Modalités pratiques pour le diagnostic biochimique et moléculaire
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1 Modalités pratiques pour le diagnostic biochimique et moléculaire de la granulomatose septique chronique Examen effectué sur rendez vous. Téléphoner au Centre Diagnostic CGD au 0476765483 une semaine à l’avance si possible. 1. Une prescription médicale est nécessaire à toute demande d’analyse. 2. Les prélèvements sont réalisés sur tubes citratés (bouchon bleu ciel) : 2 tubes de 7 ml soit entre 7 et 14 ml de sang total, moins pour les nouveaux-nés (2-5 ml si possible). 3. Nécessité d’un prélèvement témoin prélevé le même jour (7 à 14 ml sur citrate, pas nécessairement du même âge que le malade), pour constituer un contrôle ayant voyagé dans les mêmes conditions. 4. L’envoi des prélèvements se fait sous 24H maximum en triple emballage à l’adresse postale suivante (pour chronopost) : Dr Marie-José Stasia, Centre Diagnostic CGD, CHU de Grenoble, Institut de Biologie et Pathologie – BEP 1er étage BP 217, 38043 Grenoble cedex 9 Pour un transporteur type DHL, Fedex, il faut indiquer l’adresse géographique et non postale : Dr Marie-José Stasia, Centre Diagnostic CGD, CHU de Grenoble, Institut de Biologie et Pathologie – BEP 1er étage Parvis Belledonne 38700 La Tronche 5. Il est préférable de confirmer l’envoi le jour même en téléphonant au 0476765483. Demander Michelle Mollin ou Cécile Martel ou Dr MJ. Stasia. 6. Un consentement pour chacun des membres de la famille subissant un examen génétique est exigé, (pas nécessaire pour un simple diagnostic fonctionnel). 7. Un diagnostic fonctionnel est réalisé en première intention (Réduction du cytochrome c et test au NBT). Si l’activité NADPH oxydase est abolie, la recherche de la protéine déficiente est entreprise (Cytochrome b558, détermination immunochimique des constituants de l’oxydase). L’immortalisation des lymphocytes par EBV est ensuite réalisée pour pouvoir effectuer le diagnostic moléculaire et la recherche de mutations sur l’ARN (RT-PCR et séquençage) et contrôlé sur l’ADN génomique (PCR et séquençage). 8. La facturation sera effectuée selon la cotation ci-jointe. Il est préférable que les prélèvements soient effectués dans le cadre d’une hospitalisation normale ou de jour. Pour tout renseignement complémentaire, veuillez joindre le Dr Stasia au 0476765483. Laboratoire agrée pour le diagnostic de la granulomatose septique chronique Arrêté n° 08-333 du 07 Août 2008 2 Consentement du patient pour un examen de génétique moléculaire dans un but diagnostique Je soussigné(e) ………………………………………………………………………………………………………………………….......... Après avoir reçu les informations nécessaires du Docteur………………………………………………………. Sur la maladie……………………………………………………………………………………………………………………………………… Accepte que soit réalisée sur ma personne / sur mon enfant (1) une recherche par génétique moléculaire. Cet examen sera réalisé dans un but diagnostique. Je souhaite / je ne souhaite pas (1) connaître les éventuels résultats le jour où cette étude aboutira. Je consens / je ne consens pas (1) au recueil, à la saisie et au traitement des données contenues dans mon dossier médical par des personnes tenues au secret professionnel. Les données qui me concernent resteront strictement confidentielles. Je n’en autorise la consultation qu’aux personnes qui collaborent à l’analyse. Je pourrai à tout moment demander à être retiré(e) de l’analyse et à cette fin les données concernant mon dossier devront être détruites. Conformément à la loi informatique et liberté, je peux exercer mon droit d’accès aux données qui me concernent par l’intermédiaire d’un médecin de mon choix. (1) rayer la mention inutile à le : Signature Attestation de consultation médicale Je soussigné(e), Docteur …………………………………………………………….. certifie avoir apporté à : Madame, Mademoiselle, Monsieur………………………………………………. Les informations sur les caractéristiques, les moyens de détection, les possibilités de traitement et de prévention concernant……………………………………………………………………….. et avoir recueilli son consentement dans les conditions prévues à l’article R145-15-4 et R145-15-5 du code de la santé publique. à le : Signature du médecin prescripteur : Laboratoire agrée pour le diagnostic de la granulomatose septique chronique Arrêté n° 08-333 du 07 Août 2008 3 Centre CGD - Nomenclature des analyses établie selon la nomenclature de Montpellier - version du 19-01-2010 ANALYSES Mnémoniques Informatiques Techniques B BNN Codes DIAGNOSTIC FONCTIONNEL CGD Traitement des neutrophiles et des lymphocytes à partir du sang total Purification des lymphocytes et des neutrophiles