Rapport de Projet 2003

KUBS FLEUR
CARBILLET FANNY
TUTEUR :
Dr D.DUMAS
Matériels mis à disposition:
- microscope à sectionnement optique conventionnel : Olympus IX70 + module
Cellscan ( Scanalytic’s)
- microscope confocal à balayage laser monophotonique et multiphotonique SP2
Leica
Année universitaire 02/03
Etude bibliographique d
es méthodes de caractérisation de systèmes
optiques mises en œuvre en fonction des contraintes expérimentales.
L’instrumentation du service d’imagerie cellulaire est disponible pour la
réalisation des tests après formation sur les appareils. La solution
proposée sera prise en compte pour l’évolution instrumentale du
microscope confocal dans les prochains mois.
RAPPORT DE
PROJET

Rapport de projet 2003/CARBILLET-KUBS
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TABLE DES MATIERES
Introduction _______________________________________________________________4
Bases de l’étude ____________________________________________________________5
I_ Microscopie Confocale à Balayage Laser monophotonique ou multiphotonique : _5
a
a
a)
)
) CLSM = Microscopie optique :_________________________________________5
b
b
b)
)
) CLSM = Microscopie de fluorescence : __________________________________5
c
c
c)
)
) CLSM = Microscopie quantitative : _____________________________________6
d
d
d)
)
) CLSM = Principe confocalité : _________________________________________6
e
e
e)
)
) CLSM = Imagerie 3D/Microscopie à sectionnement optique :_________________7
f
f
f)
)
) CLSM = Microscopie Monophotonique / Multiphotonique
: __________________7
II_ Outils d’analyse_______________________________________________________8
a
a
a)
)
) La PSF (ou Point Spread Function) : ____________________________________8
Définition : __________________________________________________________8
Restauration d’images :________________________________________________10
b
b
b)
)
) CV (ou Coefficient de Variation) : _____________________________________10
c
c
c)
)
) Conclusion :_______________________________________________________11
Critères de caractérisation d’un système confocal : _______________________________12
I_ Présentation du système confocal : _______________________________________12
II_ Critères conditionnant la performance et la sensibilité d’un microscope confocal13
a
a
a)
)
) Test d’appréciation général de la qualité du système : ______________________13
b
b
b)
)
) Alignement des canaux : _____________________________________________15
c
c
c)
)
) Détecteurs : _______________________________________________________15
Tests de résolution latérale en mode monophotonique :_______________________16
Test de résolution spatiale en mode monophotonique : _______________________16
Influence du gain des PMT sur l’intensité : ________________________________17
d
d
d)
)
) Ouverture du pinhole :_______________________________________________18
Tests sur la résolution latérale :__________________________________________18
Test de résolution spatiale en mode monophotonique et multiphotonique :________19
e
e
e)
)
) Source laser :______________________________________________________21
Puissance laser : _____________________________________________________21
Importance de la stabilité de la source laser : _______________________________21
Illumination de l’échantillon :___________________________________________21
f
f
f)
)
) Vitesse de balayage :________________________________________________23
g
g
g)
)
) Zoom : ___________________________________________________________24
h
h
h)
)
) Conclusion :_______________________________________________________25
Complexité du problème_____________________________________________________26
I_ Exposition de la complexité des interactions entre les différents paramètres : ___26
a
a
a)
)
) Opposition pinhole/gain des PMT : ____________________________________26
b
b
b)
)
) Opposition puissance laser/ gain des PMT : ______________________________26
c
c
c)
)
) Opposition zoom/bleaching : _________________________________________26
d
d
d)
)
) Opposition gain des PMT/moyennage par plan /bleaching : _________________26

