconvénient associé à l’utilisation/ des antiviraux est l’apparition de
souches résistantes. En effet, la forte incidence de développement de résistance aux
adamantanes par le passé a obligé les instituts de santé publique à déconseiller leur
utilisation clinique.
Puisque seulement l’oseltamivir et le zanamivir sont approuvés
présentement pour utilisation clinique et que des cas de résistance à l’oseltamivir sont très
bien documentés, il est urgent de développer des nouveaux antiviraux. Le tableau 5
présente les principaux antiviraux à l’étude contre les virus influenza ainsi que leur niveau
de développement.
La résistance à l'oseltamivir fait du zanamivir la meilleure alternative pour traiter les
patients infectés par des virus résistants à l'oseltamivir. Toutefois, nombreux sont les
patients dont l'administration conventionnelle par inhalation est problématique. C'est
pourquoi
l'administration
du
zanamivir
intraveineux
est
à
l'étude.
Cette
voie
d'administration semble être prometteuse, car un cas récent d'une femme immunosupprimée
qui ne répondait pas au traitement à l'oseltamivir a démontré une amélioration de son état
de santé suite au traitement avec le zanamivir intraveineux (Kidd et al., 2009). Un cas
similaire a
été rapporté, cette fois-ci chez une jeune fille infectée avec la souche
A(H1N1)pdm09 résistante à l'oseltamivir (Gaur et al., 2010).
Un des médicaments les plus prometteurs à ce jour est le peramivir (BCX-1812,
RWJ-270201). Le peramivir est un INA qui a démontré une efficacité in vitro et chez les
modèles animaux contre les virus influenza de type A et B (Babu et al., 2000) (Bantia et al.,
2001) (Drusano et al., 2001) (Smee et al., 2001). Des études cliniques de phase III ont
prouvé l’innocuité de la molécule (dose orale: 800 mg/jour), toutefois aucune diminution
significative de la durée des symptômes n’a été observée (Barroso et al., 2005b). Ceci
s’explique par la faible biodisponibilité (<3%) du peramivir lorsqu’il est administré par la
voie orale chez l’humain. Afin de pallier à ce problème, deux voies d’administration ont été
suggérées : intramusculaire et intraveineuse. Seule une dose de 300 ou 600 mg/ jour par
42
voie intraveineuse a démontré une réduction de la durée des symptômes comparable à celle
de l’oseltamivir (Kohno et al., 2010) (Barroso et al., 2005a) (Hernandez et al., 2011).
Le 23 octobre 2009, suite à la pandémie d’influenza A/H1N1, la FDA a autorisé
l’administration du peramivir intraveineux (600mg / jour, pendant 5 à 10 jours) afin de
traiter les adultes et enfants infectés avec la souche A(H1N1)pdm09 et qui ne répondaient
pas aux antiviraux disponibles (Hollister et al., 2009). Plus récemment, le Japon a approuvé
la commercialisation du peramivir. De façon générale, les virus qui possèdent la mutation
H275Y sont moins sensibles au peramivir. Il
a été estimé que la mutation conférant la
résistance à l'oseltamivir, H275Y, réduisait la sensibilité à l'oseltamivir de 400 fois et de
130 fois au peramivir (Hurt et al., 2009a). Malheureusement, un cas de résistance au
peramivir intraveineux, associé à la mutation H275Y, a déjà été rapporté chez un patient
immunosupprimé traité avec l’antiviral (Memoli et al., 2010a). Néanmoins, en raison de
son excellente pharmacocinétique, le peramivir parentéral (intramusculaire ou intraveineux)
conserve une certaine activité contre la souche H275Y (Abed et al., 2010).
Un autre INA à l'étude est la molécule CS-8958 ou laninamivir, qui possède une
structure semblable à celle du zanamivir tout en ayant une demi-vie plus longue. Il a été
démontré que la molécule est efficace contre la souche A(H1N1)pdm09 tant in vitro que in
vivo (Itoh et al., 2009). Une étude de phase III effectuée sur une cohorte de 1000 patients, a
démontré qu'une seule dose de la molécule est suffisante pour obtenir une efficacité
comparable à celle obtenue avec l'oseltamivir (Kohno et al., 2011).
La molécule T-705 (favipiravir, Toyama Chemical) est un composé hétérocyclique
qui inhibe l'action de l'ARN polymérase virale. Son action antivirale est diminuée lorsqu’il
est en présence d’un excès de certaines purines (adénine, guanine et hypoxantine),
suggérant que le favipiravir agit comme un analogue des nucléotides (purines) (Furuta et
al., 2005). Des études in vitro et in vivo ont démontré l'efficacité du favipiravir contre les
virus influenza (Smee et al., 2009) (Takahashi et al., 2003). Néanmoins, les données
recueillies pour la molécule ne sont pas encore complètes et des études supplémentaires
doivent être effectuées. D'ailleurs, des études cliniques de phase II et III sont envisagées
43
aux États-Unis et en Japon. Cette molécule est fortement attirante, car elle est plus sélective
que d'autres molécules de sa famille, ce qui lui confère une faible toxicité chez l'humain
(Furuta et al., 2005). De plus, des passages successifs du virus en présence de l'antiviral en
culture cellulaire n'ont pas engendré le développement de virus résistants (Furuta et al.,
2002).
D'autres molécules très prometteuses sont encore au stade expérimental, entre autres
la molécule DAS181 qui a un mode d'action unique: la molécule est une sialidase qui clive
les acides sialiques sur la surface des cellules hôtes les rendant inaccessibles à l'attachement
des particules virales.
Bien que chacune des molécules mentionnées précédemment démontre une
efficacité contre les virus influenza, leur activité combinée pourrait résulter en un effet
additif ou synergique. C'est pourquoi de nombreuses combinaisons d'antiviraux et
d’immunomodulateurs sont présentement à l'étude.
Tableau 5. Molécules en développement contre le s virus influenza. Traduit de Boltz et al.,
2010.
44
CHAPITRE II : HYPOTHÈSES ET OBJECTIFS
2.1 Hypothèse
La capacité réplicative du virus influenza pandémique de 2009, A(H1N1)pdm09, est
diminuée par la mutation H275Y de la neuraminidase qui confère la résistance à
l’oseltamivir.
2.2 Objectifs
 Étudier l’impact de la mutation H275Y sur la capacité réplicative de la
souche pandémique A/H1N1 par une étude de compétition in vitro et in vivo
de la souche sauvage (H275) et de la souche mutante (275Y).
 Comparer l’efficacité du modèle de compétition à celui utilisant des
populations virales pures.
 Tenter de prédire le comportement de la souche pandémique résistante à
l’oseltamivir (H275Y) dans les futures saisons grippales.
 Déterminer les paramètres de la réplication virale de la souche pandémique
résistante à l’oseltamivir (275Y)
et de la souche sauvage (H275) par une
modélisation mathématique afin de caractériser le comportement de la
souche pandémique A/H1N1.
 Comparer les paramètres de la réplication virale de la souche pandémique
avec ceux obtenus pour la souche saisonnière A/Brisbane/59/2007 (H1N1).
 Étudier la présence et la possible transmission de la mutation H275Y dans
des isolats cliniques d’un enfant immunosupprimé et un cas possible de
transmission familiale.
45
CHAPITRE III : ARTICLE I
The H275Y neuraminidase mutation of the pandemic A/H1N1 virus lengthens the
eclipse phase and reduces viral output of infected cells compromising fitness in vitro
and in ferrets
Lady Tatiana Pinilla1†, Benjamin P. Holder
A.A. Beauchemin2*
1
2†
, Yacine Abed1 , Guy Boivin1* and Catherine
Infectious Disease Research Centre, CHUQ–CHUL and Laval University, Québec, QC,
Canada
2
†
Department of Physics, Ryerson University, Toronto, ON, Canada
LTP and BPH contributed equally to this study
* E-mail: Corresponding authors
[email protected] and [email protected]
Soumis à la revue scientifique Journal of Virology (JVI) le 21 avril 2012
Manuscrit no. JVI07244-11R1
Nombre de mots dans le résumé: 146
Nombre de mots dans le texte: 5750
46
3.1 Abstract
The H275Y amino acid substitution of the neuraminidase (NA) gene is the most
common mutation conferring oseltamivir resistance in the N1 subtype of influenza. Using a
mathematical model to analyze a set of in vitro experiments that allow for the full
characterization of the viral replication cycle, we show that the primary effects of the
H275Y substitution on the pandemic H1N1 (H1N1pdm09) strain are to lengthen the mean
eclipse phase of infected cells (from 6.6 h to 9.1h) and decrease (by 7-fold) the viral burst
size, i.e., the total number of virions produced per cell. We also find, however, that the
infectious unit to particle ratio of the H275Y mutant strain is 12-fold higher than that of the
oseltamivir-susceptible strain. In ferrets, however, the mutant strain suffers a crucial delay
in its infection of the respiratory tract which allows the susceptible strain to dominate
mixed-strain infections.
47
3.2 Résumé
La substitution H275Y dans le gène de la neuraminidase (NA) est la mutation la
plus commune conférant une résistance à l'oseltamivir chez le sous-type N1. En utilisant un
modèle mathématique pour analyser un ensemble d'expériences in vitro qui permettent la
caractérisation complète du cycle de réplication virale, nous avons montré que les effets de
la substitution H275Y dans la souche A(H1N1)pdm09 sont d'allonger le temps d’éclipse
des cellules infectées (de 6,6 h à 9.1h) et de diminuer (par 7 fois) le rendement de
production virale, soit le nombre total de virions produits par cellule. Cependant nous avons
trouvé, que le nombre d’unités infectieuses par particule virale de la souche mutante
H275Y est 12 fois supérieur à celui de la souche sensible à l'oseltamivir. Chez les furets la
souche mutante souffre d'un retard important dans l’infection des voies respiratoires qui
permet à la souche sensible de mieux se répliquer.
48
3.3 Introduction
In 2009, the World Health Organization (WHO) declared the first influenza
pandemic of this century and described the virus (H1N1pdm09) as naturally resistant to
adamantanes, but susceptible to the neuraminidase (NA) inhibitors oseltamivir and
zanamivir [9, 30]. In the past two-and-a-half years, isolated cases of oseltamivir-resistance
in H1N1pdm09 strains have been reported — almost always associated to the H275Y
mutation within the NA gene — but the overall level of resistance has remained relatively
low [43]: ∼1% in the United States [47], <1% in Canada [41], ∼2.5% in Europe [15, 28]
and <1.6% worldwide [28]. In the United States, the fraction of cases of resistance not
associated to oseltamivir exposure increased significantly from 11% in the 2009–2010
season to 75% in 2010-2011 [47]. A few small clusters of oseltamivir-resistance cases, not
associated to treatment and likely involving transmission of H1N1pdm09 mutant strains,
have been reported in Europe [23, 33], Australia [10, 16] and Vietnam [35]. The pandemic
strain completely displaced the prior seasonal H1N1 strain (A/Brisbane/59/2007) which, in
the 2008–2009 season, was nearly 100% resistant to oseltamivir [11, 21]. That dominance
of an oseltamivir-resistant H275Y mutant strain was surprising at the time because it had
been shown that the mutation usually compromised strain fitness [31]. A return to
widespread oseltamivir-resistance, with a mutated H1N1pdm09, could have significant
public health consequences [22].
Experiments on cell cultures and in animal models are widely used to predict the
potential of an influenza strain to circulate throughout the human population, particularly in
relation to oseltamivir resistance. Prior to 2007, experiments demonstrated strongly
attenuated growth of H275Y mutant strains of H1N1 in vitro [1, 24, 49], a higher viral titer
inoculum required for the infection of ferrets [24, 31], and generally less pathogenic
infections in ferrets, quantified by reduced fevers and smaller inflammatory cell counts in
nasal washes [31]. This mirrored the seasonal epidemic situation at the time, in which
oseltamivir-resistance emerged almost exclusively under drug-pressure and in immunocompromised patients [3]. Thus, the subsequent dominance of the A/Brisbane/59/2007
(H1N1) H275Y strain in 2007–2008 and 2008–2009 came as a surprise. Since its
emergence, however, the strain was found to have equivalent or greater replication capacity
49
in vitro than its susceptible counterpart [5] and produce comparable infections in ferrets
[29, 36]. Transmission experiments have not demonstrated a difference in efficiency
between the susceptible and resistant strains [2, 29]. Moreover, in vitro studies determined
that the fitness of this particular mutant strain was likely associated to its prior acquisition
(between 1999 and 2006) of permissive mutations of the NA gene, which increased both
levels of the activity and surface expression of NA [6]. The reversion of one such
permissive mutation, R222Q, in the A/Brisbane/59/2007 NA was found to reduce viral
production in infected ferrets [2].
