Lorsque [enzyme] << [substrat], la vitesse de la réaction est directement proportionnelle à la concentration de l’enzyme. La vitesse de réaction augmente lorsque [enzyme] augmente. Ceci est vraie pour n’importe quel catalyseur. Vitesse de réaction 4. Effet de la concentration d’enzyme [Enzyme] 128 3.6 Cinétique enzymatique Les enzymes détiennent leur sélectivité et capacité à accélérer la vitesse d’une réaction de la formation d’un complexe enzymesubstrat: E+S E·S E+P où E= enzyme, S= substrat, E·S = complexe enzyme-substrat et P est le produit de la réaction La formation du complexe E·S donne lieu à un état de transition pour la réaction ayant une barrière énergétique d’activation (∆G‡) abaissée; la réaction a donc moins besoin d'un apport externe d'énergie pour se dérouler. ∆G‡= (sans enzyme) =∆G‡ (avec enzyme) ∆Gréaction n’est pas affectée par l’enzyme (D’après Tinoco, Sauer, Wang & Puglisi, Physical Chemistry: Principles & Applications In Biological Sciences, 4e éd., 2002) 129 La 1ère étape critique dans une réaction avec catalyse enzymatique est la formation du complexe E·S. Puisque c’est le complexe E·S qui est le réactif dans l’étape de conversion du substrat en produit, sa concentration détermine la vitesse de réaction. La vitesse de réaction est maximale lorsque toutes les molécules d’enzyme sont complexées au substrat. Cette situation correspond à des concentrations élevées de substrat, où l’enzyme est soit disant saturée avec le substrat. Pour une concentration fixe de l’enzyme, un graphique de la vitesse initiale de réaction (Vo) en fonction de la concentration initial du substrat [S] exhibe une courbe typique d’une cinétique de saturation, où un plateau est observé à [S] élevées lorsque V= vitesse maximale (Vmax). Vitesse de réaction approche Vmax Vo Vo α [S] 130 3.6.1 Réaction à un substrat: cinétique de Michaelis-Menten Le modèle cinétique est basé sur la formation du complexe E·S selon les étapes suivantes: k1 k3 (1) E + S ES E + P k2 On cherche une expression qui relie la vitesse de réaction aux concentrations du substrat et de l’enzyme et aux vitesses des étapes individuelles; le point de départ étant que la vitesse de réaction est égale (2) au produit de [E·S] et la constante de vitesse k3: V=k3[E·S] Les vitesses de formation et de décomposition du complexe E·S sont données par: vitesse de formation de E·S = k1[E][S] (3) (4) vitesse de décomposition de E·S = (k2 + k3)[E·S] Sous conditions d’état stable: k1[E][S] = (k2 + k3)[E·S] Par réarrangement de l’éqn 5, on obtient: [E ⋅ S] = [E][S] (k 2 + k 3 )/k1 (5) (6) 131 L’équation précédente peut être simplifiée en définissant une nouvelle constante, Km, qui est la constante de Michaelis: (7) k + k3 Km = 2 k1 En substituant l’expression pour Km dans l’éqn 6, on obtient: [E ⋅ S] = De plus, Donc, [E][S] Km (8) [S] ≈ [S]totale, si [E] << [S] [E] = [E]totale – [E·S] (9) [E·S]=([E]totale –[E·S])[S]/Km (10) Par réarrangement de l’éqn 10, on obtient [E ⋅ S] = [E]totale [S] (11) [S] + K m 132 En substituant cette expression pour [E·S] dans l’équation 2, on obtient: V = k 3 [E]totale [S] [S] + K m (12) La vitesse maximale, Vmax, est atteinte lorsque tout les sites enzymatiques sont saturés de substrat, c’est à dire, lorsque [S] >> Km et donc (13) [S]/([S] + Km) tend vers 1. Il s’ensuit que Vmax = k3[E]totale La substitution de l’éqn 13 dans l’éqn 12 donne l’équation de MichaelisMenten: [S] (14) V =V max [S] + K m L’équation de Michaelis-Menten décrit la courbe cinétique de Vo-[S]: - Pour des concentrations faibles de substrat, lorsque [S] << Km, V = [S]Vmax/Km et la vitesse est directement proportionnelle à la concentration de substrat. - Pour des concentrations élevées de substrat, lorsque [S] >>Km, V = Vmax et la vitesse est indépendante de la concentration de substrat. - La signification de la constante Km est évidente. Lorsque [S] = Km, V = Vmax/2. Km est la concentration de substrat nécessaire pour que 133 l'enzyme atteigne (1/2) Vmax. Méthodes graphiques pour la détermination de Km et Vmax Il y a deux régions d’utilité analytique