Manuel Microscope confocal Biorad MRC 1024

Tutoriel
Microscope Confocal Biorad MRC 1024
Plateforme d'imagerie Quantitative
http://imageriepiq.u-strasbg.fr/
Faculté de pharmacie de Strasbourg
CNRS UMR 7213 Laboratoire de biophotonique et Pharmacologie

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Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/
Allumage et extinction du système
Mise en marche:
1. Allumez toujours la lampe de fluorescence en premier. Son allumage provoque un pic de tension
qui peut endommager les autres équipements. Basculez l’interrupteur sur on et appuyez sur le starter
quelques secondes [1]
2. Allumez le laser en tournant la clef [2], laissez toujours l’interrupteur sur on.
3. Allumez la lampe halogène [3], le boitier de contrôle électronique [4] puis l’ordinateur [5]
4. Connectez vous en temps que piq, le mot de passe est piq.
5. Lancez le logiciel LaserSharp2000, l’identifiant est confocal, le mot de passe est piq.
Extinction:
1. Fermez le logiciel.
2. Quittez windows NT4, au bout de quelques minutes l’ordinateur affiche le message « Vous pouvez
maintenant éteindre votre ordinateur » vous pouvez alors l’éteindre manuellement [5]
3. Nettoyez les objectifs à immersion avec du papier objectif uniquement.
4. Baissez les objectifs au maximum afin d’éviter qu’ils heurtent la platine si quand l’utilisateur suivant
choisira son objectif.
5. Eteignez le boitier de contrôle [4]
6. Eteignez la lampe halogène [3]
Si personne n’utilise le microscope après vous:
1. Eteignez le laser en tournant la clef [2] laissez l’interrupteur sur on.
2. Eteignez la lampe de fluorescence [1] en basculant l’interrupteur sur off.
N’oubliez pas vos échantillons !
Attention!
La lampe à fluorescence doit arriver à sa température de fonctionnement avant
d’être
éteinte
et une fois éteinte, elle doit être complètement refroidie avant de pouvoir être remise en marche. Si
vous ne respectez pas ce point elle sera détériorée et vous risquez de la faire exploser (vapeurs
toxiques).
Il en est de même pour le laser. Vérifiez toujours que personne n’utilise le microscope après vous avant
d’éteindre ces éléments.
Les temps de latences entre l’allumage et l’extinction sont de 45 minutes pour la lampe de fluorescence
et 20 minutes pour le laser
∆