Laboratory characterization of the effect of the H275Y mutation in the H1N1pdm09
background has yielded mixed conclusions. Unlike pre-2007 seasonal H1N1 strains, the
growth of the H1N1pdm09
H275Y mutant (H1N1pdm09-MUT) is not severely
compromised in vitro or in ferrets [8, 12, 18, 32]. Contact transmissions of H1N1pdm09MUT between ferrets have been successful in all experiments reported [18, 19, 36, 39, 45].
The results concerning airborne transmission, however, have been mixed, with some
studies finding comparable [45, 46] or non-significant differences [12] in efficiency and
others finding that H1N1pdm09-MUT transmitted less efficiently [19] (p=0.04 [17]) or
suffered a delay with respect to the susceptible strain [32]. Concise reviews of this prior
work can be found elsewhere [7, 28, 43]. Thus, although circulation of H1N1pdm09-MUT
is currently limited, current laboratory evidence does not necessarily prohibit its emergence
and wide distribution.
In this report, we make two contributions to the problem of predicting H1N1pdm09
strain fitness from laboratory experiments. First, we introduce a method to fully quantify
the basic components of the viral replication cycle (e.g., the length of eclipse phase and the
viral infectivity). By considering a set of complementary experiments which highlight
different aspects of viral replication, we are able to extract values for each quantitative
measure with narrow confidence intervals, using a mathematical model. This new
quantitative characterization replaces generic, experiment-specific, descriptions of strain
replication (e.g.,
“attenuated
growth”,
“reduced
fitness
in
vitro”) with meaningful
fundamental quantities representing the interaction of the virus with cells. We apply this
method to translate subtle differences in the observed in vitro virus dynamics of
H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT into reliable quantitative estimates of the
50
differences in replication induced by the H275Y mutation in the current genetic
background. We also characterize the effect of this mutation in the A/Brisbane/59/2007
(H1N1) strain background, and perform a comparative analysis.
Second, we assess the relative replication capacity of the two H1N1pdm09 strains
by performing competitive mixed-infection experiments in vitro and in ferrets. While an
infection with a pure inoculum demonstrates how each strain fares individually in separate
hosts, a competitive infection with a mixed inoculum reveals which of the two strains
would overtake the other when infecting the same host, while competing over a shared pool
of susceptible cells. Our model correctly predicts the dynamics of H1N1pdm09 mixed
infections in vitro, without any additional assumptions or parameters, verifying the
effectiveness of our method in characterizing each strain and predicting the outcome of
their interactions. Mixed infections of ferrets show a clear replicative advantage for the
susceptible
strain.
Together
with
prior
results
showing
equivalent
or
potentially
compromised transmission [12, 19, 32, 45], these results suggest that H1N1pdm09-MUT,
with its current genetic background, will remain at a low level in the human population.
3.4 Materials and Methods
3.4.1 Ethics Statement
All procedures were approved by the Institutional Animal Care Committee at Laval
University according to the guidelines of the Canadian Council on Animal Care (Permit
number: 2011055-1).
3.4.2 Viruses
The wild-type pandemic-H1N1 influenza strain (H1N1pdm09-WT) used for all
experiments — except those performed for confirmation of the analysis — was the first to
be isolated in Québec City, Canada (A/Québec/144147/09); its NA-H275Y mutant
(H1N1pdm09-MUT) differs from the WT by only a single nucleotide in the neuraminidase
gene. Recombinant H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT viruses were rescued by
51
reverse genetics as described previously [40]. The natural isolates of H1N1pdm09 used to
confirm the analysis of the recombinant strains were recovered from a boy (WT,
A/Québec/147023/09) and his father (MUT, A/Québec/147365/09) who had been placed on
oseltamivir prophylaxis, and have been described previously [4]. The A/Brisbane/59/2007like WT and MUT H1N1 strains are also each natural isolates (A/Québec/15230/08 and
A/Québec/15349/08, respectively), described previously [27].
The exponential rate of viral infectivity loss, c, was determined for each
H1N1pdm09 strain by a mock infection assay (Figure 1). Known titers of H1N1pdm09-WT
and H1N1pdm09-MUT viruses were incubated in separate wells with maintenance medium
(but without cells) at 37°C in 5% CO2 ; experiments (performed in triplicate) were
terminated at 24, 48 and 72h to determine the remaining infectious titer. The fitted decay
rates were found to be identical for the two strains, c = 0.13 h-1 (95%CI: [0.11,0.15]),
corresponding to a virion infectivity half-life of 5.2h.
3.4.3 In vitro replication experiments
For both multiple-cycle (MC) and single-cycle (SC) viral yield experiments,
ST6GalI-transfected Madin-Darby Canine Kidney (MDCKα2,6) cells were used, which
over-express α-2,6 sialic acid receptors [20]. For the SC experiment, confluent cells in 12well plates were infected with an inoculum of 4×10 6 PFU, representing a multiplicity of
infection (MOI) of 4. Supernatants were harvested every hour for the first 10h and then
every 2–3h until 18h post-infection. For the MC experiment, cells were infected with
50PFU (MOI=5×10−5 ) of pure H1N1pdm09-WT or H1N1pdm09-MUT recombinants [40],
or one of three mixtures: WT:MUT = 80:20, 20:80, or 50:50%. Supernatants were collected
every 12h until 72h post-infection in three independent experiments with three replicates
each. Additional time points were obtained in triplicate for the pure population MC
experiments. Supernatants were stored at −80°C until their use for RNA isolations, realtime RT-PCR and/or for viral titration by standard plaque assay on MDCKα2,6 cells.
52
3.4.4 RNA extraction
Total RNA was isolated from 200L of each thawed specimen or culture using the
robotic MagNA Pure instrument and the MagNA Pure LC total nucleic acid isolation kit
(Roche Applied Science, Mannheim, Germany), according to manufacturer’s instructions,
with a total elution volume of 50L. Isolated RNA was stored at −80°C.
3.4.5 NA gene H275Y discriminatory real-time RT-PCR assay
To discriminate between WT and oseltamivir-resistant strains of H1N1pdm09, a
modified version of a real-time RT-PCR method reported by van der Vries et. al. [48], was
'
'
used. This technique requires a reverse (panN1-H275-sense 5 -cagtcgaaatgaatgcccctaa-3 )
'
'
and a forward (panN1-H275-antisense 5 -tgcacacacatgtgatttcactag-3 ) primer for both the
'
WT and the H275Y viruses and two labeled allele-specific probes: panN1-275H-probe 5 ttaTCActAtgAggaatga-6-FAM/BHQ-1 and panN1-275Y-probe 5'-ttaTTActAtgAggaatgaHEX/BHQ-1. The discrimination properties of specific probes are due to Locked Nucleic
Acids (LNA) which contain the SNP of interest at the 5' end and increase melting
temperatures, thus allowing the probe to be shorter with increased discriminatory
capacities. The limit of detection is 50 copies for the mutant (H275Y) target and 10–50
copies for the WT target.
The one-step RT-PCR mix was performed in a 25L reaction volume containing
6.25L of Taqman Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, Foster city,
Canada), 0.8L of both the reverse and the forward primers, 1.0L of each probe and
4.0L RNA extract. The amplification process was performed in a Light Cycler 480 realtime thermocycler (Roche, Germany) with the following cycling conditions: 60°C for
30min (reverse transcription), 95°C for 5min (DNA polymerase activation), followed by 45
cycles of 95°C for 20s (denaturation) and 62°C for 1min (annealing). One reaction was
performed for each sample using the WT and the H275Y probes and the common reverse
53
and forward primers. Data acquisition was performed in both FAM and HEX filters during
the annealing/extension step.
3.4.6 Ferret experiments
Four groups of 4 male ferrets (1000 g)(Triple F Farms, Sayre, PA), housed in
individual cages, were anesthetized by isoflurane and received, by intranasal instillation,
250L (125L /nare) of PBS containing 106 PFU of H1N1pdm09-WT or H1N1pdm09MUT as a pure population, or a mixture of the two (WT:MUT=20:80 or 50:50%). Ferrets
were monitored daily for body weight, temperature and signs of morbidity. Nasal wash
samples were collected every 12h until 72h post-infection, and subsequently on a daily
basis until 7 days post-infection, by instillation of 5 mL of PBS into the external naris of
the animals. Samples were stored at −80°C until their use for RNA isolation and real-time
RT-PCR or for viral titration by standard plaque assay in MDCKα2,6 cells. Serum samples
were collected from each ferret before intranasal infection and on Day 14 to evaluate
specific antibody levels against H1N1pdm09 using standard hemagglutination inhibition
(HI) assays. The animal procedures were conducted at biocontainment level 2+ in
accordance
with
the
animal experimentation
guidelines of the Centre Hospitalier
Universitaire de Québec.
3.4.7 Mathematical model
Viral yield experiments (SC and MC) were simulated using the following multicompartment ordinary differential equation (ODE) model,
54
which describes the infection of a population of N susceptible target cells (T)
at a rate (βVPFU ) proportional to the concentration of infectious virions (VPFU ). Newly
infected cells first undergo an eclipse phase (E) of average duration τE before becoming
infectious (I) and producing virus at a constant rate p for an average time of τI . The two
variables VPFU and VRNA represent the infectious (PFU/mL) and total (RNA copies/mL)
virus concentrations, whose kinetics are controlled by the production rate of virus (p in
RNA copies/mL), the conversion factor between virus produced and virus observed by
titration (ϱ in PFU/RNA copies), the rate at which infectious virus lose infectivity (c), and a
rate of virus particle loss (cR). The quoted production rate per cell, pRNA , is equal to p
times the supernatant volume (0.5mL) divided by the number of cells in the culture
(106).
In previous work, we have shown that the assumption that cells spend an
exponentially-distributed amount of time in the eclipse or infectious phase — implicit to
55
the simpler, nI=nE =1, ODE models — is unrealistic [25, 26]. This is because exponentiallydistributed durations for these phases imply that cells can immediately begin viral
production upon infection, can cease viral production immediately after it is initiated and
can produce virus indefinitely. To impose more biologically-realistic conditions on the time
spent by a cell in the infected phases, we sub-divided each phase using n (or n ) equations,
E
such that these times are gamma-distributed with a mean of τ
E
deviation of σ =τ /
E
E
,n (or σ =τ /
E
I
I
I
(or τ ) and a standard
I
,n ).
I
When simulating competitive mixed-infection experiments, the infection of target
cells was determined by
where VWT,PFU and VMUT,PFU are the concentrations of the WT and H275Y mutant
strains, respectively, and different rate constants, β, were assumed for infection by each
strain. By prohibiting the co-infection of cells, two parallel instances of the remaining
equations in (1), one for each strain, were used to completely describe the dynamics.
To determine the in vitro infectivity of a particular strain, we used the infecting
time, tinfect=
,2/(ϱpβ), which is the amount of time required for a single infectious cell to
cause the latent infection of one more, within a completely susceptible population [27].
Strains with a shorter infecting time have a higher infectivity. The basic reproductive
number, R0, defined as the number of secondarily-infected cells by a single infectious cell
in a completely susceptible population, was calculated numerically for each set of extracted
parameter values. Best-fit values and the statistics of derived quantities — including the
RNA viral burst size, b=pRNA ×τ I, and the infectious units per particle, R0/b — were
calculated using the other extracted parameter values for each fit.
