Optimisation de l`activité antitumorale des lymphocytes T Vγ9Vδ2

UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER
U.F.R SVT
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE
Délivré par l’université de Toulouse III-Paul Sabatier
Spécialité Immunologie
Présentée et soutenue publiquement
Par
Julie GERTNER-DARDENNE
Le 13 Février 2008
Optimisation de l’activité antitumorale des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains
Directeur de thèse : Dr Jean Jacques FOURNIE
JURY
Guy Laurent,………………………………………………………………………..Président
Jean Jacques Fournié, …………………………………………………Directeur de thèse
Julie Deschanet-Merville,………………………………………………………. Rapporteur
Catherine Thieblemont,………………………………………………………….Rapporteur
Marc Bonneville,………………………………………………………………. Examinateur
Virginie Laffont,…... ……………………………………………………………Examinateur
1
A mon mari avec tout mon amour
A notre fils, Louis
2
Ce n'est pas le but de la promenade qui est important mais les
petits pas qui y mènent.
(Proverbe chinois)
3
Je remercie,
Le professeur Guy LAURENT qui m’a fait l’honneur de présider le jury
Le docteur Julie DESCHANET-MERVILLE et le docteur catherine THIEBLEMONT
pour avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse
Le professeur BONNEVILLE et le Docteur Virginie LAFFONT pour avoir accepté
d’en être les examinateurs
Le docteur Jean Jacques FOURNIE, « the Boss », pour m’avoir accueillie dans son
équipe, donné gout à ce métier de passion, pour m’avoir soutenue (et supportée !!!)
durant ces 4 années, pour la confiance qu’il m’a témoignée, tout simplement pour
avoir cru en moi.
Toute l’équipe « Immunité innée, hémopathie maligne et thérapie ant-cancéreuse » :
Ludo, Séverine, Rémy, Mary, charlotte, Damdam, Nicolas, Raphael, Samar, ludi, les
Emilie, Fred sans qui j’aurais engagé une guerre avec mon ordinateur, tout
particulièrement Del pour son amitié et son trop plein d’énergie stimulant, Guy
laurent pour sa confiance, Anne, les deux chris pour leur bonne humeur constante et
l’excellente collaboration au cour de ce travail.
Tous ceux qui m’ont accompagnée en dehors de la recherche, ma famille bien sur, qui
constitue pour moi une source d’énergie intarrissable, papa, maman sans qui je n’en
serais probablement pas là aujourd’hui, Bigjo, Mouti et papi. Mes amis, Pilou, Cyril,
Zanot, Pascu, 4 paires d’épaules solides et fidèles, et ma Pigue, tous témoins de mes
coups durs et de mes joies … comme on dit des amis pour la vie !
Et puis surtout les deux hommes de ma vie, mon mari, mon amour, et le fruit de notre
union, notre plus grande réussite, Louis, en espérant que beaucoup d’autres
suivront !!!
4
SOMMAIRE
ABREVATIONS ET ANGLICISMES
LISTE DES FIGURES
INTRODUCTION
I. Introduction générale : l’Immunité
II. Immunité anti-tumorale
II-1. Les antigènes de tumeurs
II-1-1. Mise en évidence
II-1-2. Les antigènes de tumeur chez l’homme
II-2. Les effecteurs de l’immunité anti-tumorale
II-2-1. Les cytokines
II-2-2. Les effecteurs de l’immunité adaptative
II-2-2-a. Les lymphocytes T CD8+
II-2-2-b. Les lymphocytes T CD4+
II-2-3-c. Les cellules NKT
II-2-3. Les effecteurs de l’immunité innée
II-2-3-a. Les cellules dendritiques
II-2-3-b. Les cellules NK
II-2-3-d. Les lymphocytes T γδ
II-3. Dynamique de la réponse immunitaire anti-tumorale normale
II-4. L’échappement tumoral
II-4-1. Résistance des cellules malignes aux effecteurs immuns
II-4-2. Inefficacité ou absence de l’induction de réponse immune
III. Immunothérapie des cancers
III-1. Immunothérapie passive par transfert adoptif de lymphocytes
III-2. Immunothérapies passives par des anticorps anti-tumoraux
III-3. Immunothérapie active non spécifique
III-4. Immunothérapie active spécifique : la vaccination
5
III-4-1. Les vaccins cellulaires
III-4-2. Les vaccins peptidiques
III-4-3. Les vaccins avec protéines ou peptides présentés par DC
III-4-4. Les vaccins recombinants / les vaccins avec l’ADN nu
IV. les lymphocytes T γδ
IV-1. Ontogénie
IV-2. Les différentes sous populations des lymphocytes T Vγ9Vδ2
IV-3. Réactivité des lymphocytes T Vγ9Vδ2
IV-3-1. Les ligands des lymphocytes T Vγ9Vδ2
IV-3-2. Biosynthèse des PAg par les voies MVA et DOXP
IV-3-3. Mécanismes de reconnaissance
IV-4. Interaction cellule cytotoxique – cellule cible
IV-4-1. Chimiotaxie et diapédèse
IV-4-2. La synapse immunologique
IV-4-3. La trogocytose
IV-4-3a. Mécanismes
IV-4-3b. Conséquences fonctionnelles
IV-4-4. La cytotoxicité
IV-4-5. Le contrôle de l’activation
IV-5. Cellules T γδ et surveillance anti-tumorale
IV-6. Cellules T γδ et immunothérapies
IV-6-1. Approches impliquant l’administration de PAg synthétiques
IV-6-2. Approches impliquant l’administration d’ABP
IV-6-2. Approches impliquant le transfert adoptif de cellules T Vγ9Vδ2
IV-6-2. Approches impliquant l’utilisation concomitante de DC et de
cellules T Vγ9Vδ2
OBJECTIF DU TRAVAIL
RESULTATS
PARTIE 1 : Etude de l’activité moléculaire à la synapse des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains
- Gertner J, Poupot M, Gray B, Fournié JJ. “lipophile fluorochrome trackers of membrane
transfers between immune cells” Immunological Investigations, 36:1–21,2007
6
- Gertner J, Wiedemann A, Poupot M, Fournié JJ. “Human γδ T lymphocytes strip and kill
tumor cells simultaneously.” Immunol letter 2007
PARTIE 2 : Etude de l’effet de la combinaison de phosphoantigène et
d’anticorps monoclonaux à usage thérapeutique.
- Gertner J., Bezombes C., Laurent G., Fournié JJ. Brevet Europeen n°EP 06291146-8
INSERM (2006). “Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic
antibodies using γδ cell activator compounds”
- Gertner-Dardenne J., Cecile Bonnafous, Christine Bezombes, Virginie Scaglione, Emilie
Gross, Jean-François Lepage, Anne Quillet Mary, Helene Sicard, Guy Laurent and Jean
Jacques Fournié “Gamma delta lymphocyte stimulation with phosphoantigens increase the
efficiency of therapeutic antibodies” Manuscript in prep.
CONCLUSION
ANNEXES
- Poupot M., Gertner J., Fournié JJ. «Molecular transfers through transient lymphoid cell-cell
channel». in: Cell-Cell Channels 2006, editors: Frantisek Baluska, Dieter Volkmann and Peter
W. Barlow. Landes Biosciences, Springer, New York, USA
- Fournié JJ., Gertner J., Poupot M., Wiedemann A. « Single cell monitoring of trogocytosis
and killing in lytic synapse between anaplastic large cell lymphoma and activated human γδ T
lymphocytes » Haematologica Reports 2006, 2: 35-36.
- Gertner J., Scotet E., Poupot M., Bonneville M., Fournié JJ. (July 2007) “Lymphocytes:
gamma delta”. in: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester
http://www.els.net.gate1.inist.fr/ [doi: 10.1002/9780470015902.a0001195.pub2]
- Thedrez A., Sabourdin C., Gertner J., Devilder MC., Alain-Maillet S., Fournié JJ., Scotet
E., Bonneville M. «Self/non self discrimination by human γδ T cells: simple solutions for a
complex issue?» Immunological review 2007, 215 :123-135.
- Gertner-Dardenne J., Pont Frederic, Fournié Jean-Jacques “The MVA pathway
transcriptome as predictive tool for biosynthesis of phosphoantigen activating anticancer
human γδ T lymphocytes”. Manuscript in prep.
BIBLIOGRAPHIE
7
Julie GERTNER-DARDENNE
Optimisation de l’activité anti-tumorale des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains
Directeur de thèse : Jean Jacques FOURNIE
Toulouse, 13 Février 2008
Si tous les vertébrés possèdent des lymphocytes T γδ, seuls les primates ont une souspopulation sanguine exprimant un récepteur de type TCR Vγ9Vδ2. Cette dernière réagit à des
phosphoantigènes non-peptidiques d’origine bactérienne et tumorale, déclenchant ainsi son
activité anti-infectieuse et anti-cancéreuse. Cette thèse traite de l’optimisation de son potentiel
thérapeutique anti-cancéreux. Ces lymphocytes cytotoxiques capturent des fragments
membranaires de leurs cellules cibles et sécrètent leurs granules cytolytiques, à travers leur
synapse immunologique. L’étude par vidéo-microscopie de l’activité moléculaire à la synapse
des lymphocytes T γδ révèle la simultanéité de ces deux processus. Ainsi, le renforcement de
l’attachement des lymphocytes T γδ à leurs cibles par la combinaison de phosphoantigène et
d’anticorps thérapeutiques permet d’optimiser leur efficacité anti-tumorale.
Cette thèse présente donc les bases moléculaires d’une nouvelle approche
thérapeutique anti-cancéreuse.
Mots-Clefs : Lymphocytes T γδ, Phosphoantigène, Anticorps monoclonaux, Membrane,
Cytotoxicité, ADCC, Vidéo-microscopie, Cancer, Thérapie.
Discipline : Immunophysiopathologie
INSERM U563, CPTP, CHU Purpan – BP 3028, 31024 TOULOUSE CEDEX 3
8
ABREVIATIONS ET ANGLICISMES
ABP, aminobiphosphonate ;
ADCA, Antibody dependant cell Attachment ;
ADCC, Antibody dependant cell cytotoxicity ;
Ac, anticorps ;
Ag, antigen ;
AICD , activation-induced cell death ;
AML, Acute Myeloid Lymphoma ;
ApoA1, apolipoprotein A1 ;
ATPS, ATP synthase ;
BCR, B cell receptor ;
BrHPP, bromohydrine pyrophosphate ;
CDC, cytotoxicité dépendante du complément ;
CDR(1-3), complementary determine region (1-3) ;
CMH-I / II, complexe majeur d’histocompatibilité de classe I / II ;
CPA, cellules présentatrices d’antigène ;
CTL, lymphocytes T cytotoxiques ;
DC, dendritic cell ;
DMAPP, dimethylallyl pyrophosphate ;
DOXP, deoxy-d-xylulose-5-phosphate ;
Fc, Fragment constant ;
FcR, Récepteur au Fragment constant ;
HDMAPP, 4-hydroxy-3-dimethylallyl pyrophosphate ;
HMB-PP, (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate
HSP, heat shock protein ;
IDC, Immature Dendritic Cell ;
IFN, interferon ;
Ig, Immunoglobuline ;
IKDC, IFN-produced Killer Dendritic Cell ;
IL, interleukine ;
IPP, isopentenyl pyrophosphate ;
9
LF, lymphomes folliculaires ;
LLC, leucémie lymphoïde chronique ;
LMC, leucémie myéloïde chronique ;
LPS, Lipopolysaccharide ;
mAb, monoclonal antibody ;
MICA /B, MHC class I related chain ;
MVA, mevalonate ;
NHL, non-Hodgkins lymphoma ;
NK, natural killer ;
PAg, phosphoantigène ;
PAMP, pathogen-associated molecular pattern ;
PBL, periferal blood lymphocyte ;
pDC, plasmacytoïd Dendritic Cell ;
PGE 2, Prostaglandine E 2;
PRR, Pattern Recognition Receptor ;
RTX, Rituximab ;
TCR, T cell receptor ;
TIL, Tumor infiltrating lymphocytes ;
TGF, tumor growth factor ;
TLR, Toll Like Receptor ;
TNF, Tumor Necrosis Factor ;
TRAIL, tumour-necrosis factor (TNF)-Related Apoptosis-Inducing Ligand ;
ULBP(1-4), UL16 Binding Protein.
10
LISTES DES FIGURES
Figure 1 : Obtention de clones CTL anti-tumoraux autologues dirigés contre MAGE
Figure 2 : Activation des cellules T CD4+
Figure 3 : Les IKDC, un nouveau type de cellule immunitaire
Figure 4 : Régulation de l’activation des cellules NK
Figure 5 : Cellules NKT et immunothérapie
Figure 6 : Dynamique de la réponse antitumorale « normale »
Figure 7 : Structure des différents anticorps monoclonaux thérapeutiques
Figure 8 : Structure du Rituximab
Figure 9 : Modes d’action du Rituximab
Figure 10 : Les stades de différentiation des lymphocytes T
Figure 11 : Modèle d’intensité du signal Notch et de synergie entre les signaux Notch et TCR
Figure 12 : Etapes développementales de génération des lymphocytes T γδ murins.
Figure 13 : Les sous populations de lymphocytes T γδ humains
Figure 14 : Les premiers phosphoantigènes identifiés
Figure 15 : Structure générale des phosphoantigènes
Figure 16 : Les différents phosphoantigènes et leur bioactivité pour les cellules T γδ
Figure 17 : Structure générale des Alkylamines
Figure 18 : Les aminobisphosphonates thérapeutiques et leurs bioactivités pour les Tγδ
Figure 19 : Biosynthèse des phosphoantigènes
Figure 20 : Pharmacophore des phosphoantigènes naturels et synthétiques
Figure 21 : Modèle mécanistique de la trogocytose
Figure 22 : Trogocytose associée au relargage de perforine dans la synapse lytique
Figure 23 : Bilan de l’effet de la combinaison RTX-PAg
Table 1 : Les Ag de tumeurs uniques
Table 2 : Les Ag de tumeurs partagés spécifiques de tumeur
Table 3 : Les Ag de tumeurs de différentiation
Table 4 : Les Ag surexprimés dans les tumeurs
Table 5 : Expression des granzymes et de la perforine par les sous-populations de PBMCs
Table 6 : Les principaux récepteurs au fragment constant des immunoglobulines
Table 7 : Les différents types de cellules NKT
Table 8 : Anticorps monoclonaux et indications thérapeutiques anti-cancéreuses
11
INTRODUCTION
I- INTRODUCTION GENERALE : L’IMMUNITE
L’immunité est « la science de la défense contre le non-soi dans le respect de soi»
(Jean Dausset, immunologiste français, prix Nobel en 1980 pour sa découverte en 1958 du
complexe majeur d’histocompatibilité).
Ainsi, le fonctionnement physiologique du système immunitaire repose sur différents
concepts que sont : la discrimination soi/non-soi, la reconnaissance du soi altéré, la théorie du
danger, et la mémoire immunitaire.
Depuis les années 1950, la théorie qui domine en immunologie est celle de la
reconnaissance du "soi" et du "non-soi" par le système immunitaire adaptatif. Cependant, ce
modèle ne permet pas d'expliquer de manière satisfaisante les phénomènes de tolérance, de
rejet de greffe, ni la nécessité de la présentation de l'antigène. Ainsi, en 1989, Charlie
Janeway propose un modèle selon lequel l'immunité innée serait la véritable gardienne des
clefs du déclenchement d'une réponse immunitaire. La décision de réagir ou non, face à un
agent étranger reposerait sur la reconnaissance de motifs par des récepteurs putatifs qu'il
nomme les PRR (pour l'anglais Pattern Recognition Receptor). Ce modèle est approfondi à
partir de 1994 par Polly Matzinger, qui développe la théorie du danger 1. D'après elle, le
déclenchement de la réponse immunitaire se ferait sur la base de motifs moléculaires associés
aux organismes pathogènes (PAMP, de l'anglais pathogen-associated molecular pattern) par
les PRR.
La discrimination entre le soi et le non-soi reste fondamentale en immunologie. Les
clones de cellules immunitaires qui sont capables de reconnaître les antigènes (Ag) du soi, et
qui risqueraient de les attaquer, sont en fait éliminés rapidement (habituellement dans leur
phase néonatale) au cours du développement des animaux. Cette délétion clonale, aboutit à
l’apparition de la tolérance du système immunitaire envers les Ag du soi.
En revanche, le système immunitaire reste capable d’identifier les cellules tumorales
qui, bien qu’appartenant au soi, portent à leur surface des Ag caractéristiques de leur
transformation (le « soi modifié »).
12
Un autre dogme de l’immunologie est la dichotomie du système immunitaire en deux
pans de l’immunité : l’inné et l’adaptatif.
D’une part, l’immunité innée qui est présente très tôt au cours de l’évolution des
espèces, représente une première barrière de défense contre les agents pathogènes, et est
immédiatement activée par la rencontre de l’agent infectieux. Elle fait intervenir de divers
types de cellules hématopoïétiques (polynucléaires, macrophages, mastocytes, cellules
dendritiques, lymphocytes Natural Killer) mais également épithéliales et stromales. La
réponse immunitaire innée est rapide, sans mémoire et indépendante de l'antigène.
D’autre part l’immunité spécifique développe une réponse plus lente (en quelques
jours) et spécifique d’un antigène donné avec persistance d’une mémoire immunologique à
l’Ag. Ce système est apparu avec les espèces animales plus évoluées. Il est constitué des
lymphocytes T et B. Cette réponse est adaptative vis-à-vis d’une spécificité moléculaire :
l’antigène, et consiste en la sélection progressive de clones de lymphocytes capables de le
cibler. Cette réponse adaptative est lente, strictement dépendante des antigènes, et possède
une mémoire immunologique. Cette notion de mémoire immunologique correspond à la
capacité des cellules immunocompétentes à répondre de façon accélérée, particulièrement
intense, à une nouvelle stimulation par un Ag déjà rencontré. La mémoire immunitaire repose
sur (i) un nombre de lymphocytes spécifiques plus important après l’expansion du premier
clone dans la réponse primaire, (ii) une meilleure adaptation des récepteurs à l’Ag, (iii) la
survie prolongée de ces lymphocytes, et enfin (iv) l’entretien de cette mémoire par une
exposition antigénique persistante ou répétée.
A la frontière entre immunité innée et adaptative cependant, certains lymphocytes tels
les lymphocytes NKT et Tγδ, sont munis de récepteurs spécifiques à l’antigène quoique sans
avérer de capacité adaptative post-natale.
Cette dichotomie immunité innée versus immunité adaptative, ne correspond pas
totalement à la réalité. En effet, les récepteurs caractéristiques de l’immunité innée et de
l’immunité acquise s’organisent probablement en un réseau bien plus intriqué qu’on ne
l’aurait initialement pensé. À l’évidence, il s’agit là de cibles particulièrement intéressantes
pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.
13
II- L’IMMUNITE ANTI TUMORALE
Une tumeur ou néoplasie est actuellement définie comme une prolifération cellulaire
excessive, ne répondant plus aux mécanismes de régulation normaux, aboutissant à une
néoformation tissulaire, ressemblant plus ou moins à un tissu normal, mais ayant tendance à
persister et à s’accroître sans contrôle.
Une tumeur échappe aux mécanismes normaux de régulation car il s'agit d'un tissu
dont la croissance est autonome. Cette autonomie n'est toutefois que relative et incomplète.
Pour exemple, le stroma, et notamment la vascularisation des cancers, dépend de l’hôte.
Cependant alors qu’il s’agit de cellules du soi, le système immunitaire est capable de les
reconnaître et de diriger des réponses cytotoxiques contre ces dernières. Dans ce cas le
système immunitaire reconnaît un « soi altéré » grâce à l’expression par les cellules tumorales
d’Ag particulier ou de molécules membranaires induite par la transformation néoplasique.
Ainsi le problème de l’immunité antitumorale ne se positionne pas totalement
différemment de la définition de l’immunité anti-infectieuse, mais plutôt comme une version
utile de l’auto-immunité.
L’existence de réponses immunitaires dirigées contre les tumeurs ne fait aucun doute.
De multiples observations, parfois très anciennes, l’attestent comme la découverte, au cours
d’autopsies, de tumeurs cliniquement silencieuses ou encore l’observation confirmée par des
données anatomopathologiques, de régressions spontanées de tumeurs. Par ailleurs, au cours
de la vie il y a deux périodes où le système immunitaire serait moins efficace : la période
néonatale et chez les sujets âgés, et c’est précisément durant ces deux périodes que
l’apparition de cancer est la plus fréquente.
De manière corrélée, les cancers sont plus fréquents chez les sujets immunodéprimés
comme les patients atteints du SIDA ou les tumeurs associées à des virus chez des patients
traités par immunosuppresseurs. De plus, une infiltration de cellules lymphoïdes
(lymphocytes T et cellules NK) a été constatée dans certaines tumeurs ce qui est d’ailleurs
considéré indicateur de pronostic plutôt favorable dans la majorité des cas, même si on
connaît aussi des exemples du contraire 2. Mais c’est dans les années 90 que cette immunosurveillance est réellement mise en exergue. En effet, l’oncogénèse est favorisée par
l’invalidation des gènes RAG-1, codant pour les protéines d’activation de la recombinaison
V(D)J nécessaires à l’expression des récepteurs des cellules T (TCR) et B (BCR) 3, du
14
récepteur à l’interféron gamma (IFNγ), cytokine centrale de l’immunité tant adaptative
qu’innée et de STAT-1, transducteur de l’effet de l’IFNγ, qui s’accompagnent d’une
augmentation claire de l’incidence des cancers chez l’animal.
Il est maintenant établi que deux conditions majeures sont nécessaires pour qu’une
immunité anti-cancéreuse spécifique puisse se développer : d’une part, l’existence d’antigènes
(Ag) restreints aux tumeurs et, d’autre part, la reconnaissance de ces Ag par les effecteurs de
l’immunité.
II-1/ Les Ag de tumeurs
II-1-1. Mise en évidence
L’approche génétique qui consiste à identifier les gènes qui codent pour un Ag
reconnu par un clone de lymphocytes T anti-tumoraux à permis de surmonter chez l’Homme
4
et chez la souris 5 le problème de l’identification de ces Ag.
Il faut rappeler alors les travaux expérimentaux de l’équipe de T Boon qui consistaient
à cultiver in vitro des cellules issues d’une biopsie de tumeur primaire, en présence de
lymphocytes périphériques du même sujet 4. Ces travaux ont permis la mise en évidence de la
reconnaissance par le système immunitaire des tumeurs humaines. En effet, au cours de cette
culture mixte, les lymphocytes reconnaissant des antigènes tumoraux, prolifèrent et se
différencient en lymphocytes T cytotoxiques (CTL), qui ont pu être clonés.
Les clones obtenus furent utilisés pour sélectionner des sous populations de cellules
tumorales dont les génomes pouvaient alors être comparés. C’est ainsi que les gènes codant
pour ces antigènes dits « de tumeur » ont été identifiés. Et c’est précisément dans ces
conditions que les gènes MAGE (mélanome antigen) ont été identifiés (Figure 1) 6.
15
Figure 1 : Obtention de clones CTL anti-tumoraux autologues dirigés contre L’Ag de tumeur MAGE.
II-1-2. Les Ag de tumeur chez l’Homme
Chez l’Homme, les Ag de tumeur ont été classés en quatre grands groupes sur la base
de leur modèle d’expression. Cette classification arbitraire présente l’intérêt d’être pratique.
En effet le modèle d’expression des Ag est le facteur critique déterminant leur utilité
potentielle pour l’immunothérapie des cancers.
Une première distinction peut être faite entre les Ag uniques (Table 1) qui résultent de
mutations ponctuelles des gènes exprimés ubiquitairement, et les Ag partagés qui sont
présents sur plusieurs tumeurs indépendantes. Les Ag partagés peuvent être ensuite divisés en
3 catégories : les Ag spécifiques de tumeur (Table 2), les Ag de différentiation (Table 3) et
les Ag surexprimés (Table 4).
Cette liste n’est pas exhaustive, en effet un grand éventail de peptides additionnels a
été décrit mais n’ont pas encore été inclus dans l’une ou l’autre de ces différentes catégories.
En effet, des protéines cellulaires anormales (et antigéniques) peuvent également provenir de
gènes viraux intégrés dans le génome de la cellule tumorale. Certains virus comme le virus
d’Epstein Barr 7, de l’hépatite B 8 ou encore des papillomes 9, 10 jouent un rôle initiateur dans
la cancérogenèse.
II-1-2-a. Les antigènes uniques
Les Ag uniques résultent de mutations ponctuelles des gènes exprimés
ubiquitairement. La mutation affecte souvent la région codante du gène et est unique à la
16
tumeur d’un patient ou restreinte à une très petite quantité de patients. Certaines de ces
mutations peuvent être impliquées dans la transformation tumorale. De tels Ag, lesquels sont
strictement spécifiques de tumeurs, peuvent jouer un rôle important dans la réponse immune
anti-tumorale des patients, mais la plupart d’entre eux ne peuvent pas être facilement utilisés
comme cibles immunothérapeutiques parce qu’ils ne sont pas partagés par les tumeurs de
différents patients.
Table 1: Ag exclusivement tumoraux
Gène / protéine
Tumeur
alpha-actinin-4
ARTC1
BCR-ABL
B-RAF
CASP-5
CASP-8
beta-catenin
Cdc27
CDK4
CDKN2A
COA-1
dek-can
EFTUD2
Elongation factor 2
ETV6-AML1
FN1
GPNMB
LDLR-fucosyltransferaseAS
HLA-A2d
HLA-A11d
hsp70-2
KIAAO205
MART2
ME1
MUM-1
MUM-2
MUM-3
neo-PAP
Myosin class I
NFYC
OGT
OS-9
pml-RARalpha
PRDX5
PTPRK
K-ras
N-ras
RBAF600
SIRT2
SNRPD1
SYT-SSX1 or -SSX2
Triosephosphate Isomerase
Carcinome du poumon
mélanome
Leucémie myéloïde chronique
mélanome
carcinome colorectal, gastrique
carcinome des cellules squameuses
mélanome
mélanome
mélanome
mélanome
colorectal carcinome
Leucémie myéloïde
mélanome
Carcinome du poumon
Leucémie lymphoblastique aigue
mélanome
mélanome
mélanome
carcinome des cellules rénales
mélanome
Carcinome des cellules rénales
Tumeur de la vessie
mélanome
Carcinoma du poumon
mélanome
mélanome
mélanome
mélanome
mélanome
carcinome du poumon
colorectal carcinome
mélanome
Leucémie promyélocytaire
mélanome
mélanome
Adénocarcinome pancréatique
mélanome
mélanome
mélanome
mélanome
sarcome
mélanome
17
II-1-2-b. Les antigènes partagés
Les Ag partagés sont présents sur plusieurs tumeurs indépendantes. Ils peuvent être
ensuite divisés en trois groupes.
•
Les antigènes spécifiques de tumeur
Ils sont habituellement le produit d’un gène normalement présent dans le génome,
mais qui ne s’exprime pas dans les cellules normales adultes. C’est le cas de la famille des
gènes MAGE (mélanome antigen), BAGE (bladder antigen) 11, GAGE (gastric antigen)
12, 13
,
RAGE (renal antigen) ou encore de l’α−foetoprotéine. Aucune expression des gènes MAGE
n’est détectable dans les tissus normaux, à l’exception des testicules et du placenta, mais 75 %
des mélanomes expriment au moins un des quatre gènes MAGE.
On peut citer également des Ag partagés par plusieurs types de tumeurs et résultant
d’un défaut de glycosylation. Dans les tumeurs mammaires, de l’ovaire ou du pancréas, une
glycosylation anormale de la mucine MUC1 engendre des déterminants antigéniques
nouveaux 14. Dans 80 % des cellules tumorales mammaires, le gène MUC1 est surexprimé ou
amplifié. La protéine Muc1 peut être clivée et son fragment soluble devient l’antigène
circulant Ca 15.3. Cet Ag constitue un marqueur très utilisé pour le suivi du cancer du sein.
Les seules cellules normales dans lesquelles une expression significative de tels gènes
a été détectée sont les trophoblastes placentaires. Parce que ces cellules n’expriment pas les
molécules de CMH de classe I, l’expression génique ne résulte pas dans l’expression de
peptides antigéniques, et de tels Ag peuvent donc être considéré comme strictement
spécifique de tumeurs.
18
Table 2 : Les Ag partagés spécifiques de tumeur
Gène / protéine
BAGE-1
GAGE-1,2,3,4,5,6,7,8
GnTVf
HERV-K-MEL
KK-LC-1
KM-HN-1
LAGE-1
MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A9,A10,A12,C2,
mucin
NA-88
NY-ESO-1 / LAGE-2
SAGE
Sp17
SSX-2
SSX-4
TRAG-3
TRP2-INT2
•
Les Ag de différentiation
Un second groupe d’Ag de tumeur partagés sont aussi exprimés dans le tissu normal.
Ces Ag peuvent être les produits de gènes de différenciation exprimés de façon limitée par les
tissus sains, mais surexprimés ou amplifiés dans les tissus cancéreux correspondants. Le
paradigme est la tyrosinase, laquelle est exprimée dans les mélanocytes normaux et dans la
plupart des mélanomes. Les Ag de ce groupe ne sont pas spécifiques de tumeurs, et leur
utilisation comme cible pour l’immunothérapie des cancers peut résulter dans l’auto-immunité
autour des tissus normaux correspondant.
Dans le cas des mélanocytes, le risque d’induire des effets secondaires sévères,
apparaît minime, et pourrait être limité à l’apparition de vitiligo. Des effets secondaires
d’auto-immunité plus sérieux concernent l’Ag carcinoembryonique (ACE), une protéine
oncofoetale exprimée dans l’épithélium du colon sain et dans la plupart des carcinomes de
l’intestin. Des CTL dirigés contre un peptide de l’ACE ont été trouvés chez des patients
immunisés avec un poxvirus recombinant contenant le gène de l’ACE 15. Il s’agit par exemple
de protéines spécifiques des mélanocytes comme la tyrosinase
A/MART1 18, gp75 19, 20.
19
16
, la gp100
17
, Melan-
Table 3 : Ag de différentiation
•
Gène / protéine
Tumeur
ACE
gp100 / Pmel17
Kallikrein 4
mammaglobin-A
Melan-A / MART-1
NY-BR-1
OA1
PSA
RAB38 / NY-MEL-1
TRP-1 / gp75
TRP-2
tyrosinase
carcinome de l’intestin
mélanome
carcinome de la prostate
cancer du sein
mélanome
cancer du sein
mélanome
carcinome de la prostate
mélanome
mélanome
mélanome
mélanome
Ag normaux surexprimés par les cellules tumorales
Il est beaucoup plus difficile de faire prédictions concernant la sécurité du ciblage des
Ag partagés du troisième groupe, lesquels sont exprimés dans une large variété de tissus
normaux et surexprimés dans les tumeurs. Parce que une faible quantité de peptide est requise
pour la reconnaissance par les CTL, un faible niveau d’expression dans les tissus normaux
peut signifier qu’il n’y a pas eu de dommages liés à la mise en place d’une réponse autoimmune. Cependant, ce seuil est difficile à définir.
L’équipe de Boone T a également mis en évidence l’existence d’un seuil d’expression
du gène en dessous duquel il n’y a pas assez de protéines et donc de peptides antigéniques
présentés pour permettre une reconnaissance par un CTL 21. C’est la raison pour laquelle les
CTL anti-tumoraux reconnaissent parfois des Ag codés par des gènes qui sont exprimés dans
beaucoup de tissus, mais qui sont plus fortement exprimés dans des tumeurs.
Par exemple, une seule copie du proto-oncogène HER-2/neu est présente dans les
cellules normales, mais le gène est amplifié dans certaines cellules tumorales 22. La protéine
HER-2/neu, à peine détectable en immuno-histochimie dans les tissus adultes, est surexprimée
dans environ 30 % des cancers du sein et de l’ovaire
23
. Il en va de même pour le gène
suppresseur p53 24. C’est le cas également des gènes RU2 dans les cellules rénales, à ceci près
que certains transcrits de RU2 (RU2A) ne sont exprimés que dans les cellules tumorales où ils
sont antigéniques 25.
20
Table 4 : Ag surexprimés par les tumeurs
Gène
Expression dans les tissus Normaux
adipophilin
AIM-2
BING-4
CPSF
cyclin D1
Ep-CAM
EphA3
FGF5
G250 / MN / CAIX
HER-2 / neu
IL13Ralpha2
Intestinal carboxyl esterase
alpha-foetoprotein
M-CSF
mdm-2
MMP-2
MUC1
p53
PBF
PSMA
RAGE-1
RNF43
RU2AS
secernin 1
SOX10
STEAP1
survivin
Telomerase
WT1
adipocytes, macrophages
Ubiquitaire (faible niveau)
Ubiquitaire (faible niveau)
Ubiquitaire (faible niveau)
Ubiquitaire (faible niveau)
Cellules épithéliales
plusieurs
Cerveau, reins
Estomac, foie, pancréas
Ubiquitaire (faible niveau)
Foie, intestin, reins
foie
Foie, reins
ubiquitaire (cerveau, muscles, poumons))
ubiquitaire
Epithélia glandulaires
Ubiquitaire (faible niveau)
Ovaires, pancréas, rate, foie
prostate, foie
rétine
Testicules, reins, bladder
ubiquitaire
Ubiquitaire (faible niveau)
prostate
Ubiquitaire
testicules, thymus, moelle osseuse noeuds lymphatiques
Testicules, ovaires, moelle osseuse, rate
II-2/ Les effecteurs de l’immunité anti-tumorale
L'immunité cellulaire anti-tumorale fait intervenir différents partenaires que sont les
cellules hématopoïétiques et les médiateurs solubles qu’elles produisent.
D'abord se sont les lymphocytes T cytotoxiques (CTLαβ, γδ, cellules NK) qui
reconnaissent des Ag spécifiques des tumeurs directement (cas des cellules NK) ou dans un
contexte CMH restreint (cas des CTLαβ). Cette dernière possibilité implique une présentation
de l’Ag tumoral par des cellules présentatrice d’Ag (CPA) telles que les macrophages, les
cellules dendritiques ou les cellules B, des virus inducteurs ou des Ag normaux hyper ou
anormalement exprimés par les cellules tumorales.
Ensuite, sous l'influence de lymphokines produites spécifiquement par les
lymphocytes T (αβ et γδ), les cellules NKT, et NK ou les macrophages vont aider à détruire
21
les cellules néoplasiques. Ainsi, les interférons (notamment l'IFNγ synthétisé par les
lymphocytes T) et l'interleukine 2 (IL2) augmentent la lyse des cellules cibles cancéreuses
sensibles et font apparaître une cytotoxicité pour d'autres cellules cancéreuses normalement
résistantes. De plus, les cellules NK et les lymphocytes T γδ, lorsqu'ils rencontrent leurs
cellules cibles, produisent de l'IFNγ et de l'IL2 (dont la production par les cellules T γδ est
plus faible que celle des cellules NK). Les fonctions de cytotoxicité (mort cellulaire) et de
cytostase (arrêt du cycle cellulaire) des macrophages pour les cellules tumorales sont
également accrues après activation des macrophages sous l'influence de l'IFNγ.
II-2-1. Les cytokines
Les cytokines sont de petites protéines qui participent à l’activation et à la
désactivation du système immunitaire en permettant la communication intercellulaire. Elles
agissent seules ou plus souvent de manière coordonnée et interviennent dans la mise en place
et le fonctionnement de mécanismes qui luttent contre les agents infectieux, l’allergie, la
greffe, l’auto-immunité ou encore contre la prolifération des cellules cancéreuses.
Les cytokines sont les outils et les cibles privilégiées de l’immuno-intervention antitumorale chez l’Homme puisque c’est par leur intermédiaire que les effecteurs de cette
immunité agissent en grande partie.
L’IL2, L’IFNγ, L’IL12, l’IL15 et l’IL18 sont parmi les principales cytokines qui
stimulent le développement de la réponse immune lymphocytaire T, et parallèlement, l’IL4,
l’IL13, l’IL10 et l’IL6 participent à la réponse humorale médiée par les lymphocytes B.
Certaines d’entre elles ont d’ailleurs un fort potentiel anti-tumoral telles que l’IL2, l’IL12,
l’IFNγ et le facteur de nécrose tumoral (TNF pour tumor necrosis factor).
L’IL2 est une des cytokines les plus anciennement identifiées pour son activité
comme facteur de prolifération des lymphocytes. Produite exclusivement par les lymphocytes
T, elle a une action principalement lymphocytaire puisque ce sont les lymphocytes T B et NK
qui en possèdent le récepteur. Ce récepteur extrêmement peu représenté sur les lymphocytes
au repos est surexprimé après leur activation.
L’IFNγ est sécrété par les lymphocytes T CD4, T cytotoxiques, les cellules NK et les
monocytes/macrophages (notamment après activation par l’IL2, l’IL12 et/ou l’IL18). L’IFNγ
22
induit l’expression des molécules d’HLA, est un puissant activateur des macrophages, stimule
la cytotoxicité anti-tumorale des cellules NK et des macrophages en stimulant la production
par ces derniers de radicaux libres oxygénés et du monoxyde d’azote. L’IFNγ stimule
également la production d’immunoglobuline G (IgG) par les lymphocytes B et inhibe la
prolifération des lymphocytes producteurs d’IL4.
L’IL12, produite par les monocytes/macrophages activés, possède une activité
synergique avec l’IL2 pour induire la sécrétion d’IFNγ par les cellules NK. L’IL12 favorise le
développement d’un certain type de lymphocytes T CD4 que sont les Th1 qui produisent les
cytokines favorisant le développement les lymphocytes cytotoxiques. L’administration de
l’IL12 à des souris porteuses de tumeurs peut prolonger leur survie en inhibant de manière
significative la progression tumorale. De plus, l’IL12 possède une activité anti-angiogénique
qui fait de cette cytokine un agent anti-tumoral potentiel avec un effet direct sur la
vascularisation tumorale 26.
Le TNF a un large spectre d’activités biologiques mais suscite un intérêt particulier
pour ses propriétés immuno-régulatrices et son action cytotoxique directe dirigée contre
certaines tumeurs humaines 27.
II-2-2. Les effecteurs de l’immunité adaptative
L’immunité anti-tumorale adaptative est dépendante des lymphocytes T αβ CD8+,
mais également les CD4+, qui ont une activité cytotoxique sur la tumeur. En effet des LT
CD8+ ne permet pas à elle seule d’éliminer la tumeur. Il existe d’autres mécanismes de
défense. Il faut en effet tenir compte du rôle des lymphocytes T CD4+ : ils « aident » les LT
CD8+ grâce à la production d’IFNγ et de TNF (pour Tumor Necrosis Factor) qui augmente
l’expression des molécules HLA de classe I, molécules qui permettent la présentation de
peptides tumoraux spécifiques aux LT CD8+.
II-2-2-a. Les différents stades de la maturation fonctionnelle des lymphocytes T
C’est au cours de leur développement intra thymique que les lymphocytes acquièrent
la
capacité
de
reconnaître
une
grande
variété
d’Ag
associés
aux
molécules
d’histocompatibilité du Soi. Cette propriété est d’une part liée à l’acquisition de récepteurs de
reconnaissance de l’antigène, les récepteurs T, dont la biosynthèse s’opère à un stade précoce
23
du développement intra thymique. Elle est d’autre part la conséquence de processus sélectifs
intra thymiques, qui favoriseront l’émergence de lymphocytes capables de reconnaître les
produits d’histocompatibilité du Soi tout en prévenant la production de thymocytes autoréactifs.
Les lymphocytes T αβ sont issus des cellules souches hématopoïétiques qui colonisent
le thymus. La phase précoce du développement est indépendante des molécules du CMH. Les
réarrangements sont en premier lieu déclenchés au niveau du locus β. L’expression du préTCR constitué d’une chaîne β et de la chaîne pTα permet la réception d’un signal antiapoptotique et la progression des cellules au stade de développement suivant (la sélection β).
La transition au stade CD4+CD8+ (double positif) s’accompagne de réarrangements V-J au
niveau du locus α. En cas de réarrangement productif, un TCR αβ se substitue au pré-TCR.
Dès lors, le développement des thymocytes est subordonné aux interactions du TCR avec les
complexes peptides-CMH exprimés à la surface des cellules stromales thymiques.
L’intégration des signaux délivrés lors de l’interaction thymocytes/ cellules stromales conduit
à la sélection positive (cette phase est dépendante des cellules épithéliales corticales) et
éventuellement, à la délétion des thymocytes (ou sélection négative) qui assure
l’établissement de la tolérance aux Ag du soi exprimés par cellules d’origine hématopoïétique.
Les thymocytes sélectionnés positivement achèvent leur maturation au sein de la médulla. Ces
thymocytes deviennent alors des CD4+ CD8- ou CD4- CD8+ et gagnent les organes
lymphoïdes périphériques au sein desquels ils constituent respectivement les précurseurs des
lymphocytes cytotoxiques (CD8+) et auxiliaires (CD4+).
II-2-2-b. Les cellules T « helper » (CD4+)
Ces cellules sont des intermédiaires de la réponse immunitaire et prolifèrent pour
activer quantité d’autres types cellulaires qui agiront de manière plus directe sur la réponse.
En effet, les cellules CD4+ régulent ou « aident » à la réalisation d'autres fonctions
lymphocytaires. Elles se différencient en cellules Th2 productrices d’IL4, IL5, IL6, IL9, IL10
et IL13 impliquées dans l’activation de la réponse humorale et en cellules Th1 productrices
d’IL2, d’IFNγ, de TNFα, de GM-CSF et de M-CSF. L’IL2 et l’IFNγ sont essentiellement
impliquées dans la réponse cellulaire avec notamment l’activation des cellules cytotoxiques
CD8+.
24
Après leur développement, les cellules T naïves quittent le thymus pour coloniser le
reste de l’organisme. Comme toutes les cellules T, elles expriment le récepteur à l’Ag des
cellules T (TCR) couplé au module de transduction CD3. Le TCR des cellules CD4+ a une
affinité pour le CMH II exprimé à la surface de toutes les cellules présentatrices d’Ag (CPA).
L’activation des cellules T CD4+ par les CPA se fait à travers une synapse
immunologique. Le terme de « synapse immunologique » est apparu récemment
28, 29
. Il
désigne la zone de contact entre une cellule du système immunitaire à vocation effectrice et
une cellule présentant l’antigène. Il n’existe pas « une » synapse immunologique unique et
canonique,
mais
« des »
synapses
immunologiques
distinctes,
compte
tenu
des
caractéristiques moléculaires des différents acteurs cellulaires mis en jeu, et des différentes
fonctions assurées : détecter la présence d’un antigène à la surface d’une APC, pour une
cellule T naïve, pour être « activée » et proliférer ; détecter la présence d’un antigène à la
surface d’une cible et la tuer, pour une cellule T CD8 activée ; délivrer des cytokines
localement à une cellule B pour provoquer sa différenciation, dans le cas d’une cellule T CD4
activée, etc. La synapse immunologique la plus étudiée est celle formée par une cellule T et
une APC 30-32.
L’activation des cellules T CD4+ nécessite deux signaux (Figure 2)
(1) Après endocytose et apprêtement de l’Ag, la CPA migre au site de l’infection dans
les ganglions lymphatiques, où elle présente les peptides antigéniques liés au MHC de classe
II, permettant l’activation sélective des cellules T CD4+ exprimant le TCR spécifique de ce
peptide. Cette activation est « permise » grâce à la liaison TCR/CD3-CMHII/peptide
stabilisée par le co-récepteur CD4 ainsi qu’à l’interaction de la protéine LFA-1 (cellule T)
avec la protéine ICAM (CPA) qui sont les molécules primaires de l'adhérence. La cellule T
CD4 établit alors un contact plus étroit permettant aux protéines kinases intracellulaires
présentes sur le TCR, le CD3 et le CD4 de s'activer par phosphorylation. Les voies activées
correspondent au signal de pro activation dans une cellule de Th.
(2) Après avoir reçu ce premier signal, la cellule T naïve doit recevoir un deuxième
signal d’activation pendant l'exposition initiale à l'Ag. Sans cela la cellule T devient
anergique, état correspondant à la perte de la propriété à réagir spécifiquement à un Ag auquel
elle est sensibilisée. Ce deuxième signal implique une interaction entre CD28 sur la cellule T
CD4+ et les protéines CD80 (B7.1) ou CD86 (B7.2) sur la CPA CD80 et CD86 activent le
récepteur CD28. Ces protéines sont également connues en tant que molécules de costimulation. Une fois que les deux signaux stimulateurs sont déclenchés dans la cellule T
25
helper, la cellule commence à proliférer, notamment grâce à sa propre libération d’IL2
(stimulation autocrine).
Figure 2 : Activation des cellules T CD4
Les cellules T mémoires seront réactivées en utilisant les mêmes voies dépendantes du
TCR, consécutivement à de nouvelles rencontres avec l'Ag.
II-2-2-c. Les cellules T cytotoxiques (CD8+)
Les cellules cytotoxiques ont la capacité de lyser les cellules consécutivement à la
reconnaissance spécifique d’un Ag. Cette cytotoxicité nécessite un contact cellulaire entre le
lymphocyte T et sa cible. Ce contact est initié par l’interaction du TCR avec le complexe
peptide-CMH de classe I. Il est renforcé par la molécule CD8 et également par des molécules
d’adhésion cellulaire. La lyse repose sur 3 grands mécanismes que sont :
- Le plus rapide (quelques minutes) et efficace met en jeu des protéines secrétées par
le CTL au point de contact entre le CTL et sa cible : il s’agit de la perforine et des
granzymes (A, B, K et M) contenues dans des vésicules acides 33. La perforine va s’insérer
dans la membrane de la cellule cible et y créer des pores. La formation de ces pores n’est pas
suffisante pour entraîner la mort de la cellule cible mais permet l’entrée des granzymes dans
la cellule. A ce jour, 5 granzymes humaines ont été identifiées (A, B, H, K et M). Les
26
granzymes sont des sérines protéases qui sont libérées par les granules cytoplasmiques
présentes dans les CTL et les cellules NK (Table 5).
Table 5 : Expression des granzymes A, B, K et M (Gzm) et de la perforine dans les PBMCs humains (d’après34)
sous-populations lymphocytaires
Gzm A/B
Gzm K
Gzm M
perforine
Cellules B
Cellules T (CD3+)
cellules Th (CD4+)
cellules TC (CD8+)
cellules Tγδ (γδ-TCR+)
cellules NKT (CD56+)
cellules NK (CD3–CD56+CD16+)
cellules CD56bright
–
+
–/+
++
++++
++++
++++
++++
–
+
–/+
+
++
++
–/+
+++
–
+
–/+
++
++++
++++
++++
+++
–
+
–
+
++++
++++
++++
++++
Les symboles représentent le pourcentage de cellules positives pour les différentes granzymes (Gzm)
(–, <1% ; –/+, 1–10% ; +, 25–50% ; +++, 50–75% ; ++++, >75% ; *perforinbright).
Les granzymes induisent l'apoptose des cellules cibles. Ces protéases clivent diverses
protéines intracellulaires telles que les caspases (particulièrement la caspase-3), la protéine
Bid et les protéines Smac/Diablo et Omi/HtrA2 entre autres. Les caspases activent des
DNases qui dégradent l'ADN, et de ce fait induisent des cascades apoptotiques 35. La protéine
Bid, recrute les protéines Bax et Bak qui modifient la perméabilité de la membrane des
mitochondries, causant le relargage du cytochrome c (qui est l'une des pièces requises pour
former la caspase-9)
36
, les protéines Smac/Diablo et Omi/HtrA2 suppriment des protéines
inhibitrices d'apoptose 37.
- Un second mécanisme met en jeu la protéine FasL membranaire
38
ou sécrétée par
le CTL qui va se fixer sur un récepteur Fas situé sur la cible. La liaison de FasL à son
récepteur va déclencher une mort par apoptose de la cellule cible. Ce mode de lyse est plus
lent (plusieurs heures) et quantitativement souvent moins efficace que la lyse dépendante du
couple perforine/granzyme.
- Enfin le TNFα sécrété par le CTL va pouvoir se fixer sur le récepteur au TNF situé
sur la cellule cible ce qui conduit aux même types de conséquences que l’interaction
FasL/Fas. Dans ces deux derniers cas, la cellule cible meure par apoptose.
27
II-2-3. Les effecteurs de l’immunité innée
II-2-3-a. Les cellules dendritiques (DC)
En 1968 Paul Langerhans a observé le premier des cellules qui allaient être identifiées
comme cellules dendritiques (DC) à l’intérieur de l’épithélium de la peau. Cinq ans plus tard
Steinman et Cohn ont identifié un type cellulaire rare présentant des prolongements appelés
dendrites, dans la rate de souris, et qui était impliqué dans l’induction de réponses immunes
39
. Ces DC sont les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) les plus puissantes et jouent un
rôle central dans l’initiation de la réponse immune 40.
Dans les tissus périphériques, les DC sont présentes dans un état « immature » qui
autorise une capture efficace des antigènes à travers la macro-pinocytose, la phagocytose et
l’internalisation médiée par les récepteurs 41. Une fois que les DC ont capturé l’antigène dans
les tissus périphériques, elles acquièrent la capacité à migrer vers les organes lymphoïdes
secondaires drainant. C’est là qu’elles vont présenter les peptides aux cellules T, et compléter
leur maturation après avoir reçu les signaux provenant des cellules T spécifiques de l’antigène
présenté
42
. Elles se différencient en DC « matures » lesquelles se caractérisent par une
activité phagocytaire faible et un potentiel de présentation antigénique élevé
43
. Alors que
d’autres CPA professionnelles (tels que les macrophages) ou non professionnelles (telles que
les cellules B) peuvent seulement stimuler des cellules T activées ou mémoire, les DC ont la
capacité unique de stimuler les lymphocytes T quiescents et naïfs. En effet, la présence d’un
large éventail de molécules de co-stimulation et d’adhésion (comme B7-1, B7-2, CD40, LFA3
ICAM1, ICAM3) sur la membrane des DC facilite les interactions cellulaires, optimise la
présentation antigénique et fournit aux cellules T un second signal, lequel est essentiel dans la
prévention de cellules T anergiques
43
. Les DC sont également importantes pour induire un
état de tolérance immunitaire 44.
Des sous-populations distinctes de DC régulent différentiellement les effecteurs
immuns tels les lymphocytes T CD4+, T CD8+ ou les cellules T régulatrices. C’est la raison
pour laquelle certains patients n’établissent pas de réponses immunes, et ne montrent pas de
réponses cliniques. On peut avancer l’hypothèse de l’implication de la nature des DC
utilisées. En effet la ou les sous populations de DC utilisées lors des protocoles de
vaccination, pourraient ne pas être adaptées à la pathologie considérée. Ainsi les patients
28
considérés pourraient avoir un défaut dans la stimulation, par les cellules DC, des
lymphocytes T CD4+, ce qui empêcherait une activation efficace des cellules T CD8+.
Alternativement, la progression de la maladie pourrait être associée à l’expansion des cellules
régulatrices telles que les cellules NKT ou les cellules Tr1.
Chez la souris, il a récemment été avéré que la source principale d'IFNγ, composant
essentiel de l’immunosurveillance antitumorale, n'est pas la cellule NK conventionnelle mais
plutôt un sous-ensemble de DC B220+ Ly6C-/- 45,46. Ces DC sont atypiques dans le sens où
elles expriment des molécules de surface de cellule NK (NK1.1)47. Lors du contact avec une
variété de cellules tumorales qui sont mal reconnues par des cellules NK conventionnelles, les
cellules dendritiques NK1.1+ B220+ sécrètent des niveaux élevés d'IFNγ et provoquent une
lyse des cellules tumorales dépendante de TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand),
cytokine appartenant à la famille du TNF. Le transfert adoptif de ces DC tueuses productrices
d’IFNγ ou IKDC (IFNγ-producing Killer Dendritic Cells) dans des souris Rag2
(-/-)
IL2rγ (-/-)
prévient la croissance de la tumeur, ce qui n’est pas le cas avec le transfert de cellules NK
conventionnelles. C’est ainsi qu’a été mise en évidence cette nouvelle sous-population de DC
impliquée dans l’immuno-surveillance des tumeurs (Figure 3).
29
Figure 3 : les IKDC, un nouveau type de cellule immunitaire (d’après 48)
Les interactions entre les DC et les NK se produisent à divers stades de la réponse immune dirigée contre les
pathogènes ou les tumeurs (panel A). Les cellules NK peuvent tuer des cellules cibles après leur identification.
Les cellules dendritiques répondent alors à la mort de ces cellules cibles en partie en reconnaissant les débris de
cellules mortes grâce à des récepteurs reconnaissant des structures conservées (pattern-recognition receptors ou
PRR), incluant les toll-like receptors (TLRs). Par la suite les cellules dendritiques activent la réponse immune
adaptatrice incluant des cellules de CD4+. Il existe donc une voie alternative à l'immunité adaptative impliquant
les IKDC capables de tuer la cellule infectée et d’activer les cellules T CD4+ (panel B). Les études réalisées par
le groupe de L. Zitvogel montrent que l'imatinib mesylate active les IKDC dans un modèle de cancer de souris,
qui pourrait expliquer l'effet thérapeutique du glivec dans certaines tumeurs stromales gastro-intestinales
résistantes à son effet anti-prolifératif.
CpG = motif d’ADN bactérien ; LPS = Lipopolysaccharide ; MHC II = Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe II
Pour leurs propriétés originales, les DC représentent un outil immuno-thérapeutique
permettant d’augmenter l’immunité contre les agents infectieux et l’efficacité des
vaccinations anti-cancéreuses (mélanomes
49-53
, prostate
54, 55
, colon
56
, lymphomes B
57
).
Dans ces diverses stratégies, les DC sont chargées avec l’Ag tumoral sous différentes formes :
peptide
50, 52, 56
de la tumeur
, lysat de plusieurs peptides 51ou de la cellule tumorale 49, idiotype spécifique
57
ou ARN de l’Ag tumoral
55
. Enfin, les DC sont désormais utilisées comme
vecteurs en immunothérapie anticancéreuse car elles représentent des adjuvants naturels 58.
30
II-2-3-b. Les cellules Natural killer (NK)
La découverte des cellules NK remonte au début des années 1970 au cours d’une étude
sur la répartition des lymphocytes du sang périphérique aussi bien de sujet sain que de
patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, et de la
tuberculose. Dans cette étude l’équipe du professeur Yvan Roitt a observé un type cellulaire
ni T ni B, capable de tuer d’autres cellules. Ces cellules ont alors été appelées « cellules
nulles » 59. Ce n’est qu’en 1975 que ce phénomène a été à nouveau observé par deux équipes
indépendantes
60, 61
, au cours de recherches sur la capacité des lymphocytes T à lyser des
cellules tumorales contre lesquelles elles avaient été préalablement immunisées. Durant ces
expériences, les chercheurs ont observé ce qu’ils ont appelé la « réactivité naturelle » :
certaines cellules pouvaient lyser des cellules tumorales sans sensibilisation préalable, et c’est
Kiessling qui leur donna le nom de cellules « Natural Killer » (NK).
Ces cellules NK sont des lymphocytes cytotoxiques qui constituent un composant
majeur du système immunitaire inné. Ils jouent un rôle majeur dans le rejet des cellules
tumorales et des cellules infectées par un virus et ont été appelés « Natural Killer » à cause du
fait qu’ils n’ont besoin d’aucune activation préalable pour tuer des cellules qui sont « missingself ». Ce modèle de reconnaissance « d’absence du soi » ou « missing self » proposé en 1990
par Ljunggren et Karre permet de décrire la reconnaissance des cellules qui ont une absence
ou un faible niveau d’expression des molécules qui caractérisent le « soi » : les molécules de
de CMH I. Cette situation pourrait être due à une infection virale ou dans les tumeurs sous
une forte pression de sélection des cellules T tueuses.
Etant donné leur forte activité cytolytique et leur potentiel pour l’autoréactivité,
l’activité des cellules NK est étroitement régulée. Elles sont activées par des signaux de
différentes natures :
(i) les cytokines : les IFNα/β jouent un rôle crucial dans l’activation des cellules NK.
Comme ces molécules sont des molécules de stress, relarguées par les cellules après infection
virale, elles servent à signaler aux cellules NK la présence de pathogènes viraux. Il a été
démontré que l’IL2 et l’IFNγ peuvent activer les cellules NK. Ainsi l’action des cellules NK
est potentialisée par certaines cytokines comme le TNFα et IL-2 (libérée par les LT CD4+) et
31
l’IL-12 sécrétée par les macrophages. Cette action nécessite donc l'activation concomitante
des LT CD4+ et des macrophages, mais le rôle des cellules NK est surtout potentialisé par
l'IL-2.
(ii) Les récepteurs au fragment constant des IgG (FcγR) : Il existe 3 classes de
FcγR : FcγRI (CD64), FcgRII (CD32), and FcγRIII (CD16). Les FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIc, et
FcγRIII sont des récepteurs activateurs due à la présence de motif ITAM. Le Cross-linking
des FcγR activateurs avec des cellules recouvertes d’IgG ou de complexes immuns IgG induit
la phosphorylation des ITAM par les tyrosines kinases Src. Les évènements de signalisation
en aval aboutissent à différentes réponses cellulaires telles que la phagocytose, l’exocytose de
granules, l’ADCC ou la synthèse de cytokine. Le seul récepteur inhibiteur, FcγRIIb, contient
un motif ITIM (pour immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) dans leurs domaines
cytoplasmiques.
Les cellules NK, ainsi que les macrophages et plusieurs autres types cellulaires,
expriment des FcR (Table 6). La plupart des FcγR, incluant le FcγRIIb, sont exprimés par les
macrophages. Donc, les complexes immuns peuvent engager à la fois les FcγR activateurs et
inhibiteurs sur la même cellule. Cependant, les NK expriment uniquement les récepteurs
activateurs, FcγRIII et FcγRIIc. L’interaction du fragment constant d’une IgG avec le CD16
active les cellules NK qui vont diriger leur activité cytolytique vers la cellule contre laquelle
une réponse humorale a été mobilisée, et à la lyser au travers d’une réaction d’ADCC
(Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity).
32
Table 6 : Récepteurs des fragments constants des Ig
Ligand
dénomination
fonction
Expression cellulaire
IgG
FcγRI (CD64)
Activateur
Macrophages
Neutrophiles
DC
Eosinophiles
FcγRII-A (CD32)
Activateur
Macrophages
Neutrophiles
Eosinophiles
Plaquettes
Cellules de Langerhans
DC
FcγRII-B1 (CD32)
Inhibiteur
Lymphocyte B
Mastocytes
DC
FcγRII-B2 (CD32)
Inhibiteur
Macrophages
Neutrophiles
Eosinophiles
FcγRII-C (CD32)
activateur
FcγRIII (CD16)
Activateur
Cellule NK
Macrophages
Lymphocytes T
DC
IgA
FcαRI (CD89)
Macrophages
Neutrophiles
Eosinophiles
Lymphocytes T
Lymphocytes B
IgE
FcεRI
Eosinophiles
Mastocytes
Basophiles
DC
FcεRII (CD23)
Macrophages
Eosinophiles
Mastocytes
Basophiles
DC
Lymphocytes T
Lymphocytes B
(iii) Les récepteurs activateurs et inhibiteurs : en plus du récepteur Fc, les cellules
NK expriment une variété de récepteurs qui servent soit à activer ou à inhiber leur activité
cytolytique. Ces récepteurs lient divers ligands sur les cellules cibles et ont un rôle important
dans la régulation de la réponse des cellules NK. En effet, dans le but de défendre l’organisme
33
contre les virus et autres pathogènes, les NK requièrent des récepteurs capables de déterminer
si une cellule est infectée ou non (Figure 4). Ces récepteurs ne sont pas tous propres aux
cellules NK et peuvent être présents dans d’autres sous-populations de cellules T.
ƒ
Les récepteurs de la superfamille des immunoglobulines : KIR
Initialement ce terme signifiait « Killer inhibitory receptor » mais la découverte progressive,
de molécules homologues et aux fonctions activatrices a conduit à conserver l'acronyme KIR
pour désigner « un killer immunoglobulin-like receptor ». Parmi les 12 gènes KIR
fonctionnels identifiés chez l'homme, le nombre de ceux-ci présents sur chaque haplotype
(entre 7 et 10 gènes) est variable. Comme ces gènes sont exprimés indépendamment du
CMH, un individu possède des KIR correspondants à ses propres allèles de CMH-I mais
également à des spécificités allogéniques qui ne lui sont d'aucun usage physiologique. En
effet, si chaque clone NK peut potentiellement exprimer plusieurs récepteurs inhibiteurs, en
règle générale il n'en possède qu'un seul. Cette distribution clonale des KIR est importante
puisqu'elle permet à un clone NK donné de percevoir l'absence isolée d'un allèle HLA.
Comme d'autres protéines à fonctions inhibitrices (CTLA-4, CD22, FcγRIIB), les KIR
inhibiteurs possèdent deux séquences ITIM intracellulaires. Les récepteurs KIR activateurs ne
possèdent pas de séquences ITIM mais au contraire, des séquences ITAM. Les séquences
ITAM transmettent un signal activateur.
ƒ
Les récepteurs de type lectine, CD94-NKG2
La famille de molécules de type C lectines NKG2 associées à CD94 constituent des
récepteurs présents sur la grande majorité des lymphocytes NK ainsi que des lymphocytes T
γδ et certains lymphocytes T αβ CD8 mémoires. Fonctionnellement, 2 complexes
interviennent, NKG2A-CD94 inhibiteur et NKG2C-CD94 activateur. La sollicitation du
récepteur NKG2A permet, via la partie intra-cytoplasmique de la molécule qui contient 2
ITIM, de transmettre un signal inhibiteur de la lyse. Le principal ligand de cet hétérodimère
est la molécule HLA-E (vue avec le CMH). Présentant des peptides issus de la séquence
leader des molécules HLA-A, B, C, G, la molécule HLA-E n'aura un déficit d'expression
qu'en cas de défaillance globale de synthèse de molécules HLA de classe I. Le récepteur
homologue, NKG2C, ne possède pas de séquences ITIM, s'associe à KARAP/DAP12 porteur
d'un ITAM et se comporte comme un activateur après interaction avec HLA-E via l'activation
de tyrosines kinases comme Syk.
ƒ
Récepteurs activateurs dénommés NCR
L’acronyme NCR signifie « Natural Cytotoxicity Receptors ». Ces récepteurs sont : NKp30,
NKp44, NKp46 et NKp80 ; ils appartiennent à la super-famille des Ig et sont très spécifiques
34
des lymphocytes NK62. Les ligands des NCR ne sont pas des produits du CMH, et leur
identification reste à faire.
ƒ
NKG2D
En 1999 le produit du gène NKG2D a été caractérisé comme associé en cluster sur le
chromosome 12 mais sans homologie de séquence avec NKG2A, C, E, F. NKG2D est un
homodimère dépourvu de séquence ITIM et non associé à CD94. Il est exprimé par la plupart
des lymphocytes NK mais aussi des lymphocytes T γδ et T CD8. Il constitue un récepteur
pour des protéines de stress, MICA et MICB, (MHC class I chain-related A/B) produits HLAlike dont les gènes très peu polymorphes, sont codés dans le CMH. Le stress, une infection
virale, une transformation maligne, augmentent fortement leur expression
63-67
. Il existe
d'autres protéines humaines reconnues par NKG2D. Il s’agit des ULBP-1, 2, 3 et 4 (UL16
Binding Protein, structure de type HLA-I-like également)
65, 68-70
qui sont induites par
l’infection virale (CMV notamment) dans de nombreux types cellulaires.
Figure 4 : Régulation de l’activation des cellules NK.
Ainsi grâce à leur récepteur KIR les cellules NK sont capables de faire la distinction
entre des cellules normales et d'autres cellules qui vont devenir leur cible. Lorsque les CMH
de classe I est identifié par les récepteurs KIR, l'action de ces cellules tueuses est inhibée. En
revanche, les cellules étrangères, caractérisées par une densité CMH très faible et surtout
35
différente de celle des cellules du soi, ne sont pas reconnues par ces récepteurs. Et en
l'absence de message inhibiteur, le mécanisme de destruction est déclenché.
Néanmoins, l’équipe d'Éric Vivier a montré que ce les récepteurs des cellules NK ne
reconnaissent pas les molécules du CMH de classe 1 spontanément
71
: Les cellules NK
semblent ne pas tuer leurs cellules cibles aussi « naturellement » qu'on le pensait. Il s'agirait
en fait d'un « apprentissage» au cours de leur maturation. En effet dans cette étude les auteurs
montrent qu’il existe dans le sang périphérique des cellules NK négatives en termes
d’expression des KIR inhibiteurs. Ces cellules présentent un phénotype de cellule NK mature
mais sont hyporépondeuses à différents stimuli, même à des cellules cibles CMH de classe Idéficientes. Au contraire les cellules NK exprimant un seul KIR inhibiteur spécifique pour le
CMH de classe I du soi, sont fonctionnellement compétentes lorsqu’elles sont exposées aux
même stimuli. Ces résultats montrent l’implication des interactions KIR-CMH de classe I
dans la calibration des capacités effectrices des cellules NK. Ainsi, les mêmes auteurs ont mis
en évidence, dans le fonctionnement de ce type de lymphocytes, un mécanisme qui ouvre des
perspectives thérapeutiques intéressantes, notamment dans les greffes. En effet, l'éducation
des cellules NK par le biais des récepteurs KIR permet d'envisager de contrôler l'activité de
ces cellules et ouvre ainsi la voie à des applications thérapeutiques importantes. Par exemple
lors des transplantations hématopoïétiques, l'éducation des cellules NK pourrait permettre de
diriger les cellules NK de manière efficace contre les cellules que l'on veut et de laisser en vie
celles que l'on veut garder.
II-2-3-c. Les lymphocytes NKT
Les lymphocytes NKT forment un groupe hétérogène de lymphocytes T. La plupart de
ces cellules reconnaissent la molécule non polymorphique CD1d, une molécule présentatrice
des antigènes lipidiques et glycolipidiques, analogue aux protéines du CMH de classe I. Les
NKT constituent 0,2% environ des lymphocytes T du sang périphérique. Le terme NKT fut
utilisé en premier lieu pour qualifier une sous-population particulière de lymphocytes T
murins exprimant le marqueur NK 1.1 (CD161, auparavant considéré comme caractéristique
unique des cellules NK). Il est maintenant admis que l’acronyme NKT fait référence aux
lymphocytes T humains et murins CD1d-restreints, co-exprimant un TCR semi-invariant et
des marqueurs NK. Ils se différentient des cellules T αβ par leur TCR peu diversifié et une
36
spécificité vis-à-vis d’Ag lipidiques et glycolipides CD1d-dépendants. Il a été proposé une
classification des NKT en trois groupes (Table 7).
Table 7 : Les différents types de cellules NKT
Autres noms
Restriction
Réactivité α-GalCer
TCR répertoire
NKT de type 1
NKT classiques
NKT invariant (iNKT)
Vα14i NKT (souris)
Vα24i NKT (humain)
CD1d
+
Vα14-Jα18:Vβ8.2,7,2 (souris)
Vα24-Jα18:Vβ11 (humain)
NKT de type 2
NKT non-classiques
NKT-Like
Cellules T NK1.1+
Cellules T CD3+CD56+
CD1d
Divers
CMH, autres ?
Divers
La sous-population de NKT restreints au CD1d la mieux connue exprime une chaîne
invariante du TCR alpha (NKT de type 1 ou iNKT). Ces cellules sont conservées des rongeurs
aux humains et sont impliquées dans de nombreux processus immunologiques. Elles forment
donc un lien entre le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif en jouant
un rôle clé dans la réponse innée et l’induction de la réponse adaptative 72. Contrairement aux
lymphocytes T conventionnels, dont le TCR reconnaît un peptide présenté par une molécule
de CMH, les NKT reconnaissent un glycolipide, dont le plus connu est l’αgalactosylceramide (α-GalCer) présenté par CD1d 73-75.
Bien que l'effet anti-tumoral de l'IL-12 soit essentiellement médié par les cellules NK
et les cellules T, les cellules Vα14 NKT se sont avérées une cible essentielle de l’IL-12, et
leur cytotoxicité se fait par un mécanisme semblable à celui des cellules NK après activation
par l’IL-12
76
. Une fois activées, les NKT sont capables de lyser les cibles tumorales tout
comme les NK puisqu’elles expriment le co-récepteurs activateurs de lyse que sont NKG2D
et CD244 et de sécréter des cytokines pro- (TNFα ou IFNγ) ou anti-inflammatoires (IL4 ou
IL13) 77. Elles peuvent donc activer les effecteurs du système immunitaire adaptatif 78. Elles
peuvent potentialiser ou inhiber l’immunité à médiation cellulaire dans les cas de surveillance
tumorale 79. Les cellules NKT sont également capables d’activer les DC grâce à la sécrétion
d’un cocktail de médiateurs solubles (Figure 5). Les DC produisent en retour de l’IL12
permettant de favoriser la réponse CTL et NK 80. Les cellules NKT permettent également la
maturation et la différenciation des monocytes en DC 81.
37
Figure 5 : cellules NKT et immunothérapie
II-2-2-d. Les lymphocytes T γδ
Les cellules T γδ, comme les cellules NKT, représentent une population de cellules T
ayant un TCR particulier, à la frontière entre immunité innée et immunité adaptative. La
plupart des cellules T possèdent un TCR composé de deux glycoprotéines, les chaînes α et β.
Cependant, les cellules γδ possèdent un TCR constitué d’une chaîne γ et d’une chaîne δ. Bien
que moins abondants que les lymphocytes T αβ (ils représentent 5% du total des LT), ces
lymphocytes non « conventionnels » n’en sont pas moins intéressants, de par leur potentiel
anti-infectieux et anti-tumoral. On assiste, en effet, ces dernières années à un intérêt
grandissant pour cette population cellulaire, notamment en immunothérapie. Cette population
cellulaire et son intérêt en immunothérapie ayant fait l’objet de ma thèse, j’en détaillerai les
caractéristiques dans le Chapitre III.
38
II-3/ Dynamique de la réponse anti-tumorale normale
Dans ce paragraphe je m’attacherai à décrire dans leur globalité comment les
différents
acteurs
de
l’immunité
antitumorale
décrit
plus
haut,
participent
à
l’immunosurveillance des tumeurs (Figure 6).