1ère partie
Description du statif
Observation en lumière transmise
Pour observer aux oculaires
en lumière transmise, vérifiez les points suivants
-
Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [
- Le miroir
du PMT 3 est tourné vers la droite
- La tirette du miroir de redirection [
6
- La lampe halogène est allumée [4]
- Utilisez le variateur pour ajuste
r l’intensité lumineuse [
Pour avoir une bonne image en lumière transmise, il faut que le condenseur soir correctement aligné.
En principe il est toujours réglé, évitez d’y toucher. Le fonctionnement du condenseur est détaillé
Observation en fluorescence
Pour observer aux oculaires
en lumière transmise, vérifiez les points suivants
- La tirette du miroir de redirection [
6
- La lampe halogène est éteinte [4]
-
Le shutter de la fluorescence est ouvert (tirette sortie) [
- Faites coulisser le chariot de filtr
es pour voir votre fluorescence [7]
Les réservations sont à déposer
sur:
Pour toute demande, adressez vous à l’ingénieur du plateau
En cas d’absence adressez vous à Philippe Rondé
Site web: http://activplanning.u-
strasbg.fr
Plateforme d'Imagere Quantitative
1ère partie
Observation aux oculaires
[1] Barillet porte objectifs
[2] Molettes de focus
et de focus fin
[3] Molettes
de déplacement XY
[4]
Interrupteur lumière transmise
[5] Variateur
lumière transmise
[6] Tirette miroir
de redirection visuel/confocal
[7] Tirette
filtres de fluorescence
[8] Miroir PMT Trans
[9]
Tirette shutter de fluorescence
∆ Le barillet porte-
objectif n’est pas motorisé, vous
devez le tourner manuellement. Avant de changer
d’objectif, n’oubliez pas de les rabaisser afin d’éviter
qu’ils heurtent la platine.
∆
Les tirettes sont fragiles manipulez les doucement
∆
Ne regardez jamais directement
lampe
de fluorescence ou le laser
en lumière transmise, vérifiez les points suivants
:
Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [
7] sortie au maximum.
du PMT 3 est tourné vers la droite
.
6
] est enfoncée.
r l’intensité lumineuse [
5]
Pour avoir une bonne image en lumière transmise, il faut que le condenseur soir correctement aligné.
En principe il est toujours réglé, évitez d’y toucher. Le fonctionnement du condenseur est détaillé
en lumière transmise, vérifiez les points suivants
:
6
] est enfoncée.
Le shutter de la fluorescence est ouvert (tirette sortie) [
9]
es pour voir votre fluorescence [7]
Contacter le service imagerie
sur:
http://activplanning.u-strasbg.fr/AP-PicQ.asp
Pour toute demande, adressez vous à l’ingénieur du plateau
romain.vauch[email protected]
En cas d’absence adressez vous à Philippe Rondé
philippe.ron[email protected]
strasbg.fr
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Plateforme d'Imagere Quantitative
http://imageriepiq.u-strasbg.fr/
et de focus fin
de déplacement XY
Interrupteur lumière transmise
lumière transmise
de redirection visuel/confocal
filtres de fluorescence
Tirette shutter de fluorescence
objectif n’est pas motorisé, vous
devez le tourner manuellement. Avant de changer
d’objectif, n’oubliez pas de les rabaisser afin d’éviter
Les tirettes sont fragiles manipulez les doucement
Ne regardez jamais directement
lumière de la
de fluorescence ou le laser
!!
Pour avoir une bonne image en lumière transmise, il faut que le condenseur soir correctement aligné.
En principe il est toujours réglé, évitez d’y toucher. Le fonctionnement du condenseur est détaillé
p9.
romain.vauch[email protected]
03688554218

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Ce microscope dispose de 2 filtres, un pour les fluorophores verts (GFP, FITC…) et un pour les rouges
(Rhodamine, Cy3 …) Ces filtres sont anciens et leurs fréquences de coupure sont mal définis, mais ne servent
qu’à l’observation visuelle. Ainsi, un signal apparemment faible peut se révéler être de bonne qualité quand
on le détecte avec la tête confocale.
2ème partie Acquisition d’images confocale
Choix du protocole
- Dans le menu Method, choisissez le protocole, il définit les canaux à imager le mode d’acquisition (séquentiel
ou simultané)
Trajet optique dans la tête confocale
Dichroïque primaire (Filter Block 1):
Ce miroir permet la séparation entre les faisceaux d’excitation et d’émission. Les longueurs d'ondes du laser
sont réfléchies vers l’échantillon et la fluorescence émise traversent ce filtre pour être transmise aux
détecteurs.
Dichroïques secondaires (Filter Block 2):
Ce miroir sépare les différentes émissions de fluorescence pour les redistribuer vers les différents capteurs.
Les longueurs d'ondes inférieures à 560nm sont réfléchies, les autres les traversent.
Filtres (Emission filter):
Ils réduisent les bandes passantes détectées pour limiter le bruit de fond, le chevauchement des signaux
d'émission des différents marqueurs et de supprimer les raies laser réfléchies par la lamelle. Ils En choisissant
une bande plus large, on augmente le signal mais on diminue sa spécificité.
Remarque : Sur notre système actuel,
il n’y a pas de laser He/Cd.