dans la courbe cinétique de - [S] < 0.1Km (pour la quantification du substrat) Vo-[S]: - [S] > 10Km (pour la quantification d’enzyme) Dans le développement d’un essais enzymatique, il est important de connaître la valeur de Km de l’enzyme et d’ajuster la valeur de Vmax afin que l’essais est accompli dans le minimum de temps requis pour une précision donnée. Il y a quatre méthodes graphiques pour établir les valeurs de Km et Vmax dans des conditions expérimentales données: Lineweaver-Burk, EadieHofstee, Hanes et Cornish-Bowden-Eisenthal. Les quatre méthodes nécessitent des données expérimentales pour la vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration initiale du substrat pour une concentration fixe d’enzyme. 134 Données cinétique 0.6 Vo (∆A340nm/min) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 1 2 3 4 [S] mmol/L 5 6 7 135 1. Méthode de Lineweaver-Burk Le réciproque de l’équation de Michaelis-Menten est très utile pour l’analyse des données de cinétique: 1 K m + [ S] = Vo Vmax ⋅ [S] 1 Km [S ] = + Vo Vmax ⋅ [S] Vmax ⋅ [S] qu'on peut aussi écrire et qui se simplifie en 1 1 1 K = + m ⋅ Vo Vmax Vmax [S] L'avantage de cette transformation mathématique est qu'elle permet de tracer un graphique 1/Vo vs 1/[S] dont la courbe est en fait une droite pour les enzymes obéissant à la relation Michaélienne entre vitesse de réaction et concentration du substrat. 136 Y = (1.12551±0.08398) + (3.79517±0.06135) * X 14 12 10 1/Vo Km/Vmax 8 6 4 Km = 3.37 mmol/L Vmax = 0.89 unités d’absorption/min 2 0 -0.5 0.0 -1/Km 1/Vmax 0.5 1.0 1.5 2.0 1/[S] 2.5 3.0 3.5 137 2. Méthode de Eadie-Hofstee V = Vmax [S] [S] + K m V [S] + VK m = Vmax [S] Équation de Michaelis-Menten V [S] VK m + = Vmax [S] [S] V = Vmax − VK m [S] Un graphique de V en fonction de V/[S] donne une droite. 138 Y = (0.90851±0.03984) + (-3.46041±0.22103)*X 1.1 1.0 0.9 Km = 3.46 mmol/L Vmax = 0.91 unités d’absorption/min Vmax 0.8 Vo 0.7 0.6 -Km 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 Vo/[S] 139 3. Méthode de Hanes V = Vmax [S] [S] + K m V ([S] + K m ) = Vmax [S] Équation de Michaelis-Menten K m + [S] [S] = Vmax V [S] K m [ S] = + V Vmax Vmax Un graphique de [S]/V en fonction de [S] donne une droite. 140 Y = (3.74211±0.11868) + (1.13445±0.03865)*X 12 11 10 [S]/Vo 9 1/Vmax 8 7 Km = 3.30 mmol/L Vmax = 0.88 unités d’absorption/min 6 5 4 Km/Vmax 0 1 2 3 4 [S] 5 6 7 141 4. Méthode de Cornish-Bowden-Eisenthal V = Vmax [S] [S] + K m Vmax [S] = V [S] + VK m Équation de Michaelis-Menten Vmax = VK m +V [S] Chaque paire de coordonnées (V, [S])] donne des valeurs uniques d’ordonné à l’origine (V) et de pente (V/[S]) dans un graphique de Vmax en fonction de Km. Pour chaque coordonnée (V, [S])], les valeurs d’ordonnée à l’origine et de pente définissent une droite unique et les droites se croiseront à un point identique correspondant au Vmax et Km de l’enzyme. 142 1.6 1.4 1.2 Vmax 1.0 Faire la moyenne des différents points de croisement 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 1 2 3 4 5 6 Km 143 3.7 Inhibiteurs enzymatiques Des inhibiteurs enzymatiques sont des espèces qui sont capables de diminuer l'activité enzymatique. Les inhibiteurs enzymatiques interagissent généralement avec l’enzyme elle-même, formant ainsi un complexe enzyme-inhibiteur (E·I). Dans certains cas, le mécanisme d’inhibition implique une réaction avec le substrat. L’inhibition enzymatique peut être: - réversible (activité spécifique et les paramètres de Michaelis-Menten sont affectés) - irréversible (la concentration d’enzyme active est diminuée) L’inhibition de réactions par des produits de la réaction catalysée (ou d’une réaction subséquente) - mécanisme de régulation/« feedback » pour le métabolisme cellulaire. Inhibition sélective d’une enzyme par des substances chimiques - à la base 144 de la pharmacologie et de la chimiothérapie. Quantification d’inhibiteurs- à partir de mesures de l’activité enzymatique (l’échantillon d’inhibiteur ne contenant pas d’enzyme). V Des standards contenant une quantité fixe d’enzyme, une concentration saturée de