Pour initier une réponse immunitaire spécifique, l’Ag doit être présenté par une
molécule de classe II aux lymphocytes T CD4. Parmi les CPA : macrophages, lymphocytes B,
cellules dendritiques ; les DC sont les plus performantes. La réponse immunitaire initiée par
les DC dans le cadre d’une réponse antitumorale efficace est de type Th1 avec sécrétion
d’IFNγ et d’IL-2 par les T CD4 auxiliaires et aboutit à la lyse de la cellule tumorale par les
effecteurs T CD8 cytotoxiques. Cependant, suivant la qualité de la synapse immunologique
(présentation antigénique, quantité de peptides, molécules de costimulation) et le contexte
cytokinique, les DC peuvent également être tolérogènes, ce qui a pour effet de favoriser le
maintien du processus cancéreux. Les DC internalisent les antigènes tumoraux provenant de
lysats, de fragments ou de corps apoptotiques de cellules cancéreuses dans les tissus
périphériques et peuvent les présenter à la fois dans un contexte CMH classe I entraînant
l’activation des T CD8 cytotoxiques et dans un contexte classe II entraînant l’activation des T
CD4 auxiliaires. Cette capacité à présenter les Ag tumoraux via les molécules de classe I et II,
joue un rôle déterminant dans la réponse immunitaire antitumorale des cellules dendritiques.
Ainsi, d’une part les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTLs) reconnaissent et tuent
les cellules tumorales dans un conteste CMH-I restreint et grâce à la voie perforine/ granzyme.
En parallèle, ils sécrètent des cytokines anti-angiogéniques tel que l’IFNγ (Figure 6a).
D’autre part, les cellules T CD4+ activées reconnaissent des macrophages infiltrants les
tumeurs de manière CMH-II restreint, et permettent la maturation de macrophages M1
producteurs d’IL10 en macrophages M2 producteurs d’IFNγ. Les lymphocytes T CD4+ helper
1 (Th1) activés peuvent aussi sécréter de l’IFNγ, lequel inhibe l’angiogénèse. Les
lymphocytes CD4+ Th2 produisent de l’IL-4 et bloquent indirectement l’angiogénèse, à
travers leur action sur les fibroblastes du stroma. (Figure 6b). De plus, les IKDC tuent les
cellules tumorales via TRAIL et la voie perforine/granzyme. Les IKDC sont aussi une source
d’IFNγ. elles peuvent aussi présenter des Ag tumoraux aux cellules T (Figure 6c).
39
Par ailleur la cellule cancéreuse peut être détectée et lysée de façon aspécifique par les
cellules NK, NKT et Tγδ. Les cellules NK détectent et lysent les cellules tumorales, soit par la
liaison de ses récepteurs inhibiteurs et activateurs sur leurs ligands, soit par la voie Fas/Fas-L
ou encore par une cytotoxicité dépendante des anticorps. En effet, les cellules NK peuvent
être activées via NKG2D par les DC qui présentent la translocation BCR–ABL dans le cas des
leucémie myéloîdes chroniques. Dans le cas d’un inflamation chronique et en présence d’IL4
et d’IL13, les DC upregulent TREM2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2),
lequel est requis pour l’activation des cellules NK (Figure 6d).
Les cellules NKT reconaissent des glycolipides présentés par la molécule CD1d à la
surface des APCs. Les cellules NKT activées sécrètent de l’IFNg et peuvent lyser les cellules
tumorales via TRAIL ou la voie perfornie granzyme (Figure 6e).
Les cellules tumorales ou les CPA présentent le complexe F1-ATPase–apolipoproteinA complex ou les phosphoantigènes to lymphocytes T γδ porteur du TCR Vγ9Vδ2. Ces
lymphocytes T γδ produisent cytokines et tuent les cellules (Figure 6f).
Enfin, les Ac spécifiques de tumeurs peuvent avoir un rôle antitumoral. En effet ces
derniers ont des effets antiprolifératifs direct ou induisent une lyse dépendante du complément
(CDC) ou des Ac par les cellules NK cells et macrophages exprimant les récepteurs pour les
IgG (FcγRs) (Figure 6g).
40
Figure 6 : Dynamique de la réponse anti-tumorale normale (d’après zytvogel)
II-4/ L’échappement tumoral
Le fait que les cellules tumorales peuvent être spécifiquement reconnues et éliminées
par des cellules effectrices du système immunitaire ne fait à présent aucun doute. En effet, des
lymphocytes infiltrants les tumeurs ont pu être isolés et cultivés à partir de biopsie de tumeurs
autologues. Il a pu ainsi être confirmé que ces lymphocytes étaient aptes à lyser les cellules
41
tumorales in vitro ainsi qu’à sécréter des cytokines inflammatoires en réponse à la
présentation d’Ag spécifiques.
Cependant les nombreux échecs, ont fait émerger le concept d’« immuno-édition ».
Cette dernière notion implique qu’après une phase de reconnaissance et de stabilisation de la
tumeur par les effecteurs immuns, pendant laquelle se produit une élimination des Ag
dominants, des phénomènes d’échappements vont se produire, rendant la tumeur inaccessible
au système immunitaire. En effet, bien que présents, les effecteurs sont souvent inefficaces in
vivo puisque la tumeur continue souvent de se développer jusqu’au stade métastatique. Ainsi,
malgré cette surveillance, les tumeurs échappent fréquemment à leur élimination par les
effecteurs du système immunitaire.
De multiples mécanismes peuvent être mis en jeu dans cet échappement au contrôle
par le système immunitaire. Ces mécanismes se basent sur deux grands concepts à savoir : (i)
la résistance des cellules malignes aux effecteurs immuns, consécutivement à la mise en place
de stratégie d’évasion ou de contre-attaque et/ou (ii) l’inefficacité ou l’absence de réponse
immune, les effecteurs immuns étant devenus tolérants vis-à-vis de la tumeur.
II-4-1. Résistance des cellules malignes aux effecteurs immuns
En réponse à la pression éradicatrice du système immunitaire ou même spontanément,
les cellules tumorales peuvent se rendre invisibles ou insensibles aux attaques des effecteurs
immuns et ceci grâce à la mise en place de différents mécanismes tels que :
- L’inaccessibilité des cellules tumorales,
D’une part, grâce à des mécanismes affectant leur migration et leur activation, le
stroma cancéreux ne permettrait pas aux effecteurs immuns de pénétrer dans la tumeur et
d’autre part, une tumeur peut constituer un environnement non permissif à la migration au
sein du stroma (absence de gradient de chimiokines) et à l’adhérence des lymphocytes.
Par exemple, une diminution de l’expression de la molécule d’adhésion LFA-3
(CD58) a pu être observée à la surface de plusieurs lignées de mélanome par comparaison aux
cellules normales correspondantes et certains défauts d’induction de la sécrétion d’IL2 ont pu
42
être corrélés à un défaut d’expression de la molécule LFA-3 à la surface des cellules de
mélanome 82.
- La faible immunogénicité des cellules tumorales
La faible immunogénicité des cellules tumorales participe au défaut d’induction ou de
maintien de la réponse immunitaire. Cette altération de l’antigénicité des cellules tumorales a
plusieurs causes :
(i)
leur faible densité membranaire en complexes peptide-CMH-I. Les cellules de
mélanome, par exemple, peuvent ainsi se rendre résistante à la lyse par les LT
CD8+ cytotoxiques consécutivement à la perte de l’expression de HLA-A2 à leur
surface
83
. Certaines études ont d’ailleurs suggérées une corrélation directe entre
un faible taux d’expression des molécules du CMH I dans cellules de mélanome et
un mauvais pronostique ou une fréquence élevée de métastases 84.
(ii)
l’absence d’expression des molécules HLA de classe II. Cette absence peut
entraîner un défaut de stimulation des LT CD4+ en absence de CPA infiltrant la
tumeur.
(iii)
leur incapacité à délivrer les signaux de co-stimulation. En effet, les tumeurs
solides expriment peu ou pas les molécules de la famille B7 (B7.1 = CD80 et B7.2
= CD86), et l’absence de second signal peut induire des phénomènes d’anergie des
lymphocytes spécifiques qui ne répondent plus à l’Ag 85. D’ailleurs, la régression
de diverses tumeurs a pu être observée consécutivement à la transfection des
cellules tumorales avec les gènes codant pour les molécules B7 86.
(iv)
l’instabilité génétique des tumeurs. Cette instabilité entraîne une modulation de
l’expression de l’Ag. On peut citer notamment l’exemple dans les mélanomes des
Ag tels que la gp100, MART-1 ou la tyrosinase qui sont présents chez 100% des
cellules tumorales au stade I, et qui ne sont plus exprimés que dans 75% des cas au
stade IV. Une perte de l’expression d’un Ag reconnu par des CTL spécifiques a
ainsi été observée dans différentes tumeurs murines et humaines 87.
43
- La résistance des cellules tumorales à la mort
La résistance à l’apoptose naturelle est un phénomène inhérent au processus tumoral.
Cette résistance s’établit à travers des mécanismes multiples et qui peuvent se cumuler. Parmi
ces mécanismes on trouve : (i) la surexpression de molécules anti-apoptotiques telles que les
molécules appartenant à la famille Bcl-2
88
, (ii) à la diminution/mutation de molécules pro-
apoptotiques, (iii) la dérégulation de la voie Pi3K/Akt, (iv) l’expression de molécules telles
que les serpines qui protègent contre la lyse perforine / granzymes 89.
- Contre-attaque de la cellule tumorale
L’expression constitutive de FasL a été observée dans les cellules de mélanome. Ces
dernières peuvent inhiber activement les effecteurs cytotoxiques tels que les cellules NK et les
CTL grâce à l’expression membranaire de FasL qui va se lier à Fas à la surface des effecteurs
immuns Ainsi, dans les lésions métastatiques, cette expression entraîne l’apoptose des LT
cytotoxiques exprimant Fas
90
. Par ailleurs, la sécrétion de Fas soluble
91, 92
ou de ligand de
93
NKG2D tel que MICA , constitue des leurres pour les effecteurs immuns.
II-4-2. Inefficacité ou absence de l’induction de réponse immune efficace
- L’activation de cellules effectrices spécifiques.
La présentation des antigènes tumoraux, assimilés à des peptides du soi, est réalisée
par des CPA inductrices de tolérance (DC tolérogènes). On observe alors une tolérance
périphérique à l’encontre des cellules néoplasiques qui ne sont pas affectées par la présence
de lymphocytes T devenus anergiques. Les données de différents laboratoires obtenus ces
quelques dernières années indiquent qu’un défaut dans le système des DC est un des facteurs
principaux responsables de l’échappement tumoral (pour revue voir 94).
Cette tolérance peut également résulter de la présence des lymphocytes T CD4
immuno-régulateurs (CD4+ CD25+) qui ont été détectés parmi les TIL de tumeurs humaines
et qui sont malheureusement activés par les DC
95
. Les lymphocytes T régulateurs peuvent
exercer leur contrôle de façon directe sur les autres lymphocytes par la production notamment
44
d’IL10, mais agissent sur l’orientation de la maturation des DC vers un phénotype
suppresseur.
Bien que les cellules NKT participent indiscutablement à l’immunité anti-tumorale
quand elles sont activées dans des conditions optimales, si elles sont activées dans des
conditions de stimulation non optimales alors les cellules NKT semblent pouvoir exercer un
effet répressif sur le déploiement d’effecteurs anti-tumoraux. L’équipe de Berzofsky a
d’ailleurs mis au point un modèle qui décrit parfaitement cet aspect. Dans ce modèle, la
tumeur est un fibrosarcome produit in vitro par transfection de myc et ras, ayant subi
auparavant une transfection lui faisant exprimer la protéine gp160 du HIV. Lorsque de telles
cellules tumorales sont injectées à des souris BALB/c par voie sous cutanée, une tumeur
macroscopique se développe puis régresse pour disparaître vers le 20ème jour et réapparaître
vers le 30ème jour pour se développer jusqu’à la mort de l’animal. Les auteurs ont montré que
les cellules impliquées dans cet échappement tumoral sont les cellules NKT. En effet ces
dernières, grâce à la production d’IL13
79
, inhibent le développement d’une réponse
cytotoxique médiée par les CTL CD8. Or les lymphocytes T ne possèdent pas le récepteur à
l’IL13. Les mêmes auteurs ont mis en évidence une population « bystander » constituée de
cellules myéloïdes immatures (CD11c+ Gr1+) répondant à l’IL13 par la production de TGFβ,
ce dernier inhibant la différenciation et l’activation des cellules CD8 96. Les cellules NKT ont
également été impliquées dans l’immuno-suppression induite par les UV facilitant ainsi le
développement de tumeurs cutanées induites par une exposition chronique aux UV 97.
- La sécrétion locale de facteurs suppresseurs par la tumeur et son
microenvironnement
Cette sécrétion s’oppose à ce que les lymphocytes spécifiques puissent mettre en place
des mécanismes de défense contre les cellules tumorales. Des cytokines inhibitrices des
réponses immunitaires (NO, TGFβ, IL-10, IL6 ou PGE-2) peuvent être produites localement,
par les cellules tumorales, notamment les carcinomes,
tumoral
100,
101
98, 99
mais également par le stroma
et peuvent d’ailleurs activer les cellules myéloïdes immatures
immunosuppressives citées plus haut.
45
Ce microenvironnement immunosuppresseur peut alors favoriser la différenciation des
lymphocytes T en Th2 sécréteurs de cytokines anti-inflammatoires ou encore en lymphocytes
régulateurs (Th3)
102
, voire tout simplement inhibiteurs de fonctions effectrices des
lymphocytes T cytotoxiques.
- la modulation antigénique par l’anticorps
Cette modulation peut se faire soit par endocytose et dégradation des Ag de surface
consécutivement à la fixation d’Ac, soit suite au « shaving » du complexe Ag/Ac par les
macrophages exemple, en clinique du complexe RTX-CD20. En effet, des investigations
cliniques ont indiqué que l’injection d’anticorps monoclonaux à usage thérapeutique dirigés
vers des cellules normales ou tumorales peut mener à la perte de l'épitope visé, un phénomène
appelé modulation antigénique 29, 103-105.
Récemment, il a été rapporté que le traitement des patients atteints de leucémies
lymphoïdes chroniques par le RTX induit la perte substantielle de CD20 106 sur les cellules B
trouvées dans la circulation après injection de RTX et ceci du à un « shaving » du complexe
RTX-CD20 sur les cellules B par les monocytes ou les macrophages via leurs récepteurs au
fragment constant des Ig. Une telle modulation antigénique peut sévèrement compromettre
l'efficacité thérapeutique 107.
- Altération de voies métaboliques fondamentales
Métabolisme du tryptophane : ici on voit apparaître un nouveau mécanisme de tolérance
périphérique où les DC jouent un rôle pivot pour acquérir un phénotype tolérogène via
l’altération du métabolisme du tryptophane
108
. Ce phénotype peut être acquis
consécutivement à l’activation par l’IFNγ, au contrôle par les lymphocytes T régulateurs 109 et
à la sollicitation par l’IL10. En effet les DC peuvent être activés pour la production d’IDO.
L’IDO est l’enzyme responsable du catabolisme du tryptophane en kinurénine et donc de
l’appauvrissement du milieu en tryptophane. Cette production est stimulée par l’IFNγ et
l’IL10 et par sollicitation de la liaison CTLA-4 (compétiteur négatif de CD28 ayant une
avidité 20 fois supérieure à celle de CD28) à CD80/CD86
110
. L’appauvrissement en
tryptophane conduit à l’activation d’un « bio senseur » général du stress, la kinase GCN2
(General Control Non depressible 2), consécutivement à sa liaison aux ARNt non chargés par
46
leurs amino-acides respectifs. Cette activation se traduit par une inhibition de l’initiation de la
traduction protéique avec un arrêt de la prolifération et/ou l’induction de l’apoptose 111.
Métabolisme de l’arginine : les cellules myéloïdes qui sont maintenues dans un état
immature peuvent être suppressives par divers mécanismes (production de cytokines telles
que GM-CSF, VEGF, TGFβ et IL3 ou d’autres facteurs solubles tels que ROS, PGE2).
Cependant celui affectant le métabolisme de l’arginine paraît dominant
112
. La privation en
arginine peut agir de la même façon que celle du tryptophane par l’activation des systèmes
généraux de surveillance tels que GCN2, précédemment cité
113
. La carence en arginine peut
également entraîner une inhibition de la réexpression de la chaîne ζ du complexe CD3 après
activation des lymphocytes T 112.
- Activation permanente de Stat3 par les tumeurs
Les différents signaux émis par les tumeurs induisant et maintenant un état de
tolérance, exerceraient leurs effets via la voie de transduction des cytokines Jak-STAT et plus
spécifiquement en utilisant le couple Jak2-STAT3. De récentes études ont montré un rôle
important de la voie Jak2/STAT3 dans la différenciation des DC dans des conditions
physiologiques et dans des cas de cancers. Laouar 114 a montré que STAT3 est requis pour la
différenciation des DC dépendante de Flt3. Au même moment, il a été démontré que l’hyper
activation de la voie de signalisation Jak2/STAT3 est directement impliquée dans la
différenciation anormale des DC dans le cancer
115, 116
. Les cellules myéloïdes maintiennent
des niveaux élevés d’activité de Jak2 et STAT3 et sont incapables de se différencier en DC in
vitro 116.
Il a été montré en 1999 que l’inactivation de STAT3 dans les macrophages et les
polynucléaires dans un modèle murin, induit une hypersensibilité des souris au LPS et le
développement d’un choc septique sévère avec une hyperproduction de cytokines
inflammatoires IL6, TNF, IL1 et IFNγ
117
. Par contre, l’activation inappropriée de STAT3
dans les cellules tumorales prévient leur sécrétion de cytokines inflammatoires. Ainsi en
supprimant toute signalisation inflammatoire et en rendant les DC tolérogènes, les cellules
tumorales peuvent exploiter tout leur potentiel migratoire sans risquer d’être détruites.
47
III- L’IMMUNO-THERAPIE DES CANCERS
Il existe aujourd'hui un réel besoin de découvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques
contre le cancer. La survie à court/moyen terme a fait peu de progrès depuis quarante ans. Les
effets secondaires des traitements standards (notamment la chimiothérapie) sur les tissus sains
sont particulièrement importants, limitant ainsi les traitements prolongés. Par conséquent, des
traitements mieux supportés susceptibles d'améliorer la survie et la qualité de vie à court
terme sont nécessaires.
Comparée à d'autres formes de traitement de cancer, telles que la chirurgie, la
radiothérapie ou la chimiothérapie, l'immunothérapie est relativement nouvelle. En effet, bien
qu’il soit suspecté depuis longtemps que le système immunitaire a un effet sur certains
cancers, c'est seulement dans les dernières décennies que l'immunothérapie a prouvé son
utilité comme forme de traitement.
Bien que les cellules tumorales stimulent le système immunitaire moins facilement
que des pathogènes viraux ou bactériens, on sait depuis les expériences de William Coley en
1893, qu’il peut aussi être mobilisé contre des tumeurs bien établies. L'immunothérapie du
cancer offre donc une stratégie alternative, certainement complémentaire, dont les effets
secondaires seraient moindres.
L’éradication des cellules néoplasiques sans affecter les cellules normales, et cela
quelle que soit leur localisation, notamment dans les métastases, est le concept de base de
l’immunothérapie des cancers. Les connaissances acquises récemment sur l’immunité antitumorale ont permis de cibler les différents points à corriger pour atteindre une réponse
immunitaire efficace.
Les stratégies thérapeutiques sont variées mais ont toutes pour objectif de lever
l’anergie, c'est-à-dire une hypo-réactivité à l’Ag, des cellules potentiellement réactives en les
stimulant dans des conditions optimisées.
Il existe différents types d'immunothérapie anti-tumorale.
► Les immunothérapies passives emploient des composants de système immunitaire
tels que des anticorps ou des effecteurs cytotoxiques de « suppléance ».
► Les immunothérapies actives permettent d’induire in vivo chez le malade la
réponse immunitaire.
48
Parmi ces traitements, certains ont déjà fait leurs preuves. C’est le cas de l’injection de
cytokines, comme par exemple l’IL-2 et l’IFN-α, qui est devenue le traitement de référence
dans les cancers du rein métastatiques
118
ou dans les mélanomes
119
. D’autres sont en cours
d’évaluation clinique. C’est le cas des thérapies cellulaires ainsi que des vaccinations contre le
cancer, qui suscitent de réels espoirs.
Les types d'immunothérapie incluent :
► Transfert adoptif de lymphocytes
► Thérapie basée sur l’utilisation de mAb
Immunothérapies passives
► Immunothérapies non spécifiques et adjuvants
Immunothérapies actives
► Vaccins anti-cancéreux
III.1/ Immunothérapie passive par transfert adoptif de lymphocytes
L’immunothérapie passive à vue le jour dans les années 80 avec les expériences de
l’équipe de Rosenberg
120
. Ces expériences consistaient à injecter des lymphocytes activés
dans plusieurs modèles de tumeur murine. Les résultats obtenus ont montré que d’une part, le
nombre et la taille des métastases étaient réduits et d’autre part, des injections d’IL-2
potentialisaient cet effet. Dans les différents modèles de tumeur murine testés un modèle,
celui des macro métastases de l’adénocarcinome du côlon, a montré en plus de la disparition
des métastases une guérison de la totalité des animaux ayant reçu une injection de
lymphocytes activés 121.
Plusieurs équipes ont confirmé ces résultats ce qui a permis la mise en place d’essais
cliniques faisant intervenir des TIL dans le traitement du mélanome et du cancer du rein. Dans
les cancers du rein métastasés, ces essais ont donné des réponses complètes dans plusieurs
études et des réponses partielles dans toutes les études, comme par exemple l’essai mené par
l’équipe de Belldegrun en 1997. Cet essai comptait 62 patients inscrits et sur ce total, 55 ont
été traités avec des lymphocytes infiltrants les tumeurs et de l’IL-2. Les résultats obtenus ont
montré que 11% ne pouvaient pas subir la thérapie systémique, 9 % ont eu une réponse
complète et 25.5% une réponse partielle. Les réponses étaient durables avec une durée
médiane de survie de 22 mois. Ces résultats démontraient que la néphrectomie en
combinaison avec l'immunothérapie (TIL + IL2) donnaient un avantage clinique substantiel à
la majorité des patients 122.
49
Des essais cliniques de traitement des mélanomes par des lymphocytes activés ont
également été menés en France dans l’équipe de Francine Jotereau 123. Le but de son approche
était d'employer des TIL en tant que thérapie adjuvante pour le mélanome de stade III. 88
patients ont été sélectionnés pour être inclus dans cette étude et ont été affectés au hasard pour
recevoir soit TIL + IL2 pendant 2 mois, soit l’IL2 seule. Cette étude montra d’une part, une
augmentation significative de la survie globale sans rechute des patients traités par des
lymphocytes activés plus l’IL2, par rapport au groupe témoin (IL2 seule) et d’autre part, que
l'efficacité des TIL dans le mélanome de stade III est directement liée au nombre de ganglions
lymphatiques atteints. Ainsi l’efficacité clinique a pus être corrélée au pourcentage de
lymphocytes T spécifiques des antigènes de tumeur.
Outre l’utilisation de TIL, plusieurs équipes ont utilisé des LAK (lymphokineactivated Killer cells) pour des études menées sur des patients atteints de carcinomes rénaux
ou de mélanomes
124, 125
. Ces travaux n’ont cependant obtenu d’amélioration que dans le cas
des mélanomes 124.
En conclusion, on peut distinguer deux approches de transfert adoptif de
lymphocytes : une première approche consiste à transformer in vitro des cellules immunitaires
autologues en « cellules tueuses hyper activées » alors qu’une deuxième approche consiste à
transférer des lymphocytes T autologues spécifiques d’Ag de tumeurs (obtenus comme décrit
précédemment cf. § II-1-1). En plus de détruire la tumeur, ces derniers pourraient contribuer
à l’établissement d’une mémoire immunitaire, au rôle probablement protecteur contre les
récidives. Cette dernière approche semble prometteuse lorsqu’elle est combinée à une
chimiothérapie légère permettant d’éliminer les cellules régulatrices afin de permettre
l’expansion des cellules transférées.
III.2/ Immunothérapie passive par des anticorps anti-tumoraux
La thérapie à base d'Ac monoclonaux est une forme d'immunothérapie passive parce
que les Ac injectés au patient n’ont pas été produits par son propre système immunitaire mais
par génie génétique biologique.
La première technologie développée et la plus utilisée pour la génération d’Ac
monoclonaux est l’utilisation d’hybridome de souris générés à partir de fusion stable de
cellules de myélome immortalisées avec des cellules B issues d’une souris immunisée 126.
50
Cependant ces Ac de souris ont un très faible taux de succès dans le développement de
produits pharmaceutiques. Ce faible succès clinique reflète à la fois la grande immunogénicité
de ces protéines étrangères chez l’homme ainsi que la faible interaction de ces Ac avec le
complément humain et les FcγRs qui ne permet pas une activation optimale des effecteurs
immuns. Les limitations de ces Ac de souris ont largement été surmontées par leur
chimérisation et leur humanisation, des avancées technologiques qui les ont introduit dans
l’ère des Ac thérapeutiques. La chimérisation consiste à fusionner les domaines variables d’un
Ac monoclonal de souris aux domaines constants d’un Ac humain. L’humanisation nécessite
le transfert des CDRs (pour complémentary determine regions qui correspondent aux boucles
de liaison à l’Ag) d’un Ac de souris à une IgG humaine.
Il existe différents types d’Ac monoclonaux à usage thérapeutique (Figure 7).
Figure 7 : Structure des différents anticorps monoclonaux thérapeutiques (d’après 127).
La molécule d’IgG est un tétramère d’environ 150 kDa composé d’une paire identique de chaînes lourdes et
légères liées par des ponts disulfures (barre verte). Les chaînes lourdes contiennent un domaine variable (VH en
vert) et 3 domaines constants (CH1, CH2 et CH3 en bleu). Au contraire les chaînes légères contiennent un
domaine V (VL en orange) et un seul domaine constant (CL en bleu). L’architecture du domaine variable des
immunoglobulines a été exploitée pour créer une variété croissante d’Ac différents. Leurs différences se situent
au niveau de leur poids moléculaire (de 12 à 150 kDa), de leur valence (de 1 à 4) ainsi que de leur spécificité de
liaison à l‘Ag (de 1 à plus de 3 Ag ou épitopes sur le même Ag). La structure la plus fréquemment utilisée pour
créer un nouveau « format » d’Ac est le fragment d’Ac correspondant au domaine variable d’une seule chaîne
(scFv) qui est composé du domaine variable de la chaîne lourde et légère (domaines VH et VL ) lié par un peptide
d’environ 15 acides aminés. Les peptides et les « linkers » chimiques sont représentés par les traits orange et
rouge respectivement.
51
Le développement des Ac thérapeutiques constitue une avancée biomédicale
considérable ainsi qu’un incontestable succès commercial. Parmi les dix-sept anticorps
monoclonaux sur le marché en 2006, huit concernaient des indications contre des cancers
(leucémies, lymphomes, cancers métastatiques du colon et du sein) (Table 8). Ils permettent
d’augmenter la survie, souvent en association avec le traitement chimiothérapeutique
standard.
Plus de 300 essais cliniques d’anticorps monoclonaux thérapeutiques sont
actuellement en cours, et l’AFSSAPS ainsi que la Food and Drug Administration américaine
(FDA) en ont déjà approuvé plusieurs pour le traitement de certains cancers mais pas
uniquement. Il s’agit dans de nombreux cas aussi de traitement de pathologies auto-immunes
telle que la polyarthrite rhumatoïde 128.
Table 8 : Les anticorps monoclonaux concernant des indications anti-cancéreuses
nom de l'anticorps
nom commercial
Rituximab
Rituxan
Trastuzumab
Herceptin
Gemtuzumab / ozogamicin*
Mylotarg
Alemtuzumab
Campath
Ibritumomab / tiuxetan*
Zevalin
Tositumomab*
Bexxar
Bevacizumab
Avastin
Cetuximab
Erbitux
utilisation
NHL
Breast cancer
A ML
B-C L L
NHL
NHL
Colorectal cancer
Colorectal cancer
head & neck cancers
cibles
approuvé en
CD20 antigen
1997
HER2 protein
1998
CD33 antigen
2000
CD52 antigen
2001
CD20 antigen
2002
CD20 antigen
2003
VEGF protein
2004
EGFR protein
2004
2006
*conjugated monoclonal antibodies
Ils peuvent être nus tels que le Rituxan, l’Herceptin, Le Campath, l’Avastin et l’Herbitux ou conjugués (à une
drogue utilisée en chimiothérapie, à une particule radioactive ou à une toxine) comme le Bexxar, le Zevalin et le
Mylotarg.
Il existe plusieurs types de mode d’action pour ces Ac monoclonaux à usage
thérapeutique : certains ont été utilisés non marqués comme effecteurs immunitaires soit pour
cibler un Ag de surface soit pour inhiber un récepteur. D’autres (les immunotoxines ou les Ac
radiomarqués) ont permis de diriger des toxines et des isotopes radioactifs sur la surface des
cellules tumorales.
52
- Ciblage d’un Ag de surface
A titre d’exemple, le RTX (Figure 8), un Ac chimérique produit par génie génétique, a été le
premier Ac monoclonal approuvé par la FDA pour le traitement de cancer en 1997. Le RTX
cible l'Ag CD20, récepteur membranaire exprimé par plus de 95% des lymphocytes B sains
ou malins du stade B immature au stade de cellule B mémoire.
Figure 8 : Structure tridimensionnelle du Rituximab, représentant les chaines lourdes (gris clair) et légère (gris
foncé)
Le CD20 ne circule pas sous une forme libre dans le sang, n'est ni internalisé ni
modulé, ce qui en fait une cible thérapeutique de choix. Le RTX a donc été utilisé dans un
premier temps pour traiter (avec succès) les lymphomes non-Hodgkiniens (540,000 patients
traités) de bas grade et folliculaires en rechute. Déjà certaines combinaisons se montrent
prometteuses. Par exemple : (i) - RTX + CHOP (chimiothérapie composée de
Cyclophosphamide,
adriamycine
(doxorubicine
ou
Hydrodoxorubicine),
vincristine
(Oncovine) et Prednisone –la plus commune association pour le traitement des lymphomes
non-Hodgkiniens et (ii) RTX+ FC (pour Fludarabine/Cyclophophamide).
Trois mécanismes rendant compte du mode d’action de l’anticorps RTX seul ont été
décrit (Figure 9). Ces trois mécanismes correspondent à : (i) la cytotoxicité cellulaire
dépendante de l'anticorps (ADCC)
129-132
(ii) la cytotoxicité dépendante du complément
53
(CDC)
129, 133
prolifération
, et (iii) l'induction de l'apoptose in vitro
136
134
et in vivo
135
ou l'inhibition de la
.
Figure 9 : Modes d’action du Rituximab
Le fragment Fc peut générer des fonctions d'effecteurs immunitaires qui entraînent la lyse de ces lymphocytes.
Les mécanismes possibles de la lyse cellulaire induite par les effecteurs sont la cytotoxicité dépendante du
complément (CDC), faisant intervenir la liaison du fragment C1q, la cytotoxicité cellulaire dépendante de
l’Anticorps (ADCC), passant par des récepteurs au fragment constant des immunoglobulines (FcR) de la surface
des granulocytes, macrophages et cellules NK. Le fragment Fab du Rituximab lie le CD20 des NHL induisant
une mort cellulaire par apoptose ou une inhibition de la prolifération ainsi qu’une sensibilisation à la
chimiothérapie (CT).
Deux équipes ont montré que le traitement au RTX induisait une mort cellulaire par
apoptose caspase-dépendante des cellules de B-CLL in vitro
134
et in vivo
135
. De plus la
résistance au RTX dans les CLL, associée à la surexpression de protéines inférieures 137 vient
appuyer le rôle intrinsèque du RTX.
La CDC a été rapportée comme mécanisme prédominant d'activité du RTX in vitro 129,
133
, en montrant notamment que la CDC des cellules de lymphome traitées in vitro au RTX est
corrélée avec le niveau de l'expression des protéines associées au complément sur les cellules
54
tumorales
129
. Ces protéines, parmi lesquelles les protéines liées aux glycosyl-
phosphatidylinositol (GPI), CD46, CD55, et CD59, permettent d’inhiber le système du
complément afin d’éviter des dommages tissulaires. La neutralisation de ces protéines grâce à
des mAb bloquants augmente la CDC in vitro
138-140
. Donc, le ciblage concomitant de CD20
et la neutralisation de CD59 par un mAb bispécifique pourrait être testé dans le cas des
lymphopathie B résistante au RTX. Une autre voie pour agir sur la CDC pourrait être
d’améliorer la liaison de C1q à la portion Fc. Le site de liaison au C1q sur l’IgG humain a
récemment été cartographié
141
et un mutant IgG1 avec une liaison à C1q augmentée a été
créé 142. Ce mutant augmente l’activité CDC mais faiblement l’ADCC in vitro.
Parallèlement, d'autres équipes ont démontré que l’ADCC médiée in vitro par des
cellules NK
129
Cartron et al.
ou des neutrophiles
131
130
, contribue au mode d’action du RTX. L’étude de
démontre une corrélation entre la réponse clinique au RTX et un
polymorphisme allélique spécifique du récepteur FcγRIIIa, révélant qu'un mécanisme médié
par le FcγRIIIa, tel que l’ADCC, est prépondérant in vivo. L’importance d’un tel mécanisme
est désormais largement acceptée, et ces conclusions ont par la suite étaient étayées par la
découverte de mutation de FcγRIII qui accentuent l’efficacité de l’ADCC, et provoque ainsi
des réponses encore plus efficaces
143
. Le FCGR3A Humain montre un polymorphisme
nucléotidique au nucléotide 559 résultant de la substitution d’un acide aminé à la position 158
avec soit une phenylalanine (F) ou une valine (V). La substitution influence l’affinité de
l’IgG1 pour le récepteur FcγRIIIa avec une forte affinité pour les cellules NK FcγRIIIa158VV
144
. L’équipe de Cartron a démontré une corrélation entre le génotype FcγRIIIa et les
réponses cliniques et moléculaires au RTX dans les lymphomes folliculaires non traités ; les
patients homozygotes pour le FcγRIIIa-158VV ont de meilleures réponses cliniques et
moléculaires
131
. Ces résultats cliniques ont récemment été confirmés par d’autre
145
qui
supportent fortement l’hypothèse que l’ADCC est un des mécanismes d’action du RTX dans
les lymphomes folliculaires. Par ailleurs, grâce à des techniques de biologie moléculaire in
vitro de la région Fc, il est possible d’augmenter l’affinité des mAbs pour le FcγRIII et donc
d’augmenter l’ADCC
146
. En effet, la glycosylation des IgG est nécessaire pour les fonctions
effectrices et particulièrement pour l’interaction avec les FcγR
147
. Les modifications de
glycosylation pourraient influencer la capacité des mAb à activer l’ADCC. 148-150.
55
Enfin, l’activité cytostatique, a été montré par Bezombes en 2004. En effet,
l'engagement du CD20 par le RTX dans les cellules de type lymphome folliculaire induit la
délocalisation depuis des compartiments internes de la cellule vers le feuillet externe de la
membrane plasmique de la sphingomyélinase acide ainsi qu'à son activation dans des
microdomaines membranaires rafts. Cet événement conduit à l'hydrolyse de la
sphingomyéline et la génération de céramide qui va alors permettre le recrutement de
protéines à la membrane plasmique et conduire à terme à une augmentation de l'expression de
la protéine p27Kip1 impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire. Ces événements
conduisent à l'inhibition de la prolifération des cellules lymphoïdes B 136.
-
Inhibition d’un récepteur.
Certains mAb thérapeutiques se lient aux récepteurs des antigènes de cellules
cancéreuses, nécessaires à leur prolifération, ce qui bloque la fixation récepteur / Ag, et
empêchent donc les cellules cancéreuses de croître rapidement. Le Trastuzumab (Herceptin),
par exemple est un mAb nu utilisé contre le cancer du sein avancé, qui provoque
l’internalisation du récepteur HER2/Neu, l’empêchant ainsi d’interagir avec de nouveaux
facteurs de croissance extracellulaires 151.
-
Les Ac conjugués
Les Ac peuvent diriger des toxines et des isotopes radioactifs sur la surface des
cellules tumorales. Les Ac spécifiques des Ag tumoraux sont alors soit couplés à des toxines
soit couplés à des radio-isotopes.
Les anticorps conjugués à une toxine : exemple du Mylotarg™ (gemtuzumab ozogamicine)
Les conjugué des toxines biologiques et d’Ac sont appelés immunotoxines. En plus de leur
mode d’action hautement sélectif, dû à la fixation de l’Ac monoclonal à l’Ag tumoral, les
immunotoxines sont activées uniquement après leur pénétration dans les cellules, ce qui
devrait réduire le risque d’endommager les cellules non cancéreuses. Après leur fixation aux
cellules tumorales, les immunotoxines sont endocytées. Une fois dans les endosomes, la
toxine est séparée de l’Ac par clivage enzymatique, ce qui lui permet d’exercer son effet
toxique. Lorsque les anticorps testés étaient couplés à des toxines ou des agents antimitotiques
tels que la ricine ou l’ozogamicine, les résultats cliniques ont été plutôt décevants.
56
Le Mylotarg™ est la première chimiothérapie véhiculée vers les cellules cancéreuses par un
anticorps monoclonal spécifique de l'antigène CD33. C’est un nouveau traitement destiné aux
patients de plus de 60 ans en rechute de leucémie myéloïde chronique (LMC), et dont les
globules blancs expriment CD33. Il est composé de deux éléments : un anticorps monoclonal
IgG4 « humanisé » anti-CD33, et comme partie cytotoxique l’ozogamicine, une substance
bactérienne de la famille des anthracyclines.
Les anticorps conjugués à molécule radioactive : exemples du Zevalin™ (ibritumomab
tiuxetan Y90) et du Bexxar™ (tositumomab I131)
Quand les Ac ont été marqués par des radionucléides, principalement l’iode 131, les résultats
cliniques ont été contrastés. Ils ont été parfois très favorables dans les cas de formes
réfractaires de lymphomes non-Hodgkiniens ou de leucémies aiguës. Dans cette dernière
indication, la radio-immunothérapie a été associée à une chimiothérapie pour en intensifier
l’action avant une greffe de moelle. Les résultats cliniques ont été en revanche décevants dans
le traitement de tumeurs solides où les seules réponses ont été observées pour des cibles de
petite taille.
L’Y90 ibritumomab tiuxetan (Zevalin™) est anticorps monoclonal murin dirigé contre le
CD20 exprimés par lymphocytes B, combiné à l’yttrium-90. Ce médicament est homologué
en France et est indiqué dans le traitement des lymphomes folliculaires. Ce médicament est en
cours d’évaluation pour le traitement de la leucémie lymphoïde chronique « LLC ».
Le I131 tositumomab (Bexxar™) est un anticorps monoclonal, de type IgG2a, murin conjugué
avec une molécule d’iode radioactive dirigée contre les lymphocytes B CD20+. Cette nouvelle
approche à l’avantage d’administrer de faibles doses d’anticorps. Ce médicament est
homologué dans certains pays pour le traitement des lymphomes folliculaires réfractaires. Il
est en cours d’évaluation dans les « LLC ».
III.3/ Immunothérapie active non-spécifique
Bien qu’à l’heure actuelle les recherches se focalisent sur les méthodes
d’immunothérapies actives spécifiques (cf. § II-4), d’autres types d’immunothérapie ont fait
leur preuve. En effet, l’immunothérapie active non-spécifique qui permet une stimulation
globale du système immunitaire des patients atteints de cancer a montré son efficacité.
57
•
Injection de produits bactériens : le BCG
L’objectif de cette stratégie est de stimuler l’immunité anti-tumorale grâce à l’injection
de différentes molécules et protéines, sans cibler spécifiquement des Ag de tumeurs donnés.
L’effet anti-tumoral lié aux mycobactéries a été observé pour la première fois en 1929,
par Pearl qui observa lors de l'analyse d'une série nécrosique, que les patients atteints de
tuberculose développaient moins de tumeurs malignes que la population générale. En 1953,
un chirurgien américain qui avait constaté la régression d'un lymphosarcome chez un patient
atteint d'un érysipèle (dermo/hypodermite bactérienne aiguë non nécrosante par
streptocoques/mycob), a tenté pour la première fois l'utilisation d'extraits bactériens comme
traitement adjuvant du traitement des tumeurs. En 1966, Coe a alors démontré que la vessie
pouvait être le site de réactions d'hypersensibilité retardée au même titre que la peau
152
. Sur
cette base d’éléments, en France, Mathé a utilisé en 1969, pour la première fois le Bacille
Calmette-Guerin (BCG) en thérapeutique humaine anti-tumorale, mais dans le cadre de
leucémies aiguës de l’enfant, mais qui s’accompagna d’échecs liés à des granulomatoses
disséminées
153
. Cependant le BCG a quand même été utilisé dans le traitement des
mélanomes métastatiques dès les années 1970. Ainsi en 1974, Zbar a démontré l'effet antitumoral du BCG administré localement sur l'hépatocarcinome du cobaye 154. Ensuite en 1975,
Bloomberg a démontré la bonne tolérance des instillations endovésicales de BCG chez le
chien
155
. La même année Kernion rapportait le premier traitement d'une tumeur vésicale
métastatique d'un mélanome malin par BCG-thérapie locale
156
. Enfin, ces observations ont
conduit Morales à utiliser en 1976 le BCG en instillations locales dans le traitement de
tumeurs non invasives de la vessie et, elles ont montré une élimination de la tumeur grâce à
une inflammation locale 157.
En effet, après l'attachement à l'urothelium, le BCG induit un processus inflammatoire
et un relargage précoce de cytokines pro-inflammatoires attirant ainsi les cellules de
l’immunité innée telles que les macrophages et les neutrophiles. Ces dernières augmentent la
production locale de cytokines et de chimiokines et attirent des sous-ensembles de
lymphocytes activés tels que les cellules T CD4+ et CD8+ aussi bien que les cellules NK. Ces
cellules effectrices lysent finalement des cellules tumorales de la vessie par la cytolyse.
Depuis cette époque, l'immunothérapie adjuvante à base de BCG pour le cancer de la
vessie est très utilisée et l’instillation intra vésicale de BCG (ImmuCyst™) est actuellement
un traitement de choix pour les formes précoces et localisées de ce type de tumeur (pour
revues voir :
158, 159
).
58
•
Administration systémique de cytokines
L’utilisation des cytokines en thérapeutique anticancéreuse est une des grandes
innovations de ces dernières années. En effet, elle permet une manipulation fine de
l’hématopoïèse et des réponses immunitaires.
Il existe plusieurs cytokines approuvées par les autorités pour le traitement de certains
cancers. L’interleukine 2 (IL-2) est utilisée pour le traitement des patients atteints
d’adénocarcinome du rein métastatique (20% de réponses cliniques). L’interféron alpha (IFNα) est également utilisé pour le traitement de l’adénocarcinome du rein métastatique mais
aussi pour le traitement du mélanome
160
, des sarcomes de Kaposi liés au SIDA
161
, des
lymphomes folliculaires 162, du myélome multiple et des leucémies myéloïdes chroniques.
Pour les tumeurs solides, les taux de réponse aux cytokines recombinantes, rIL2 et
rIFNα, sont compris entre 5 et 25%, dont la moitié sont des réponses complètes. Par ailleurs,
la combinaison de ces deux cytokines améliore significativement la survie sans progression
des patients atteints d’adénocarcinome rénal ainsi que leur taux de réponse (entre 6 et 7% de
réponse pour les monothérapies rIL2 ou rIFNα seules contre plus de 18% pour la
combinaison rIL2 plus rIFNα) 118.
•
Thalidomide et IMIDS
La thalidomide (N-phthalidoglutarimide), est un mélange des formes lévogyres et
dextrogyres de l'acide glutamique dont les propriétés principales sont immunomodulatrices et
anti-inflammatoires. Son arrivée en 1999 a permis l'obtention de rémissions chez des patients
réfractaires à toute chimiothérapie.
D’abord, la thalidomide modifie les interactions entre ces cellules en diminuant
l'expression de nombreuses molécules d'adhésion au niveau des cellules tumorales et
stromales, telles que la E-selectin, VCAM (vascular cell adhesion molecule), ICAM-1
(intercellular cell adhesion molecule-1) et PECAM (platelet–endothelial cell adhesion
molecule - sCD31). Elle réduit l'invasion locale et la migration métastatique en diminuant
l'expression de la cyclo-oxygénase de type 2 (cox-2). Ensuite, au niveau de la production
cytokinique, la thalidomide inhibe également la voie de signalisation intracellulaire du TNFα,
diminue la synthèse de nombreuses interleukines (IL-1, 6 et 12), augmente la production de
59
l'IL-4 et IL-5, et inhibe aussi les deux principales cytokines proangiogéniques, le bFGF
(basic-fibroblast growth factor) et le VEGF (vascular endothelial growth factor).
Par ailleur, la thalidomide inhibe la voie du NF-kB. En conséquence, l'expression de
nombreux gènes impliqués dans la réponse immune, dans l'angiogenèse et dans la réponse
anti-inflammatoire, tels que ceux de l'IL-8 et 12 et du TNF-α sont régulés négativement. De
plus, elle inhibe l'insulin like growth factor-1 (IGF-1), facteur de croissance et de survie
majeur des cellules myélomateuses.
Enfin elle diminue la capacité de phagocytose des monocytes et des polynucléaires,
ainsi que le chimiotactisme de ces derniers. En outre, elle augmenterait le nombre et la
fonction d'un certain type de cellules NK, à l'origine d'une immunité antitumorale.
Des analogues structuraux du thalidomide, privilégiant un des mécanismes d'action
spécifique du thalidomide, sont en cours d'évaluation, les SelCIDS (selected cytokine
inhibitory drugs) et les IMiDs (immunomodulatory drugs). Le lénalidomide (CC-5013,
Revlimid®) est une substance immunomodulatrice, analogue structural et fonctionnel du
thalidomide appartenant à la famille des IMiDS (IMiDs). Les IMiDs, dont le mode d'action
est fondé sur une stimulation de la lymphopoïèse T et moins sur l'inhibition du TNFα font
l'objet d'essais thérapeutiques dans le myélome multiple et semblent promis à un intéressant
avenir. Les mécanismes d'action du lénalidomide sont semblables à ceux du thalidomide, avec
cependant une activité in vitro très nettement supérieure lors des études pré-cliniques.
•
Ligands de TLR exploités en oncothérapie
Il existe une dizaine de récepteurs de l’immunité innée, qui sont structurellement
aparentés à la protéine d’insecte Toll, ces récepteurs sont appelés les TLR pour Toll-Like
Receptors (TLR1-11). Les ligands de ces TLR représentent de puissants adjuvants de
l’immunité 163. De nombreux agonistes naturels et de synthèse des divers TLR tels loxoribine,
R-848 et imiquimod (ligands de TLR7,8) présentent des propriétés antivirales et
antitumorales, mettant en jeu des réponses IFN de type I. Par ailleurs, les
oligodeoxynucleotides porteurs de motifs CpG non méthylés (ODN CpG) interagissent
sélectivement avec le récepteur TLR9 164. Leur activité adjuvante est basée sur leur capacité à
activer les cellules B humaines et les DC plasmacytoïdes (pDC), les deux principaux types
cellulaires exprimant le TLR9 chez l’homme. En effet, les pDC peuvent devenir de puissants
effecteurs cytotoxiques capables de tuer des cellules infectées ou des cellules tumorales. Les
60
pDC activées par le virus de l'influenza ou par des dérivés de produits microbiens qui se
fixent sur des récepteurs particuliers (les TLR), expriment très rapidement à leur surface
TRAIL. Quand ce ligand de mort se fixe sur des cellules cibles qui expriment le récepteur
DR4 ou DR5, il induit la mort par apoptose de ces cellules
165
. La démonstration de cette
nouvelle propriété des pDC contribue certainement à l'efficacité thérapeutique de ces ligands
de TLR.
Chez l’homme, les ODN CpG augmentent l’immunogénicité des vaccins de la grippe
et de l’HBV
166
et peuvent amplifier les effets de l’adjuvant incomplet de Freund (IFA) dans
les protocoles antitumoraux. Les réponses cytotoxiques des cellules T CD8+ à l’Ag de
mélanome MART1 sont augmentées de plus de 10 fois lorsque les ODN CpG sont ajoutés au
vaccin MART1 + IFA
demeurent
167
. Cependant ces lymphocytes T CD8+ MART1-spécifiques
quantitativement
sous-représentés au
niveau
des
sites
tumoraux
168
.
L’incorporation de ODN CpG aux mélanges vaccinaux nécessite cependant d’être optimisée,
les réponses qu’ils potentialisent n’ayant pas encore fait la preuve de leur efficacité protectrice
chez l’homme et chez le primate non humain. Ainsi les ODN CpG pourraient contribuer à
l’induction des Tregs169. Il est toutefois clair que les ODN CpG peuvent synergiser avec
d’autres modalités antitumorales, comme les réponses antitumorales résiduelles post
élimination des Treg par chimiothérapie. Aussi, dans les cancers du poumon, l’addition de
ODN CpG à la chimiothérapie améliore le taux de réponse mais ceci sans améliorer la survie.
Le développement de cette nouvelle classe d’agents thérapeutiques très prometteuse
pour l’immunothérapie des tumeurs est actuellement en plein essor.
III.4/ Immunothérapies actives spécifiques : les vaccinations
La vaccination antitumorale est un champ d’investigation important. Différentes
formes de vaccins ont été successivement explorées : elles comprennent les vaccins cellulaires
qui ont initialement prédominé la discipline, puis les vaccins moléculaires ont abordé l’usage
de peptides tumoraux purifiés. Ces étapes ont été suivies de l’évaluation de combinaisons de
vaccins associant cellules immunogènes (cellules dendritiques notamment) et protéines
tumorales et enfin de vaccins à base de vecteurs recombinants.
Depuis la découverte des premiers Ag de tumeur, plus de 150 peptides antigéniques
ont été caractérisés (http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm, pour
61
une liste plus complète). La démonstration de leur utilisation en thérapeutique est en cours.
Actuellement, une centaine d’essais cliniques de thérapie vaccinale du cancer sont référencés
par le NCI (National Cancer Institute, USA). Certains de ces essais utilisent des peptides,
seuls ou en association, d’autres utilisent des extraits de tumeur autologue ou de lignées
cellulaires « sécurisées » (lignée cellulaire sans potentiel infectieux). L’usage des lignées
« sécurisées » dans le cadre d'un essai thérapeutique doit être autorisé par l'AFSSAPS
(Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé).
Selon les essais, les Ag sont utilisés directement ou après chargement sur des CPA,
(des DC le plus souvent) ou encore en combinaison avec des injections de cellules
mononuclées et/ou de cytokines.
III-4-1. Les vaccins cellulaires
Les vaccins cellulaires sont formés de cellules tumorales autologues ou plus
fréquemment allogéniques, irradiées et servent à immuniser les patients. Chez la majorité des
patients atteints de mélanome, de cancer du rein ou du colon, ces cellules irradiées sont
généralement injectées en combinaison avec un adjuvant immunologique tels que différents
extraits bactériens. En 1990, Berd a mené une étude randomisée sur 64 patients atteints de
mélanomes métastatiques, dans laquelle le vaccin était composé de 10 à de 25 millions de
cellules tumorales autologues irradiées et mélangées au BCG. Sur 40 patients évaluables
(avec les métastases mesurables), cinq ont répondu : quatre réponses complètes et une
partielle, avec une médiane de survie de 10 mois. Dans six patients additionnels, il a été
observé une réponse anti-tumorale correspondant à la régression des lésions métastatiques
après le début de l'immunothérapie 170.
Pour produire in vivo chez les malades des cellules effectrices capables de lyser
spécifiquement les cellules tumorales, les Ag tumoraux doivent être présentés de nouveau à
l’organisme dans des conditions favorables au déclenchement d’une réponse immunitaire.
Ceci a été tenté expérimentalement dans les essais d’injection de cellules tumorales modifiées,
par exemple en les transfectant avec des ADNc codant pour des molécules de co-stimulation
ou pour des cytokines. L’augmentation de leur immunogénicité induit une protection antitumorale chez l’animal. Le même objectif qui est poursuivi actuellement dans les essais
d’immunisation avec de simples peptides antigènes de tumeur.
62
III-4-2. Les vaccins peptidiques
C’est grâce au développement extraordinaire de la recherche sur les Ag tumoraux
qu’une large panoplie d’épitopes pour les CTL anti-tumoraux a pu être identifiée. Des essais
cliniques des peptides MAGE ont montré des régressions métastatiques chez les patients
atteints de mélanomes. Dans ces cas, on a souvent noté l’association de la réponse
antimélanome à l’apparition d’un vitiligo, dermatose de nature autoimmune caractérisée par
l’apparition de plaques dépigmentées.
Actuellement, des essais sont menés avec des Ag de tumeur fusionnés avec des ligands
de surface des DC, comme des chimiokines ou des fragments Fc d’immunoglobulines. Ceci a
pour but d’adresser plus sélectivement l’Ag à la DC 171.
III-4-3. Les vaccins avec protéines ou peptides présentés par des DC
Les essais d’injection de CPA sont en pleine évolution, et de plus en plus de nouvelles
stratégies voient le jour en donnant des résultats expérimentaux extrêmement encourageants.
En effet, les DC peuvent être chargées avec (i) des peptides tumoraux, (ii) des extraits de
cellules tumorales, (iii) des corps apoptotiques, (iv) des exosomes (microparticules
membranaires sécrétées dans le milieu), ou encore (v) être fusionnées avec des cellules
tumorales. Dans toutes ces situations expérimentales, ces DC possèdent la capacité d’activer
in vitro des lymphocytes anti-tumoraux spécifiques des Ag présentés, qui acquièrent alors des
propriétés cytotoxiques. Des essais pré-cliniques montrent que les DC ont un pouvoir curatif
et préventif à l’égard de tumeurs greffées. Dans des modèles murins de tumeur gliale
172
, de
mastocytome 173; 174 ou de mélanome 175, l’injection sous-cutanée de DC chargées avec un Ag
de tumeur entraîne une infiltration de la tumeur par des CTL, associée à un effet
thérapeutique. C’est en 1996 que les premiers essais cliniques à base de DC ont vu le jour 176.
L’étude portait sur des patients atteints de cancer métastatique de la prostate exprimant le
CMH de classe I HLA-A2. Cette étude consistait à administrer aux patients des DC
autologues chargées avec l’Ag de membrane spécifique de la prostate (PSMA pour ProstateSpecific Membrane Antigen). Les résultats ont été une amélioration significative du taux de
survie et 27% de réponses partielles.
63
Les résultats de l’essai portant sur le traitement de mélanomes métastatiques mené par
le groupe de F.O. Nestle 49 méritent également d’être soulignés. Les DC étaient chargées avec
des peptides caractéristiques des haplotypes HLA-A2 ou HLA-A1 ou des lysats de la tumeur
autologue (chez quatre patients). Sur les seize patients inclus, cinq réponses ont été obtenues
dont deux avec les lysats tumoraux
49
. L’utilisation de lysats tumoraux présente l’intérêt
majeur d’être a priori applicable à toutes les tumeurs, les Ag de ces tumeurs étant et individuspécifiques et a priori non-identifiés.
Par la suite, d’autres essais cliniques utilisant des DC chargées avec des Ag tumoraux
ont montré des réponses immunes et cliniques sans toxicité significative 177, 178.
Actuellement, plusieurs approches expérimentales, comme la fusion de DC avec des
liposomes ou encore leur transfection avec des ARN tumoraux, sont encore menées pour
améliorer la présentation des Ag de tumeur par le CMH de classe I. Une façon efficace
d’obtenir l’expression endogène d’Ag de tumeurs par les DC est de les fusionner avec les
cellules tumorales. Un essai clinique vient d’en apporter la démonstration : 17 patients atteints
de cancer du rein métastatique ont été vaccinés avec 100 millions de cellules résultant de
l’électrofusion de DC allogéniques avec des cellules tumorales autologues. 23% des patients
ont éliminé leurs métastases et 17% ont bénéficié d’une réduction de plus de la moitié de tous
les sites tumoraux pendant plus de trois mois
179
. Les analyses histologiques et biologiques
confirment une réponse immunitaire anti-tumorale relayée par des lymphocytes T CD8+
spécifiques. Cet excellent résultat est notoirement supérieur à ce qui est obtenu avec les
traitements habituels du cancer du rein métastatique.
III-4-4. Les vaccins recombinants / les vaccins avec l’ADN nu
Des vecteurs viraux ou d’ADN nu codant un Ag tumoral sont en évaluation comme
potentiels vaccins anti-cancéreux 171. Ces vaccins vivants sont fabriqués grâce aux techniques
de recombinaison génétique telles que les techniques expérimentales d'assemblage de
séquences d'ADN non contiguës à l'état naturel. Par rapport aux techniques traditionnelles de
conception de vaccins, le génie génétique permet de définir les caractéristiques du vaccin. Il
n'est donc plus nécessaire d'utiliser le virus entier, seul l'Ag est inséré. Le premier vaccin
recombinant humain mis sur le marché a été celui de l'hépatite B, suivi du vaccin anticoqueluche.
64
Evidemment, l’efficacité de l’immunothérapie s’avère meilleure à un stade
précoce de la maladie. Cependant comme le choix immunothérapie active ou passive
dépend de l’état (notamment aplasie) du patient et donc du stade de sa maladie,
plusieurs approches complémentaires doivent être combinées.
Dans cette logique, cette thèse propose et démontre que la combinaison d’un
agent d’immunothérapie active (phosphoantigène) avec une immunothérapie passive
(anticorps thérapeutique) améliore l’efficacité anticancéreuse.
65
IV- LYMPHOCYTES T γδ
La réponse immunitaire comprend une composante innée médiée par les cellules
polymorphonucléaires, macrophagiques, dendritiques et NK ainsi qu’une composante
adaptative à l'Ag, médiée par les lymphocytes (B, Tαβ et Tγδ). Les lymphocytes T γδ ont été
identifiés en 1986 comme étant une nouvelle population de lymphocytes T périphériques et de
thymocytes CD3+ double négatif CD4- CD8- caractérisés par un récepteur pour l’Ag (TCR)
formé de l’association d’une chaîne gamma (γ) et d’une chaîne delta (δ) et associé à
l’expression de CD3 180-183.
Contrairement à leurs homologues αβ, les lymphocytes T γδ ne représentent qu’une
faible proportion (< 6%) des lymphocytes circulants dans le sang périphérique. Ils sont
beaucoup plus répandus dans les tissus épithéliaux et tous les organes lymphoïdes où ils
peuvent représenter jusqu’à 50% des lymphocytes T. Cependant, lors de diverses infections
bactériennes telles que la tuberculose
184, 185
par des protozoaires tels que la malaria
190
, la méningite
186
, la toxoplasmose
ou encore la tularémie
187-189
, et
191
192-194
les
ou la leishmaniose
lymphocytes T γδ s’amplifient à des niveaux tels qu’ils peuvent alors représenter la majorité
des cellules T circulantes (jusqu’à 40% chez certains individus). Enfin, ils se distinguent
surtout des lymphocytes T αβ par leur capacité à reconnaître des Ag solubles sans
présentation par le CMH des CPA 195.
Ainsi, à la différence des deux autres populations de lymphocytes, les lymphocytes T
γδ se situent à la frontière de l’immunité innée et de l’immunité adaptative car ils expriment à
la fois des récepteurs non réarrangés caractéristiques de l’immunité innée de type NKR, qu’ils
partagent avec les cellules NK, et un récepteur réarrangé de type TCR, caractéristique de
l’immunité adaptative. Tous les vertébrés ont des lymphocytes T γδ, mais seuls les primates
(humains et non humains) ont dans le sang circulant un sous-groupe de lymphocytes T γδ à
TCR de type Vγ9Vδ2 (désignés ci-dessous par cellules T Vγ9Vδ2).
Constituant 1 à 5% des lymphocytes totaux circulants chez l’adulte, cette souspopulation prédominante répond uniformément à des Ag très conservés
196
. Ces Ag sont
distincts des peptides présentés par les molécules du CMH ou de lipides présentés par CD1
66
197
. En effet, ces Ag sont de nature non peptidiques, étrangers ou du soi, mais ni présentés ou
même restreints par le CMH
198
. Cependant ces Ag seraient présentés par une molécule
présentatrice d’Ag inconnue 199, 200.
Ce mode de stimulation non limité par le polymorphisme du CMH fait des
lymphocytes T γδ une population de choix pour un ciblage thérapeutique, car un réservoir
encore trop peu exploité de cellules effectrices anti-infectieuses 201 et anti-cancéreuses 202.
IV-1/ Ontogénie des lymphocytes Tγδ
Le récepteur Notch est la molécule clé dans l’orientation du choix entre les lignées αβ
ou γδ au cours de la maturation. Cette molécule transmembranaire, conservée au cours de
l’évolution, régule le développement d’un très large éventail de types cellulaires.
Des études chez la souris ont permis de déterminer que le lignage des lymphocytes T
γδ de souris se différencierait aux stades Double Négatif DN (CD4-CD8-) 2 et 3
10) du développement thymique des lymphocytes T.
Figure 10 : Les stades de différentiation des cellules T (d’après 204).
DN= Double négatif, ISP = Immature simple positif, SP = simple positif, DP = double positif
67
203
(Figure
De plus, un signal délivré par le récepteur Notch favoriserait l’orientation αβ alors que
son inactivité orienterait vers la lignée γδ (Figure 11) 205.
Figure 11 : Modèle d’intensité du signal Notch et de synergie entre le signal Notch et le signal TCR (d’après
204
).
Ce modèle soutient le fait que le destin des cellules doubles négatives DN3 est dicté par le TCR et le pré-TCR et
que de puissants signaux TCR (rouge), orientent les cellules vers un phénotype γδ, alors qu’un signal pré-TCR
plus faible (vert) conduit les cellules à survivre, proliférer et se différencier en un pool de cellules double
positives (DP). Le signal Notch soutiendrait simplement la deuxième voie. Dans, le modèle de la synergie entre
le signal Notch et le signal TCR, c’est le signal Notch (bleu) qui est le facteur limitant, en effet, il est requis en
faible quantité pour le signal pré-TCR orientant les cellules vers le pool DP, alors qu’au contraire, les signaux
TCR requièrent des taux important de Notch pour permettre une différentiation des DP
Alors que Notch régule les phases précoces de la différentiation des lignages αβ et γδ,
l’équipe de B. Malissen a montré que la protéine LAT (pour Linker for Activation of T cells)
est un régulateur essentiel de l’homéostasie et de la différentiation terminale des lymphocytes
T γδ. En effet, les souris homozygotes pour la mutation des trois résidus tyrosine en C
terminal de LAT montrent un blocage dans le développement des cellules T αβ et un
développement partiellement altéré des cellules T γδ. Ce développement partiellement altéré
des cellules T γδ est caractérisé par une absence des cellules Tγδ dans la rate et les ganglions
lymphatiques et reflèterait un défaut dans la différentiation terminale des lymphocytes Tγδ 206.
68
L’ontogénie des lymphocytes T γδ a surtout été étudiée chez la souris : ils apparaissent
par vagues successives (Figure 12) au cours du développement notamment dans le thymus à
partir duquel ils vont coloniser un organe particulier dans lequel ils resteront tout au long de la
vie fœtale 207.
Figure 12 : Etapes développementales de génération des lymphocytes T γδ murins (d’après 204).
Les vagues de progéniteurs DN1, 2 et 3 provoquent des vagues de cellules T γδ qui colonisent des localisations
anatomiques distinctes. Les données montrent qu’au moins le répertoire TCRγδ canonique de la peau est
positivement sélectionné.
Le foie et l’intestin fœtal sont chez l’Homme les premiers sites de l’ontogenèse des
lymphocytes T γδ: ce sont les premiers lymphocytes à apparaître (entre les 7 et 11ème
semaines) 208. Le thymus est alors colonisé par vagues successives dès la 10ème semaine. Une
étude de l’évolution des populations γδ au cours de la vie
209
a montré une expansion
périphérique de la sous-population Vδ2 lors de l’enfance sans qu’il y ait de colonisation
thymique suggérant ainsi un développement périphérique de cette population. Des études
génétiques ont montré que chez l’Homme toutes les familles Vδ et Vγ sont exprimées et
réarrangées dans le thymus dès la 11ème semaine de la vie fœtale (sauf Vδ4) avec la
prédominance des TCR exprimant Vδ2. Dans tous les cas, les TCR exprimés sont limités aux
Vδ1 et Vδ2.
69
Chez l’Homme, comme chez la souris, les réarrangements des différents loci se font de
manière ordonnée 210. Au cours de leur développement thymique, ces cellules réarrangent les
segments géniques codant pour leur TCR γδ par un mécanisme de recombinaison somatique
assez similaire à celui mis en jeu par les lymphocytes T αβ. C’est grâce à la diversité
combinatoire c'est-à-dire la combinaison de différents segments (V, J et C pour les chaînes α
et γ ou V, D, J et C pour les chaînes β et δ) que la diversité du TCR est générée. Les chaînes
des TCR αβ et γδ sont codées par plusieurs segments de gènes chez l’Homme 211. Le locus de
la chaîne γ du TCR se trouve sur le chromosome 7 et le locus de la chaîne δ du TCR est inclus
dans celui de la chaîne α du TCR entre les segments Vα et Jα. Le nombre de segments γ et δ
étant bien inférieur à celui des segments α et β, les combinaisons γδ sont limitées par rapport
aux lymphocytes T αβ.
Le répertoire γδ périphérique évolue au cours du temps. Majoritairement généré dans
le thymus, chez le fœtus de 8 à 15 semaines il est très restreint du fait de l’utilisation d’un
petit nombre de segments variables : on assiste à des jonctions Vδ2 et Dδ3 et Vγ8 ou Vγ9 au
cluster Jγ1 avec une diversité jonctionnelle très limitée
212
. 4 à 6 mois après la naissance, les
réarrangements impliquent les segments Vδ1 avec Dδ1 et Dδ2 et les segments Vγ2, 3, 5, 8
(famille VγI) au cluster Jγ2 avec une diversité plus grande. Les cellules qui expriment ces
TCR sont les LT VγIVδ1. Ainsi dans le thymus postnatal et tout au long de la vie on compte
15% de LT Vγ9Vδ2 et 80% de LT VγIVδ1. Toutefois dans le sang circulant les LT Vγ9Vδ2
finissent par être majoritaires (80% environ) au détriment des VδI 209.
Les lymphocytes T γδ ont un biais dans la distribution de leur répertoire périphérique
et chaque réarrangement préférentiel au niveau des gènes codant pour le TCR constitue une
sous-population aux caractéristiques fonctionnelles particulières. Chez l’Homme, on observe
une sous-population majoritaire dans le sang circulant : les cellules T Vγ9Vδ2
213
. Chez
l’adulte ce seul sous ensemble de lymphocytes T γδ représente normalement autour de 80%
des T γδ sanguins totaux, soit approximativement entre 1 et 6% des T sanguins. Enfin,
contrairement à la règle de l’exclusion allélique observée chez les lymphocytes T αβ, il est
fréquent chez l’humain, que les lymphocytes T γδ sanguins expriment simultanément deux
TCR γδ distincts et soient fonctionnellement bi-réactifs.
70
IV-2/ Les différentes sous populations de lymphocytes TVγ9Vδ2
Il a été montré que l’expression des marqueurs CD45RA, CD27 et plus récemment du
marqueur CXCR5, définit plusieurs sous-populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2 (Figure 13)
avec des fonctions et des distributions anatomiques distinctes 214, 215.
CD45RA+
CCR7+
CD27+
CD62L++
CD45RACCR7CD27+
CD62L+
CD45RA+
CD16+
CD27CD62L-
CD45RACD16CD27CD62L-
Figure 13 : Les sous populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2
Le modèle actuel propose un enchainement des trois stades de maturation successifs,
constitué des sous-groupes suivants. Il s’agit des lymphocytes T γδ naïfs, des lymphocytes T
γδ « mémoire centrale » et leur sous-compartiment CXCR5+ (cf ci-dessous), ainsi que des
lymphocytes effecteurs mémoires, soit de type Th1 (Vγ9Vδ2 TEMh, CD27-, CD45RA-, CD16-)
soit de type lytique (Vγ9Vδ2 TEMRA, CD27-, CD45RA+, CD16+).
Les cellules naïves (TN) constituent 20% des lymphocytes T Vγ9Vδ2 dans le sang de
donneurs sains adultes. Ces cellules naïves, de phénotype CD27+, CD45RA+, CXCR5-, CD1671
se localisent principalement au sein des ganglions lymphatiques et elles expriment d’ailleurs
des récepteurs impliqués dans la migration vers les ganglions lymphatiques CCR7 et CD62L,
mais n’expriment pas les récepteurs aux chimiokines pro-inflamatoires que sont CCR2,
CCR5, CCR6, et CXCR3.
Les cellules centrales mémoires (TCM) constituent 50% des lymphocytes T Vγ9Vδ2
dans le sang de donneurs sains adultes. Ces TCM expriment les récepteurs aux chimiokines
CCR5 et CXCR3. Ces γδ TCM ont pour phénotype CD27+, CD45RA-, CXCR5- CD16-. Ils sont
essentiellement capables de proliférer en réponse à leur Ag spécifique (cf § III-3-1), mais
présentent une très faible capacité lytique et de production cytokinique. Cette sous-population
petite fraction qui reste localisée au niveau des ganglions lymphatiques. Il a récemment été
montré que l’expression du marqueur CXCR5 identifie une sous-population de TCM. Cette
sous-population exprime également les molécules de costimulation ICOS et CD40L, sécrète
de l’IL2, de l’IL4 et de l’IL10 et aide les cellules B pour la production d’IgG. Ces propriétés
décrivent les cellules T Vγ9Vδ2 CXCR5+ comme une sous-population de cellules T mémoire
distincte avec des fonctions cytokiniques de type Th2 215.
Les cellules effectrices mémoires TEMh1 et TEMRA ont des phénotypes, des modes
d’activation et des rôles complémentaires. Elles représentent probablement deux voies
alternatives de maturation terminale pour les cellules T γδ circulantes 214, 216.