A number of parameter values were fixed in all simulations. The rate at which
infectious
H1N1pdm09-WT
and
H1N1pdm09-MUT
virions
lose
infectivity
was
determined independently in mock infection experiments (above), and was fixed to the
value c = 0.13 h-1 . Sensitivity analysis of the model (not shown) showed that the standard
56
deviation of the infectious lifespan was not identifiable. We therefore fixed nI=100 (σI=4h
when τI =40h). A constant delay of virus production for cells infected in the simulated
inoculation period (1h prior to t=0) was required for the simulation of MC experiments; this
was fixed for both strains to 12.3h. Finally, the production rate of infectious virus in
simulations of the SC experiment was allowed to differ from that of the MC experiment,
and was effectively fixed by the normalization of the SC experimental data to unity. This
normalization was necessary to avoid the confounding effects of defective interfering
particles which can cause highly variable virus levels for high-MOI infections [27, 37].
3.4.8 Regression and statistics
Nonlinear least-squares regression of the model to the SC and MC viral yield data
sets simultaneously was performed using the Octave 3.2.4 [13] implementation of the
Levenberg-Marquardt algorithm, leasqr. In this analysis, parameter values were assumed
to be the same for the two experiments but initial conditions were adjusted to reflect the
experimental preparations: the one-hour experimental infection of cells (which produced an
MOI of 4 for the SC and 50/106 for the MC) was numerically simulated such that the
desired MOI and a small residual amount of virus were present at t=0. Fit residuals were
sampled with replacement (within each experiment type) to produce 1000 bootstrap
replicates of the data sets [14], from which 95% confidence intervals were determined for
the extracted parameter values. The significance level (p-value) for the difference in
estimated parameter values between the two strains (WT and MUT) was determined by a
two-sided Z-test, with variance values taken from the bootstrap-derived parameter values.
Specifically, for a particular parameter Θ (e.g., the mean eclipse phase, τE ), the test statistic
with variance values σ2,WT and σ2,MUT calculated directly from the bootstrapderived values for the WT and MUT strains, was assumed to have standard normal form.
When the distributions of bootstrap values for each strain were better described as
57
lognormal (i.e., for the mean eclipse phase, the production rate per cell, the viral burst size,
the basic reproductive number and the ratio of infectious units per particle), the above
analysis was performed on the log of the parameter instead.
3.5 Results
3.5.1 Quantification of the H1N1pdm09 replication cycle in vitro
The method we introduce here enables the independent quantification of each of the
fundamental phases of viral replication within a cell: infection, a period of eclipse (latent
infection), virus production and virus-induced cell death. This is achieved by analyzing
parallel single-cycle (SC) and multiple-cycle (MC) viral yield experiments, performed for
each H1N1pdm09 strain (H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT) under identical
experimental conditions (see Materials and Methods). The SC experiment, in which the cell
culture is infected with a high inoculum (MOI > 1), allows for the characterization of the
eclipse phase due to the synchronized infection of nearly all cells [25]. The MC experiment,
in which the cell culture is infected at a much lower inoculum (MOI ≪ 1), provides a
complementary picture, highlighting the progressive consumption of susceptible cells
through an exponential increase of virus. We fitted the mathematical model to the SC and
MC data sets simultaneously (Figure 2A) and determined values for the relevant viral
kinetics parameters for each H1N1pdm09 strain (Table 1 and Figure 2B).
The H275Y amino acid substitution caused a significant change in a number of
quantitative measures of the infection cycle. The mean eclipse phase for H1N1pdm09MUT was significantly longer (9.1 h vs. 6.6 h for H1N1pdm09-WT, p=0.013) and the viral
production rate per MDCKα2,6 cell was significantly reduced (from 2200 to 370 RNA
copies/h, p=0.004). The difference in the eclipse phase can be seen directly in the SC data,
as a longer delay of H1N1pdm09-MUT viral titer growth. The ratio of the production rates
can also be approximately determined directly from the data, by taking the ratio of the peak
RNA virus levels in the MC experiment (this follows by setting dVRNA/dt=0 in Equation
(1), assuming that the WT and MUT values of cR are approximately equal — their fitted
values were 0.07 and 0.08 h-1 respectively — and assuming that all cells are infectious at
the time of viral peak). In the MC experiment (Figure 2A, bottom), this ratio was ∼6,
58
matching the ratio of viral production rates determined above. The higher viral production
rate of H1N1pdm09-WT is an important fact to consider when analyzing the competitive
mixed-infection results, presented below.
The average infectious lifespan of an MDCKα2,6 cell (the amount of time for which
it produces virus) approximately determines the width of the MC viral titer (PFU) curve
and the length of its plateau (seen in the PFU data between 42 h and 72 h) where virus
production is balanced by the loss of virion infectivity. We determined infectious cell
lifespans of 49 h for H1N1pdm09-WT and 41 h for H1N1pdm09-MUT (p=0.24).
Additionally, by multiplying the infectious lifespan by the viral production rate per cell, we
can obtain the viral burst size for each strain, i.e., the total number of virions produced by
an infected cell. The burst size was found to be significantly larger for H1N1pdm09-WT
(1.1×105 vs. 1.5×104 RNA copies, p=0.001).
We quantified the infectivity of a virus strain by its infecting time, which is defined
as the amount of time required for a single infectious cell to cause the infection of one more
in a completely susceptible population (see Materials and Methods). This measure therefore
depends both on the rate at which virions are produced by cells and the relative infectivity
of these virions. The estimated infecting times were 31min for H1N1pdm09-WT and 22min
for H1N1pdm09-MUT (p=0.35). To estimate the infectious proportion of virions produced
by each strain, we numerically calculated the basic reproductive number, which is defined
as the number of secondary infections caused by a single infectious cell. The number of
infectious units per RNA particle is therefore equal to the basic reproductive number
divided by the viral burst size. Like the infecting time, the basic reproductive number was
not significantly different for the two strains. We found, however, that the infectious unit to
particle ratio was 12 times higher (p=0.031) for H1N1pdm09-MUT.
To verify that our findings generalized to other H1N1pdm09 backgrounds, we
reproduced the SC and MC viral yield experiments with a WT-MUT strain pair of
H1N1pdm09 natural isolates (Figure 3). A good fit to the data from the pair of natural
isolates was obtained using the key parameter values determined for the recombinant pair.
This serves as both a qualitative and quantitative confirmation of the effect of the H275Y
mutation on the replication kinetics of H1N1pdm09, presented above.
59
3.5.2
Comparative
A/Brisbane/59/2007
analysis
to
seasonal
strain
Having determined the effect of the H275Y mutation on the infection kinetics
parameters of H1N1pdm09, we performed the same (SC & MC) analysis on
A/Brisbane/59/2007-like strains (both WT and H275Y MUT) from the 2008–2009
influenza season. These data were presented previously [27], though without this full
analysis, and are not reproduced here (see accompanying Supplemental Material). The
results of this new SC and MC fitting analysis for A/Brisbane/59/2007 WT and MUT are
given in Table 2. A comparison of the results to those of H1N1pdm09 is presented in
Figure 4.
It is clear that the H275Y mutation has a similar effect in the A/Brisbane/59/2007
strain background. In particular, the mean eclipse phase is significantly longer for the
mutant strain (p<0.001). One notable distinction, however, is that there is a significant
difference between the WT and MUT infecting times for A/Brisbane/59/2007 (p<0.001) —
with the mutant possessing a shorter infecting time, and thus higher infectivity — while
there was not a significant difference for the H1N1pdm09. Moreover, the infecting times
for both A/Brisbane/59/2007 strains are significantly lower than those of H1N1pdm09-WT
(p<0.05). The higher infectivity of the A/Brisbane/59/2007 MUT strain is also evidenced
by its basic reproductive number, which is >10-fold larger than all other strains (p<0.001).
The A/Brisbane/59/2007 strains also have significantly shorter infectious lifespans than the
H1N1pdm09 (p<0.05). This corroborates our own experimental observations that dead-cell
plaques are only observed at very late times in H1N1pdm09 titration experiments,
compared to A/Brisbane/59/2007, although foci of infected cells are observed early on
(data not shown).
60
3.5.3 Competitive mixed-infection experiments in vitro
To observe the effects of strain-specific parameter differences in direct competition,
we performed competitive mixed-infection experiments between the two H1N1pdm09
strains in vitro. MDCKα2,6 cells were infected with a mixture of the virus strains at three
ratios — WT:MUT = 80:20, 20:80 and 50:50% — adding up to a total inoculum of 50PFU
(MOI=50/106 =5×10−5 ). The mathematical model was adjusted to allow for two virus
strains, under the assumption of no co-infection of cells: a cell can be infected by either the
WT or MUT strain but once infected by one strain it is no longer available for infection by
the other strain. This allowed us to simulate the mixed-infection experiments, using the
previously extracted parameter values for each strain, without any additional assumptions
or parameters. The results of these experiments, along with virus and infected cell values
predicted by the model, are shown in Figure 5. Generally, the model predictions matched
the experimental values very well. This success of the model at predicting the results of an
independent set of experiments lends weight to the validity of the extracted values of the
infection kinetics parameters for each strain.
In terms of total virus produced, the H1N1pdm09-WT strain shows a clear
dominance in the mixed-infection results. At the 50:50 infection ratio, for example, the
H1N1pdm09-WT virus counts are significantly larger than the H1N1pdm09-MUT values
for all but the first two time points (p<0.05, rank-sum). The model prediction for the
infected cell fractions, however, suggests that the H1N1pdm09-MUT strain infected a
larger fraction of available cells. Taking into account the 95% CI found above for each
parameter, this difference in the fraction of cells infected by each strain is not significant,
i.e., at the 50:50 infection ratio, the model predicts that each strain infects approximately
half of the cells. This is consistent with our previously extracted parameters: if the
H1N1pdm09-WT infects the same number of cells as the H1N1pdm09-MUT, it will
produce a higher proportion of the total virus due to its ∼6-fold larger viral production rate.
The infection of an equal fraction of the cell culture would also be consistent with the
similar basic reproductive numbers determined for the two strains.
61
3.5.4 Pure and competitive infections in ferrets
To directly compare the replication capacity of the H1N1pdm09 viruses in vivo,
5
four groups of four ferrets were infected with 10 PFU of pure H1N1pdm09-WT or
H1N1pdm09-MUT, or a mixture of the two at the ratios WT:MUT = 50:50 and 20:80%. A
slight weight loss of 4%–6.5% was observed two days post-infection (dpi), but there was
no statistically significant difference in body weights between the four groups of ferrets
(data not shown). All groups of animals developed a fever 2 dpi with mean peaks of
temperature of 39.43±0.23; 39.00±0.11; 39.25±0.16 and 39.20±0.11°C for WT:MUT =
100:0, 0:100, 20:80 and 50:50% groups, respectively (p=0.39, 1-factor ANOVA). These
observations are similar to those of previous ferret infection studies with H1N1pdm09 [30,
36], as well as studies with A/Brisbane/59/2007-like strains [29, 36] and pre-2007 strains
[31]. No marked differences were observed for other clinical parameters, such as lethargy,
sneezing and interest in food. Specific antibody levels against H1N1pdm09 were not found
in the serum collected before intranasal infection (<10), but all ferrets had developed HI
antibodies against the virus at 14 dpi.
Nasal washes, collected every 12 h for 72 h and subsequently daily until 7 dpi, were
analyzed by real time RT-PCR and viral titration (Figure 6). Peak viral shedding for all
experiments occurred between 48 h and 60 h post-infection. The individual (pure
population) infections for the H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT strains were quite
similar, e.g., the peak RNA virus values were identical for the two strains and the decay of
virus following the peak was similar (Figure 6, top left). Notably, however, the initial virus
increase and the peak value of H1N1pdm09-WT preceded that of H1N1pdm09-MUT by
approximately 12 h (MUT virus was significantly smaller than WT at 24 h and 36 h;
p=0.03, rank-sum). In the 50:50 mixed infections, the H1N1pdm09-WT RNA virus was
significantly larger at the peak (p=0.03) and for most other time points. Additionally,
H1N1pdm09-WT virus copies in each mixture were only slightly reduced compared to the
pure H1N1pdm09-WT, while nearly all H1N1pdm09-MUT values were significantly lower
than their pure population infection values. There were no significant differences between
the peak nasal wash viral titer values in the pure infections and the 80:20 mixture, but the
peak titer was significantly lower (p=0.05) for the 50:50 mixture (Figure 6, bottom row).
