Manuel Microscope confocal Biorad MRC 1024
publicité
Tutoriel Microscope Confocal Biorad MRC 1024 Plateforme d'imagerie Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Faculté de pharmacie de Strasbourg CNRS UMR 7213 Laboratoire de biophotonique et Pharmacologie Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Allumage et extinction du système Mise en marche: 1. Allumez toujours la lampe de fluorescence en premier. Son allumage provoque un pic de tension qui peut endommager les autres équipements. Basculez l’interrupteur sur on et appuyez sur le starter quelques secondes [1] 2. Allumez le laser en tournant la clef [2], laissez toujours l’interrupteur sur on. 3. Allumez la lampe halogène [3], le boitier de contrôle électronique [4] puis l’ordinateur [5] 4. Connectez vous en temps que piq, le mot de passe est piq. 5. Lancez le logiciel LaserSharp2000, l’identifiant est confocal, le mot de passe est piq. ∆ Attention! La lampe à fluorescence doit arriver à sa température de fonctionnement avant d’être éteinte et une fois éteinte, elle doit être complètement refroidie avant de pouvoir être remise en marche. Si vous ne respectez pas ce point elle sera détériorée et vous risquez de la faire exploser (vapeurs toxiques). Il en est de même pour le laser. Vérifiez toujours que personne n’utilise le microscope après vous avant d’éteindre ces éléments. Les temps de latences entre l’allumage et l’extinction sont de 45 minutes pour la lampe de fluorescence et 20 minutes pour le laser Extinction: 1. Fermez le logiciel. 2. Quittez windows NT4, au bout de quelques minutes l’ordinateur affiche le message « Vous pouvez maintenant éteindre votre ordinateur » vous pouvez alors l’éteindre manuellement [5] 3. Nettoyez les objectifs à immersion avec du papier objectif uniquement. 4. Baissez les objectifs au maximum afin d’éviter qu’ils heurtent la platine si quand l’utilisateur suivant choisira son objectif. 5. Eteignez le boitier de contrôle [4] 6. Eteignez la lampe halogène [3] Si personne n’utilise le microscope après vous: 1. Eteignez le laser en tournant la clef [2] laissez l’interrupteur sur on. 2. Eteignez la lampe de fluorescence [1] en basculant l’interrupteur sur off. N’oubliez pas vos échantillons ! 2 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Contacter le service imagerie Les réservations sont à déposer sur: http://activplanning.u-strasbg.fr/AP-PicQ.asp Pour toute demande, adressez vous à l’ingénieur du plateau [email protected] 03688554218 En cas d’absence adressez vous à Philippe Rondé [email protected] Site web: http://activplanning.u-strasbg.fr strasbg.fr 1ère partie Observation aux oculaires Description du statif [1] Barillet porte objectifs [2] Molettes de focus et de focus fin [3] Molettes de déplacement XY [4] Interrupteur lumière transmise [5] Variateur lumière transmise [6] Tirette miroir de redirection visuel/confocal [7] Tirette filtres de fluorescence [8] Miroir PMT Trans [9] Tirette shutter de fluorescence ∆ Le barillet porte-objectif objectif n’est pas motorisé, vous devez le tourner manuellement. Avant de changer d’objectif, n’oubliez pas de les rabaisser afin d’éviter qu’ils heurtent la platine. ∆ Les tirettes sont fragiles manipulez les doucement ∆ Ne regardez jamais directement lumière de la lampe de fluorescence ou le laser !! Observation en lumière transmise Pour observer aux oculaires en lumière transmise, vérifiez les points suivants : - Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [7] [ sortie au maximum. - Le miroir du PMT 3 est tourné vers la droite. droite - La tirette du miroir de redirection [6 6] est enfoncée. - La lampe halogène est allumée [4] - Utilisez le variateur pour ajusterr l’intensité lumineuse [5] [ Pour avoir une bonne image en lumière transmise, il faut que le condenseur soir correctement aligné. En principe il est toujours réglé, évitez d’y toucher. Le fonctionnement du condenseur est détaillé p9. Observation en fluorescence Pour observer aux oculaires en lumière transmise, vérifiez les points suivants : - La tirette du miroir de redirection [6 6] est enfoncée. - La lampe halogène est éteinte [4] [ - Le shutter de la fluorescence est ouvert (tirette sortie) [9] - Faites coulisser le chariot de filtres es pour voir votre fluorescence [7] 3 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Ce microscope dispose de 2 filtres, un pour les fluorophores verts (GFP, FITC…) et un pour les rouges (Rhodamine, Cy3 …) Ces filtres sont anciens et leurs fréquences de coupure sont mal définis, mais ne servent qu’à l’observation visuelle. Ainsi, un signal apparemment faible peut se révéler être de bonne qualité quand on le détecte avec la tête confocale. 