Les cellules Vγ9Vδ2 TEMh1 expriment un fort niveau de récepteurs aux chimiokines
(notamment CXCR3, CCR5 et CCR6) et peu de récepteurs de type NKR, suggérant leur
implication préférentielle dans des processus d’inflammation plutôt que cytolytiques. En
réponse à une stimulation par leur antigène spécifique, ils produisent des taux élevés d’IFNγ
et de TNFα. Ces cellules possèdent également un potentiel cytolytique non négligeable,
mettant en jeu le relarguage de perforine.
A l’inverse des cellules Vγ9Vδ2 TEMh1, les cellules Vγ9Vδ2 TEMRA expriment
constitutivement peu de récepteurs aux chimiokines mais plusieurs NKR dont le récepteur
activateur CD16, suggérant leur implication préférentielle dans des processus lytiques plutôt
qu’inflammatoires. Guère répondeuses aux Ag solubles spécifiques, ces cellules T « NKlike » sont particulièrement cytotoxiques contre les cellules tumorales humaines grâce à leur
récepteur activateur CD16 et sécrètent des taux élevés de perforine et d’IFNγ 217. Les résultats
de l’équipe de Dieli suggèrent que la fraction des TCM localisée dans les ganglions
72
lymphatiques serait un réservoir de cellules effectrices, généré lors de la réexposition à l’Ag
214
. Les Ag activateurs des cellules T Vγ9Vδ2 permettent donc d’une part d’expandre le
réservoir de cellules mémoire centrale mais aussi d’en provoquer la maturation sous forme de
cellules TEMh1 ; la génération des cellules TEMRA étant quant à elle indépendante de l’Ag 218.
Il a été démontré qu’in vivo, des macaques dont les lymphocytes T γδ répondeurs à
une première exposition à l’Ag s’avèrent progressivement et sélectivement anergisés par ce
dernier
219,
329
. Aussi le concept de « mémoire
immunologique» ne semble pas
s’accompagner, in vivo chez les lymphocytes Τ γδ, de l’acquisition de caractéristiques
fonctionnelles typiques de la mémoire immunologique telle qu’introduite auparavant dans ce
manucript. Ce schéma de différentiation s’appuie sur différentes études et notamment celle de
Géginat en 2003 qui montre que cette différentiation est relativement apparentée à celle des
lymphocytes conventionnels T αβ CD8 220.
IV-3/ Réactivité des lymphocytes T Vγ9Vδ2
IV-3-1. Les ligands des lymphocytes T γδ
Dès leur première description, les lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains se sont avérés
répondre aux mycobactéries et aux cellules tumorales humaines telles que les lymphomes de
Burkitt 221.
Les premières analyses de l’extrait bactérien issu de Mycobacterium tuberculosis ont
mené à l'identification de 4 fractions distinctes en chromatographie liquide. Ces 4 fractions
étaient pourvues d’activité antigénique correspondant à quatre antigènes distincts. Il s’agit de
phosphoesters structuralement apparentés, appelés TUBag 1-4, (Figure 14).
Micobactérium tuberculosis
Figure 14 : Les premiers PAg identifiés
73
Ces phosphoesters correspondent à des conjugués triphosphates de la thymidine, de
l’uridine et leurs fragments pyrophosphates non-nucléotidiques
196
. Ces quatre composés ont
été retrouvés, quoique à des doses différentes, dans toutes les espèces de mycobactéries 222.
Cependant, ces analyses n’ont pas permis d’expliquer la réactivité croisée des cellules
Vγ9Vδ2 aux cellules tumorales humaines. Il est depuis, devenu clair, qu'un large éventail de
composés phosphatés est produit par des micro-organismes et des cellules de mammifères qui
stimulent sélectivement les cellules T γδ humaines exprimant le TCR Vγ9Vδ2. Ces composés
non peptidiques phosphatés (Figure 15) ont alors été appelés phosphoantigènes (PAg)
O
O
Alkyle
O
P
O
O
-
P
O
OH
-
Figure 15 : Structure générale des Phosphoantigènes
Les PAg naturels tels que l'isopentenyl pyrophosphate (IPP), le diméthylallyl
pyrophosphate (DMAPP)
199
, ou également le 3 formyl-butyl-pyrophosphate
196; 223
et le
pyrophosphate de 4-hydroxy-3-dimethylallyl (HDMAPP) également dénommé (E)-4hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMB-PP) ont été identifiés chez plusieurs
micro-organismes et plantes
224
. Les PAg naturels IPP et DMAPP ont également été détectés
dans diverses cellules cancéreuses humaines
225
, où ils sont produits quoiqu’en très faible
quantité en tant que métabolites. Cela implique que ces organismes partagent des voies de
biosynthèse pour ces métabolites phosphatés, il s’agit des métabolismes menant à des
isoprenoïdes et stérols.
De nombreux agonistes des PAg naturels pour les lymphocytes T γδ humains et
simiens ont été produits par synthèse chimique totale 199, parmi lesquels le plus puissant est à
l’heure actuelle le pyrophosphate de bromohydrine (BrHPP) 226 (Figure 16).
74
Figure 16 : Les différents phosphoantigènes et leur bioactivité pour les cellules T γδ (d’après 227)
75
En outre, des composés non-peptidiques et non-phosphatés tels que les alkylamines
naturelles et synthétiques (Figure 17) et les aminobisphosphonates (ABP) thérapeutiques
(Figure 18) comme le pamidronate ou le zolédronate sont maintenant connus pour induire
quoique de manière indirecte la production des PAg endogènes IPP/DMAPP.
R
NH2
Figure 17 : Formule générale des Alkylamines
Figure 18 : Les aminobisphosphonates thérapeutiques et leurs bioactivités pour les cellules T γδ and FPPS
enzyme IC50 for human FPPS enzyme (μM); EC50 for human γδ cells (μM) (d’après 227).
Les composés isolés à partir des cellules cancéreuses humaines qui stimulent les
cellules T Vγ9Vδ2 ont été récemment identifiés comme les métabolites IPP et DMAPP issus
de la voie de biosynthèse du cholestérol chez les mammifères ou voie du mévalonate (MVA).
Les ABP qui bloquent la voie du MVA après la biosynthèse de l’IPP et du DMAPP ont la
capacité d’activer les cellules T γδ humaines en induisant l'accumulation de l’IPP dans les
cellules traitées, contrairement au PAg qui a une action directe.
76
Ainsi, les inhibiteurs en amont du MVA tels que les statines peuvent abroger
l'activation de cellules T γδ, vraisemblablement par le blocage de la production des
métabolites en aval tels que l’IPP.
IV-3–2. Biosynthèse des PAg : les voies métaboliques MVA et DOXP
La production de molécules pyrophosphatées non peptidiques est assurée par un
métabolisme distinct selon qu’il s’agit de microbes ou de cellules humaines.
Les PAg comprennent -et sont structuralement apparentés à- l’isopentenyl–PP (IPP),
dont la production chez les cellules de mammifères est assurée par la voie de biosynthèse du
cholestérol (dite voie du mévalonate ou MVA, Figure 19). Cette voie métabolique est
étroitement contrôlée chez les cellules humaines saines, mais très exacerbée chez les cellules
cancéreuses. En effet, deux équipes indépendantes ont récemment montré que la dérégulation
de la voie MVA dans les cellules tumorales peut conduire à l’accumulation du PAg IPP et
activer les lymphocytes T Vγ9Vδ2
225
. Ainsi, l’activité tueuse des lymphocytes T γδ
reflèterait, en partie, la voie MVA tumorale, mais on ignore si cela s’applique à toutes les
cellules cancéreuses qu’ils reconnaissent. De plus, la fonction cytolytique varie avec les
individus et l’état de maturation de leurs lymphocytes T . Chez les procaryotes cependant,
cette voie n’existe pas, car une voie alterne dite de «Rohmer » ou du « déoxy-xylulose-5phosphate » produit les mêmes métabolites IPP et DMAPP. Celle-ci ne débute pas par le
métabolisme lipidique de l’acétyl-CoA, mais par un métabolisme glucidique totalement
différent dont l’issue est toutefois identique : la production d’IPP. Ainsi tous les organismes
vivants produisent des isoprénoïdes, métabolites essentiels de leur biologie cellulaire et
intercellulaire, par l’une ou l’autre des deux voies qui se rejoignent à l'isomérisation des deux
métabolites en C5 : l'IPP et le DMAPP.
D'une part, les archaebactéries et la plupart des eucaryotes synthétisent de l’IPP à
partir de l’'acétyl-CoA par la voie du métabolite MVA. Aussi, les statines et les ABP peuvent
s'avérer utiles pour sonder cette voie dans toutes ces cellules.
D'autre part, les cyanobactéries, la plupart des eubactéries, les algues et les plastides
font de l’IPP différemment, par un itinéraire à base d'hydrates de carbone désignés sous le
nom de (1)-déoxy-D-xylulose-5-phosphate (DOXP). La voie de DOXP commence à partir du
77
pyruvate et du D-glyceraldéhyde-3-phosphate, et après plusieurs étapes dont l’une nécessite
l'absence d'oxygène, produit le dérivé hydroxylé du DMAPP, désigné HDMAPP. Cette
molécule est alors métabolisée en DMAPP lequel donne son isomère IPP. Les métazoaires tls
que les algues multicellulaires et les plantes supérieures cumulent donc la voie du MVA dans
leur cytosol et mitochondries, et la voie DOXP dans leurs chloroplastes.
Bien que ces deux itinéraires mènent habituellement à différents produits finaux
d'isoprénoïdes chez les plantes supérieures (caroténoïdes dans les chloroplastes et stérols dans
le cytoplasme), les isoprénoïdes plastidiaux sont formés par la voie DOXP et peuvent
compléter la voie cytosolique de MVA.
Ainsi en surveillant une voie métabolique normale, sa dérégulation ou son
remplacement par un équivalent microbien, les lymphocytes T γδ de primates effectuent un
contrôle à la fois anti-tumoral et anti-infectieux (notion de première ligne de défense) 228.
La large distribution des PAg parmi les cellules eucaryotes et procaryotes
explique probablement l'activation des cellules T Vγ9Vδ2 dans divers contextes
infectieux. Ces caractéristiques pourraientt expliquer l'expansion sélective et postnatale
des cellules Vγ9Vδ2 périphériques. La régulation positive des métabolites de la voie du
MVA dans des cellules transformées pourrait également expliquer la large réactivité
anti-tumorale de cellules Vγ9Vδ2 et leur implication probable dans l'immunosurveillance anti-tumorale.
78
Figure 19: Biosynthèse des PAg. Les voies métaboliques DOXP et MVA de la biosynthèse de cholestérol
impliquent des intermédiaires PAg. L’arbre phylogénétique du vivant est à la base de la distribution des voies
DOXP (boîtes vertes) et MVA (boîtes jaunes) conduisant à la biosynthèse des phosphoantigènes dont les
structures sont figurées en modèles « ball and sticks» colorées selon le type d’atomes.
79
IV-3-3. Mécanismes de reconnaissance des PAg par les cellules T Vγ9Vδ2
La spécificité des effets de la reconnaissance des PAg sur l'activation des cellules
Vγ9Vδ2 ainsi que les caractéristiques structurales de cette bioactivité ont été abordés dans
plusieurs études. Néanmoins, les mécanismes de présentation des PAg aux cellules T Vγ9Vδ2
demeurent encore inconnus.
Par analogie avec les lymphocytes T αβ, il a été suggéré que le TCR était impliqué
dans la reconnaissance de l’Ag. De nombreuses études ont d’ailleurs démontré l’implication
du TCR Vγ9Vδ2 dans la reconnaissance spécifique des PAg :
(i)
L’étude détaillée des gènes des chaînes du TCR exprimé par les lymphocytes T
Vγ9Vδ2 du sang périphérique a montré que les cellules qui utilisent des gènes
uniques V gamma et V delta partagent des caractéristiques jonctionnelles
gamma et delta. Cela suggère l’existence d’une sélection périphérique des
motifs jonctionnels du TCR parmi ces cellules 229.
(ii)
l’utilisation d’anticorps anti-TCR empêchent la prolifération des cellules T γδ
consécutivement à la stimulation par les 4 ligands isolés à partir de la souche
H37Rv de Mycobacterium tuberculosis196.
(iii)
Il a été montré que les cellules T Vγ9Vδ2 prolifèrent en réponse aux cellules
du lymphome de Burkitt Daudi, aux alkyles phosphatés synthétiques incluant
les monoethylphosphates (MEP), et aux phosphoantigènes naturels. La
transfection des cellules Jurkat avec des cDNA codant le TCRVγ9Vδ2 permet
à ces transfectants de produire de l’IL2 en réponse aux cellules Daudi, aux
extraits bactériens, et aux phosphoantigènes 230.
(iv)
La mutation des résidus de lysine dans la région CDR3 de la chaîne TCRγ
abroge complètement la réponse des lymphocytes T γδ à tous les Ags non
peptidiques sans affecter la réponse aux Ac anti-CD3 231.
80
(v)
La modélisation moléculaire et l’analyse QSAR (Quantitative StructureActivity Relationship) réalisée en collaboration avec l’équipe de E. Olfield a
proposé un modèle de pharmacophore de PAg qui serait corrélé à sa bioactivité
sur les lymphocytes T γδ
232
. L’issue des calculs réalisés au moyen de deux
algorithmes différents fut identique suggèrant l’existence d’une conformation
tridimensionnelle commune à tous les PAg, qui permet leur reconnaissance
directe sans présentation (Figure 20).
Figure 20 : Pharmacophore des phosphoantigènes naturels et synthétiques (d’après 232)
Toutefois, cette interaction n’a pas encore été formellement démontrée par la
technique de BIAcore ou par cristallographie aux rayons X.
Cependant en 2001 la cristallographie aux rayons X d’un TCR Vγ9Vδ2 complet a été
réalisée avec une résolution de 3,1 Å
213
. Le cristal a été obtenu à partir du TCR du clone
G115 dérivé du sang d’un donneur sain et répondant aux PAg en termes de cytotoxicité et
sécrétion de cytokines. Bien que sa structure globale plus coudée ressemble néanmoins à celle
d’un TCRαβ ou d’un fragment Fab, la comparaison des parties CDR3 des Ig, et des TCRαβ
avec celles du TCR Vγ9Vδ2 ont montré que le TCR γδ s’apparente plus à une Ig qu’au
TCRαβ. En effet, chaque domaine V est formé de 2 planchers de feuillets β avec 4 feuillets
externes et 5 feuillets internes. Les boucles formant les régions CDR sont au sommet des
domaines V et pointent vers l’extérieur au contraire des TCRαβ. Les portions des CDR1δ,
81
CDR1γ et CDR2γ se combinent avec la brèche entre les boucles CDR3 pour former une poche
qui est vraisemblablement le site de liaison au PAg. Cette “poche” positivement chargée est
formée par l’Arg59 du CDR2γ, la Lys 109 du CDR3γ, et Arg 51 du CDR2δ, qui peuvent
interagir avec la partie pyrophosphate des PAg. Les domaines C sont eux aussi formés de 2
planchers de feuillets β avec 3 feuillets externes et 4 feuillets internes. Le positionnement
relatif des domaines V et C est particulier : la partie C est fortement décalée par rapport à
l’axe de la partie V contrairement au TCR αβ ou au Fab. Ainsi l’angle formé entre les deux
axes des parties V et C est plus petit. Le domaine Cγ présente en outre une différence avec le
domaine Cβ : la boucle FG de Cγ est courte et plaquée contre le cœur de la molécule alors que
celle du Cβ est longue et fait saillie.
Ainsi la structure tridimensionnelle du TCR Vγ9Vδ2 semble apte à fixer des PAg
directement et s’avère globalement similaire à celle d’une IgG très coudée.
Bien que l'activation des cellules Vγ9Vδ2 par les PAg se produise dans les secondes
qui suivent l’exposition à l’Ag, elle exige un contact entre la cellule T γδ et sa cible
antigénique. Ces observations ont plusieurs explications possibles.
•
D’abord, l'activation des Vγ9Vδ2 par le PAg se produirait dans une synapse
immunologique, consécutivement à l’engagement du TCR par le PAg soluble
natif, mais exigeant des signaux additionnels de co-stimulation fournis par la
membrane des cellules cibles. Cette hypothèse n’explique toutefois pas les échecs
de co-cristallisation de TCR/PAg.
•
le PAg pourrait être présenté par une molécule encore non identifiée, mais distincte
des molécules classiques (CMH) ou non-classiques.
•
Enfin, le PAg induirait une modification conformationnelle et/ou une
surexpression d'une molécule/ligand de stress lui-même reconnu par le TCR
Vγ9Vδ2. Dans ce dernier cas, la cinétique extrêmement rapide de l'activation des
cellules Vγ9Vδ2 par les PAg impliquerait que ces changements conformationnels
et/ou surexpressions soient particulièrement brèves et rapides.
Plusieurs protéines candidates ont été proposées pour être les récepteurs de surface
liés, modifiés ou régulés positivement par le PAg. D’abord dans les années 90, les protéines
de choc thermique (HSP) (comme HSP65 et HSP70) ont fait l’objet de plusieurs observations.
82
Ces observations ont successivement suggéré l’implication de HSP70 dans la
reconnaissance de cellules tumorales par les lymphocytes Vγ9Vδ2 et une corrélation entre la
surexpression de HSP sur des cellules tumorales et l’infiltration / activation des γδ
233, 234
.
Mais les études ultérieures ont démontré que l'activation directe des cellules Vγ9Vδ2 ne
relève pas d’une reconnaissance de molécules de type HSP (HSP65 ou HSP70)235.
Plus récemment, une autre molécule membranaire a été identifiée sur des cellules
tumorales et pourrait probablement expliquer la reconnaissance des tumeurs par les
lymphocytes T Vγ9Vδ2
236
. Ce récepteur correspond à un complexe constitué par
l'apolipoprotein A1 (ApoA1), une lipoprotéine à haute densité abondante dans le sérum, et la
sous unité F1 de l’ATPase synthase (ATPS), une enzyme multimérique mitochondriale.
Lorsqu’il est transloqué à la surface des cellules tumorales ce complexe a été identifié comme
étant une cible des cellules Vγ9Vδ2. Ces conclusions découlent des propriétés d’un anticorps
monoclonal neutralisant de l’activation γδ, et qui s’est avéré dirigé contre ce complexe et
capable d’empêcher la reconnaissance d'une variété de cellules tumorales par les lymphocytes
Vγ9Vδ2 in vitro. L’implication de l’ATPS dans l'activation sélective des cellules Vγ9Vδ2 a
été plus directement documentée dans des systèmes acellulaires, en utilisant des billes
recouvertes d’AS purifié (d’origine bovine) et d’ApoA1. La reconnaissance de l’ATPS par les
cellules Vγ9Vδ2 pourrait expliquer leur large activité anti-tumorale, puisque la sous-unité F1
de l’ATPS semble être exprimée à la surface cellulaire de plusieurs lignées de tumeurs
hématopoïétiques et solides. Cependant, plusieurs questions importantes demeurent ouvertes.
En particulier, bien que dans certaines conditions, la protéine ApoA1 humaine potentialiserait
la lyse in vitro de cellules tumorales par les lymphocytes T Vγ9Vδ2, des billes recouvertes
d’ATPS purifiée de source bovine peuvent également activer les lymphocytes T Vγ9Vδ2 à
sécréter de faibles quantités du TNFα236. Aussi, tant la nature exacte du complexe ATPS
reconnu in vivo que les modalités de participation d'ApoA1 à un tel complexe, demeurent
encore à préciser.
Comme déjà mentionné, l'activation des cellules de T Vγ9Vδ2 par les ABP peut se
produire sous l’effet de l'accumulation des intermédiaires d'isoprénoïdes tel que l’IPP, qui
agissent alors en tant qu'agonistes directs du TCR Vγ9Vδ2, tels que les PAg bactériens. Alors
que l’IPP peut activer des cellules Vγ9Vδ2 isolées, l'activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 du
sang périphérique par les ABP requiert les cellules monocytaires237. En effet, l’étude de
83
Miyagawa a montré en 2001 que la lignée myélomonocytaire THP1, devient capable d’activer
des cellules T γδ purifiés (production d’IFNγ) lorsqu’elle est traitée au pamidronate. Ces
cellules sont alors significativement plus susceptibles à la lyse médiée par les lymphocytes T
γδ que les cellules THP1 non-traitées. Enfin, les cellules T Jurkat (TCR-) transfectées avec les
gènes du TCRγδ produisent des niveaux significatifs d’IL2 en réponse aux cellules THP1
traitées au pamidronate. Ces résultats ont fortement suggéré que les cellules T γδ sont
fonctionnellement activées via le TCRγδ par les Ag d’ABP présentés à la surface des cellules
monocytaires plutôt que directement dans leur forme native.
En 2007, Uchida a cherché à évaluer le mécanisme de reconnaissance des cellules de
myélomes par les LTγδ. Le prétraitement des cellules de myélome avec un ABP (l’acide
zolédronique) ou une statine (la mévastatine) montre que les LTγδ tuent ces dernières
consécutivement à la reconnaissance de métabolites de la voie du MVA. Dans cette étude les
auteurs ont notamment montré que le niveau d’expression de la molécule d’adhésion
intercellulaire ICAM-1 sur les cellules de myélome était corrélé à la cytotoxicité des
lymphocytes Tγδ. En outre, le prétraitement des cellules de myélome avec une Ig anti-ICAM1 inhibe leur cytotoxicité. Enfin, les cellules AMO-1, une lignée de myélome normalement
résistantes à la lyse par les lymphocytes Tγδ, y deviennent sensibles après avoir été
transfectées par un ADNc humain codant pour ICAM-1 238.
Bien que beaucoup reste à faire afin de comprendre entièrement les mécanismes de
reconnaissance par les cellules T Vγ9Vδ2, la disponibilité de plusieurs agonistes spécifiques a
conduit à proposer et tester des approches thérapeutiques ciblant ces lymphocytes pour le
traitement de pathologies cancéreuses, infectieuses et / ou auto-immunes.
IV-4. Interaction cellules T γδ cytotoxiques - cellule cible
IV-4-1. Chimiotaxie et diapédèse des lymphocytes T γδ
Les lymphocytes T γδ périphériques expriment la molécule NKRP1A (Natural-killercell Receptor Protein 1A) ou CD161 239, glycoprotéine membranaire de type II habituellement
exprimée par les cellules NK et fonctionnant comme une molécule d’adhésion. Cette C-
84
lectine est impliquée dans le franchissement de la paroi des capillaires, la diapédèse, en
l’absence de signal chimiotactique ou par les cellules T Vγ9Vδ2 lors d’un stress
inflammatoire.
Comme pour les lymphocytes T CD4+ 240, l’IL12 produite lors d’une inflammation par
les DC et les macrophages augmente l’expression de la protéine CD161 à la surface des
cellules T Vγ9Vδ2
infecté
241
239
, favorisant ainsi leur migration trans-endothéliale au niveau du site
. Concernant le profil d’expression des récepteurs aux chimiokines, la plupart des
lymphocytes T γδ circulants présentent un profil d’expression de type Th1, tel que
l’expression majoritaire de CCR1, CCR5, CXCR3 242, 243. En effet, les cellules T γδ expriment
un niveau particulièrement élevés du récepteur inflammatoire CCR5 qui reconnaît RANTES
et macrophage protein-1alpha/-1beta (MIP-1α et MIP-1β), et des niveaux également élevés de
CCR1 et CXCR3
242, 243
. Par ailleurs, CXCR5
215
est exprimé par une sous-population
distincte de cellules Tγδ mémoire centrale, cette population présentant des fonctions de type
Th2-like c'est-à-dire auxiliaires de la production d'anticorps par les cellules B.
IV-4-2. Formation d’une synapse immunologique
Consécutivement à la reconnaissance cellulaire des ligands par les récepteurs T et
NKR (activateurs ou inhibiteurs), les lymphocytes T γδ, établissent comme les cellules NK,
un contact étroit avec leurs cibles qui est désigné par « synapse immunologique » (§ II-2-2-b).
Cette zone d’apposition membranaire entre les deux cellules permet de moduler l’intensité du
signal activateur qui, par l’intégration des signaux délivrés entre les deux cellules, se traduit
par la modulation de la réponse effectrice de la cellule T
150
. En effet, quoique indépendante
du CMH, la reconnaissance de PAg microbiens ou tumoraux par le TCR Vγ9Vδ2 nécessite
néanmoins un contact cellulaire par la synapse immunologique T γδ pour induire une réponse
proliférative, tueuse, et productrice de cytokines de type Th1 198.
"La raison d'être" de la synapse immunologique est de favoriser l'intégration des
signaux provenant de l'engagement progressif des TCR présents à la surface de la cellule T
244
, avec ceux émanant des molécules accessoires (protéines d’adhésion, corécepteur et
molécules de costimulation) 245, 246.
85
Comme pour les lymphocytes T αβ, l’interaction des cellules T γδ avec leur cellule
cible est associée à une coalescence des TCRs dans la partie centrale de la synapse. Le
récepteur CD2 ainsi que le module de signalisation CD3 247 sont recrutés en même temps que
le TCR à la synapse. Les molécules de signalisation telles que p56lck 248, 249, fyn, zap70
impliquées dans l'activation des cellules T, accompagnent ce recrutement
28, 251-254
250
. Les
intégrines et leurs molécules associées, telles CD43 et CD45, sont principalement repoussées
à la périphérie de cette interface
28, 252, 255, 256
. L'exclusion des molécules capables de délivrer
un signal inhibiteur pourrait augmenter le signal induit par le TCR et ainsi favoriser
l'activation des cellules T
257
. En outre, les récepteurs « innés » tels que NKG2D et
CD94/NKG2A-C sont également co-recrutés à la synapse avec le TCR
258
et servent de co-
activateurs pour la réponse à l‘Ag des lymphocytes T γδ 259.
Il a été montré que la formation de la synapse immunologique des cellules T Vγ9Vδ2,
n’est pas couplée avec ses fonctions. En effet, la conjugaison des cellules T γδ avec les
cellules cibles augmente après stimulation par le PAg soluble, est parallèle à l'activation
métabolique des cellules T γδ et mène à la production de cytokines. Mais en l'absence
d’addition de PAg exogène, alors que la ségrégation moléculaire des molécules
précédemment citées se produit également à l'interface des cellules T avec leur cible, elle ne
provoque ni la mise en place d’une signalisation intracellulaire, ni la production des cytokines
(IFNγ et TNFα) dans ces conditions. Ainsi, si la reconnaissance de l’Ag par la cellule T
Vγ9Vδ2 est suffisante pour induire la formation de la synapse immunologique, la production
de cytokines exige le plein enclenchement du TCR par le PAg et donc la formation d’une
synapse immunologique stable
258
. Contrairement à la production cytokinique, chez les
lymphocytes T γδ cependant, la fonction lytique des lymphocytes T αβ cytotoxiques est
toutefois activable sans formation de la synapse immunologique mature 262.
Plus récemment, grâce à une l'étude de la dynamique moléculaire au site de contact
entre une cellule T et de multiples CPA en co-culture, il a été montré que la cellule T peut
traiter et discriminer les signaux provenant de multiples synapses simultanées. Elle peut, en
effet, discriminer les intensités provenant de ces différentes synapses, re-localiser rapidement
leur TCR et leur appareil de Golgi vers la synapse délivrant le stimulus le plus fort. Ces
résultats montrent que bien que l'activation des cellules T exige une signalisation soutenue, les
cellules T peuvent rapidement remodeler leur synapse et y polariser leurs réponses effectrices.
86
Ainsi, la combinaison d'une signalisation soutenue associée à la capacité de rapides repolarisations constitue un mécanisme permettant la sensibilité et la haute sélectivité des
réponses des cellules T
263
.
IV-4-3. Transferts membranaires intercellulaires : la trogocytose
La synapse immunologique des lymphocytes T cytolytiques permet la reconnaissance
des cellules cibles et la sécrétion orientée des granules lytiques. Cependant durant ce contact,
la synapse immunologique est également le siège de captures de morceaux de membrane de la
cellule cible par la cellule effectrice. Il s'agit d'un processus de transfert synaptique
264-266
par
lequel les lymphocytes acquièrent activement des fragments de membranes provenant des
cellules auxquelles ils sont attachés de pour les incorporer à leur propre membrane. Ce
processus de transfert synaptique est phénomène actif, unidirectionnel, qui intervient
rapidement (maximum atteint en quelques minutes). Au cours de ce processus, les
lymphocytes peuvent acquérir des marqueurs présents sur d'autres cellules en quantités
pouvant dépasser 1% des niveaux trouvés sur les cellules donneuses. Ce processus de tranfert
synaptique désigné sous le nom de « trogocytose » (du grec « trogos » : pour grignoter)
initialement été décrit chez les lymphocytes B et T cytotoxiques CD8
268, 269
les autres types de lymphocytes (T CD4, T γδ, B, NK) (pour revues voir :
267
a
, puis chez tous
266, 270-274
). Notre
équipe a montré que la capacité à « trogocyter » diverses cellules cancéreuses des
lymphocytes T γδ et des cellules NK reflète leur activation et corrèle avec leurs fonction
lytiques 272, 274.
IV-4-3a. Mécanisme de trogocytose
Le mécanisme de capture de membrane n'est pas déterminé. Cependant, plusieurs
hypothèses ont été avancées : des fragments de membrane pourraient être arrachés des
cellules cibles au moment de la dissociation des conjugués
275
, ce qui impliquerait que ce
transfert soit un événement post-synaptique. Alternativement, ce mécanisme pourrait
impliquer la perte d’exosomes par les CPA et leur re-capture par les lymphocytes conjugués
276-278
, mais le modèle en accord avec le plus de données propose que ce transfert se produit
directement par un glissement membranaire unidirectionnel à travers la synapse
immunologique (Figure 21).
87
Figure 21 : Modèle mécanistique de la trogocytose (d’après271)
En effet, la réciprocité des transferts entre NK et les cellules cibles 279 implique que la
trogocytose se produise tandis que des cellules sont liées. De plus, les synapses
immunologiques formées entre CTL conventionnels et leurs cibles présentent des ponts
membranaires et des microdomaines de fusion membranaire
280
. Ces structures pourraient
permettre les transferts synaptiques par diffusion latérale le long de la membrane. Enfin, des
inhibiteurs de l'activation lymphocytaire (tels que PP2 qui inhibe l’activité kinase de la
famille Src et la rottlerine qui inhibe les PKC) ou du cytosquelette (tels que la cytochalasine
D, la latrunculine, la colchicine) peuvent également bloquer la trogocytose, liant ce processus
à l'activation des cellules associées 264, 266, 268, 269, 272, 274.
IV-4-3b. Conséquences fonctionnelles de la trogocytose
Parallèlement à l’étude du mécanisme moléculaire du transfert intercellulaire, il est
nécessaire d’en établir les conséquences fonctionnelles. En effet, ce type de transfert de
marqueurs de surface cellulaire est potentiellement réalisé par une large gamme de types
cellulaires. Il pourrait donc présenter une grande diversité de conséquences fonctionnelles.
88
Plusieurs études montrent que ce phénomène peut avoir une influence importante sur le cours
de la réponse immunitaire (pour revue voir 281).
En effet, le transfert intercellulaire de protéines de surface peut initier des réponses
imunitaires notamment par l’intermédiaire des cellules B qui consécutivement à
l’internalisation d’Ag de membrane deviennent capables de les présenter aux cellules T
268
.
De la même façon les cellules dendritiques peuvent acquérir des complexes CMH-peptides
consécutivement à une interaction avec des cellules tumorales telles que les cellules de
mélanomes et les présenter aux cellules T 282.
Par ailleurs consécutivement à l’interaction avec des APC, l’acquisition par les
cellules T CD4+ de molécules de co-stimulation CD80 et de protéine CMH de classe II leur
permet de soutenir l’amplification in vivo des cellules T après transfert adoptif
283, 284
.
Eventuellement la présentation de complexes CMH-peptides capturés entre cellules T CD4+
activées peut au contraire entrainer l’apoptose ou l’induction des cellules T régulatrices voire
anergiques
285
. Ainsi la capture de complexes CMH-peptide par les cellules T permet de
réguler la réponse immunitaire
286, 287
. Ces dernières possibilités considèrent le transfert
intercellulaire de l’APC vers la cellule T, cependant le transfert dans le sens inverse (des
cellules T vers les APC) peut également moduler la réponse immunitaire. En effet les CPA
peuvent aquérir un phénotype tolérogène consécutivement à l’intéraction avec des cellules T
anergiques ou régulatrices
288
. Outre les cellules T, ce transfert intercellulaire peut également
réguler les réponses des cellules NK. En effet, le contact entre les cellules NK et des cellules
cibles qui expriment MICB, le ligand de NKG2D, conduit à l’échange intercellulaire de
NKG2D et MICB, échange qui corrèle avec la diminution de la cytotoxicité des cellules NK
289
.
Plutôt que de permettre de soutenir l’amplification des cellules T, le transfert
intercellulaire peut, à l’inverse limiter l’expansion clonale ou abroger les réponses des cellules
T. En effet, consécutivement à la capture membranaire de complexes peptide-CMH de classe
I d’APC, les CTL peuvent devenir susceptibles à la lyse fratricide
264
. De plus, les ligands
activateurs transférés sur les cellules effectrices pourraient déclencher la downrégulation et /
ou l'internalisation des récepteurs des cellules effectrices voisines 264.
89
Une autre conséquence de ce transfert intercellulaire est l’aquisition d’un
comportement cellulaire aberrant. En effet, l’acquisition de récepteurs viraux entraine des
infections virales atypiques. Par exemple, le transfert sur les cellules NK du recepteur pour le
virus Epsein-Barr (EBV) peut faciliter l’infection des cellules NK par l’EBV 290. Le transfert
intercellulaire du récepteur de chemokine CCR5 sur des cellules CCR5 négatives pourrait
événtuellement aussi contribuer à rendre ces dernières susceptibles à l’infection par le HIV in
vitro 291.
Le transfert intercellulaire de protéines a également été mis en cause dans
l’angiogénèse. En effet les cellules T activées peuvent acquérir des déterminant de surface des
cellules endothéliales durant la migration transendothéliale
292
. Grâce au transfert de la
neurophiline 1, les DC conférer aux cellules T CD4+ un phénotype VEGFR+ (pour recepteur
du vascular endothelial growth factor) 293.
Enfin certaines cellules cancéreuses telles les lymphomes B Daudi effectuent
spontanément ce processus de transfert intercellulaire de manière homotypique sous l’effet de
leur statut constitutivement activé
294
. Ce processus est certainement à l’origine du transfert
homotypique de la protéine PgP, qui permet l’acquisition d’un chémorésistance des cellules
malignes295.
IV-4-4. Production de cytokines
L’exposition à différents pathogènes peut stimuler au moins deux schémas de
production de cytokines par les cellules T CD4+. Grâce à l’analyse de la production d’IFNγ et
d’IL4 par les cellules T de souris infectées par Listeria monocytogénes ou Nippostrongylus
brasiliensis, l’équipe de D. Ferrick a montré en 1995 que les lymphocytes T γδ de souris sont
capables de discriminer le début de l’infection par ces deux pathogènes en produisant les
cytokines associées à la réponse T auxiliaire
296
. En 2001, l’équipe de D. Kabelitz a montré
qu’il en était de même pour les cellules T γδ humaines. En effet la majorité d’entre elles
peuvent être orientées en cellules productrices de cytokines Th1 ou Th2 selon
l’environnement cytokinique dans lequel se fait la rencontre avec les PAg. Ainsi, en réponse à
une stimulation par un PAg, les LT γδ humains augmentent très rapidement leur production
intracellulaire d’IFNγ et de TNFα
297
(profil Th1), ou de d’IL4 et d’IL5 215, 298 (profil Th2) .
90
De plus, il a été montré que des souris déficientes en IFNγ sont beaucoup plus
sensibles que les souris normales au développement tumoral induit par des carcinogènes ou
par inoculation de cellules de mélanome B16
299
. Ces résultats démontrent que les cellules T
γδ peuvent jouer un rôle nécessaire dans l'immunité anti-tumorale en fournissant une première
source d'IFNγ pouvant réguler les cellules T αβ.
L’IL-15 augmente de manière significative l'expansion des cellules T γδ dans le sang
périphérique après stimulation in vitro par les phosphoantigènes. De plus, l’utilisation de
clones lymphocytaires T γδ a permis de démontrer que la prolifération des cellules T induite
par l’IL15 dépendait de la chaîne bêta d'IL-2R mais pas de la chaîne alpha d'IL-2R
300
. En
effet, la chaîne alpha de l'IL-15R est exprimée par les cellules T γδ humaines activées, mais
pas celles au repos. Bien que l'IL-15 seule ait peu d'effet sur la production d’IFNγ des cellules
T γδ, elle synergise l’IL-12 pour cette activité, notamment par l'activation concomitante de
STAT1 et STAT4
300
. Ces cytokines entrent aussi en synergie avec l’IL2, pour induire plus
généralement des réponses cytokiniques de type Th1 par les lymphocytes T γδ 300.
IV-4-5. Cytotoxicité
Le potentiel cytolytique anti-tumoral des lymphocytes T γδ activés a été démontré in
vitro vis-à-vis de très nombreux types de cellules cancéreuses
221
. Ce potentiel cytolytique a
également été démontré in vivo dans divers modèles murins immunodéficients xénogreffés 301
ainsi qu’ex vivo à partir de cellules de patients atteints de carcinome rénal 302,303 ou à partir de
cellules de patients atteints de myélome multiple 304.
Les lymphocytes T γδ sont capables d’induire la mort de leurs cellules cibles grâce à
au moins trois principaux mécanismes de mort : la sécrétion polarisée de granules lytiques, la
voie impliquant l’interaction du récepteur Fas (CD95) avec son ligand Fas-L (CD95L), et le
récepteur TRAIL.
En effet, les lymphocytes T γδ expriment les granzymes A, B et M, la granulysine et la
perforine, composants des granules lytiques
305
. L’expression de ces molécules est corrélée
avec leurs stades de différenciation. Ainsi, elle augmente avec les effecteurs tardifs TEMRA et
est absente des cellules TN et TCM214. Ainsi, les lymphocytes T γδ activés vont se différencier
91
en effecteurs T et ainsi participer à la destruction de la cible par dégranulation de leurs
composants lytiques 218.
D’autre part, les lymphocytes T γδ activés expriment la molécule Fas-L qui leur
permet d’induire l’apoptose de leurs cibles exprimant le récepteur Fas. Parallèlement
l’expression de Fas est augmentée à leur surface, les rendant sensibles à l’apoptose par
interaction autocrine (AICD pour Activation-Induced Cell Death). Ce mécanisme autolytique
est impliqué dans la régulation homéostatique du compartiment T γδ et dans certaines
pathologies comme la tuberculose pulmonaire 306.
IV-4-6. Contrôle de l’activation : rôle des NKR
A l’instar des cellules NK (Cf § II-2-3-b), on trouve aussi très fréquemment des
récepteurs de type NKR à la surface des lymphocytes T Vγ9Vδ2, surtout consécutivement à
un épisode inflammatoire. Habituellement, autour de 50% des cellules T γδ sanguines sont
NKR+ chez l’adulte sain, et cette proportion augmente pendant et après une infection. Ces
récepteurs discriminent vraisemblablement les cellules normales des cellules « stressées ».
Les récepteurs NKR exprimés par les cellules T γδ sanguines sont de type C-lectine ou
de type Ig-SF, notamment l’hétérodimère CD94/NKG2A-C (formes activatrices et inhibitrices)
et l’homodimère NKG2D (forme co-activatrice courte) sur la majorité de ces cellules. Une ou
plusieurs protéines récepteurs de molécules MHC I : CD185x sont souvent exprimées par les
lymphocytes T γδ humains, chez lesquels elles exercent un contrôle inhibiteur de l’activation
cellulaire. En effet, ces NKR inhibiteurs (iNKR) modulent négativement la cytotoxicité des
CTL Vγ9Vδ2 vis-à-vis des cellules cibles exprimant des niveaux élevés de molécules de
CMH classiques et / ou non classiques 307.
Les iNKR peuvent également assurer la tolérance chez un individu. En effet, ces
molécules peuvent réguler négativement la reconnaissance de cellules saines activées par des
CTL Vγ9Vδ2, pour deux raisons. D’une part un signal positif fort provient de la large
distribution cellulaire d’agonistes du TCR Vγ9Vδ2 tels que les phosphoantigènes, régulés
positivement par la plupart des cellules activées ou transformées. D’autre part la modulation
négative fréquente de l'expression du CMH-I sur ces dernières, lève un éventuel signal
92
inhibiteur. En conséquence, le masquage des allèles HLA-I autologues sur des cellules cibles
ou de l’heterodimère NKG2A/CD94 sur les cellules effectrices augmente la lyse par les
cellules T Vγ9Vδ2 activées 307, 308, 309 , 310.
Ainsi, TCR et NKR agissent de manière coordonnée pour diriger les réponses des
cellules T Vγ9Vδ2 contre les cellules soumises à un stress, infectées et / ou transformées.
Chacune de ces interactions récepteur / ligand peut déclencher des fonctions effectrices des
cellules T Vγ9Vδ2 in vitro. Il reste à déterminer comment ces cellules T Vγ9Vδ2 intègrent les
signaux activateurs et inhibiteurs fournis par TCR et NKR in vivo et comment manipuler ces
processus pour exploiter cette population cellulaire à des fins anti-tumorales.
IV-5. Cellules T γδ et surveillance anti-tumorale
L’implication des lymphocytes T Vγ9Vδ2 en immuno-surveillance des tumeurs est
appuyée à la fois par de nombreuses observations tant in vivo qu’in vitro. Ainsi par exemple
en 1991, l’étude de Ensslin et Formby
311
ou celle de Boismenu et Havran en 1998
312
illustrèrent le rôle des lymphocytes T γδ dans la surveillance anti-tumorale.
Ces études ont montré que les lymphocytes T γδ activés d’individus sains présentent in
vitro une activité cytotoxique contre les cellules transformées plus importante que celle des
lymphocytes T αβ, et cela sans exposition préalable à une tumeur. De nombreuses
expériences in vitro ont aussi illustré cette importante activité cytotoxique, faisant notamment
état du potentiel lytique des lymphocytes T γδ résidents (cellules T Vδ1) et circulants (cellules
T Vγ9Vδ2) contre des cellules malignes. Les cellules malignes ciblées par les lymphocytes T
gamma delta sont extremement diverses, comprenant des carcinomes épithéliaux, de sein
neuroblastome
314
, rein
303
, côlon
315
, prostate
316
313
,
et également des cellules hématopoïétiques
telles que leucémies, lymphomes 317 et myélomes 202.
De plus, plusieurs études ont également montré la présence de lymphocytes T γδ au
niveau du site tumoral, dans plusieurs modèles tumoraux tels que par exemple, (liste non
exhaustive) des carcinomes du poumon 318, du rein 302,319, de la thyroïde 320, des ovaires 321 et
dans plusieurs types de lymphomes B
322
. Les cellules T Vγ9Vδ2 du sang périphérique
s’avèrent fréquemment amplifiables chez ces patients.
93
Comme la plupart des cellules T Vγ9Vδ2 circulantes chez l’adulte sont pré-activées,
de phénotype mémoire et expriment des récepteurs aux chémokines inflammatoires
243
, ils
semblent rapidement recrutables aux sites inflammés au cours de l’oncogenèse. En cela, les
lymphocytes T Vγ9Vδ2 peuvent contribuer au stade précoce de la protection immune à
travers au moins 3 mécanismes possibles :
•
En raison de leur forte activité lytique et de leur capacité à libérer des cytokines et
des composés pro-inflammatoires, les cellules T Vγ9Vδ2 peuvent directement
médier l’élimination des cellules tumorales.
•
Les cellules T Vγ9Vδ2 peuvent également contribuer à l’activation des cellules
dendritiques immatures (iDC) et donc initier les réponses conventionnelles Th1.
Comme pour les autres lymphocytes “innés”, l’activation des iDC médiée par les
cellules T Vγ9Vδ2 se fait en deux étapes. La première étape correspond à une surexpression des récepteurs de costimulation et des molécules de CMH I et II. Elle
est induite après engagement de CD40L et exposition au TNFα produit par les
cellules T Vγ9Vδ2 activées. La deuxième étape correspond à la production d’IL12
stimulée par une boucle de rétrocontrôle positif 323. Les cellules T Vγ9Vδ2 peuvent
aussi activer les iDC à travers l’engagement de Fas
324
. En effet après stimulation
au PAg, les lymphocytes T Vγ9Vδ2 présentent une forte sur-expression à la fois
des mRNA de FasL et CD40 L 325.
•
Enfin, les cellules T Vγ9Vδ2 semblent impliquées dans la stimulation des cellules
T naïves, à travers leur capacité à se comporter comme des CPA professionnels.
En effet, une étude récente suggère qu’après une stimulation antigénique de court
terme en présence de lymphocytes B, les cellules T Vγ9Vδ2 acquièrent divers
traits phénotypiques et fonctionnels des CPA, tels que l’expression de CD40 et des
molécules de costimulation326. Ces observations assez paradoxales n’ont cependant
jamais été confirmées depuis leur parution.
En montrant une forte susceptibilité à la carcinogenèse cutanée des souris déficientes
en cellules T γδ
327
plusieurs équipes ont démontré le role de ces dernières au cours des
premières étapes de la protection antitumorale. Cependant les modèles les plus adaptés à
l’étude pré-clinique des lymphocytes T γδ en immunothérapie sont les modèles murins SCID
xénogreffés, reconstitués avec des PBL humains ou avec des cellules T Vγ9Vδ2. Grâce à ces
modèles murins SCID xénogreffés avec des tumeurs humaines du nasopharynx
94
314
, de
mélanome et d’adénocarcinome pancréatique 328, le potentiel anti-tumoral des lymphocytes T
γδ humains a également été démontré in vivo. Dans un modèle SCID/HuPBL, l’activation
directe par un phosphoantigène et l’IL2 conduit à une infiltration massive des cellules T
Vγ9Vδ2 in vivo dans les tumeurs rénales transplantées, suivi d’une élimination efficace de la
tumeur. Cela indique que les récepteurs de « homing » de tumeur peuvent être induits sur les
cellules T Vγ9Vδ2 après stimulation in vivo.
La réactivité anti-tumorale des lymphocytes T Vγ9Vδ2 est corrélée à la fréquente surexpression de plusieurs molécules de surface sur les cellules tumorale. En effet, les cellules T
Vγ9Vδ2 reconnaissent à la surface des cellules néoplasiques, en plus des divers ligands du
TCR, des ligands du récepteur co-stimulant NKG2D. Ces ligands sont des molécules du soi
induites en condition de stress ou de processus malins telles que MICA/B (MHC class Irelated genes A et B), les ULBP1-4 (U16 ligand binding protein 1,2,3 and 4), la molécule
apparentée au CMH de classe I, le CD1 associée à la β2-microglobuline et les molécules
d’HLA non classiques 329. Par ailleurs, la protéine MICA induit l’amplification des cellules T
γδ Vδ1 positives à partir de tissu tumoral in vitro. Ces cellules T γδ Vδ1 montrent une
importante activité cytolytique face aux lignées tumorales exprimant MIC-A. Ainsi, les
cellules T γδ réactives à la protéine MIC-A peuvent être en théorie des candidates pour des
thérapies cellulaires adoptives chez les patients atteints de tumeurs exprimant MICA
330
.
Cependant en pratique ces tumeurs sécrètent du MIC-A soluble, et inhibent cette interaction
331
.
Comme cité précédemment (Cf § III-3-3), un complexe formé de l’Apo-A1 connue
pour son rôle dans le transport des lipides dans le sang, associée à la sous unité F1 de l’ATPsynthase, serait potentiellement reconnue par les lymphocytes circulants T Vγ9Vδ2
236
. Bien
qu’à l’heure actuelle on ignore les fonctions de ce complexe, on sait maintenant que les
lymphocytes T γδ se fixent d'abord à l'ATP-synthase. Amenée par le sang, l’Apo A1 viendrait
renforcer cette liaison. Ce mécanisme pourrait déboucher sur de nouveaux médicaments
anticancéreux.
95
IV-6. Lymphocytes T γδ et immunothérapie
En 2003, une étude menée par l’équipe de Provinciali sur 23 patients atteints de
mélanome cutané primaire et 28 sujets sains démontrait que le nombre absolu et le
pourcentage de cellules T γδ circulants étaient significativement réduits chez les patients
atteints de mélanome par rapport aux sujets sains. Cette diminution concernait spécifiquement
les cellules T Vδ2, car le nombre de cellules T Vδ1 demeurait inchangé. De plus, les patients
atteints de mélanome présentent un faible pourcentage de cellules T γδ produisant du TNFα
ou de l’IFNγ. Ainsi, un déficit à la fois quantitatif et qualitatif des cellules T γδ contribuerait à
une déficience de la protection immunitaire des patients atteints de mélanome. Ces
observations pourraient justifier la mise en oeuvre de nouvelles approches d’immunothérapie
des mélanomes notamment par le ciblage des lymphocytes T γδ 332.
Le statut des cellules T γδ de patients porteurs de carcinome nasopharyngiens (CNP) a
été comparé à celui de donneurs sains et à celui de sujets CNP après rémission clinique. Il a
été trouvé que les cellules T γδ de patients sont déficientes dans leur réponse à la stimulation
par la lignée de myélome XG-7 connue pour activer la prolifération des lymphocytes T
Vγ9Vδ2
333
. De plus les cellules T γδ de ces mêmes patients présentent une absence de
cytotoxicité envers les cibles CNP. Cependant, la prolifération et la cytotoxicité des
lymphocytes T γδ envers les cibles CNP, absente dans les stades précoces et avancés du
cancer, sont restaurées chez les sujets après traitement 334. Ces données indiquent un rôle des
cellules T γδ périphériques dans la protection immunitaire contre le mélanome et le cancer du
nasopharynx. Ceci explique l’intérêt grandissant pour l’amplification et l’activation de cette
population T γδ.
ª Deux
stratégies peuvent être envisagées pour l’activité anti-tumorale des
lymphocytes T γδ :
(i)
l’administration in vivo de composés activateurs de lymphocytes T γδ,
(ii)
l’amplification ex vivo de lymphocytes T γδ par les composés activateurs
suivie de leur transfert autologue chez le patient.
96
Comme précédemment décrit (Cf § III-3-1), deux types d’agonistes structuraux de
composés activateurs des lymphocytes T Vγ9Vδ2 ont été découverts : les PAg naturels tels
que l’HDMAPP ou l’IPP qui agissent directement sur le TCR Vγ9Vδ2.
Les lymphocytes T Vγ9Vδ2 peuvent aussi être activés par des molécules synthétiques
telles que la bromohydrine pyrophosphate (BrHPP), un agoniste de type PAg, dont le
mécanisme d’action est identique à celui des PAg naturels
226
et les ABP, lesquels induisent
plutôt l’accumulation de PAg endogènes (IPP, DMAPP) et activent donc indirectement les
cellules T Vγ9Vδ2335. Le BrHPP (PhosphostimTM) est actuellement développé sous le terme
IPH1101 en oncologie (essais cliniques de phase I et II) par la compagnie pharmaceutique
Innate Pharma, (Marseille) pour l'activation sélective des cellules T Vγ9Vδ2 dans le
traitement de lymphomes et de tumeurs solides.
IV-6-1. Approches impliquant l’administration de PAg synthétiques
Il a été démontré dans un modèle de primate non-humain que les cellules T Vγ9Vδ2
peuvent être manipulées in vivo avec du PhosphostimTM. L’injection au Macaque fascicularis
de BrHPP conduit à une activation dose–dépendante des cellules T Vγ9Vδ2, qui sécrètent de
grandes quantités de cytokines de type Th1. De plus, la combinaison du BrHPP avec de
faibles dose d’IL2 recombinante humaine induit une amplification spécifique des cellules T
Vγ9Vδ2 effecteurs mémoires dans le sang périphérique. Cette réponse proliférative est
transitoire, car le taux de ces lymphocytes retourne à son niveau basal en 10 à 15 jours.
Cependant, l'injection répétée de BrHPP et d’IL2 recombinante humaine induit des réponses
similaires mais de moins forte ampleur, suggérant leur épuisement progressif 336.
Ces observations tranchent avec celles obtenues en 2002 par l’équipe de Z.W. Chen201.
Ce dernier déduit que les lymphocytes T Vγ9Vδ2+ de macaques « vaccinés » par le BCG
développent une mémoire immunitaire. En effet, ces lymphocytes T Vγ9Vδ2+ circulant
montrent une réponse à la fois plus intense et plus longue consécutivement à la réinfection
avec le BCG qu’à la première infection.
La diférence entre ces deux études peut s’expliquer par le fait que dans l’étude le ZW
Chen, PAg n’est pas pur, on peut donc penser qu’il présente des conditions adjuvantes
97
nécessaires à l’établissement d’une mémoire immunologique. Par ailleurs, l’infection par le
BCG, qui est vivant, pourrait ne pas constituer une « vacination » mais plutôt une
« infection ».
IV-6-2. Approches impliquant l’administration d’aminobisphosphonates
Parallèlement, d’autres études ont montré que des thérapies pharmacologiques avec les
aminobisphosphonates (zoledronate, pamidronate) peuvent être utilisées avec l’IL2 pour
induire l’amplification in vivo et l’activité anti-tumorale des lymphocytes T Vγ9Vδ2 304.
L’amplification et l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2 périphériques chez des
patients présentant des cancers métastatiques d’origines variées ont été obtenus par
administration d’acide zoledronique et d’IL2 337. Trois patients sur cinq porteurs de myélomes
multiples ou de lymphomes non-Hodgkinien (NHL) de bas grade ont montré une réduction
tumorale significative associée à une augmentation du nombre de cellules T γδ circulantes
sous traitement par le Pamidronate et l’IL2202. De plus, les cytokines Th1 produites par les
lymphocytes T Vγ9Vδ2 étaient augmentées après une seule injection de pamidronate.
Plus récemment, un essai clinique de phase I sur le cancer de la prostate métastasé a
également fait état de cette amplification des lymphocytes T Vγ9Vδ2 périphériques,
consécutivement à l’administration d’Acide Zoledronique, chez des patients présentant un
cancer de la prostate métastasé 338. Cette étude a examiné la faisabilité et les conséquences de
l’utilisation de zolédronate, seul ou en combinaison avec de faible dose d’IL2 afin d’activer
les cellules T γδ du sang périphérique. Cette étude a montré que bien qu’aucun traitement n’a
montré de cytotoxicité appréciable, 2 patients sur 9 ont montré un changement significatif
dans la population des cellules T γδ autour d’un phénotype central mémoire activé, produisant
de la perforine et de l’IFNγ. Ces patients maintiennent également un niveau élevé de TRAIL
sérique produit par les cellules T γδ activées. De plus le nombre de cellules T γδ au stade
« effecteur mémoire » semble corréler à la diminution du taux sérique de PSA ainsi qu’un
résultat clinique objectif avec 3 cas de rémission partielle et 5 cas de maladie stabilisée. Au
contraire, la plupart des patients traités uniquement avec du zolédronate ne soutient ni le
nombre de cellules T γδ ni le niveau de TRAIL dans le sérum, et montre une détérioration
clinique progressive.
98
Donc la combinaison zolédronate IL2 représente une approche nouvelle pour induire
des réponses cliniques et immunologiques chez les patients avec des carcinomes
métastatiques. Les phénotypes des cellules T γδ ainsi que le niveau de TRAIL dans le sérum
pourraient constituer de nouveaux bio-marqueurs de pronostic consécutifs à une thérapie des
carcinomes métastatiques avec zolédronate et IL2. L’utilisation des ABP comme agents
stimulants les lymphocytes T Vγ9Vδ2 offre donc de nouvelles approches d’immunothérapie
dans les pathologies malignes 339.
Ainsi, plusieurs essais cliniques ayant pour but d’agir sur l’activation in vivo des
cellules T Vγ9Vδ2 chez les patients atteint de cancer sont actuellement en cours.
L’augmentation transitoire systémique des concentrations d’IL6, de TNFα , d’IFNγ , et de
TRAIL dans le sérum a été observée quelques heures après injection en intra veineuses
d’ABP ou de PAg seul, chez des primates et chez des patients 336, 338, 340. Si de tels traitements
échouent à induire l’expansion in vivo des cellules T Vγ9Vδ2 chez la plupart des individus, la
co-administration d’agoniste de cellules T Vγ9Vδ2 et d’IL-2 recombinante conduit à une
expansion significative des Vγ9Vδ2 sanguins
202, 336, 338, 340
. De manière intéressante, la
stabilisation de la tumeur voire sa régression partielle ont été observées chez plusieurs patients
atteint de myélomes multiples dans un protocole de stimulation de lymphocytes T Vγ9Vδ2
202
. De plus, les cellules T Vγ9Vδ2 périphériques de la moitié des patients traités ne sont pas
amplifiés après traitement avec un agoniste des Vγ9Vδ2 plus IL2 303. Des traitements répétés
conduisent à une rapide diminution des réponses prolifératives périphériques des cellules T
Vγ9Vδ2 à la fois chez les primates sains et les patients malades, bien que la capacité de ces
lymphocytes à répondre aux Ag in vitro semblent être maintenus 336.
Ces observations, certes prometteuses, indiquent que les protocoles immunothérapeutiques qui ciblent les lymphocytes T Vγ9Vδ2 nécessitent d’être optimisés. A cet
égard, l’IL15 est un facteur homéostatique et de croissance pour les cellules Vγ9Vδ2
218
.
Comme cette dernière cytokine peut aussi augmenter la lyse NKG2D-médiée de cellules
tumorales ciblées à la fois par les cellules T αβ et T γδ
association avec des agonistes du TCR Vγ9Vδ2.
99
341
, elle pourrait être utilisée en
IV-6-3. Approches impliquant le transfert adoptif de cellules T Vγ9Vδ2
Une alternative à l’activation in vivo des cellules T γδ par administration d’ABP ou de
PAg en combinaison avec l’IL2 pourrait être une thérapie basée sur le transfert adoptif de
cellules T Vγ9Vδ2. Ces cellules seraient isolées ex vivo à partir du sang périphérique et
amplifiées in vitro grâce à des PAg ou des ABP. En effet après transfert adoptif dans des
souris SCID, les cellules T γδ activées à l’alendronate plus IL-2 prolongent significativement
la survie des souris SCID inoculées avec les cellules tumorales humaines
342
. Ainsi une
immunothérapie efficace basée sur les cellules T γδ pourrait requérir l’activation des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 endogènes grâce à l’administration de PAg (ou d’ABP) et d’IL-2,
suivi par un transfert adoptif des cellules T Vγ9Vδ2 amplifiées in vitro.
L’activation cellulaire peut également être induite par des méthodes plus classiques
telle que l’administration in vitro d’anticorps dirigés contre le CD3 et /ou le TCRVγ9. En
effet, l’amplification et l’activation ex vivo des cellules T γδ à partir de sang périphérique de
patients atteints de cancer du nasopharynx ont été réalisées par un anticoprs anti-TCRγ fixé
sur support 343.
La mort cellulaire induite par l’activation (AICD, Activation Induced Cell Death) qui
se produit très fréquemment dans ces cultures in vitro pourrait être prévenue par la protection
avec un anticorps anti-CD2
l’IL15
345
344
et / ou l’addition de cytokines anti-apoptotiques telle que
. En effet, les études de R. Lopez ont permis d’identifier et de caractériser une voie
de signalisation, dépendante de l’IL12 et médiée par CD2, qui inhibe l’apoptose des cellules T
γδ induites par un mitogène. Ces auteurs ont depuis lors exploité cette voie pour développer
des méthodes d’amplification ex vivo de cellules T γδ viables, fonctionnelles et résistantes à
l’apoptose.
Le procédé de thérapie cellulaire INNACELL-γδ TM, développé par Innate pharma est
un produit de thérapie cellulaire autologue en essai clinique de phase I chez des patients
atteints de carcinome rénal métastatique (mRCC). Les cellules mononuclées autologues de
patients mRCC sont collectées et les cellules T Vγ9Vδ2 sont spécifiquement amplifiées ex
vivo avec de l’IL2 et du BrHPP. Plusieurs milliards de lymphocytes T Vγ9Vδ2 sont ainsi
100
obtenus en 2 semaines par culture in vitro. Cette stimulation ex vivo s’affranchit de potentiels
effets inhibiteurs de la tumeur et autorise ainsi la génération d’un nombre élevé de cellules
effectrices 346.
Bien que divers types d'immunothérapie aient été utilisés pour tenter d'améliorer le
pronostic des patients présentant un mRCC, l'immunothérapie adoptive utilisant des cellules T
γδ n'avait pas encore été testée. Très récemment une étude pilote d’immunothérapie adoptive
sur sept patients utilisant les cellules de T γδ activées in vitro contre mRCC a été mise au
point. Ainsi, les cellules T γδ autologues activées in vitro ont été administrées à des patients
mRCC ayant subi une néphrectomie. Le traitement a été bien toléré par tous ces patients et
pour 3 sur 5 d’entre eux, des effets anti-tumoraux ont été observés347.
IV-6-4. Approches impliquant l’utilisation concomitante de DC et de
cellules T Vγ9Vδ2
Les stratégies de vaccinations à base de DC actuellement mises en place
57, 348-350
pourraient être couplées avec l’utilisation de lymphocytes T Vγ9Vδ2. En effet un des aspects
critiques de l’établissement d’une réponse immune effective est la maturation des DC. Or les
lymphocytes T Vγ9Vδ2 sont capables d’induire la maturation des cellules dendritiques par la
production de cytokines
351
ou via la molécule CD1
351, 352
. De plus la co-culture de DC
immatures (iDC) avec des cellules T Vδ2 du sang périphérique activées avec un PAg ou un
ABP (pamidronate; PAM) conduit à une modulation positive spécifique de CD86 et des
molécules de CMH de classe I et à l’acquisition de marqueurs fonctionnels typiques des DC
activées
323
. D’autre part, il a été décrit que les iDC potentialisent la production de cytokines
par les cellules T Vγ9Vδ2 stimulées par un Ag , lesquelles exercent un effet réciproque sur la
maturation des DC
353
. Les iDC augmentent en effet la production cytokinique Th1 (voire
même Th2) par les cellules T Vγ9Vδ2. Ainsi la capacité des iDC à sélectivement potentialiser
la réponse cytokinique des cellules T Vγ9Vδ2 suggère l’effet adjuvant de ces lymphocytes.
L’induction de la sécrétion de cytokines, nécessaire au processus de maturation des DC,
suggère donc, que les cellules T Vγ9Vδ2 peuvent agir comme adjuvant des réponses immunes
cellulaires. Cependant l’étude très récente de Cendron
219
concernant le possible rôle adjuvant
des lymphocytes Tγδ dans un vaccin sous-unitaire antituberculeux n’a pas confirmé cet
aspect, infirmant également un hypothétique role d’APC
101
326
.
***
Cet état de l’art souligne l’importance des cellules non-conventionnelles
Tγδ en immunité anti-tumorale et leur parfaite adéquation à de nouvelles
stratégies thérapeutiques. L’ensemble de ces résultats est très encourageant et
justifie d’optimiser le ciblage des lymphocytes Tγδ pour explorer le traitement
de différents types de cancers.
***
102
OBJECTIF DU TRAVAIL
Si les lymphocytes T γδ humains reconnaissent des PAg à la surface des cellules
tumorales humaines et tuent ces dernières, les modalités de ces processus de reconnaissance
restaient mal définies. L’objectif de mes travaux de recherches doctorales était donc de
clarifier ces aspects, pour ensuite tenter d’optimiser l’action anticancéreuse de ces
lymphocytes non-conventionnels.
Mon doctorat a donc consisté à décrire les étapes du déclenchement des fonctions
tueuses des lymphocytes T γδ vis-à-vis de cellules cancéreuses humaines : fixation aux
cellules cibles, détection de PAg tumoraux, signalisations intracellulaires puis déclenchement
des mécanismes de lyse.
Aussi, dans un premier temps, ce projet s’est focalisé sur l’analyse (notamment vidéomicroscopique) de l’activité moléculaire se déroulant à la synapse immunologique des
lymphocytes T γδ avec des lymphomes anaplasiques à grandes cellules.
Dans un second temps, j’ai utilisé les résultats de ces observations pour optimiser les
modalités de l’action anti-tumorale de ces lymphocytes T γδ. Ce concept sera illustré de
données obtenues dans le contexte de l’immunothérapie associant anticorps monoclonaux
anticancéreux et lymphocytes T γδ activés. Plus spécifiquement, les travaux que je présente
dans cette thèse démontrent l’intérêt thérapeutique de l’association anticorps monoclonal
thérapeutique rituximab et de phosphoantigènes vis-à-vis des lymphomes non-Hodgkiniens.
Pour leur extrapolation à toutes les thérapies par anticorps monoclonaux, comme
l’illustreront ici quelques exemples obtenus avec l’alemtuzumab et le trastuzumab, les
résultats de mon doctorat ont fait l'objet d’une publication, de plusieurs communications
orales et d'un brevet déposé par INSERM, sur lequel se base désormais un essai clinique de
phase II dans le traitement du lymphome folliculaire en rechute.
103
RESULTATS
1. Première partie : Etude de l’activité moléculaire à la synapse
des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains
Comme abordé précédemment, les lymphocytes effecteurs cytotoxiques, et
particulièrement les cellules T Vγ9Vδ2 sont capables de capturer des morceaux de
membranes de leurs cellules cibles et de lui envoyer des granules lytiques à travers la synapse
immunologique. Cependant, le positionnement de ces deux activités l’une par rapport à l’autre
restait un mystère. Notre hypothèse de travail est que leur ordre à la synapse lytique pouvait
fournir des indices quant à la signification physiologique de ce transfert et -peut être- en faire
une cible pour de nouveaux protocoles thérapeutiques.
En effet la question était de savoir si cette capture de membrane de cellules cibles est
pré-requise, simultanée, ou postérieure à la sécrétion des granules lytiques à la synapse. En
effet, bien que la capture de membrane dans une synapse immunologique lytique de CTL
déficient en perforine puisse se produire sans induire la mort de cellules cibles
265
, cela
n’élimine pas la possibilité que la trogocytose puisse être couplée à l'exocytose de granules
lytiques.
Trois hypothèses peuvent être avancées pour la signification physiologique de ce
transfert :
- Si cette capture se produit peu après le contact synaptique, elle pourrait soutenir la
signalisation activatrice avant la sécrétion de granule.
- Si elle se produit une fois que les lymphocytes ont commencé à recruter leurs
vésicules lytiques au MTOC, elle pourrait alors contribuer à ajuster la sécrétion à la
synapse.
- Si elle se produit après la sécrétion des granules, elle pourrait contribuer à la
dissociation des conjugués 275.
104
Pour mieux cerner le rôle et la pertinence physiologique de cette capture membranaire
dans l’efficacité de cytotoxicité des lymphocytes T γδ, nous avons donc étudié en parallèle la
capture de membrane et l'exocytose de granules dans une synapse lytique.
Pour cela nous avons mis au point un modèle de synapse lytique qui nous permettait
d’observer à la fois la capture membranaire et le relargage de perforine. Les acteurs cellulaires
étaient les lymphocytes T γδ humains et deux lignées de lymphome anaplasique à grande
cellule (ALCL) (Karpas-299 et COST). En effet, nous avions précédemment observé que les
ALCL étaient particulièrement bien trogocytés par les lymphocytes T γδ du sang périphérique
354
. C’est la raison pour laquelle l’interaction cellulaire γδ-ALCL pouvait représenter un
modèle approprié pour cette étude.
Les ALCL représentent environ 2% des lymphomes en général et jusqu’à 12% des
lymphomes de l’enfant. C’est un type de lymphome non-Hodgkinnien, un cancer qui trouve
son origine dans le tissu lymphatique. Les symptômes se traduisent par des désordres lymphoprolifératifs cutanés bénins allant jusqu’aux désordres systémiques suites à l’atteinte des
nœuds lymphatiques et des régions extranodales
355
. Les principales cellules impliquées dans
cette pathologie sont les leucocytes de phénotype T ou « nul » (c'est-à-dire ni T ni B) CD30+
perforine+ TCR−. La lignée cellulaire Karpas-299 représente le type le plus commun d'ALCL
356
alors que la lignée cellulaire COST est une variante morphologique d'ALCL à petites
cellules. En général, les types de variants d’ALCL dits à petites cellules s’accompagnent de
pronostics très défavorables 357.
Publication # 1: Human γδ T lymphocytes strip and kill tumor cells simultaneously. Julie
GERTNER, Aurélie WIEDEMANN, Mary POUPOT and Jean Jacques FOURNIE,
Immunol Lett 110, 42-53 (2007).
Cette étude décrit l'induction du transfert synaptique et de l’activité lytique des
lymphocytes T Vγ9Vδ2 en co-culture avec les lignées d’ALCL Karpas-299 et COST.
Elle met en évidence deux traits importants de l’interaction des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 avec leur cible tumorale. Le premier est la simultanéité de la capture de membrane et
du relargage de perforine. La deuxième est la persistance de ces deux processus post mortem
de la cible.
105
Immunology Letters 110 (2007) 42–53
Human ␥␦ T lymphocytes strip and kill tumor cells simultaneously
Julie Gertner a , Aurélie Wiedemann b , Mary Poupot a , Jean-Jacques Fournié a,∗
a Department of Oncology, Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale Unité 563, BP 3128, Hopital Purpan, 31024 Toulouse Cedex 03, France
b Department of Immunology, InstitutNational de la Santé Et de la Recherche Médicale Unité 563, BP3128, Hopital Purpan, 31024 Toulouse Cedex 03, France
Received 23 January 2007; received in revised form 20 February 2007; accepted 5 March 2007
Available online 3 April 2007
Abstract
When human ␥␦ lymphocytes bind to tumor cells for killing, they also strip their membrane for unknown reasons. Here we investigated this topic
using the model of human ␥␦ lymphocytes co-incubated with anaplastic large cell lymphomas, a group of tumors with cytolytic T or null lineage.