62
3.6 Discussion
We performed a set of in vitro and ferret infection experiments, with analysis using
a mathematical model, to characterize the specific quantitative effects of the H275Y
neuraminidase (NA) mutation on the infection kinetics of the pandemic H1N1 virus
(H1N1pdm09) in the absence of treatment with oseltamivir. We found that the H275Y
mutation causes a significant increase in the length of the eclipse phase and a significant
reduction in the viral output per MDCKα2,6 cell in vitro. Interestingly, similar changes
were found in the analysis of the prior seasonal strain, A/Brisbane/59/2007 (WT and
MUT). In the A/Brisbane/59/2007 background, however, we found that the H275Y
mutation also causes a significant increase in infectivity which could have contributed to
the wide-spread dissemination of the oseltamivir-resistant strain in the population. In mixed
infections with equal inoculum in vitro, the H1N1pdm09-WT strain produced more virus
than H1N1pdm09-MUT, but likely infected an approximately equal fraction of the cell
culture. Infections of ferrets with pure populations of virus were similar for the two strains,
but the H1N1pdm09-WT strain showed a clear replicative advantage in mixed infections.
These in vivo results support the hypothesis that H1N1pdm09-MUT is not likely to achieve
a replicative fitness advantage over H1N1pdm09-WT, necessary for its wide dissemination
in the human population, unless it acquires compensatory mutations.
In general terms, the replication capacity of a particular strain can be considered a
balance between the infectivity of the strain (how much virus is produced by infected cells
together with how infectious each virion is) and the delay in its growth. In this sense, the
longer eclipse period we have found for H1N1pdm09-MUT in MDCKα2,6 cells should be
seen as reducing its replicative fitness in vitro, since any delay will reduce its ability to
infect cells. A shorter infecting time for the MUT strain could potentially yield a
compensatory effect, but no significant difference was found for the two H1N1pdm09
strains. The basic reproductive numbers for the two strains were also found to be
statistically equivalent. In the analysis of the prior seasonal strain, A/Brisbane/59/2007, we
found that the eclipse period was similarly lengthened by the H275Y mutation, but that the
infecting time of the MUT strain was significantly shorter and its basic reproductive
63
number was significantly larger, suggesting a potentially more advantageous balance
between infectivity and delay in that background.
The changes in the infection kinetics parameters which we determined in vitro, are
consistent with the physical changes caused by the H275Y mutation. The conformational
change in the NA structure which prohibits efficient bonding with oseltamivir is also likely
to impair the function of the NA itself. Reduced affinity for the substrate (i.e., increased Km
) in enzymatic activity assays is typical for H275Y strains in general [42] and for
H1N1pdm09-MUT in particular [8, 12]. This impairment would likely cause a delay in the
release of progeny virus (a lengthened eclipse phase) and a reduction in the number of
virions released from the surface of an infected cell (a reduction in the viral production per
cell). It is also known that the A/Brisbane/59/2007 strains have increased NA surface
expression and activity [6] (relative to H1N1pdm09 and pre-2007 strains), which may lead
to generally increased infectivity, consistent with our finding that both the WT and MUT
A/Brisbane/59/2007
strains
had
comprehensive visual analysis
shorter infecting times than H1N1pdm09-WT.
—
A
using electron microscopy [30] or fluorescence
techniques [34, 44] — of the budding process of H275Y mutants in comparison to their
wild-type counterparts could shed more light on the mechanism of both the lengthened
eclipse period and reduced viral production that we have highlighted here and constitutes
an important direction for future work.
The reduction in viral production which is evidently induced by the H275Y
mutation allowed H1N1pdm09-WT to dominate total viral production in competitive
mixture infections in vitro. We showed, however, that the observed difference in total virus
produced at a 50:50 infection ratio was consistent with an equal number of cells being
infected by each strain (given the larger viral production rate per cell of the WT). This
suggests that H1N1pdm09-MUT produces a larger proportion of infectious virus than
H1N1pdm09-WT. Indeed, we found that the ratio of infectious units to virus particles was
12 times higher for the resistant strain: approximately 60 virions were produced for every
successful infection by H1N1pdm09-WT, while only five were required per infection for
H1N1pdm09-MUT.
In ferrets,
competitive mixed
infections with H1N1pdm09 demonstrated an
unambiguous replication advantage for H1N1pdm09-WT over H1N1pdm09-MUT. In
64
contrast to the in vitro case, peak virus levels in pure infections of ferrets were equal for
H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT. Unless the number of cells infected by each
strain is very different, this implies that the viral production rates per cell in ferrets is
roughly equivalent (following the same, dVRNA/dt=0, argument presented for estimating the
ratio of viral production rates from the in vitro data). Therefore, assuming that co-infection
of cells by the two strains is negligible; the observed dominance of H1N1pdm09-WT virus
throughout the mixed-infection experiments with equal inoculum indicates that the
susceptible strain infected a much larger fraction of cells than the resistant strain.
The most notable difference between the H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT
(pure population) infections of ferrets was a delay in the growth of the infection for
H1N1pdm09-MUT. Prior experimental infections of ferrets with H1N1pdm09 [12, 18, 32,
45, 46] have not been powered to demonstrate such a difference between the two strains,
due to less frequent nasal wash samplings and larger initial inoculum. Since the WT and
MUT virus production curves here were otherwise similar, it is likely that this delay
allowed for, or at least contributed to, the dominance of H1N1pdm09-WT in mixed
infections. A delayed infection by the H1N1pdm09-MUT strain could be related to the
compromised NA action caused by the mutation [8, 12]. While the primary function of NA
is to allow the release of progeny virions from a cell surface, a secondary function in vivo is
to cleave sialic acid in the mucus layer, which aids the virus penetration to the respiratory
tract epithelium [38]. It is important to note in this context that, while a certain ratio of WT
to MUT virus in the infecting inoculum in vitro will result in that ratio of initially infected
cells (because the ratio is prepared using titrations on the same culture of cells), this is not
necessarily true in vivo.
The strength of our competitive mixed-infection model over the analysis of
infections with only pure populations of virus is that it closely mimics natural infections at
the crucial moment where strain replacement might occur within a host (see also the recent
analysis of A/Brisbane/59/2007 [29]). While previous studies have assessed the replication
efficiency of pure populations of H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09-MUT in vitro and in
ferrets [18, 32, 39], most have found similar virus production for the two strains (as we
have found), suggesting similar replication capacity. Two recent studies did perform a
mixed-infection experiment [12, 45], one of which concluded that replication capacities
65
were equal [45] while the other found that H1N1pdm09-MUT growth was impaired [12].
An important extension of this line of research will be the analysis of mixed-population
infections of animals undergoing oseltamivir treatment. Competitive infections cannot be
expected to completely predict fitness in a human population, but — together with results
suggesting similar or impaired airborne transmission of H1N1pdm09-MUT strains between
ferrets [12, 19, 32, 45, 46] — our results are consistent with epidemiological data showing
that H1N1pdm09-WT remains the dominant influenza A/H1N1 strain.
The method we have employed here (analysis of two complementary in vitro assays
with a mathematical model) enables the extraction of the parameters which characterize
viral replication for a given strain. Some of the extracted parameters (viral clearance rate,
production rate, and eclipse phase length) can be seen directly in the experimental viral
kinetics time course, providing validation of the method. But the strongest validation is the
model’s accurate prediction of the kinetics of the competitive mixed-infection experiments
in vitro. We believe that this new approach for characterizing and quantitatively comparing
strains has great potential. For example, it could be applied to characterize the effect of any
single mutation, by providing a quantitative understanding of the phenotypic differences
introduced by the genotypic change. It could also be used to characterize the mode of action
of a novel antiviral compound by quantifying the changes it introduces in each phase of
viral replication.
3.7 Acknowledgments
This study was supported by a grant from the Canadian Institutes for Health
Research [www.cihr-irsc.gc.ca; funding reference numbers 86937 and 111071] (GB and
CAAB).
The computational aspects of this work were made possible by the facilities of the
Shared
Hierarchical
Academic
Research
Computing
Network
(SHARCNET:
www.sharcnet.ca) and Compute/Calcul Canada.
66
3.8 Tables
Table 1: Best-fit viral kinetics parameters for H1N1pdm09. Fitted parameter values for
H1N1pdm09 WT and MUT, with 95% confidence intervals (CI) from bootstrap replicates of
SC and MC viral yield experiments.
67
Table 2: Best-fit viral kinetics parameters for A/Brisbane/59/2007. Fitted parameter values
for A/Brisbane/59/2007 WT and MUT, with 95% CI from bootstrap replicates of SC and MC
viral yield experiments. The data and fitted model curves can be found in the Supplementary
Material.
68
3.9 Figures
Figure 1: Mock infection experiment to determine viral infectivity loss rate . H1N1pdm09WT (squares, black) and H1N1pdm09-MUT (triangles, red) viruses subjected to the physical
conditions of the in vitro experiments (37°C, 5% CO ) lose infectivity exponentially with
2
identical rates cWT = cMUT = 0.13 h-1 , corresponding to a virion infectious half-life of 5.3 h-1 .
69
Figure 2: Single -cycle and multiple-cycle viral yield experiments. A Experimental values of
infectious virus (PFU/mL, filled symbols) and total viral load (RNA/mL, open symbols) for the
H1N1pdm09 (squares, black) and MUT (triangles, red) strains in the single -cycle (SC, top)
and multiple-cycle (MC, bottom) viral yield experiments. Best-fit model virus curves are overplotted as lines (infectious, solid; total, dashed). B Histograms of parameter values determined
from fits to 1000 bootstrap replicates of the SC and MC data for the H1N1pdm09 (black) and
MUT (red).
70
Figure 3: Single -cycle and multiple -cycle viral yield experiments for a second pair of
H1N1pdm09 strains. Total viral load was determined by RT-PCR (WT, black squares; MUT,
red triangles) in the SC (top) and MC (bottom) experiments. Best fit model curves, assuming
that all parameters except σ and c remained fixed to the values found for the original
E
R
strains (see Figure 2 and Table 1), are over-plotted. Fitted values for the (WT,MUT) strains
are σ = (1.8,3.3 h) and c = (0.014,0.019 h -1 ).
E
R
71
Figure 4: Comparison of H1N1pdm09 and A/Brisbane/59/2007 viral kinetics parameter
values. Parameter values of the four strains, normalized to the value of H1N1pdm09 -WT.
Vertical boxes and bars represented the 68 and 95% confidence intervals, respectively,
determined from the boots trap replicates to SC and MC data. Note that the comparison for
the basic reproductive number is logarithmic.
72
Figure 5: Competitive mixed-infection experiments with H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09MUT in vitro. Experimental values of H1N1pdm09-WT (squares, black) and H1N1pdm09MUT (triangles, red) are given for different initial infection ratios. Model-predicted virus
curves (dashed lines) for H1N1pdm09 (black) and MUT (red) and the fraction of cells infected
by each strain (solid lines) are plotted, using only the parameter values determined from fits
to the pure population SC and MC experiments.
73
Figure 6: Pure and competitive mixture infections of H1N1pdm09-WT and H1N1pdm09MUT in ferrets. Total virus counts (top row) of H1N1pdm09-WT (squares, black) and
H1N1pdm09-MUT (triangles, red) strains over time for infections in ferrets, and
corresponding infectious titer measures (bottom row). The left panel shows the results of
infections with purely H1N1pdm09-WT and purely H1N1pdm09-MUT (the two data sets are
over-plotted for comparison purposes), while the other two panels show mixed infections at
different initial infection ratios. Each point is the geometric average from four ferrets with
geometric standard errors indicated. Dotted lines in the right two panels indicate the values of
the pure population viral load from the leftmost panel, for reference.
74
3.10 References
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78
CHAPITRE IV : ARTICLE II
Presence of oseltamivir-resistant pandemic A/H1N1 minor variants before drug
therapy with subsequent selection and transmission
Elodie Ghedin1* , Edward C. Holmes2,3 , Jay V. DePasse1 , Lady Tatiana Pinilla4 , Adam
Fitch1 , Marie-Eve Hamelin4 , Jesse Papenburg5 , Guy Boivin4*
1
Department of Computational & Systems Biology, Center for Vaccine Research,
University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA 15261, USA
2
Center for Infectious Disease Dynamics, Department of Biology,
The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA
3
Fogarty International Center, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA
4
Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Québec and Université Laval,
Québec City,Québec, Canada
5
McGill University Health Centre, Montréal, Québec, Canada
* E-mail: Corresponding authors
[email protected] and [email protected]
Soumis à la revue scientifique The Journal of Infectious Diseases (JID) le 01 mai 2012
Manuscrit no 50050.