2ème partie Acquisition d’images confocale Choix du protocole - Dans le menu Method, choisissez le protocole, il définit les canaux à imager le mode d’acquisition (séquentiel ou simultané) Trajet optique dans la tête confocale Remarque : Sur notre système actuel, il n’y a pas de laser He/Cd. Dichroïque primaire (Filter Block 1): Ce miroir permet la séparation entre les faisceaux d’excitation et d’émission. Les longueurs d'ondes du laser sont réfléchies vers l’échantillon et la fluorescence émise traversent ce filtre pour être transmise aux détecteurs. Dichroïques secondaires (Filter Block 2): Ce miroir sépare les différentes émissions de fluorescence pour les redistribuer vers les différents capteurs. Les longueurs d'ondes inférieures à 560nm sont réfléchies, les autres les traversent. Filtres (Emission filter): Ils réduisent les bandes passantes détectées pour limiter le bruit de fond, le chevauchement des signaux d'émission des différents marqueurs et de supprimer les raies laser réfléchies par la lamelle. Ils En choisissant une bande plus large, on augmente le signal mais on diminue sa spécificité. 4 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Ce diagramme est accessible en cliquant sur l’icône , il permet de modifier l’intensité du laser, les raies d’excitation, et les filtres d’émission. émission. Il est fortement conseillé de laisser ces derniers comme présenté sur le schéma. Les miroirs dichroïques sont fixes et ne peuvent êtres êtres changés qu’en les démontant de la tête confocale. Sur le statif - Il n’y a pas de filtre de fluorescence engagé (tirette [3] [ sortie au maximum) - La tirette du miroir de redirection [6 6] est sortie. - La lampe halogène est éteinte [4] Paramétrer un canal Dans la fenêtre image chaque cadran représente un canal. L’image est présentée en niveau de gris, les pixels saturés sont en rouge et les pixels nuls en vert. Le dernier cadran représente l’overlay des canaux de fluorescence en fausses couleurs. - Pour visualiser plus us facilement un canal, double-cliquez double cliquez sur le cadran correspondant pour zoomer dessus. - En mode simultané, multané, vous illuminez tout vos fluorophores en même temps, quand vous travaillez sur un canal, ne gardez que la bonne raie laser pour éviter de bleacher l’autre. Allez dans Optic Diagram et sélectionnez la longueur d’onde dans le menu déroulant de Excitation Filter. Filter - Dans la fenêtre de paramètres clique iquez sur l’onglet de votre canal [A] Paramètres fondamentaux Il y a 4 principaux paramètres qui vont déterminer la puissance du signal, signal, il faut trouver le bon équilibre entre ceux-cis pour optimiser la détection. [1] Puissance du laser. En augmentant la puissance du laser, on augmente la quantité de lumière émise et donc le signal collecté sans augmenter le bruit. La puissance du laser doit souvent rester modérée pour éviter un photoblanchiment excessif. [10] Target Iris et [2] Iris (Ouverture Ouverture du pinhole) pinhole Cet outil sert à optimiser l’ouverture du pinhole en fonction del’objectif. Il fixe le pinhole hole à une unité d’airy, ce qui signifie que la surface détectée par le PMT correspond à la résolution optique du système. La résolution est alors maximale la section optique est la plus fine possible. En fermant plus le pinhole, on collecte moins de lumière sans gagner en résolution. En ouvrant plus le pinhole, on perd en résolution axiale mais on collecte plus de lumière. Dans certains cas il est e utile d’augmenter l’épaisseur de la coupe optique. L’ouverture du pinhole est affichée en mm. [3] Amplification du photomultiplicateur (Gain) Le gain contrôle directement le voltage traversant le PMT. Il permet de contrôler l’intensité du signal détectée. détec En augmentant le gain, on augmente aussi le bruit de fond, il est conseillé de ne pas dépasser les 1400 V [4] L’offset permet de fixer le 0 de la détection. détection 5 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Il défini une valeur d’intensité en dessous duquel on la considère comme nulle. Ce réglage intervient avant la numérisation du signal, il ne s’agit donc pas d’un seuillage qui tronque la dynamique (c'est-à-dire qui ne conserve que les niveaux de gris supérieurs au seuil) mais qui la décale. L’offset et le gain doivent êtres réglés conjointement. Autres paramètres - Vitesse d’acquisition [5] La vitesse de balayage définit le temps d’exposition de chaque pixel et donc la quantité de fluorescence captée. En diminuant cette vitesse, on augmente le photobleaching (effet similaire à l’augmentation de la puissance du laser) Il y a deux vitesses possibles sur ce microscope, quand