By using flow cytometry and live cell imaging, we show that as soon as both cells were in contact, the TCR-mediated activation of ␥␦ lymphocytes
simultaneously triggered their secretion of lytic granules and stripping of lymphoma cell membranes, and both activities continued even after their
cell death. However reciprocally in such conjugates, resistant lymphoma failed to strip ␥␦ cells and to kill them by untargeted secretion of their
own lytic granules. This indicated that secretion of lytic granules and target membrane stripping are associated in lytic cell conjugates, and that ␥␦
T lymphocytes strip and kill their targets simultaneously.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Activation; Membrane; Lymphoma; Cell imaging; Cell death
1. Introduction
The immunological synapse (IS) of cytolytic T lymphocytes (CTL) allows the recognition of target cells, orientated
secretion of lytic granules as well as intercellular capture of
membrane fragments [1,2]. This latter activity resembles to that
of cytopathogenic amoeba [3] and is referred to as “trogocytosis” [4], “stripping” [5] or “trapping” [6]. Both in vivo and in
vitro evidence have shown that B and T lymphocytes strip antigen cells upon TCR- or BCR-mediated endocytosis of antigen
complexes from APC (see for reviews: [7–9]). ␣␤ T lymphocytes also capture membrane fragments from antigen-free APC
[10]. ␥␦ T and NK cells nibble their targets [11–13] while the
latter capture some killer cell membrane markers [14]. Several hematopoietic and non-hematopoietic tumor cells capture
constitutively homotypic cell membranes [15,16]. This type of
intercellular transfer of cell surface markers can be detected in
a broad range of cell types and therefore has functional conse-
Abbreviations: ALCL, anaplastic large cell lymphoma; APC, antigenpresenting cell; CMTMR, orange-(5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)
amino)tetramethylrhodamine); CTL, cytolytic T lymphocytes; FCS, fetal calf
serum; IS, immunological synapse; mfi, mean of fluorescence intensity
∗ Corresponding author. Tel.: +33 5 6274 8364.
E-mail address: [email protected] (J.-J. Fournié)
0165-2478/$ – see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.imlet.2007.03.002
quences on immunoregulation [5,17,18], viral infection [19,20],
neo-angiogenesis [21,22] and tumorigenesis [15,16].
The mechanism of membrane capture remains elusive and
could involve exosome shedding from APC and their recapture
by conjugated lymphocytes [10,23–25]. Alternatively, membrane fragments could be sheared from target cells upon
conjugate dissociation [26], which implies that this transfer is
a post-synaptic event. Several lines of evidence suggest that
stripping occurs directly across synapses. Firstly, the reciprocity
of transfers between NK and target cells [14] implies that this
occurs while cells are bound. Secondly, the synapses formed
between conventional CTL and their targets are composed of
membrane bridges and fusion microdomains [27], which could
support transfer by lateral diffusion along the membrane. Lastly,
inhibitors of lymphocyte activation or cytoskeleton remodelling
also block stripping [1,7,11,13,28,29], linking this process to
activation in cell conjugates.
While cytotoxic responses can be monitored on both target
and killer cells, stripping can only be assessed on the latter.
Hence, lytic synapses represent an interesting model to investigate when transfer is triggered relative to cytotoxic activity.
NK, CD8 ␣␤ and ␥␦ T cells have different requirements for
activation, but share a need for low level of activating signals to
induce their cytotoxic and trogocytic responses [2,11–13,30,31].
Although membrane capture in lytic IS of perforin-deficient
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
CTL can occur without inducing target cell death [2], this observation did not rule out the possibility that stripping could be
coupled with granule exocytosis. In effector lymphocytes, membrane capture and granule secretion occur in opposite directions,
so their sequence at the lytic synapse could provide clues as to
the physiological significance of this transfer. Whether the capture of the target cell membrane is pre-required, simultaneous,
or posterior to the secretion of lethal granules at the synapse
remains however unknown. If it occurs soon after cell–cell contact, the transfer could support activatory signaling prior to
granule secretion [31]. Alternatively, if it occurs once the activated lymphocytes exocytose their vesicules, it could contribute
to adjusting the secretion at the synapse. Finally, if it occurs
after the delivery of lethal hits, it could contribute to the dissociation of cell conjugates [26]. Hence, simultaneous monitoring
of membrane capture and granule exocytosis in lytic synapses
is required to evaluate these various possibilities.
We have previously observed stripping of anaplastic large
cell lymphoma cells (ALCL) by ␥␦ T blood lymphocytes [32].
Human ␥␦ T lymphocytes expressing V␥9/V␦2-encoded TCR
represent a polyclonal T-cell subset that is highly biased for
MHC-unrestricted reactivity to non-peptide phosphoantigens
and anti-tumoral cytotoxicity [33]. Since we had previously
characterized the immunological synapse of ␥␦ T lymphocytes
[34] and their propensity to nibble human cancer cells [11],
we suggested that ␥␦–ALCL cell interactions could represent a
suitable model for this study. ALCL comprise a group of several
histotypes of T- or null-, CD30+ perforin+ TCR− lymphocyte
neoplasms, ranging from benign cutaneous lympho-proliferative
disorders to systemic lymphomas [35]. The most common type
of ALCL is represented by the Karpas-299 cell line [36], while
the COST cell line is a morphological variant of small-size
ALCL [37]. Here, we investigated the induction of transfer and
of lytic activity by ␥␦ T lymphocytes conjugated to the Karpas299 and COST ALCL cell lines. We found that as soon as cell
conjugates were formed, ␥␦ TCR-mediated activation triggered
both perforin release and ALCL membrane capture. Imaging
experiments showed that ␥␦ T cells remain conjugated to targets
even after their cell death, sustaining both stripping and granule
exocytosis at the synapse. In addition, COST cells were able
to release perforin to the conjugated ␥␦ lymphocytes and strip
membranes from the conjugated ␥␦ lymphocytes. However, both
of these activities were relatively weak. Together these observations suggest that ␥␦ T cells bound to tumor cells coordinate
their capture of membrane fragments to their targeted exocytosis
of lytic granules.
2. Materials and methods
2.1. Reagents
The PKH67 lipophilic fluorochrome was purchased from
Sigma–Aldrich (St. Louis, MO). Orange-(5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine) (CMTMR),
the calcein green AM cell viability tracker and the LysoTracker
Red DND 99 were from Molecular Probes (Cergy Pontoise,
France). PTIR-271, a lipidic carbocyanine derivative with stable
43
membrane intercalating properties was a kind gift from Brian
Gray (PTI Research, Inc., Exton, PA, USA). This fluorochrome
has a high extinction coefficient (216,700 M−1 cm−1 ) and
emits in the far red. IgG isotype controls, anti-pan-␥␦ TCR,
anti-TCRV␥9 and FITC-conjugated anti-CD30 reagents were
from Beckman-Coulter-Immunotech (Marseille, France).
Anti-IgG1-PE, anti-TCRV␥9-PE, PC5-conjugated anti-CD16,
PC5-conjugated anti-CD107a and FITC-conjugated anti-human
perform mAbs were from BD Biosciences-Pharmingen (San
Diego, CA) and anti-NKG2D was from R&D Systems Europe
(Lille, France). Anti-MHC class I (clone W6.32) (BeckmanCoulter-Immunotech), anti-MIC-A (MICA) from Immatics
(Tuebingen, Germany), anti-ULBP 1,2,3 from R&D Systems,
and FITC- and PE-conjugated secondary goat anti-mouse IgG
were from Caltag Labs (Burlingame, CA, USA).
2.2. Cell culture
PBMCs were isolated from fresh blood samples using
LeucosepTM tubes (Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)
and cultured in vitro for 2 weeks (1.5 × 106 ml−1 ) in complete
RPMI 1640 medium supplemented with 10% heat-inactivated
fetal calf serum (FCS) (Invitrogen, San Diego, CA). To produce
␥␦ CTL, PBMC were stimulated with 400 nM of phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (Innate Pharma, Marseilles,
France) and 300 IU/ml of recombinant human IL2 (kind gift
from Sanofi-Synthélabo-Aventis, Labège, France). IL2 was
renewed every 3 days at the same concentration and lymphocytes were kept at 1.5 × 106 cells/ml. Flow cytometry analysis
using mAbs for either TCRV␥9 or TCRV␦2 chains indicated these TCR chains of the ␥␦ TCR were co-expressed
by >90% of the resulting ␥␦ cell lines as described previously. The cell lines of Burkitt’s lymphoma Daudi and
the thymoma Ichikawa were cultured (0.5 × 106 ml−1 ) in
complete RPMI 1640 medium supplemented with 10% heatinactivated FCS. Karpas-299 and COST ALCL cells were kept
between 0.5 and 1 × 106 cells/ml in the same culture medium
but supplemented with 15% FCS as previously described
[37,38].
2.3. Flow cytometry
2 × 105 PBMCs were washed in PBS (Cambrex Bio Science)
and incubated at 4 ◦ C for 20 min with the specified mAb conjugates diluted in PBS plus 5% FCS. Thirty thousand events
were collected per experiment and analysed on a Facs-Calibur
(Becton Dickinson) using the Cell Quest-Pro software (BD
Biosciences, Mountain View, CA). For analysis of CD107a
expression, ␥␦ T lymphocytes and target cells (cell ratio of
1:2, respectively) were co-incubated at 37 ◦ C in the presence
of anti-CD107a conjugate and monensin (9 ␮M, added after 1 h
to the co-cultures). Four hours later, cells were collected, washed
twice with PBS-EDTA (0.5 mM) and labelled for TCRV␥9. For
intracellular staining of perform, T cells were washed, added
to ALCL in 200 ␮l of RPMI 1640 with 5% FCS and spun
down by mild centrifugation in U-bottom 96-well plates to
allow conjugate formation. After 4 h at 37 ◦ C, the cells were
44
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
fixed for 10 min at room temperature with 3% paraformaldehyde, permeabilized for 10 min with Hepes-buffered PBS
containing 0.1% saponin and 3% bovine serum albumin and
stained with PE-conjugated anti-human perforin mAb (BD Biosciences, Mountain View, CA) or with PE-conjugated IgG2b
control.
2.4. Flow cytometry-based measure of synaptic transfer
These assays were performed using a 1:2 cell ratio of ␥␦ T:
PKH67-stained ALCL as described elsewhere [32]. For blocking experiments, 10 ␮g/ml of anti-TCR␥␦ mAb (IMMU510;
IgG1; Beckman-Coulter-Immunotech, Villepinte, France), antiNKG2D (149810; IgG1; R&D) or control mouse mAb IgGl
isotype-matched control were added to the co-incubated
cells.
2.5. Specific lysis
Specific lysis was measured using standard 4 h 51 Cr-release
assay. When specified, effector T cells were pre-incubated for
20 min with 15 nM concanamycin A (Sigma–Aldrich) at 37 ◦ C
and then added without further washing to the labelled target
cells. For blocking experiments the same mAbs as above were
added to the cells before co-incubation with the Cr51 -pulsed
target cells.
2.6. Time-lapse confocal microscopy
Karpas-299 cells were stained with calcein AM and with
PTIR-271 (diluted 1/500), according to the manufacturer’s
instructions, or with the anti-CD30 monoclonal antibody for
Ki-1 antigen when specified. Cells were plated on Lab-Tek
chambered coverglass (VWR) previously coated with poly-dLysine hydrobromide (Sigma–Aldrich), and incubated at 37 ◦ C
in a 5% CO2 atmosphere. The ␥␦ T cells were stained with
LysoTracker red according to the manufacturer’s instructions
and were added to the chambers after adhesion of Karpas299 cells. Lyso Tracker red labels acidic intracellular structures
such as lytic CTL granules without affecting the kinetics
of their release [39]. Time-lapse confocal microscopy was
performed by acquiring pseudocolour images at a rate of
1 every 8 s for sequences of 2 h as described [40]. RGB
images show green for calcein (viability), blue for PTIR271 (membrane transfer) and red for acidic granules (perforin
release).
2.7. Single cell analysis of synaptic transfer and viability
Transfer was analysed at the single-cell level by monitoring
the distribution of fluorescence from Karpas-299 membranes as
a function of cell contact time. In the above time-lapse protocols, bmp files of successive images of Karpas-299 cells were
selected. These produced a (x, y, z) 3D-plot for each timepoint,
with x, y as pixel coordinates and z as membrane fluorescence
intensity. For each successive image, z was plotted along a segment [␮1–␮2] crossing the cell from the synaptic membrane
(␮1) to the opposite side (␮2) and the resulting curve was integrated. The kinetics of transfer were represented by plotting
the ␮1/␮2 ratio as a function of time. A similar procedure was
followed to measure cell viability using the above images monitored on the green channel (calcein). A cytoplasmic region of
interest was selected and the mean intensity of calcein was calculated. This value was normalised and plotted as a function of
time.
2.8. Statistical analysis
Differences among groups were analysed by the Mann–
Whitney U test using SigmaStat 3.0 (SPSS Inc., Chicago).
3. Results
3.1. Capture of Karpas-299 membrane markers by
polyclonal γδ T lymphocytes
Polyclonal cell lines of TCRV␥9+ ␥␦ T lymphocytes stripped
ALCL cell lines similarly to freshly isolated peripheral ␥␦ T
lymphocytes [32]. When co-incubated with Karpas-299 cells
labelled with the membrane fluorochrome PTIR-271, polyclonal
TCRV␥9+ lymphocytes captured fragments of their membrane
(Fig. 1A). When co-incubated for 60 min with Karpas-299 cells,
the TCRV␥9+ ␥␦ T lymphocytes acquired more fluorescence
than the other lymphocytes from the ␥␦ T cell line. In addition, stripping of Karpas-299 cells was more important than
that observed with other lymphoma or leukaemia cell lines,
such as Daudi or Ichikawa. A representative experiment out
of 10 (Fig. 1B) showed that in TCRV␥9+ cells, PKH67 (mfi)
intensity shifted from 4 before co-incubation to 128 after 1 h
of incubation with Karpas-299 cells. In the same experiment,
the mfi of non-␥␦ T cells shifted from 4 to 27. Comparatively, with Ichikawa and Daudi cells, the mfi of ␥␦ T cells
shifted from 4 (t0 min ) to 23 (t60 min ) and from 5 (t0 min ) to 61
(t60 min ), respectively. Hence the nibbling of the Ichikawa cell
line was only marginal as compared to that other tumor cell
lines. Six other polyclonal TCRV␥9+ ␥␦ T cell lines derived from
healthy donors gave the same results (data not shown). Confocal microscopy illustrated the capture of Karpas-299 membrane
fragments by cells that were in contact with the latter. ␥␦ lymphocytes were loaded with orange-CMTMR and co-incubated
for 15 min with Karpas-299 cells previously labelled with PTIR271 and positive for CD30. Fig. 1C (representative results
out of five experiments) shows that PTIR-271 and CD30 colocalised on the cell membrane of the conjugated ␥␦ lymphocyte,
while these Karpas-299 markers were absent prior to cell contact. Flow cytometry confirmed this was a general trend of the
␥␦ T cells, as 18% of TCRV␥9+ ␥␦ T lymphocytes acquired
CD30 from Karpas-299 cells within 60 min of co-incubation
(Fig. 1D), and this proportion increased with time (not shown).
Thus both the protein marker CD30 and the membrane-inserted
fluorochrome PTIR-271 were captured from Karpas-299 cell
surface by the conjugated TCRV␥9+ ␥␦ T lymphocytes, indicating that the stripping was not selective of some membrane
markers.
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Fig. 1. Strong stripping of Karpas-299 ALCL by polyclonal TCRV␥9+ lymphocytes. (A) Sequence of snapshots depicting the capture by ␥␦ T lymphocytes of
fragments (yellow arrows) from Karpas-299 cell membranes previously labelled with PTIR-271 and shown here with blue pseudocolour. (B) Stripping of Karpas299, Daudi or Ichikawa cells by polyclonal ␥␦ T lymphocytes. Karpas-299, Daudi or Ichikawa cells labelled with the PKH67 fluorochrome were co-incubated with
␥␦ T cell lines and analysed by flow cytometry. Top: mfi of PKH67 on the ␥␦ TCR+ lymphocytes, bottom: mfi of PKH67 on (␥␦ TCR−) lymphocytes from the same
cell lines. (C) Karpas-299-derived markers CD30 (green) and PTIR-271 (blue) are absent from CMTMR+ ␥␦ T lymphocytes (red) before co-incubation (upper left),
but are present on the ␥␦ T cells co-incubated with Karpas-299 for 15 min (upper right). Lower panels: co-localisation of CD30 and PTIR-271 on the surface of the
conjugated CMTMR + ␥␦ T lymphocyte in the above images from (B) (the x-axis of the histogram corresponds to the AB segment from respective images in (B)).
Representative images from five co-incubation experiments. (D) acquisition of CD30 derived from Karpas-299 cells (left panel) by polyclonal ␥␦ T lymphocytes
co-incubated for 0 min (middle panel) or 60 min (right panel).
46
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Fig. 2. Perforin-mediated killing of Karpas-299 by the ␥␦ CTL. (A) Phenotype of the ␥␦ CTL involved in this study. Cells were labelled for the specified markers
(open histograms) or the corresponding isotype-matched Ig control (shaded histograms). (B) Specific lysis of Karpas-299 (black circles), Daudi (grey squares) and
Ichikawa (white squares) tumor cell targets in a standard 51 Cr-release assay. Data shown are the mean and S.D. from three independent experiments with different ␥␦
T cell lines. (C) Inhibiting perforin release by treatment with concanamycin A (triangles) reduced the killing of Karpas-299 (black circles) in a standard 51 Cr-release
assay (mean and S.D. from three independent experiments). (D) Co-incubation with Karpas-299 cells induced expression of CD107a by ␥␦ T lymphocytes, measured
using an LSR-II flow cytometer. Data are from three experiments performed in triplicate.
3.2. γδ T lymphocytes kill Karpas-299 cells by secreting
perforin
All ␥␦ T cell lines involved in this study were mostly composed of TCRV␥9+ lymphocytes. These CD27− cells express
high levels of intracellular perforin and harbour C-type lectin
receptor NKG2D, CD16 and CD56 at the cell surface (Fig. 2A).
This phenotype corresponds to a previously depicted subset of
fully mature peripheral TCRV␥9 cells, the cytolytic effector
memory ␥␦ T cells [41]. Accordingly, when tested for specific lysis in standard 51 Cr-release assays, these ␥␦ lymphocytes
killed Karpas-299 targets more efficiently than Daudi, the standard target, or Ichikawa, a negative control (Fig. 2B). Hence
the low lysis of Ichikawa cells was in line with its marginal
stripping depicted in the above experiment. This lytic activity was reduced, at least in part, by a short pre-treatment with
Concanamycin A, an inhibitor of perforin exocytosis (Fig. 2C).
Accordingly, co-incubation with Karpas-299 cells induced most
␥␦ T cells to express the CD107a marker of lytic lysosome
exocytosis (Fig. 2D). Thus, ␥␦ T lymphocytes killed Karpas299 cells by releasing perforin, as it has already been shown in
non-Hodgkin lymphomas [42].
3.3. TCRVγ9 triggers both membrane stripping and killing
of Karpas-299 cells
The ␥␦ lymphocytes in this study expressed the TCRV␥9+
receptors and NKG2D (see above), both of which could potentially explain their reactivity to Karpas-299 cells. We thus
assessed their respective involvement by adding a saturating
concentration of neutralising antibody to these receptors in
synaptic transfer and lysis assays. Lysis of Karpas-299 by the
␥␦ T lymphocytes was strongly inhibited by IMMU510, an
anti-TCR␥␦ mAb (74% inhibition by antibody at E:T = 30:1).
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Fig. 3. TCR ␥␦ triggers lysis and stripping of Karpas-299 by ␥␦ lymphocytes. (A) Antibody blocking of Karpas-299 lysis by ␥␦ T CTL. The specified E:T cell ratios
were tested in a standard 51 Cr-release assay in the presence of either of the following antibodies: anti-TCR ␥␦ (clone IMMU 510, white circles), anti-NKG2D (clone
149810, grey triangles), both antibodies (white squares) or isotype-matched control antibody (black circles). (B) Antibody blocking of Karpas-299 stripping by ␥␦
T CTL. Karpas-299 cells labelled with PKH67 were co-incubated for 1 h with ␥␦ T cells in the presence of the specified antibodies and analysed by flow cytometry.
The PKH67mfi of ␥␦ T lymphocytes are indicated.
Conversely, this lytic activity was only marginally affected
by the anti-NKG2D mAb alone. Furthermore, the addition of
both mAbs abrogated the killing to approximately the same
extent as that observed with the anti-TCR␥␦ mAb alone (71%
inhibition in these conditions, Fig. 3A). The capture by ␥␦ lymphocytes of PKH67, a fluorochrome inserted into Karpas-299
cell membranes, was also inhibited when the anti-TCR␥5 mAb
IMMU510 was added to the synaptic transfer assay. Conversely,
the anti-NKG2D mAb alone had little effect. Addition of both
mAbs during the co-incubation had approximately the same
effect as the anti-TCR␥␦ mAb alone (Fig. 3B).
Thus both stripping and killing of Karpas-299 resulted from
recognition essentially mediated by the ␥␦ TCR with little (if
any) contribution from NKG2D.
3.4. Single cell imaging shows simultaneous lysis and
stripping by γδ T lymphocytes
We used time-lapse confocal fluorescence microscopy to
visualise both membrane capture and perforin release at the
single-cell level. The ␥␦ T lymphocytes were labelled with
LysoTracker (red) to view their acidic perforin granules and
co-incubated for 2 h in microchambers at 37 ◦ C in 5% CO2
with Karpas-299 cells previously loaded with calcein (viability
tracker) and PTIR-271 (membrane tracker, blue). Cell conjugates were selected and images were taken every 8 s for 2 h,
with t0 corresponding to the time of cell contact.
Prior to cell contact, ␥␦ T lymphocytes crawled rapidly over
the support. They harboured either circular or highly plastic
morphologies comprising one or several pseudopodia, a motile
body with one or several sprawling heads, scanning for antigen cells. Each ␥␦ lymphocyte harboured between 5 and 15
cytolytic granules that were highly mobile upon cell movement.
Frequent homotypic ␥␦–␥␦ cell contacts were extremely shortlived, while most ␥␦–ALCL cell contacts led to stable synapses.
As soon as the synapses were formed, both the ␥␦ lytic granules
and the ALCL cell membrane converged to the synapse. Lytic
granules at the synapse vanished, either by exiting the confocal plane or through secretion. The conjugated Karpas-299 cells
were still alive several minutes after contact and their stripping
was visible. Both cytoplasmic extinction of calcein and osmotic
turgescence demonstrated Karpas-299 cell death, which most
frequently occurred approximately 10 min after contact. Of note,
however, the conjugates did not dissociate immediately after
target cell death and ␥␦ lymphocytes continued to exocytose
perform and to capture target cell membrane fragments at the
synapse. Fig. 4 shows a representative sequence of snapshots,
out of 13 imaging sequences of different cell conjugates from
5 independent experiments with similar results. Serial killing
by ␥␦ T lymphocytes was rarely observed (e.g. only twice in
25 lytic conjugates), this behavior was therefore not their most
frequent mode of lytic activity.
Hence, the formation of cell conjugates initiated in a timely
coordinated fashion both capture of the ALCL membrane and
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Fig. 4. Imaging of transfer and killing of Karpas-299 in the lytic ␥␦ synapse. Karpas-299 cells loaded with calcein (green) and labelled with PTIR-271 (blue) were
co-incubated with ␥␦ T CTL labelled with LysoTraker (red) and visualised by time-lapse video-confocal microscopy. Cell death is visible 12 min after cell contact.
release of ␥␦ lytic granules, which persisted after target cell
death.
3.6. Weak stripping and targeting of perforin secretion in
the reverse direction of the cell conjugate
3.5. Karpas-299 cell stripping by conjugated γδ T
lymphocytes is immediate and sustained in the synapse
As the ␥␦–Karpas-299 model unravelled an association
between membrane capture and perforin release by the ␥␦ lymphocyte, we wondered whether this association also occurred
in the reciprocal direction of these synapses. Karpas-299 cells
however were rapidly killed once conjugated and could therefore not be used to address this question. COST is another
CD30+ perforin+ TCR− ALCL cell line that is also recognized
and strongly stripped by the same ␥␦ T cells [32,37]. By contrast however, COST expresses high levels of serpin A1 [38],
a potent inhibitor of granzyme/perforin-mediated lysis. Hence
COST is much less efficiently killed by ␥␦ T lymphocytes (not
shown), thereby providing an ideal model to answer the above
question. We therefore co-incubated COST cells with PKH67+
␥␦ T lymphocytes to evaluate transfer in the reverse direction
(“reciprocal activities”). ALCL cells, gated by their high SSC,
marginally nibbled the ␥␦ lymphocyte membranes: their mfi
increased from 3 to 20 after 1 h of co-incubation (Fig. 6A), corresponding to membrane transfers roughly 10 times lower than
in the reverse direction (not shown). This could have suggested
that COST cells were not activated in these conjugates. This
hypothesis was ruled out as co-incubation with ␥␦ T lymphocytes induced COST cells to strongly release their intracellular
perforin (Fig. 6B and C). However, 51 Cr-release assays from
labelled ␥␦ T cell targets indicated that they were not killed by
COST cells (No specific lysis at E:T 30:1, not shown). Thus
COST cells were activated upon binding to the ␥␦ lymphocytes,
but failed to nibble and kill the latter through massive perforin
release.
Imaging LysoTracker+ COST cells co-incubated with
calcein+ ␥␦ lymphocytes illustrated this defect. COST cells
made long-lasting synapses with ␥␦ lymphocytes and sustained
ALCL membrane struipping was then monitored at the level
of single cell conjugates through confocal microscopy. Cell
conjugates were selected and the evolution of PTIR-271 on
Karpas-299 cell membranes was plotted against time. This
approach revealed the rapid redistribution of the Karpas-299 cell
membrane at the synapse. In contrast with its stable distribution
before contact, 1 min after ␥␦ binding, PTIR-271 accumulated
in the synaptic membrane as it disappeared from other sites
(Fig. 5A). Small patches also appeared on the ␥␦ T cell surface
in non-successive snapshots, suggesting the discrete nature of
the transfer. Integration of the PTIR-271 signal at synaptic (␮1)
and opposite (␮2) membranes of the Karpas-299 cell quantified the rapid redistribution of this fluorochrome induced by
cell attachment (Fig. 5B). The follow-up of PTIR-271 label of
cell membrane in function of time demonstrated that rather than
an arbitrary result from positions of ␮1 and ␮2, the redistribution of the target cell membrane was global and consecutive
to contact with the ␥␦ lymphocyte. At the earliest time points
(0–7 min), these changes were too low however, to alter significantly the ␮1/␮2 ratio of the live target. Seven to 12 min later, a
strong ␮1/␮2 shift demonstrated that membrane accumulation
continued even though the target cell had died. Hence the lytic
␥␦ synapse persisted despite target cell destruction, sustaining
both granule exocytosis and membrane capture for nearly 25 min
(Fig. 5C).
Thus single cell imaging confirmed that membrane stripping
was rapidly triggered by ␥␦ cell conjugation and was sustained
even after target cell death.
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
49
Fig. 5. Kinetics of Karpas-299 stripping. (A) Distribution of PTIR-271 fluorescence at the cell membrane of a Karpas-299 cell in a conjugate with ␥␦ T CTL, as a
function of time after contact. (B) Integration of PTIR-271-fluorescence for the segment indicated in A, from the synaptic membrane (␮1) to its opposite side (␮2).
(C) Karpas-299 membrane stripping (quantified by the ␮1/␮2 ratio) and viability as a function of synapse duration.
their exocytosis of lytic granules. In five independent experiments however, we could not detect any single conjugated COST
cell with perforin exocytosis directed towards the synapse. This
defective polarisation can be visualised in the representative
sequence of snapshots shown in Fig. 6D. So the association
of membrane capture and perforin secretion was also observed
in the reverse direction of ␥␦–COST cell conjugates. In this
context however, reduced synaptic transfer was associated with
defective targeting of granule exocytosis.
4. Discussion
The model of in vitro interactions of ␥␦ T lymphocytes
and ALCL allowed us to investigate the relationship between
membrane capture and secretion of cytolytic granules. In this
model, we found that these two processes were associated.
Through the synapse of functional ␥␦ T lymphocytes, both
proceed efficiently. These were immediately initiated by ␥␦
TCR-mediated activation at cell contact, and persisted after
target cell death. In COST lymphoma however, reduced membrane capture was associated with a disorientated exocytosis
of granules. Altogether with the observation of membrane capture coordinated to granule secretion in synapses of ␥␦ T cells,
these results suggested that membrane transfer could possibly contribute to direct exocytosis towards the immunological
synapse.
The immunological synapse of human gamma delta lymphocytes concentrates activating receptors such as the ␥␦ TCR
50
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
Fig. 6. COST cells are defective for both synaptic transfer and orientation of perforin release. (A) COST cells strip weakly ␥␦ T lymphocytes. COST cells co-incubated
with PKH67+ ␥␦ T lymphocytes were gated using SSC and their PKH67 mfi are indicated. (B) Intracellular perforin stain of COST cells alone. (C) Perforin secretion
by COST cells as a function of ␥␦ T cell ratio. Results show % of perforin mfi relative to basal staining of COST cells alone. Data are from three experiments
performed in triplicate. (D) Sequence of snapshots depicting the sustained synapse of a COST cell with a ␥␦ T lymphocyte loaded with calcein (green). The secretion
of lytic granules (stained red with Lyso Tracker) from COST cells is never orientated towards the synapse, while the ␥␦ T lymphocyte remains viable.
and NKG2D [34]. Hence both receptors could mediate the
recognition of Karpas-299 cells, as these latter express the
ULBP2 and ULBP3 cell surface ligands (data not shown).
However, antibody blocking experiments ruled out a major
role for NKG2D-mediated interactions in the activation of ␥␦
lymphocyte responses. Recognition of Karpas-299 cells by ␥␦
T lymphocytes preferentially involved TCRV␥9+ . Although
recognition of the ALCL antigen was not the purpose of this
study, recent studies suggest that it could be non-peptide phosphoantigens or the mitochondrial ATP synthase found at the
surface of normal hepatocytes and some tumor cell lines [43].
Phosphoantigens are small metabolites from the mevalonate
pathway of cholesterol biosynthesis [44], the titration of which
is not yet possible in human cell samples [45]. This unconventional mode of antigen recognition is highly typical of innate-like
lymphocytes and enables the specific recognition of HLA class I
deficient Burkitt’s lymphoma Daudi cells [46] as well as a broad
array of human cancer cells [44,47,48]. Although surface HLA
class I deficiencies facilitate the recognition by TCRV␥9+ cells
[49–52], most ALCL tested including Karpas-299 and COST
cells expressed high levels of HLA class I molecules (data not
shown). Hence, Karpas-299 cells could harbour a strong antigenic stimulus for ␥␦ lymphocytes. It could be interesting to
establish the respective role of tumoral mevalonate pathway and
of ATP synthase in the ␥␦ T cell reactivity to ALCL.
The binding of ␥␦ T lymphocytes to ALCL cells was similar
to the lytic synapses of conventional CD8 ␣␤ CTL. In the latter case, membrane capture and secretion of cytotoxic granules
[2,53,54] respond to low amounts of activating ligands [31]. In
our experiments, conjugation of ␥␦ with ALCL cells led to strong
membrane transfers and cytotoxic activity. This was recently
found for cytolytic effector memory TCRV␥9+ lymphocytes that
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
were co-incubated with B-cell lymphoma [41]. The homophilic
␥␦–␥␦ contacts observed in our imaging experiments were fastdissociating with no granule recruitment, possibly due to the
fact that recognition of self-HLA class I protects against ␥␦ T
cell auto-reactivity [51,52]. In contrast, contact with Karpas-299
cells led to stable conjugates, secretion of lytic granules and target cell death within about 10 min. This was similar to killing
by ␣␤ CTL [40], but longer than antibody-induced killing by TALL cells [39]. The lytic ␥␦ IS were also very stable, as most ␥␦
T lymphocytes did not dissociate immediately from dead cells
to associate with other cell targets. The experiments depicted
here indicate that they therefore behave unfrequently like “serial
killers” with successive “on/off” conjugation–dissociation
sequences [55]. Much like CD8 ␣␤ CTL, they switched “on,
once and for all” their programme of lytic granule delivery at the synapse, to potentially kill other conjugated targets
[40].
This study stemmed from the hypothesis that the identification of a relationship between membrane capture and
perforin release within a lytic IS could provide information on
the physiological significance of synaptic transfer. We report
here a temporal association of both processes. As soon as the
conjugates were formed, TCR-mediated activation triggered
membrane stripping and granule exocytosis, both of which
persisted beyond target cell death. In the reverse situation of
␥␦–ALCL conjugates involving COST cells, this association
was demonstrated further by the concerted lack of reciprocal
stripping and of targeted exocytosis.
What could be the functional significance for stripping by ␥␦
lymphocytes?
The molecules captured upon transfer could sustain the
stimulatory signals required by CD4 lymphocytes to release
cytokines, once the conjugates are dissociated [26,31,56]. However, the activation threshold for cytokine release is above the
level required for perforin release [30]. Therefore, low amounts
of antigens that were insufficient to induce mature synapses and
cytokine release could still trigger spiky Ca+ signaling, transfer and cytotoxicity [31,53]. This work shows that in ␥␦ T cell
synapses, the release of perforin was triggered very early by
TCR activation, although the lytic IS was maintained for much
longer. We therefore favor the view that intercellular capture in
the lytic ␥␦ IS was probably not required for inducing activation,
but rather resulted from the latter.
Alternatively, membrane capture could be a “linking” process
by which the induced secretory response is correctly orientated towards the synapse that triggers the signaling cascade.
The findings presented in this report support this hypothesis
in two ways. In the ␥␦–Karpas-299 conjugates, trogocytosis
was intense and sustained, together with a correct addressing
of perform secretion to the synapse. In the reverse direction
of ␥␦–COST conjugates, although ALCL cells were triggered
to release perforin, their defective stripping did not adequately
orientate the perforin exocytosis to the synapse. In ␥␦–ALCL
conjugates, some rare instances of serial killing allowed us to
observe dissociating cells with transferred fragments. This situation resembled the capture of GFP-tagged MHC class II by CD4
T lymphocytes dissociating from conjugates [26]. We found here
51
that with ␥␦ T cells such patterns of capture were quite rare, and
mostly occurred between bound cells. Against all appearances
our observations were not contradictory for the following reasons. Firstly, PTIR-271 accumulation at the ␥␦ synapse occurred
similarly to the capture of GFP-MHC by CD4 [26]. The only
difference between these two models was that in the latter
study, conjugate dissociation–associations were faster and more
frequent. Secondly, the MHC-unrestricted lytic ␥␦ IS was triggered differently to the MHC class II-restricted stimulatory
CD4 IS.
Thus stripping and lytic activities of ␥␦ T lymphocytes
are tightly coordinated, warranting to investigate this association in lymphocytes from individuals with defective secretory
machinery.
Acknowledgements
This study was supported by grants from the Institut National
de la Santé Et de la Recherche Médicale and the Association
pour la Recherche sur le Cancer (contract # 3757, JJF). J.G and
A.W. received fellowships from the Ministère de l'Education
Nationale, de la Recherche et de la Technologie. We acknowledge B. Gray (PTIR Research Labs) for providing us with
PTIR-271, Sanofi-Synthélabo-Aventis for rhIL2, Innate Pharma
for Bromohydrin Pyrophosphate, E. Espinos and L. Lamant
for providing ALCL cell lines, C. Greenland for editing the
manuscript. We thank S. Valitutti and P. Brousset for stimulating
discussions on this work.
References
[1] Huang JF, Yang Y, Sepulveda H, Shi W, Hwang I, Peterson PA, et al. TCRmediated internalization of peptide-MHC complexes acquired by T cells.
Science 1999;286:952–4.
[2] Hudrisier D, Riond J, Mazarguil H, Gairin JE, Joly E. Cutting edge: CTLs
rapidly capture membrane fragments from target cells in a TCR signalingdependent manner. J Immunol 2001;166:3645–9.
[3] Marciano-Cabral F, Zoghby KL, Bradley SG. Cytopathic action of Naegleria fowleri amoebae on rat neuroblastoma target cells. J Protozool
1990;37:138–44.
[4] Joly E, Hudrisier D. What is trogocytosis and what is its purpose? Nat
Immunol 2003;4:815.
[5] Kedl RM, Schaefer BC, Kappler JW, Marrack P. T cells down-modulate
peptide-MHC complexes on APCs in vivo. Nat Immunol 2002;3:27–32.
[6] Beadling C, Slifka MK. Quantifying viable virus-specific T cells without
a priori knowledge of fine epitope specificity. Nat Med 2006;12:1208–12.
[7] Hudrisier D, Bongrand P. Intercellular transfer of antigen-presenting cell
determinants onto T cells: molecular mechanisms and biological significance. FASEB J 2002;16:477–86.
[8] Davis DM, Igakura T, McCann FE, Carlin LM, Andersson K, Vanherberghen B, et al. The protean immune cell synapse: a supramolecular
structure with many functions. Semin Immunol 2003;15:317–24.
[9] Poupot M, Gertner J, Fournié JJ. Molecular transfers through transient lymphoid cell–cell channels. In: Baluška F, Volkmann D, Barlow PW, editors.
Cell–cell channels. Landes Bioscience & Springer Verlag; 2006. p. 267–82.
[10] Undale AH, van den Elsen PJ, Celis E. Antigen-independent acquisition of MHC class II molecules by human T lymphocytes. Int Immunol
2004;16:1523–33.
[11] Espinosa E, Tabiasco J, Hudrisier D, Fournie JJ. Synaptic transfer by human
gamma delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol
2002;168:6336–43.
52
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
[12] Carlin LM, Eleme K, McCann FE, Davis DM. Intercellular transfer and supramolecular organization of human leukocyte antigen C at
inhibitory natural killer cell immune synapses. J Exp Med 2001;194:
1507–17.
[13] Tabiasco J, Espinosa E, Hudrisier D, Joly E, Fournie JJ, Vercellone A.
Active trans-synaptic capture of membrane fragments by natural killer cells.
Eur J Immunol 2002;32:1502–8.
[14] Vanherberghen B, Andersson K, Carlin LM, Nolte-’t Hoen EN, Williams
GS, Hoglund P, et al. Human and murine inhibitory natural killer cell receptors transfer from natural killer cells to target cells. Proc Natl Acad Sci USA
2004;101:16873–8.
[15] Poupot M, Fournie JJ. Spontaneous membrane transfer through homotypic
synapses between lymphoma cells. J Immunol 2003;171:2517–23.
[16] Levchenko A, Mehta BM, Niu X, Kang G, Villafania L, Way D, et al. Intercellular transfer of P-glycoprotein mediates acquired multidrug resistance
in tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:1933–8.
[17] Patel DM, Arnold PY, White GA, Nardella JP, Mannie MD. Class II MHC/
peptide complexes are released from APC and are acquired by T cell
responders during specific antigen recognition. J Immunol 1999;163:
5201–10.
[18] Zhang ZX, Yang L, Young KJ, DuTemple B, Zhang L. Identification of a
previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism
of suppression. Nat Med 2000;6:782–9.
[19] Tabiasco J, Vercellone A, Meggetto F, Hudrisier D, Brousset P, Fournie JJ.
Acquisition of viral receptor by NK cells through immunological synapse.
J Immunol 2003;170:5993–8.
[20] Mack M, Kleinschmidt A, Bruhl H, Klier C, Nelson PJ, Cihak J, et al.
Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membranederived microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency
virus 1 infection. Nat Med 2000;6:769–75.
[21] Brezinschek RI, Oppenheimer-Marks N, Lipsky PE. Activated T cells
acquire endothelial cell surface determinants during transendothelial
migration. J Immunol 1999;162:1677–84.
[22] Bourbie-Vaudaine S, Blanchard N, Hivroz C, Romeo PH. Dendritic
cells can turn CD4+ T lymphocytes into vascular endothelial growth
factor-carrying cells by intercellular neuropilin-1 transfer. J Immunol
2006;177:1460–9.
[23] Arnold PY, Mannie MD. Vesicles bearing MHC class II molecules mediate
transfer of antigen from antigen-presenting cells to CD4+ T cells. Eur J
Immunol 1999;29:1363–73.
[24] Hwang I, Huang JF, Kishimoto H, Brunmark A, Peterson PA, Jackson MR,
et al. T cells can use either T cell receptor or CD28 receptors to absorb and
internalize cell surface molecules derived from antigen-presenting cells. J
Exp Med 2000;191:1137–48.
[25] Utsugi-Kobukai S, Fujimaki H, Hotta C, Nakazawa M, Minami M. MHC
class I-mediated exogenous antigen presentation by exosomes secreted
from immature and mature bone marrow derived dendritic cells. Immunol
Lett 2003;89:125–31.
[26] Wetzel SA, McKeithan TW, Parker DC. Peptide-specific intercellular transfer of MHC class II to CD4+ T cells directly from the immunological
synapse upon cellular dissociation. J Immunol 2005;174:80–9.
[27] Stinchcombe JC, Griffiths GM. The role of the secretory immunological
synapse in killing by CD8+ CTL. Semin Immunol 2003;15:301–5.
[28] Hwang I, Sprent J. Role of the actin cytoskeleton in T cell absorption and
internalization of ligands from APC. J Immunol 2001;166:5099–107.
[29] Batista FD, Iber D, Neuberger MS. B cells acquire antigen from target cells
after synapse formation. Nature 2001;411:489–94.
[30] Valitutti S, Muller S, Dessing M, Lanzavecchia A. Different responses are
elicited in cytotoxic T lymphocytes by different levels of T cell receptor
occupancy. J Exp Med 1996;183:1917–21.
[31] Hudrisier D, Riond J, Garidou L, Duthoit C, Joly E. T cell activation correlates with an increased proportion of antigen among the materials acquired
from target cells. Eur J Immunol 2005;35:2284–94.
[32] Poupot M, Pont F, Fournie JJ. Profiling blood lymphocyte interactions with
cancer cells uncovers the innate reactivity of human gamma delta T cells
to anaplastic large cell lymphoma. J Immunol 2005;174:1717–22.
[33] Poupot M, Fournie JJ. Non-peptide antigens activating human
Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes. Immunol Lett 2004;95:129–38.
[34] Favier B, Espinosa E, Tabiasco J, Dos Santos C, Bonneville M, Valitutti S, et al. Uncoupling between immunological synapse formation and
functional outcome in human gamma delta T lymphocytes. J Immunol
2003;171:5027–33.
[35] Pulford K, Morris SW, Mason DY. Anaplastic lymphoma kinase proteins
and malignancy. Curr Opin Hematol 2001;8:231–6.
[36] Fischer P, Nacheva E, Mason DY, Sherrington PD, Hoyle C, Hayhoe FG,
et al. A Ki-1 (CD30)-positive human cell line (Karpas 299) established
from a high-grade non-Hodgkin’s lymphoma, showing a 2;5 translocation and rearrangement of the T-cell receptor beta-chain gene. Blood
1988;72:234–40.
[37] Lamant L, Espinos E, Duplantier M, Dastugue N, Robert A, Allouche
M, et al. Establishment of a novel anaplastic large-cell lymphoma-cell
line (COST) from a ‘small-cell variant’ of ALCL. Leukemia 2004;18:
1693–8.
[38] Duplantier MM, Lamant L, Sabourdy F, de Reynies A, Delsol G, Espinos
E. Serpin A1 is overexpressed in ALK(+) anaplastic large cell lymphoma
and its expression correlates with extranodal dissemination. Leukemia;
2006.
[39] Lyubchenko TA, Wurth GA, Zweifach A. Role of calcium influx in cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis during target cell killing.
Immunity 2001;15:847–59.
[40] Wiedemann A, Depoil D, Faroudi M, Valitutti S. Cytotoxic T lymphocytes kill multiple targets simultaneously via spatiotemporal uncoupling
of lytic and stimulatory synapses. Proc Natl Acad Sci USA 2006;103:
10985–90.
[41] Angelini DF, Borsellino G, Poupot M, Diamantini A, Poupot R,
Bernardi G, et al. FcgammaRIII discriminates between two subsets of
Vgamma9Vdelta2 effector cells with different responses and activation
pathways. Blood 2004;104:1801–7.
[42] Sicard H, Al Saati T, Delsol G, Fournie JJ. Synthetic phosphoantigens
enhance human Vgamma9Vdelta2 T lymphocytes killing of non-Hodgkin’s
B lymphoma. Mol Med 2001;7:711–22.
[43] Scotet E, Martinez LO, Grant E, Barbaras R, Jeno P, Guiraud M, et al. Tumor
recognition following Vgamma9Vdelta2 T cell receptor interactions with
a surface Fl-ATPase-related structure and apolipoprotein A–I. Immunity
2005;22:71–80.
[44] Gober HJ, Kistowska M, Angman L, Jeno P, Mori L, De Libero G. Human T
cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med 2003;197:163–8.
[45] Pont F, Luciani B, Belmant C, Fournie JJ. Characterization of phosphoantigens by high-performance anion-exchange chromatography-electrospray
ionization ion trap mass spectrometry and nanoelectrospray ionization ion
trap mass spectrometry. Anal Chem 2001;73:3562–9.
[46] Fisch P, Oettel K, Fudim N, Surfus JE, Malkovsky M, Sondel PM. MHCunrestricted cytotoxic and proliferative responses of two distinct human
gamma/delta T cell subsets to Daudi cells. J Immunol 1992;148:2315–23.
[47] Kunzmann V, Wilhelm M. Anti-lymphoma effect of gammadelta T cells.
Leuk Lymphoma 2005;46:671–80.
[48] Kabelitz D, Wesch D, Pitters E, Zoller M. Potential of human gammadelta
T lymphocytes for immunotherapy of cancer. Int J Cancer 2004;112:
727–32.
[49] Poccia F, Cipriani B, Vendetti S, Colizzi V, Poquet Y, Battistini L, et al.
CD94/NKG2 inhibitory receptor complex modulates both anti-viral and
anti-tumoral responses of polyclonal phosphoantigen-reactive V gamma
9V delta 2 T lymphocytes. J Immunol 1997;159:6009–17.
[50] Fisch P, Meuer E, Pende D, Rothenfusser S, Viale O, Kock S, et al. Control of B cell lymphoma recognition via natural killer inhibitory receptors
implies a role for human Vgamma9/Vdelta2 T cells in tumor immunity.
Eur J Immunol 1997;27:3368–79.
[51] Carena I, Shamshiev A, Donda A, Colonna M, Libero GD. Major histocompatibility complex class I molecules modulate activation threshold
and early signaling of T cell antigen receptor-gamma/delta stimulated by
nonpeptidic ligands. J Exp Med 1997;186:1769–74.
[52] Halary F, Peyrat MA, Champagne E, Lopez-Botet M, Moretta A, Moretta L,
et al. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma
delta T cell receptors by natural killer inhibitory receptors. Eur J Immunol
1997;27:2812–21.
J. Gertner et al. / Immunology Letters 110 (2007) 42–53
[53] Faroudi M, Utzny C, Salio M, Cerundolo V, Guiraud M, Muller S, et
al. Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell
interaction: manifestation of a dual activation threshold. Proc Natl Acad
Sci USA 2003;100:14145–50.
[54] Stinchcombe JC, Bossi G, Booth S, Griffiths GM. The immunological
synapse of CTL contains a secretory domain and membrane bridges. Immunity 2001;15:751–61.
53
[55] Isaaz S, Baetz K, Olsen K, Podack E, Griffiths GM. Serial killing by cytotoxic T lymphocytes: T cell receptor triggers degranulation, re-filling of
the lytic granules and secretion of lytic proteins via a non-granule pathway.
Eur J Immunol 1995;25:1071–9.
[56] Valitutti S, Dessing M, Aktories K, Gallati H, Lanzavecchia A. Sustained
signaling leading to T cell activation results from prolonged T cell receptor
occupancy. Role of T cell actin cytoskeleton. J Exp Med 1995;181:577–84.
Ainsi l’ensemble de ces observations suggère d’abord que la trogocytose n’est pas
requise pour l’activation des lymphocytes T Vγ9Vδ2, mais plutôt une conséquence de cette
dernière. Ensuite chez les cellules T Vγ9Vδ2 cytolytiques la capture des fragments de
membrane et la sécrétion orientée de granules lytiques sont deux activités coordonnées
simultanément à travers la synapse immunologique lytique. Sur la base de ces données nous
avons proposé un schéma de « trogocytose associée au relargage de perforine dans la
synapse lytique » (Figure 22).
Figure 22 : La trogocytose associée au relargage de perforine dans la synapse lytique. Avant le contact cellulaire
(étape 1) les granules lytiques marquées à l’aide du lysotraker sont uniformément réparties dans le cytoplasme
du lymphocyte T γδ (grains rouges). Très rapidemment après le contact cellulaire (étape 2), les lymphocytes T γδ
capturent des morceaux de membrane marquées (en bleu) de leur cellule cible dont le cytoplasme est colorisé
(vert) (étape 3). Cette trogocytose est associée à la polarisation des granules lytiques du lymphocyte Tgd (étape
4) puis à la mort de la cellule cible (étape 5).
Les conséquences fonctionnelles de cette séquence sont multiples. Les molécules
capturées par transfert synaptique pourraient soutenir les signaux stimulateurs et/ou permettre
d’orienter correctement les granules cytolytiques à la synapse.
106
Publication #2: Lipophile fluorochrome trackers for membrane transfers between immune
cells. Julie Gertner-Dardenne, Mary Poupot and Jean Jacques Fournié, Immunol.
Invest. (in press)
Le transfert intercellulaire (ou trogocytose) de protéines de surface cellulaire est un
phénomène commun à plusieurs types de cellules immunes. Il est donc maintenant considéré
comme important pour la biologie de ces cellules (pour revue voir
281
). Cette mini-revue
décrit notre méthode analytique et les principales caractéristiques de ce phénomène. Plusieurs
documents de cette publications sont des séquences de vidéomicroscopie, et ne peuvent etre
présentées dans ce manuscript.
2. Deuxième partie : étude de combinaisons de PAg et
d’anticorps monoclonaux à usage thérapeutique.
De nombreux anticorps monoclonaux (mAb) thérapeutiques doivent leur bioactivité à
leur capacité d’induire la déplétion sélective de cellules cibles telles que les cellules
cancéreuses.
Le mode d'action des mAb thérapeutiques in vivo implique les mécanismes de
cytotoxicité cellulaire dépendante de l’anticorps (ADCC), de cytotoxicité dépendante du
complément (CDC), ainsi que l'induction d'apoptose directe. Des trois mécanismes
moléculaires d’action des mAb thérapeutiques, on s’intéressera tout particulièrement à
l’ADCC par laquelle les cellules cibles reconnues par le mAb se fixent aux lymphocytes
tueurs et détruites par leur activité lytique. Donc le nombre et l'activation des lymphocytes
tueurs médiateurs d’ADCC sont deux paramètres cruciaux pour l'efficacité de tout mAb
thérapeutique.
Les lymphocytes T γδ (T Vγ9Vδ2) sont faiblement représentés dans le sang circulant
humain mais peuvent proliférer et médier l’ADCC de cellules tumorales. De plus, ils peuvent
être activés sélectivement par des agonistes tels que les PAg naturels dérivés de tumeurs ou de
microbes voire par des agonistes synthétiques tels que Phosphostim® ou Picostim®, entre
autres.
Nous montrons ici que l'efficacité des mAb utilisés dans plusieurs thérapies
anticancéreuses impliquant l’ADCC, peut dans certains cas être accrue par l'adjonction de
PAg synthétiques.
107
Downloaded By: [Fournié, Jean-Jacques] At: 09:02 7 January 2008
Immunological Investigations, 36:665–685, 2007
Copyright © Informa Healthcare USA, Inc.
ISSN: 0882-0139 print / 1532-4311 online
DOI: 10.1080/08820130701674646
Lipophilic Fluorochrome
Trackers of Membrane
Transfers between Immune
Cells
1532-4311
0882-0139
LIMM
Immunological
Investigations,
Investigations Vol. 36, No. 5-6, Sep 2007: pp. 0–0
Tracking
J.
GertnerIntercellular
et al.
Transfers
Julie Gertner-Dardenne,1,* Mary Poupot,1,* Brian Gray,2
and Jean-Jacques Fournié1
1
Innate Immunity, Malignant Hemopathies and Cancer Immunity, Dept of Oncology,
Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale Unit 563, BP 3128, Hospital
Purpan, Toulouse, Cedex, France
2
PTI Research Inc., Exton, Pennsylvania, USA
Cell-to-cell transfers of membrane molecules between lymphoid cells (sometimes
referred to as trogocytosis) is frequent and has multiple physiological consequences.
Although difficult to visualize through the tracking of defined cell surface proteins, this
process can be readily monitored by inserting PKH or CellVue Maroon fluorochromes
into the plasma membranes of donor cells. We discuss here parameters that determine
its detection by a flow-cytometry-based in vitro assay and present examples of application, including time-lapse video-microscopy analysis of transfers at the immunological
synapse. By combining detection of cell-to-cell transfer and of cell surface CD107, it is
possible to discriminate lymphoid cells binding target cells with and without perforin
release. This could prove useful for identifying cells that destruct known target cells in
autoimmune pathologies.
[Supplementary materials are available for this article. Go to the publisher’s online
edition of Immunological Investigations for the following free supplemental resources:
movie files of Suppl Data 1 CellVue Maroon Synaptic Transfers, Suppl Data 2 Synaptic
redistribution of CellVue Maroon, Suppl Data 3 lytic synapse and Suppl Data 4 Serial
killer in action and jpeg of Suppl Data 5 Intensity of PKH67-transfer detection]
Keywords
Fluorescent trackers, membrane, lymphocytes, flow cytometry, confocal
microscopy.
*Both authors contributed equally to this work.
Address correspondence to Jean-Jacques Fournié, INSERM Unit 563, BP 3128,
Hopital Purpan, 31024 Toulouse, Cedex 03, France; E-mail: fournie@toulouse.
inserm.fr
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J. Gertner-Dardenne et al.
INTRODUCTION
Although cells are usually considered as entities with relatively stable phenotypes, some physiological processes are now known that may lead to expression of unexpected cell surface markers by other well-defined cell types.
Fascinating examples of these are provided by immune cells, which are able to
transiently express on their surface some lineage markers that they are typically unable to produce upon differentiation. Among these are the expression
of membrane-bound immunoglobulin (sIg), of non-self antigen (Ag), or of
allogeneic MHC class II molecules on some T lymphocyte’s surface. In immune
cells, it is now known that ectopic markers are frequently acquired upon intercellular transfers occurring at immunological synapses. Immunological synapses (IS) are supramolecular interfaces of immune cells in contact, which
enable both recognition of antigens on target cells and delivery of immunological responses from the effector lymphocytes, such as release of Ig, of cytokines
or of cytolytic granules.
To operate optimally, these activities require that cell membranes from
both cell types are brought together in very close vicinity. This dense
membrane environment enables direct transfers of integral membrane
patches from one cell to the other, and thus to acquisition of new, exogenous
protein markers. Reminiscent of the cell nibbling by cytopathogenic amoeba
(Marciano-Cabral et al., 1990), this synaptic transfer was successively
referred to as “stripping (Kedl et al., 2002), “trogocytosis” (Joly and Hudrisier,
2003) and “trapping” (Beadling and Slifka, 2006).
How synaptic transfer operates is unclear: it could indirectly involve exosomes secreted from APC and readsorbed by conjugated lymphocytes (Arnold
and Mannie, 1999; Hwang et al., 2000; Utsugi-Kobukai et al., 2003; Undale
et al., 2004). However, this transfer is dependent upon fully active signal
transduction and requires cytoskeleton remodeling as inhibitors of activation
or cytoskeleton efficiently block trogocytosis (Huang et al., 1999; Batista et al.,
2001; Hwang and Sprent, 2001; Espinosa et al., 2002). Indeed, membrane
fragments could also be sheared from target cells upon conjugate dissociation
(Wetzel et al., 2005), which implies that transfer is almost a post-synaptic consequence. In agreement with this possibility, the transfers between NK and
target cells are bidirectionnal implying that both cells are bound (Vanherberghen
et al., 2004). It was found that, lytic immunological synapses between cytotoxic
T cells and their targets comprise membrane bridges and fusion microdomains (Clark et al., 2003), so bridges could enable lateral diffusion of protein markers from one cell to the other and hence trogocytosis.
Intercellular transfers of cell surface proteins are common between most
types of immune cells and are now considered important for their biology
(Davis, 2007). Although the role and physiological relevance of intercellular
transfers are beyond the scope of this paper, such investigations require the
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Tracking Intercellular Transfers
availability of a suitable analytical method for their detection and quantitation. Here we show the use of membrane–inserting dyes such as PKH or CellVue Maroon for a flow-cytometry-based assay of trogocytosis and we present
methodological variations for the simultaneous detection of cytolytic lymphocytes.
MATERIALS AND METHODS
Reagents
The PKH67 lipophilic fluorochrome and C18 RP-HPLC silica beads were
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) and PKH67 was used for cell labelling
according to supplier’s procedures. IgG isotype controls, PE-conjugated antiKi-1 and anti-CD107a reagents were from Beckman-Coulter-Immunotech
(Marseille, France). Calcein Green AM and LysoTracker Red DND 99 were
from Molecular Probes (Cergy Pontoise, France); CellVue Maroon was from
PTI Research, Inc (Exton, PA, USA). BrHPP was from Innate Pharma
(Marseilles, France).
Cell Culture and Flow Cytometry-Based Measure
of Synaptic Transfer
PBMCs were isolated from fresh blood samples using Leucosep tubes
(Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany) and cultured in vitro for 2 weeks
(1.5x106/ml) in complete RPMI 1640 medium supplemented with 10% heatinactivated fetal calf serum (FCS) (Invitrogen, San Diego, CA). Karpas-299
anaplastic large cell lymphoma target cells were kept between 0.5–1x106
cells/ml in the same culture medium supplemented with 15% FCS. Pure NK
cells were obtained by negative selection from PBMC using MACS on LS separating column (NK cell isolation kit II, Miltenyi Biotec).When specified, polyclonal T cell lines (98% of cytolytic TCR γδ+,CD3+cells) were raised by in vitro
stimulation with phosphoantigen (100 nM BrHPP) and 3 weeks of culture in
IL2-supplemented complete RPMI 1640 culture medium. The flow cytometrybased synaptic transfer assays were performed using a 1:2 cell ratio of lymphocytes:PKH67-stained targets as described (Poupot et al., 2005). Briefly,
5×106 pelleted cells were stained for 5 min. at room temperature in the dark
with 500 μl of PKH67 (1 μM final conc.) in Diluent C (Sigma Aldrich), the
staining was stopped by adding 500 μl of FCS and cells were washed three
times by mild centrifugation in complete culture medium. For flow cytometry
2×105 PBMCs were washed in PBS and incubated at 4°C for 20 minutes with
the specified mAb conjugates diluted in PBS supplemented with 5% FCS. At
least 50,000 ungated events were collected per experiment and analysed on an
LSR-II (Becton Dickinson) using the Diva software (BD Biosciences, Mountain
View, CA) or WinMDI (http://fcs.scripps.edu) when specified. In the specified
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J. Gertner-Dardenne et al.
samples, mfi was defined as the geometric mean of fluorescence intensity for
the gated cells. PKH67 was monitored as FL1 in conjunction with other
fluorochromes set for monitoring on FL2 and FL3 channels.
Time-Lapse Confocal Microscopy
Karpas-299 cells were stained with Calcein AM (Molecular Probes) and
with CellVue Maroon membrane dye (PTIR Res. Labs), according to the manufacturer’s instructions. Briefly, 5×106 cells were stained for 5 min. at room temperature in the dark with 500 μl of CellVue Maroon or PKH67 diluted 1 μM in
Diluent C (Sigma Aldrich), the staining was stopped by adding 500 μl of FCS
and cells were washed three times by mild centrifugation in complete culture
medium. Cells were then plated on Lab-Tek chambered coverglass (VWR) previously coated with poly-D-Lysine hydrobromide (Sigma Aldrich), and incubated at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. The cytolytic T cells were stained with
LysoTracker Red (Molecular Probes) and were added to the chambers after
adhesion of Karpas-299 cells. Lyso Tracker Red labels acidic intracellular
structures such as lytic CTL granules without affecting the kinetics of their
release (Lyubchenko et al., 2001; Faroudi et al., 2003; Wiedemann et al., 2006).
Time-lapse confocal microscopy was performed by acquiring pseudocolour
images at a rate of 1 every / 8 seconds for sequences of 2 hours as described.
Fluorescence measurements were done on a LSM-510 confocal microscope
(Zeiss, Iena Germany) at 37°C and 5% CO2 in air atmosphere. The Calcein
probe was excited with a 488 nm laser line and its emission was recorded at
525 nm using a 40 nm bandpass filter. The Lyso Tracker Red probe was
excited with a 543 nm laser line and its emission was recorded at 600 nm
using a 80 nm bandpass filter. The far red CellVue Maroon probe was excited
with a 633 nm laser line and its emission was recorded at 700 nm using a 100 nm
bandpass filter. Image sequences of the time-lapse recordings were processed
as described (Gertner et al., 2007). RGB images show green for calcein (viability), blue for CellVue Maroon (membrane transfer) and red for acidic granules
(perforin release).
Single Cell Analysis of Tracker Distribution in Labelled Cells
The effects of synapse formation and synaptic membrane transfer of
tracker dye was analysed at the single-cell level by monitoring the distribution
of CellVue Maroon fluorescence as a function of time on a whole Karpas-299
cell. In these time-lapse experiments, each bmp file of successive images of a
gated Karpas-299 cell was respectively converted to a corresponding 3D-plot
with the Image J 1.36b freeware (http://rsb.info.nih.gov/ij/). These plots comprised x, y as pixel coordinates and z as CellVue Maroon fluorescence intensity. The resulting sequence of successive 3D plots showed the evolution of cell
membrane labelling with CellVue Maroon as a function of time.
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Tracking Intercellular Transfers
RESULTS
Cell Surface Protein Markers Provide Good Specificity
but Low Sensitivity for Tracking Intercellular Transfer
between Lymphocytes
When co-incubated with human cancer cell lines, lymphocytes from normal human donors are able to bind to these cells and acquire surface markers
characteristic of these cell lines.
For example, normal blood lymphocytes co-incubated in vitro for one hour
with the anaplastic lymphoma cell line (ALCL) Karpas-299 progressively
expressed a small level of the Reed-Sternberg’s ALCL cell marker Ki-1 at
their cell surface. This transfer between conjugated lymphocytes could be
detected by labelling the whole cell co-culture after 0 and 60 minutes of coincubation with a Ki-1-specific Mab-fluorescein conjugate and flow cytometric
analysis of Ki-1 expression. Blood-derived lymphocytes were gated on the
basis of morphology (FSC, SSC). After 60 minutes, their mean fluorescence
intensity (mfi) for Ki-1 increased to 11.8 as compared to their mfi of 5.1 after 0
minutes of co-culture or to the mfi of 5.0 for labelling with a control isotype
reagent (Figure 1).
This simple analytical method enabled us to track the intercellular transfer of Ki-1 protein from co-incubated ALCL. Although of good specificity however, this approach based on detecting protein transfers has a low sensitivity.
We found from several independent experiments that on average, trogocytosis
led to transfer of low amounts (0.1–1%) of the donor’s cell surface markers
(Tabiasco et al., 2002, 2003; Poupot et al., 2006), so the sensitivity of this
detection method depends strongly upon the level of expression of the tracked
protein on the lymphoma cell.
Membrane-Inserting PKH Dyes Enhance Detection of Membrane
Transfers between Lymphocytes
Although normal lymphocytes were induced to weak trogocytosis by
exposure to allogeneic ALCL cells, the low abundance of the Ki-1 protein
markers on ALCL cells limited our ability to detect it based on surface
marker transfer. Therefore, by general labelling ALCL cells with a stable
membrane-inserting fluorochrome such as PKH67, their much brighter fluorescence was expected to enhance the detection of intercellular membrane
transfers in these co-incubations. Accordingly, unstained normal lymphocytes
were co-incubated at a 1-to-1 cell ratio with PKH67-labelled Karpas-299 cells
for either 0 or 60 minutes and assayed by flow cytometry for PKH67 fluorescence. Although in this case, light scatter gating was unnecessary because
FSC/SSC enabled us to discriminate unambiguously normal lymphocytes from
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J. Gertner-Dardenne et al.
0 min. co-incubation:
mfi isotype = 5.0
0 min. co-incubation:
mfi Ki-1 = 5.1
60 min. co-incubation:
mfi Ki-1 = 11.8
Ki-1
Figure 1: Cell-to-cell transfer of the lymphoma protein marker Ki-1 to normal lymphocytes. The
Anaplastic Large Cell Lymphoma Karpas-299 cell line expresses the Ki-1 cell marker (detected
by anti-CD30 mAb-phycoerythrin conjugate). Blood-derived polyclonal γδ T lymphocytes
were co-incubated for 0 min (middle panel) or 60 min (bottom panel) with Karpas-299 cells at
a 1:1 cell ratio, and the geometric mfi for the Ki-1 marker on the surface of γδ lymphocytes
(gated on the basis of FSC, SSC) is specified in each conditions, with non-specific staining with
isotype-matched Ig control shown in the top panel.
Karpas-299 (Figure 2, top), the PKH67 fluorescence of these two cells types were
highly different at either timepoints of co-incubation (Figure 2, bottom).
After 1 hour of co-incubation, the PKH67 fluorescence of normal lymphocytes increased, whereas that of Karpas-299 did not change. This was
expected as a small increase of fluorescence from negative cells was far more
detectable than a low decrease from brightly labelled ones. As compared to the
PKH67+
targets
SSC
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Tracking Intercellular Transfers
PBMC
FSC
targets
PBMC
t 0′
t 60 ′
100
101
102
103
104
PKH67
Figure 2: Co-incubation of normal lymphocytes with PKH67-labelled lymphoma cells labelled
with PKH67 demonstrates cell-to-cell membrane transfer. The Karpas-299 cell line stained with
PKH67 and co-incubated at a 1:1 cell ratio with the above described gd T lymphocytes were
analysed by flow cytometry. PBMC and effector cells were clearly resolved using either FSC/
SSC parameters (top panel) or PKH67 fluorescence intensity (t 0’ histogram in lower panel).
Comparing all cells after 0 min and 60 min of co-incubation demonstrates clearcut increase
of PKH67 fluorescence on lymphocytes without detectable decrease of Karpas-299 cell
fluorescence (bottom panel).
transfer of Ki-1 depicted previously (Figure 1), transfer of the PKH67 tracker
appeared more clearly (Figure 2, bottom: PKH67 mfi=5 at 0 minutes versus
PKH67 mfi=45 at 60 minutes): for example there was a 2.3- (11.8 /5.1) fold
increase using Ki-1 and a 9- (45/5) fold increase with PKH67. Dual monitoring
of both PKH67 and of various cell membrane markers in several distinct cell
types have previously shown that such intercellular transfers are not just
transfers of dye but rather involve integral patches of cell membrane, but not
cytosol material (Hudrisier et al., 2001; Tabiasco et al., 2002; Poupot and
Fournie, 2003; Tabiasco et al., 2003; Poupot et al., 2005).
Additional experimental data such as trogocytosis blockade by selective
inhibitors of lymphocyte activation strengthen further this conclusion (see
next). Furthermore, rather than suggesting these intercellular transfers
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J. Gertner-Dardenne et al.
involved PKH67 more selectively than the Ki-1protein, these results illustrate
the advantage of using a bright membrane tracker to optimize detection of
trogocytosis. Similar conclusions could be reached by using other membrane
intercalating fluorochromes such as PKH26 with other cell lines (Poupot and
Fournie, 2003; Poupot et al., 2006) or CellVue Maroon (Gertner et al., 2007
and see later).
Membrane-Inserting CellVue Maroon for Visualisation of
Intercellular Transfers by Confocal Video-Microscopy
As the transferred lipophile PKH67 fluorochrome was not a normal lipid
component of the ALCL cell membrane, its transfer in the previous experiment demonstrated trogocytosis was not selectively restricted to the Ki-1 protein. To provide even further sensitivity for single cell imaging studies, we
therefore labelled the ALCL cells with the new tracker CellVue Maroon, a lipidic carbocyanine derivative with stable membrane intercalating properties,
high extinction coefficient (216,700 M-1cm-1) and emission in the far red
region of the spectrum where cell auto-fluorescence is minimal. A polyclonal
cell line of T lymphocytes expressing TCRγδ and highly cytolytic for ALCL cell
lines was raised as described (Gertner et al., 2007). The labelled ALCL were
then co-incubated with unlabeled cytolytic T lymphocytes (98% pure γδT cells,
see Materials and Methods section) in 37°C chambers perfused with 5% CO2-in
air and were visualized by time-lapse confocal microscopy. In further concordance with the above-mentioned flow cytometry results, the video sequences
showed the active and rapid capture of large patches of fluorescent ALCL
membrane (shown with blue colour) by most of the transiently synapsed T
lymphocytes (see Suppl data 1 CellVue Maroon synaptic transfers.mov). By
digitizing the fluorescence signal from a confocal microscopy sequence of
related images, we could monitor the stability and cell distribution of the CellVue Maroon tracker in the immunological synapse of an ALCL and a cytolytic
T lymphocyte. The resulting sequence of 3D plots shows the cell distribution of
this tracker was mostly stable and rather uniform at the ALCL membranes
prior to contact with the lytic lymphocyte. Upon this contact, however, this
CellVue Maroon distribution was deeply affected and was progressively relocalized at the immunological synapse and further on the conjugated cell, as
demonstrated by the rapid movements of tracker patches (see supplemental
data 2 Synaptic Redistribution of CellVue Maroon.mov).
Flow-Cytometer Parameters Affecting Quantitation of
Intercellular Transfers in Flow Cytometry-Based Assay
Since we defined the measure of trogocytosis as the increase of mean cell
fluorescence intensity between 0 and 60 minutes of co-incubation, this type of
value depends upon the scale of fluorescence intensity used by the flow
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Tracking Intercellular Transfers
cytometer’s software. According to the software, the same parameter might be
converted into different values over log-scale ranges of either four or five
decades. Indeed for example, BD’s Diva uses 5 decades of log-scale fluorescence ranges whereas CellQuest or WinMDI use only 4 decades. We analysed
the synaptic transfer from a PKH67-labelled Burkitt’s lymphoma cell line to
normal blood lymphocytes and obtained trogocytosis results of different intensities from the same experiment when the raw fluorescence data were processed with either WinMDI or Diva. Using WinMDI, the PKH67 mfi=6 at 0
minutes versus PKH67 mfi=90 at 60 minutes, while PKH67 mfi=170 at 0
minutes versus PKH67 mfi=4800 at 60 minutes using Diva (supplemental
data 6). Such data also depended upon flow cytometer acquisition settings and
the size of target cells, as larger cells comprise more membrane fluorochromes.