Nombre de mots dans le résumé: 126
Nombre de mots dans le texte: 3455
79
4.1 Abstract
A small proportion (1-1.5%) of 2009 pandemic A/H1N1 influenza viruses
(A(H1N1)pdm09) are oseltamivir-resistant, due almost exclusively to a H275Y mutation in
the neuraminidase protein. However, many individuals infected with resistant strains had
not received antivirals. The objective of this study was to determine and quantify, by real
time PCR and deep sequencing, the presence of the H275Y mutation before and during
treatment in a patient immunosuppressed and in two individuals in a household outbreak.
We observed that the H275Y mutation was present as a minor variant in infected hosts
prior to onset of therapy. We also found evidence for the transmission of this drug-resistant
variant alongside drug-sensitive viruses. These observations provide important information
on the relative fitness of the H275Y mutation in the absence of oseltamivir.
80
4.2 Résumé
Une faible population (1-1.5%) des virus A/H1N1 pandémique de 2009 est
résistante à l’oseltamivir, dû presque exclusivement à la mutation H275Y dans la protéine
NA. Cependant, plusieurs personnes infectées par la souche résistante n’avaient pas reçu
d’antiviraux. L’objectif de cette étude était de déterminer et de quantifier, par PCR en
temps réel et séquençage à haut débit, la présence de la mutation H275Y avant et durant le
traitement chez un patient immunosupprimé ainsi que chez deux individus dans le contexte
d’une transmission familiale. Nous avons observé que la mutation H275Y était présente
comme population mineure avant le début du traitement dans les deux cas. De plus, nous
avons documenté la transmission de la souche résistante à l’antiviral dans la famille. Ces
observations fournissent des informations importantes concernant la capacité réplicative de
la souche résistante en l’absence d’oseltamivir.
81
4.3 Introduction
The 2009 pandemic A/H1N1 influenza virus (A(H1N1)pdm09) emerged following
reassortment between two swine viruses circulating in North America and Eurasia [1].
Between 1 and 1.5% of A(H1N1)pdm09 strains analyzed to date have been found to be
resistant to oseltamivir, a neuraminidase (NA) inhibitor that constitutes the current standard
of care [2]. Virtually all oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 viruses contain an H275Y
amino acid substitution in the viral NA gene [3]. Among the drug-resistant strains
recovered from immunocompetent patients, approximately one-third have been recovered
from untreated individuals [4]. Whether drug-resistant variants are initially present as
minor variants in untreated subjects due to transmission from a host harboring a minority
drug-resistant population, or whether they emerge following de novo replication, is of great
importance for predicting the speed at which resistance will arise: the selection of resistant
mutations will occur more rapidly if they are already present within hosts as pre-existing
minor variants [5]. In addition, the presence (or not) of the H275Y mutation in pretreatment samples provides important information on the relative fitness of drug resistance
mutations in the absence of oseltamivir.
To determine whether the H275Y mutation is present as a minor variant within
hosts infected with influenza A virus, we performed ultra-deep sequencing of viral
populations from nasopharyngeal specimens of two sets of individuals infected with
A(H1N1)pdm09 viruses.
First, we examined longitudinal samples collected from an
immunocompromised child who remained infected for more than 6 weeks, during which
time a drug-resistant strain came to dominate the virus population. Second, we analyzed the
emergence of oseltamivir-resistant viruses in an household outbreak of A(H1N1)pdm09
infections in which the contact case developed influenza symptoms 24 hours after starting
post-exposure oseltamivir prophylaxis [6].
82
4.4 Materials and Methods
Study 1: Immunocompromised child. A 31 month-old boy weighing 13.4 kg,
diagnosed three months earlier with medulloblastoma, was admitted on January 5, 2011 for
consolidation chemotherapy in preparation for the first of 3 consecutive autologous bone
marrow transplants (ABMT). On admission, the child presented rhinorrhea and mild cough
but was afebrile. Members of his immediate family, including his older sister and his father ,
had cold-like symptoms 1-2 weeks prior; none of the family members, including the
patient, had received the 2010-11 influenza vaccine, the monovalent A(H1N1)pdm09
vaccine or any antiviral drug. A nasopharyngeal aspirate (NPA) collected on admission was
positive for the A(H1N1)pdm09 virus by real-time RT-PCR [7] and by viral culture on
A549 and Mink lung cells. Treatment with oseltamivir (30 mg, twice daily) was started on
January 6. The following day, the patient developed fever (max. 39.2 °C), coincident with
dropping neutrophil counts. The child received his first ABMT on January 10. NPA
specimens collected throughout admission remained positive for A(H1N1)pdm09 influenza
virus by RT-PCR (Table 1). Oseltamivir therapy was continued during the hospitalisation
and after discharge on January 22. The patient was readmitted from January 27 to February
14, 2011 for his second ABMT. A NPA specimen collected on January 28 was positive for
A(H1N1)pdm09 by RT-PCR. Because of persistent viral excretion, oseltamivir was
replaced by zanamivir (25 mg inhaled four times daily) on February 1 and continued until
negative RT-PCR results on February 17. The patient received a third ABMT on February
18 and he recovered from his influenza infection without complications.
Study 2: Transmission in household. A detailed description of the familial cluster
of infections with A(H1N1)pdm09 virus has been reported elsewhere [6]. Briefly, a 13-year
old asthmatic male developed infection with A(H1N1)pdm09 confirmed by RT-PCR
testing of a NPA. The child was started on oseltamivir (60 mg twice daily for 5 days) and
discharged home the same day. Simultaneously to treatment of the index case, postexposure oseltamivir prophylaxis (75 mg once daily for 10 days) was prescribed to the 59year old father with chronic obstructive pulmonary disease. Approximately 24 hours after
beginning oseltamivir prophylaxis, the father developed influenza-like symptoms. On day 8
83
of oseltamivir prophylaxis, he consulted his general practitioner for persistent cough. An
NPA collected at that time was positive by RT-PCR and by culture for A(H1N1)pdm09.
The father had an uneventful clinical course and an NPA sampled at the end of his illness
was negative. The son’s A(H1N1)pdm09 isolate collected before oseltamivir therapy was
susceptible to oseltamivir (50% inhibitory concentration or IC 50 : 0.27 nM) whereas the
father’s A(H1N1)pdm09 isolate was highly resistant to oseltamivir (IC 50  400 nM). The
complete (consensus sequence) virus genomes of the father (GenBank accession
FN434454) differed by one amino substitution (H275Y) in the NA protein compared to the
virus present in the son (GenBank FN434445).
Informed consent. Written consent was obtained for report of the case described in
Study 1. Samples used in Study 2 were obtained as part of an investigation of the Public
Health Department of the Ministry of Health, Quebec, Canada.
Clinical specimens and viral culture. In Study 1 (immunocompromised child), 7
NPAs were collected between January 5 and February 17, 2011 for RT-PCR testing (Table
1 and Figure 1). Viral isolates were also obtained by culture from NPAs sampled on
January 5 and January 20. In Study 2 (household transmission), the NPA from the index
case (son) was collected prior to oseltamivir treatment whereas the NPA from his father
was obtained on day 8 of oseltamivir prophylaxis (Figure 1).
NA inhibition assay. The drug resistance phenotype to NA inhibitors was
determined by NA inhibition assays [8]. The IC50 values were determined from the dose
response curve. A virus was considered resistant to a drug if its IC 50 value was 10-fold
greater than that of the wild-type (WT) virus [9].
RNA extraction. Total RNA was extracted from 200 L of thawed specimen or
culture using the MagNA Pure instrument and the MagNA Pure LC total nucleic acid
isolation kit (Roche Applied Science) according to the manufacturer’s instructions and
stored at -80o C.
84
Discriminative real-time PCR assay. To discriminate between WT and H275Y
oseltamivir-resistant strains of A(H1N1)pdm09, a modified version of a previouslyreported real time RT-PCR method [10] was used to test samples. This technique requires a
reverse (panN1-H275-sense 5’–cagtcgaaatgaatgcccctaa-3’) and a forward (panN1-H275antisense 5’ –tgcacacacatgtgatttcactag- 3’) primer for both the WT and the H275Y viruses
and two labelled allele-specific probes: panN1-275H-probe (5’–ttaTCActAtgAggaatga-6FAM/BHQ-1) and panN1-275Y-probe (5’–ttaTTActAtgAggaatga-HEX/BHQ-1). In the
aforementioned probe sequences, locked nucleic acid (LNA) nucleotides are denoted in
upper case, DNA nucleotides are denoted in lower case, and the single nucleotide
polymorphism (SNP) is underlined. The limits of detection for the assay are 50 copies for
the H275Y target and between 10 and 50 copies for the WT target. RT-PCR conditions are
available upon request. Data acquisition was performed in both FAM and HEX filters
during the annealing/extension step. Standard curves were constructed using 10-fold serial
dilutions of pJET1.2-NA-Y275 and pJET1.2-NA-H275 plasmids.
Sequencing and analysis. RNA isolated from two cultured isolates and seven
primary specimens
collected for Study 1 (Figure 1A), and two primary specimens for
Study 2 (Figure 1B), was subjected to a multisegment RT-PCR (M-RT-PCR) step [11] and
random priming with barcoding using the SISPA (sequence independent single primer
amplification) protocol [12]. For each RNA sample, we performed two M-RT-PCR
reactions using the One Step Superscript III RT kit (Invitrogen). Reactions were purified
independently
using
the
Qiagen
MinElute
kit
and
quantitated
on
a
Nanodrop
spectrophotometer; 100-200 ng of each purified M-RT-PCR reaction was used in two
separate SISPA reactions with two different barcode tags for a total of 4 tagged reactions
per original RNA sample. Products were then separated on a 1% agarose gel and fragments
from 200-400bp purified with the Qiagen MinElute kit. Pooled samples were sent for
paired end (PE) library preparation and 100 base sequencing on the Illumina Hi-Seq2000
platform.
The barcoded amplification products were sequenced on one lane of the sequence
run. Analyses were performed to reduce the distortion caused by SISPA amplification,
account for both PCR and sequencing errors, and provide a ‘clean' comparison between the
85
mapped reads of the experimental samples. The trimmed reads were mapped to
A/Quebec/144147/2009(H1N1) (GenBank accession FN434457-FN434464) using the
bowtie short-read aligner [13].
The frequency of each codon observed in the set of mapped reads from each
amplification replicate was tabulated across each of the 10 influenza genes. To account for
sequence-specific errors [14, 15], the variant counts for the forward and reverse direction
reads were calculated separately, and only those variants for which counts were within 50%
of each other in both directions were retained. For these summaries, the unique reads from
all amplification replicates were pooled and total coverage is reported for each codon site.
The proportion of codons expected to differ from the consensus due to background
mutation and technical error was estimated from a separate cell culture of the PR8 strain
that was otherwise processed in exactly the same manner as the specimens in this study.
This proportion, found to be 0.00392, lies well outside of the 95% confidence interval for
any variant codon in our study that is (a) represented by more than 4 sequence reads, and
(b) found in at least 2% of all sequence reads mapped to that position. The lower limit of
the 95% confidence interval determined by computing the inverse of the appropriate
cumulative Beta distribution is 0.00813.
