Fluorimétrie moléculaire

doc from JF Perrin
Fluorimétrie Molécualire
Fluorimétrie moléculaire: définition et description du phénomène, mesures quantitatives,
introduction à l'utilisation de la fluorimétrie quantitative et à l'utilisation de marqueurs
fluorescents en biologie.
Hors sujet, hors programme : la fluorimétrie atomique
1. Le phénomène de fluorescence moléculaire
Les différents états énergétiques possibles des électrons d'une molécule donnée sont discrets,
quantifiés.
Les états électroniques moléculaires sont quantifiés. Les différences d'énergie entre les états
électroniques moléculaires varient de 150 à 600 kJ.mol -1. On rappelle que les orbitales moléculaires
résultent de la combinaison d1 orbitales atomiques d' électrons d'atomes liés dans la molécule
considérée.
A chaque état électronique correspond plusieurs niveaux vibrationnels quantifiés (les différences
d'énergie entre les états vibrationnels varient de 4 à 40 kJ.mol-1).
A chaque état vibrationnel correspond plusieurs niveaux rotationnels quantifiés (les différences d'énergie
entre les états rotationnels sont inférieurs à 0,5 kJ.mol-1).
Lorsqu'une molécule donnée présente la propriété de fluorescence c'est que :
- on a réalisé une excitation photonique UV de la molécule. Lorsqu'une molécule donnée est
excitable à la longueur d'onde UV λ, c'est que λ correspond à une énergie permettant le transfert d'un
électron depuis une orbitale moléculaire à l'état fondamental de plus basse énergie vers une autre
orbitale moléculaire d'énergie plus élevée correspondant à un état dit excité.
- Lors de la désactivation, on assiste dans un premier temps au retour à l'état vibrationnel de
moindre énergie de l'état excité (relaxation, durée type = 10-12s). Puis le retour vers l'état fondamental se
fera sur un niveau vibrationnel quelconque de l'état électronique fondamental de moindre énergie avec
émission d'un photon (durée de vie à l'état excité de l'ordre de 10 -9s). La durée de l'ensemble du
processus est de l'ordre de 10-9 à 10-8s pour une molécule. La longueur d'onde d'émission est toujours
supérieure à la longueur d'onde d'excitation puisque ΔE = hv = hc/λ . Quand ΔE diminue, λ augmente.
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En fluorescence moléculaire on excite dans l'UV et on observe des émissions de longueurs d'ondes plus
élevées dans l'UV proche ou le visible. Elles correspondent à des transitions faisant intervenir des
électrons Π et des électrons n. Les molécules à groupements fluorescents sont souvent des molécules
avec un(des) polycycles conjugués.
Remarque : le phénomène de phosphorescence correspond, lui aussi, à une émission de photons après
une excitation photonique. Cependant, il fait intervenir un changement de spin de l'électron lors de la
phase non radiative (le changement de spin conduit à ce qu'on appelle un état triplet en mécanique
quantique). Tout état triplet excité a une durée de vie très longue de 10 -5s à quelques secondes ou
quelques minutes. Le retour à l'état fondamental (retour à ce qu'on appelle un état singulet pour lequel
les 2 électrons d'une orbitale sont de spin opposés) est émissif. On parle alors de phosphorescence.
Phosphorescence et fluorescence font partie des phénomènes de luminescence.
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2. Le spectrofluorimètre
Le mot fluorimètre devrait être réservé à des appareils à filtres qui ne permettent pas l'étude des
spectres mais sont dédiés à des composés fluorescents donnés.
Dans les fluorimètres et les spectrofluorimètres, l'angle entre le flux d'excitation et le flux d'émission
mesuré est très important à définir. En général, on choisi un angle de 90° (aucune lumière d'excitation
réfléchie ne peut parvenir au photorécepteur). Attention : on utilise des cuves quartz (on travaille dans
l'UV pour l'excitation) à 4 faces polies.
Un microscope à fluorescence se comporte en fait comme un fluorimètre pour lequel l'œil sert de
photorécepteur.
3. Spectres de fluorescence
Toute molécule fluorescente se caractérise par 2 spectres: le spectre d'excitation (efficacité des
différentes longueurs d'ondes à exciter pour conduire finalement à une émission luminescente) et le
spectre d'émission (intensité relative des émissions aux différentes longueurs d'onde). Chacun est un
spectre de bande(s).
3.1. Spectres d'excitation
Par principe, il est en correspondance parfaite avec le spectre d'absorption.