substrat et des concentrations variables d’inhibiteur sont préparés. Des courbes de l’activité enzymatique vs. [I] sont réalisées à partir des standards. Courbes types pour des inhibiteurs (a) réversible et (b) irréversible. (D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 145 3.7.1 Inhibiteur compétitif Il y une compétition entre l’inhibiteur et le substrat pour le site actif de l’enzyme. L’inhibiteur se lie réversiblement à l’enzyme mais n’est pas converti en produit. k1 k2 E + S ES E + P k-1 E + I k3 k-3 EI P L’inhibiteur bloque le site actif de l’enzyme, empêchant la liaison du substrat. Son efficacité est décrit par la constante d’inhibition, Ki (constante de dissociation du complexe E·I) = k-3/k3. Pour une simple réaction à un substrat, l’effet de l’inhibiteur compétitif sur la vitesse initiale de la réaction est donné par: Vo = Vmax 1 + (K m /[S]) × (1 + [I] / K i ) L’inhibiteur peut être déplacé à des concentrations élevées du substrat. 146 Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur compétitif Les inhibiteurs compétitifs n’ont pas d’effet sur le Vmax de l’enzyme, mais changent le Km. Le Km augmente par un facteur de (1+[I]Ki). L’inhibition compétitive des enzymes est une stratégie souvent adoptée dans le développement de médicaments et antibiotiques (ex. les sulfonamides compétition avec le acide p-aminobenzoïque, un facteur de croissance essentiel pour plusieurs types de bactérie). (D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 147 3.7.2 Inhibiteur non compétitif Ce type d’inhibiteur ne ressemble généralement pas au substrat naturel. L’inhibiteur se lie à l’enzyme à un site autre que le site actif, causant ainsi un changement réversible dans la structure tertiaire de l’enzyme qui interfère la vitesse de conversion du substrat en produit. L’inhibiteur peut interagir avec l’enzyme libre ou avec le complexe E·S. Dans ce type d’inhibition, la quantité d’enzyme active semble diminuer lorsque [I] augmente; Vmax de la réaction diminue: Vo = Vmax (1 + [I] / K i ) × (1 + K m /[S]) où Vmax,app = Vmax/{1+[I]/Ki} 148 Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur non compétitif (D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 149 3.7.3 Inhibiteur incompétitif Les inhibiteurs incompétitifs se lient au complexe E·S, réduisant ainsi la vitesse de formation du produit. Il y a une diminution du Km et du Vmax de la réaction enzymatique. Une approximation de ce comportement est donnée par la relation: Vo = Vmax (K m /[S]) + ([I] / K i ) + 1 Le modèle prédit un changement équivalent du Km et du Vmax, résultant en des droites de pentes identiques dans le graphique de Lineweaver-Burk. 150 Graphique Lineweaver-Burk pour un inhibiteur incompétitif = {1+[I]/Ki}/Vmax = -{1+[I]/Ki}/Km (D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 151 3.8 Activateurs enzymatiques Les activateurs sont des espèces qui augmentent l’activité enzymatique sans être eux-mêmes impliqués dans la réaction catalysée par l’enzyme. Ces espèces peuvent être nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme, tels que des groupements prosthétiques ou cofacteurs, ou ils peuvent augmenter l’activité spécifique d’une enzyme qui est déjà active (ex. ions inorganiques). À une concentration saturée et constante du substrat, des concentrations croissantes de l’activateur augmentent la vitesse initial de réaction; une vitesse limitante est atteinte à des concentrations élevées d’activateur. 152 Dans certains cas, telle que l’activation par un groupe prosthétique, la séquence suivante de réactions peut servir comme modèle pour une description cinétique: A + Einactive S + Eactive SEactive Eactive Eactive + P Des séquences parallèles de réactions doivent être considérées si l’enzyme est catalytiquement active en absence de l’activateur. À l’exception des groupes prosthétiques ou co-facteurs, les activateurs ne sont pas généralement spécifiques et plusieurs espèces peuvent avoir le même effet d’activation sur une enzyme (ex. l’amylase est activé par une variété d’anions, incluant le Cl-). 153