4.5 Results
4.5.1 Presence of drug-resistant viruses before drug treatment in
an immunocompromised child (study 1)
The results of the NA gene H275Y discriminatory real-time RT-PCR assay
performed on the seven primary specimens and the two viral isolates (January 5 and 20) are
presented in Table 1.. In the first NPA collected on January 5 (day 1), prior to antiviral
therapy (initiated January 6), 99.9% of the viral population was WT at NA position 275 by
our discriminatory assay. Nevertheless, a very small sub-population of H275Y mutant was
also detectable (0.08%). The corresponding viral isolate (05-01-2011 – CM2 in Table 1)
contained 99.9% of WT virus and was susceptible to oseltamivir (IC 50 =0.77 nM ± 0.02),
zanamivir (IC50 =0.15 nM ± 0.02), and peramivir (IC 50 =0.05 nM ± 0.01). Notably, the
86
H275Y mutation could not be detected by conventional RT-PCR and Sanger sequencing in
the original sample. A second NPA collected on January 10 (day 6) also demonstrated a
predominance of the WT population (99.8%). However, the proportion of the H275Y
mutant detected in NPAs collected on January 17, 20, and 28 increased to 96.9, 95.9, and
83.5%, respectively, during continuous oseltamivir treatment. Furthermore, the second
passage on Madin Darby canine kidney (MDCK) cells of the January 20 viral isolate (2001-2011-CM2 in Table 1) resulted in 100% H275Y mutant population compared with
95.4% from the primary culture recovered from A549 and Mink lung cells. This viral
isolate exhibited an IC 50 value of 556.75 nM ± 61.32 for oseltamivir, 0.22 nM ± 0.01 for
zanamivir, and 34.81 nM ± 5.77 for peramivir, which indicates a resistance phenotype to
oseltamivir and peramivir. Antiviral therapy was changed to zanamivir on February 1 st . The
February 8 sample contained a predominance of 88.5% of H275Y mutant virus, whereas
the last NPA collected on February 17 was negative for A(H1N1)pdm09 by RT-PCR.
A number of the primary specimens (January 5, 10, 17, 20, 28, and February 8;
corresponding to samples 1-6 in Figure 1A) for which M-RTPCR product could be
generated, as well as the viral isolates, were subjected to deep sequencing to better evaluate
the genetic diversity of the viral population, including the presence of drug-resistant
mutants. Based on the average depth of coverage across each of the virus segments, we
highlighted codons represented by at least 2% of the sequence reads covering each position
(Table S1). This percentage is conservative enough that, even in low-coverage areas, it
excludes potential sequence and PCR errors.
The positions on the NA and NS1 proteins that display evidence for the presence of
minor variants at a frequency of 2% or above in more than one of the samples are shown in
Figure 2. Similar patterns are observed for all other proteins (Table S1). Over time, the
ratios of the minor variants to the dominant codon remain relatively stable, except for NA
position 275 where a shift of H to Y is apparent on 17 January 2011. The ratios are similar
to the ones observed in the real-time discriminatory RT-PCR assays for each of the samples
tested (Table 1), although values across both assays are not identical. No other position on
the NA protein appears to co-vary with the 275Y variant. The same pattern is observed in
the culture isolates (05-01-2011-CM2 and 20-01-2011-CM1 in Table S2). However,
position 153 in NS1 displays a similar switch, although involving a synonymous mutation
87
(from codon GAG to GAA, for E (glutamic acid)). Hence, the sample from the original
infection contained a drug-associated minor variant prior to the onset of drug treatment,
and this minor variant differed from the dominant strain by only two nucleotide positions.
Due to drug-associated selection pressure, this minor variant eventually became dominant
in the host. The variant codons observed at the other positions are also possibly
representative of other minor variants in the original virus population but, as they remained
minor members of the viral population, they are unlikely to have a selective advantage.
4.5.2 Evidence for transmission of drug-resistant viruses in
household (study2)
In a separate study, we observed a similar phenomenon where oseltamivir resistance
emerged quickly in the household contact (father) of an index case (son). Both family
members were started on oseltamivir on the same day (Figure 1B) i.e., twice a day
treatment for the son and once a day prophylaxis for the father. The latter developed
influenza-like symptoms 24 hours after drug treatment was begun. Such a rapid clinical
presentation suggests that he was already infected at the time prophylaxis was initiated, and
that drug-resistant viruses were most likely already present.
We characterized the genetic diversity of the virus populations in both individuals
by deep sequencing. An example for the HA and NA genes where most of the variants seen
in the son are also observed in the father is shown in Figure 3. While the dominant viruses
are drug-sensitive in the son and drug-resistant in the father, apparent by the switch from
H275 to 275Y, it is striking that a minor population of viruses in the son already carries the
drug resistance mutation; minor drug resistant variant residue 275Y is present in more than
2.4% of the reads in the son (which was not detected by conventional RT-PCR and Sanger
sequencing). Hence, it is likely that viruses carrying this mutation were transmitted to the
father along with drug sensitive viruses, and became dominant in that individual following
selection associated with a subtherapeutic (prophylactic) dose of oseltamivir.
Also of note was that the same minor variants were found in both the father and the
son at 60 residue positions across all 10 viral proteins (Table S3). We estimate that there
were 8 days of replication in the father from the time he was possibly infected by the son
88
(assuming it occurred 24 hours before any symptoms) to the time the specimen was
collected. Over that time, variant representation could have fluctuated such that the set of
60 variants seen in both samples is likely to underestimate the true number. While the
number of conserved variants points to possible transmission, and the probability that the
same variants could appear in both the son and the father by chance alone is extremely low,
we do not have other potential contacts or index cases to test in order to confirm this
observation.
4.6 Discussion
The most striking observation from both of these studies is that the mutation most
commonly associated with resistance to oseltamivir (H275Y) is present in the viral
population of some individuals prior to the onset of drug treatment. In addition, this minor
drug-resistant population could not be revealed by conventional methods such as
phenotypic resistance tests and Sanger sequencing. This observation is important for a
number of reasons. First, the prior existence of Y275 means that the selection for drug
resistance will proceed much more rapidly following the onset of drug selection pressure
than if only wild-type viruses are present in the population, as there is no waiting time for
the correct mutation to appear [5]. Further, that the Y275 mutation is present in untreated
hosts indicates that this mutation is not strongly deleterious in the absence of oseltamivir,
and likely does not need compensatory mutations to enable its fixation [16-18]. Indeed, in
both cases studied here, we observed no amino acid changes that were fixed concordant
with Y275, and only a single synonymous mutation (in NS1) in the case of the
immunocomprised child. In these circumstances, the pre-existence of Y275 means that
oseltamivir resistance will likely spread rapidly as soon as there is drug selection pressure,
especially in immunocompromised individuals and when suboptimal antiviral dosage is
used.
If the Y275 mutation is present in individual hosts prior to the onset of drug
treatment then it is also likely to have been transmitted between individuals as a minor
variant. This in turn suggests that there may not often be a severe population bottleneck
during the inter-host transmission of influenza virus. Indeed, mixed infections of multiple
89
variants of influenza virus have been observed in both natural human infections [19-21] and
experimental animal infections [22, 23], and hence may be commonplace. Co-infection
with major and minor variants, captured by deep sequencing, was also observed during the
course of human rhinovirus infections [24], indicating that this phenomenon is not unique
to influenza. In contrast, sequencing studies of HIV suggest that a small number of viral
particles initiate infection, such that most variants are produced following replication
within the newly infected host [25].
Such transmission of multiple variants is most clearly documented in the son-father
case, where perhaps 60 mutational variants are passed between these two individuals, one
of which confers oseltamivir resistance. However, the availability of only short sequence
reads makes it impossible to determine the exact number of distinct viral haplotypes these
correspond to. In addition, our sampling protocol in the son-father transmission case
dictates that we cannot exclude that there was rapid selection of oseltamivir resistance in
the son after we sampled his virus population, such that a majority Y275 population was in
fact transmitted to the father. However, this would entail extremely rapid selection for
resistance and does not change the central observation that multiple variants are transmitted
between hosts as both H275 and Y275 are found in the father.
That the Y275 mutation is present in the son prior to oseltamivir treatment and so
soon after symptom onset suggests that this resistance mutation was also present in the viral
population initially transmitted to the son. Similarly, the presence of Y275 in the
immunocomprised child suggests that this mutation may have been transmitted to the child
in a mixed infection containing both drug-sensitive and -resistant mutations, although it
cannot be excluded that the variant appeared de novo. If Y275 is indeed present in the
founding population in both individuals then it is possible that this mutation is present as a
low frequency variant in many individuals infected with A(H1N1)pdm09, and that its
presence reflects the combined action of past selection for drug resistance in patients
receiving oseltamivir, incomplete reversion to the wild-type H275 mutation in patients that
are not on the drug, and a lack of strongly deleterious fitness effects in the absence of
drug. The large-scale ultra-deep sequencing of additional A(H1N1)pdm09 patients who
have not received oseltamivir will clearly be central to answering this question.
90
Next generation ultra-deep sequencing of intra-host viral populations such as that
undertaken here promises to transform our understanding of the evolution of drug
resistance in acute viral infections, allowing the dissection of the mutational spectrum at an
unprecedented level of precision. Indeed, it is striking that in the two cases conventional
RT-PCR failed to detect the presence of oseltamivir resistance even though Y275 was
present in the viral population. However, despite its undoubted potential, ultra-deep
sequencing also comes with a number of inherent analytical difficulties. First, because the
sequencing protocol leads to the generation of short sequence reads, nucleotide positions
cannot be linked either within or among individual genes except if they are close enough to
appear on the same sequence read, or if they have the same pattern of prevalence. More
fundamentally, it is critical to ensure that minor genetic variants are not the result of
PCR/sequencing artefacts. Amplification leads to the well-known problem of 'PCR
duplicates', sometimes resulting in severe distortion to the observed proportions of true
variant subpopulations and the possible creation of false variant sequences through PCR
errors. To address these problems, each specimen from our study was amplified in four
independent reactions using different barcodes, allowing us to track amplification products
and their respective sequence reads. Future work will employ a simpler and more costeffective approach using modified primers that include unique tags for each template [26].
91
4.7 Tables
Table 1. Virological testing of nasopharyngeal aspirates sampled from a young boy
undergoing autologous bone marrow transplantation and infected with A(H1N1)pdm09
influenza. n.e. = not evaluated. CM1 and CM2= Culture passages 1 and 2. S= Primary
specimen (nasopharyngeal aspirates).
92
4.8 Figures
Figure 1. Outline of studies indicating day of onset, day when oseltamivir treatment was
started, and sampling timeline. A) Study 1: Immunocompris ed 31 month-old boy. B) Study 2:
Son-father transmission.
93
Figure 2. Longitudinal study of variant codon prevalence across multiple time -points in an
infected immunocompromised child. Ratios of major and minor codons are represented at
each position where the variant codons appear in more than 2% of the deep sequence data
reads in at least two of the time -points. Data collection dates are represented on the left hand
side and each group corresponds to the positions where variant residues are observed in the
NA and NS1. Codons and single letter amino acid codes are indicated below the position
number.
94
Figure 3. Transmission study of variant codon prevalence compared between son and father
specimens. Ratios of major and minor codons are represented at each position of the
neuraminidase (NA) and hemagglutinin (HA) where the variant codons appear in more than
2% of the deep sequence data reads in at least one of the samples. Codons and single letter
amino acid codes are indicated below the position number.
95
4.9 References
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deep sequencing of the HIV-1 protease gene using a Primer ID. Proc Natl Acad
Sci U S A 2011; 108:20166-71.
97
CHAPITRE V : DISCUSSION
L'immunisation annuelle est le principal moyen utilisé pour prévenir les infections
d'Influenza saisonnières et pandémiques. Cependant, les limitations concernant l'efficacité
du vaccin, sa formulation et sont temps de production font des antiviraux un moyen
complémentaire qui permet de diminuer le taux élevé de morbidité et de mortalité associé
au virus de l'influenza.
Présentement,
commercialement
l'oseltamivir et le zanamivir (INAs) sont les seuls antiviraux
disponibles
pour
utilisation
clinique.