Such features require that intra- and inter laboratory comparisons of
trogocytosis experiments based on flow cytometry must not only use similar
hardware, software and settings, but also standardized operating procedures.
In this objective we are currently assessing whether the use of beads with calibrated number of molecules of equivalent soluble fluorochrome units (MESF)
will enable to convert the mean fluorescence intensity values into mean number of trogocytosed molecules per cell (Schwartz et al. 1998). This approach is
expected to produce standard trogocytosis curves that could help normalizing,
via transferred MESF units, the MFI obtained on one instrument with
another instrument. In addition, as long as the type of relation (e.g., linear
proportion, log-fold increase, complex function) between change of mfi and
number of transferred molecules is not determined, it is difficult to decide how
to best quantitate trogocytosis. Once the standard trogocytosis curves are
available, it will be possible to determine what type of measure could best correspond to trogocytosis units: normalized % increase, absolute number difference,
transfer rate in molecules per cell per minute, inter alia.
Cell Parameters Affecting Extent of Transfer
In addition to flow cytometer settings, other parameters at the cell level
are highly relevant for the intensity of intercellular transfers. As described
elsewhere (Hudrisier et al., 2001; Espinosa et al., 2002; Tabiasco et al., 2002;
Poupot and Fournie, 2003; Hudrisier et al., 2005), cell-to-cell ratio, co-incubation
time and pre-activation (see scheme in Figure 3) are major determinants of this
bioactivity. Since intercellular transfer only takes place between conjugated
cells, the duration of their cell contact, and therefore of the whole co-incubation
time has a major influence on trogocytosis assays.
We found that pelleting together both cell types in U-bottom culture wells
by mild centrifugation and their immediate dissociation for cell fluorescence
measures constituted a suitable “time 0” control. Without cell centrifugation,
this control gave lower fluorescences that were unrelated to the co-incubation
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stimulated
Intensity of Intercellular transfer
(difference of PKH67 mfi for effector cells before and after co-incubation)
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unstimulated
0
20
40
60
120
Co-incubation time (min.)
None –9
–7
–5
–3
Antigen concentration (log M)
10
1
0.1
Effector : Target-cell Ratio
Figure 3: Scheme summarizing how some experimental settings influence the trogocytosis flow
cytometry assays. The “intensity of intercellular transfer” which corresponds to the increase of
PKH67 mfi on effector (recipient) cells during the 1 hour co-incubation is affected by either of
cell co-incubation-time, lymphocyte pre-activation status, antigen concentration and recipient
(effector)-to-donor (target) ratio.
conditions. Accordingly, the fluorescence acquired by intercellular transfer
increases with duration of cell co-incubation time. From several separate
experiments of intercellular transfers we found maximal values were recorded
after 1 hour of cell co-incubation.
Furthermore, the kinetics of transfer were different according to preactivation of lymphocytes. In presence of the same type of PKH67+ donor cell,
both onset and maximal intensity of captured fluorescence were higher with
activated lymphocytes than with resting ones. Along this line, lymphocytes
acquired more fluorescence when exogenously activated by stimuli of increasing strength, such as increasing concentrations of a soluble stimulus (BrHPP
phosphoantigen for human γδ T cells, Figure 3) or similar concentrations of
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Tracking Intercellular Transfers
stronger phosphoantigen agonists (Figure 3). This feature has been used earlier to compare the potency of various phosphorylated agonists for human γδ
lymphocytes (Espinosa et al., 2002). The role of lymphocyte activation in
transfer was already established, and was best evidenced with autoreactive
lymphocytes, where homotypic trogocytosis is constitutive, but fully stopped by
adding protein kinase inhibitors to the milieu (Poupot and Fournie, 2003).
The ratio of recipient cells versus donor cells introduced in co-incubation
wells also plays an important role on this assay. Decreasing the number of cell
effectors (recipients) per target (donor) cell in the co-incubation step increased
their fluorescence (Figure 3). In seeming contrast to the Effector-to-Target cell
titrations of cytolytic activities (51Cr-release), this increase reflected the
increased availability of fluorescence donors per effector (recipient) cell on
which fluorescence is measured. Along the same line, larger fluorescencedonor cells tended to transfer more fluorescence to recipient cells, presumably
thanks to their larger reservoir of fluorescent trackers.
Lack of Synaptic Transfers from Synthetic PKH67+ Beads
Since activation of lymphocytes increased their trogocytosis activity, intercellular transfer could be a measure for activation. So we attempted to use flow
cytometry-based trogocytosis assays in presence of exogenous stimuli to measure
and compare the extent of lymphocyte activation. To standardize these tests, we
used synthetic mimics of cells rather than live cells as fluorescence donors. By
having a standardized target, this approach was expected to enable us to compare effector cells of different types, states of activation, activating stimuli, etc.
Thus, HPLC-designed silica beads covered with C18 aliphatic chains were
stained by the same protocol as live cells to insert the PKH67 fluorochrome in
their lipidic surface. Accordingly, the C18 microbeads could be easily detected by
flow cytometry and were fluorescent once incubated with PKH67 (Figure 4A).
We then co-incubated these PKH67+ beads for 0 and 60 minutes with a bulk
culture of unseparated blood-derived lymphocytes in the presence of additional
T-cell stimuli including mitogens, anti-TCR mAb or PHA, phosphoantigens, IL2
and IL15 cytokines and several TLR ligands. However none of these stimuli
added to cells and beads in co-incubation medium triggered any trogocytosis of
the PKH67+ beads by the lymphocytes (Figure 4B). Despite various contexts
inducing strong T-cell stimulation, these results demonstrated that trogocytosis
needs live target cells as PKH67 donors through intercellular transfer.
Monitoring of Trogocytosis and of Inducible CD107 Expression in
NK Effector Cells
Since activated lymphocytes acquire PKH67 from conjugated cell targets,
the activated recipient cells could be monitored for additional responses, such
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A: microbeads alone
before staining
after PKH67 staining
mfi = 3
mfi = 754
SSC
SSC
FSC
PKH67
B: lymphocytes with PKH67+ microbeads
SSC
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676
Analysis of gated lymphocyte :
microbeads
FSC
t 0 min.
mfi = 5
t 60 min.
overlay
mfi = 5
PKH67
Figure 4: PKH67-labelled C18 HPLC beads do not support trogocytosis by activated lymphocytes. (A) Labelling of C18-HPLC beads with PKH67. B: analysis of PKH67 acquisition by activated lymphocytes (e.g., Polyclonal human T lymphocytes preincubated for 1 hour with 10
μg/ml of PHA or 10 μg/ml of anti-CD3 mAb) demonstrates lack of bead trogocytosis. Shown
are the PKH67 mfi of beads at the specified time of labelling.
as cell surface expression of an inducible marker. Since cytolytic lymphocytes
in a co-culture can be identified by their cell surface expression of late acidic
membrane protein (LAMP, CD107) (Betts et al. 2003), this criterion could be
used to further classify the cytolytic lymphocytes among cells that captured
fragments of target cell membrane in a 4-hour co-incubation. Polyclonal NK
cells from healthy donors are highly cytolytic for the HLA class I-deficient
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Tracking Intercellular Transfers
chronic myeloid leukaemia K562 cell line. So K562 cells were labelled with
PKH67 and co-incubated for 4 hours with a purified polyclonal human NK
cells. After this co-incubation, all cells were labelled for surface expression of
CD107 and analysed by flow cytometry. Although FSC/SSC could discriminate NK from K562 cells in the co-culture samples, their respective PKH67
fluorescence enabled to easily gate each cell type (Figure 5A).
NK cells gated on the basis of their low PKH67 fluorescence were then
analysed for mfi of PKH67 and expression of CD107. After 0 minutes of
co-incubation with PKH67+ K562 targets, the NK cells had the same low
intensity of PKH67 fluorescence as after 4 hours without K562 cells. By contrast, after 4 hours with PKH67+ K562 targets, a sizable proportion of NK cells
had captured PKH67 from the targets and up-regulated cell surface expression
of CD107 (Figure 5B). At the end of this experiment, however, the double staining
for PKH67 and CD107 revealed that NK cells segregated within 3 categories.
These comprised NK cells that remained negative for both labels, NK cells that
did trogocytosis without attacking the targets and a group of NK cells that
mediated both trogocytosis and degranulation of cytolytic granules (Figure 5C).
So this flow cytometry-based trogocytosis and phenotyping assay enabled us to
readily delineate three subsets of NK cells able to conjugate to target cells with
and without lytic attack, as demonstrated by CD107 expression. Further use of
a viability probe for K562 targets could also determine whether killing had
occurred in these experiments, and to what extent did trogocytosis and degranulation correlate to efficient killing of the target cells.
The versatility of the trogocytosis assay might soon prove useful in the
tackling of autoimmune cell subsets with identified targets that are easily
accessible for labelling by PKH such as erythrocytes in autoimmune
haemolytic anemia.
Simultaneous Visualization of Perforin Release, Trogocytosis and
Cell Death at the Single Cell Level of a Lytic Immunological
Synapse
We used time-lapse confocal fluorescence microscopy to simultaneously
visualize at the single cell level cell-to-cell membrane transfer, perforin
release and target cell death. ALCL cells were labelled for cell membranes
with CellVue Maroon (blue) and loaded with calcein AM (green), as a cytoplasmic tracker for viability. In addition, acidic perforin granules of cytolytic T
lymphocytes were labelled using LysoTracker Red (red) to reveal perforin
secretion (Faroudi et al., 2003; Wiedemann et al., 2006). T lymphocyte and
ALCL cells were co-incubated as above, and cell conjugates were selected and
confocal microscopy images were taken every 8 seconds for 2 hours.
Before formation of immunological synapses, the lytic lymphocytes had
numerous cytolytic granules in the cytoplasm that moved rapidly upon cell
677
J. Gertner-Dardenne et al.
A: co-incubating NK cells with PKH67+ targets K562
gated NK cells
All cells
gated K652
K562
0 min
NK
K562
4 hr
NK
B: analyzing PKH67 and CD107 on NK cells
CD107a
4 hr incubation
NK without K562
CD107a
4 hr co-incubation
NK with K562
Isotype ct l
0 min. co-incubation
NK with K562
CD107a
PKH67
C: subtyping NK cell responses
trogocytosing and lytic
NK cells
CD107a
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trogocytosing
non-lytic NK cells
resting NK cells
PKH67
Figure 5: Combined detection of NK trogocytosis and cytolytic potential through dual
monitoring of cell surface PKH67and CD107 expression. (A) NK cells were co-incubated with
K562 target cells and analysed for FSC/SSC or PKH67. Shown are FSC/SSC dot plots of all cells
in the co-cultures and PKH67/SSC dot plots for either of the gated NK and K562 populations
after 0 min. and 4 hr of co-incubation (B) Analysing cell surface PKH67and CD107 expression
by NK cells with and without 4 hour co-incubation with PKH67-labelled K562 target cells. Pure
NK cells were obtained by negative selection from PBMC using MACS on LS separating
column (NK cell islation kit II, Miltenyi Biotec). Data show the contours of cell density plots. (C)
subtyping of NK cell subsets interacting with K562 through trogocytosis alone, or through
trogocytosis and cytolytic degranulation.
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Tracking Intercellular Transfers
attachment to targets. As soon as cell conjugates were formed, both T cell’s
lytic granules and ALCL’s membrane fluorescence accumulated to the synapse. Lytic granules were rapidly secreted and induced ALCL cell death, as
demonstrated by loss of the green calcein fluorescence. Meanwhile, the lytic
lymphocytes durably continued to secrete perforin and to trogocytose their
targets (see supplement data 3 Lytic synapse.mov). The serial killing of several ALCL targets was seldom observed (see supplement data 4 Serial killer in
action.mov), and this lymphocyte degranulation was sustained on bound target
cells as described recently (Wiedemann et al., 2006).
DISCUSSION
Many physiological consequences of cell-to-cell transfers are possible, such as
transmission of receptors for viruses (Mack et al., 2000; Tabiasco et al., 2003),
growth factor (Bourbie-Vaudaine et al., 2006), interleukins (Burkett et al.,
2004; Poupot et al., 2006) or chemokines (Mack et al., 2000), of drug resistance
glycoprotein (Levchenko et al., 2005), immuno-protective HLA molecules
(Sjostrom et al., 2001; Zimmer et al., 2001; Tabiasco et al., 2002). Cell-cell
transfer of whole functional mitochondria (Spees et al., 2006) and of prion particles (Liu et al., 2002) have been reported, and could also result from processes related to trogocytosis. Thus, measuring intercellular transfer
represents a method well fitted to identify the immune cell interactions
underlying most of these contexts. It is therefore quite important to be able to
detect even very low level of membrane capture, which in many instances
appears difficult due to the low abundance of relevant protein markers. The
use of membrane-inserting fluorochromes such as the PKH represents a convenient alternative for increasing the sensitivity of these detections
(Hudrisier et al., 2001; Puaux et al., 2006). Likewise this method is promising
for studying autoimmune diseases involving unidentified cytolytic cells, such
as the self red blood cell destruction in the Evan’s Syndrome and related Auto
Immune Haemolytic Anemia (Colin et al., 2004; Aladjidi et al., 2006). Current
work by ourselves and our collaborators attempts to take advantage of PKH
dyes and the above described flow cytometry-based trogocytosis assay for
identifying the lymphoid cell subset(s) responsible for conjugating and lysing
autologous red blood cells during crisis episodes.
However, due to the strong dependence on experimental parameters such
as effector: target cell ratio, cell concentration, time of co-incubation, activation status and nature of the investigated lymphocytes, this approach needed
to be standardized. This was attempted by use of highly reproducible celllabelling reagents such as PKH fluorescent trackers on the one hand and
standardized targets on the other, thereby enabling us and others to compare
various ligands for theirefficiency to stimulate cell transfers (Hudrisier et al.,
2001; Espinosa et al., 2002; Puaux et al., 2006). However as shown in this
679
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680
J. Gertner-Dardenne et al.
work, synthetic beads covered with PKH fluorochromes in the presence of
lymphocyte-stimulating drugs were not be good targets for trogocytosis.
Although these beads were strongly stained with PKH67, optimisations of
such reagents are clearly required for their use in standardized trogocytosis
assay. It is possible however that trogocytosis only occurs between live cells,
through actively formed membrane bridges involving the phospholipid bilayers from both cell types. In this case, synthetic beads could not be trogocytosed
by lymphocytes possibly for the inadequacy to either membrane fusion or
transfer of their synthetic lipidic surface. Another alternative would be to use
PKH67-labelled liposomes as synthetic “baits” for a liposome-to-lymphocyte
cell transfer, in which activated lymphocytes nibbling on the labeled liposomes for a while would get labelled, such as to produce a standardized cell
target for trogocytosis.
Whether cell membrane sub-structures, such as cholesterol-rafts, contribute to the rupture of cell membranes and to the translocated fusion of both lipidic bilayers from the synapsed cell is unknown and so far remains
hypothetical. Our preliminary results suggest however, a role for cholesterol
in transfer, as cell-to-cell transfer was drastically reduced by cell pretreatment with cholesterol-depleting β-cyclodextrins (data not shown). In addition, trogocytosis was reproducibly low in the context of active lymphocytes conjugated to dead or dying cells, suggesting that intercellular transfers needed
some form of metabolic activity from “membrane donor” cells. This contribution
would then account for the lack of membrane transfer with inert beads and
might—if validated—rule out the possibility to substitute live labelled cells by
fluorescent liposomes in the attempt to standardize trogocytosis targets cells.
This study examplified the use of PKH dyes for simultaneously monitoring multiple aspects of effector cell function (e.g., target cell binding as measured by trogocytosis and degranulation as monitored by induction of CD107a
expression in NK cells). Other variations of this type of experiment could also
define and subtype the trogocytosis-bioactive effector cells from a bulk of
hematopoietic cell populations, such as whole unseparated peripheral blood
mononuclear cells, as reported elsewhere with human γδ TCR-expressing
lymphocytes (Angelini et al., 2004; Poupot et al., 2005).
Since intercellular membrane transfers increase with time and cell density, it can be envisaged that increase of the mean fluorescence intensity on
recipient lymphocytes results from a function of probability for donorrecipient cell encounter. Indeed, cell-to-cell transfer has already been shown
to strictly rely upon cell contact through immunological synapses (Huang
et al., 1999; Batista and Neuberger, 2000; Batista et al., 2001). This context
accounts for the direct link of transfer with cell activation, whereby cognate
cell contacts trigger cell activation which in turn promotes mobility and thus
further cell-cell interactions (Hwang et al., 2000; Hwang and Sprent, 2001).
Modeling this auto-catalytic process at the whole cell population scale by use
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Tracking Intercellular Transfers
of already established probabilistic models will help in understanding
whether and how far cell-to-cell transfer is predictable by pre-determined cell
conditions.
This approach could also aid in understanding the spreading of cell surface markers with strong physiopathological significance, such as molecular
determinants of pathogenicity for HIV (Igakura et al., 2003) or cancer escape
(Levchenko et al., 2005). Identifying lymphoid cell effectors of self-cytolytic
reactions is a central theme in research on autoimmune diseases. The above
method is compatible to studies wherein target cells are known and can be isolated and labeled with PKH trackers. In this regard, it is expected this new
method will prove particularly informative for identifying autoreactive
cytolytic cells responsible for the autoimmune attack of red blood cells and
platelets in AIHA and Evans syndromes.
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to S. Allart for technical assistance and access to the confocal
microscope facility (Microscopy Platform of IFR30). J.J.F. lab is supported by
institutional grants from the Institut National de la Santé Et de la Recherche
Médicale (INSERM), the Association pour la Recherche sur le Cancer (contract # 3757), the Agence Nationale pour la Recherche (RIB-Picostim) and the
Groupement d’Interet Scientifique «Maladies Rares: AIHA–Syndrome
d’Evans». J.G. received fellowships from the Ministère de l’Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie while M.P. is the recipient of a
post-doctoral fellowship from INSERM.
ABBREVIATIONS
ALCL
APC
CTL
FCS
IS
mfi
anaplastic large cell lymphoma
antigen-presenting cell
cytolytic T lymphocytes
fetal calf serum
immunological synapse
mean of fluorescence intensity
REFERENCES
Aladjidi, N., Leverger, G., Pariente, A., Bader-Meunier, B., Le Deist, F., Colin, Y., Michel, G.,
Quartier, P., Pondare, C., Monpoux, F., Leblanc, T., Nelken, B., Lutz, P., Blouin, P.,
Yacouben, K., Robert, A., Stephan, J. L., Perel, Y. (2006). [Epidemiology of autoimmune haemolytic anemia in children: French data]. Arch. Pediatr. 13(6):511–514.
Angelini, D. F., Borsellino, G., Poupot, M., Diamantini, A., Poupot, R., Bernardi, G.,
Poccia, F., Fournie, J. J., Battistini, L. (2004). FcgammaRIII discriminates
681
Downloaded By: [Fournié, Jean-Jacques] At: 09:02 7 January 2008
682
J. Gertner-Dardenne et al.
between two subsets of Vgamma9Vdelta2 effector cells with different responses
and activation pathways. Blood 104:1801–1807.
Arnold, P. Y., Mannie, M. D. (1999). Vesicles bearing MHC class II molecules mediate
transfer of antigen from antigen-presenting cells to CD4+ T cells. Eur J Immunol
29(4):1363–1373.
Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. (2001). B cells acquire antigen from target
cells after synapse formation. Nature 411(6836):489–494.
Batista, F. D., Neuberger, M. S. (2000). B cells extract and present immobilized antigen: implications for affinity discrimination. Embo. J. 19(4):513–520.
Beadling, C., Slifka, M. K. (2006). Quantifying viable virus-specific T cells without a
priori knowledge of fine epitope specificity. Nat. Med. 12(10):1208–1212.
Betts, M. R., Brenchley, J. M., Price, D. A., De Rosa, S. C., Douek, D. C., Roederer, M.,
Koup, R. A. (2003). Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells
by a flow cytometric assay for degranulation. J. Immunol. Meth. 281(1–2):65–78.
Bourbie-Vaudaine, S., Blanchard, N., Hivroz, C., Romeo, P. H. (2006). Dendritic cells
can turn CD4+ T lymphocytes into vascular endothelial growth factor-carrying
cells by intercellular neuropilin-1 transfer. J. Immunol. 177(3):1460–1469.
Burkett, P. R., Koka, R., Chien, M., Chai, S, Boone, D. L., Ma, A. (2004). Coordinate expression and trans presentation of interleukin (IL)-15Ralpha and IL-15 supports natural
killer cell and memory CD8+ T cell homeostasis. J. Exp. Med. 200(7):825–834.
Clark, R. H., Stinchcombe, J. C., Day, A., Blott, E., Booth, S., Bossi, G., Hamblin, T.,
Davies, E. G., Griffiths, G. M. (2003). Adaptor protein 3-dependent microtubulemediated movement of lytic granules to the immunological synapse. Nat. Immunol. 4(11):1111–1120.
Colin, I. M., Isaac, J., Dupret, P., Ledant, T., D'Hautcourt, J. L. (2004). Functional lymphocyte subset assessment of the Th1/Th2 profile in patients with autoimmune
thyroiditis by flowcytometric analysis of peripheral lymphocytes. J. Biol. Regul.
Homeost. Agents 18(1):72–76.
Davis, D. M. (2007). Intercellular transfer of cell-surface proteins is common and can
affect many stages of an immune response. Nat. Rev. Immunol. 7(3):238–243.
Espinosa, E., Tabiasco, J., Hudrisier, D., Fournie, J. J. (2002). Synaptic transfer by
human gamma delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J. Immunol. 168(12):6336–6343.
Faroudi, M., Utzny, C., Salio, M., Cerundolo, V., Guiraud, M., Muller, S., Valitutti, S.
(2003). Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell
interaction: manifestation of a dual activation threshold. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100(24):14145–14150.
Gertner, J., Wiedemann, A., Poupot, M., Fournie, J. J. (2007). Human gammadelta T
lymphocytes strip and kill tumor cells simultaneously. Immunol. Lett. 110(1):42–53.
Huang, J. F., Yang, Y., Sepulveda, H., Shi, W., Hwang, I., Peterson, P. A., Jackson, M. R.,
Sprent, J., Cai, Z. (1999). TCR-Mediated internalization of peptide-MHC complexes acquired by T cells. Science 286(5441):952–954.
Hudrisier, D., Riond, J., Garidou, L., Duthoit, C., Joly, E. (2005). T cell activation correlates with an increased proportion of antigen among the materials acquired from
target cells. Eur J. Immunol. 35(8):2284–2294.
Hudrisier, D., Riond, J. Mazarguil, H., Gairin, J. E., Joly, E. (2001). Cutting edge:
CTLs rapidly capture membrane fragments from target cells in a TCR signalingdependent manner. J. Immunol. 166(6):3645–3649.
Downloaded By: [Fournié, Jean-Jacques] At: 09:02 7 January 2008
Tracking Intercellular Transfers
Hwang, I., Huang, J. F., Kishimoto, H., Brunmark, A., Peterson, P. A., Jackson, M. R.,
Surh, C. D., Cai, Z., Sprent, J. (2000). T cells can use either T cell receptor or CD28
receptors to absorb and internalize cell surface molecules derived from antigenpresenting cells. J. Exp. Med. 191(7):1137–1148.
Hwang, I., Sprent, J. (2001). Role of the actin cytoskeleton in T cell absorption and
internalization of ligands from APC. J. Immunol. 166(8):5099–5107.
Igakura, T., Stinchcombe, J. C., Goon, P. K., Taylor, G. P., Weber, J. N., Griffiths, G.
M., Tanaka, Y., Osame, M., Bangham, C. R. (2003). Spread of HTLV-I between
lymphocytes by virus-induced polarization of the cytoskeleton. Science 299(5613):
1713–1716.
Joly, E., Hudrisier, D. (2003). What is trogocytosis and what is its purpose? Nat. Immunol. 4(9):815.
Kedl, R. M.,Schaefer, B. C., Kappler, J. W., Marrack, P. (2002). T cells down-modulate
peptide-MHC complexes on APCs in vivo. Nat. Immunol. 3(1):27–32.
Levchenko, A., Mehta, B. M., Niu, X., Kang, G., Villafania, L., Way, D. Polycarpe, D.,
Sadelain, M., Larson, S. M. (2005). Intercellular transfer of P-glycoprotein mediates acquired multidrug resistance in tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
102(6):1933–1938.
Liu, T., Li, R., Pan, T., Liu, D., Petersen, R. B., Wong, B. S., Gambetti, P., Sy, M. S.
(2002). Intercellular transfer of the cellular prion protein. J. Biol. Chem. 277(49):
47671–476718.
Lyubchenko, T. A., Wurth, G. A., Zweifach, A. (2001). Role of calcium influx in cytotoxic
T lymphocyte lytic granule exocytosis during target cell killing. Immunity. 15(5):
847–859.
Mack, M., Kleinschmidt, A., Bruhl, H., Klier, C., Nelson, P. J., Cihak, Plachy, J., M.
Stangassinger, M., Erfle, V., Schlondorff, D. (2000). Transfer of the chemokine
receptor CCR5 between cells by membrane-derived microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection. Nat. Med. 6(7):
769–775.
Marciano-Cabral, F., Zoghby, K. L., Bradley, S. G. (1990). Cytopathic action of Naegleria fowleri amoebae on rat neuroblastoma target cells. J. Protozool. 37(2):138–144.
Poupot, M., Fournie, J. J. (2003). Spontaneous membrane transfer through homotypic
synapses between lymphoma cells. J. Immunol. 171(5):2517–2523.
Poupot, M., Gertner, J., Fournié, J. J. (2006). Molecular transfers through transient
lymphoid cell-cell channels. Cell-Cell Channels. F. Baluška, D. Volkmann and P.
W. Barlow, Landes Bioscience. Pp. 266–282.
Poupot, M., Pont, F., Fournie, J. J. (2005). Profiling blood lymphocyte interactions with
cancer cells uncovers the innate reactivity of human gamma delta T cells to anaplastic large cell lymphoma. J. Immunol. 174(3):1717–1722.
Puaux, A. L., Campanaud, J., Salles, A., Preville, X., Timmerman, B., Joly, E.,
Hudrisier, D. (2006). A very rapid and simple assay based on trogocytosis to detect
and measure specific T and B cell reactivity by flow cytometry. Eur. J. Immunol.
36(3):779–788.
Schwartz, A., Marti, G. E., Poon, R., Gratama, J. W., Fernandez-Repollet, E. (1998).
Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards
used for flow cytometry. Cytometry 33(2):106–114.
Sjostrom, A., Eriksson, M., Cerboni, C., Johansson, M. H., Sentman, C. L., Karre, K.,
Hoglund, P. (2001). Acquisition of external major histocompatibility complex class
683
Downloaded By: [Fournié, Jean-Jacques] At: 09:02 7 January 2008
684
J. Gertner-Dardenne et al.
I molecules by natural killer cells expressing inhibitory Ly49 receptors. J. Exp.
Med. 194(10):1519–1530.
Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. (2006). Mitochondrial transfer
between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci USA 103(5):
1283–1288.
Tabiasco, J., Espinosa, E., Hudrisier, D., Joly, E., Fournie, J. J., Vercellone, A. (2002).
Active trans-synaptic capture of membrane fragments by natural killer cells. Eur
J. Immunol. 32(5):1502–1508.
Tabiasco, J., Vercellone, A., Meggetto, F, Hudrisier, D., Brousset, P., Fournie, J. J.
(2003). Acquisition of viral receptor by NK cells through immunological synapse. J.
Immunol. 170(12):5993–5998.
Undale, A. H., van den Elsen, P. J., Celis, E. (2004). Antigen-independent acquisition of MHC class II molecules by human T lymphocytes. Int. Immunol. 16(10):
1523–1533.
Utsugi-Kobukai, S., Fujimaki, H., Hotta, C., Nakazawa, M., Minami, M. (2003). MHC
class I-mediated exogenous antigen presentation by exosomes secreted from
immature and mature bone marrow derived dendritic cells. Immunol. Lett. 89(2–
3):125–131.
Vanherberghen, B., Andersson, K., Carlin, L. M., Nolte-'t Hoen, E. N., Williams, G. S.,
Hoglund, P., Davis, D. M. (2004). Human and murine inhibitory natural killer cell
receptors transfer from natural killer cells to target cells. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101(48):16873–16878.
Wetzel, S. A., McKeithan, T. W., Parker, D. C. (2005). Peptide-specific intercellular
transfer of MHC class II to CD4+ T cells directly from the immunological synapse
upon cellular dissociation. J. Immunol. 174(1):80–89.
Wiedemann, A., Depoil, D., Faroudi, M., Valitutti, S. (2006). Cytotoxic T lymphocytes kill multiple targets simultaneously via spatiotemporal uncoupling of
lytic and stimulatory synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(29): 10985–
10990.
Zimmer, J., Ioannidis, V., Held, W. (2001). H-2D ligand expression by Ly49A+ natural
killer (NK) cells precludes ligand uptake from environmental cells: implications
for NK cell function. J. Exp. Med. 194(10):1531–1539.
SUPPLEMENTAL DATA
Suppl data 1 CellVue Maroon Synaptic Transfers.mov (466 Ko).
Suppl data 2 Synaptic Redistribution of CellVue Maroon.mov (1720 Ko).
Suppl data 3 Lytic synapse.mov (187 Ko).
Suppl data 4 Serial killer in action.mov (671 Ko).
Suppl data 5 Intensity of PKH67-transfer detection depends on the data
processing software. Co-incubation of normal lymphocytes with the
Karpas-299 lymphoma cells labelled with PKH67 demonstrates cell-to-cell
transfer by fluorescence increase after 60 minutes. Cell-to-cell transfers
from a PKH67-labelled lymphoma target cell line onto normal blood lymphocytes co-incubated for 0 min. and 60 min. was measured as in Fig. 2
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Tracking Intercellular Transfers
using an LSR-II flow cytometer. The same set of raw fluorescence data
were then processed for geometric mfi with either WinMDI or Diva softwares and the resulting values are specified.
685
Comparativement
à
l'utilisation
d’un
anticorps
seul,
l’association
d’un
phosphoantigène et d’un mAb thérapeutique provoque non seulement un meilleur attachement
aux cellules cancéreuses mais aussi leur lyse plus efficace par ADCC.
Les méthodes et exemples produits dans ce brevet démontrent une potentialisation de
la lyse de cellules cancéreuses sous l’effet d’une combinaison d’anticorps thérapeutique et de
PAg, dans le contexte de différents types d’anticorps thérapeutiques et cibles tumorlaes
Publication # 3: Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic
antibodies using γδ T cell activator compounds. Brevet Europeen INSERM, EP 062911468, déposé le 13/07/2006, à l'Office Européen des Brevets.
Inventeurs : Julie GERTNER, Christine BEZOMBES, Guy LAURENT, Jean Jacques
FOURNIE
108
Publication # 4 : Gamma delta lymphocyte stimulation with phosphoantigens increase the
efficiency of therapeutic antibodies. Julie GERTNER-DARDENNE, Cecile Bonnafous,
Christine Bezombes, Virginie Scaglione, Emilie Gross, Jean-François Lepage, Anne
Quillet Mary, Helene Sicard, Guy Laurent and Jean-Jacques Fournié (manuscript en
cours de redaction)
Dans la précédente étude de vidéo-microscopie (publication #2), nous avions
démontré la simultanéité de la lyse et de la trogocytose à la synapse des lymphocytes T γδ
avec leur cible tumorale. Ainsi avons-nous envisagé que le renforcement de la synapse de ces
effecteurs cytotoxiques à leurs cibles (par la combinaison de phosphoantigènes et d’Ac
thérapeutiques) permettrait d’optimiser leur efficacité anti-tumorale.
En effet, si les Ac thérapeutiques représentent une approche thérapeutique spécifique
et efficace chez l’homme, particulièrement pour le traitement des tumeurs ou de pathologie
auto-immunes, ils n’ont pas toujours une efficacité soutenue au cours du temps. En effet, on
sait aujourd'hui que l’anticorps monoclonal chimère anti-CD20 rituximab (RTX), efficace
dans le traitement des NHL, seul ou combiné à une chimiothérapie, montre jusqu'à 50 % de
non-réponse chez les patients atteints de NHL de bas grade. Ce manque efficacité a été
attribué à : (i) un insuffisant niveau d’expression de CD20 sur les cellules de lymphome, (ii)
une trop importante masse tumorale au moment du traitement, (iii) une insufficante
concentration de RTX sérique chez certains patients traités. Enfin, l’utilisation d’Ac
thérapeutiques peut être limitée par les effets secondaires causés par leur administration de
type « cytokine storms » par exemple
358-360
. Ainsi il est donc intéressant de chercher à
augmenter l’efficacité des Ac thérapeutiques en diminuant leurs doses afin qu’ils soient moins
susceptibles de produire de tels effets secondaires.
Actuellement, l’amélioration des traitements basés sur l’utilisation du RTX est liée à la
compréhension du ou des mécanismes d’action de ce dernier in vivo, ainsi les mécanismes
clés de son mode d’action pourront être exploités au mieux dans diverses immunothérapies.
Par exemple, la connaissance et l'activation des effecteurs lymphoïdes responsables de l’effet
ADCC du RTX peut conduire à associer cet anticorps à un agoniste sélectif des mêmes
effecteurs en vue d’augmenter leur nombre et leur activité.
109
γδ cell stimulation increase ADCC by therapeutic antibodies
Gertner-Dardenne & al.
Phosphoantigens increase the efficiency of therapeutic antibodies
Julie Gertner-Dardenne1, Christine Bezombes1, Helene Sicard2, Emilie Gross1, Anne Quillet Mary1,
Guy Laurent1 and Jean-Jacques Fournié*1
1
Innate Immunity, Malignant Hemopathies and Cancer Immunity,
Dept of Oncology, Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale Unit 563,
BP 3128, Hospital Purpan,, 31024 Toulouse Cedex 03, France
2
Innate Pharma, Immeuble Grand Pré, 119-121ancien chemin de Cassis, 13006 Marseilles France
*Address correspondence to : J.J.Fournié, INSERM Unit 563, BP 3128, Hopital Purpan, 31024
Toulouse Cedex 03, France ; Ph +335 6274 8364 ; Email : [email protected]
Keywords: antigens/monoclonal antibody/lymphocytes/cancer therapy/
Abbreviations used:
lymphoma, therapeutic antibody, rituximab, cytolytic T lymphocytes, ADCC, cancer, therapy
Footnotes: 10 pages, 6 B& W figures, 5786 words (summary 111), 33832 characters.
ABSTRACT
The advent of humanized monoclonal antibodies (mAb) has revolutionized the treatment of
several malignant and autoimmune diseases. Rational improvement of the efficiency of antibodies
involves at least target cell expression of the mAb ligand (Ag) and antibody-dependent cell-mediated
cytotoxicity (ADCC). Here, we show that selectively activating ADCC-mediating γδ T lymphocytes
by phosphoantigens strongly increased both binding and killing of CD20 B-cell lymphoma by the antiCD20 mAb Rituximab in vitro and in vivo. Likewise, phosphoantigen association to anti–CD52
alemtuzumab (Campath™) improved ADCC of against CD52+ tumour cells. Hence phosphoantigens
improve the bioactivity of therapeutic monoclonal antibodies.
1
A
B
T60
none
TCRVγ9
T0
RTX
3262
1251
5125
PAg
RTX + PAg
106
7179
11532
105
MESF
104
103
102
PKH67
C
transferred MESF
(x 10-3)
50
120
60
40
15
15
10
10
60
20
40
20
10
50
0
Granta
80
0
120
5
5
0
0
20
0
105
100
100
40
NCEB1
transferred MESF
(x 10-3)
20
80
30
0
D
20
103
104
Fluorescence intensity
120
cells alone
60
cells +RTX
40
cells +PAg
20
cells +PAg+RTX
0
Karpas422
RL
EsMoult
80
20
20
80
15
15
60
10
10
5
5
0
0
Raji
60
100
40
60
30
40
20
40
cells alone
40
10
20
0
0
20
NCEB1
cells +PAg
cells +PAg+ALZ
0
Granta
cells +ALZ
20
EsMoult
RL
0
Karpas422
Raji
Figure 1 : Phosphoantigen + mAb improve γδ T lymphocyte binding to tumour cells
(A) γδ T lymphocytes acquire fluorescence upon binding to labeled tumour cells, so NCEB1 lymphoma cells labeled with PKH67 were coincubated for 1 hour with polyclonal γδ T lymphocytes in presence of the specified reagents in culture medium, and the γδ T lymphocyte
fluorescence was measured by flow cytometry, their mean fluorescence intensities are indicated. (B) Calibration of number of molecules of
equivalent soluble fluorochrome (MESF) vs fluorescence intensity using unlabelled beads (clear histogram) and beads with known number
of fluorescent molecules (shaded histograms). (C-D) Quantitation of γδ lymphocyte binding to tumour cells, either by cells alone or in
presence of PAg, rituximab (RTX) (C), alemtuzumab (ALZ) (D) mAb or PAg+mAb together, as numbers of MESF transferred while bound
to the specified tumour cell line.
A
0
5
5
60
5
60
5
60
P- ERK 1/2
572
P-ZAP70
PAg + RTX
5 min
1646
60 min
2262
5 min
1934
60 min
2748
5 min
1957
60 min
2368
768
392
775
390
861
501
363
P-ZAP70
ERK1/2
RTX
PAg
unstimulated
P-ERK1/2
min
B
PAg
+ RTX
RTX
PAg
unstimulated
ZAP70
TCRVγ9
unstimulated
P-SYK
C
15 min
30 min
0.8%
0.5%
anti-CD3
15 min
2.2%
PAg
RTX
PAg + RTX
30 min
15 min
30 min
15 min
30 min
15 min
30 min
4.0%
2.8%
0.5%
0.8%
53%
2.0%
1.0%
TCRVγ9
D
transferred MESF
(Thousands)
0
10 20 30 40 50
E
none
RTX
0%
cells alone
+RTX
+PAg
+PAg+RTX
cells +Pag+RTX+
no inhibitor
PAg
1%
32%
RTX + PAg
39%
F
none
RTX
3%
IFNγ
% IFNγ-positive γδ cells
0 10 20 30 40 50
cells+Pag+RTX+
no inhibitor
PAg
4%
72%
RTX + PAg
70%
CD107a
% CD107a-positive γδ cells
0
20 40 60 80
cells+Pag+RTX+
no inhibitor
SU6656
SU6656
SU6656
Piceatannol
Piceatannol
Piceatannol
Wortmannin
Wortmannin
Wortmannin
PD98059
PD98059
PD98059
Chelerythrin
Chelerythrin
Chelerythrin
LFM-A13
LFM-A13
LFM-A13
Figure 2: γδ T cell signaling for PAg+RTX.
(A) Kinetics of ERK1/2 and ZAP70 activation by PAg and RTX. 3.107 polyclonal γδ T cells derived from a healthy donor were either
unstimulated or stimulated for the indicated times with PAg (20nM), RTX (10 µg/ml) or both. Total cellular proteins were separated on
10% SDS-PAGE and revealed by Western blot analysis using the specified antibodies. Shown are representative results out of six
experiments. Phosphorylation of intracellular ERK1/2 and ZAP70 (B) and Syk (C) in γδ T cells stimulated by PAg and RTX. 106 γδ T
cells in complete medium at 37°C were stimulated as specified for the indicated time. Cells were then fixed and stained according to
BD protocol, with both FITC anti-TCRVγ9 (Beckman-Immunotech), PE anti-phospho-Erk1/2(T202/Y204) and Ax647 anti-phosphoZap70(Y319) (Becton Dickinson). For intracellular labeling of phospho-Syk (C), cells were labeled with PE anti-TCRVγ9 and a
polyclonal rabbit anti-phospho-Syk (Y525/526) followed by secondary FITC goat anti-rabbit Ig (Cell Signaling). 150,000 events were
analyzed for each experiment using an LSRII cytometer (Becton Dickinson). The rabbit IgG isotype control (Cell Signaling) was used
to set the threshold and determine the percentage of phospho-Syk-positive TCRVγ9 cells shown on contour plots. (D-F) Inhibition of
PAg+RTX-induced γδ T cell functions by drugs targeting signaling protein kinases. Polyclonal γδ T lymphocytes were co-incubated
with RL cells in presence of PAg and RTX as specified, and were analysed for trogocytosis (D), intracellular IFNγ (E) and cell surface
CD107a (F). In these assays, PAg+RTX was also tested in presence of either SU6656 (1µM), wortmannin (0,1µM), piceatannol
(20nM), PD98059 (100 µM), chelerythrin (1µM) or LFM-A13 (20µM).
B
NS
IFNγ
TNFα
50
NS
dividing γδ cells (%)
60
40
30
20
10
0
100
donor 2
80
donor 1
60
40
20
0
none
RTX
PAg
PAg
+RTX
0
% CD107a+ / TCR γδ cells
0
20
40
60
80
C
RL + γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
NCEB1+ γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
Raji + γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
Karpas422 + γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
EsMoult + γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
Daudi + γδ cells alone
+ RTX
+ PAg
+PAg + RTX
D
*
*
NS
NS
phagocytosis by CD14 monocytes
(increase of mfi / 60 min.)
γδ cells expressing
intracellular cytokines (%)
A
0.1
1
10
PAg concentration (nM)
100
phagocytosis of inert beads
NS
200
100
0
60,000
phagocytosis of CD20+ lymphoma cells
NS
40,000
20,000
0
*
*
*
*
NS
none
RTX
PAg
PAg+RTX
NS
NS
NS
Fig.3 : PAg+RTX induces γδ T lymphocyte responses and monocyte phagocytosis
(A)
Cytokine production by γδ lymphocytes activated with PAg+RTX in presence of CD20 tumor cells. γδ lymphocytes were
co-incubated with RL lymphoma cells in complete medium supplemented with brefeldin A and the specified stimuli for 6 hrs at
37°C. Cells were then fixed, permeabilized, stained for intracellular IFNγ or TNFα and analyzed by flow cytometry. Shown are
mean and SD from three independent experiments; NS: no significant difference between PAg and PAg+RTX conditions for
inducing intracellular IFNγ or TNFα.
(B)
Peripheral blood-derived γδ lymphocyte proliferation to PAg+RTX. Whole PBMC freshly isolated from two healthy adults
6
were stained with CFSE (1µM, 8 minutes), washed and plated (1.5x10 cells/mL) in culture wells containing complete medium
supplemented with IL2, the specified concentration of PAg and with RTX (10 µg/ml) (closed dots) or without (open dots). IL2 was
renewed at day 3 and at day 6, cells were stained for TCRVγ9 and analyzed for division by flow cytometry using the CFSE
dilution assay.
(C)
Cytolytic activity of γδ lymphocytes activated with PAg+RTX in presence of CD20 tumor cells. γδ lymphocytes were coincubated with the specified tumor cells in complete medium supplemented with the indicated stimuli for 4 hrs at 37°C. Cells were
then fixed ,stained for cell surface expression of TCRγδ and for CD107a and analyzed by flow cytometry. Numbers show the
percentage of γδ lymphocytes expressing the cytolytic granule marker CD107a in these conditions.
(D)
Spontaneous and Antibody-dependent phagocytosis by freshly isolated monocytes in presence of PAg+RTX.
Monocytes freshly isolated from circulating blood were co-incubated for one hour either with FITC polystyrene beads to assess
non-specific phagocytosis (upper panel) or with PKH67-stained RL lymphoma cells to assess antibody-dependent phagocytosis
+
(lower panel). The increase of mean fluorescence intensity (mfi) for CD14 cells between 0 and 60 min. of co-incubation in the
specified conditions are shown. NS: no significant difference.
A
0
% specific lysis
20
40
60
100
RL cell target cells alone + RTX (µg/ml) 50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX Fab’2 + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
MgCl2 EDTA + RTX + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
80
*
*
0
% specific lysis
20
40
60
*
+RTX (µg/ml)
*
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
Karpas422 target cells alone:
*
*
*
*
NS
*
+RTX (µg/ml)
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
Daudi target cells alone:
+ALZ (µg/ml)
+RTX (µg/ml)
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
Granta target cells alone:
+ALZ MAb (µg/ml)
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ ALZ (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
Daudi target cells alone:
80
80
100
RL target cells alone:
+ALZ (µg/ml) 50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ ALZ (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ ALZ (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
% specific lysis
20
40
60
100
50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
Raji target cells alone:
C
Granta target cells alone:
0
100
NCEB1 target cells alone:
+RTX (µg/ml) 50
10
30:1
+ PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
30:1
+ RTX (10µg/ml) + PAg-activated γδ (E:T ratio) 10:1
1:1
*
*
B
*
NS
+RTX (µg/ml)
Fig.4: PAg+MAb increase tumor cell ADCC
Specific lysis of the indicated tumour cells pulsed with 51Cr after 4 hrs of co-incubation in the specified medium
conditions. (A) PAg+RTX increase perforin-dependent ADCC of the RL lymphoma by γδ lymphocytes. (B) Specific
lysis of the CD20 lymphoma cell lines NCEB1 Raji, Karpas422, Granta and Daudi in the same conditions as in (A).
(C) PAg+Alemtuzumab (ALZ) increase the ADCC mediated by γδ T lymphocytes. Results (means from triplicates
+/- s.d.) are representative of a typical experiment out of three independent ones, involving γδ T lymphocytes from
different donors in each panel. NS: non significant difference, *P<0.05.
*
NS
Deep tissues
Peripheral blood
A
macaques with RTX alone
TCRVγ9+ cells with RTX alone
TCRVγ9+ cells with RTX +PAg/IL2
30
macaques with RTX+PAg/IL2
CD20+ cells with RTX alone
CD20+ cells with RTX+ PAg/IL2
100
T cells (%)
20
(%)
10
80
60
40
20
0
16
(Weeks) 0
RTX
1
2
3
RTX
RTX
RTX
4
5
6
7
8
B cells (%)
0
9
12
8
4
0
PAg/IL2
PAg/IL2
80
ex vivo (culture day 0 )
day13 /IL2 medium
CD20 cells in culture
(number x 10-6)
BM
day13 PAg /IL2 medium
60
50
B-CLL patient PBMC co-incubated 4 hrs in IL2 medium + :
RTX-Fab’2
none
4%
4.2%
RTX
PAg
12.7%
RTX + PAg
76.4%
40
specific lysis of autologous B-CLL
(%)
B
LN
PAg/IL2
74.4%
40
+ RTX+PAg
30
+RTX
20
20
10
CD107a expression by TCRVγ9 γδ T cells (gated)
0
0
20
40
60
TCRVγ9 γδ cells in culture (number x 10-6)
+PAg
IL2 medium
0
40:1
20:1
C
Fig.5: Relevance of PAg+MAb for chemotherapy
(A) Co-injection of PAg/IL2 enhances B-cell depletion by RTX in LN and BM and delays their reconstitution in blood
of macaques. Follow-up of in vivo B-cell depletion by RTX in blood, lymph nodes (LN) and bone marrow (BM) of
macaques (n=8) receiving 5 mg/kg of intravenous RTX with or without PAg /IL2 with the specified schedule. Animals
were euthanasied at day 62 for analysing BM, LN at necropsy. B) PBMC from four out of six B-CLL patients at
diagnostic responded to PAg+RTX in vitro. CD20+ (both normal B and CLL) vs TCRVγ9+ γδ T cell counts from 107
PBMC from (n=6) B-CLL patients cultured in IL2-containing medium with or without PAg. The B cell decreases
followed the γδ T cell expansions. Within 4hrs in presence of RTX+PAg, the PBMC from a B-CLL patient strongly
responsive to PAg (Box) raised a major rate of cytolytic (CD107a+) TCRVγ9+ lymphocytes and of autologous B-CLL
lysis (51Cr-release assays, the data shown are mean from three independent experiments performed in triplicate).
10:1 (E:T ratio)
Le mode d'action du RTX in vivo implique les mécanismes de cytotoxicité cellulaire
dépendante de l’anticorps (ADCC), de cytotoxicité dépendante du complément (CDC), et
l'induction d'apoptose directe résultant de l'altération des flux calciques dans les cellules
CD20. Ces différents mécanismes ont été démontrés in vitro. Deux équipes ont montré que le
traitement au RTX induisait une mort cellulaire par apoptose caspase-dépendante des cellules
de B-CLL in vitro
134
et in vivo
135
. De plus la résistance au RTX dans les CLL associée à la
surexpression de protéines inférieures
137
vient appuyer le rôle intrinsèque du RTX. D’autres
auteurs ont rapporté la CDC comme mécanisme prédominant d'activité du RTX in vitro
133
129,
, en montrant notamment que la CDC des cellules de lymphome traitées in vitro au RTX est
corrélée avec le niveau de l'expression des protéines associées au complément sur les cellules
tumorales
129
cellules NK
. Enfin, d'autres équipes ont démontré que l’ADCC médiée in vitro par des
129
Cartron et al.
ou des neutrophiles
131
130
, contribue au mode d’action du RTX. L’étude de
démontre une corrélation entre la réponse clinique au RTX et un
polymorphisme allélique spécifique du récepteur FcγRIIIa, révélant qu'un mécanisme médié
par le FcγRIIIa, tel que l’ADCC, est prépondérant in vivo. L’importance d’un tel mécanisme
est désormais largement acceptée, et ces conclusions ont par la suite étaient étayées par la
découverte de mutation de FcgRIII qui accentuent l’efficacité de l’ADCC, et provoque ainsi
des réponses encore plus efficaces 143.
Ce rôle du FcγRIIIa est, d’ailleurs, appuyé par une série d'expériences, décrites par
Clynes
132
, réalisées avec des modèles de souris xénogreffées et syngéniques FcγR-
déficientes. Dans cette étude les souris déficientes en FcγRIIB présentent une forte ADCC
alors que les souris déficientes en récepteur Fcγ activateur (FcγRIII) sont incapables de
stopper la croissance tumorale in vivo. Ces données démontrent que la molécule inhibitrice
FcγRIIB est un régulateur efficace de l’ADCC in vivo. En effet la molécule FcγRIIB module
l'activité du FcγRIII sur les cellules effectrices.
Parallèlement à ces données sur le rôle de l’ADCC et des FcγR tant in vitro qu’in vivo,
l’équipe de Lucas Battistini a montré en 2004,
217
que le récepteur Fcγ RIII, (CD16),
permettait de distinguer deux sous-populations de lymphocytes T Vγ9Vδ2 effecteurs, en
terme d’activation et de fonctions effectrices. D’une part les Vδ2TEMh expriment peu CD16 et
d’autre part les Vδ2TEMRA l’expriment fortement. Dans cette étude, les auteurs montrent que la
production intracellulaire d'IFN-γ et de TNF-α est induite chez les Vδ2TEMh par la stimulation
du PAg BrHPP, tel n’est pas le cas pour les Vδ2TEMRA . En effet pour ces derniers la
110
production d’IFNγ résulte de l’engagement de leur FcγRIIIa CD16. D’autre part, cette étude a
montré que l'activité cytotoxique des deux sous-ensembles de lymphocytes T Vγ9Vδ2
effecteurs, dirigée contre des cellules tumorales, est corrélée à la densité de CD16 à la surface
cellulaire. Enfin, les cellules Vδ2TEMRA représentent la sous-population de lymphocytes T
Vγ9Vδ2 la plus active dans leur capacité à former des synapses avec des cellules cibles.
Ces dernières données nous ont conduit à cibler les lymphocytes T Vγ9Vδ2 pour
optimiser l’action du RTX. Nous avons testé la combinaison du RTX avec du
phosphoantigène (PAg) dans le but d’augmenter le nombre et l’activité de ces lymphocytes T
Vγ9Vδ2 sur divers aspects de leur activité. Ainsi l’engagement cellulaire, la prolifération, la
production cytokinique, la signalisation cellulaire et la cytotoxicité des lymphocytes T
Vγ9Vδ2 à l’encontre de divers B-NHL (lymphomes CD20+ du manteau, folliculaire et de
Burkitt) ont été analysés.
Cette étude démontre l’intérêt de l’utilisation conjointe du RTX et d’un
phosphoantigène vis-à-vis de l’efficacité lytique des lymphocytes T Vγ9Vδ2 contre différents
lymphomes (Figure 23).
Phagocytose
Ag spé / non spé
Prolifération
X
Production
cytokinique TH1
X
X
γδ T cell
ADCA
+++
X
NHL CD20+
ADCC
+++
Figure 23 : Bilan de l’effet de la combinaison RTX-PAg.
ADCC (Antibody-dependant cell cytotoxicity)
ADCA (Antibody-dependant cell attachment)
111
Expression de
CD107a par les LTγδ
CONCLUSION
Depuis plus de dix ans, la population T Vγ9Vδ2 est devenue un outil d’importance
croissante pour l’immunothérapie des tumeurs. L’étude des modalités de leur action lytique
nous a amenés à proposer et développer de nouvelles approches thérapeutiques antitumorales.
Dans tous les cas de figures observés au cours de mes travaux de thèse, la simultanéité
des processus de lyse et de trogocytose induisait l'idée que le renforcement de l’attachement
des lymphocytes T γδ à leurs cibles -notamment par la combinaison de phosphoantigènes et
d’anticorps thérapeutiques- pouvait améliorer leur efficacité anti-tumorale. En fait, la quantité
et l’efficacité des effecteurs mis en jeu sont des paramètres déterminants pour l’efficacité
d’une thérapie anti-cancéreuse. Il est en effet important de générer dans un premier temps des
cellules spécifiquement cytolytiques telles que les lymphocytes T Vγ9Vδ2 dont l’activité antitumorale est établie vis-à-vis de tumeurs autologues. Cependant il n’est pas tojours suffisant
de générer des lymphocytes antitumoraux, il faut également « cibler » leur potentiel
antitumoral. Ainsi, cette thèse soutient qu’un meilleur engagement cellulaire provoqué par la
combinaison (anticorps+phosphoantigène) améliore le ciblage et l’activité tueuse donc
l’efficacité anti-tumorale.
γδ T cell
NHL CD20+
ADCA
+++
ADCC
+++
Cette combinaison permet donc, d’optimiser le potentiel cytolytique des lymphocytes
T gd dans des stratégies thérapeutiques antitumorales. Un des aspects majeurs de cette
stratégie est que, comme l’efficacité de cette combinaison est médiée par un mécanisme
112
d’ADCC impliquant le récepteur au fragment constant des IgG, elle est applicable à tous les
Ac thérapeutiques de même idiotype tels que, par exemple, l’alemtuzumab (Campath™) pour
les lymphomes non Hodgkiniens CD52+ ou le trastuzumab (Herceptin™) pour le carcinomes
mammaires Her2/Neu+. Cette combinaison prend toute son importance quand on sait qu’il
existe 500 000 patients traités au Rituximab et 3000 nouveaux cas par an de cancer du sein
traités à l’Herceptin.
113
ANNEXES (Revues)
- Poupot M., Gertner J., Fournié JJ. «Molecular transfers through transient lymphoid cell-cell
channel». in: Cell-Cell Channels 2006, editors: Frantisek Baluska, Dieter Volkmann and Peter
W. Barlow. Landes Biosciences, Springer, New York, USA
- Fournié JJ., Gertner J., Poupot M., Wiedemann A. « Single cell monitoring of trogocytosis
and killing in lytic synapse between anaplastic large cell lymphoma and activated human γδ T
lymphocytes » Haematologica Reports 2006, 2: 35-36.
- Gertner J., Scotet E., Poupot M., Bonneville M., Fournié JJ. (July 2007) “Lymphocytes:
gamma delta”. in: Encyclopedia of Life Sciences. John Wiley & Sons, Ltd: Chichester
http://www.els.net.gate1.inist.fr/ [doi: 10.1002/9780470015902.a0001195.pub2]
- Thedrez A., Sabourdin C., Gertner J., Devilder MC., Alain-Maillet S., Fournié JJ., Scotet
E., Bonneville M. «Self/non self discrimination by human γδ T cells: simple solutions for a
complex issue?» Immunological review 2007, 215 :123-135.
114
Molecular Transfers through Transient Lymphoid Cell-Cell Channels
Mary Poupot, Julie Gertner and Jean-Jacques Fournié.
Baluska Book (2006)
115
CHAPTER
Molecular Transfers Through Transient
Lymphoid Cell-cell Channels
Mary Poupot, Julie Gertner and Jean-Jacques Fournié*
Abstract
I
ntercellular communication is inherent to life, and has evolved with extremely diversified forms
from prokaryotes to the most sophisticated multicellular eukaryotes. Haematopoietic cells from
mammalians have adapted a transient and highly versatile means for the direct transfer of molecular information through cell-cell channels. This channel takes place and operates transiently at a
highly specialised interface now referred to as the immunological synapse. The oriented transfer of
membrane molecules from one cell to another is now referred to as trogocytosis, a cell process
discovered recently, but which consequences have been described for decades without clear understanding of its cellular basis. This article will review current state-of-the-art knowledge on trogocytosis,
its technological use and physiological significance.
Introduction: Transient Cell-cell Contacts Take Place at the
Immunological Synapse Between Lymphoid Cells
Haematopoietic cells are highly mobile, and frequently engage numerous contacts with other
cells. To fulfil their immunological functions, these contacts must enable the lymphoid cells to
recognize and discriminate normal self tissues and cells from foreign ones, including microbial pathogens, parasites and transformed cells. The site of such meetings is variable, from blood and vasculature to inflamed tissues and lymphoid organs. Three successive phases characterize the cell-cell contact involving lymphoid cells: the attachment/scanning/activation phase, the lymphoid cell response
phase and the cell dissociation. However, given the huge number of possible encounters and responses the lymphocyte has to face, cell contacts are usually transient, and adapted to the functions
that immune cells will fulfil. In vitro, while a normal T lymphocyte may bind, scan and release an
autologous resting T lymphocyte within ten seconds because no activation ensued the scanning of
its surface, the same cell may engage a cognate interaction for hours with an antigen-presenting cells,
till adequate cytokine secretion takes place. The lymphoid cell surface in tight contact with a scanned
cell (we will refer below to this recognized cell entity as to “target cell”, regardless of the recognizing
lymphoid cells and nature of its response) is also unstable in structure and supramolecular organization.
The immunological synapse (Fig. 1) has been the subject of recent reviews (see for instance1-4)
and will not be discussed further here. We will focus our review on events related locally and temporally to this structure: the intercellular transfer of membrane patches located at the apposed surfaces.
*Corresponding Author: Jean-Jacques Fournié—Groupe d’Etude des Antigènes NonConventionnels,
département Oncogénèse & Signalisation dans les Cellules Hématopoiétiques, INSERM Unité 563,
Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan,
BP3048, Hôpital Purpan, 31024 Toulouse Cedex 03, France, email: [email protected]
Cell-Cell Channels, edited by Frantisek Baluska, Dieter Volkmann, and Peter W. Barlow.
©2005 Eurekah.com.
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Cell-Cell Channels
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Figure 1. The immunological synapse of a cytolytic T lymphocyte (green membrane) attacking a B-cell lymphoma
target(red). Note the concentration of phosphoprotein signals at the center of the synapse (anti phosphoprotein
antibody, stained blue) of the killer cell, prior to delivery of its lethal hits.
These have been described recently,5,6 and may take place through either large synapses or conversely very narrow structures referred to as nanotubes.7 Their possible role in cell communication
will be discussed below.
First Findings of Intercellular Transfer of Membrane Markers Through the SI
Several reports in the 70'-80’s had described the presence of unexpected markers on the cell
surface of lymphocyte subsets known for not expressing them, such as Ig and allogenic MHC molecules on T cells8,9 or Mls superantigen on IE cells.10 Along the same line, but at the time not
understood as the same process, was the acquisition of fluorescence derived from labelled cell targets
by antigen-specific effector T cells.11 Although of unclear significance at the time, a major breakthrough in this domain was brought by the demonstration that GFP-MHC molecules derived from
antigen presenting cells could be acquired by antigen-specific CD8+ CTL through their immunological synapse.12 Both TCR and CD28 T-cell surface receptors were found to trigger what by then
was thought to be the mere consequence of uptake by internalization of cognate receptor/ligand
complexes.13
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Molecular Transfers Through Transient Lymphoid Cell-cell Channels
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Figure 2. Example of ectopic marker Igµ chain (stained yellow) present on the surface of cytolytic T lymphocyte
after it attacked an IgM+ B-cell lymphoma target as in (Fig. 1) This Ig was nibbled from the B cell surface and has
a short half-life on the T cell surface (~1-2 hr).
Further, two nearly simultaneous reports described however this process to be of wider occurrence, being also mediated by antigen-specific B lymphocytes14,15 and not restricted to capture of
ligand molecules in T cells, where it encompasses capture of most surface molecules from the antigen cells.16 Likewise, the ability of other lymphoid cell types to nibble the surface of cells to which
they are actively conjugated was soon documented in activated γδT cells17 and in activated NK cells
either in vitro and in vivo.18-22
CD4 T lymphocytes were also found able to capture MHC Class II molecules.23,24 By then, it
became clear that most lymphoid cells were fully capable to acquire/nibble/capture/transfer
membrane-derived molecules from cells to which they bind (Fig. 2),25 but despite little understanding of its physiological function, this process was called “trogocytosis” from the greek trogos –to
nibble-.26
Two Different Ways for Cell-cell Transfer Between Lymphoid Cells
Cell-cell Channels by Trans-synaptic Trogocytosis
On the basis of published data, there is global agreement for trogocytosis as an active process
which takes place between cells in contact through an immunological synapse, is highly polarized
from the target cell to the effector lymphocyte, and only results in transfer of membrane molecules,
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Figure 3. Confocal image of a conjugate T lymphocyte-lymphoma cell undergoing trogocytosis illustrating the
large patches of green fluorochrome-labelled membranes swapping from one cell to the other (image taken 5' after
cell contact).
whatever their chemical structure. Recent work suggests however that under some defined circumstances, the transfer may be bi-directional with effector membrane transfer on the target cell surface,27 resulting in a formal molecular swapping28 between conjugated cell partners (Fig. 3). Here
however, one might argue that of two cells conjugated through an immunological synapse, each one
is the other’s target, opening the possibility that bidirectional transfer just reflects each effector cell’s
activation. Little -if any evidence- supports the possibility that target-derived cytosol molecules are
acquired during the immunological synapse, or that any such transfer occurs in absence of cell-cell
contact. Clearly, trogocytosis is totally different from capture of soluble secreted exosomes which
don’t need cell-cell contact to occur and are usually detected once cells which exchange exosomes
have been coincubated for 24 hours or more.29
How then does membrane material from one cell switches onto the surface of conjugated cells?
Much remains to be clarified on this topic, but important clues were provided in the CD8 CTL/
target cell model, where superb electronic images of the conjugates evidenced the presence of bridges
localised at the immunological synapse between these cells.30 There, small membrane continuities
between effector and target cells bridge physically both cells through their surfaces, creating small
pores. No such observations have ever been made with other lymphoid cell types, but it is now
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Figure 4. Cell-cell nanotubes (nt) progressively formed at the dissociation of an immunological synapse between
a γδ T lymphocyte and an anaplastic lymphoma cell target. The intracellular cytolytic granules of γδ T lymphocytes
are stained red using Lyso-Tracker, while the anaplastic lymphoma cytoplasm is stained green with Calcein for
viability and its cell membrane is stained blue using the PTIR271 dye (reagent provided by courtesy of B. Gray,
PTIR-Research Labs, Ex, IL). Note also the trogocytosis taking place in the upper left side conjugate, seen as blue
membrane accumulated at the attacking γδ T cell synapse.
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Figure 5. A mechanistic model for trogocytosis.
tempting to speculate that similar bridges are formed at most immunological synapses involving
almost any lymphoid cell types.
Cell-cell Channels by Post Synaptic Intercellular Nanotubes
Two recent studies have also uncovered another type of cell-cell channels, made of extremely thin
tubular structures of 50-200 nm diameter and several tens of µm length, with an F-actin skeleton
and a membrane bilayer.7 Not only the pheochromocytome cell line P12 in the initial study but also
human lymphoid cells such as blood NK cells, macrophages, and EBV-transformed B cells make
nanotubes31 (and our unpublished observations, see below). In contrast with the stable immunological synapse of two intimately bound cells however, these highly labile nanotubular structures
appear transiently at the dissociation phase of immunological cell conjugates. As one cell moves
away, several nanotubes anchored at its previous attachement appear as unfolded from the pseudopode
of the amoeboid shape of the motile, crawling lymphocyte, in a “webspider” style (Fig. 4). Thus,
short-lived nanotubular networks could be assembled de novo and rapidly erased between post
synaptic, moving immune cells. Since such structures actively transport selected endosome-like organelles and membrane proteins or lipids but not cytosolic metabolites,7 the tubular networks might
play some yet unclear role in late cell-cell communication.32 Unfortunately, adequate experimental
methods for analyzing the role and function of nanotubes are scarce, since shear force applied on
cells along flow cytometry analysis for instance is inadequate to maintain these labile structures, and
their study in vivo does not seem much easier either. Nanotubes are described in greater detail in
another chapter of this book.
In addition, the relation of trogocytosis to nanotubular highways remains thus far unknown,
although our current understanding of both processes would strongly favour a temporal separation
of both entities: trogocytosis and then nanotubular networking. A main characteristic of trogocytosis
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Figure 6. Quantification of trogocytosis based on distributions of fluorescence per pixel using successive confocal
images of cell conjugates with fluorescent target cell membranes involved in immunological synapses. (J. Gertner
et al, unpublished).
is its propensity to increase with effector cell activation, and most likely with duration of the immunological synapse. Since this latter reflects the counting process, i.e., the integration of activatory
signaling cascades below the synapse, it is thus also the consequence of activating ligand detected on
the target cell surface. Therefore, analytic techniques have been developed that monitor trogocytosis
as a readout for immunological activation of effector cells.
A Mechanistic Model of Trogocytosis
The main features of intercellular transfer through cell-cell channels referred to as trogocytosis
involve: its strict localization (and time dependence to immunological synapses), its restriction to
membrane material, and the main polarization of transferred molecules from target to the effector
cell. In addition, there is of as yet no selectivity in the structural class of membrane molecules that
shift from one cell to the other, suggesting the whole lipidic bilayer is involved in this movement. We
present below a model for trogocytosis which integrates these features (Fig. 5).
This model involves a progressive acquisition of target cell membrane patches by the effector
cell, only once the synapse has been formed. This latter relies upon effector cell activation by the
antigen/ activating stimuli scanned at the target surface during the synapse existence. This model
has the following implications:
-the structure of the immunological synapse must involve membrane bridges in all kinds of cell
conjugates where trogocytosis takes place.
- the whole cell membrane structure may pass in the form of patches and integrates with the
same orientation on the effector cell membrane.
-the effector cell actively “sucks” the target cell surface, since its pretreatment with inhibitory
drugs abrogate this activity,
-dissociation may release live cells with surface markers they did not encode for (ectopic markers), and which lifespan may enable to mediate some specific functions (selective binding
for example, see below).
This model also puts forward several questions:
-How does the effector cell achieve selectivity for membrane but not cytoplasm molecules in its
acquisition process? Alternatively, this could be formulated as: what blocks the molecular
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Figure 7. Principle and basic method for measuring trogocytosis by flow cytometry. Target cells must be stained
on their membrane by a green (or red) fluorochrome easily monitored with PMT1 or PMT2 on flow cytometers.
The analysis is gated on more than 10, 000 effector cells only ( R2 box in this example), acquired before (t0') and
after (t60') minutes of coincubation. These increased their green fluorescence from 5 to 40 in this example. Note
that in the example shown here, the target cells (bright green cells on Y axis did simultaneously trogocytose the
red fluorochrome (incorporated prior to coincubation) from the surface of effector cells: bidirectional trogocytosis.
diffusion or acquisition from the target cell? Are there molecular filters, physical constraints
(size, hydrophobicity, ….) induced locally and temporally, and finally is there any selective
sorting of the respective partners compartments at the level of these bridges?
-Why is such a membrane acquisition polarized from target to effector? Conceivably although
one lymphoid cell (e.g., a T lymphocyte) may recognize activating ligands (e.g., MHC/
peptide molecules) on the bound target cell surface, it is likely that in frequent cases, the
“target” cell is also another lymphocyte which may also recognize activating ligands on the
“effector” cell and thus trigger its own activity en retour. Thus such situations should provoke trogocytosis apparently unpolarized for they just result from the sum of two-reverse
direction trogocytosis.
-Is the receptor-mediated activation of one effector cell the driving force that triggered its
nibbling activity?
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Figure 8. NK cell-mediated trogocytosis of EBV-transformed B-cell targets.
-At dissociation in the model applied to a conjugate of a non cytolytic effector and its target,
why and how do both cells achieve separation at the very same place of the bilayer continuity so that they both continue existing without profound membrane chimerism?
-Does some trogocytosis occur nonsynaptically, through other kinds of cell-cell channels? This
question may apply to the recently discovered intercellular nanotubes described in this
book.
Methods and Techniques for the Monitoring of in Vitro Trogocytosis
Confocal microscopy is a very useful tool to visualize trogocytosis. This technique was applied in
the study from both J. Sprent’s and F. Batista’s groups who provided a remarkable dynamic imaging
of T-cell and B-cell mediated antigen-specific trogocytosis, repectively.12,14 These studies took advantage of GFP-labelled specific antigen which selective capture by specific lymphocytes could be
monitored in time and space. Trogocytosis by NK cells was also depicted using this technique.18
Quantitative study of results is based on quantification of images with using counts of fluorescence intensity on selected pixels or related image analysis. Although highly informative at the single
cell level (see example in Fig. 6), most microscopy–based techniques were however not really adequate for the quantitative studies on large number of cells from whole lymphoid populations.