Rapport de projet 2003/CARBILLET-KUBS
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II_ Autres paramètres relatifs à la technique :________________________________27
a
a
a)
)
) Influence de l’ouverture numérique : ___________________________________27
b
b
b)
)
) Brillance : ________________________________________________________27
c
c
c)
)
) L’immersion : _____________________________________________________28
d
d
d)
)
) Repositionnement du système de déplacement en Z nanométrique piézoélectrique :
29
e
e
e)
)
) Taille de champs / pixels :____________________________________________29
f
f
f)
)
) Bruits intrinséques :_________________________________________________29
g
g
g)
)
) Eclairage : ________________________________________________________29
h
h
h)
)
) Erreurs informatiques : ______________________________________________30
III_ Paramètres externes : ________________________________________________30
a
a
a)
)
) Relatif à l’environnement : ___________________________________________30
b
b
b)
)
) Relatifs à l’échantillon : _____________________________________________30
IV_ Conseils d’utilisation :________________________________________________31
a
a
a)
)
) Etapes à suivre quant aux réglages des paramètres d’acquisition :_____________31
b
b
b)
)
) Avant toute acquisition : _____________________________________________31
c
c
c)
)
) Contraintes de préparation : __________________________________________31
d
d
d)
)
) Il est également conseillé de : _________________________________________32
V_ Conclusion : _________________________________________________________32
Conclusion _______________________________________________________________34

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En général, la plupart des microscopes sont évalués avec des échantillons biologiques de
référence. Cependant de simples comparaisons d’images effectuées sur une lame biologique
sont subjectives et ne permettent pas de détecter un mauvais fonctionnement, ni de déterminer
la performance du système.
Bien que les microscopes confocaux à balayage laser (CLSM) impliquent l’utilisation de
lasers, de composants électroniques, de composants d’optique, et bien évidemment un
microscope, il n’existe pas de tests standardisés ni de spécifications constructeur pour la
caractérisation (en terme de performance et de sensibilité) de ces systèmes.
De nombreux tests portant sur la caractérisation des CLSM ont pourtant été publiés.
Les objectifs de notre projet étaient les suivants :
- préparation préalable au stage de maîtrise
- débuter la formation sur le système SP2 Leica mis à notre disposition
- effectuer des tests de caractérisation du système
- rendre compte des manipulations effectuées
- et proposer des conditions optimales d’acquisition d’images de haute qualité
Après avoir rappelé les principaux phénomènes physiques de base et les propriétés de la
technologie utilisée, nous avons présenté les différents d’outils d’analyse permettant
l’exploitation de nos expérimentations. Ensuite, nous avons procédé à l’analyse des
paramètres les uns indépendamment des autres afin de bien situer l’action de chacun sur la
qualité des images réalisées. Puis nous avons dégagé les liens existant entre tous ces facteurs
pour exposer la complexité de la caractérisation de tels systèmes.

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Dans un premier temps, nous avons jugé nécessaire de faire un rappel des phénomènes
physiques de base et de la technique d’observation d’échantillons biologiques sur laquelle ont
porté nos tests de caractérisation de système. Puis nous présentons les outils d’analyse dont
nous avons usé pour interpréter les résultats de ces tests.
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e :
:
:
La définition de la Microscopie Confocale à Balayage Laser (CLSM pour Confocal Laser
Scanning Microscope) monophotonique et/ou multiphotonique repose sur les six
propriétés suivantes…
CLSM = Microscopie optique :
D’un point de vue général, la microscopie optique est basée sur la capacité de l’échantillon
observé à absorber ou réfléchir des photons (contrairement à la microscopie électronique qui
repose sur l’absorption d’électrons).
CLSM = Microscopie de fluorescence :
Dans le cas d'une observation en microscopie à fluorescence conventionnelle, les molécules
de l’échantillon sont soumises à une source lumineuse (lampe à vapeur de mercure,
lasers,…) et absorbent les photons suffisamment énergétiques (longueur d’onde λ
exc
) :
l’échantillon est dit « excité », il rentre alors dans un état énergétique instable et supérieur à
son état énergétique fondamental.
Il tend à retourner à son état de repos en libérant l’énergie emmagasinée sous forme de
chaleur et d’émission de photons appelés photons de fluorescence dont la longueur d’onde λ
em
est supérieure à la longueur d’onde des photons d’excitation λ
exc
.
Ces photons émis sont alors captés au niveau du système par des détecteurs de type Caméras
CCD (Charged Coupled Device), Photomultiplicateurs, Photodiodes à avalanche,…
Remarques :
Les sources d’excitation utilisées en CLSM sont des lasers !
Les λ d’absorption, d’émission et d’excitation sont spécifiques pour chaque molécule de
fluorophore.