En fait, pour l'obtenir pratiquement avec un spectrofluorimètre, on va placer le monochromateur de
réception sur d'émission de fluorescence à la longueur d'onde de maximum d'intensité de fluorescence
et on va balayer les longueurs d'onde d'excitation avec le monochromateur d'excitation. Comme les
lampes sources n'ont pas une intensité de flux d'excitation constante avec λ, on obtient un spectre
d'excitation apparent pour le fluorimètre utilisé (qui peut donc correspondre à une zone du spectre
d'absorption légèrement déformé).
3.2. Spectres d'émission
Pour l'obtenir, on règle l'excitation à λ, du maximum d'excitation . On enregistre l'intensité d'émission
pour différentes longueurs d'ondes sélectionnées par le monochromateur définissant I de la "lumière"
atteignant le photomultiplicateur (le capteur). En fait, À du maximum d'émission de fluorescence qui va
être obtenu est peu dépendant de la longueur d'onde d'excitation.
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3.3. Représentation conventionnelle
Par convention, on représente souvent les 2 spectres sur un même graphe du type de celui de la figure
7. Il faut bien avoir en tête à quoi correspond vraiment chaque spectre.
4. Remarque concernant le phénomène de transfert de fluorescence
Si 2 chromophores fluorescents qui appartiennent à une même molécule sont suffisamment proches et
que le spectre d'émission d'un des 2 chromophores appelé donneur recouvre le spectre d'excitation de
l'autre chromophore appelé accepteur, on constate que l'émission de fluorescence sera due en fait au
chromophore accepteur. Il y a transfert de fluorescence vers le chromophore accepteur.
5. Rendement quantique de fluorescence (Y) (hors programme)
Y = (nombre de molécules se désactivant d'un état excité vers l'état fondamental en émettant un photon)
/ (nombre de photons absorbés) = (nombre de photons émis) / (nombre de photons absorbés).
0 < Y < 1.
6. Facteurs du milieu modifiant la fluorescence d'une molécule donnée
- nature du solvant : selon sa nature, le spectre d'émission et le rendement quantique seront modifiés.
- pH du milieu : pour des molécules fluorescentes ionisables en solution aqueuse, les variations de pH
entraînent des variations de spectre d'émission et de rendement quantique.
- température et viscosité : en diminuant la température et en augmentant la viscosité, on augmente le
rendement quantique.
- effets d'autres molécules environnantes : par exemple, le dioxygène est connu pour abaisser le
rendement quantique de fluorescence de nombreux fluorochromes. (Désaération des solutions à
analyser).
Il est d'usage d'appeler "Quenching", toute influence qui diminue l'intensité d'émission de fluorescence.
Ainsi de nombreuses natures de solvant peuvent participer au "Quenching".
7. Fluorimétrie et analyse quantitative
Soit des solutions contenant un fluorochrome mesurées dans des conditions de rendement
quantique constant. On mesure à λexc. donnée et λém. donnée.
Soit Φ0 l'intensité du flux photonique d'excitation à λexc..
Soit Φ l'intensité du flux photonique transmis (non absorbé) à λexc.
Soit ε le coefficient d'absorbance moléculaire du fluorochrome étudié à λexc..
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Soit I l'épaisseur de cuve de mesure.
Soit c la concentration en fluorochrome.
On a Φ = Φ0 10-εlc (loi de Béer lambert)
Donc le flux absorbé est Φabs = (Φ0 - Φ) soit Φabs = Φ0 - Φ0 10-εlc
soit Φabs = Φ0 (1 - 10-εlc)
La fluorescence est mesurée à λém. donnée. Le rendement quantique est Y et les photons mesurés sont
ceux de longueur d'onde λém. dont l'énergie est plus faible que celle des photons absorbés et selon un
angle qui fait qu'on ne mesure qu'une fraction f de la fluorescence.
On a donc Φfluorescence mesurée = f Y Φ0 (1 – 10-εlc) avec 0<f<1 et avec 0<Y<1.
Si c est faible, le développement limité au premier ordre donne :
Φfluorescence mesurée = f Y Φ0 ln(10) ε I c qui devient :
Φfluorescence mesurée = K c
avec K coefficient qui sera évalué par étalonnage.
8. Applications de la fluorescence moléculaire en biologie
8.1. Fluorimétrie et dosages quantitatifs de substances (hors anisotropie de fluorescence)
Principe du dosage exposé au paragraphe 7.
De nombreux dosages en biologie peuvent être réalisés en mesurant finalement une intensité de
fluorescence. De tels dosages exigent de travailler dans des milieux de composition strictement
déterminée pour s'assurer que les rendements quantiques ne varient pas.