Ce diagramme est accessible en cliquant sur
d’excitation, et les filtres d’
émission. Il
schéma. Les miroirs
dichroïques sont fixes et ne peuvent êt
confocale.
Sur le statif
-
Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [
- La tirette du miroir de redirection [
6
- La lampe halogène est éteinte [4]
Paramétrer un canal
Dans la fenêtre image chaque cadran représente un canal. L’image est présentée en niveau de gris, les pixels
saturés sont en rouge et les pixels nuls en
fluorescence en fausses couleurs.
- Pour visualiser pl
us facilement un canal, double
- En mode si
multané, vous illuminez tout vos fluorophores en
canal, ne gardez que la bonne raie laser pour éviter de bleacher l’autre. Allez dans
sélectionnez la longueur d’onde dans le menu déroulant de Excitation Filter
- Dans la fenêtre de paramètres cl
ique
Paramètres fondamentaux
Il y a 4 principaux paramètres
qui vont déterminer la puissance du signal
ceux-cis pour optimiser la détection.
Plateforme d'Imagere Quantitative
Ce diagramme est accessible en cliquant sur
l’icône
, il permet de modifier l’intensité du laser, les raies
émission. Il
est fortement conseillé de laisser
ces derniers comme présenté
dichroïques sont fixes et ne peuvent êt
res changés qu’en les démontant
Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [
3] sortie au maximum)
6
] est sortie.
Dans la fenêtre image chaque cadran représente un canal. L’image est présentée en niveau de gris, les pixels
saturés sont en rouge et les pixels nuls en
vert.
Le dernier cadran représente l’overlay des
us facilement un canal, double
-
cliquez sur le cadran correspondant pour zoomer dessus.
multané, vous illuminez tout vos fluorophores en
même temps, quand vous travaillez sur un
canal, ne gardez que la bonne raie laser pour éviter de bleacher l’autre. Allez dans
sélectionnez la longueur d’onde dans le menu déroulant de Excitation Filter
.
ique
z sur l’onglet de votre canal [A]
qui vont déterminer la puissance du signal
, il faut trouver le bon équilibre entre
[1] Puissance du laser.
En augmentant la puissance du laser, on augmente
lumière émise et donc le signal collecté sans augmenter le bruit. La
puissance du laser doit souvent rester modérée pour éviter un
photoblanchiment excessif.
[10] Target Iris et [2] Iris (
Ouverture du pinhole
Cet outil sert à optimiser l’ouverture du pinhole en fonction
del’objectif. Il fixe le pin
hole à une unité d’airy, ce qui signifie que
la surface détectée par le PMT
correspond à la résolution optique
du système.
La résolution est alors maximale
la section optique
possible.
En fermant plus le pinhole, on collecte moins de lumière sans
gagner en résolution.
En ouvrant plus
le pinhole, on perd en résolution axiale
collecte plus de lumière. Dans certains cas il e
l’épaisseur de la coupe optique.
L’ouverture du pinhole est affichée en mm.
[3] Amplification du photomultiplicateur (Gain)
Le gain contrôle directement le voltage traversant le PMT. Il
permet de contrôler l’intensité du signal détec
le gain, on augmente aussi le bruit de fond, il est conseillé de ne
pas dépasser les 1400 V
[4] L’offset permet de fixer le 0 de la
détection
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, il permet de modifier l’intensité du laser, les raies
ces derniers comme présenté
sur le
res changés qu’en les démontant
de la tête
Dans la fenêtre image chaque cadran représente un canal. L’image est présentée en niveau de gris, les pixels
Le dernier cadran représente l’overlay des
canaux de
cliquez sur le cadran correspondant pour zoomer dessus.
même temps, quand vous travaillez sur un
canal, ne gardez que la bonne raie laser pour éviter de bleacher l’autre. Allez dans
Optic Diagram et
, il faut trouver le bon équilibre entre
En augmentant la puissance du laser, on augmente
la quantité de
lumière émise et donc le signal collecté sans augmenter le bruit. La
puissance du laser doit souvent rester modérée pour éviter un
Ouverture du pinhole
)
Cet outil sert à optimiser l’ouverture du pinhole en fonction
hole à une unité d’airy, ce qui signifie que
correspond à la résolution optique
la section optique
est la plus fine
En fermant plus le pinhole, on collecte moins de lumière sans
le pinhole, on perd en résolution axiale
mais on
collecte plus de lumière. Dans certains cas il e
st utile d’augmenter
L’ouverture du pinhole est affichée en mm.
[3] Amplification du photomultiplicateur (Gain)
Le gain contrôle directement le voltage traversant le PMT. Il
permet de contrôler l’intensité du signal détec
tée. En augmentant
le gain, on augmente aussi le bruit de fond, il est conseillé de ne
détection
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