In this regard, flow cytometry proved an unvaluable tool to rapidly quantify trogocytosis in
effector cell subsets. Hudrisier's group took advantage of hydrophobic fluorochromes stably inserted
in the cell membranes of antigen-presenting cells for demonstrating that their trogocytosis by
antigen-specific CD8 T lymphocytes actually encompassed the capture of integral membrane patches,
with transfer of the antigen but also of most membrane proteins and lipids, including the fluorochrome tracer.16 Using one hour in vitro cocultures of target cells prelabelled with PKH67 and alike
fluorochromes which stably insert in membranes33 with unlabelled effector γδ T or NK cells, we
showed that effector cell activation was correlated to their trogocytic acquisition of PKH.17,20 Experimental settings are quite simple, since cocultures comprise usually two cell types: one as bait and
one as hunter, usually mixed in a five-to-one bait–to-hunter cell ratio. The assay is versatile since
highly variable coculture conditions (time, temperature, exogenous stimuli or inhibitor drugs) can
be used. Its final readout is the mean of PKH fluorescence intensity (PKH mfi) of the whole effector
cell population as measured by straightforward flow cytometry analysis. Statistical significance of
the results is ensured by gating the analysis on effector cells only, usually 30,000 cells from which the
PKH mfi is calculated. We found most convenient to compare the PKH mfi after 0’ (negative
control) and 60' of cell coincubation, and with setting the cytometer detection sensitivity such as 1°)
the background fluorescence PKH mfi of effector cells prior to cell contact is below the first decade
(usually t0' mfi~5), and 2°) stained “bait” cells have their PKH mfi above the fourth decade (usually
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Figure 9. Exogenous B cell-specific stimulus (anti Igµ) selectively increases the trogocytosis mediated by B lymphocytes. Left: total PBMC (lymphocyte gate) were coincubated with PKH67-labelled Burkitt’s lymphoma cell
line (bait cells). Right: trogocytosis measured by green (PKH67) fluorescence intensity of the gated CD20+ B cells
in the specified conditions. Note that nonB cells did not increase their trogocytosis in the stimulated assay, as
compared to control t60'.
t0' mfi for targets is > 5,000). While measuring the trogocytosis-induced fluorescence loss from
target cells could represent a readout for this test, we found it far less sensitive than the reciprocal
measure of its appearance on unlabelled effectors.
Usually, quantification of trogocytosis may be based on arithmetic or geometric mean of green
fluorescence intensity from raw data, but also using the fold increase of fluorescence on effector cells
by the formula: fold increase = log2 (PKH mfi at t60'/ PKH mfi at t0'). A typical example for
transfer is given above, with increases of one order of magnitude: mfi shifts from 5 to 40. Their
graphical representation may conveniently show either raw flow cytometry results (Fig. 7), histograms or heat maps of fluorescence intensity or their increase (as fold factors, see § below). Statistical
comparisons of sets of data are usually best obtained by Mann-Whitney’s log rank sum test, since the
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Figure 10. Model for trans-synaptic infections of NK cells by EBV. Left: conventional mode of EBV infection.
Right: trogocytosis-promoted infection.
distributions of cell fluorescence intensities acquired by bulks of effector and noneffector cells are
not always corresponding to normal parametric distributions.
Intercellular Transfer in Activated Lymphoid Cells
In the settings described previously, the usual trogocytosis of a resting T lymphocyte towards
autologous cells in absence of any exogenous stimulus is typically almost null, of mfi (t0) = 4.8, mfi
(t60) = 4.8 +/- 0.2, corresponding to very little if any significant change in fluorescence. However,
these figures are highly divergent as the target cell carries stimulating molecules, like antigen/MHC,
or alloantigen, or mitogen for T lymphocytes: typically of mfi (t0) = 4.8, mfi (t60) = 150 +/- 20.
Activation of trogocytosis is not solely due to TCR-delivered signals however, as very similar conclusions may be drawn from NK cell stimulation by adequate target cells harbouring activating ligands
and lacking inhibitory molecules such as self HLA alleles.20 In the context of such cell targets, NK
sometimes trogocytose extremely high amounts of the target cell surface, typically up to 1-10 % of
the membrane material constituting the target cell membrane (Fig. 8). An example is shown in
Figure 8, with mfi (t0) = 4.8, mfi (t60) = 1200 when IL2-activated NK cells trogocytose HLA-deficient
or allogeneic EBV-transformed B cell line targets.
The first studies in this domain12,16 have documented this correlate by analysing activated T
lymphocytes: stronger amounts of target cell membrane derived fluorescence was acquired by T cells
stimulated with increasing peptide antigen concentrations loaded on the APC target, demonstrating
the strong dependence of trogocytosis to TCR-driven stimulation signals. Thus effector cell activation was the driving force for the intercellular transfer. Further confirmation of this view came from
another study with T cells which show an MHC-unrestricted mode of antigen recognition, the
human γδ T lymphocytes. In this model, the T lymphocytes respond to exogenous soluble small
nonpeptide antigens referred to as phosphoantigens.34 Using well established γδ T targets cell lines
stained with a membrane fluorochrome and exposed for one hour to the γδ T cells, it was shown that
the spontaneous trogocytosis of tumour cells increased by adding either soluble or cell phosphoantigens
to the culture medium.17 Similar conclusions were drawn from NK cell models, where TCR-mediated
antigen specific activation is absent. In contrast with the relation of effector-to target in cytolytic
assays, where lysis increases with the killer-to-target cell ratio, here the trogocytosis increases on the
opposite, with the target-to-effector cell ratio. This is due to the fact that any effector gets more
chances to trogocytose and acquire fluorescence with increasing numbers of surrounding fluorescent
surfaces, i.e., target cells.
Spontaneous Homotypic Intercellular Transfer in Lymphoid Cancer Cells
As specified above, resting lymphocytes do not mediate trogocytosis in absence of any stimulus.
This can be easily demonstrated experimentally by the fully stable intensity of membrane fluores-
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Figure 11. Trogotype of a healthy adult donor to cancer cells. 24 different cancer cell lines (columns) were tested
for trogocytosis by 5 distinct lymphoid cell subsets (lines) from this donor. Intensity of the trogocytosis here shown
as ∆ mfi (t60’minus t0') from raw flow cytometry data is represented as a heatmap of green colour scale.
cence (using the PKH67 fluorochrome for instance) of whole blood lymphocytes derived from one
donor and coincubated for one hour without exogenous stimulus but with the same cells prelabelled
with PKH67. This result is strictly recovered whether any purified cell subset comprising the initial
PBMC sample is tested separately. Some cancer cells however do present the unusual ability to
strongly trogocytose cells of the same cell line, in absence of exogenous stimulus. This has been
examplified with the Daudi Burkitt’s lymphoma cell line and other lymphoma and leukaemia cell
lines, which spontaneous self trogocytic activity is related to their constitutive autoreactivity. For the
Daudi cells, their BCR-driven signals fully control this spontaneous auto-trogocytosis, as indicated
by both receptor agonists and selective inhibitors of BCR signal transduction.35 Although the physiological significance of this finding remains yet undetermined, it points out the possible intercellular
transfer of tumoural cell surface markers (oncoproteins) onto surrounding nonmalignant lymphocytes of the same subset and its physiological consequences. Our preliminary results in this topic
tend to indicate that such cancer-to-noncancer cell trogocytosis does occur in the context of some
hematopoietic malignancies.
Physiological Consequences of Intercellular Transfer by T Lymphocytes
Although different roles for trogocytosis have been proposed, none has thus far been demonstrated formally. The first reports that described intercellular transfers involving T cells, although
this was not called trogocytosis by then, showed that thymocytes cells acquired MHC proteins from
their surrounding cell environment.8,36 This was though to reflect a passive process,37 but later
intercellular transfer from antigen-presenting cells38 was found to be highly active, resistant to cycloheximide,39 and to further drive to internalization by a surface-receptor-driven endocytic process13
that involves a highly active cytoskeleton remodelling.40 In this context, MHCp capture was shown
to result in further fratricide killing by neighbouring T cells.12,16,41 This elimination reaction “en
chaine” was thus proposed to account for exhaustion of the immune response. Conceivably also, this
homeostatic control could induce tolerance39 or appearance of antigen-specific Treg cells that acquire alloantigen from antigen-presenting cells and present it to activated syngeneic CD8 T cells, to
provide them with death signals.42 Another alternative was to propose that since T cells compete in
vivo for APC,43 the antigen nibbling by high affinity lymphocytes exhaust it from the APC surface
and thus promotes the in vivo selection of mature, high affinity T cell clones.44 This latter hypothesis is highly speculative however, since trogocytosis does not exhaust the APC surface from its
structural components. Most of trogocytosis that was analysed carefully showed that quantitatively,
it concerns at best around 1-10% of the cell surface material (most often this is rather of around 1‰
in ag-induced trogocytosis) and not its whole amount, and qualitatively that trogocytosis is not a
selective sorting for some few cell surface markers but rather a global transfer of MHC and many
other compartments.16 Accordingly, nonMHC molecules such as costimulatory molecules including CD80, CD86, B7-H1, PD-L2, B7-H3, and B7RP-1 are also acquired through trogocytosis by
T lymphocytes and to provide their functional activities to the recipient cells.45-47 During
transendothelial migration, activated T cells also acquire a variety of markers from endothelial cell
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plasma membranes, possibly to further deliver them to perivascular sites. These acquired endothelial
markers include CD31, CD49d, CD54, CD61, and CD62E (along with the lipophilic dye
(DiOC-16) used to detect the endothelial cells).48
The bad counterpart of nonselective T cell-mediated trogocytosis is also its unfortunate ability to
convey viral targeting. Molecules such as OX40L, once acquired by normal reactive CD4 T cells,
enable to stimulate latent HIV-1-infected cells to produce viral proteins via OX40 signaling.49 Likewise, cell contact rapidly induces polarization of the cytoskeleton of HTLV-I infected cell to the
cell-cell junction with uninfected T cells, enabling both HTLV-I core protein complexes and its
genome to be trogocytosed by the uninfected cell.50 In line with similar results documented earlier
for NK cells51 (see below), it is highly likely that other lymphotropic viruses such as HIV-1 may
similarly subvert normal T cell physiology for their propagation. The detection of HIV-specific T
lymphocytes based on the monitoring of their ability to trogocytose an HIV-specific Tat peptide
complexed to HLA-GFP has thus been proposed recently.52
Physiological Consequences of Intercellular Transfer by NK Cells:
Protective Role of Acquired HLA Class I Alleles, Cytokine Receptor and
Deleterious Role of Acquired Viral Receptors
In NK cells, which surface receptors may transduce either activatory or inhibitory signaling
cascades according to the recognized ligands,53 the unselective acquisition of extremely high amounts
of target cell surface markers may have opposite consequences. Since self-MHC class I alleles are
protective against NK cell lysis, their acquisition strongly influenced the NK cell activity in vivo,
such as ligand uptake,22 partial inactivation of cytotoxic activity by transduction of the inhibitory
signals from the detected protective MHC molecules of ectopic origin in vivo21 and in vitro.20
Interestingly enough, a recent study has demonstrated that target cells involved in immunological
synapses with NK cells are also able to acquire their NK receptors (KIR molecules), and that these
molecules were associated with intracellular signling in the recipient cells, suggesting that in this
setting, the trogocytosis was bidirectional.27
Although it remains to be shown that in this case the target cell was not itself an activated
lymphocyte recognizing stimulating ligands borne at the NK cell surface, this finding indicated that
some synapses may be privileged sites for bidirectional information and molecules exchanges. In this
regard, IL15 represents a unique illustration of a possible evolutive role of trogocytosis. IL15 is a well
known survival and maturation cytokine for NK cell differentiation.54 Thus presence of its
heterotrimeric receptor IL15R (αβγ chain complex) at the cell surface of maturating NK cells55 is of
the uttermost importance to their development.56 However, the mechanism by which IL-15Rα
mediates IL-15 functions is unique among cytokines. Although initially, IL-15Rα was thought to be
a component of this heterotrimeric receptor complex required for mediating signalling, it barely acts
as such actually since it is dispensable for or IL-15 action in vivo and is solely expressed on monocytes/dendritic cells but not by NK cells! This chain serves rather to capture and present IL-15 in
trans through immunological synapses to cells expressing the IL-15Rβγ signalling component57 and
involved in a direct cell-cell contact channel (trogocytosis). IL-15 trans-presentation to NK cells by
trogocytosis operates in vivo and increase their maturation and lytic activity, thereby augmenting
the tumour immune surveillance mechanism.58 This explains the broad, nonlymphoid expression
pattern of IL-15Rα and its dispensable expression by recipient lymphocytes in vivo. Hence
trogocytosis-mediated cytokine delivery by multicomponent acquisition represents a new concept
for lymphocyte developmental biology and haematology.59
The darker face of NK cell-mediated trogocytosis of target cells is also due to the maintenance of
functionality for cell surface receptors acquired from the target cells by the attacking NK cell. While
NK cells establish immunological synapses with EBV-infected B cells prior to delivering their lytic
granules, NK cells acquire their CD21 receptor for EBV infection.51 This enables further binding of
EBV to NK cells surface to which no attachment was otherwise possible, and permitted NK cell
infections by EBV in vitro, which could account for clinical findings of neoplastic EBV+ NK histotypes
in malignant infectious mononucleosis60 (Fig. 10).
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Technological Consequences of Trogocytosis
As depicted above, whatever the effector/target conjugate considered, trogocytosis increases with
activation. It is thus straightforward to use a trogocytosis assay involving a defined effector lymphocyte and a weakly trogocytosed “bait” cell line for the screening of new stimuli to the above lymphocyte. In the example shown below, the B-cell mediated trogocytosis of a bait cell line without exogenous stimulus is referred to as baseline: mfi (t0) = 4.8, mfi (t60) = 16, while mfi (t60) = 52 when a
B-cell-specific stimulus was added to the coincubation well (Fig. 9). Accordingly, trogocytosis increases with: stimulus concentration, strength, bait cell number etc…, or conversely decreases with
inhibitors of effector cells (see Src inhibitor Fig. 8). This property has been used to compare the
potency of different phosphoantigens which selectively activated human γδ T cells, and the resulting
ranking fully matched the results of other classic functional assays for these lymphocytes.17
Trogotypes for Immuno-monitoring the Lymphoid Cell Reactivity to
Cancer
Among the possible conceptual application of assays based on trogocytosis to measure lymphocyte reactivity to soluble or cell antigens presented in the previous paragraph, one was indeed to
monitor the lymphoid cell reactivity to cancer cells. The ability of the immune system to “see “tumour cells in a cancer patient is currently a crucial question to oncologists.61 It is important because
if cancer cells are seen but the immune response is qualitatively inadequate, this prompts the clinician for other kinds of therapeutic directions than if the cancer cells are totally ignored by the
immune system (in which case better issues may be expected by reenabling its detection). We thus
monitored lymphoid cell contact with cancer cells through trogocytosis by a two-step process wherein
the tumour cell are labelled with PKH67, prior to 60' (or 0') coincubation with whole un-separated
PBMC from the patients, the labelling of PBMC subsets with anti-CD lymphoid cell typing reagents and measuring each subset-specific trogocytosis of the tumour cell. This techniques enables
the direct and individual quantification of all cell interactions with the proposed bait cell, and is
highly versatile as it is amenable to declinations as various as i) identification of a reactive blood cell
subset, ii) identification of the possible contact cell, iii) screening and/or identification of exogenous
stimuli enabling the trogocytosis and its activation.62 By multiplexing this analysis to one human
PBMC donor tested against several cancer cells simultaneously, one can produce a global mapping
of the whole PBMC trogocytic ability to a large panel representative of several different cancer cells.
This map, defined as the trogotype (Fig. 10), constitutes a stable and characteristic profile for any
individual’s ability to “see” cancer cells. As required above for clinical issues, we are currently analysing
the temporal changes associated in the trogotype of defined cancer patients monitored through
longitudinal follow-ups of their clinical evolution, possibly meaningful for their treatment.
Transynaptic Acquisition of Functional Markers in Oncology
Novel studies about haematological but also in nonhaematological cells now appear more and
more frequently, that describe intercellular transfers mediated through cell contacts, with features
corresponding to trogocytosis as described in this article. This concerned the intercellular transfer of
chemokine receptor CCR5 from HIV –infected macrophages which may lead to HIV infection of
tissues without endogenous CCR5 expression,63 but also of the intercellular transfer of cell transporters such as the P-glycoprotein (P-gp) by human cancer cells.64 In this latter case, the transfer was
demonstrated in vitro and in vivo, and led to acquisition of the multidrug resistance (MDR) phenotype by human neuroblastoma cells. This example documented trogocytosis through cell-cell contact distinct from the conventional immunological synapse, but clearly evidenced the selective advantage acquired by the recipient cell upon acquisition of the functional molecules. The trogocytosis
here enabled recipient cells to resist to chemotherapy, and this selective advantage enabled investigators to evidence the progressive spread of P-gp recipient cells through a whole cancer cell population
that does not encode for this marker. Former reports had indeed mentioned the increased resistance
to toxic molecules in a mixed coculture with resistant and sensitive cells65,66 or in vivo around the
tumour mass.67,68 The finding of proteins with unexpected patterns of cell expression, notably in
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Molecular Transfers Through Transient Lymphoid Cell-cell Channels
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tissues known for not expressing the corresponding genes is thus likely to increase in the near future.
These findings, in the light of our current understanding of trogocytosis, should also induce for
more careful appraisal of the proteome profilings currently undertaken to characterize cancer cells in
their local microenvironment. Of great importance will be the careful assignment of their original
producing cell, which is also appearing as a witness of past interactions with the tumours.
Concluding Remarks
This article as reviewed current features associated with a recently discovered field of cell biology,
namely the frequent acquisition of ectopic and functional cell markers through immunological and
possibly other nonimmunological cell synapses. Indeed cell-cell channels have always been considered a central aspect of cell biology. With haematopoietic cells and trogocytosis however, these appear to provide a more and more versatile way of cell communication, with its so far not sufficiently
appreciated consequences in cell biology. At the higher scale of whole, mixed cell populations, tissues and organism biology, these cell-cell transfers are very likely to lead to the appearance of complex and transient phenotypes not present in each of the selective cell components of the population
taken separately. This new combinatorial dimension of system biology may thus uncover the appearance of complex and transient phenotypes which careful analysis at the single cell level will be
hardly evaluated using our current tools of biological science. Novel techniques will need to be
designed to bring such complexity into a tractable scientific arena.
Acknowledgements
The author’s work is supported by INSERM, MENSR and l’ARC.
References
1. Kupfer A, Kupfer H. Imaging immune cell interactions and functions: SMACs and the Immunological Synapse. Semin Immunol 2003; 15:295-300.
2. Gascoigne NR, Zal T. Molecular interactions at the T cell-antigen-presenting cell interface. Curr
Opin Immunol 2004; 16:114-119.
3. Krogsgaard M, Huppa JB, Purbhoo MA et al. Linking molecular and cellular events in T-cell
activation and synapse formation. Semin Immunol 2003; 15:307-315.
4. Davis DM, Igakura T, McCann FE et al. The protean immune cell synapse: A supramolecular
structure with many functions. Semin Immunol 2003; 15:317-324.
5. Hudrisier D, Bongrand P. Intercellular transfer of antigen-presenting cell determinants onto T
cells: Molecular mechanisms and biological significance. FASEB J 2002; 16:477-486.
6. Davis DM. Assembly of the immunological synapse for T cells and NK cells. Trends Immunol
2002; 23:356-363.
7. Rustom A, Saffrich R, Markovic I et al. Nanotubular highways for intercellular organelle transport.
Science 2004; 303:1007-1010.
8. Nagy Z, Elliott BE, Nabholz M et al. Specific binding of alloantigens to T cells activated in the
mixed lymphocyte reaction. J Exp Med 1976; 143:648-659.
9. Nagy Z, Elliott BE, Nabholz M. Specific binding of K- and I-region products of the H-2 complex
to activated thymus-derived (T) cells belonging to different Ly subclasses. J Exp Med 1976;
144:1545-1553.
10. Speiser DE, Schneider R, Hengartner H et al. Clonal deletion of self-reactive T cells in irradiation
bone marrow chimeras and neonatally tolerant mice. Evidence for intercellular transfer of Mlsa. J
Exp Med 1989; 170:595-600.
11. Sellin D, Wallach DF, Fischer H. Intercellular communication in cell-mediated cytotoxicity. Fluorescein transfer between H-2 d target cells and H-2 b lymphocytes in vitro. Eur J Immunol 1971;
1:453-458.
12. Huang JF, Yang Y, Sepulveda H et al. TCR-Mediated internalization of peptide-MHC complexes
acquired by T cells. Science 1999; 286:952-954.
13. Hwang I, Huang JF, Kishimoto H et al. T cells can use either T cell receptor or CD28 receptors
to absorb and internalize cell surface molecules derived from antigen-presenting cells. J Exp Med
2000; 191:1137-1148.
14. Batista FD, Iber D, Neuberger MS. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature 2001; 411:489-494.
Baluska(Fournie)
15
9/15/05, 11:19 AM
Cell-Cell Channels
16
15. Batista FD, Neuberger MS. B cells extract and present immobilized antigen: Implications for affinity discrimination. EMBO J 2000; 19:513-520.
16. Hudrisier D, Riond J, Mazarguil H et al. Cutting edge: CTLs rapidly capture membrane fragments from target cells in a TCR signaling-dependent manner. J Immunol 2001; 166:3645-3649.
17. Espinosa E, Tabiasco J, Hudrisier D et al. Synaptic transfer by human gamma delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol 2002; 168:6336-6343.
18. Carlin LM, Eleme K, McCann FE et al. Intercellular transfer and supramolecular organization of
human leukocyte antigen C at inhibitory natural killer cell immune synapses. J Exp Med 2001;
194:1507-1517.
19. McCann FE, Suhling K, Carlin LM et al. Imaging immune surveillance by T cells and NK cells.
Immunol Rev 2002; 189:179-192.
20. Tabiasco J, Espinosa E, Hudrisier D et al. Active trans-synaptic capture of membrane fragments by
natural killer cells. Eur J Immunol 2002; 32:1502-1508.
21. Sjostrom A, Eriksson M, Cerboni C et al. Acquisition of external major histocompatibility complex class I molecules by natural killer cells expressing inhibitory Ly49 receptors. J Exp Med 2001;
194:1519-1530.
22. Zimmer J, Ioannidis V, Held W. H-2D ligand expression by Ly49A+ natural killer (NK) cells
precludes ligand uptake from environmental cells: Implications for NK cell function. J Exp Med
2001; 194:1531-1539.
23. Undale AH, van den Elsen PJ, Celis E. Antigen-independent acquisition of MHC class II molecules by human T lymphocytes. Int Immunol 2004; 16:1523-1533.
24. Wetzel SA, McKeithan TW, Parker DC. Peptide-specific intercellular transfer of MHC class II to
CD4+ T cells directly from the immunological synapse upon cellular dissociation. J Immunol 2005;
174:80-89.
25. Poupot M, Pont F, Fournie JJ. Profiling blood lymphocyte interactions with cancer cells uncovers
the innate reactivity of human gamma delta T cells to anaplastic large cell lymphoma. J Immunol
2005; 174:1717-1722.
26. Joly E, Hudrisier D. What is trogocytosis and what is its purpose? Nat Immunol 2003; 4:815.
27. Vanherberghen B, Andersson K, Carlin LM et al. Human and murine inhibitory natural killer cell
receptors transfer from natural killer cells to target cells. Proc Natl Acad Sci USA 2004;
101(48):16873-16878.
28. Sprent J. Swapping molecules during cell-cell interactions. Sci STKE 2005; 2005(273):pe8.
29. Amigorena S. Exosomes derived from dendritic cells. J Soc Biol 2001; 195:25-27.
30. Stinchcombe JC, Bossi G, Booth S et al. The immunological synapse of CTL contains a secretory
domain and membrane bridges. Immunity 2001; 15:751-761.
31. Onfelt B, Nedvetzki S, Yanagi K et al. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.
J Immunol 2004; 173:1511-1513.
32. Onfelt B, Davis DM. Can membrane nanotubes facilitate communication between immune cells?
Biochem Soc Trans 2004; 32:676-678.
33. Slezak SE, Horan PK. Cell-mediated cytotoxicity. A highly sensitive and informative flow cytometric
assay. J Immunol Methods 1989; 117:205-214.
34. Poupot M, Fournie JJ. Nonpeptide antigens activating human Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes.
Immunol Lett 2004; 95:129-138.
35. Poupot M, Fournie JJ. Spontaneous membrane transfer through homotypic synapses between lymphoma cells. J Immunol 2003; 171:2517-2523.
36. Sharrow SO, Mathieson BJ, Singer A. Cell surface appearance of unexpected host MHC determinants on thymocytes from radiation bone marrow chimeras. J Immunol 1981; 126:1327-1335.
37. Lorber MI, Loken MR, Stall AM et al. I-A antigens on cloned alloreactive murine T lymphocytes
are acquired passively. J Immunol 1982; 128:2798-2803.
38. Merkenschlager M. Tracing interactions of thymocytes with individual stromal cell partners. Eur J
Immunol 1996; 26:892-896.
39. Patel DM, Arnold PY, White GA et al. Class II MHC/peptide complexes are released from APC
and are acquired by T cell responders during specific antigen recognition. J Immunol 1999;
163:5201-5210.
40. Hwang I, Sprent J. Role of the actin cytoskeleton in T cell absorption and internalization of
ligands from APC. J Immunol 2001; 166:5099-5107.
41. Hanon E, Stinchcombe JC, Saito M et al. Fratricide among CD8(+) T lymphocytes naturally
infected with human T cell lymphotropic virus type I. Immunity 2000; 13:657-664.
42. Zhang ZX, Yang L, Young KJ et al. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med 2000; 6:782-789.
Baluska(Fournie)
16
9/15/05, 11:19 AM
Molecular Transfers Through Transient Lymphoid Cell-cell Channels
17
43. Kedl RM, Rees WA, Hildeman DA et al. T cells compete for access to antigen-bearing
antigen-presenting cells. J Exp Med 2000; 192:1105-1113.
44. Kedl RM, Schaefer BC, Kappler JW et al. T cells down-modulate peptide-MHC complexes on
APCs in vivo. Nat Immunol 2002; 3:27-32.
45. Sabzevari H, Kantor J, Jaigirdar A et al. Acquisition of CD80 (B7-1) by T cells. J Immunol 2001;
166:2505-2513.
46. Tatari-Calderone Z, Semnani RT, Nutman TB et al. Acquisition of CD80 by human T cells at
early stages of activation: Functional involvement of CD80 acquisition in T cell to T cell interaction. J Immunol 2002; 169:6162-6169.
47. Ferlazzo G, Semino C, Meta M et al. T lymphocytes express B7 family molecules following interaction with dendritic cells and acquire bystander costimulatory properties. Eur J Immunol 2002;
32:3092-3101.
48. Brezinschek RI, Oppenheimer-Marks N, Lipsky PE. Activated T cells acquire endothelial cell surface determinants during transendothelial migration. J Immunol 1999; 162:1677-1684.
49. Baba E, Takahashi Y, Lichtenfeld J et al. Functional CD4 T cells after intercellular molecular
transfer of 0X40 ligand. J Immunol 2001; 167:875-883.
50. Igakura T, Stinchcombe JC, Goon PK et al. Spread of HTLV-I between lymphocytes by
virus-induced polarization of the cytoskeleton. Science 2003; 299:1713-1716.
51. Tabiasco J, Vercellone A, Meggetto F et al. Acquisition of viral receptor by NK cells through
immunological synapse. J Immunol 2003; 170:5993-5998.
52. Tomaru U, Yamano Y, Nagai M et al. Detection of virus-specific T cells and CD8+ T-cell epitopes
by acquisition of peptide-HLA-GFP complexes: Analysis of T-cell phenotype and function in chronic
viral infections. Nat Med 2003; 9:469-476.
53. Vivier E, Nunes JA, Vely F. Natural killer cell signaling pathways. Science 2004; 306:1517-1519.
54. Becknell B, Caligiuri MA. Interleukin-2, interleukin-15, and their roles in human natural killer
cells. Adv Immunol 2005; 86:209-239.
55. Colucci F, Caligiuri MA, Di Santo JP. What does it take to make a natural killer? Nat Rev Immunol
2003; 3:413-425.
56. Schluns KS, Lefrancois L. Cytokine control of memory T-cell development and survival. Nat Rev
Immunol 2003; 3:269-279.
57. Dubois S, Mariner J, Waldmann TA et al. IL-15Ralpha recycles and presents IL-15 In trans to
neighboring cells. Immunity 2002; 17:537-547.
58. Kobayashi H, Dubois S, Sato N et al. Role of trans-cellular IL-15 presentation in the activation of
NK cell-mediated killing, which leads to enhanced tumor immunosurveillance. Blood 2005; 105:721727.
59. Schluns KS, Stoklasek T, Lefrancois L. The roles of interleukin-15 receptor alpha: Trans-presentation,
receptor component, or both? Int J Biochem Cell Biol 2005; 37:1567-1571.
60. Trempat P, Tabiasco J, Andre P et al. Evidence for early infection of nonneoplastic natural killer
cells by Epstein-Barr virus. J Virol 2002; 76:11139-11142.
61. Pardoll D. Does the immune system see tumors as foreign or self? Annu Rev Immunol 2003;
21:807-839.
62. Poupot M, Pont F, Fournie JJ. Inventors; INSERM patent. Global Scan for Cell Interactions.
INPI Paris 2004.
63. Mack M, Kleinschmidt A, Bruhl H et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells
by membrane-derived microparticles: A mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1
infection. Nat Med 2000; 6:769-775.
64. Levchenko A, Mehta BM, Niu X et al. Intercellular transfer of P-glycoprotein mediates acquired
multidrug resistance in tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102:1933-1938.
65. Tofilon PJ, Buckley N, Deen DF. Effect of cell-cell interactions on drug sensitivity and growth of
drug-sensitive and -resistant tumor cells in spheroids. Science 1984; 226:862-864.
66. Frankfurt OS, Seckinger D, Sugarbaker EV. Intercellular transfer of drug resistance. Cancer Res
1991; 51:1190-1195.
67. Miller BE, Machemer T, Lehotan M et al. Tumor subpopulation interactions affecting melphalan
sensitivity in palpable mouse mammary tumors. Cancer Res 1991; 51:4378-4387.
68. Petrylak DP, Scher HI, Reuter V et al. P-glycoprotein expression in primary and metastatic transitional cell carcinoma of the bladder. Ann Oncol 1994; 5:835-840.
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17
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Single Cell monitoring of trogocytosis and killing
in lytic synapse between anaplastic large cell lymphoma
and activated human γδ T lymphocytes
Jean Jacques Fournié, Julie Gertner, Mary Poupot, Aurélie Wiedemann.
Haematologica Reports (2006)
116
[haematologica reports]
2006;2(3):35-36
FOURNIÉ JJ
GERTNER J
POUPOT M
WIEDEMANN A
Groupe d’Etude des Antigènes
Non-Conventionnels,
Departement Oncogénèse &
Signalisation dans les Cellules
Hématopoiétiques,Unité 563 de
l’Institut National de la Santé et
de la Recherche Médicale,Centre
de Physiopathologie de Toulouse
Purpan, Toulouse, France
Single cell monitoring of trogocytosis and
killing in lytic synapses between anaplastic
large cell lymphoma and activated human γδ T
lymphocytes
irculating human γδ T lymphocytes
comprise a unique lymphoid cell
subset exerting strong cytolytic
activity against cancer cells.1 In healthy
adults, around 1% of peripheral blood
mononuclear cells are γδ T lymphocytes,
most of which harbour a CD3+ CD4- CD8NKG2D+ phenotype and express the same
TCR Vγ9/Vδ2 gene-encoded receptor for
antigens. These lymphocytes often referred
to as Vγ9/Vδ2+ T cells do respond to both
human cancer cells and tuberculosis infection, by the selective recognition of HLAunrestricted antigens with non-peptide
phosphoesters structures, the phosphoantigens.2
Natural phosphoantigens are thus produced by both mycobacteria and by
human cancer cells, although the metabolic pathways to produce phosphoantigens differ in both types of producing
cells. While mammalian cells and notably
human tumours produce the phosphoantigens isopentenyl pyrophosphate and
dimethylallylpyrophosphate through the
mevalonate pathway for cholesterol
biosynthesis, bacteria produce structurally related phosphoantigens like hydroxyldimethylallylpyrophosphate through a
non-mevalonate pathway unique to the
eukaryotic world.3 Since therapeutic aminobisphosphonates like Aredia™ or Zometa™ target the farnesylpyrophosphate
synthase enzyme from the mammalian
mevalonate pathway, this drug induces
bioaccumulation of endogenous phosphoantigens in treated cells.4 Thus as recently discovered by Kunzmann and colleagues, Vγ9/Vδ2+ T cells are strongly activated in cancer patients with multiple
myeloma receiving Zometa™ or Aredia™
treatment for their bone-metastasis, and
induced myeloma reductions.5,6 Activating
Vγ9/Vδ2+ T cells in vivo in cancer patients
either through Phosphostim™7 or Zometa™8,9 thus provides a novel means for
anticancer immunotherapy. It is therefore
of interest to identify other types of malignant diseases which may be targeted by
C
Vγ9/Vδ2+-T cell recognition and cytolytic
activity.10
Like other cytotoxic lymphocytes,
human γδ T cells expressing Vγ9/Vδ2+encoded TCR cells bind to antigen cells
through immunological synapses,11 acquire
patches of their plasma membrane (trogocytosis) 12 and eventually kill these targets.13 Although the process of trogocytosis mediated at the lytic synapse by cytolytic lymphocytes has recently been
described,14 there is of as yet no clear
understanding of how the delivery of
cytolytic granules to target cells is associated to their trogocytosis, nor of their
temporal relationship.15 Here using flow
cytometry and time-lapse confocal video
microscopy, we analyzed at the single cell
level both features between human
Vγ9/Vδ2+ T lymphocytes preactivated with
synthetic phosphoantigens or with zometa
and anaplastic large cell lymphoma (ALCL)
cell lines.16 We found that both trogocytosis and perforin release were simultaneously initiated by formation of the immunological synapses. However, the target
cell death stopped trogocytosis while the
release of lytic granules at the synapse
continued. Since nibbling of the target
depended upon its viability, this demonstrated that the target cells controlled its
trogocytosis together with the effector
lymphocytes. In the reverse direction, the
target cell also mediated a weak trogocytosis of its effector, in which case however the delivery of lytic granules from the
ALCL cancer cells (contre-attaque) was
unadjusted, and missed its objective. This
first report for a dissociation of trogocytosis and cytotoxic response at the single
cell level of lytic synapses (Figure 1) suggests that in this context, the purpose of
trogocytosis could be to polarize the
secretion of cytolytic granules.
Thus the strong reactivity of human
Vγ9/Vδ2δ T lymphocytes to anaplastic
large cell lymphoma triggers their specific lysis. These in vitro findings evidence the
potential of activating γδ T cells for
haematologica reports 2006; 2(issue 3):March 2006
35
Fournié JJ, et al.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Figure 1. Lytic attack of ALCL tumour cell targets by
human Vγγ9/Vδδ2+ T lymphocytes. Confocal microscopy
showing γδ T cells with perforin granules (red) attacking
the ALCL tumour cells (blue membrane, green cytoplasmic stain for viability).
10.
11.
12.
immunotherapies of ALCL, a recently classified hematological malignancy and broadens their possible
therapeutic use.
13.
14.
References
15.
1. Kabelitz D, Wesch D, Pitters E, Zoller M. Potential of human gammadelta T lymphocytes for immunotherapy of cancer. Int J Cancer 2004;112:727.
2. Bonneville M, Fournie JJ. Sensing cell stress and transformation
through Vγ9Vδ2 T cell-mediated recognition of the isoprenoid
pathway metabolites. Microbes Infect 2005;7:503.
3. Fournie JJ, Bonneville M, Romagne F. Mechnanisms of action of
36
16.
non peptide antigens actiuvating human Vγ9Vδ2 T cells and their
potential use for immunointervention. Current Medicinal Chemistry_Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents 2005;4:161.
Gober HJ, Kistowska M, Angman L, Jeno P, Mori L, De Libero G.
Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous
mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med 2003;197:163.
Kunzmann V, Bauer E, Wilhelm M. γ/δ T-cell stimulation by
pamidronate. N Engl J Med 1999;340:737.
Kunzmann V, Bauer E, Feurle J, Weissinger F, Tony HP, Wilhelm
M. Stimulation of gammadelta T cells by aminobisphosphonates
and induction of antiplasma cell activity in multiple myeloma.
Blood 2000;96:384.
Bennouna JJ, Medioni F, Rolland J, Misset M, Campone H, Sicard
J et al. Phase I clinical trial of Bromohydrin Pyrophosphate BrHPP (Phosphostim) a Vγ9Vδ2 T lymphocytes agonistin combination with low-dose interleukin-2 in patients with solid tumors.
(abstract # 2536). J Clin Oncol 2005;23:174s.
Dieli F, Gebbia N, Poccia F, Caccamo N, Montesano C, Fulfaro F,
et al. Induction of gammadelta T-lymphocyte effector functions
by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo.
Blood 2003;102:2310.
Mariani S, Muraro M, Pantaleoni F, Fiore F, Nuschak B, S. Peola,
et al. Effector gammadelta T cells and tumor cells as immune targets of zoledronic acid in multiple myeloma. Leukemia 2005;
19:664.
Blattman JN, Greenberg PD. Cancer immunotherapy: a treatment for the masses. Science 2004;305:200.
Favier B, Espinosa E, Tabiasco J, Dos Santos C, Bonneville M, Valitutti S, et al. Uncoupling between immunological synapse formation and functional outcome in human gamma delta T lymphocytes. J Immunol 2003;171:5027.
Espinosa E, Tabiasco J, Hudrisier D, Fournie JJ. Synaptic transfer
by human gamma delta T cells stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol 2002;168:6336.
Sicard H, Al Saati T, Delsol G, Fournie JJ. Synthetic phosphoantigens enhance human Vγ9Vδ2 T lymphocytes killing of nonHodgkin's B lymphoma. Mol Med 2001;7:711.
Poupot M, GertnerJ, Fournié JJ. Molecular transfers through
transient lymphoid cell-cell channels. In Cell-Cell channels, Vol.
1. F. Baluska, D. Volkmann, and P. W. Barlow, eds. Landes Bioscience, p. in press.
Poupot M, Pont F, Fournie JJ. Profiling blood lymphocyte interactions with cancer cells uncovers the innate reactivity of human
gamma delta T cells to anaplastic large cell lymphoma. J
Immunol 2005;174:1717.
Gertner J, Poupot M, Wiedemann A, Fournié JJ. Trogocytosis and
cytotoxicity at the single-cell level of lytic synapses between
anaplastic large cell lymphoma and human gamma delta T cells.
(submitted for publication).
haematologica reports 2006; 2(issue 3):March 2006
Lymphocytes : Gamma Delta
Julie Gertner, Emmanuel Scotet, Marie Poupot, Marc Bonneville, Jean Jacques
Fournié.
ELS (2007)
117
Lymphocytes: Gamma
Delta
Advanced article
Article Contents
. Introduction
Julie Gertner, INSERM, Toulouse, France
Emmanuel Scotet, INSERM, Nantes, France
Mary Poupot, INSERM, Toulouse, France
Marc Bonneville, INSERM, Nantes, France
Jean-Jacques Fournié, INSERM, Toulouse, France
. Distribution, Morphology and Phenotype
. TCR Structure and Recognition Repertoire
. Ontogeny
. Antigen Recognition
. Conclusion
doi: 10.1002/9780470015902.a0001195.pub2
Based in part on the previous version of this Encyclopedia of Life Sciences
(ELS) article, Lymphocytes: Gamma Delta by Marc Bonneville and
Jean-Jacques Fournié.
gd Lymphocytes are a subset of T lymphocytes that express the gd receptor for
antigens. They are distinct from ab T lymphocytes not only by their different mode of
antigen recognition but also for the functions they fulfil. These HLA-unrestricted
lymphocytes are particularly attractive for developing anticancer therapies based on
new activatory drugs.
Introduction
Antigen recognition by B and T lymphocytes is achieved
by highly diverse heterodimeric receptors, the B- and
T-cell receptors (TCRs). T lymphocytes can be subdivided into two mutually exclusive subpopulations carrying TCR chains encoded by either a and b or g and d
gene loci. These T-cell subsets are classically referred to
as ‘ab’ and ‘gd’ T cells, respectively. Like other antigen
receptors, the extensive structural diversity of gd TCR is
generated through somatic recombination of gene segments termed variable (V), diversity (D) and joining (J).
Moreover, in common with ab TCR, gd TCR is noncovalently linked to a transduction complex composed of
several CD3 subunits, which triggers intracellular signalling cascades and subsequent activation of T-cell
effector functions following antigen recognition.
See also: B Lymphocytes: Receptors; Immunoglobulin
Gene Rearrangements; T-cell Receptors
gd T cells, which were fortuitously discovered in humans
and rodents about a decade ago, are produced by all vertebrates studied thus far. While they generally represent a
small fraction of T cells in primary and secondary lymphoid organs, they are greatly enriched in mucosal tissues,
where they can make up the vast majority of T cells. Despite
this, whether gd T cells fulfil functions distinct from, or
redundant to, those achieved by ab T cells has long remained an enigma. Although this issue is not yet solved,
several observations detailed hereafter suggest that gd T
cells recognize a specific set of conserved antigens and play
unique important roles in various immune responses and
cell homeostatic processes. See also: Lymphoid System;
Mucosal Lymphoid Tissues
Distribution, Morphology and
Phenotype
Distribution
The relative abundance of T cells bearing gd TCR varies
greatly from species to species or from one body site to
another. Furthermore, the individual’s age and immunological history (e.g. infectious episodes) are two other important parameters that critically affect the frequency of gd
T cells in a given tissue location. In healthy individuals, gd
T cells represent an average between 1 and 5% of peripheral
blood T cells in humans, and at most 3% of spleen and
lymph node T cells in rodents. Their frequency in these
body sites is much higher in ruminants and birds, where
they constitute up to one-third of total T cells. The fraction
of T cells expressing gd TCR is greatly increased in epithelial sites directly contacting the external milieu. This enrichment is particularly pronounced in rodents, in which gd
T cells represent at least one-third of intraepithelial T cells
throughout the digestive tract and in reproductive organ
mucosa, and constitute most, if not all, intraepidermal T
cells. An increased frequency of gd T cells within intraepithelial lymphocytes of the digestive tract is also observed in
humans and chickens, but their proportion in other epithelial sites remains a subject of debate. See also: Lymph
Nodes; Spleen
Morphology
In peripheral blood, spleen or lymph nodes, mature
gd T lymphocytes are not distinguishable from
either B or other (ab) T lymphocytes by traditional
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES & 2007, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net
1
Lymphocytes: Gamma Delta
The expression of INMR enables gd T cells to modulate
their activation threshold at signals received from the immunological synapse. Moreover, as for NK cells, INMR
might help in controlling the inherent self-reactivity of
some gd T-cell subsets by delivering inhibitory signals upon
interaction with self MHC class I molecules (see below).
See also: CD Antigens; Flow Cytometers; Major Histocompatibility Complex: Human; Natural Killer (NK)
Cells; T Lymphocytes: Cytotoxic
May–Grünwald/Giemsa staining. In their resting state,
these cells frequently appear smooth and round, approximately 7–12 mm in diameter, with a central circular nucleus with a condensed amorphous chromatin appearance
surrounded by a light-blue scanty cytoplasm. When activated in vitro or when drawn during viral or microbial infections, they appear, like activated ab T lymphocytes,
much larger with more irregular and granular shapes.
These features are frequently shared by gd T cells located in
mucosa and stratified epithelia, where these cells can show
a highly unusual ‘dendritic-like’ morphology, such as the
murine intraepidermal gd T cells, which for this reason
have been referred to as ‘dendritic epidermal T cells’. See
also: B Lymphocytes; Dendritic Cells (T-lymphocyte
Stimulating); T Lymphocytes: Helpers
TCR Structure and Recognition
Repertoire
Phenotype
Overall structure of the cd TCR/CD3 complex
Besides g and d TCR chains, which are by definition the
most reliable markers allowing identification and isolation
of gd T cells, gd T cells carry on their surface a large set of
surface molecules whose expression can be detected by flow
cytometry using a variety of labelled monoclonal antibodies. While most of these markers are shared with ab T cells
(e.g. CD2, CD3, CD7) and/or other haematopoietic cells
(e.g. CD18, CD58), several are preferentially expressed by
one or other T-cell subset. In rodents and humans, CD4 or
CD8 coreceptors are found on the vast majority of mature
ab T cells but on a tiny fraction only of gd T cells derived
from nonepithelial sites. CD8+gd T cells are much more
frequent in the blood and spleen of cattle and birds and in
the intestinal mucosa of most animals studied thus far.
However, unlike CD8+ab T cells, which generally express
heterodimeric CD8 coreceptors (i.e. composed of an a and
a b subunit), most gd T cells express homodimeric ‘aa’
CD8 molecules, consistent with the thymic independence
of some of these cells. There are several explanations for
these phenotypic differences that are related to the distinct
developmental features, antigen specificity and activation
status of ab and gd T cells. In particular, the lack of both
CD4 and CD8 coreceptors on most gd T cells probably
reflects their prominent reactivity against major histocompatibility complex (MHC)-unrelated ligands, as will be
discussed later. Furthermore, the frequent expression of
CD8aa homodimers by intestinal intraepithelial gd T cells
is probably due to their chronic in vivo stimulation. Indeed,
expression of CD8 homodimers, unlike that of CD8 heterodimers, can be induced on various lymphoid cells,
including gd T cells and natural killer (NK) cells, following
their in vitro activation. Moreover CD8 gd T cells taken ex
vivo display several phenotypic and functional features of
preactivated/memory T cells such as CD25 or CD45RO.
Unlike ab T cells, gd T cells frequently share several markers with NK cells, including the coactivatory NKGD2 homodimer, the FcgRIII receptor CD16 and CD56. Several
inhibitory receptors binding to MHC class I (INMR), such
as CD94/NKG2 heterodimers, are also frequently detected
on blood NK and gd T cells but seldom found on ab T cells.
In common with ab TCRs, gd TCRs are heterodimeric
receptors composed of two glycoprotein subunits, a rather
acidic d chain of 40–60 kDa and a rather basic g chain of
30–60 kDa. Each TCR chain comprises two immunoglobulin-like domains. While the membrane-distal domain
(termed variable or V domain) is structurally diverse, the
membrane-proximal one (termed constant or C) is highly
conserved from one g or d chain to another. The gd TCR
expressed by most circulating gd T cells in humans presents
an overall immunoglobulin (Ig) fold resembling to the ab
TCR, except its smaller elbow angle of the V:C domain
border. This provides an orientation towards the side of the
structure rather than to the top of the cell. The antigenbinding surface is not as flat as that of ab TCR, and
possibly accommodates ligands of small size. The short
intracytoplasmic tail of TCR g and d chains is devoid of
signalling properties, and thus transduction of the antigenrecognition signal requires additional transmembrane
proteins, which are able to recruit intracellular second
messengers. As for ab TCR, this function is fulfilled by a
multimeric complex comprising several CD3 subunits noncovalently linked to gd TCR chains. The composition and
stoichiometry of CD3 complexes expressed by most ab and
gd T cells are very similar: these complexes possess six CD3
subunits (g, d, 2e and 2z) forming homodimers (i.e. CD3zz)
or heterodimers (i.e. CD3ge and de). Interactions between
the TCR chains and the CD3 complex are established
through electrostatic bonds between polar residues located
within the transmembrane regions of the TCR g and d
and the CD3g and d subunits. Transduction of the signal
is achieved by the CD3e and z components, which
carry one or several intracellular motifs (called ITAMs,
immunoreceptor tyrosine-based activating motifs) that
allow recruitment and phosphorylation of several tyrosine
kinases such as p59fyn, ZAP70 and Syk, and subsequent
activation of the whole signalling cascade. For reasons not
yet understood, the g chain of the type I receptor for Fce
(FceRIg) substitutes for CD3z in most intestinal epithelial
gd T cells and in a small fraction of splenic and lymph node
gd T cells. See also: Glycoproteins; Lymphocyte Activation
2
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Lymphocytes: Gamma Delta
Signals: Transduction; Signal Transduction: Overview;
Transmembrane Signalling
Genomic organization of c and d gene loci
The structural diversity of the TCR Vg and Vd domains is
generated through somatic rearrangements of two (GV
and GJ) and three (DV, DD and DJ) segments, respectively. Throughout the text, these segments are designated
according to the last WHO-IUIS nomenclature (Table 1).
GV1S1–GV1S8 are referred to as Vg1–Vg8, respectively, according to Lefranc et al. or as Vg1.1–Vg1.8, respectively according to Yoshikai et al.
TCRG loci
The overall structure of the human TCRG locus, located
on chromosome 7 at band 7p14–p15, is very similar to that
of the TCRB locus. It comprises 14 GV gene segments
belonging to four weakly homologous subfamilies. The
first subfamily comprises eight members, of which only five
are functional (GV1S2, GV1S3, GV1S4, GV1S5 and
GV1S8). The second subfamily comprises a single functional V gene (GV2S1). All the other GV segments are
nonfunctional. There are five GJ elements (GJ1S1, GJ1S2,
GJ1S3, GJ2S1 and GJ2S2) located upstream of two GC
genes (GC1 and GC2). Although the two GC genes are
highly homologous between each other, they show several
substantial structural differences. The GC1 gene comprises
three exons: exon I codes for the extracellular Cg domain;
exon II for the ‘connecting’ region which comprises a
cysteine involved in a TCRg/d interchain disulfide bridge
and exon III which codes for the hydrophobic transmembrane region and the short intracytoplasmic tail. The GC2
gene contains four or five exons owing to duplication or
triplication of exon II. Moreover, since exon II of the GC2
gene is devoid of cysteine, there is no covalent link between
TCR d chains and TCR g chains encoded by TCRGVJC2
genes.
The murine TCRG locus, located on chromosome 13, is
organized in ‘clusters’. There are four GC genes (GC1,
GC2, GC3 and GC4), each preceded by a single GJ element
and one or several GV elements. These clusters are rearranged independently and sometimes concomitantly on the
same chromosome, thus in some cases, leading to expression of distinct TCR g isotypes paired with the same TCR d
chain in a given T-cell clone. This lack of ‘isotypic exclusion’, which is reminiscent of the lack of allelic exclusion of
TCR gene rearrangement and expression observed in some
ab and gd T-cell clones, does not seem to have any dramatic
physiopathological consequences.
TCRD loci
In both humans and mice, the TCRD locus is embedded
within the TCRA locus on chromosome 14, between the AJ
and AV elements. It comprises two (in mice) or four
(in humans) DJ elements, followed by three DD elements
and a single DC gene. One DV segment (DV103S1 in
humans, DV105S1 in mice) is located downstream of DC
in an inverse transcriptional orientation. All the other DV
segments are interspersed within the AV segments, upstream of the DD elements. Because of the peculiar organization of the TCRA/D loci, any AV or DV segment could
in theory be used to form a TCR a or d chain. Accordingly,
some V segments, such as DV101S1 in humans, are found
equally on d and a TCR chains. However, this seems to be
an exception rather than a rule. Actually only 15 (out of
approximately 50 functional) V segments have been found
rearranged to DD/DJ elements, and only 3–5 of these V
elements (DV101S1, 102S1, 103S1 in humans, DV101S1,
102S1, 104S1, 105S1 and ADV7S1 in rodents) have been
detected on a significant fraction (above 1%) of gd T cells.
The precise rules governing usage of a given V gene by
either ab or gd T cells are still unknown: in addition to
central and peripheral antigen selection processes (see below), they probably involve several structural features of
the V domains (e.g. VaVb/VgVd pairing constraints) or of
the V genes, such as V gene location and accessibility to
recombinases, compatibility of the V/J recombination
signal sequences and so on.
Junctional diversity of cd TCR
Despite the relatively small number of distinct V(D)J
elements available for recombination, the sequence diversity of gd TCR chains is considerable, due to extensive
nucleotide trimmings and additions occurring at the junctions of the rearranging V(D)J segments. This is particularly true for TCR d chains, which are encoded by up to five
elements rearranged in tandem (i.e. VD1D2D3J) and thus
contain up to four sites of nucleotide insertion/nibbling.
Furthermore, D segments can be read in all three reading
frames. Hence, based on theoretical considerations, the size
of the gd TCR repertoire has been estimated as up to 1017,
as compared to 1015 for ab TCR. However, for several
reasons detailed below, the actual size of the gd T-cell repertoire and the diversity of their recognized antigens is
much more limited.
Tissue-dependent restriction of the cd TCR
repertoire
A striking and unique hallmark of gd T cells is the
preferential expression of different V regions in distinct
tissue locations, thus suggesting recognition of a restricted set of related antigens in a given body site which
would differ from one tissue to another (Table 1). In humans, up to 95% of peripheral blood gd T cells use a V gene
combination (GV2S1/DV102S1), which is seldom found in
other tissues (e.g. in spleen, thymus and intestinal epithelium). Interestingly, the proportion and absolute number
of peripheral blood gd cells bearing GV2S1/DV102S1+
TCRs are low at birth but then rapidly increase in this site
during the first years of life, while they remain low and
stable in other sites (e.g. in thymus). In parallel, blood
GV2S1/DV102S1+gd T cells acquire several markers of
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3
Lymphocytes: Gamma Delta
Table 1 Gamma delta T-cell subsets in the mouse and human
Species
TCR V regions
Main previous
TCR
designation
Mouse
GV1S1/DV101S1
(GV5S1/DV101S1)
GV2S1/DV101S1
Vg3/Vd1a
Vg5/Vd1b
Vg4/Vd1a
TCR diversity
Developmental
origin
Preferential
location
0
Fetal
Epidermis
0
Fetal
Vagina, uterus
and oral
epithelium
GV5S1/DV104S1 or
Vg6/Vd1b
Vg1.1/Vd4 or 6a
+/++
Fetal/adult
Intestinal
epithelium,
spleen, lymph
node
ADV7
GV4S1/diverse Vd
Vg1/Vd4 or 6b
Vg5a
++
Adult
Intestinal
epithelium
GV3S1/diverse Vd
Vg7b
Vg2a
+++
Adult
Spleen, lymph
node
+/++
Fetal/adult
Peripheral blood
++/+++
Fetal/adult
Spleen,
intestinal
epithelium
Vg4b
Human
GV2S1/DV102S1
Diverse Vg/DV101S1 or
DV103S1
Vg9/Vd2c
Vg2/Vd2d
Vd1 or Vd3
TCR V regions have been designated according to the official World Health Organization nomenclature, which is seldom used in the literature.
a
Raulet (1989).
b
Haas and Tonegawa1 (1993).
c
Lefranc (1990).
d
Yoshikai et al. (1987).
memory cells, indicating an ongoing antigen-driven expansion. Hence, these findings suggest that the skewed V
gene usage by peripheral blood gd T cells is the consequence
of a postnatal peripheral selection process mediated by a
restricted set of highly recurrent antigens. The biased usage
of particular V regions is also observed in other peripheral
sites such as spleen and intestine, where human gd T cells
express predominantly DV101S1+ or DV103S1+ chains.
Since the diversity of the TCR chain junctional sequences
and of the Vg regions expressed by these cells is quite important, it suggests their in vivo selection by a rather
heterogeneous set of antigens.
Accordingly, recent studies have demonstrated that a
mouse gd TCR contacts directly its T22 MHC class I-like
ligand by the D-encoded amino acid residues. In this species,
three sets of gd T cells are usually distinguished. One set
matures in fetal thymus and then homes to defined epithelia
with a correlated expression of homogeneous (‘invariant’)
TCR comprising GV1S1/DV101S1 or GV5S1/DV101S1
regions in the skin and GV2S1/DV101S1 regions in the mucosa of vagina, uterus and tongue (vut-IEL). These populations represent extreme examples of tissue-dependent
repertoire restriction because not only do they express similar V region combinations in a given site but also their TCR
4
chains show identical junctional sequences. This extensive
TCR sequence conservation is partly due to enzymatic constraints, as all these subsets are derived from fetal precursors
that are devoid of terminal-desoxynucleotidyl transferase,
and thus cannot diversify their V(D)J junctions by ‘N’ nucleotide additions. However, there is strong evidence for an
additional selection of these cells by highly conserved but yet
undefined epithelial ligands that further restricts the sequence diversity of the TCR clonotypes expanded in situ. A
second set of murine gd T cells matures in adult thymus,
locates in all lymphoid organs and expresses diversified TCR
comprising mainly GV5S1 or GV3S1, and sometimes
GV5S2 or GV4S1-encoded V regions. A third group matures extrathymically, expresses diversified GV4S1 or
GV5S1-encoded TCR and locates in the intestinal epithelium (i-IEL). Biased expression of particular Vg regions in
specific anatomical sites by the last two sets of gd T cells
presumably reflects a local selection driven by related antigens, but the relatively high combinatorial and junctional
diversity of their TCRs suggest that the selecting antigens
must be quite heterogeneous or impose fewer structural
constraints on their recognition receptors. See also: Epithelial Cells: Immunological Aspects; Lymphocytes: Intraepithelial; Thymus
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Lymphocytes: Gamma Delta
Ontogeny
ab/cd lineage split
Although some T-cell subsets, such as the intestinal ab and
gd intraepithelial T lymphocytes (IELs), develop mainly
through an extrathymic differentiation pathway, the thymus remains the main site of differentiation of both ab and
gd T cells. While these two lineages share common early
progenitors, the point at which thymocytes become committed to one or other lineage has not been precisely determined. In vivo repopulation and in vitro differentiation
experiments using early thymocytes (i.e. before acquisition
of CD3/TCR complexes) have not led to clear answers,
mainly because of the poor definition of the precursor
populations studied. A more fruitful way of addressing this
issue was to study the TCR rearrangement events occurring
in developing ab and gd thymocytes. TCR gene rearrangements occur in a sequential order during thymic ontogeny,
TCR g, d and b loci being rearranged first and TCR a locus
a day later. Three models of ab/gd lineage separation have
been considered: (1) a ‘sequential’ model, wherein gd T cells
are produced first and ab T cells develop from precursor
cells that have failed to produce functional g and/or d gene
rearrangements; (2) a ‘competitive’ model, stating that g, d
and b gene rearrangements occur simultaneously in uncommitted thymocytes: if g and d genes are productively
rearranged first, the cell becomes a gd T cell, if the b gene is
productively rearranged first, the cell commits to the ab
lineage and (3) an ‘independent lineage’ model, stating that
ab and gd T cells develop through independent pathways
(i.e. lineage commitment is independent of the outcome of
the rearrangement events occurring in the precursor cell).
See also: Lymphocyte Development
The last two models are currently favoured: while the
competitive model is supported by recent analyses of thymocyte rearrangement status, the independent lineage
model fits well with: (1) the existence of silencer elements
repressing the transcription of TCR a and g genes in a
lineage-specific fashion; (2) the lack of perturbation of ab
or gd T-cell development following inactivation of gd or ab
TCR genes, respectively and (3) the differential cytokine
requirements for ab and gd T-cell development (e.g. inactivation of the IL-7 gene abrogates gd and NK-cell development but has little effect on the production of ab T cells).
See also: Cells of the Immune System
Programmed rearrangement and expression
of TCR V genes
Vg and Vd genes are rearranged in a highly ordered fashion
during thymic ontogeny. In mice, most fetal thymocytes
express nondiversified DV101S1 TCR chains, paired first
with GV1S1+ (at day 14–15 of gestation) and then with
either GV2S1+ and GV5S1+ chains (at day 16–19 of fetal
life). These fetal populations become rapidly undetectable
in the thymus after birth but are found in several epithelial
sites in adults, such as epidermis and reproductive organ
mucosa, thus suggesting an early homing from the fetal
thymus to these peripheral tissues. Thymic waves of gd T
cells developing after birth express junctionally diverse
TCR chains bearing GV3S1, GV4S1, GV5S1 and GV5S2
regions and Vd regions distinct from DV101S1. Similarly,
in humans there is some evidence for the existence of an
early thymic wave of gd T cells expressing GV2S1/
DV102S1 TCR, followed by cells using more upstream V
genes. In both species, the V gene rearrangement order
follows the genomic position of these elements within the
TCR g and d loci, the earliest waves using the most proximal VJ elements, the latest waves using the most distal
elements. Several other important factors (developmentally regulated expression of the selecting ligands, activation
of specific cis-acting transcriptional factors) critically contribute to the emergence of these distinct T-cell waves.
Intrathymic selection of cd T cells
During their intrathymic development, ab thymocytes go
through several ‘checkpoints’ that allow selective survival
and expansion of cells that have successfully completed the
previous maturation steps and elimination of the others.
There are two main checkpoints. After production of a
functional b chain, precursor cells will receive maturation
signals from the ‘preTCR’ (b/pTa) that will lead to their
differentiation into CD4/CD8 double-positive (DP) thymocytes. Then DP thymocytes that have produced ‘selectable’ ab TCR (i.e. showing enough affinity/avidity for self
MHC–peptide complexes) will receive signals leading to
their terminal maturation (positive selection), if their TCRs
show intermediate avidity for self, or to apoptosis (negative
selection) if their TCR are strongly self-reactive. Whether
gd T cells are subjected to such a complex epigenetic control
is still debated. While it is now clear that these cells do not
proceed through a DP stage and do not receive early maturation signals through pre-TCR-like structures, gd T cells,
like ab T cells, are subjected to both positive- and negativeselection processes. Indeed, in mice transgenic for gd TCR
directed against polymorphic MHC class Ib molecules,
cells bearing transgenic gd TCR strongly reactive against
self MHC class Ib alleles are eliminated or inactivated (i.e.
they are negatively selected), and they fail to develop in
mice devoid of MHC class Ib molecules (i.e. they need
positive selection signals). See also: Apoptosis: Molecular
Mechanisms; Immune Response: Regulation; Lymphocytes: Antigen-Induced Gene Activation; Transgenic
Animals in Immunology
Antigen Recognition
The way gd T cells recognize antigens was elusive for a
while, as both MHC-unrestricted and MHC-restricted gd
cells had been characterized. It is now clear that gd T cells
differ mainly from ab T cells in their requirements for
antigen recognition. It has been demonstrated on theoretical grounds that the antigen-binding loops of the gd TCR
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Lymphocytes: Gamma Delta
provided by human GV2S1/DV102S1+ T cells, the predominant peripheral blood gd T-cell subset in human
adults. The gd TCR lymphocytes presents an overall Ig fold
resembling to the ab TCR, except its smaller elbow angle of
the V:C domain border. Its highly protruding CDR3g and
CDR3d loops could enable direct interactions with small
ligands such as phosphoantigens (Figure 1). See also:
Antigens; Antigen–Antibody Binding; Antigen Recognition by Lymphocytes; Superantigens
This gd subset was initially detected by its dual crossreactivity to mycobacterial pathogens and human B
lymphoma. It is now well established that this reflected
recognition of the same set of highly unusual antigens
are from both kinds of cells. These antigens are low
molecular weight compounds with nonpeptide structures
(300 Da), either organic pyrophosphates commonly referred to as phosphoantigens, or nonphosphorylated
molecules whose bioactivity relates directly to the above
phosphoantigens.
Natural phosphoantigens are produced by most live
cells, bacteria, eukaryotic pathogens such as Plasmodia,
plants and human cells including especially tumours. All
these phosphoantigens are endogenous metabolites of cholesterol biosynthesis. In bacteria, algae and some plastids,
this metabolism is called the DOXP pathway for involving
the deoxy-xylulose-phosphate carbohydrate and yields as
intermediate (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphate, referred below to as hydroxy-DMAPP (HDMAPP)
for reader’s convenience. At nanomolar concentrations,
HDMAPP is very selectively recognized by GV2S1
/DV102S1+ gd T cells, and enables their ability to mediate the immune surveillance of microbial infections.
are more similar to those of Ig than of ab TCR. Indeed the
lengths of CDR3 sequences from antigen recognition receptor chains have been compared, and their distribution
was found to be much narrower for ab TCR than for Ig and
gd TCR. The constrained junctional lengths of TCR a and
b CDR3 might reflect recognition of antigens in a restricted
cellular context (i.e. MHC molecules), whereas the wide
CDR3 length distribution of IgH and TCRd chains might
reflect recognition of a wider set of conformational
epitopes on native molecules. The hypothesis that gd
TCR might recognize antigens in an Ig-like mode is now
supported by considerable experimental evidence. Structurally unrelated proteins such as gIg, a herpes simplex
virus glycoprotein, the murine MHC class II molecules IEk or the nonclassical MHC class Ib products T10 and T22
are well-documented examples of antigens recognized by
gd T cells. In these cases, the protein is the actual antigen,
i.e. it is directly recognized without any known requirement
for processing or presentation. Its recognition is always
based on a TCR-mediated interaction with conformational
epitopes found in highly heterogeneous experimental systems (e.g. an MHC class Ib molecule, T22 MHC, Qa,b
complexed with a glutamic-tyrosine copolymer, a peptidic
fragment of tetanus toxoid, heat-shock proteins, etc.). The
crystal structure of gd TCR complexed with MHC-like T22
has provided a first example of such complex, explaining
why gd T cells seem to barely use the large diversity of their
TCRg and TCRd sequences. Unlike ab TCR, this gd TCR
did not bind to the top of the MHC-like molecule, but
rather hanged off laterally, interacting only through its
TCRDd2-encoded amino acids. Another typical example
of nonconventional antigen recognition by gd T cells is
V
V
V
V
C
C
C
Figure 1
6
C
Structure of the human gd T-cell receptor. Courtesy of D. Garboczi.
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Lymphocytes: Gamma Delta
In human and most eukaryote cells, by contrast, biosynthesis of cholesterol proceeds by a different metabolic route
involving mevalonate. This ‘mevalonate pathway’ produces
two metabolic intermediates, the dimethylallyl-pyrophosphate (DMAPP) – related to the above HDMAPP – and
its isomer isopentenyl-pyrophosphate (IPP). Both IPP
and DMAPP are also selectively recognized by
GV2S1/DV102S1+ gd T cells, though at one thousand
times higher concentrations than microbial HDMAPP. So,
because IPP and DMAPP are produced by all our cells, how
do our own gd lymphocytes discriminate normal human
cells to ignore from tumours to eliminate? This is simply due
to their respective concentrations of phosphoantigens: normal cells only produce subnanomolar concentrations of IPP
without bioaccumulation, whereas tumours often show an
upregulated mevalonate pathway i.e. able to produce endogenous concentrations of IPP/DMAPP phosphoantigens
above the minimal detection threshold. Thus, reactivity to
either microbial or tumour-derived phosphoantigens enable
the main subset of peripheral gd lymphocytes to survey for
infections and tumours (Figure 2).
In addition, reactivity to phosphoantigens is controlled
by INMRs expressed by the gd T cells. This control operates by a counterbalance of the kinases transducing the
activating signal from the TCR by intracellular phosphatases triggered by the INMR–MHC class I complex
(Figure 3).
By this means, normal HLA class I+ cells deliver negative signalling, which is able to induce the gd T cell to spare
autologous cell, whereas tumour cells with frequently altered expression of HLA class I molecules are not able to
deliver these protective negative signalling.
Two other classes of nonpeptide molecules, which are
able to selectively activate GV2S1/DV102S1+ T lymphocytes, have also been described. These comprise on the
one hand alkylamines such as the microbial isobutylamine
or ethylamine from brewed tea, and on the other, a group of
aminobisphosphonates such as pamidronate, risedronate
and zoledronate, common therapeutic drugs for osteolytic
diseases. Although primarily thought to behave like the
phosphoantigens depicted above, it is now clear that neither alkylamines and aminobisphosphonates stimulate
directly the gd cells. Rather these two classes of drugs
block the mevalonate pathway downstream to IPP, and
induce bioaccumulation of endogenous phosphoantigens
IPP and DMAPP by treated cells.
Chemical synthesis of various organic phosphoesters
gave compounds such as ethyl-pyrophosphate or ribosephosphate weakly – but selectively – bioactive for human
gd lymphocytes. However, second- and third-generation of
chemically synthesized drugs selectively activating
GV2S1/DV102S1+ T lymphocytes have arisen, leading
to molecules active in the nanomolar to picomolar concentration, such as bromohydrin pyrophosphate (BrHPP).
The upscaled production of these novel compounds open
unique opportunity to directly assess the potentiality of
activated gd lymphocytes in preventive or therapeutic approaches against infections and tumours.
Although phosphoantigens activate gd T cells, by an interaction with the TCR yet to be demonstrated, this reactivity is not restricted by polymorphic MHC molecules.
Therefore, the use of phosphoantigens is not limited to
small subgroups of the human population harbouring the
adequate HLA. Consequently, the ubiquitous distribution
of phosphoantigens (see above) make them likely responsible for the in vivo peripheral expansion of GV2S1/
DV102S1+ T cells that occurs during the first years of life.
Function
Given the marked differences between gd T-cell subsets in
terms of tissue distribution, TCR diversity and recognized
antigens, gd T cells cannot be considered as a homogeneous
lymphoid population fulfilling a single specialized function. In fact, analysis of mice deficient for either ab or gd
T cells has revealed different functions played by gd T cells:
an early protective role partly redundant to that of ab T
cells, and a late immunomodulatory function more specifically fulfilled by this lymphoid subset.
The former role is supported by the reactivity of gd
T cells against native epitopes carried by widely distributed
and highly conserved bacterial ligands (such as the bacterial phosphoantigens activating human gd T cells) and their
ability to rapidly produce proinflammatory cytokines (interferon g, tumour necrosis factor a, interleukin 2, etc.)
upon recognition of these antigens. In support of the latter
function, secondary ab T-cell responses against various
infectious agents (e.g. listeria, protozoa) are exacerbated in
mice lacking gd T cells, when compared to wild-type mice.
Furthermore, several gd T-cell subsets (e.g. the murine
GV5S1/DV104S1+ or the human GV2S1/DV102S1+
cells) were shown to modulate ab T-cell function in vitro
and in vivo. In addition, gd T cells crosstalk with dendritic
cells in the priming of adaptive immune responses, leading
to reciprocal regulation of maturation. Activation of human peripheral gd T cells might confer these cells some
antigen-presenting functions. This homeostatic role for gd
T cells probably extends beyond the immune system, as
murine intraepidermal gd T cells are activated by stressed
keratinocytes and can secrete keratinocyte growth factor
(KGF), thus suggesting their implication in epithelial
homeostasis. A similar role is suspected for human and
murine intestinal gd IELs. In mice, these cells largely predominate in the intestinal epithelium of mice maintained in
a germ-free environment but are rapidly diluted out by ab T
cells when mice are exposed to bacteria. Since intestinal gd
IEL also produce KGF, these results would support their
implication in the control of intestinal epithelium integrity
through recognition of conserved self epithelial antigens.