La
principale
préoccupation
associée à leur utilisation est l'apparition et la transmission des mutations qui diminuent la
sensibilité des virus, rendant les antiviraux inutilisables cliniquement. Cette crainte s'est
concrétisée par le passé suite à l'utilisation des adamantanes, la première classe d'antiviraux
disponibles contre les virus de l'Influenza. L'histoire semble s'être répétée pendant les
saisons infectieuse de 2007/8/9, lorsque la fréquence de résistance à l'oseltamivir (associée
à la mutation H275Y) n'a cessé d'augmenter, et ce même en absence de pression sélective
apparente de l'antiviral. Contrairement aux prévisions des études in vitro et celles effectuées
dans les modèles animaux, la souche saisonnière A/Brisbane/59/2007 résistante à
l'oseltamivir portant la mutation H275Y a démontré une capacité réplicative supérieure à
celle des virus sauvages en se transmettant facilement de personne à personne, ce qui lui a
permis de devenir la souche dominante pendant la saison infectieuse 2008/9, alors que près
de 100% des isolats d'influenza dans plusieurs pays étaient résistants à l'oseltamivir
(H275Y) (Smith et al., 2011).
De façon générale, les mutations qui confèrent un avantage pour le virus, tel la
résistance aux antiviraux, causent également une diminution de la capacité réplicative de la
souche mutante. L'équipe de Bloom et al. (Bloom et al., 2010) a utilisé une analyse
phylogénique afin de comprendre du point de vue moléculaire pourquoi la mutation H275Y
avait une capacité réplicative augmentée. Ce groupe a constaté que deux mutations dans le
gène de la NA : V234M et R222Q ont agi de manière compensatoire en restorant le
98
phénotype réplicatif diminué par la mutation H275Y. Effectivement, la mutation de
résistance à l'oseltamivir diminue la quantité de NA à la surface alors que les mutations
compensatoires V234M et R222Q semblent l'augmenter, résultant ainsi en une souche avec
une activité NA améliorée.
L'apparition de la souche pandémique en 2009, qui est naturellement sensible aux
INAs, a remplacé la souche saisonnière A/Brisbane/59/2007 résistante à l'oseltamivir,
redonnant à l'antiviral son utilité clinique. Malheureusement, de nombreux cas de résistance
associés à la mutation H275Y dans la souche A(H1N1)pdm09 ont déjà été décrits (environ
1.5% des souches testées), particulièrement chez des patients immunosupprimés.
Dans le but de mieux caractériser la mutation H275Y, nous avons obtenu des virus
recombinants, créés par génétique inverse, à partir de la première souche A(H1N1)pdm09
isolée dans la ville de Québec, Canada (A/Québec/144147/09). Les virus recombinants,
sauvage (H275) et mutant (275Y), ne différaient entre eux que par la mutation H275Y dans
le gène NA, ce qui nous a permis d'écarter l'action possible de mutations compensatoires
qui pourraient avoir eu un effet sur le phénotype des virus mutants. Ces virus recombinants
ont servi à effectuer une série d’expériences in vitro et in vivo (chez le furet), qui nous ont
permis de valider un modèle mathématique. Cet outil nous a été utile dans le but d’évaluer
et de caractériser la capacité réplicative de la mutation H275Y sur la cinétique d'infection
du virus A(H1N1)pdm09 en l'absence de traitement à l'oseltamivir.
La force de notre étude réside dans le fait que nous avons tenté de reproduire une
infection qui mime de façon plus réaliste l'évolution des souches virales de l'influenza dans
la nature en utilisant une étude de compétition, qui consiste en la co-infection avec
différents ratios (20%:80%, 50%:50% et 80%:20%) du virus sauvage et du virus mutant.
Ainsi, lorsqu'une nouvelle souche virale fait son apparition (par exemple la souche
H275Y), elle est en compétition avec les souches sauvages pour les cellules cibles dans un
même hôte (Hurt et al., 2010).
99
Dans le cadre de notre étude in vitro, nous avons observé que les virus portant la
mutation H275Y se reproduisaient de manière moins efficace que les virus sensibles à
l'oseltamivir lors qu'ils étaient mis en compétition et ce de manière significative pour les
trois ratios. Cela suggère que la mutation H275Y diminue la capacité réplicative de la
souche pandémique. Nos observations chez le furet, suite à l'étude de compétition appuient
celles obtenues pour les cellules MDCK α2,6. Les infections des furets avec des
populations pures ne démontrent pas un avantage de réplication pour la souche sauvage ou
pour la souche résistante. Par contre, la souche A(H1N1)pdm09-sauvage a démontré un
avantage réplicatif dans les infections mixtes et ce de façon significative. Pour les
infections chez le furet avec la souche pandémique, nous avons observé une augmentation
d'environ 2o C de température, une faible perte de poids (3 - 6%) et des signes cliniques peu
importants, tel que décrit par d’autres études similaires (Itoh et al., 2009) (Maines et al.,
2009). La réduction de la production virale, qui est évidemment induite par la mutation
H275Y a permis à la souche A(H1N1)pdm09-sauvage de dominer la production totale du
virus dans les infections mixtes in vitro et in vivo.
La différence la plus notable entre les populations pures de A(H1N1)pdm09sauvage et A(H1N1)pdm09-mutante chez les furets est un retard dans la croissance virale
pour la souche mutante. Il est probable que ce retard ait permis, ou du moins contribué à la
domination de la souche sauvage dans les infections mixtes. Une infection retardée de la
souche résistante à l’oseltamivir pourrait être liée à une diminution de l’action de la NA
causée par la mutation H275Y.
Des études similaires à la nôtre ont montré que la mutation H275Y dans le bagage
génétique des virus A(H1N1)pdm09 n'affecte pas la capacité réplicative de façon
significative si on la compare au virus sauvage (Hamelin et al., 2010a) (Seibert et al.,
2010a). Bien que nos observations n'aillent pas dans le même sens que celles des études
précédentes, il est important de remarquer que nous avons utilisé un modèle de compétition
(beaucoup plus sensible et réaliste) pour caractériser la mutation H275Y. Les résultats de
notre étude suggèrent que l'étude de compétition in vitro et in vivo est une approche qui se
prête très bien à la comparaison de deux virus et qui permet de mieux nous éclairer sur
100
l'efficacité de la capacité réplicative. Il est important de noter que nous avons validé le
modèle mathématique en effectuant des expériences in vitro avec deux paires de souches
(cliniques et recombinantes) qui ne diffèrent entre elles que par la mutation H275Y dans la
NA.
La caractérisation du virus recombinant sauvage et mutant par modélisation
mathématique nous a permis de déterminer neuf paramètres qui jouent un rôle important
dans le cycle de réplication viral: le temps d'éclipse, l’écart-type du temps d’éclipse, le
temps d'infection, la longévité des cellules, la perte d’infectivité, le taux de production des
virions, le rendement de la production virale, le nombre de reproduction (Ro ) ainsi que le
nombre d’unités infectieuses par particule virale.
Nous avons observé des différences
significatives entre les souches sauvage et mutante au niveau de trois paramètres soit le
temps d'éclipse, le taux de production de particules virales ainsi que le rendement de la
production virale. Le temps d'éclipse, ou le temps écoulé entre l'entrée de la particule virale
dans la cellule cible et la sortie des nouveaux virions, était plus long pour le virus mutant
H275Y, alors que le taux de production de virions par cellule etait 12 fois supérieur pour le
virus sauvage. Le rendement de la production virale, qui est le nombre de particules virales
produites par une cellule pendant sa durée de vie, était 7 fois inférieur pour la souche
mutante. Autrement dit, le virus contenant la mutation H275Y nécessite plus de temps pour
produire des nouvelles particules virales et en produit 7 fois moins que le virus sauvage par
cellule, ce qui expliquerait pourquoi la mutation H275Y affecte négativement la capacité
réplicative. En termes généraux, la capacité de réplication d'une souche particulière peut
être considérée comme un équilibre entre l'infectivité de la souche (la quantité de virus
produite par les cellules infectées) et le temps de latence (temps entre l’entrée de la
particule virale dans la cellule et la production de nouveaux virions).
Le modèle mathématique que nous avons développé tient compte des neuf
paramètres clés extraits à partir des expériences à haut et faible MOI (Multiplicity Of
Infection) in vitro. En règle générale, les prédictions du modèle correspondaient aux valeurs
expérimentales obtenues dans les études de compétition in vitro. Ce succès du modèle à
101
prédire les résultats des expériences de compétition fait preuve de la validité des valeurs
extraites pour chaque souche.
Afin de vérifier que nos conclusions pouvaient être généralisées pour toutes les
souches A(H1N1)pdm09, nous avons reproduit les expériences virales in vitro avec une
paire des souches cliniques qui ne diffèrent entre elles que par la mutation H275Y dans le
gène de la NA (A/H1N1pdm09-sauvage et mutante). Tout comme la souche recombinante
résistante à l’oseltamivir (H275Y), l’isolat clinique mutant (résistant à l’antiviral) a
démontré une capacité réplicative réduite significativement lorsque comparée à celle de la
souche sensible. Les valeurs des paramètres clés déterminées pour la paire d'isolats
cliniques sont très similaires à celles obtenues pour la paire de virus recombinants.
D’ailleurs, les mêmes différences significatives ont été retrouvées pour les isolats cliniques
et les souches recombinantes. Cela sert à la fois de confirmation qualitative et quantitative
de l'effet de la mutation H275Y sur la cinétique de réplication de la souche A/H1N1pdm09.
Pour l'isolat mutant de 2007 A/Brisbane/57/2007, les résultats semblent être
similaires à ceux obtenus pour la souche pandémique, quoiqu’une différence importante
saute à nos yeux. Effectivement, il existe une différence significative pour le temps
d'infection (temps nécessaire à un virion pour infecter une cellule), qui est augmenté pour
le virus sauvage saisonnier (Holder et al., 2011). En d'autres termes, le virion mutant
infecte plus rapidement une nouvelle cellule cible dès son bourgeonnement que le virion
sauvage, ce qui suggère un meilleur équilibre entre l'infectivité de la souche (la quantité de
virus produite par les cellules infectées) et le retard de croissance de la souche saisonnière
A/Brisbane/57/2007 par rapport à celle de la souche A(H1N1)pdm09. À la lumière de ces
résultats, nous concluons que le temps d’infection est le paramètre majeur responsable de
l'efficacité de réplication du virus mutant H275Y pendant les saisons infectieuses 2007/8/9,
car il a permis de compenser la diminution du taux de production des virions et
l'augmentation du temps de latence chez la souche A/Brisbane/57/2007, lui permettant de
devenir la souche dominante.
102
Nous croyons que cette nouvelle approche de caractérisation et de comparaison
quantitative des souches virales a un grand potentiel. Par exemple, il pourrait être utilisé
pour caractériser l'effet des mutations uniques,
en fournissant une compréhension
quantitative des différences phénotypiques causées par le changement génotypique et du
potentiel de dissémination de telles souches. Il pourrait également être utilisé pour
caractériser le mode d'action d'un composé antiviral en quantifiant les changements qu'il
introduit dans chaque phase de la réplication virale.
Comme on l’a mentionné précédemment, la plupart des cas de résistance à
l’oseltamivir rapportés chez les virus A(H1N1)pdm09 ont été associés à la mutation H275Y
dans le gène de la neuraminidase (NA). Ces cas ont été rapportés le plus souvent chez des
patients immunosupprimés. Fait inquiétant, certains d'entre eux semblent être apparus en
absence de traitement à l'oseltamivir, comme dans les deux cas cliniques que nous
présentons ici. L’objectif de cette étude était de déterminer et de quantifier la présence de la
mutation H275Y avant et durant le traitement chez un patient immunosupprimé et chez un
patient immunocompétent ayant reçu un traitement prophylactique.
Le premier cas est celui d’un patient immunosupprimé qui présentait des
symptômes
grippaux,
lors
de
l’admission
à
l’hôpital.
L’infection
par
le
virus
A(H1N1)pdm09 a été confirmée par PCR entrainant le début du traitement avec
l’oseltamivir. Après 27 jours de traitement, et sans amélioration de l’état clinique du
patient, l’oseltamivir a été remplacé par le zanamivir. Sept échantillons de lavages nasaux
(avant, pendant et après le traitement) du patient immunosupprimé ont été soumis à une
amplification par PCR quantitative en temps réel dans le but de discriminer les populations
virales sauvage et mutante, à l’aide de deux sondes fluorescentes spécifiques à chacun des
variants (275H/Y). Afin de mieux évaluer la diversité génétique de la population virale, les
échantillons ont été soumis également au séquençage à haut débit.