PREP Numération cellulaire Isolement des polynucléaires Isolement des leucocytes Immortalisation des lymphocytes par EBV CULLB Congélation des lymphocytes Activité NADPH Oxydase dans les neutrophiles Réduction du Cytochrome C CONLB Test de réduction du NBT et phagocytose sur lame de billes de latex opsonisé NBT Luminescence (luminol/isoluminol) LUMIN Fluorimétrie - Amplex RedR AR Cytométrie en flux –Dihydrorhodamine (DHR) CYTOF CYT C SER80 CULOT 35 150 200 4030 1250 Prod. d’anions superoxyde Stimulation au Zymosan Stimulation au fMLP Réduction du NBT Stimulation des PN au latex Stimulation des PN au PMA Chimioluminescence Stimulation des PN au zymos Stimulation des PN au fLMP Prod. H2O2 Stimulation au Zymosan Stimulation au PAF/fMLP Mesure de la prod. H2O2 Marquage Ac Perméabilisation cellulaire Sérothèque Conservation des PMNs G188 G181 E004 50 x 6 G183 800 200 200 380 200 200 300 300 300 400 200 200 400 100 20 20 35 G073 G069 G069 G075 G069 G069 G076 G077 G077 G074 G069 G069 G074 G065 G066 G187 G185 200 G086 DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE CGD Détermination immunochimique des constituants de la NADPH-oxydase dans les neutrophiles et lymphocytes Préparation extrait soluble Triton X100 EXTRI Dosage des protéines DPROT Prep. membrane et cytosol cellulaires MBCYT Western-blot WBPN gp91 p22 p67 p47 p40 Rac CYTOB Quantification du Cytochrome b558 1634 70 200 G086 NADPH oxydase WB Western blot des composants du complexe NADPH oxydase (5) 800 G072 Petite G Protéine Spectrophotométrie différentielle 300 1000 G146 G070 Q Laboratoire agrée pour le diagnostic de la granulomatose septique chronique Arrêté n° 08-333 du 07 Août 2008 4 Mnémoniques Informatiques Techniques B BNN Codes DIAGNOSTIC GENETIQUE CGD Contrôle préanalytique du dossier (consentement, indication) Enregistrement des données du patient dans les bases informatique (Hors SGL) Discussion clinico-biologique 30 N200 50 N206 100 N207 ARNT Extraction d’ARN +Dosage d’acides nucléiques 200 10 N010 N014 ARNM Préparation des ARNs messagers RT Réverse transcription 50 N018 100 N011 Southern ou Northern blot (par puits nécessaire pour l’étude d’un patient) SSCP (par puits-exclu PCR) 300 N037 200 N030 ADN Extraction d’ADN +Dosage d’acides nucléiques 80 10 N008 N014 PCR PCR et analyse directe par migration sur gel + Séquençage double brin Southern ou Northern blot (par puits nécessaire pour l’étude d’un patient) PCR +Séquençage +Etude de microsatellites Etude par des logiciels standards de prédiction Recherche dans les bases de données Intégration des données clinico-biologiques Saisie d’un nouveau variant PR ARN + RT + PCR +Couple d’amorces supplém. 130 N902 340 300 N906 N037 130 340 120 50 N902 N906 N926 N210 100 N211 500 N215 50 210 100 130 20 N216 Etude d’un des 4 gènes impliqués dans la CGD CYBB→gp91phox – CGD liée à l’X CYBA→p22 phox – CGD Autosomale Récessive NCF1→p47 phox– CGD Autosomale Récessive NCF2→p67 phox– CGD Autosomale Récessive Gène de rac – Déficit immunitaire héréditaire sévère Cotation valable pour chaque gène étudié PAT ARN RTARN NORB SSCP ADN génomique SOUB Microsatellites MSAT Analyse de variants non classés NMUT Quantification de transcrit Laboratoire agrée pour le diagnostic de la granulomatose septique chronique Arrêté n° 08-333 du 07 Août 2008 N011 N902 N025 5 Mnémoniques Informatiques DEFICIT EN CHIMIOTACTISME DU NEUTROPHILE Chimiotactisme Fluorimétrie à 37°C Techniques B BNN Codes 800 200 200 200 G067 G069 G069 G069 ETUDE DU POUVOIR BACTERICIDE DES NEUTROPHILES Bactéricidie avec Pseudomonas Aeruginosa BACTE 950 G078 Bactéricidie avec Eschericha Coli 950 G078 200 200 G069 G069 120 120 50 60 140 50 60 120 140 1521 J018 J018 J081 J017 E028 G063 J017 J018 E028 300 150 140 G092 G082 K054 150 140 G082 K054 100 G093 SERAC PEPCH PEPAF Chimiotactisme des PN Stimulation au sérum activé Stimulation au fMLF Stimulation au PAF BACTE ETUDE DE LA DEGRANULATION DES NEUTROPHILES Dégranulation ou exocytose des DEGR neutrophiles Activation des PN par fMLP Activation des PN par PMA Dosage dans le surnageant d’exocytose : LDH MMP9 TIMP1 ADA Lysosyme (par assimilation) Elastase leucocytaire MPO des PN Cathepsine G MMP 8 Lactoferrine 20 ETUDE DE L’ACTIVATION DES TLR SUR LES PBMC Tri cellulaire par billes magnétiques 1-Activation au Pam3 Dosage de TNFα 2- Idem LTA 3- Idem LPS 4- Idem peptidoglycane 5- Idem poly U 6-Activation par la flagelline Dosage de IL6 7- Idem R837 8- Idem CPG 9- Idem TNFα 10- Idem IL1β Populations lymphocytaires en cytométrie de flux Laboratoire agrée pour le diagnostic de la granulomatose septique chronique Arrêté n° 08-333 du 07 Août 2008