La sensibilité des dosages par fluorimétrie est de 100 à 1000 fois plus grande que celle des dosages par
absorptiométrie ! Les dosages fluorimétriques impliquent 2 longueurs d'ondes caractéristiques de la
substance à mesurer: une λexc. donnée et λém. donnée. Ceci améliore a priori les capacités de tels
dosages à éviter les interférences par rapport aux dosages absorptiométriques qui sont réalisée à une
longueur d'onde d'absorption donnée.
Des applications exemples en biologie sont :
- fluorimétrie quantitative dans les dosages mettant en œuvre des réactions enzymatiques et faisant
intervenir le couple NAD+/NADH,H+.
Voir à ce sujet les chapitres concernant les dosages mettant en œuvre des réactions enzymatiques et
faisant intervenir le couple NAD+/NADH,H+.
- fluorimétrie quantitative dans les dosages de substances mettant en œuvre des réactions Ag/Ac et des
Ag ou des Ac marqués par des fluorochromes = dosages par immunofluorescence. De tels dosages sont
réalisables en méthodes compétition en phases hétérogène, en méthodes non compétitives en phase
hétérogène ou en méthode compétitive en phase homogène. Il faut voir à ce propos le cours dédié sur
les dosages de substances mettant en œuvre des Ag ou des Ac marqués.
- fluorimétrie quantitative en cytométrie de flux. Voir chapitre dédié. On rappelle simplement qu'une
population de cellules à étudier par cytométrie de flux peut être marquée par des fluorochromes : par
exemple le marquage de l'ADN au BET, le marquage spécifique de telle ou telle cellule par un anticorps
conjugué à un fluorochrome.
Chaque cellule engagée dans le tube de flux passe devant un éclairage laser à une longueur d'onde
adéquate et donne un flash de fluorescence dont l'intensité dépend de la quantité de fluorochrome fixé.
Ceci permet de construire des histogrammes de distribution dans la population des cellules analysées et
de réaliser des tris de cellules.
8.2. Anisotropie de fluorescence (hors programme)
On utilise une "lumière" d'excitation polarisée. On mesure l'émission de fluorescence selon 2 angles de
polarisation (1 parallèle || et 1 perpendiculaire _|_à la polarisation de la "lumière" d'excitation).
L'effet d'anisotropie de fluorescence A est défini par :
(Intensité émission polarisée || ) - (Intensité émission polarisée _|_ )
A = ---------------------------------------------------------------------------------------------(Intensité émission polarisée || ) + 2 x (Intensité émission polarisée _|_)
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Applications :
- Un antigène marqué par un fluorochrome, selon qu'il est libre ou lié à un anticorps, ne donnera pas la
même polarisation de fluorescence (essentiellement par effet de taille, le complexe Ag-Ac est plus gros
que l'Ag libre). Ceci permet des dosages de substances par méthodes immunologiques très rapides qui
ne nécessitent pas toutes les étapes de lavage des méthodes immunofluorimétriques ou
immunoenzymatiques classiques.
- L'effet d'anisotropie de fluorescence est fondateur de méthodes permettant d'évaluer le volume
moléculaire à l'état hydraté de biomolécules (hors programme) d'étudier des interactions protéines
ligands ; protéines molécules de l'environnement solvant.
8.3. Marquages fluorescents "qualitatifs"
8.3.1. Marqueurs fluorescents utilisés pour observations de cellules en microscopie
à fluorescence
- Marquages à l'acridine orange ou au DAPI ou aux marqueurs fluorescents modernes d'activité
biologique et numérations DEFT. Voir chapitre dédié. On rappelle simplement ici que l'acridine est un
fluorochrome métachromatique dont la fluorescence n'apparaît que lorsque la molécule est intercalée
dans les acides nucléiques ADN et ARN. L'émission est verte pour des acides nucléiques doubles brins
et rouge pour des acides nucléiques simples brins.
- Coloration en fluorescence des mycobactéries à l'auramine. Voir chapitre dédié.
- Marquages spécifiques par anticorps conjugués à des fluorochromes en histologie/cytologie et en
microbiologie. Voir les chapitres dédiés. Les mots clefs : techniques directes et techniques indirectes.
8.3.2. Marquage fluorescent de l'ADN au BEI et électrophorèses
Voir le chapitre électrophorèses d'acides nucléiques.
8.3.3. Remarque concernant le phénomène d'exctinction de fluorescence
Les marqueurs fluorochromes utilisés en biologie sont généralement des molécules peu stables et dans
les milieux biologiques, l'éclairage UV conduit à l'apparition de radicaux libres qui conduisent à une
réaction autocatalytique de destruction des fluorochromes. C'est le phénomène d'extinction de
fluorescence : la fluorescence diminue (de façon exponentielle) sous éclairage UV.
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