Along this line, some human intestinal gd IELs were recently shown to recognize weakly polymorphic MHC class
Ib products called MICA and MICB, which are specifically
expressed on activated and transformed epithelial cells.
Similar regulatory functions of gd T cells have also been
demonstrated in allergy and in oral tolerance, although
their stimulatory or modulatory role depends on the
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7
Lymphocytes: Gamma Delta
Glyceraldehyde-3-P
Pyruvate
AcetylCoA
Pyruvate
AcetoacetylCoA
DOXP
HMGCoA
MVA
DOXP
MVA
MEP
CDP-MEP
MVA5 P
CDP-ME
HDMAPP
MVA5 PP
cMEPF
IPP
DMAPP
Geranyl PP
PPi
PPi
Farnesyl PP
Cholesterol
Tumour
phosphoantigens
Microbial
phosphoantigen
O
O
P
HO
O
O
O
P
P
O
O−
O
P
O
OH
O
O−
−
O−
OH
DMAPP
MW 246
HDMAPP
MW 262
Figure 2 Biosynthesis of nonpeptide phosphoantigens recognized by human gd T lymphocytes. Left, microbial pathogens, e.g. Mycobacterium tuberculosis, the
agent of human TB produces the HDMAPP phosphoantigen to make cholesterol; right, in human cells, cholesterol biosynthesis proceeds by the mevalonate
pathway and produces IPP and DMAPP phosphoantigens.
experimental conditions. See also: Cytokines; Epitopes;
Epithelial Cells: Immunological Aspects; Immunological
Tolerance: Mechanisms; T-lymphocyte Activation
Given the similarities existing between activated and
transformed cells, it is not surprising that gd subsets recognizing the former (i.e. taking part in homeostatic processes) also recognize the latter, and thus play a role in
8
tumour surveillance. In this regard, mice transgenic for a gd
TCR presumably directed against a self molecule expressed
by activated ab T cells developed an increased resistance to
various acute leukaemias. Similarly in humans, the major
GV2S1DV102S1+ T-cell subset, which is stimulated upon
an MHC-unrestricted recognition of phosphoantigens,
kills activated T cells upon masking of its inhibitory
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES & 2007, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net
Lymphocytes: Gamma Delta
Target cell
Antigen
TCR
CD3
MHC classI
(e.g. HLA-E )
INMR
(e.g. CD94/NKG2-A)
p56 lck
ZAP 70
syk
T cell
+++
Activation by
phosphorylations
SHP-1
SHP-2
SHIP
Deactivation by
dephosphorylations
Conclusion
Figure 3 Stimulation of a human gd T lymphocyte by the MHC-unrestricted
recognition of a small nonpeptidic antigen. Its TCR-mediated activation
threshold is balanced by inhibitory signals triggered by the interaction of
INMR with MHC class I on target cells. Zap, z-associated protein of 70 KDa.
−2 min.
+2 min.
MHC-specific receptors, and also displays strong cytolytic
activity against a wide array of lymphoid tumours. For
example, GV2S1DV102S1+ T-lymphocytes engage immunological synapses with anaplastic lymphoma target
cells and within minutes, are able to kill them by the release
of intracellular granules of perforin (Figure 4). See also:
Leukaemias and Lymphomas; Tumour Immunology
Hence, this subset displays important anticancer function that could be boosted upon activation by synthetic
phosphoantigens. As the potential for cancer immunotherapy of these immunostimulatory drugs is now widely
accepted, several clinical trials are currently ongoing to
harness this new family of therapeutic cells in lymphoma
and solid tumours.
Gamma delta T cells probably play two important roles
that complement those fulfilled by ab T cells. During primary responses, these cells can rapidly mount responses
against a small set of phylogenetically conserved but structurally diverse ligands. They may thus represent a first line
of defence against external insults and probably act as an
efficient link between adaptive and nonadaptive immunity.
During later stages of the immune response, gd T cells
Tumour cell
10 µm
0 min.
+8 min.
Figure 4 A human gd T lymphocyte rapidly scans the surface of an anaplastic lymphoma cell target (green cytoplasm and blue membranes) for stimulating and
inhibitory signals. Once fully activated, the gd T lymphocyte kills this target by secreting its cytolytic perforin granules (stained red). The green fluorochrome
(calcein AM) is a viability cytoplasmic stain, whose loss indicates cell death. For easier views, the target cell membrane was labelled with a blue fluorochrome.
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES & 2007, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net
9
Lymphocytes: Gamma Delta
probably take part in the control of ab T-cell activation,
through recognition of self ligands upregulated during
immune activation. Additionally, the peculiar tissue distribution of gd T cells, their trophic function for epithelia
and their ability to recognize stressed or activated epithelial
cells suggest an important role in nonimmune homeostatic
processes. Ongoing developments of innovative cancer
immunotherapies will put in practise the antitumoral potential of human gd lymphocytes, activated by a new class
of compounds such as the synthetic phosphoantigen
analogues.
References
Haas W, Pereira P and Tonegawa S (1993) Gamma/delta cells.
Annual Review of Immunology 11: 637–685.
Lefranc MP (1990) Organization of the human T-cell receptor
genes. European Cytokine Network 1(3): 121–130.
Raulet DH (1989) The structure, function, and molecular genetics
of the gamma/delta T cell receptor. Annual Review of Immunology 7: 175–207.
Yoshikai Y, Toyonaga B, Koga Y et al. (1987) Repertoire of the
human T cell gamma genes: high frequency of nonfunctional
transcripts in thymus and mature T cells. European Journal of
Immunology 17(1): 119–126.
10
Further Reading
Allison TJ and Garboczi DN (2002) Structure of gammadelta
T cell receptors and their recognition of non-peptide antigens.
Molecular Immunology 38: 1051–1061.
Blattman JN and Greenberg PD (2004) Cancer immunotherapy:
a treatment for the masses. Science 305: 200–205.
Bonneville M and Fournie JJ (2005) Sensing cell stress and transformation through Vgamma9Vdelta2 T cell-mediated recognition of the isoprenoid pathway metabolites. Microbes and
Infection 7: 503–509.
Fournie JJ, Bonneville M and Romagne F (2005) Mechanisms of
action of non peptide antigens activating human Vg9Vd2 T cells
and their potential use for immunointervention. Current
Medicinal Chemistry_Anti-Inflammatory and Anti-Allergy
Agents 4: 161–168.
Hayday AC (2000) [gamma][delta] cells: a right time and a right
place for a conserved third way of protection. Annual Review of
Immunology 18: 975–1026.
Kabelitz D, Wesch D, Pitters E and Zoller M (2004) Potential of
human gammadelta T lymphocytes for immunotherapy of
cancer. International Journal of Cancer 112: 727–732.
Kunzmann V and Wilhelm M (2005) Anti-lymphoma effect of
gammadelta T cells. Leukemia & Lymphoma 46: 671–680.
Sanders JM, Ghosh S, Chan JM et al. (2004) Quantitative structure–activity relationships for gammadelta T cell activation by
bisphosphonates. Journal of Medicinal Chemistry 47: 375–384.
Zitvogel L, Tesniere A and Kroemer G (2006) Cancer despite
immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nature Reviews Immunology 6: 715–727.
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES & 2007, John Wiley & Sons, Ltd. www.els.net
Self/ non self discrimination by human γδ T cells :
Simple solutions for a complexe issues ?
Aurélie Thedrez, Caroline Sabourin, Julie Gertner, Marie Claire Devilder, Sophie
Allain-Maillet, Jean Jacques Fournié, Emmanuel Scotet, Marc Bonneville.
Immunological Review (2007)
118
Self/non-self discrimination by
human gd T cells: simple solutions
for a complex issue?
Aurélie Thedrez
Caroline Sabourin
Julie Gertner MarieClaire Devilder
Sophie Allain-Maillet
Jean-Jacques
Fournié Emmanuel
Scotet Marc
Bonneville
Authors’ addresses
Aurélie Thedrez , Caroline Sabourin , Julie
Gertner , Marie-Claire Devilder , Sophie
´2
Allain-Maillet
, Jean-Jacques Fournie,
Emmanuel Scotet *, Marc Bonneville *
INSERM U601, Département de Recherche en
Cancérologie, Institut de Biologie/CHU,
Nantes, France. INSERM U563, Centre de
Physiologie de Toulouse Purpan, Toulouse,
France.
*The work reviewed herein was performed equally
within these two investigator’s laboratories.
1
1
2
1
2
1
1
1
2
Correspondence to:
Marc Bonneville
INSERM U601 Département de
Recherche en Cancérologie Institut de
Biologie/CHU 9, quai Moncousu 44035
Nantes cedex 01, France Tel.: þ33
240084715 Fax: þ33240356697 E-mail:
[email protected]
Acknowledgements
We thank Innate Pharma (Marseille, France) for kindly
providing phospho-antigens; Brigitte Gicquel and Nathalie
Winter (Institut Pasteur, Paris) for kindly providing
Mycobacteria strains; and Emmanuel Donnadieu (Institut
Cochin, Paris) for expert work in videomicroscopy. The
authors are supported in their research by grants from
INSERM, from the Commission of the European Union
Programme 6FP (LSH-CT-2003-503367) TB-VAC, from
ANR (projects #A05118GS and PRIB/017), and from ARC
(#3662).
Immunological Reviews 2007
Vol. 215: 123–135 Printed in
Singapore. All rights reserved
ª 2007 The Authors Journal compilation
ª 2007 Blackwell Munksgaard
Immunological Reviews
0105-2896
Summary: Although gd T cells express clonally distributed T-cell
receptors (TCRs), a hallmark of adaptive immunity, they are classically
considered as innate-like effectors, owing to the high frequency of
preactivated gd T cells, with restricted antigen recognition repertoire in
particular tissue locations. Actually, such features are shared only by a
fraction of gd T-cell subsets located in the skin and reproductive organ
mucosa in rodents or in peripheral blood in humans. By contrast, other
gd subsets, e.g. those found in rodent and human spleen, show diverse
antigenic reactivity patterns and mixed naive/memory phenotypes.
Thus, gd T cells are made of both ‘primitive’ subsets endowed with
innate-like properties and ‘evolved’ subsets able to mount anamnestic
responses like conventional major histocompatibility complexrestricted ab T cells. In this article, we show that human gd T cells,
although heterogeneous, do share recurrent innate features that
distinguish them from mainstream ab T cells. In particular, most of
them are activated on TCR-or natural killer receptor-mediated
recognition of a restricted set of conserved yet poorly defined
endogenous stress determinants. This rather simple recognition
mechanism allows human gd T cells to discriminate healthy cells from
altered cells and to exert a variety of immunostimulatory or regulatory
functions. The recent availability of synthetic gd T-cell agonists
mimicking these natural stress-induced ligands have fostered
development of immunotherapeutic strategies, with broad indications
against infectious and tumor diseases, which are briefly reviewed here.
Keywords: T-cell
immunotherapy
receptor,
T
lymphocyte,
innate
immunity,
Introduction
The highly restricted T-cell receptor (TCR) V region
repertoire of gd T cells is certainly one of the most salient
features that distinguish these lymphocytes from
conventional major histocompatibility complex (MHC)restricted ab T cells. In humans, gd T cells use three main
Vd and at most six Vg region genes to make their TCRs (1,
2). The actual peripheral gd TCR combinatorial diversity is
even more limited because the TCR V region repertoire of
human gd T cells, as in rodents, is highly skewed in
particular tissue locations (3, 4). Indeed, most peripheral
blood gd T cells express Vd2 TCR chains paired with Vg9
chains, whereas in other tissues, gd T cells express TCRs
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
primarily made of Vd1 or Vd3 regions paired with a diverse
array of Vg regions. Vd2 and non-Vd2 subsets differ in several
aspects. Most Vd2 cells display a memory phenotype acquired
during perinatal life, whereas non-Vd2 cells are mainly naive in
young adults (5). Moreover, most Vg9Vd2 T cells from
peripheral blood lymphocytes (PBLs) react against the same
related set of non-peptidic, phosphorylated compounds (3),
whereas non-Vd2 cells seem to recognize heterogeneous yet illdefined antigens presumably unrelated to Vd2 agonists. In this
article, we review recent studies, providing new insights into
the fine mode of activation of Vg9Vd2 T cells by their nonpeptidic agonists and into the biological significance of this
recognition process. We underline the similarities between the
activation contexts of Vd2 and non-Vd2 subsets and show how
recognition of a restricted set of stress-induced natural killer
receptor (NKR) and TCR ligands allows these cells to express
immunoprotective and regulatory functions complementary to
those ensured by conventional ab T lymphocytes.
Target cell recognition by human gd T cells
At least three kinds of receptor–ligand interactions contribute to
gd T-cell activation by their target cells: adhesion molecules,
TCRs, and NKRs. The adhesion receptors playing a key role in Ttarget cell interactions, such as leukocyte-function-associated
antigen-1/intercellular adhesion molecule-1, are shared in
most instances by both gd (6, 7) and ab T cells and are not
discussed further.
gd TCR stimuli: Vg9Vd2 T cells
Vg9Vd2 T cells recognize in a TCR-dependent fashion
a restricted set of phosphorylated compounds referred to as
‘phospho-antigens’, which are produced through the isoprenoid biosynthetic pathway (reviewed in 3, 8–10). The most
potent agonists, like hydroxy-dimethyl-allyl-pyrophosphate
(HDMAPP), are intermediates of the so-called ‘1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate pathway’, restricted to plant cells and
some microorganisms. Intermediates of the mevalonate (MVA)
pathway used by mammalian cells and some bacteria, such as
isopentenyl pyrophosphate (IPP), can also activate Vg9Vd2 T
cells, although at concentrations of 10- to 100 000-fold higher
than those for microbial agonists. Because IPP production is
strongly upregulated in tumor cells (11), recognition of
isoprenoid pathway intermediates by Vg9Vd2 lymphocytes
allows discrimination not only between infected and noninfected cells (through detection of highly potent microbial
phospho-antigens) but also between resting and transformed
cells (through detection of overexpressed IPP). Two additional
124
Immunological Reviews 215/2007
classes of compounds, namely aminobisphosphonates (ABPs)
and alkylamines, have been shown to activate Vg9Vd2 T cells.
Through their ability to inhibit farnesyl pyrophosphate synthase
(FPPS) (12), an enzyme acting downstream of IPP synthesis
along the MVA pathway, ABPs promote intracellular accumulation of IPP. Such a mechanism most likely underlies the
Vg9Vd2-stimulating activity of ABPs (11, 13). The mode of
action of alkylamines has remained debated until recently. It
was initially assumed that these compounds, like phosphoantigens, were directly recognized by Vg9Vd2 T cells (14).
However, owing to the non-phosphorylated nature of alkylamines, such a hypothesis was difficult to reconcile, with
studies showing a key contribution of pyrophosphate moieties
to Vg9Vd2 agonist activity of phospho-antigens. A recent study
strongly suggests that like ABPs, alkylamines promote intracellular accumulation of Vg9Vd2 agonists derived from the MVA
pathway, presumably through inhibition of FPPS (15).
Therefore, it appears that in all instances, Vg9Vd2 T cells are
stimulated by phosphorylated intermediates of the isoprenoid
biosynthetic pathway (Fig. 1A).
How precisely the Vg9Vd2 T cells are activated by phosphoantigens remains unclear. Phospho-antigen-induced activation
of T cells requires expression of a Vg9Vd2 TCR, as indicated by
antibody blocking and gene transfer approaches (16, 17).
Moreover, phospho-antigens induce within seconds a burst
of respiratory activity (18) and within minutes a strong
Ca2þ signaling by Vg9Vd2 T cells (E. Scotet, M.-C. Devilder,
M. Bonneville, unpublished data), suggesting a very swift
engagement of TCRs on incubation with phospho-antigens.
However, all attempts to show cognate interactions between
recombinant, soluble Vg9Vd2 TCRs and phospho-antigens have
failed so far. Because respiratory burst and Ca2þ signaling events
are observed in pelleted Vg9Vd2 cells but not when they are
maintained in suspension, phospho-antigens may not be
recognized per se but instead may be recognized in association
with a yet undefined surface presenting receptor (PR). It is also
possible that phospho-antigens, whose Vg9Vd2 agonist activity closely correlates with their chemical reactivity (reviewed
in 8), induce conformational or chemical modification of a
surface receptor(s), which would be recognized in turn by
Vg9Vd2 TCRs (Fig. 1B). Several groups have tried to get
evidence on binding between phospho-antigens and their
putative PRs through analysis of target cell susceptibility to
Vg9Vd2 T-cell lysis after preincubation with phospho-antigens.
Although previous studies failed to show any activation of
Vg9Vd2 cells by target cells pretreated with semipurified
microbial agonists or IPP (19), efficient Vg9Vd2 sensitization of
target cells preincubated with the most potent agonists, like
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
Fig. 1. Activation of Vg9Vd2 T cells by phospho-antigens. (A).
Discrimination between normal versus altered self by Vg9Vd2 T cells
through recognition of isoprenoid pathway intermediates. Vg9Vd2 T
cells are activated either by weak phosphorylated agonists (such as IPP)
produced through the MVA pathway found in mammalian cells or by
strong agonists (such as HDMAPP) produced through the 1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate pathway found in some microorganisms.
Upregulation of IPP production in activated/transformed cells
(pathway 1) and/or of HDMAPP production in cells infected by
intracellular bacteria (pathway 2) allows respective recognition of
tumor and infected cells by Vg9Vd2 T cells. Bacteria and/or viruses
may also modulate endogenous IPP production (pathways 3 and 4,
respectively) and subsequent Vg9Vd2 activation by infected cells.
Finally, pharmacological inhibitors of the MVA pathway acting
upstream (like statins) or downstream of IPP synthesis (like ABP or
alkylamines), respectively, decrease or enhance treated cell recognition
by Vg9Vd2 T cells (pathway 5). (?) refers to pathway not yet formally
proven. (B). Possible mechanisms of TCR-mediated activation of
Vg9Vd2 T cells by their phosphorylated and tumor antigen.
1: Recognition of a complex formed by P-Ag and a putative PR.
2: Recognition of a surface molecule modified by phospho-antigen.
3: Recognition of a complex made of apoA1 and AS. 4: Recognition of
AS loaded with a chemically modified apoA1 (possibly mediated by
phospho-antigen). 5: Recognition of P-Ag in the context of AS. #
indicates the pathway number. P-Ag, phospho-antigen. * refers to
chemically modified ApoA1.
HDMAPP, was more recently reported (20). In our experience,
the latter results are most likely explained by insufficient
washing of HDMAPP, which acts at picomolar concentrations,
rather than by stable binding of phospho-antigens to their PRs
(M.-C. Devilder, E. Scotet, M. Bonneville, unpublished data). In
line with these results, several recent observations suggest that
phospho-antigen-induced activation is a very transient process.
First, phospho-antigen-stimulated gd T cells exhibit ‘spiky’
Ca2þ fluxes, unlike antigen-stimulated ab T cells, which show
an early and sustained Ca2þ signaling (Fig. 2A). Moreover, the
phosphorylation kinetics of protein tyrosine kinases linked to
the TCR signaling cascade are quite delayed in phosphoantigen-activated gd T cells compared with the peptidestimulated ab T cells (Fig. 2B). These results suggest serial but
highly transient engagements of TCRs by phospho-antigen–PR
complexes, possibly explained by formation of very labile
phospho-antigen–PR complexes and/or low-affinity interactions between TCR and phospho-antigen–PR complexes.
In addition to phospho-antigens, Vg9Vd2 T cells were
recently shown to recognize a complex formed between
apolipoprotein (apo)A1and adenosine triphosphate synthase
(AS), an enzymatic complex normally found in the inner
mitochondrial membrane that is translocated to the cell surface
of some tumor cells (21). Activation of Vg9Vd2 T cells by
apoA1 is reminiscent of apoH recognition by some murine gd
hybridomas (22). As the oxidized forms of apoA1 have been
detected in particular inflammatory contexts linked to atherosclerosis (reviewed in 23), the above results could reflect an
implication of gd T cells in lipid metabolism and immune
control of some cardiovascular pathological processes. The
apoA1 also contributes to innate defense against some parasitic
infections (24) and may represent a stress-associated cue
recognized by gd T cells. However, although apoA1 enhances
tumor cell recognition by Vg9Vd2 T cells, it is neither necessary
nor sufficient for this process because the purified apoA1 does
not readily activate Vg9Vd2 T cells, unlike beads coated with
purified AS alone. Given the ability of AS to bind phosphorylated compounds, this receptor could be a logical candidate for
phospho-antigen presentation (Fig. 1B), although this association remains to be proven in cell-free systems. The mechanisms
Immunological Reviews 215/2007
125
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
Fig. 2. Vg9Vd2 and ab T lymphocytes exhibit distinct signaling
profiles following antigenic stimulation. (A) Characteristics of T-cell
Ca2þ responses following antigenic activation. Fura-2-AM-loaded T
cells (Vg9Vd2 clone G42 and ab clone A4.5) were co-incubated with
DCs in the presence of either soluble phospho-antigen (BrHPP, 3 mM)
or HLA-A*0201-Epstein–Barr virus peptide (BMLF1/GLCTLVAML,
10 mM) respectively. Single-cell Ca2þ levels were analyzed by collecting
510-nm emissions (340/380-nm excitation) for the indicated times
(Min). (B). Kinetics of extracellular signal-regulated kinase (Erk)
activation in human Vg9Vd2 and ab T cells. T-cell clone GR72
(Vg9Vd2) and clone A4.5 (ab) were incubated in the presence of
BrHPP (3 mM) and BMLF1 peptide (20 mM) respectively for the
indicated times (Min). Total cellular proteins were separated on 12%
sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and showed
by western blot using an anti-p42/44 Erk antibody (recognizing
phosphorylated and active forms of Erk-1 and Erk-2) (p-Erk).
Normalization was performed by stripping the antibody and subsequent incubation with anti-Erk antibody (recognizing total p42/44
Erk) (Erk). PMA was used at 0.1 mM as a positive control. PMA, Phorbol
12-myristate 13-acetate.
of surface translocation of AS are still unclear. Such a process
could result from fusion events between the plasma membrane
and the inner membrane of disrupted mitochondria that are
generated during apoptosis. AS recognition could therefore
allow Vg9Vd2 T cells to sense stressed and/or pre-apoptotic
cells. In light of a study suggesting strong upregulation of
mycobacterium-derived AS subunits in infected macrophages
(25) and owing to the extensive phylogenetic conservation of
AS from bacteria to mammalian cells, AS may also represent, like
microbial phospho-antigen, a pathogen-associated molecular
pattern, permitting detection of infected cells by Vg9Vd2
effectors. AS has also been found on the surface of the
endothelial cells (26, 27). Therefore, its targeting by Vg9Vd2
T cells could reflect a possible implication of this gd subset in the
regulation of angiogenesis and anti-tumor immunity.
non-MHC molecules (Table 1) suggest recognition of a highly
diverse and heterogeneous set of antigens by non-Vd2 cells.
However, several important issues remain unsettled. Cognate
interactions between non-Vd2 TCRs and any of the above
antigens have not been shown yet, and they have been indirectly
supported by gene transfer experiments in a few cases only [e.g.
for CD1c-specific clones (28)]. MHC class-I-chain-related gene
A (MICA) has also been proposed as an important tumor antigen
recognized by Vd1 T cells, owing to TCR-dependent recognition of MICA-positive tumor cells by Vd1-lymphocytes
infiltrating colon carcinomas (29–31). However, the very
low affinity of MICA–Vd1 TCR interactions estimated by surface
plasmon resonance analyses raises doubts about the functional
relevance of MICA or MHC class-I-chain-related gene B (MICB)
recognition by Vd1 TCRs (32). Moreover, the frequency of Vd1
or Vd3 clones directed against any of the above antigens has not
been assessed but is presumably low, at least with respect to CD1
molecules. Hence, the antigens recognized by non-Vd2 T cells
remain in most instances unknown.
gd TCR stimuli: non-Vd2 subsets
The extensive structural diversity of Vd1 and Vd3 TCRs and the
existence of Vd1 clones reactive against MHC, MHC-like, or
126
Immunological Reviews 215/2007
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
Table 1. Marked reactivity of human gd T cells toward self-stimuli upregulated in various physiopathological contexts
gd subset
Physiopathological context
Antigen origin
Antigen structure
References
Vd1
Tumors
Viral infections
Bacterial infections
Self
Self
Self
Self
Self
Non-Self
Self
Self
Self
Self
MICA/MICB
?
CD1c (þ self ?)
?
?
HLA-DR
IPP
AS/Apo A1
?
IPP/HDMAPP/TubAg
Groh et al. (29,30)
Halary et al. (37)
Spada et al. (28)
Poccia et al. (33)
Halary et al. (37)
Flament et al. (85)
Gober et al. (11)
Scotet et al. (21)
Poccia et al. (33)
Bonneville and Fournie (3),
Espinosa et al. (8),
Poupot and Fournie (9),
Bonneville and Scotet (10)
Viral infections, tumors
Viral infections, tumors
Non-Self (?)
Self
Self
?
?
?
Infections
Vd2
Vd3
Vd5
Alloreactivity
Tumor cells
Halary et al. (37)
Halary et al. (37)
? refers to undefied antigen or not yet formally proven mechanism.
Non-Vd2 gd T cells are expanded in various infectious
contexts involving intracellular bacteria (Mycobacteria, Listeria,
Borrelia, etc.) and viruses [HIV, cytomegalovirus (CMV)]
(reviewed in 10, 33). In most instances, the stimuli that trigger
Vd1 expansion are not derived from pathogens but instead
correspond to endogenous gene products presumably upregulated on infection. For instance, most Vd1 T-cell clones
expanded after coculture with autologous dendritic cells
(DCs) loaded with microbial lipids derived from Gramnegative bacteria (Escherichia coli, Salmonella typhimurium) actually
recognize endogenous DC-derived stimuli upregulated by
interleukin (IL)-12 (34). Both Vd1 and Vd3 subsets are
dramatically expanded in immunosuppressed patients undergoing CMV reactivation, and a large fraction of clonally
expanded Vd1 and Vd3 cells from these patients recognizes
in a TCR-dependent fashion CMV-infected fibroblasts in vitro
(35, 36). A recent study indicates that the putative Vd1/Vd3
antigens recognized by CMV-reactive subsets are not
virally encoded but instead correspond to endogenous stressinduced ligands possibly shared by CMV-infected cells
and several colon tumors (37). Importantly, the frequency
of Vd1 PBLs reactive against these CMV-induced antigens
might be quite high, even in healthy donors who have not
undergone CMV reactivation (38). The antigen recognized by
non-Vd2 T cells expanded in the above infectious contexts have
not been characterized, but the fact that Vd1 T-cell responses
are not blocked by monoclonal antibody directed against
known classical or non-classical MHC molecules suggests
recognition of a new class of conserved stress-induced
antigens.
NKR signals
Human gd T cells frequently express activating and/or
inhibitory NKRs (iNKRs) that can fine-tune their activation
threshold (reviewed in 39, 40) (Fig. 3). NKG2D, an activating
C-type lectin receptor directed against MICA/MICB and UL16binding protein (ULBP) molecules, seems to be a major
costimulator of both Vd2 and non-Vd2 gd T cells (41). Indeed,
NKG2D is recruited within the Vg9Vd2 immunological synapse
(42) and enhances recognition by Vg9Vd2 T cells of
Mycobacteria-infected DCs and various MICA/MICBþ or ULBPþ
hemopoietic and non-hemopoietic tumors (7, 43). NKG2D has
also been involved in Vd1 T-cell-mediated recognition of
infected DCs and epithelial and hemopoietic tumors (29, 34,
44). NKG2D is upregulated by inflammatory cytokines (e.g. IL-15)
(45), and NKG2D ligands are induced after a physical or genotoxic
stress and/or along infection by intracellular pathogens. Therefore,
NKG2D is a key stress sensor that strongly enhances recognition
of altered or infected self by human gd T cells.
The gd T cells also express several other activating and iNKRs
belonging to either the C-type lectin (e.g. CD94/NKG2A,
CD94/NKG2C) or the immunoglobulin [e.g. killer cell
immunoglobulin-like receptor or immunoglobulin-like transcript 2 (ILT2)] superfamilies. Although ILT2 is frequently
found on Vd2 subset and presumably on non-Vd2 subset
(C. Benezech, R. Breathnach, personal communication), CD94/
NKG2A is expressed by the majority of Vd2 cells but not by Vd1
cells (46). NKR expression has been correlated with acquisition
of effector memory markers within both mainstream MHCrestricted ab T cells and non-classical, CD1d-restricted,
invariant natural killer T (iNKT) cells. Thus, the different NKR
Immunological Reviews 215/2007
127
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
strongly inhibit killing of MHC class Iþ or class Ibþ target cells
by Vg9Vd2 T cells (47-49). As the partial downmodulation of
MHC class I and class Ib molecules, which frequently occurs
along cell transformation, prevents engagement of ILT2 and
inhibitory CD94/iNKG2A receptors, these iNKRs may ensure
efficient discrimination of transformed versus normal cells by
Vg9Vd2 T lymphocytes (48, 49) (Fig. 3).
Factors contributing to human gd T-cell activation and
homeostasis
Fig. 3. Modulation of gd T-cell activation by TCR and NKR signals.
(A). The amount of antigen required to activate gd effector/
proliferative responses (activation threshold represented as a dotted
line) is controlled by inhibitory and activating signals delivered by
engaged NKRs expressed by gd T cells. It is decreased at high aNKR/
iNKR signaling ratios (red antigen response curve) or increased at low
aNKR/iNKR ratios (blue antigen response curve). In the steady state,
low expression of gd TCR antigen and aNKR stimuli and/or high
expression of MHC class I/class Ib that engage ILT2 and CD94/NKG2A
iNKR prevents self-recognition by gd T cells (blue arrows). Stress
(infection/cell transformation) may lead to increased gd antigen and/
or aNKR ligand expression and decreased MHC class I/class Ib
expression (red arrows), resulting in gd T-cell activation. (B). Balance
between TCR and NKR signals in tumor B-cell lines showing different
susceptibility to Vg9Vd2 T-cell-mediated lysis. Vg9Vd2 T cells
efficiently lyse the Daudi Burkitt’s lymphoma and the RPMI 8226
myeloma but not the Raji Burkitt’s lymphoma nor B-LCL. Daudi cells do
not express MHC class I and class Ib on their surface because of the lack
of functional b2m, and are thus unable to deliver iNKR signals to ILT2/
NKG2AþVg9Vd2 T cells. Transfection of functional b2m (b2m Tx) in
Daudi cells strongly inhibit their lysis by Vg9Vd2 T cells, presumably
through iNKR engagement (blue arrow). Daudi lysis can also be
modulated by inhibiting or increasing endogenous IPP levels using
pharmacological inhibitors of the MVA pathway (green arrows). RPMI
8226 cells are as efficiently lysed by Vg9Vd2 than Daudi cells, although
they express ‘normal’ levels of MHC class I/class Ib molecules. Because
Daudi and RPMI 8226 cells express similar levels of NKG2D ligands,
this finding suggests that the latter cells express higher endogenous
levels of phospho-antigen than the former cells. Knockdown of b2m
(b2m KO) expression in RPMI 8226 cells prevents iNKR engagement
on Vg9Vd2 effectors and strongly enhances target cell lysis (red arrow).
Finally, Vg9Vd2-mediated lysis of B-LCL or Raji cells is not enhanced by
MHC class I/class Ib knockdown, consistent with very low expression
of Vg9Vd2 antigen. aNKR, activating natural killer receptor; b2m, b2
microglobulin; B-LCL, B-lymphoblastoid cell lines.
phenotypes of Vd2 versus Vd1 cells may merely reflect distinct
functional/memory status of these gd subsets (5). On
a functional standpoint, both ILT2 and CD94/NKG2A receptors
128
Immunological Reviews 215/2007
Cytokines
Purified Vg9Vd2 cells are unable to proliferate after in vitro
antigen stimulation, unless supplemented with IL-2 or
incubated with stimulated conventional T helper (Th) cells
(50). Similarly, strong in vivo expansion of Vg9Vd2 PBLs is
observed in primates injected with both Vg9Vd2 synthetic
agonists and IL-2 but not in individuals receiving Vg9Vd2
agonists alone (51, 52). Terminal differentiation of most
Vg9Vd2 PBLs into effector or effector/memory T cells probably
explains their poor IL-2 responses. In this regard, most IL-2producing Vg9Vd2 PBLs display a typical CD27brightCD11adull
phenotype shared with conventional ab naive T cells (5). IL-15
can also restore the in vitro proliferative responses of antigenstimulated Vg9Vd2 T cells to a similar extent as IL-2 (A.
Thedrez, E. Scotet, M. Bonneville, unpublished data). As for
conventional memory T cells, IL-15 seems to be an important
homeostatic cytokine for peripheral Vg9Vd2 PBLs, at least in vitro
(53). Several other growth factors, such as IL-7 and IL-21, may
also contribute, although to a lesser extent, to proliferation
of this gd subset (A. Thedrez, E. Scotet, M. Bonneville,
unpublished data). Soluble factors contributing to non-Vd2
T-cell activation remain ill defined as in most instances, the fine
antigen specificity of Vd1 and Vd3 subsets has not been
characterized. Moreover, in-depth ex vivo functional analysis of
these subsets has been hampered by their low frequency in
readily accessible samples such as peripheral blood.
Enhancement of gd T-cell responses by DCs
In line with their effector/memory phenotype, ex vivo Vg9Vd2
T cells can be readily activated by specific agonists in the absence
of any professional antigen-presenting cells (APCs). However,
Vg9Vd2 cytokine responses but not cytolytic activity are
significantly enhanced when these cells are stimulated in the
presence of DCs (54). Quite unexpectedly, immature DCs (iDCs)
are much better cytokine-response enhancers than mature
DCs (mDCs). The factors responsible for this iDC-mediated
potentiating effect remain unknown. They are presumably
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
membrane bound, as suggested by Transwell experiments, but are
distinct from several costimulators known to be strongly
expressed on iDCs, such as CD2, LIGHT (homologous to
lymphotoxins, inducible expression, competes with herpes
simplex virus glycoprotein D for herpes virus entry mediator,
a receptor expressed on T lymphocytes), or APRIL (a proliferation-inducing ligand) (M.-C. Devilder, S. M, E. Scotet, and
M. Bonneville, unpublished data). Importantly, iDC-mediated
potentiation of cytokine responses is also observed on antigenstimulated MHC class-I-restricted CD8þ T-cell clones and on
ex vivo CD4þ T cells stimulated by superantigen, which indicates
that it is a general property of ex vivo memory T cells (M.-C.
Devilder, E. Scotet, M. Bonneville, unpublished data). These in
vitro findings, whose physiological relevance is still unclear, are
clearly in line with previous reports implicating DCs in both the
in vivo maintenance of conventional memory T cells (55) and
optimal in vivo activation of glycolipid-specific memory natural
killer T cells (56, 57).
Human gd T-cell physiological roles
gd T-cell-mediated priming of adaptive and innate immune
effectors
Both Vd1 and Vd2 gd T cells can activate iDCs in vitro through
various mechanisms (Fig. 4). Activation of iDCs into IL-12producing mDCs mediated by CD1c-restricted gd T cells is
a two-step process initiated by CD40 and tumor necrosis factora (TNFa) engagement and completed through an interferon
(IFN)-g/IL-12-positive feedback loop (58). IL-12-dependent
upregulation of endogenous DC-derived Vd1 ligands by some
intracellular bacteria may also trigger IFNg release by CD1independent Vd1 cells and presumably subsequent iDC
activation (34). Moreover, a recent study indicates that Vd1
synovial fluid lymphocytes from patients with Lyme arthritis
can promote activation of Borrelia-infected iDCs in a Fas/Fasligand-dependent fashion (59).
Unlike CD1c-specific Vd1 cells, Vd2 T cells do not directly
recognize iDCs, unless incubated with Vg9Vd2 agonists or infected by Vg9Vd2-stimulating pathogens. Antigen-stimulated
Vg9Vd2 cells can induce rapid and complete iDC activation into
IL-12-producing cells (54). As for Vd1 or iNKT cells, this
process involves CD40/CD40 ligand, TNFa, and IFNg (60).
The iDC-mediated potentiation of Th1 cytokine production by
gd and, more generally, by memory T cells may further enhance
their own activation and the subsequent priming of proinflammatory adaptive immune responses. Accordingly, both
iNKT cells and murine gd T cells were shown to induce priming
of conventional Th1 responses (61–63) in rodent models and,
in the former case, in humans as well (64). Natural memory
T cells, such as iNKT or Vg9Vd2 lymphocytes, could be major
players in such a priming process, owing to their high
frequency in pre-immune individuals and their reactivity
against broadly distributed conserved antigens. Conventional
memory ab T cells directed against common environmental
agents (like influenza, Epstein–Barr virus, CMV, or Mycobacteria)
could also significantly contribute to such a phenomenon
because these cells represent up to several percent of the
peripheral lymphoid pool in primed individuals. The iDCmediated potentiation of memory-T-cell cytokine responses
and subsequent priming of naive immune responses, which
remains to be formally shown for both human gd and
conventional T cells, could be key in situations where T-cellstimulating pathogens are unable to induce full iDC activation,
as is the case for Mycobacteria or Toll-like receptor-deficient aproteobacteria infections.
gd T cells as effectors of protective immunity against
pathogens and tumors
Numerous studies have reported in vitro reactivity of both Vd2
and non-Vd2 gd T-cell subsets against a broad range of tumor
cell lines and normal cells infected by a variety of viruses,
parasites, and bacteria [reviewed by Bonneville and Fournie
(3), Poccia et al. (33), Dechanet et al. (65) and Ferrarini et al.
(66)]. With respect to transformed cells, the range of cell lines
recognized by Vg9Vd2 T cells, initially thought to be primarily
restricted to hemopoietic tumors (47), was recently extended
to several solid tumors, such as renal and colon carcinomas
(7, 43). Both Vd2 and non-Vd2 subsets are able to directly
kill target cells in vitro, express bactericidal molecules such as
granulysin, and express proinflammatory cytokines involved in
clearance of tumor and infected cells (3, 28, 67, 68). Therefore,
a direct implication of both subsets in anti-tumor and antiinfectious protective immunity is highly likely. However, Vd2
and non-Vd2 subsets may exert distinct functions according to
the type of tumor or infectious agent and/or the tissue
environment. For instance, although Vd2 T cells predominate
within the mycobacterial lesions in patients with tuberculosis,
Vd1 cells are preferentially expanded in HIV-infected patients
with systemic Mycobacterium avium complex infections (69).
Major Vd1/Vd3 expansions have been reported in HIV-infected
patients and in immunosuppressed patients undergoing
CMV reactivation [reviewed by Poccia et al. (33) and Dechanet
et al.], whereas Vd2 cells are mostly anergic in such situations.
In a tumor context, the frequency of Vd2 cells within
lymphocytes infiltrating solid tumors is generally low, even
within Vg9Vd2-susceptible tumors such as renal and colon
Immunological Reviews 215/2007
129
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
Fig. 4. Cross talk between gd T cells and DCs. The gd T cells are
activated by DCs through recognition of either microbial antigen (e.g.
phospho-antigen specific for Vd2 cells) or self-antigen upregulated on
viral or microbial infection (as is presumably the case for CMV-specific
Vd1 cells or virus-induced Vd2 cells). Microbial or viral pathogens may
also induce, presumably through Toll-like receptor engagement and
expression of stress-associated ligands recognized by NKG2D, which
can then enhance activation of NKG2Dþ gd T cells. Both TCR- and
NKR-induced signals trigger expression of T-cell-derived molecules
belonging to the TNF/TNFR family (CD40 ligand, Fas ligand, TNFa).
These molecules in turn may upregulate expression of costimulatory
(CD80, CD83, CD86) and MHC class I/class II molecules on iDCs after
engagement of their respective counter receptors (step 1). Although
CD40 ligand/CD40 signaling plays an important role in iDC maturation
induced by Vd2 cells, Fas ligand/Fas signaling may significantly
contribute to iDC activation induced by some Vd1 cells (e.g. specific
for Borrelia burgdorferi). Soluble factors such as TNFa can also contribute
to DC maturation mediated by antigen-stimulated Vd2 cells and CD1cspecific Vd1 cells. Complete maturation of DCs into IL-12p70producing cells (step 2) requires both Toll-like receptor engagements
by PAMPs and T-cell-derived IFNg. IL-12 production can be readily
induced by high concentrations of PAMPs alone (e.g. microgram
amounts of lipopolysaccharide) or by low PAMP concentrations (e.g.
nanogram amounts of lipopolysaccharide) together with T-cell-derived
maturation signals such as IFNg. IL-12 upregulates IFNg production,
which in turn upregulates IL-12 through a positive feedback loop. IL12 may also upregulate gd TCR/NKR ligands, as suggested by analysis
of some Vd1 subsets expanded in vitro after incubation with DCs treated
with Gram-negative bacterial extracts. Finally, the ability of iDCs to
potentiate both TNFa and IFNg production by gd T cells may further
enhance T-cell-induced iDC activation. PAMPs, pathogen-associated
molecular patterns.
carcinomas (7, 43). By contrast, Vd1 cells are quite frequent
within T cells infiltrating solid tumors (reviewed in 70).
Similarly, Vd1 cells but not Vd2 cells are present within noninflamed skin, consistent with a specific role played by the
former subset in skin immunosurveillance (71).
In line with the above-mentioned observations, in vivo studies
in severe combined immunodeficient disease (SCID)/hu
models indicate that although both Vd2 and Vd1 cells can clear
human melanoma cells in grafted mice with SCID when injected
within the tumor, only Vd1 cells can clear tumor cells when
injected systemically (72). These distinct behaviors of Vd2
versus Vd1 cells could be explained by expression of a different
set of homing receptors on these gd subsets (71, 73). However,
such a functional dichotomy between Vd1 and Vd2 cells may
not apply for all solid tumors, as suggested by enhanced
elimination of melanoma (74) or renal carcinoma cells by Vd2
cells in very similar SCID/hu models (Y. Morel, personal
communication). In mice with SCID/huPBL, Vg9Vd2 PBLs
activated in vivo can migrate to and clear human kidney tumors
grafted subcutaneously. These seemingly discrepant results
could be explained by upregulation of skin-homing receptors on activated Vg9Vd2 T cells and/or by different levels of
130
Immunological Reviews 215/2007
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
tumor-induced inflammation in the above models, leading in
only some cases to in situ migration of Vg9Vd2 cells, which have
a strong tropism for inflammatory sites. In an infectious
context, Bukowski and colleagues (75) have reported efficient
clearance of intraperitoneal bacterial infections in SCID mice
following adoptive transfer of Vg9Vd2 PBLs, in accordance with
their in vitro anti-bacterial effector properties (see above).
gd T cells as professional APCs
As suggested by a recent study (76), Vg9Vd2 T cells can acquire
within few hours after antigenic activation several attributes
of APCs, such as expression of costimulatory molecules (e.g.
CD40), which allow them to efficiently stimulate naive T cells.
These are clearly new and quite exciting observations, whose
overall physiological relevance remains to be assessed in ad hoc
in vivo models.
In vivo/in vitro manipulation of human gd T cells for
immunotherapeutic purposes
Ongoing Vg9Vd2 T-cell-based immunotherapies
Broad reactivity of Vg9Vd2 PBLs toward a broad range of
tumors and recent availability of several synthetic clinical-grade
Vg9Vd2 agonists or pharmacological inhibitors able to trigger
selective Vg9Vd2 expansion and enhance Vg9Vd2 recognition
of tumor cells have fostered development of several new
immunotherapeutic approaches targeting this gd subset.
Toxicity and efficacy of adoptively transferred Vg9Vd2
lymphocytes after in vitro expansion are currently assessed in
patients with renal carcinoma through several phase I and phase
I/II clinical trials (77). Although it is too early to draw
conclusions about the therapeutic efficacy of such protocols,
these trials have shown that it is possible to expand under GMP
conditions up to 8 billion T cells highly enriched for Vg9Vd2
lymphocytes (Fig. 5A), which can be injected into patients
without overt toxicity. Nevertheless, in vitro proliferative
responses of Vg9Vd2 PBLs from patients with cancer here
turned out to be significantly lower than those obtained with
their healthy-donor-derived counterparts. This phenomenon
could be accounted for by chronic Vg9Vd2 stimulation, tumorinduced specific or systemic anergy induction, or iatrogenic
effects. Irrespective of the mechanisms involved, this decreased
proliferative activity is an important drawback that may
significantly hamper development of Vg9Vd2 T-cell-based
adoptive immunotherapy. This problem could be circumvented
by administration of allogeneic Vg9Vd2 T cells derived from
healthy donors because this gd subset is not alloreactive and
has not been involved so far in graft-versus-host (GVH) reactions.
Several active immunotherapy trials aim at directly activating
Vg9Vd2 T cells in vivo, using either synthetic GMP-grade
phospho-antigen or ABP (78, 79). As mentioned, these
compounds do not induce Vg9Vd2 expansion in vivo in
primates, unless co-injected with IL-2 (51, 52). In monkeys
treated with both gd T-cell agonists and IL-2, the frequency of
Vg9Vd2 PBLs increases dramatically between days 5 and 8 but
rapidly goes down to basal levels within 10–15 days. Moreover,
the magnitude of Vg9Vd2 PBL expansions rapidly decreases
after repeated treatments with gd T-cell agonists and IL-2
(Fig. 5B). This outcome could reflect an exhaustion of the naive
compartment and/or terminal maturation of Vg9Vd2 T cells in
treated monkeys. However, ex vivo phenotypic studies did not
evidence long-term modification of the effector/memory
phenotype of Vd2 PBLs from treated monkeys. Repeated
phospho-antigen treatments may also lead to depletion of
a high-affinity Vg9Vd2 subset, as suggested by preliminary
in vitro analyses of primate PBL responses to phospho-antigen
(J.-J. Fournié, unpublished data). In humans, ABPs can induce
dramatic expansion of Vg9Vd2 PBLs associated with an acutephase response in a small fraction of treated patients, indicating
that gd T cells can proliferate in an autocrine fashion on
antigenic stimulation in vivo. However, in line with primate
studies, most ABP- or phospho-antigen-treated patients do not
show any in vivo amplification of their Vg9Vd2 PBLs, unless they
are co-treated with IL-2. Importantly, stable responses or partial
tumor remission has been observed in several patients with
multiple myeloma receiving ABP and IL-2 (79, 80). Confirmation of these encouraging yet very preliminary results may come
from several ongoing phase I or phase I/II trials, which are based
on repeated administration of synthetic phospho-antigen and
IL-2 in patients carrying either hemopoietic or solid tumors.
Optimization of gd immunotherapeutic approaches
Researchers designing gd T-cell-based immunotherapies are
still facing several problems that currently preclude careful
assessment of the therapeutic potential of these protocols.
Current optimization strategies in this field (Fig. 5C) aim to (i)
improve long-term maintenance of adoptively transferred gd T
cells through administration of homeostatic cytokines (such as
IL-15) or induction of lymphodepletion prior to adoptive cell
transfer; (ii) combine ABP treatment, which increases tumor
cell susceptibility to Vg9Vd2 lysis, with adoptive transfer of
Vg9Vd2 T cells; (iii) use allogeneic Vg9Vd2 T cells, which are
presumably unable to induce GVH owing to their Th
dependency and their lack of alloreactivity; (iv) improve
effector functions of adoptively transferred cells during their
in vitro expansion, e.g. through addition of IL-15 (which may
Immunological Reviews 215/2007
131
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
Fig. 5. In vivo/in vitro stimulation of Vg9Vd2 T cells for immunotherapeutic purposes. (A). Selective in vitro expansion of Vg9Vd2 T
cells within PBLs cultured with synthetic P-Ag (BrHPP/Phosphostim,
Innate Pharma SA, Marseilles, France) and recombinant IL-2. Growth
curves deduced from representative data obtained with in vitrostimulated PBLs from healthy donors (A. Thedrez, E. Scotet, M.
Bonneville, unpublished data). (B). In vivo expansion of Vg9Vd2 PBLs in
Cynomolgus monkeys treated with Phosphostim and IL-2 sc.
Percentage and absolute numbers of Vg9Vd2 PBLs peak at 7–10 days
after each treatment but go down to basal levels after 2 weeks.
Moreover, the intensity of Vg9Vd2 in vivo expansion rapidly decreases
after repeated treatments, suggesting gd T-cell exhaustion/anergy
[typical response pattern drawn from Sicard et al.(52)]. A similar
phenomenon is observed in patients receiving multiple treatments with
Vg9Vd2 agonists and IL-2 (P-Ag or ABP) (J. Bennouna, personal
communication). (C). Possible ways to improve gd T-cell-based
immunotherapeutic protocols. Ab, antibody; IL-2 sc, IL-2 subcutaneously; P-Ag, phospho-antigen; TRAIL, TNF-related apoptosis-inducing
ligand.
increase cytolytic properties and anti-tumor reactivity of gd T
cells through upregulation of NKG2D signaling), IL-4 (which
may allow acquisition of anti-inflammatory and/or B-helper
functions for some infectious and/or allergic indications), or
IFNa (which may increase TNF-related, apoptosis-inducing,
ligand-dependent killing of tumor cells); and (v) transduce
Vg9Vd2 T cells with tumor-specific TCRs (e.g. specific for
leukemia-specific minor histocompatibility antigen) (81) or
chimeric tumor-specific immunoglobulin receptors (e.g.
specific for gangliosides or CD19) (82).
The gd T cells can improve monoclonal-antibody-mediated
tumor clearance in vitro and in vivo [e.g. anti-GD2 (82)],
presumably through antibody-dependent, cell-mediated
cytotoxicity. In this respect, a significant fraction of Vg9Vd2
132
Immunological Reviews 215/2007
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
T cells expresses intermediate levels of CD16, which is
preferentially upregulated within the effector/recently activated (the so-called ‘TEMRA’) T-cell subset (83, 84). This
provides a strong rationale for combination therapies using
tumor-specific monoclonal antibodies and either adoptively
transferred gd T cells or gd T-cell agonists. In vivo Vg9Vd2 Tcell responses following treatment with ABP or phosphoantigen may be improved through replacement of IL-2 by IL-15
or IL-7, which contribute to peripheral maintenance of memory
gd T cells and may prevent exhaustion of the naive
compartment, respectively. Administration of strong Vg9Vd2
agonists, like HDMAPP, can induce prolonged in vivo expansion
of Vg9Vd2 T cells in primates, which may last up to several
weeks. Such new generation compounds represent promising
means to improve the pharmacodynamics of gd T-cell responses
in patients with cancer and possibly their anti-tumor efficacy.
Conclusions
Studies performed during the past 5 years have brought
important new information regarding the specificity, activation
modalities, and in vivo function of human gd T cells. However,
we still know very little about the nature of human gd antigens,
their precise recognition mechanisms, and their therapeutic
potential. It is clear that the major efforts recently put into largescale production of clinical-grade gd T-cell agonists and the
design and optimization of immunotherapeutic protocols
targeting gd T cells will certainly help address several of these
challenging issues. Another major challenge will be to define
the right therapeutic window for immunotherapeutic treatments, including gd T-cell-based ones and the proper way to
combine these approaches with new therapies targeting tumor
cells and/or angiogenesis.
References
1. Haas W, Pereira P, Tonegawa S. Gamma/delta
cells. Annu Rev Immunol 1993;11:637–685.
2. Hayday AC. Gammadelta cells: a right time
and a right place for a conserved third way of
protection. Annu Rev Immunol
2000;18:975–1026.
3. Bonneville M, Fournie JJ. Sensing cell stress
and transformation through Vgamma9Vdelta2 T cell-mediated recognition of the
isoprenoid pathway metabolites. Microbes
Infect 2005;7:503–509.
4. Born WK, Reardon CL, O’Brien RL. The
function of gammadelta T cells in innate
immunity. Curr Opin Immunol 2006;18:
31–38.
5. De Rosa SC, Andrus JP, Perfetto SP, Mantovani
JJ, Herzenberg LA, Roederer M. Ontogeny of
gamma delta T cells in humans. J Immunol
2004;172:1637–1645.
6. Kato Y, Tanaka Y, Tanaka H, Yamashita S,
Minato N. Requirement of species-specific
interactions for the activation of human
gamma delta T cells by pamidronate. J
Immunol 2003;170:3608–3613.
7. Corvaisier M, et al. V gamma 9V delta 2 T cell
response to colon carcinoma cells. J Immunol
2005;175:5481–5488.
8. Espinosa E, Belmant C, Sicard H, Poupot R,
Bonneville M, Fournie JJ. Y2Kþ1 state-of-theart on non-peptide phosphoantigens, a novel
category of immunostimulatory molecules.
Microbes Infect 2001;3:645–654.
9. Poupot M, Fournie JJ. Non-peptide antigens
activating human Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes. Immunol Lett 2004;95:129–138.
10. Bonneville M, Scotet E. Human Vg9Vd2 T
cells: promising new leads for immunotherapy of infections and tumors. Curr Opin
Immunol 2006;18:539–546.
11. Gober HJ, Kistowska M, Angman L, Jeno P,
Mori L, De Libero G. Human T cell receptor
gammadelta cells recognize endogenous
mevalonate metabolites in tumor cells.
J Exp Med 2003;197:163–168.
12. Bergstrom JD, Bostedor RG, Masarachia PJ,
Reszka AA, Rodan G. Alendronate is a specific,
nanomolar inhibitor of farnesyl diphosphate
synthase. Arch Biochem Biophys
2000;373:231–241.
13. Kunzmann V, Bauer E, Wilhelm M.
Gamma/delta T-cell stimulation by pamidronate. N Engl J Med 1999;340:
737–738.
14. Bukowski JF, Morita CT, Brenner MB. Human
gamma delta T cells recognize alkylamines
derived from microbes, edible plants, and tea:
implications for innate immunity. Immunity
1999;11:57–65.
15. Thompson K, Rojas-Navea J, Rogers MJ.
Alkylamines cause Vgamma9Vdelta2 T-cell
activation and proliferation by inhibiting
the mevalonate pathway. Blood
2006;107:651–654.
16. Bukowski JF, Morita CT, Band H,
Brenner MB. Crucial role of TCR gamma chain
junctional region in prenyl pyrophosphate
antigen recognition by gamma delta
T cells. J Immunol 1998;161:286–293.
17. Miyagawa F, et al. Essential contribution of
germline-encoded lysine residues in
Jgamma1.2 segment to the recognition of
nonpeptide antigens by human gammadelta T
cells. J Immunol 2001;167:6773–6779.
18. Sireci G, Espinosa E, Di Sano C, Dieli F,
Fournie JJ, Salerno A. Differential activation of
human gammadelta cells by nonpeptide
phosphoantigens. Eur J Immunol
2001;31:1628–1635.
19. Lang F, et al. Early activation of human V
gamma 9V delta 2 T cell broad cytotoxicity
and TNF production by nonpeptidic mycobacterial ligands. J Immunol 1995;154:
5986–5994.
20. Kato Y, Tanaka Y, Hayashi M, Okawa K,
Minato N. Involvement of CD166 in the
activation of human {gamma}{delta}T cells
by tumor cells sensitized with nonpeptide
antigens. J Immunol 2006;177:877–884.
21. Scotet E, et al. Tumor recognition following
Vgamma9Vdelta2 T cell receptor interactions
with a surface F1-ATPase-related structure and
apolipoprotein A-I. Immunity 2005;22:
71–80.
22. Born WK, et al. Hybridomas expressing
gammadelta T-cell receptors respond to cardiolipin and beta2-glycoprotein 1 (apolipoprotein H). Scand J Immunol 2003;58:
374–381.
23. Navab M, Anantharamaiah GM, Fogelman
AM. The role of high-density lipoprotein in
inflammation. Trends Cardiovasc Med
2005;15:158–161.
24. Shiflett AM, Bishop JR, Pahwa A, Hajduk SL.
Human high density lipoproteins are platforms for the assembly of multi-component
innate immune complexes. J Biol Chem
2005;280:32578–32585.
25. Ragno S, Romano M, Howell S, Pappin DJ,
Jenner PJ, Colston MJ. Changes in gene
expression in macrophages infected with
Mycobacterium tuberculosis: a combined
transcriptomic and proteomic approach.
Immunology 2001;104:99–108.
26. Moser TL, et al. Endothelial cell surface F1-F0
ATP synthase is active in ATP synthesis and
is inhibited by angiostatin. Proc Natl Acad
Sci USA 2001;98:6656–6661.
Immunological Reviews 215/2007
133
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
27. Moser TL, et al. Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial
cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:
2811–2816.
28. Spada FM, et al. Self-recognition of CD1 by
gamma/delta T cells: implications for innate
immunity. J Exp Med 2000;191:937–948.
29. Groh V, Steinle A, Bauer S, Spies T. Recognition of stress-induced MHC molecules by
intestinal epithelial gammadelta T cells. Science 1998;279:1737–1740.
30. Groh V, Rhinehart R, Secrist H, Bauer S,
Grabstein KH, Spies T. Broad tumorassociated expression and recognition by
tumor-derived gamma delta T cells of MICA
and MICB. Proc Natl Acad Sci USA
1999;96:6879–6884.
31. Wu J, Groh V, Spies T. T cell antigen receptor
engagement and specificity in the recognition
of stress-inducible MHC class I-related chains
by human epithelial gamma delta T cells.
J Immunol 2002;169:1236–1240.
32. Zhao J, Huang J, Chen H, Cui L, He W.
Vdelta1 T cell receptor binds specifically to
MHC I chain related A: molecular and
biochemical evidences. Biochem Biophys
Res Commun 2006;339:232–240.
33. Poccia F, Agrati C, Martini F, Capobianchi MR,
Wallace M, Malkovsky M. Antiviral reactivities
of gammadelta T cells. Microbes Infect
2005;7:518–528.
34. Das H, Sugita M, Brenner MB. Mechanisms of
Vdelta1 gammadelta T cell activation by
microbial components. J Immunol
2004;172:6578–6586.
35. Dechanet J, et al. Major expansion of gammadelta T lymphocytes following cytomegalovirus infection in kidney allograft recipients.
J Infect Dis 1999;179:1–8.
36. Dechanet J, et al. Implication of gammadelta T
cells in the human immune response to
cytomegalovirus. J Clin Invest
1999;103:1437–1449.
37. Halary F, et al. Shared reactivity of Vdelta2neg
gammadelta T cells against cytomegalovirusinfected cells and tumor intestinal epithelial
cells. J Exp Med 2005;201:1567–1578.
38. Ehl S, et al. A variant of SCID with specific
immune responses and predominance of
gamma delta T cells. J Clin Invest
2005;115:3140–3148.
39. Halary F, Fournie JJ, Bonneville M. Activation
and control of self-reactive gammadelta T
cells. Microbes Infect 1999;1:247–253.
40. Fisch P, Moris A, Rammensee HG,
Handgretinger R. Inhibitory MHC class I
receptors on gammadelta T cells in tumour
immunity and autoimmunity. Immunol
Today 2000;21:187–191.
41. Das H, et al. MICA engagement by human
Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their
antigen-dependent effector function.
Immunity 2001;15:83–93.
134
42. Favier B, et al. Uncoupling between immunological synapse formation and functional
outcome in human gamma delta T lymphocytes. J Immunol 2003;171:5027–5033.
43. Viey E, et al. Phosphostim-activated gamma
delta T cells kill autologous metastatic renal
cell carcinoma. J Immunol 2005;174:
1338–1347.
44. Poggi A, et al. Vdelta1 T lymphocytes from
B-CLL patients recognize ULBP3 expressed on
leukemic B cells and up-regulated by
trans-retinoic acid. Cancer Res
2004;64:9172–9179.
45. Roberts AI, et al. NKG2D receptors induced by
IL-15 costimulate CD28-negative effector CTL
in the tissue microenvironment. J Immunol
2001;167:5527–5530.
46. Aramburu J, et al. A novel functional cell
surface dimer (Kp43) expressed by natural
killer cells and T cell receptor-gamma/deltaþ
T lymphocytes. I. Inhibition of the IL-2dependent proliferation by anti-Kp43 monoclonal antibody. J Immunol 1990;144:
3238–3247.
47. Fisch P, et al. Control of B cell lymphoma
recognition via natural killer inhibitory
receptors implies a role for human
Vgamma9/Vdelta2 T cells in tumor immunity. Eur J Immunol 1997;27:3368–3379.
48. Halary F, et al. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma delta
T cell receptors by natural killer inhibitory
receptors. Eur J Immunol 1997;27:
2812–2821.
49. Trichet V, Benezech C, Dousset C, Gesnel MC,
Bonneville M, Breathnach R. Complex interplay of activating and inhibitory signals
received by Vg9Vd2. T cells revealed by target
cell beta2microglobulin knock down.
J Immunol 2006;177:6129–6136.
50. Pechhold K, Wesch D, Schondelmaier S,
Kabelitz D. Primary activation of V gamma 9expressing gamma delta T cells by Mycobacterium tuberculosis. Requirement for
Th1-type CD4 T cell help and inhibition
by IL-10. J Immunol 1994;152:4984–4992.
51. Casetti R, et al. Drug-induced
expansion and differentiation of V gamma 9V
delta 2 T cells in vivo: the role of
exogenous IL-2. J Immunol 2005;175:
1593–1598.
52. Sicard H, et al. In vivo immunomanipulation
of V gamma 9V delta 2 T cells with a synthetic
phosphoantigen in a preclinical nonhuman
primate model. J Immunol 2005;175:
5471–5480.
53. Caccamo N, et al. Differential requirements
for antigen or homeostatic cytokines for
proliferation and differentiation of human
Vgamma9Vdelta2 naive, memory and
effector T cell subsets. Eur J Immunol
2005;35:1764–1772.
Immunological Reviews 215/2007
54. Devilder MC, Maillet S, Bouyge-Moreau I,
Donnadieu E, Bonneville M, Scotet E. Potentiation of antigen-stimulated V{gamma}
9V{delta}2 T cell cytokine production by
immature dendritic cells (DC) and reciprocal
effect on DC maturation. J Immunol
2006;176:1386–1393.
55. Zammit DJ, Cauley LS, Pham QM, Lefrancois
L. Dendritic cells maximize the memory CD8
T cell response to infection. Immunity
2005;22:561–570.
56. van der Vliet HJ, et al. Potent expansion of
human natural killer T cells using alphagalactosylceramide (KRN7000)-loaded
monocyte-derived dendritic cells, cultured in
the presence of IL-7 and IL-15. J Immunol
Methods 2001;247:61–72.
57. Fujii S, Shimizu K, Kronenberg M, Steinman
RM. Prolonged IFN-gamma-producing NKT
response induced with alpha-galactosylceramide-loaded DCs. Nat Immunol 2002;3:
867–874.
58. Leslie DS, et al. CD1-mediated gamma/delta T
cell maturation of dendritic cells. J Exp Med
2002;196:1575–1584.
59. Collins C, Wolfe J, Roessner K, Shi C,
Sigal LH, Budd RC. Lyme arthritis synovial
gammadelta T cells instruct dendritic
cells via Fas ligand. J Immunol 2005;175:
5656–5665.
60. Conti L, et al. Reciprocal activating interaction
between dendritic cells and pamidronatestimulated gammadelta T cells: role of CD86
and inflammatory cytokines. J Immunol
2005;174:252–260.
61. Fujii S, Liu K, Smith C, Bonito AJ, Steinman
RM. The linkage of innate to adaptive immunity via maturing dendritic cells in vivo
requires CD40 ligation in addition to antigen
presentation and CD80/86 costimulation.
J Exp Med 2004;199:1607–1618.
62. Girardi M, et al. Resident skin-specific gammadelta T cells provide local, nonredundant
regulation of cutaneous inflammation. J Exp
Med 2002;195:855–867.
63. Girardi M, et al. The distinct contributions of
murine T cell receptor (TCR)gammadeltaþ
and TCRalphabetaþ T cells to different stages
of chemically induced skin cancer. J Exp Med
2003;198:747–755.
64. Chang DH, et al. Sustained expansion of NKT
cells and antigen-specific T cells after injection
of alpha-galactosyl-ceramide loaded mature
dendritic cells in cancer patients. J Exp Med
2005;201:1503–1517.
65. Dechanet J, Merville P, Pitard V, Lafarge X,
Moreau JF. Human gammadelta T cells and
viruses. Microbes Infect 1999;1:213–217.
66. Ferrarini M, Ferrero E, Dagna L, Poggi A,
Zocchi MR. Human gammadelta T cells:
a nonredundant system in the immunesurveillance against cancer. Trends
Immunol 2002;23:14–18.
Thedrez et al Self/non-self discrimination by human gd T cells
67. Battistini L, et al. Phenotypic and cytokine
analysis of human peripheral blood gamma
delta T cells expressing NK cell receptors.
J Immunol 1997;159:3723–3730.
68. Dieli F, et al. Granulysin-dependent killing of
intracellular and extracellular Mycobacterium
tuberculosis by Vgamma9/Vdelta2 T lymphocytes. J Infect Dis 2001;184:1082–1085.
69. Moreau JF, et al. Increases in CD3þCD4-CD8T lymphocytes in AIDS patients with disseminated Mycobacterium avium-intracellulare
complex infection. J Infect Dis
1996;174:969–976.
70. Zocchi MR, Ferrarini M, Migone N, Casorati
G. T-cell receptor V delta gene usage by
tumour reactive gamma delta T lymphocytes
infiltrating human lung cancer. Immunology
1994;81:234–239.
71. Ebert LM, Meuter S, Moser B. Homing and
function of human skin gammadelta T cells
and NK cells: relevance for tumor surveillance. J Immunol 2006;176:4331–4336.
72. Lozupone F, et al. Effect of human natural
killer and gammadelta T cells on the growth of
human autologous melanoma xenografts in
SCID mice. Cancer Res 2004;64:378–385.
73. Battistini L, et al. Homing and memory
patterns of human gammadelta T cells in
physiopathological situations. Microbes
Infect 2005;7:510–517.
74. Kabelitz D, Wesch D, Pitters E, Zoller M.
Characterization of tumor reactivity of human
V gamma 9V delta 2 gamma delta T cells
in vitro and in SCID mice in vivo.
J Immunol 2004;173:6767–6776.
75. Wang L, Kamath A, Das H, Li L, Bukowski JF.
Antibacterial effect of human V gamma 2V
delta 2 T cells in vivo. J Clin Invest
2001;108:1349–1357.
76. Brandes M, Willimann K, Moser B. Professional antigen-presentation function by
human gammadelta T cells. Science
2005;309:264–268.
77. Viey E, Laplace C, Escudier B. Peripheral
gammadelta T-lymphocytes as an innovative
tool in immunotherapy for metastatic renal
cell carcinoma. Expert Rev Anticancer Ther
2005;5:973–986.
78. Wilhelm M, et al. Gammadelta T cells for
immune therapy of patients with lymphoid
malignancies. Blood 2003;102:200–206.
79. Kunzmann V, Wilhelm M. Anti-lymphoma
effect of gammadelta T cells. Leuk Lymphoma
2005;46:671–680.
80. Kunzmann V, Bauer E, Feurle J, Weissinger F,
Tony HP, Wilhelm M. Stimulation of
gammadelta T cells by aminobisphosphonates
and induction of antiplasma cell activity
in multiple myeloma. Blood 2000;96:
384–392.
81. van der Veken LT, Hagedoorn RS, van Loenen
MM, Willemze R, Falkenburg JH, Heemskerk
MH. Alphabeta T-cell receptor engineered
gammadelta T cells mediate effective
antileukemic reactivity. Cancer Res 2006;
66:3331–3337.
82. Rischer M, Pscherer S, Duwe S, Vormoor J,
Jurgens H, Rossig C. Human gammadelta T
cells as mediators of chimaeric-receptor
redirected anti-tumour immunity. Br J
Haematol 2004;126:583–592.
83. Lafont V, Liautard J, Liautard JP, Favero J.
Production of TNF-alpha by human V
gamma 9V delta 2 T cells via engagement of
Fc gamma RIIIA, the low affinity type 3
receptor for the Fc portion of IgG,
expressed upon TCR activation by
nonpeptidic antigen. J Immunol 2001;166:
7190–7199.
84. Angelini DF, et al. FcgammaRIII discriminates
between 2 subsets of Vgamma9Vdelta2
effector cells with different responses and
activation pathways. Blood 2004;104:
1801–1807.
85. Flament C, Benmerah A, Bonneville M,
Triebel F, Mami-Chouaib F. Human
TCR-gamma/delta alloreactive response to
HLA-DR molecules. Comparison with
response of TCR-alpha/beta. J Immunol
1994;153:2890–2904.
Immunological Reviews 215/2007
135
BIBLIOGRAPHIE
1.
Matzinger, P. Tolerance, danger, and the extended family. Annu Rev Immunol 12, 991-1045 (1994).
2.
de Visser, K.E., Eichten, A. & Coussens, L.M. Paradoxical roles of the immune system during cancer
development. Nat Rev Cancer 6, 24-37 (2006).
3.
Mombaerts, P. et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell 68, 869-877
(1992).
4.
van der Bruggen, P. et al. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a
human melanoma. Science 254, 1643-1647 (1991).
5.
Boon, T. Toward a genetic analysis of tumor rejection antigens. Adv Cancer Res 58, 177-210 (1992).
6.
Traversari, C. et al. A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognized on HLA-A1 by
cytolytic T lymphocytes directed against tumor antigen MZ2-E. The Journal of experimental medicine
176, 1453-1457 (1992).
7.
Epstein, M.A. Epstein-Barr virus as the cause of a human cancer. Nature 274, 740 (1978).
8.
Zuckerman, A.J. Role of hepatitis B virus in primary liver cancer. J Toxicol Environ Health 5, 275-280
(1979).
9.
Altundag, K., Altundag, O. & Gundeslioglu, O. Human papilloma virus and breast cancer. J Clin Virol
33, 179 (2005).
10.
Abraham, S. in Med J Aust, Vol. 144 1641986).
11.
Boel, P. et al. BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic T
lymphocytes. Immunity 2, 167-175 (1995).
12.
Russo, V. et al. MAGE BAGE and GAGE genes expression in fresh epithelial ovarian carcinomas. Int J
Cancer 67, 457-460 (1996).
13.
Li, J. et al. Expression of BAGE, GAGE, and MAGE genes in human gastric carcinoma. Clin Cancer
Res 2, 1619-1625 (1996).