Le deuxième cas est relié à deux membres d’une même famille. Le cas index est un
jeune adolescent qui s’est présenté à l’hôpital avec des symptômes grippaux. Suite à la
confirmation de la présence du virus A(H1N1)pdm09 dans un lavage nasal prélevé lors de
103
l’admission, le traitement à l’oseltamivir a été débuté. Un traitement prophylactique a été
administré aux membres de sa famille, qui avaient des maladies subjacentes. Le père du cas
index a présenté des symptômes grippaux 24 h après le début du traitement prophylactique
avec l’oseltamivir. Un lavage nasal prélevé 7 jours après le début du traitement a été positif
pour la souche A(H1N1)pdm09 et révélait la présence de la mutation H275Y (absente chez
le fils).
Dans le premier cas, la PCR conventionnelle a permis de détecter une population
sauvage prédominante (H275) dans l’échantillon prélevé avant le traitement. Toutefois, une
sous population résistante (H275Y) représentant 0.08% et 3.5% de la population totale a été
détectée par PCR discriminative et par séquençage à haut débit, respectivement. Cette
population mineure résistante aux médicaments n'a pas pu être détectée par des méthodes
conventionnelles telles que les tests de résistance phénotypique et le PCR suivi du
séquençage de type Sanger. L’analyse des échantillons prélevés lors du traitement à
l’oseltamivir révélait une augmentation de la population mutante (H275Y) atteignant 97%
de la population totale (confirmé par les deux méthodes après 11 jours de traitement à
l’oseltamivir). Suite à un traitement au zanamivir pendant 17 jours, le patient s’est rétabli
de son infection virale, puisque les résultats étaient négatifs par PCR conventionnelle et en
temps réel.
L’analyse des résultats du séquençage à haut débit, nous ont révélé qu’il ne semblait
pas y avoir d’autres mutations liées à la mutation H275Y dans le gène de la NA, qui
auraient pu affecter la capacité réplicative de la souche mutante. L’échantillon avant le
traitement à l’oseltamivir contenait une sous-population résistante à l’oseltamivir qui
différait de la souche sauvage par deux nucléotides : 1- une cytosine par une thymine à la
position 823 dans le gène de la NA causant la mutation H275Y et 2- une guanine par une
adénine à la position 459 dans le gène NS1, ne causant pas de changement d’acide aminé
(mutation silencieuse).
Nos résultats indiquent que la mutation H275Y était présente avant le début du
traitement antiviral, représentant jusqu’à 3% de la population totale, et était la seule
104
responsable du phénotype de résistance à l’antivirale. Il est donc possible que la souche
résistante ait été transmise par un des membres de sa famille (tous non-traités et ayant
présenté des symptômes grippaux peu avant le patient immunosupprimé) ou acquise à
l’hôpital lors des visites médicales. La détection des populations mixtes (274Y et H274)
dans l'échantillon nasal avant traitement antiviral dans le cas clinique étudié ici, suggère
que la mutation a été transmise et que la sélection exercée par l’oseltamivir a permis à la
sous-population résistante de devenir dominante.
Dans le deuxième cas, nous avons observé que l’échantillon prélevé chez le cas
index (fils) avant le début du traitement était sensible à l’oseltamivir, alors que celui du
père prélevé 7 jours après le début de la prophylaxie était résistant à l’antiviral. L’analyse
du séquençage à haut débit des deux échantillons nous a permis de détecter une souspopulation mineure (2.4%) résistante à l’oseltamivir dans l’échantillon du cas index (avant
le début du traitement à l’oseltamivir). Cette sous-population résistante (H275Y) a été
transmisse au père, en même temps que la population sauvage, et la dose prophylactique
d’antiviral administrée au père (administration uniquotidienne dans le cas de la prophylaxie
au lieu de biquotidienne dans le cas du traitement) a exercé une puissante pression sélective
permettant à la souche A(H1N1)pdm09-MUT de devenir dominante rapidement.
Une comparaison des séquences de deux échantillons (père et fils) a permis de
déceler un ensemble de 60 variations, qui sont dues possiblement au temps de réplication
chez le père (8 jours de différence entre l’échantillon prélevé chez le cas index et le père du
cas index). Bien que ces variations semblent importantes, on a décelé des variations
semblables entre deux échantillons prélevés à un intervalle de 5 jours chez un même patient
(étude 1), ce qui supporte fortement la théorie de transmission fils-père.
L'observation la plus importante des deux études est que la mutation la plus
couramment associée à la résistance à l'oseltamivir (H275Y) est présente dans la population
virale de certains individus avant le début du traitement antiviral. Cette observation est très
importante car l'existence préalable de la mutation H275Y permet une sélection plus rapide
de la résistance à l’oseltamivir suite à la pression sélective de l’antiviral, que si elle est
105
sélectionnée de novo à partir d’une population entièrement sauvage. De plus, l’apparition
de la mutation H275Y en l’absence de pression sélective indique que la mutation n’est pas
très nuisible au virus et que l’apparition de mutations compensatrices permettrait à la
souche mutante d’avoir une meilleure capacité réplicative et donc un avantage sur la souche
sauvage.
Dans le but de discriminer les deux populations de virus (sauvage et mutante) nous
avons utilisé une méthode de PCR en temps réel qui nécessite deux sondes spécifiques à
chaque variant viral. La spécificité de chaque sonde est due à l’intégration des acides
nucléiques modifiés ou LNA (locked nucleic acids) dans la séquence des sondes. Ceux-ci
ont la fonction d’augmenter la température d’hybridation nécessaire à l’obtention d’une
sonde capable de différencier une cible qui ne diffère d’une autre que par une mutation
ponctuelle, comme c’est le cas pour les échantillons cliniques A(H1N1)pdm09 que nous
avons étudiés ici.
Nous avons observé que les proportions de virus (sauvage et mutant) obtenues par
PCR en temps réel et par séquençage à haut débit étaient parfois un peu différentes pour un
même échantillon. Ces différences s’expliquent principalement par les nombreuses étapes
d’amplification requises pour le séquençage à haut débit (contrairement à la PCR
discriminative). Il est important de noter que dans les deux cas cliniques,
la PCR
conventionnelle ne nous a pas permis de détecter la présence de la mutation de résistance à
l'oseltamivir
(H275Y)
soulignant
ainsi
l’importance
de
l’utilisation
de
la
PCR
discriminative et du séquençage à haut débit.
Jusqu’à
présent,
l’apparition
et
la transmission des souches résistantes à
l’oseltamivir ne semblait être qu’un problème occasionnel. Malheureusement, une éclosion
de souche résistante à l’oseltamivir a été récemment décrite en Australie et ce en l’absence
de pression sélective de l’antiviral. Parmi les isolats cliniques analysés entre la période de
mai et de septembre 2011, à Hunter New England (HNE) en Australie, 15% d’entre eux
contenaient la substitution H275Y responsable de la résistance à l'oseltamivir et seulement
un patient avait reçu un traitement à l’oseltamivir. L’analyse génétique des séquences
106
suggère la propagation d'un seul variant. La plus importante découverte de cette éclosion
est la mise en évidence de trois possibles mutations dans le gène de la NA (V241I, N369K
et N386S) qui pourraient compenser l’effet déstabilisateur de la mutation H275Y (Hurt et
al., 2012).
107
CHAPITRE VI : CONCLUSION ET PERSPECTIVES
L'oseltamivir est l'antiviral le plus utilisé dans des nombreux pays pour traiter et
prévenir
les
infections d'influenza.
Malheureusement,
les expériences passées nous
montrent que l’apparition et la propagation des souches résistantes aux antiviraux peuvent
avoir lieu spontanément et rapidement. En moins de 12 mois, une souche saisonnière
résistante à l’oseltamivir portant la mutation H275Y a remplacé complètement la souche
sensible à l’agent antiviral, le rendant totalement inefficace.
Nous avons démontré que la souche pandémique A(H1N1)pdm09 contenant la
mutation H275Y qui confère la résistante à l’oseltamivir possède une capacité réplicative
réduite, ce qui peut sembler rassurant du point de vue clinique. Toutefois, il ne faut pas
oublier que des mutations compensatrices peuvent survenir et rétablir la capacité réplicative
des virus résistants. C’est d’ailleurs ce que l’on a observé lors des saisons infectieuses
2007/8/9. C’est pourquoi, il est très important de continuer de surveiller, tant de manière
locale qu’internationale, l’apparition et la transmission des cas de résistance associés à la
mutation H275Y en particulier.
Grâce au modèle mathématique, nous concluons que le temps d’infection est le
paramètre principal responsable de la réplication efficace du virus mutant H275Y des
saisons infectieuses 2007/8/9. La diminution significative du temps d’infection pour la
souche
A/Brisbane/57/2007-mutante a permis de compenser la diminution du taux de
production de virions et l'augmentation du temps de latence, lui permettant ainsi de devenir
la souche dominante. Puisque la souche A(H1N1)pdm09-mutante ne possède pas cet
avantage, il est normal qu’elle ne soit pas dominante pour l’instant. On peut donc conclure
que la capacité de réplication d'une souche virale peut être considérée comme un équilibre
entre l'infectivité de la souche (la quantité de virus produite par les cellules infectées) et le
temps de latence, car ces deux paramètres ont été identifiés comme étant impliqués dans
l’amélioration (chez la souche A/Brisbane/57/2007-mutante) ou la diminution (chez la
souche A/H1N1pdm09-mutante) de la capacité réplicative virale.
108
Les deux cas cliniques nous ont permis de démontrer que la mutation la plus
couramment associée à la résistance à l'oseltamivir (H275Y) peut surgir naturellement chez
certains individus en l’absence de traitement antiviral. Ceci peut s’avérer problématique,
car l’utilisation de concentrations sub-optimales d’antiviral (comme celles utilisés en
prophylaxie) pourrait exercer une pression sélective qui permettrait à la souche résistante de
devenir la souche dominante.
À la lumière de nos résultats, nous pouvons prédire que la souche pandémique
résistante à l'oseltamivir (H275Y) ne circulera pas de manière dominante à moins que des
mutations compensatrices apparaissent dans le bagage génétique des virus A(H1N1)pdm09,
ou bien que l'antiviral soit utilisé de telle façon qu'il y ait une pression sélective importante
(comme on l’a observé dans les cas cliniques, i.e., chez des individus immunosupprimés ou
recevant des doses sub-optimales d’antiviral). Jusqu'à présent, nos observations ont été
confirmées par le comportement de la souche pandémique dans la population, i.e., la
souche sauvage est toujours dominante malgré l'émergence du virus mutant (H275Y)
particulièrement chez les individus immunosupprimés.
Heureusement, les cas de résistance au zanamivir sont très rares, ce qui fait de cet
agent le seul choix disponible pour traiter et prévenir les infections avec des souches
d’influenza résistantes aux adamantanes et à l’oseltamivir. Les alternatives quant au choix
des antiviraux étant si limité en cas de résistance, il est donc très important de continuer le
développement de nouvelles molécules contre les virus influenza. À ce sujet, il serait très
approprié de cibler différentes étapes du cycle réplicatif du virus, afin de diminuer la
fréquence de résistance. Une approche très intéressante, qui est utilisée contre des virus
comme le VIH, est la combinaison des différents antiviraux. Ceux-ci pourraient avoir une
action synergique tout en diminuant la toxicité et l’apparition des cas de résistance.
Nous avons démontré la pertinence de l’utilisation du modèle de compétition pour
mieux évaluer deux souches différentes. À l’avenir, il serait très intéressant d’utiliser ces
modèles in vitro et in vivo pour étudier d’autres mutations qui confèrent la résistance à
l’oseltamivir dans la souche pandémique, telle la mutation I223V (Chen et al., 2009)
109
(Pizzorno et al., 2012). Il serait également pertinent d’évaluer l’impact des mutations
connues comme ayant un effet compensatoire dans le bagage génétique de la souche
pandémique et d’étudier les capacités réplicatives de celles-ci. Puisqu’il est connu qu’il
existe un lien étroit entre les protéines de la neuraminidase et de la hémagglutinine,
l’introduction du gène de la HA en plus de la NA mutée de la souche A/Brisbane /57/2007
dans le bagage génétique de la souche pandémique nous permettrait de mieux comprendre
la balance entre ces deux protéines.
110
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