14.
Irimura, T., Denda, K., Iida, S., Takeuchi, H. & Kato, K. Diverse glycosylation of MUC1 and MUC2:
potential significance in tumor immunity. J Biochem (Tokyo) 126, 975-985 (1999).
15.
Tsang, K.Y. et al. Generation of human cytotoxic T cells specific for human carcinoembryonic antigen
epitopes from patients immunized with recombinant vaccinia-CEA vaccine. J Natl Cancer Inst 87, 982990 (1995).
16.
Merimsky, O., Shoenfeld, Y., Baharav, E., Zigelman, R. & Fishman, P. Reactivity to tyrosinase:
expression in cancer (melanoma) and autoimmunity (vitiligo). Hum Antibodies Hybridomas 7, 151-156
(1996).
17.
Bakker, A.B. et al. Melanocyte lineage-specific antigen gp100 is recognized by melanoma-derived
tumor-infiltrating lymphocytes. The Journal of experimental medicine 179, 1005-1009 (1994).
18.
Coulie, P.G. et al. A new gene coding for a differentiation antigen recognized by autologous cytolytic T
lymphocytes on HLA-A2 melanomas. The Journal of experimental medicine 180, 35-42 (1994).
119
19.
Wang, R.F., Robbins, P.F., Kawakami, Y., Kang, X.Q. & Rosenberg, S.A. Identification of a gene
encoding a melanoma tumor antigen recognized by HLA-A31-restricted tumor-infiltrating
lymphocytes. The Journal of experimental medicine 181, 799-804 (1995).
20.
Holzmann, B., Johnson, J.P., Kaudewitz, P. & Riethmuller, G. In situ analysis of antigens on malignant
and benign cells of the melanocyte lineage. Differential expression of two surface molecules, gp75 and
p89. The Journal of experimental medicine 161, 366-377 (1985).
21.
Lethe, B., van der Bruggen, P., Brasseur, F. & Boon, T. MAGE-1 expression threshold for the lysis of
melanoma cell lines by a specific cytotoxic T lymphocyte. Melanoma Res 7 Suppl 2, S83-88 (1997).
22.
Yoshino, I. et al. HER2/neu-derived peptides are shared antigens among human non-small cell lung
cancer and ovarian cancer. Cancer Res 54, 3387-3390 (1994).
23.
Slamon, D.J. et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the
HER-2/neu oncogene. Science 235, 177-182 (1987).
24.
Gnjatic, S. et al. Accumulation of the p53 protein allows recognition by human CTL of a wild-type p53
epitope presented by breast carcinomas and melanomas. J Immunol 160, 328-333 (1998).
25.
Van Den Eynde, B.J. et al. A new antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human kidney
tumor results from reverse strand transcription. The Journal of experimental medicine 190, 1793-1800
(1999).
26.
Voest, E.E. et al. Inhibition of angiogenesis in vivo by interleukin 12. J Natl Cancer Inst 87, 581-586
(1995).
27.
Chouaib, S., Branellec, D. & Buurman, W.A. More insights into the complex physiology of TNF.
Immunol Today 12, 141-142 (1991).
28.
Grakoui, A. et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.
Science 285, 221-227 (1999).
29.
Miller, R.A., Maloney, D.G., McKillop, J. & Levy, R. In vivo effects of murine hybridoma monoclonal
antibody in a patient with T-cell leukemia. Blood 58, 78-86 (1981).
30.
Delon, J., Stoll, S. & Germain, R.N. Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in
culture and in intact lymphoid tissue. Immunol Rev 189, 51-63 (2002).
31.
Dustin, M.L. & Cooper, J.A. The immunological synapse and the actin cytoskeleton: molecular
hardware for T cell signaling. Nat Immunol 1, 23-29 (2000).
32.
Anton van der Merwe, P., Davis, S.J., Shaw, A.S. & Dustin, M.L. Cytoskeletal polarization and
redistribution of cell-surface molecules during T cell antigen recognition. Semin Immunol 12, 5-21
(2000).
33.
Trapani, J.A. & Smyth, M.J. Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway. Nat
Rev Immunol 2, 735-747 (2002).
34.
Bade, B. et al. Differential expression of the granzymes A, K and M and perforin in human peripheral
blood lymphocytes. Int Immunol 17, 1419-1428 (2005).
35.
Atkinson, E.A. et al. Cytotoxic T lymphocyte-assisted suicide. Caspase 3 activation is primarily the
result of the direct action of granzyme B. J Biol Chem 273, 21261-21266 (1998).
36.
Waterhouse, N.J., Sedelies, K.A. & Trapani, J.A. Role of Bid-induced mitochondrial outer membrane
permeabilization in granzyme B-induced apoptosis. Immunol Cell Biol 84, 72-78 (2006).
37.
Goping, I.S. et al. Granzyme B-induced apoptosis requires both direct caspase activation and relief of
caspase inhibition. Immunity 18, 355-365 (2003).
120
38.
Barry, M. & Bleackley, R.C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nat Rev Immunol 2,
401-409 (2002).
39.
Steinman, R.M. & Cohn, Z.A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice.
I. Morphology, quantitation, tissue distribution. The Journal of experimental medicine 137, 1142-1162
(1973).
40.
Banchereau, J. & Steinman, R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252
(1998).
41.
Mellman, I. & Steinman, R.M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines.
Cell 106, 255-258 (2001).
42.
Schultze, J., Nadler, L.M. & Gribben, J.G. B7-mediated costimulation and the immune response. Blood
Rev 10, 111-127 (1996).
43.
Banchereau, J. et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18, 767-811 (2000).
44.
Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. & Inaba, K. The induction of tolerance by dendritic cells that
have captured apoptotic cells. The Journal of experimental medicine 191, 411-416 (2000).
45.
Taieb, J. et al. A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance. Nat Med 12, 214219 (2006).
46.
Chan, C.W. et al. Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive
immunity. Nat Med 12, 207-213 (2006).
47.
Shortman, K. & Villadangos, J.A. Is it a DC, is it an NK? No, it's an IKDC. Nat Med 12, 167-168
(2006).
48.
Smyth, M.J. Imatinib mesylate--uncovering a fast track to adaptive immunity. N Engl J Med 354, 22822284 (2006).
49.
Nestle, F.O. et al. Vaccination of melanoma patients with peptide- or tumor lysate-pulsed dendritic
cells. Nat Med 4, 328-332 (1998).
50.
Jonuleit, H. et al. A comparison of two types of dendritic cell as adjuvants for the induction of
melanoma-specific T-cell responses in humans following intranodal injection. Int J Cancer 93, 243-251
(2001).
51.
Banchereau, J. et al. Immune and clinical responses in patients with metastatic melanoma to CD34(+)
progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res 61, 6451-6458 (2001).
52.
De Vries, I.J. et al. Effective migration of antigen-pulsed dendritic cells to lymph nodes in melanoma
patients is determined by their maturation state. Cancer Res 63, 12-17 (2003).
53.
Schuler-Thurner, B. et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic
melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived
dendritic cells. The Journal of experimental medicine 195, 1279-1288 (2002).
54.
Fong, L. et al. Dendritic cell-based xenoantigen vaccination for prostate cancer immunotherapy. J
Immunol 167, 7150-7156 (2001).
55.
Heiser, A. et al. Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA stimulate
CTL responses against metastatic prostate tumors. J Clin Invest 109, 409-417 (2002).
56.
Fong, L. et al. Altered peptide ligand vaccination with Flt3 ligand expanded dendritic cells for tumor
immunotherapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98,
8809-8814 (2001).
121
57.
Hsu, F.J. et al. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic
cells. Nat Med 2, 52-58 (1996).
58.
Paczesny, S., Ueno, H., Fay, J., Banchereau, J. & Palucka, A.K. Dendritic cells as vectors for
immunotherapy of cancer. Semin Cancer Biol 13, 439-447 (2003).
59.
Williams, R.C., Jr., DeBoard, J.R., Mellbye, O.J., Messner, R.P. & Lindstrom, F.D. Studies of T- and
B-lymphocytes in patients with connective tissue diseases. J Clin Invest 52, 283-295 (1973).
60.
Herberman, R.B., Nunn, M.E., Holden, H.T. & Lavrin, D.H. Natural cytotoxic reactivity of mouse
lymphoid cells against syngeneic and allogeneic tumors. II. Characterization of effector cells. Int J
Cancer 16, 230-239 (1975).
61.
Kiessling, R., Klein, E. & Wigzell, H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with
specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J
Immunol 5, 112-117 (1975).
62.
Moretta, A. et al. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated
cytolysis. Annu Rev Immunol 19, 197-223 (2001).
63.
Groh, V. et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in
gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 93, 12445-12450 (1996).
64.
Groh, V. et al. Broad tumor-associated expression and recognition by tumor-derived gamma delta T
cells of MICA and MICB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 96, 6879-6884 (1999).
65.
Salih, H.R. et al. Functional expression and release of ligands for the activating immunoreceptor
NKG2D in leukemia. Blood 102, 1389-1396 (2003).
66.
Welte, S.A. et al. Selective intracellular retention of virally induced NKG2D ligands by the human
cytomegalovirus UL16 glycoprotein. Eur J Immunol 33, 194-203 (2003).
67.
Wu, J. et al. Intracellular retention of the MHC class I-related chain B ligand of NKG2D by the human
cytomegalovirus UL16 glycoprotein. J Immunol 170, 4196-4200 (2003).
68.
Nomura, M. et al. Genomic structures and characterization of Rae1 family members encoding GPIanchored cell surface proteins and expressed predominantly in embryonic mouse brain. J Biochem
(Tokyo) 120, 987-995 (1996).
69.
Diefenbach, A., Jamieson, A.M., Liu, S.D., Shastri, N. & Raulet, D.H. Ligands for the murine NKG2D
receptor: expression by tumor cells and activation of NK cells and macrophages. Nat Immunol 1, 119126 (2000).
70.
Cerwenka, A. et al. Retinoic acid early inducible genes define a ligand family for the activating
NKG2D receptor in mice. Immunity 12, 721-727 (2000).
71.
Anfossi, N. et al. Human NK cell education by inhibitory receptors for MHC class I. Immunity 25, 331342 (2006).
72.
Smyth, M.J. et al. NKT cells - conductors of tumor immunity? Curr Opin Immunol 14, 165-171 (2002).
73.
Kawano, T. et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by
glycosylceramides. Science 278, 1626-1629 (1997).
74.
Burdin, N. et al. Selective ability of mouse CD1 to present glycolipids: alpha-galactosylceramide
specifically stimulates V alpha 14+ NK T lymphocytes. J Immunol 161, 3271-3281 (1998).
122
75.
Brossay, L. et al. Structural requirements for galactosylceramide recognition by CD1-restricted NK T
cells. J Immunol 161, 5124-5128 (1998).
76.
Cui, J. et al. Requirement for Valpha14 NKT cells in IL-12-mediated rejection of tumors. Science 278,
1623-1626 (1997).
77.
Smyth, M.J. & Godfrey, D.I. NKT cells and tumor immunity--a double-edged sword. Nat Immunol 1,
459-460 (2000).
78.
Ota, T. et al. IFN-gamma-mediated negative feedback regulation of NKT-cell function by
CD94/NKG2. Blood 106, 184-192 (2005).
79.
Terabe, M. et al. NKT cell-mediated repression of tumor immunosurveillance by IL-13 and the IL-4RSTAT6 pathway. Nat Immunol 1, 515-520 (2000).
80.
Godfrey, D.I. & Kronenberg, M. Going both ways: immune regulation via CD1d-dependent NKT cells.
J Clin Invest 114, 1379-1388 (2004).
81.
Hegde, S. et al. NKT cells direct monocytes into a DC differentiation pathway. J Leukoc Biol 81, 12241235 (2007).
82.
Guilloux, Y. et al. Defective lymphokine production by most CD8+ and CD4+ tumor-specific T cell
clones derived from human melanoma-infiltrating lymphocytes in response to autologous tumor cells in
vitro. Eur J Immunol 24, 1966-1973 (1994).
83.
Maeurer, M.J. et al. Tumor escape from immune recognition: loss of HLA-A2 melanoma cell surface
expression is associated with a complex rearrangement of the short arm of chromosome 6. Clin Cancer
Res 2, 641-652 (1996).
84.
Ferrone, S. & Marincola, F.M. Loss of HLA class I antigens by melanoma cells: molecular
mechanisms, functional significance and clinical relevance. Immunol Today 16, 487-494 (1995).
85.
Pardoll, D.M. Cancer vaccines. Nat Med 4, 525-531 (1998).
86.
Bueler, H. & Mulligan, R.C. Induction of antigen-specific tumor immunity by genetic and cellular
vaccines against MAGE: enhanced tumor protection by coexpression of granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor and B7-1. Mol Med 2, 545-555 (1996).
87.
Lehmann, F. et al. Differences in the antigens recognized by cytolytic T cells on two successive
metastases of a melanoma patient are consistent with immune selection. Eur J Immunol 25, 340-347
(1995).
88.
Trisciuoglio, D. et al. Bcl-2 overexpression in melanoma cells increases tumor progression-associated
properties and in vivo tumor growth. J Cell Physiol 205, 414-421 (2005).
89.
Bots, M., Offringa, R. & Medema, J.P. Does the serpin PI-9 protect tumor cells? Blood 107, 4974-4975;
author reply 4975 (2006).
90.
Hahne, M. et al. Melanoma cell expression of Fas(Apo-1/CD95) ligand: implications for tumor immune
escape. Science 274, 1363-1366 (1996).
91.
Song, E. et al. Soluble Fas ligand released by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte
apoptosis: an active mode of immune evasion in colon cancer. Br J Cancer 85, 1047-1054 (2001).
92.
Perabo, F.G. et al. Soluble Fas and Fas-ligand in bladder cancer in vitro and in vivo. Urol Oncol 6, 163169 (2001).
93.
Clayton, A. & Tabi, Z. Exosomes and the MICA-NKG2D system in cancer. Blood Cells Mol Dis 34,
206-213 (2005).
123
94.
Gabrilovich, D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nat
Rev Immunol 4, 941-952 (2004).
95.
Sakaguchi, S. Regulatory T cells: key controllers of immunologic self-tolerance. Cell 101, 455-458
(2000).
96.
Terabe, M. et al. Transforming growth factor-beta production and myeloid cells are an effector
mechanism through which CD1d-restricted T cells block cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor
immunosurveillance: abrogation prevents tumor recurrence. The Journal of experimental medicine 198,
1741-1752 (2003).
97.
Moodycliffe, A.M., Nghiem, D., Clydesdale, G. & Ullrich, S.E. Immune suppression and skin cancer
development: regulation by NKT cells. Nat Immunol 1, 521-525 (2000).
98.
Holland, G. & Zlotnik, A. Interleukin-10 and cancer. Cancer Invest 11, 751-758 (1993).
99.
Norgaard, P., Hougaard, S., Poulsen, H.S. & Spang-Thomsen, M. Transforming growth factor beta and
cancer. Cancer Treat Rev 21, 367-403 (1995).
100.
Cardillo, M.R., Lazzereschi, D., Gandini, O., Di Silverio, F. & Colletta, G. Transforming growth factorbeta pathway in human renal cell carcinoma and surrounding normal-appearing renal parenchyma. Anal
Quant Cytol Histol 23, 109-117 (2001).
101.
Cardillo, M.R. & Ippoliti, F. Interleukin-6, interleukin-10 and heat shock protein-90 expression in renal
epithelial neoplasias and surrounding normal-appearing renal parenchyma. Int J Immunopathol
Pharmacol 20, 37-46 (2007).
102.
Chouaib, S., Asselin-Paturel, C., Mami-Chouaib, F., Caignard, A. & Blay, J.Y. The host-tumor immune
conflict: from immunosuppression to resistance and destruction. Immunol Today 18, 493-497 (1997).
103.
Ritz, J. et al. Serotherapy of acute lymphoblastic leukemia with monoclonal antibody. Blood 58, 141152 (1981).
104.
Letvin, N.L. et al. In vivo administration of lymphocyte-specific monoclonal antibodies in nonhuman
primates: I. Effects of anti-T11 antibodies on the circulating T cell pool. Blood 66, 961-966 (1985).
105.
Bertram, J.H. et al. Monoclonal antibody T101 in T cell malignancies: a clinical, pharmacokinetic, and
immunologic correlation. Blood 68, 752-761 (1986).
106.
Kennedy, A.D. et al. Rituximab infusion promotes rapid complement depletion and acute CD20 loss in
chronic lymphocytic leukemia. J Immunol 172, 3280-3288 (2004).
107.
Beum, P.V., Kennedy, A.D., Williams, M.E., Lindorfer, M.A. & Taylor, R.P. The shaving reaction:
rituximab/CD20 complexes are removed from mantle cell lymphoma and chronic lymphocytic
leukemia cells by THP-1 monocytes. J Immunol 176, 2600-2609 (2006).
108.
Terness, P. et al. Inhibition of allogeneic T cell proliferation by indoleamine 2,3-dioxygenaseexpressing dendritic cells: mediation of suppression by tryptophan metabolites. The Journal of
experimental medicine 196, 447-457 (2002).
109.
Fallarino, F. et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat Immunol 4, 12061212 (2003).
110.
Grohmann, U. et al. CTLA-4-Ig regulates tryptophan catabolism in vivo. Nat Immunol 3, 1097-1101
(2002).
111.
Munn, D.H. et al. GCN2 kinase in T cells mediates proliferative arrest and anergy induction in response
to indoleamine 2,3-dioxygenase. Immunity 22, 633-642 (2005).
124
112.
Makarenkova, V.P., Bansal, V., Matta, B.M., Perez, L.A. & Ochoa, J.B. CD11b+/Gr-1+ myeloid
suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J Immunol 176, 2085-2094 (2006).
113.
Rodriguez, P.C., Quiceno, D.G. & Ochoa, A.C. L-arginine availability regulates T-lymphocyte cellcycle progression. Blood 109, 1568-1573 (2007).
114.
Laouar, Y., Welte, T., Fu, X.Y. & Flavell, R.A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell
differentiation. Immunity 19, 903-912 (2003).
115.
Wang, T. et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor
cells. Nat Med 10, 48-54 (2004).
116.
Nefedova, Y. et al. Hyperactivation of STAT3 is involved in abnormal differentiation of dendritic cells
in cancer. J Immunol 172, 464-474 (2004).
117.
Takeda, K. et al. Enhanced Th1 activity and development of chronic enterocolitis in mice devoid of
Stat3 in macrophages and neutrophils. Immunity 10, 39-49 (1999).
118.
Negrier, S. et al. Recombinant human interleukin-2, recombinant human interferon alfa-2a, or both in
metastatic renal-cell carcinoma. Groupe Francais d'Immunotherapie. N Engl J Med 338, 1272-1278
(1998).
119.
Kirkwood, J.M. et al. Interferon alfa-2b adjuvant therapy of high-risk resected cutaneous melanoma: the
Eastern Cooperative Oncology Group Trial EST 1684. J Clin Oncol 14, 7-17 (1996).
120.
Mule, J.J., Shu, S., Schwarz, S.L. & Rosenberg, S.A. Adoptive immunotherapy of established
pulmonary metastases with LAK cells and recombinant interleukin-2. Science 225, 1487-1489 (1984).
121.
Rosenberg, S.A., Spiess, P. & Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer
with tumor-infiltrating lymphocytes. Science 233, 1318-1321 (1986).
122.
Figlin, R.A. et al. Treatment of metastatic renal cell carcinoma with nephrectomy, interleukin-2 and
cytokine-primed or CD8(+) selected tumor infiltrating lymphocytes from primary tumor. J Urol 158,
740-745 (1997).
123.
Dreno, B. et al. Randomized trial of adoptive transfer of melanoma tumor-infiltrating lymphocytes as
adjuvant therapy for stage III melanoma. Cancer Immunol Immunother 51, 539-546 (2002).
124.
Rosenberg, S.A. et al. Prospective randomized trial of high-dose interleukin-2 alone or in conjunction
with lymphokine-activated killer cells for the treatment of patients with advanced cancer. J Natl Cancer
Inst 85, 622-632 (1993).
125.
Law, T.M. et al. Phase III randomized trial of interleukin-2 with or without lymphokine-activated killer
cells in the treatment of patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer 76, 824-832 (1995).
126.
Kohler, G. & Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined
specificity. Nature 256, 495-497 (1975).
127.
Carter, P.J. Potent antibody therapeutics by design. Nat Rev Immunol 6, 343-357 (2006).
128.
Stewart, M., Malkovska, V., Krishnan, J., Lessin, L. & Barth, W. Lymphoma in a patient with
rheumatoid arthritis receiving methotrexate treatment: successful treatment with rituximab. Ann Rheum
Dis 60, 892-893 (2001).
129.
Manches, O. et al. In vitro mechanisms of action of rituximab on primary non-Hodgkin lymphomas.
Blood 101, 949-954 (2003).
130.
van der Kolk, L.E., de Haas, M., Grillo-Lopez, A.J., Baars, J.W. & van Oers, M.H. Analysis of CD20dependent cellular cytotoxicity by G-CSF-stimulated neutrophils. Leukemia 16, 693-699 (2002).
125
131.
Cartron, G. et al. Therapeutic activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism
in IgG Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99, 754-758 (2002).
132.
Clynes, R.A., Towers, T.L., Presta, L.G. & Ravetch, J.V. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo
cytoxicity against tumor targets. Nat Med 6, 443-446 (2000).
133.
Kennedy, A.D. et al. An anti-C3b(i) mAb enhances complement activation, C3b(i) deposition, and
killing of CD20+ cells by rituximab. Blood 101, 1071-1079 (2003).
134.
Pedersen, I.M., Buhl, A.M., Klausen, P., Geisler, C.H. & Jurlander, J. The chimeric anti-CD20 antibody
rituximab induces apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia cells through a p38 mitogen
activated protein-kinase-dependent mechanism. Blood 99, 1314-1319 (2002).
135.
Byrd, J.C. et al. The mechanism of tumor cell clearance by rituximab in vivo in patients with B-cell
chronic lymphocytic leukemia: evidence of caspase activation and apoptosis induction. Blood 99, 10381043 (2002).
136.
Bezombes, C. et al. Rituximab antiproliferative effect in B-lymphoma cells is associated with acidsphingomyelinase activation in raft microdomains. Blood 104, 1166-1173 (2004).
137.
Bannerji, R. et al. Apoptotic-regulatory and complement-protecting protein expression in chronic
lymphocytic leukemia: relationship to in vivo rituximab resistance. J Clin Oncol 21, 1466-1471 (2003).
138.
Harjunpaa, A., Junnikkala, S. & Meri, S. Rituximab (anti-CD20) therapy of B-cell lymphomas: direct
complement killing is superior to cellular effector mechanisms. Scand J Immunol 51, 634-641 (2000).
139.
Bellosillo, B. et al. Complement-mediated cell death induced by rituximab in B-cell
lymphoproliferative disorders is mediated in vitro by a caspase-independent mechanism involving the
generation of reactive oxygen species. Blood 98, 2771-2777 (2001).
140.
Treon, S.P. et al. Tumor Cell Expression of CD59 Is Associated With Resistance to CD20 Serotherapy
in Patients With B-Cell Malignancies. J Immunother 24, 263-271 (2001).
141.
Idusogie, E.E. et al. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human
IgG1 Fc. J Immunol 164, 4178-4184 (2000).
142.
Idusogie, E.E. et al. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol
166, 2571-2575 (2001).
143.
Cartron, G., Watier, H., Golay, J. & Solal-Celigny, P. From the bench to the bedside: ways to improve
rituximab efficacy. Blood 104, 2635-2642 (2004).
144.
Koene, H.R. et al. Fc gammaRIIIa-158V/F polymorphism influences the binding of IgG by natural
killer cell Fc gammaRIIIa, independently of the Fc gammaRIIIa-48L/R/H phenotype. Blood 90, 11091114 (1997).
145.
Weng, W.K. & Levy, R. Two immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms independently
predict response to rituximab in patients with follicular lymphoma. J Clin Oncol 21, 3940-3947 (2003).
146.
Shields, R.L. et al. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc
gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc
gamma R. J Biol Chem 276, 6591-6604 (2001).
147.
Wright, A. & Morrison, S.L. Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic
engineering. Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997).
148.
Umana, P., Jean-Mairet, J., Moudry, R., Amstutz, H. & Bailey, J.E. Engineered glycoforms of an
antineuroblastoma IgG1 with optimized antibody-dependent cellular cytotoxic activity. Nat Biotechnol
17, 176-180 (1999).
126
149.
Shinkawa, T. et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting Nacetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing
antibody-dependent cellular cytotoxicity. J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003).
150.
Davis, S.J. & van der Merwe, P.A. The immunological synapse: required for T cell receptor signalling
or directing T cell effector function? Curr Biol 11, R289-291 (2001).
151.
Wong, W.M. Drug update: trastuzumab: anti-HER2 antibody for treatment of metastatic breast cancer.
Cancer Pract 7, 48-50 (1999).
152.
Coe, J.E. & Feldman, J.D. Extracutaneous delayed hypersensitivity, particularly in the guinea-pig
bladder. Immunology 10, 127-136 (1966).
153.
Mathe, G., Pouillart, P. & Lapeyraque, F. Active immunotherapy of L1210 leukaemia applied after the
graft of tumour cells. Br J Cancer 23, 814-824 (1969).
154.
Zbar, B. & Rapp, H.J. Immunotherapy of guinea pig cancer with BCG. Cancer 34, suppl:1532-1540
(1974).
155.
Bloomberg, S.D., Brosman, S.A., Hausman, M.S., Cohen, A. & Battenberg, J.D. The effects of BCG on
the dog bladder. Invest Urol 12, 423-427 (1975).
156.
deKernion, J.B., Golub, S.H., Gupta, R.K., Silverstein, M. & Morton, D.L. Successful transurethral
intralesional BCG therapy of a bladder melanoma. Cancer 36, 1662-1667 (1975).
157.
Morales, A., Eidinger, D. & Bruce, A.W. Intracavitary Bacillus Calmette-Guerin in the treatment of
superficial bladder tumors. J Urol 116, 180-183 (1976).
158.
Meyer, J.P., Persad, R. & Gillatt, D.A. Use of bacille Calmette-Guerin in superficial bladder cancer.
Postgrad Med J 78, 449-454 (2002).
159.
Brandau, S. & Suttmann, H. Thirty years of BCG immunotherapy for non-muscle invasive bladder
cancer: A success story with room for improvement. Biomed Pharmacother (2007).
160.
Fleischmann, C.M., Wu, T.Y. & Fleischmann, W.R., Jr. B16 melanoma cells exposed in vitro to longterm IFN-alpha treatment (B16 alpha cells) as activators of tumor immunity in mice. J Interferon
Cytokine Res 17, 37-43 (1997).
161.
Abrams, D.I. & Volberding, P.A. Alpha interferon therapy of AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Semin
Oncol 13, 43-47 (1986).
162.
Solal-Celigny, P. et al. Recombinant interferon alfa-2b combined with a regimen containing
doxorubicin in patients with advanced follicular lymphoma. Groupe d'Etude des Lymphomes de
l'Adulte. N Engl J Med 329, 1608-1614 (1993).
163.
Akira, S., Takeda, K. & Kaisho, T. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired
immunity. Nat Immunol 2, 675-680 (2001).
164.
Krieg, A.M. Development of TLR9 agonists for cancer therapy. J Clin Invest 117, 1184-1194 (2007).
165.
Blum, A. et al. Mechanisms of TRAIL-induced apoptosis in leukemic plasmacytoid dendritic cells. Exp
Hematol 34, 1655-1662 (2006).
166.
Krieg, A.M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat Rev Drug Discov 5, 471-484
(2006).
167.
Speiser, D.E. et al. Rapid and strong human CD8+ T cell responses to vaccination with peptide, IFA,
and CpG oligodeoxynucleotide 7909. J Clin Invest 115, 739-746 (2005).
127
168.
Appay, V. et al. New generation vaccine induces effective melanoma-specific CD8+ T cells in the
circulation but not in the tumor site. J Immunol 177, 1670-1678 (2006).
169.
Moseman, E.A. et al. Human plasmacytoid dendritic cells activated by CpG oligodeoxynucleotides
induce the generation of CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 173, 4433-4442 (2004).
170.
Berd, D., Maguire, H.C., Jr., McCue, P. & Mastrangelo, M.J. Treatment of metastatic melanoma with
an autologous tumor-cell vaccine: clinical and immunologic results in 64 patients. J Clin Oncol 8, 18581867 (1990).
171.
Biragyn, A. & Kwak, L.W. Designer cancer vaccines are still in fashion. Nat Med 6, 966-968 (2000).
172.
Liau, L.M. et al. Treatment of intracranial gliomas with bone marrow-derived dendritic cells pulsed
with tumor antigens. J Neurosurg 90, 1115-1124 (1999).
173.
Zitvogel, L. et al. Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on
T cells, B7 costimulation, and T helper cell 1-associated cytokines. The Journal of experimental
medicine 183, 87-97 (1996).
174.
Lespagnard, L. et al. Dendritic cells fused with mastocytoma cells elicit therapeutic antitumor
immunity. Int J Cancer 76, 250-258 (1998).
175.
Wang, J., Saffold, S., Cao, X., Krauss, J. & Chen, W. Eliciting T cell immunity against poorly
immunogenic tumors by immunization with dendritic cell-tumor fusion vaccines. J Immunol 161, 55165524 (1998).
176.
Murphy, G., Tjoa, B., Ragde, H., Kenny, G. & Boynton, A. Phase I clinical trial: T-cell therapy for
prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from
prostate-specific membrane antigen. Prostate 29, 371-380 (1996).
177.
Lau, R. et al. Phase I trial of intravenous peptide-pulsed dendritic cells in patients with metastatic
melanoma. J Immunother (1997) 24, 66-78 (2001).
178.
Davis, I.D., Jefford, M., Parente, P. & Cebon, J. Rational approaches to human cancer immunotherapy.
J Leukoc Biol 73, 3-29 (2003).
179.
Kugler, A. et al. Regression of human metastatic renal cell carcinoma after vaccination with tumor celldendritic cell hybrids. Nat Med 6, 332-336 (2000).
180.
Bank, I. et al. A functional T3 molecule associated with a novel heterodimer on the surface of immature
human thymocytes. Nature 322, 179-181 (1986).
181.
Brenner, M.B. et al. Identification of a putative second T-cell receptor. Nature 322, 145-149 (1986).
182.
Moingeon, P. et al. A unique T-cell receptor complex expressed on human fetal lymphocytes displaying
natural-killer-like activity. Nature 323, 638-640 (1986).
183.
Weiss, A., Newton, M. & Crommie, D. Expression of T3 in association with a molecule distinct from
the T-cell antigen receptor heterodimer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 83, 6998-7002 (1986).
184.
Balbi, B. et al. T-lymphocytes with gamma delta+ V delta 2+ antigen receptors are present in increased
proportions in a fraction of patients with tuberculosis or with sarcoidosis. Am Rev Respir Dis 148, 16851690 (1993).
185.
Ito, M. et al. Increased proportions of peripheral blood gamma delta T cells in patients with pulmonary
tuberculosis. Chest 102, 195-197 (1992).
128
186.
Raziuddin, S., Mir, N.A., el-Awad, M.e.-H., Telmesani, A.W. & al-Janadi, M. Gamma delta T
lymphocytes and proinflammatory cytokines in bacterial meningitis. J Allergy Clin Immunol 93, 793798 (1994).
187.
Sumida, T. et al. Predominant expansion of V gamma 9/V delta 2 T cells in a tularemia patient. Infect
Immun 60, 2554-2558 (1992).
188.
Poquet, Y. et al. Expansion of Vgamma9 Vdelta2 T cells is triggered by Francisella tularensis-derived
phosphoantigens in tularemia but not after tularemia vaccination. Infect Immun 66, 2107-2114 (1998).
189.
Kroca, M., Tarnvik, A. & Sjostedt, A. The proportion of circulating gammadelta T cells increases after
the first week of onset of tularaemia and remains elevated for more than a year. Clin Exp Immunol 120,
280-284 (2000).
190.
Ho, M., Webster, H.K., Tongtawe, P., Pattanapanyasat, K. & Weidanz, W.P. Increased gamma delta T
cells in acute Plasmodium falciparum malaria. Immunol Lett 25, 139-141 (1990).
191.
Scalise, F. et al. Lymphocytes bearing the gamma delta T-cell receptor in acute toxoplasmosis.
Immunology 76, 668-670 (1992).
192.
Raziuddin, S., Telmasani, A.W., el-Hag el-Awad, M., al-Amari, O. & al-Janadi, M. Gamma delta T
cells and the immune response in visceral leishmaniasis. Eur J Immunol 22, 1143-1148 (1992).
193.
Russo, D.M. et al. Antigen-reactive gamma delta T cells in human leishmaniasis. J Immunol 151, 37123718 (1993).
194.
Modlin, R.L. et al. Lymphocytes bearing antigen-specific gamma delta T-cell receptors accumulate in
human infectious disease lesions. Nature 339, 544-548 (1989).
195.
Morita, C.T. et al. Direct presentation of nonpeptide prenyl pyrophosphate antigens to human gamma
delta T cells. Immunity 3, 495-507 (1995).
196.
Constant, P. et al. Stimulation of human gamma delta T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands.
Science 264, 267-270 (1994).
197.
Brigl, M. & Brenner, M.B. CD1: antigen presentation and T cell function. Annu Rev Immunol 22, 817890 (2004).
198.
Lang, F. et al. Early activation of human V gamma 9V delta 2 T cell broad cytotoxicity and TNF
production by nonpeptidic mycobacterial ligands. J Immunol 154, 5986-5994 (1995).
199.
Tanaka, Y. et al. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human gamma delta T cells.
Nature 375, 155-158 (1995).
200.
Spada, F.M. et al. Self-recognition of CD1 by gamma/delta T cells: implications for innate immunity.
The Journal of experimental medicine 191, 937-948 (2000).
201.
Shen, Y. et al. Adaptive immune response of Vgamma2Vdelta2+ T cells during mycobacterial
infections. Science 295, 2255-2258 (2002).
202.
Wilhelm, M. et al. Gammadelta T cells for immune therapy of patients with lymphoid malignancies.
Blood 102, 200-206 (2003).
203.
Prinz, I. et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus.
Nat Immunol 7, 995-1003 (2006).
204.
Hayday, A.C. & Pennington, D.J. Key factors in the organized chaos of early T cell development. Nat
Immunol 8, 137-144 (2007).
129
205.
Washburn, T. et al. Notch activity influences the alphabeta versus gammadelta T cell lineage decision.
Cell 88, 833-843 (1997).
206.
Nunez-Cruz, S. et al. LAT regulates gammadelta T cell homeostasis and differentiation. Nat Immunol 4,
999-1008 (2003).
207.
Carding, S.R. & Egan, P.J. Gammadelta T cells: functional plasticity and heterogeneity. Nat Rev
Immunol 2, 336-345 (2002).
208.
McVay, L.D. & Carding, S.R. Extrathymic origin of human gamma delta T cells during fetal
development. J Immunol 157, 2873-2882 (1996).
209.
Parker, C.M. et al. Evidence for extrathymic changes in the T cell receptor gamma/delta repertoire. The
Journal of experimental medicine 171, 1597-1612 (1990).
210.
Porcelli, S., Brenner, M.B. & Band, H. Biology of the human gamma delta T-cell receptor. Immunol
Rev 120, 137-183 (1991).
211.
Arden, B., Clark, S.P., Kabelitz, D. & Mak, T.W. Mouse T-cell receptor variable gene segment
families. Immunogenetics 42, 501-530 (1995).
212.
Krangel, M.S., Yssel, H., Brocklehurst, C. & Spits, H. A distinct wave of human T cell receptor
gamma/delta lymphocytes in the early fetal thymus: evidence for controlled gene rearrangement and
cytokine production. The Journal of experimental medicine 172, 847-859 (1990).
213.
Allison, T.J., Winter, C.C., Fournie, J.J., Bonneville, M. & Garboczi, D.N. Structure of a human
gammadelta T-cell antigen receptor. Nature 411, 820-824 (2001).
214.
Dieli, F. et al. Differentiation of effector/memory Vdelta2 T cells and migratory routes in lymph nodes
or inflammatory sites. The Journal of experimental medicine 198, 391-397 (2003).
215.
Caccamo, N. et al. CXCR5 identifies a subset of Vgamma9Vdelta2 T cells which secrete IL-4 and IL10 and help B cells for antibody production. J Immunol 177, 5290-5295 (2006).
216.
Gioia, C. et al. Lack of CD27-CD45RA-V gamma 9V delta 2+ T cell effectors in immunocompromised
hosts and during active pulmonary tuberculosis. J Immunol 168, 1484-1489 (2002).
217.
Angelini, D.F. et al. FcgammaRIII discriminates between 2 subsets of Vgamma9Vdelta2 effector cells
with different responses and activation pathways. Blood 104, 1801-1807 (2004).
218.
Caccamo, N. et al. Differential requirements for antigen or homeostatic cytokines for proliferation and
differentiation of human Vgamma9Vdelta2 naive, memory and effector T cell subsets. Eur J Immunol
35, 1764-1772 (2005).
219.
Cendron, D. et al. A tuberculosis vaccine based on phosphoantigens and fusion proteins induces distinct
gammadelta and alphabeta T cell responses in primates. Eur J Immunol 37, 549-565 (2007).
220.
Geginat, J., Lanzavecchia, A. & Sallusto, F. Proliferation and differentiation potential of human CD8+
memory T-cell subsets in response to antigen or homeostatic cytokines. Blood 101, 4260-4266 (2003).
221.
Fisch, P. et al. Recognition by human V gamma 9/V delta 2 T cells of a GroEL homolog on Daudi
Burkitt's lymphoma cells. Science 250, 1269-1273 (1990).
222.
Constant, P. et al. The antituberculous Mycobacterium bovis BCG vaccine is an attenuated
mycobacterial producer of phosphorylated nonpeptidic antigens for human gamma delta T cells. Infect
Immun 63, 4628-4633 (1995).
223.
Belmant, C. et al. 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate A novel mycobacterial metabolite-activating human
gammadelta T cells. J Biol Chem 274, 32079-32084 (1999).
130
224.
Hintz, M. et al. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator
for human gammadelta T cells in Escherichia coli. FEBS Lett 509, 317-322 (2001).
225.
Gober, H.J. et al. Human T cell receptor gammadelta cells recognize endogenous mevalonate
metabolites in tumor cells. The Journal of experimental medicine 197, 163-168 (2003).
226.
Espinosa, E. et al. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent
stimulator of human gamma delta T cells. J Biol Chem 276, 18337-18344 (2001).
227.
Belmant, C., Decise, D. & Fournie, J.J. Phosphoantigens and aminobisphosphonates: New leads
targeting gamma delta T lymphocytes for cancer immunotherapy. Drug DiscoveryToday: Therapeutic
Strategies 3, 17-23 (2006).
228.
Sicard, H. & Fournie, J.J. Metabolic routes as targets for immunological discrimination of host and
parasite. Infect Immun 68, 4375-4377 (2000).
229.
Davodeau, F. et al. Peripheral selection of antigen receptor junctional features in a major human gamma
delta subset. Eur J Immunol 23, 804-808 (1993).
230.
Bukowski, J.F. et al. V gamma 2V delta 2 TCR-dependent recognition of non-peptide antigens and
Daudi cells analyzed by TCR gene transfer. J Immunol 154, 998-1006 (1995).
231.
Miyagawa, F. et al. Essential contribution of germline-encoded lysine residues in Jgamma1.2 segment
to the recognition of nonpeptide antigens by human gammadelta T cells. J Immunol 167, 6773-6779
(2001).
232.
Gossman, W. & Oldfield, E. Quantitative structure--activity relations for gammadelta T cell activation
by phosphoantigens. J Med Chem 45, 4868-4874 (2002).
233.
Kaur, I. et al. Human peripheral gamma delta T cells recognize hsp60 molecules on Daudi Burkitt's
lymphoma cells. J Immunol 150, 2046-2055 (1993).
234.
Wei, Y. et al. Induction of autologous tumor killing by heat treatment of fresh human tumor cells:
involvement of gamma delta T cells and heat shock protein 70. Cancer Res 56, 1104-1110 (1996).
235.
Kabelitz, D., Bender, A., Schondelmaier, S., Schoel, B. & Kaufmann, S.H. A large fraction of human
peripheral blood gamma/delta + T cells is activated by Mycobacterium tuberculosis but not by its 65-kD
heat shock protein. The Journal of experimental medicine 171, 667-679 (1990).
236.
Champagne, E., Martinez, L.O., Vantourout, P., Collet, X. & Barbaras, R. Role of apolipoproteins in
gammadelta and NKT cell-mediated innate immunity. Immunol Res 33, 241-255 (2005).
237.
Miyagawa, F., Tanaka, Y., Yamashita, S. & Minato, N. Essential requirement of antigen presentation
by monocyte lineage cells for the activation of primary human gamma delta T cells by
aminobisphosphonate antigen. J Immunol 166, 5508-5514 (2001).
238.
Uchida, R. et al. Gamma delta T cells kill myeloma cells by sensing mevalonate metabolites and
ICAM-1 molecules on cell surface. Biochem Biophys Res Commun 354, 613-618 (2007).
239.
Poggi, A. et al. IL-12-mediated NKRP1A up-regulation and consequent enhancement of endothelial
transmigration of V delta 2+ TCR gamma delta+ T lymphocytes from healthy donors and multiple
sclerosis patients. J Immunol 162, 4349-4354 (1999).
240.
Poggi, A., Costa, P., Zocchi, M.R. & Moretta, L. Phenotypic and functional analysis of CD4+
NKRP1A+ human T lymphocytes. Direct evidence that the NKRP1A molecule is involved in
transendothelial migration. Eur J Immunol 27, 2345-2350 (1997).
241.
Poggi, A., Costa, P., Zocchi, M.R. & Moretta, L. NKRP1A molecule is involved in transendothelial
migration of CD4+ human T lymphocytes. Immunol Lett 57, 121-123 (1997).
131
242.
Dagna, L. et al. Skewing of cytotoxic activity and chemokine production, but not of chemokine receptor
expression, in human type-1/-2 gamma delta T lymphocytes. Eur J Immunol 32, 2934-2943 (2002).
243.
Glatzel, A. et al. Patterns of chemokine receptor expression on peripheral blood gamma delta T
lymphocytes: strong expression of CCR5 is a selective feature of V delta 2/V gamma 9 gamma delta T
cells. J Immunol 168, 4920-4929 (2002).
244.
Favier, B., Burroughs, N.J., Wedderburn, L. & Valitutti, S. TCR dynamics on the surface of living T
cells. Int Immunol 13, 1525-1532 (2001).
245.
Zaru, R., Cameron, T.O., Stern, L.J., Muller, S. & Valitutti, S. Cutting edge: TCR engagement and
triggering in the absence of large-scale molecular segregation at the T cell-APC contact site. J Immunol
168, 4287-4291 (2002).
246.
Faroudi, M., Zaru, R., Paulet, P., Muller, S. & Valitutti, S. Cutting edge: T lymphocyte activation by
repeated immunological synapse formation and intermittent signaling. J Immunol 171, 1128-1132
(2003).
247.
Krummel, M.F., Sjaastad, M.D., Wulfing, C. & Davis, M.M. Differential clustering of CD4 and
CD3zeta during T cell recognition. Science 289, 1349-1352 (2000).
248.
Holdorf, A.D., Lee, K.H., Burack, W.R., Allen, P.M. & Shaw, A.S. Regulation of Lck activity by CD4
and CD28 in the immunological synapse. Nat Immunol 3, 259-264 (2002).
249.
Ehrlich, L.I., Ebert, P.J., Krummel, M.F., Weiss, A. & Davis, M.M. Dynamics of p56lck translocation
to the T cell immunological synapse following agonist and antagonist stimulation. Immunity 17, 809822 (2002).
250.
Blanchard, N., Di Bartolo, V. & Hivroz, C. In the immune synapse, ZAP-70 controls T cell polarization
and recruitment of signaling proteins but not formation of the synaptic pattern. Immunity 17, 389-399
(2002).
251.
Bromley, S.K. et al. The immunological synapse and CD28-CD80 interactions. Nat Immunol 2, 11591166 (2001).
252.
Monks, C.R., Freiberg, B.A., Kupfer, H., Sciaky, N. & Kupfer, A. Three-dimensional segregation of
supramolecular activation clusters in T cells. Nature 395, 82-86 (1998).
253.
Dustin, M.L. et al. A novel adaptor protein orchestrates receptor patterning and cytoskeletal polarity in
T-cell contacts. Cell 94, 667-677 (1998).
254.
Montoya, M.C., Sancho, D., Vicente-Manzanares, M. & Sanchez-Madrid, F. Cell adhesion and polarity
during immune interactions. Immunol Rev 186, 68-82 (2002).
255.
Delon, J., Kaibuchi, K. & Germain, R.N. Exclusion of CD43 from the immunological synapse is
mediated by phosphorylation-regulated relocation of the cytoskeletal adaptor moesin. Immunity 15,
691-701 (2001).
256.
Allenspach, E.J. et al. ERM-dependent movement of CD43 defines a novel protein complex distal to the
immunological synapse. Immunity 15, 739-750 (2001).
257.
Leupin, O., Zaru, R., Laroche, T., Muller, S. & Valitutti, S. Exclusion of CD45 from the T-cell receptor
signaling area in antigen-stimulated T lymphocytes. Curr Biol 10, 277-280 (2000).
258.
Favier, B. et al. Uncoupling between immunological synapse formation and functional outcome in
human gamma delta T lymphocytes. J Immunol 171, 5027-5033 (2003).
259.
Das, H. et al. MICA engagement by human Vgamma2Vdelta2 T cells enhances their antigen-dependent
effector function. Immunity 15, 83-93 (2001).
132
260.
Lee, K.H. et al. T cell receptor signaling precedes immunological synapse formation. Science 295,
1539-1542 (2002).
261.
Lee, K.H. et al. The immunological synapse balances T cell receptor signaling and degradation. Science
302, 1218-1222 (2003).
262.
Faroudi, M. et al. Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell interaction:
manifestation of a dual activation threshold. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 100, 14145-14150 (2003).
263.
Depoil, D. et al. Immunological synapses are versatile structures enabling selective T cell polarization.
Immunity 22, 185-194 (2005).
264.
Huang, J.F. et al. TCR-Mediated internalization of peptide-MHC complexes acquired by T cells.
Science 286, 952-954 (1999).
265.
Hudrisier, D., Riond, J., Mazarguil, H., Gairin, J.E. & Joly, E. Cutting edge: CTLs rapidly capture
membrane fragments from target cells in a TCR signaling-dependent manner. J Immunol 166, 36453649 (2001).
266.
Hudrisier, D. & Bongrand, P. Intercellular transfer of antigen-presenting cell determinants onto T cells:
molecular mechanisms and biological significance. Faseb J 16, 477-486 (2002).
267.
Joly, E. & Hudrisier, D. What is trogocytosis and what is its purpose? Nat Immunol 4, 815 (2003).
268.
Batista, F.D., Iber, D. & Neuberger, M.S. B cells acquire antigen from target cells after synapse
formation. Nature 411, 489-494 (2001).
269.
Hwang, I. & Sprent, J. Role of the actin cytoskeleton in T cell absorption and internalization of ligands
from APC. J Immunol 166, 5099-5107 (2001).
270.
Davis, D.M. et al. The protean immune cell synapse: a supramolecular structure with many functions.
Semin Immunol 15, 317-324 (2003).
271.
Poupot, M., Gertner, J. & Fournié, J.J. in Cell-Cell channels, Vol. 1. (eds. F. Baluška, D. Volkmann &
P.W. Barlow) in press (Landes
Bioscience, 2006).
272.
Espinosa, E., Tabiasco, J., Hudrisier, D. & Fournie, J.J. Synaptic transfer by human gamma delta T cells
stimulated with soluble or cellular antigens. J Immunol 168, 6336-6343 (2002).
273.
Carlin, L.M., Eleme, K., McCann, F.E. & Davis, D.M. Intercellular transfer and supramolecular
organization of human leukocyte antigen C at inhibitory natural killer cell immune synapses. The
Journal of experimental medicine 194, 1507-1517 (2001).
274.
Tabiasco, J. et al. Active trans-synaptic capture of membrane fragments by natural killer cells. Eur J
Immunol 32, 1502-1508 (2002).
275.
Wetzel, S.A., McKeithan, T.W. & Parker, D.C. Peptide-specific intercellular transfer of MHC class II
to CD4+ T cells directly from the immunological synapse upon cellular dissociation. J Immunol 174,
80-89 (2005).
276.
Arnold, P.Y. & Mannie, M.D. Vesicles bearing MHC class II molecules mediate transfer of antigen
from antigen-presenting cells to CD4+ T cells. Eur J Immunol 29, 1363-1373 (1999).
277.
Hwang, I. et al. T cells can use either T cell receptor or CD28 receptors to absorb and internalize cell
surface molecules derived from antigen-presenting cells. The Journal of experimental medicine 191,
1137-1148 (2000).
133
278.
Utsugi-Kobukai, S., Fujimaki, H., Hotta, C., Nakazawa, M. & Minami, M. MHC class I-mediated
exogenous antigen presentation by exosomes secreted from immature and mature bone marrow derived
dendritic cells. Immunol Lett 89, 125-131 (2003).
279.
Vanherberghen, B. et al. Human and murine inhibitory natural killer cell receptors transfer from natural
killer cells to target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 101, 16873-16878 (2004).
280.
Stinchcombe, J.C. & Griffiths, G.M. The role of the secretory immunological synapse in killing by
CD8+ CTL. Semin Immunol 15, 301-305 (2003).
281.
Davis, D.M. Intercellular transfer of cell-surface proteins is common and can affect many stages of an
immune response. Nat Rev Immunol 7, 238-243 (2007).
282.
Russo, V. et al. Acquisition of intact allogeneic human leukocyte antigen molecules by human dendritic
cells. Blood 95, 3473-3477 (2000).
283.
Zhou, J., Tagaya, Y., Tolouei-Semnani, R., Schlom, J. & Sabzevari, H. Physiological relevance of
antigen presentasome (APS), an acquired MHC/costimulatory complex, in the sustained activation of
CD4+ T cells in the absence of APCs. Blood 105, 3238-3246 (2005).
284.
Game, D.S., Rogers, N.J. & Lechler, R.I. Acquisition of HLA-DR and costimulatory molecules by T
cells from allogeneic antigen presenting cells. Am J Transplant 5, 1614-1625 (2005).
285.
Tsang, J.Y., Chai, J.G. & Lechler, R. Antigen presentation by mouse CD4+ T cells involving acquired
MHC class II:peptide complexes: another mechanism to limit clonal expansion? Blood 101, 2704-2710
(2003).
286.
Kedl, R.M., Schaefer, B.C., Kappler, J.W. & Marrack, P. T cells down-modulate peptide-MHC
complexes on APCs in vivo. Nat Immunol 3, 27-32 (2002).
287.
Patel, D.M., Arnold, P.Y., White, G.A., Nardella, J.P. & Mannie, M.D. Class II MHC/peptide
complexes are released from APC and are acquired by T cell responders during specific antigen
recognition. J Immunol 163, 5201-5210 (1999).
288.
Nolte-'t Hoen, E.N. et al. Uptake of membrane molecules from T cells endows antigen-presenting cells
with novel functional properties. Eur J Immunol 34, 3115-3125 (2004).
289.
Roda-Navarro, P., Vales-Gomez, M., Chisholm, S.E. & Reyburn, H.T. Transfer of NKG2D and MICB
at the cytotoxic NK cell immune synapse correlates with a reduction in NK cell cytotoxic function.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 11258-11263
(2006).
290.
Tabiasco, J. et al. Acquisition of viral receptor by NK cells through immunological synapse. J Immunol
170, 5993-5998 (2003).
291.
Mack, M. et al. Transfer of the chemokine receptor CCR5 between cells by membrane-derived
microparticles: a mechanism for cellular human immunodeficiency virus 1 infection. Nat Med 6, 769775 (2000).
292.
Brezinschek, R.I., Oppenheimer-Marks, N. & Lipsky, P.E. Activated T cells acquire endothelial cell
surface determinants during transendothelial migration. J Immunol 162, 1677-1684 (1999).
293.
Bourbie-Vaudaine, S., Blanchard, N., Hivroz, C. & Romeo, P.H. Dendritic cells can turn CD4+ T
lymphocytes into vascular endothelial growth factor-carrying cells by intercellular neuropilin-1 transfer.
J Immunol 177, 1460-1469 (2006).
294.
Poupot, M. & Fournie, J.J. Spontaneous membrane transfer through homotypic synapses between
lymphoma cells. J Immunol 171, 2517-2523 (2003).
134
295.
Levchenko, A. et al. Intercellular transfer of P-glycoprotein mediates acquired multidrug resistance in
tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102,
1933-1938 (2005).
296.
Ferrick, D.A. et al. Differential production of interferon-gamma and interleukin-4 in response to Th1and Th2-stimulating pathogens by gamma delta T cells in vivo. Nature 373, 255-257 (1995).
297.
Garcia, V.E. et al. Single-cell cytokine analysis of gamma delta T cell responses to nonpeptide
mycobacterial antigens. J Immunol 159, 1328-1335 (1997).
298.
Wesch, D., Glatzel, A. & Kabelitz, D. Differentiation of resting human peripheral blood gamma delta T
cells toward Th1- or Th2-phenotype. Cell Immunol 212, 110-117 (2001).
299.
Gao, Y. et al. Gamma delta T cells provide an early source of interferon gamma in tumor immunity.
The Journal of experimental medicine 198, 433-442 (2003).
300.
Garcia, V.E. et al. IL-15 enhances the response of human gamma delta T cells to nonpeptide [correction
of nonpetide] microbial antigens. J Immunol 160, 4322-4329 (1998).
301.
Malkovska, V., Cigel, F.K., Armstrong, N., Storer, B.E. & Hong, R. Antilymphoma activity of human
gamma delta T-cells in mice with severe combined immune deficiency. Cancer Res 52, 5610-5616
(1992).
302.
Choudhary, A. et al. Selective lysis of autologous tumor cells by recurrent gamma delta tumorinfiltrating lymphocytes from renal carcinoma. J Immunol 154, 3932-3940 (1995).
303.
Viey, E. et al. Phosphostim-activated gamma delta T cells kill autologous metastatic renal cell
carcinoma. J Immunol 174, 1338-1347 (2005).
304.
Kunzmann, V. et al. Stimulation of gammadelta T cells by aminobisphosphonates and induction of
antiplasma cell activity in multiple myeloma. Blood 96, 384-392 (2000).
305.
Sayers, T.J. et al. The restricted expression of granzyme M in human lymphocytes. J Immunol 166,
765-771 (2001).
306.
Li, B. et al. Involvement of the Fas/Fas ligand pathway in activation-induced cell death of
mycobacteria-reactive human gamma delta T cells: a mechanism for the loss of gamma delta T cells in
patients with pulmonary tuberculosis. J Immunol 161, 1558-1567 (1998).
307.
Halary, F. et al. Control of self-reactive cytotoxic T lymphocytes expressing gamma delta T cell
receptors by natural killer inhibitory receptors. Eur J Immunol 27, 2812-2821 (1997).
308.
Poccia, F. et al. CD94/NKG2 inhibitory receptor complex modulates both anti-viral and anti-tumoral
responses of polyclonal phosphoantigen-reactive V gamma 9V delta 2 T lymphocytes. J Immunol 159,
6009-6017 (1997).
309.
Poccia, F. et al. Gammadelta T cell activation or anergy during infections: the role of nonpeptidic TCR
ligands and HLA class I molecules. J Leukoc Biol 62, 287-291 (1997).
310.
Fisch, P. et al. Control of B cell lymphoma recognition via natural killer inhibitory receptors implies a
role for human Vgamma9/Vdelta2 T cells in tumor immunity. Eur J Immunol 27, 3368-3379 (1997).
311.
Ensslin, A.S. & Formby, B. Comparison of cytolytic and proliferative activities of human gamma delta
and alpha beta T cells from peripheral blood against various human tumor cell lines. J Natl Cancer Inst
83, 1564-1569 (1991).
312.
Boismenu, R. & Havran, W.L. Gammadelta T cells in host defense and epithelial cell biology. Clin
Immunol Immunopathol 86, 121-133 (1998).
135
313.
Bank, I. et al. V delta 2+ gamma delta T lymphocytes are cytotoxic to the MCF 7 breast carcinoma cell
line and can be detected among the T cells that infiltrate breast tumors. Clin Immunol Immunopathol 67,
17-24 (1993).
314.
Schilbach, K.E., Geiselhart, A., Wessels, J.T., Niethammer, D. & Handgretinger, R. Human
gammadelta T lymphocytes exert natural and IL-2-induced cytotoxicity to neuroblastoma cells. J
Immunother (1997) 23, 536-548 (2000).
315.
Corvaisier, M. et al. V gamma 9V delta 2 T cell response to colon carcinoma cells. J Immunol 175,
5481-5488 (2005).
316.
Liu, Z., Guo, B.L., Gehrs, B.C., Nan, L. & Lopez, R.D. Ex vivo expanded human Vgamma9Vdelta2+
gammadelta-T cells mediate innate antitumor activity against human prostate cancer cells in vitro. J
Urol 173, 1552-1556 (2005).
317.
Duval, M. et al. Potential antileukemic effect of gamma delta T cells in acute lymphoblastic leukemia.
Leukemia 9, 863-868 (1995).
318.
Zocchi, M.R., Ferrarini, M. & Rugarli, C. Selective lysis of the autologous tumor by delta TCS1+
gamma/delta+ tumor-infiltrating lymphocytes from human lung carcinomas. Eur J Immunol 20, 26852689 (1990).
319.
Kowalczyk, D., Skorupski, W., Kwias, Z. & Nowak, J. Activated gamma/delta T lymphocytes
infiltrating renal cell carcinoma. Immunol Lett 53, 15-18 (1996).
320.
Paolieri, F. et al. Infiltrating gamma/delta T-cell receptor-positive lymphocytes in Hashimoto's
thyroiditis, Graves' disease and papillary thyroid cancer. J Endocrinol Invest 18, 295-298 (1995).
321.
Raspollini, M.R. et al. Tumour-infiltrating gamma/delta T-lymphocytes are correlated with a brief
disease-free interval in advanced ovarian serous carcinoma. Ann Oncol 16, 590-596 (2005).
322.
Kuriyama, Y., Kawanishi, Y., Otawa, M., Utsumi, K. & Ohyashiki, K. Circulating and tumorinfiltrating gamma delta T Cells in patients with B-cell lymphomas. Leuk Lymphoma 39, 321-327
(2000).
323.
Conti, L. et al. Reciprocal activating interaction between dendritic cells and pamidronate-stimulated
gammadelta T cells: role of CD86 and inflammatory cytokines. J Immunol 174, 252-260 (2005).
324.
Collins, C. et al. Lyme arthritis synovial gammadelta T cells instruct dendritic cells via fas ligand. J
Immunol 175, 5656-5665 (2005).
325.
Yamashita, S. et al. Analysis of mechanism for human gammadelta T cell recognition of nonpeptide
antigens. Biochem Biophys Res Commun 334, 349-360 (2005).
326.
Brandes, M., Willimann, K. & Moser, B. Professional antigen-presentation function by human
gammadelta T Cells. Science 309, 264-268 (2005).
327.
Girardi, M. et al. Regulation of cutaneous malignancy by gammadelta T cells. Science 294, 605-609
(2001).
328.
Kabelitz, D., Wesch, D., Pitters, E. & Zoller, M. Characterization of tumor reactivity of human V
gamma 9V delta 2 gamma delta T cells in vitro and in SCID mice in vivo. J Immunol 173, 6767-6776
(2004).
329.
Barakonyi, A. et al. Recognition of nonclassical HLA class I antigens by gamma delta T cells during
pregnancy. J Immunol 168, 2683-2688 (2002).
330.
Qi, J. et al. [Cytotoxicity of MICA-reactive V delta 1 gamma delta T cells towards epithelial tumor
cells]. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao 26, 1-7 (2004).
136
331.
Groh, V., Wu, J., Yee, C. & Spies, T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of
NKG2D and T-cell activation. Nature 419, 734-738 (2002).
332.
Argentati, K. et al. Reduced number and impaired function of circulating gamma delta T cells in
patients with cutaneous primary melanoma. J Invest Dermatol 120, 829-834 (2003).
333.
Li, X., Zhang, X. & Zhang, Y. [Establishment of a novel culture system for specific expansion of
human gamma delta T cell and study of its biological properties]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi 77, 111-114
(1997).
334.
Zheng, B.J. et al. Peripheral gamma delta T-cell deficit in nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer 99,
213-217 (2002).
335.
Thompson, K. & Rogers, M.J. Statins prevent bisphosphonate-induced gamma,delta-T-cell proliferation
and activation in vitro. J Bone Miner Res 19, 278-288 (2004).
336.
Sicard, H. et al. In vivo immunomanipulation of V gamma 9V delta 2 T cells with a synthetic
phosphoantigen in a preclinical nonhuman primate model. J Immunol 175, 5471-5480 (2005).
337.
Dieli, F. et al. Induction of gammadelta T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic
acid in cancer patients in vivo. Blood 102, 2310-2311 (2003).
338.
Dieli, F. et al. Targeting human {gamma}delta} T cells with zoledronate and interleukin-2 for
immunotherapy of hormone-refractory prostate cancer. Cancer Res 67, 7450-7457 (2007).
339.
Galluzzo, S. et al. Immunomodulating role of bisphosphonates on human gamma delta T cells: an
intriguing and promising aspect of their antitumour activity. Expert Opin Ther Targets 11, 941-954
(2007).
340.
Casetti, R. et al. Drug-induced expansion and differentiation of V gamma 9V delta 2 T cells in vivo: the
role of exogenous IL-2. J Immunol 175, 1593-1598 (2005).
341.
Meresse, B. et al. Coordinated induction by IL15 of a TCR-independent NKG2D signaling pathway
converts CTL into lymphokine-activated killer cells in celiac disease. Immunity 21, 357-366 (2004).
342.
Kabelitz, D., Wesch, D., Pitters, E. & Zoller, M. Potential of human gammadelta T lymphocytes for
immunotherapy of cancer. Int J Cancer 112, 727-732 (2004).
343.
Wang, X. et al. [The ex vivo expansion of gamma delta T cells from the peripheral blood of patients
with nasopharyngeal carcinoma and their cytotoxicity to nasopharyngeal carcinoma lines in vitro]. Lin
Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi 17, 155-158 (2003).
344.
Lopez, R.D., Xu, S., Guo, B., Negrin, R.S. & Waller, E.K. CD2-mediated IL-12-dependent signals
render human gamma delta-T cells resistant to mitogen-induced apoptosis, permitting the large-scale ex
vivo expansion of functionally distinct lymphocytes: implications for the development of adoptive
immunotherapy strategies. Blood 96, 3827-3837 (2000).
345.
Saito, K. et al. Impaired protection against Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin infection in
IL-15-deficient mice. J Immunol 176, 2496-2504 (2006).
346.
Salot, S. et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell
therapy product. J Immunol Methods 326, 63-75 (2007).
347.
Kobayashi, H. et al. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using gammadelta T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother 56,
469-476 (2007).
348.
Holtl, L. et al. Cellular and humoral immune responses in patients with metastatic renal cell carcinoma
after vaccination with antigen pulsed dendritic cells. J Urol 161, 777-782 (1999).
137
349.
Gong, J. et al. Activation of antitumor cytotoxic T lymphocytes by fusions of human dendritic cells and
breast carcinoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 97, 2715-2718 (2000).
350.
Gong, J. et al. Fusions of human ovarian carcinoma cells with autologous or allogeneic dendritic cells
induce antitumor immunity. J Immunol 165, 1705-1711 (2000).
351.
Ismaili, J., Olislagers, V., Poupot, R., Fournie, J.J. & Goldman, M. Human gamma delta T cells induce
dendritic cell maturation. Clin Immunol 103, 296-302 (2002).
352.
Leslie, D.S. et al. CD1-mediated gamma/delta T cell maturation of dendritic cells. The Journal of
experimental medicine 196, 1575-1584 (2002).
353.
Devilder, M.C. et al. Potentiation of antigen-stimulated V gamma 9V delta 2 T cell cytokine production
by immature dendritic cells (DC) and reciprocal effect on DC maturation. J Immunol 176, 1386-1393
(2006).
354.
Poupot, M., Pont, F. & Fournie, J.J. Profiling blood lymphocyte interactions with cancer cells uncovers
the innate reactivity of human gamma delta T cells to anaplastic large cell lymphoma. J Immunol 174,
1717-1722 (2005).
355.
Pulford, K., Morris, S.W. & Mason, D.Y. Anaplastic lymphoma kinase proteins and malignancy. Curr
Opin Hematol 8, 231-236 (2001).
356.
Fischer, P. et al. A Ki-1 (CD30)-positive human cell line (Karpas 299) established from a high-grade
non-Hodgkin's lymphoma, showing a 2;5 translocation and rearrangement of the T-cell receptor betachain gene. Blood 72, 234-240 (1988).
357.
Lamant, L. et al. Establishment of a novel anaplastic large-cell lymphoma-cell line (COST) from a
'small-cell variant' of ALCL. Leukemia 18, 1693-1698 (2004).
358.
Gaston, R.S. et al. OKT3 first-dose reaction: association with T cell subsets and cytokine release.
Kidney Int 39, 141-148 (1991).
359.
Wing, M.G. et al. Mechanism of first-dose cytokine-release syndrome by CAMPATH 1-H:
involvement of CD16 (FcgammaRIII) and CD11a/CD18 (LFA-1) on NK cells. J Clin Invest 98, 28192826 (1996).
360.
Winkler, U. et al. Cytokine-release syndrome in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and
high lymphocyte counts after treatment with an anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab, IDECC2B8). Blood 94, 2217-2224 (1999).
361.
Gertner, J., Wiedemann, A., Poupot, M. & Fournie, J.J. Human gammadelta T lymphocytes strip and
kill tumor cells simultaneously. Immunol Lett 110, 42-53 (2007).
362.
Isaaz, S., Baetz, K., Olsen, K., Podack, E. & Griffiths, G.M. Serial killing by cytotoxic T lymphocytes:
T cell receptor triggers degranulation, re-filling of the lytic granules and secretion of lytic proteins via a
non-granule pathway. Eur J Immunol 25, 1071-1079 (1995).
363.
Wiedemann, A., Depoil, D., Faroudi, M. & Valitutti, S. Cytotoxic T lymphocytes kill multiple targets
simultaneously via spatiotemporal uncoupling of lytic and stimulatory synapses. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 103, 10985-10990 (2006).
364.
Poccia, F. et al. Peripheral V gamma 9/V delta 2 T cell deletion and anergy to nonpeptidic
mycobacterial antigens in asymptomatic HIV-1-infected persons. J Immunol 157, 449-461 (1996).
365.
Li, B. et al. Disease-specific changes in gammadelta T cell repertoire and function in patients with
pulmonary tuberculosis. J Immunol 157, 4222-4229 (1996).
138
366.
Miller, R.A., Maloney, D.G., Warnke, R. & Levy, R. Treatment of B-cell lymphoma with monoclonal
anti-idiotype antibody. N Engl J Med 306, 517-522 (1982).
139
Julie GERTNER-DARDENNE
Optimisation de l’activité anti-tumorale des lymphocytes T Vγ9Vδ2 humains
Directeur de thèse: Jean Jacques FOURNIE
Toulouse, 13 Février 2008
Si tous les vertébrés possèdent des lymphocytes T γδ, seuls les primates ont une souspopulation sanguine exprimant un récepteur de type TCR Vγ9Vδ2. Cette dernière réagit à des
phosphoantigènes non-peptidiques d’origine bactérienne et tumorale, déclenchant ainsi son
activité anti-infectieuse et anti-cancéreuse. Cette thèse traite de l’optimisation de son potentiel
thérapeutique anti-cancéreux. Ces lymphocytes cytotoxiques capturent des fragments
membranaires de leurs cellules cibles et sécrètent leurs granules cytolytiques, à travers leur
synapse immunologique. L’étude par vidéo-microscopie de l’activité moléculaire à la synapse
des lymphocytes T γδ révèle la simultanéité de ces deux processus. Ainsi, le renforcement de
l’attachement des lymphocytes T γδ à leurs cibles par la combinaison de phosphoantigène et
d’anticorps thérapeutiques permet d’optimiser leur efficacité anti-tumorale.
Cette thèse présente donc les bases moléculaires d’une nouvelle approche
thérapeutique anti-cancéreuse.
Mots-Clefs : Lymphocytes T γδ, Phosphoantigène, Anticorps monoclonaux, Membrane,
Cytotoxicité, ADCC, Vidéo-microscopie, Cancer, Thérapie.
Immunologie
INSERM U563, CPTP, CHU Purpan – BP 3028, 31024 TOULOUSE CEDEX 3
140
Julie GERTNER-DADENNE
Optimisation of human Vγ9Vδ2 T lymphocytes antitumoral activity
Thesis supervisor: Jean Jacques FOURNIE
Toulouse, February 13th 2008
Abstract
Although all vertebrates possess γδ T lymphocytes, only primates have a blood-borne
γδ T cell subset expressing a TCR Vγ9Vδ2 receptor. This population reacts to bacterial and
tumoral non-peptidic phosphoantigens, triggering its anti-infectious and anti-cancer activity.
This thesis deals with the optimization of the therapeutic anti-cancer activity of TCR Vγ9Vδ2
γδ T lymphocytes. These cytotoxic effectors capture membrane fragments of target cells and
release cytolytic granules through their immunological synapse. The timelapse videomicroscopy study of the molecular activity at the γδ T lymphocytes synapse shows both
processes simultaneously. So, the strengthening of the γδ T lymphocytes synapses to their
target through a combination of phosphoantigen and therapeutic antibody strongly optimizes
their anti-tumor efficacy.
This thesis presents the molecular basis for a new anti-cancer therapeutic approach.
Key Words : γδ T Lymphocytes, Phosphoantigen, Trogocytosis, Cytotoxicity, ADCC,
Therapeutic monoclonal antibodies, Video-microscopy.
Immunology
INSERM U563, CPTP, CHU purpan – BP 3028, 31024 TOULOUSE CEDEX 3
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