on utilise la vitesse rapide il n’est pas nécessaire d’augmenter le gain car un étage d’amplification supplémentaire est mis en service. Au final, on observe que le ratio signal/bruit est considérablement meilleur avec un balayage lent. Echantillonnage et résolution L’échantillonnage et la résolution sont deux notions différentes : - La résolution est une caractèristique du système optique, elle correspond à la plus petite distance permettant de séparer deux points, elle dépend de l’ouverture numérique de l’objectif et non de son grossissement. Il est toujours possible d’agrandir une image mais la limite résolutive empêche de rendre visibles des détails plus fins, on grossit du flou. - L’échantillonnage est la taille des pixels collectés, elle dépend du grandissement de l’objectif, du zoom et du nombre de pixels. Conséquences : - Un sous échantillonnage masque les détails fins pourtant accessibles. - Un suréchantillonnage entraine inutilement une acquisition plus lourde (lenteur, photobleaching, phototoxicité, fichiers plus volumineux) - Le choix de l’objectif ne doit pas être fait selon son grandissement mais selon son ouverture numérique. C’est pourquoi on ne trouve jamais d’objectif 100x sur un microscope confocal, les forts grossissements se font grâce au zoom confocal. Le choix d’un objectif de forte ouverture numérique permet non seulement une meilleure résolution mais aussi une détection plus sensible (plus de lumière est collectée) Sur ce système, choisissez toujours l’objectif 40x 1.30 à huile - Echantillonnage [6] On choisit ici le nombre de points (pixels) mesurés sur la surface balayée. Plus l’échantillonnage est grand plus le temps d’acquisition sera long. - Zoom [7] Le zoom confocal consiste à diminuer la surface balayée en conservant le même nombre de pixels, ce qui correspond à une hausse de l’échantillonnage (diminution de la taille des pixels). Vous pouvez déplacer la zone de zoom avec les flèches bleues. - Scan multiples [8] .Direct: Il s’agit du mode « live » le balayage continue jusqu'à ce que vous le stoppiez. .Kalman: Ce mode permet de faire des moyennes sur plusieurs passages. Le nombre d’expositions est à entrer dans la case N, en choisissant STOP, l’accumulation d’images à moyenner continue jusqu'à ce que vous stoppez le balayage. Cette fonction améliore le signal/bruit et augmente le photobleaching mais moins qu’en diminuant la vitesse de balayage (les fluorophores ont le temps de se relaxer entre chaque passage) .Accumulate : Principe identique au Kalman sauf qu’il s’agit d’une somme et non d’une moyenne, cette fonction est à utiliser pour des signaux extrêmement faibles. 6 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ .Peack : Conserve la valeur maximale de chaque pixel sur les différentes expositions, cette fonction est rarement utile. - Objective [9] Indiquez l’objectif que vous utilisez, ce paramètre sera utilisé pour optimiser l’ouverture du pinhole. Il permet aussi de déterminer l’échelle de l’image mais nous ne garantissons pas que la calibration soit correcte. Processus d’acquisition - Pour gagner du temps et éviter de bleacher votre échantillon pendant les réglages, scannez en mode direct [8] vitesse rapide [5] et à échantillonnage faible [6]. En mode simultané, pensez à couper les raies laser des autres canaux. - Essayez d’abord avec une puissance de laser faible (10%) - Commencez avec un pinhole à une unité d’Airy (cliquez sur Target Iris [10]) si votre projet ne demande pas de coupe optique épaisse. - Lancez le scan [B] - Montez le gain pour voir votre échantillon. - Ajustez le focus, trouvez une zone d’intérêt, ajustez le zoom. - Ajustez l’offset de façon à avoir quelques pixels verts (pixels nuls) - Réajustez le gain pour être à la limite de la saturation (pixels rouges), veuillez à ce qu’il n’y ait aucun pixel saturé si vous utilisez vos images pour de l’analyse quantitative. Si le signal est trop faible pour avoir une dynamique et un rapport signal/bruit satisfaisant, augmentez la puissance du laser. Si le signal bleache trop vite vous en pouvez pas exciter fortement avec le laser, vous êtes alors obligés d’ouvrir le pinhole pour gagner en intensité et en S/B au détriment de la résolution et de l’épaisseur de la coupe optique pensez qu’au-delà de 3 unités d’Airy, il n’y a presque plus d’effet confocal. Si votre projet ne nécessite pas de section fine, n’hésitez pas à ouvrir le pinhole, toutefois utilisez la même ouverture de pinhole pour tous les échantillons que vous voulez comparer. Si l’échantillon bleache de trop pendant que vous paramétrez le microscope, changez de champ d’observation ! - Une fois que vous avez une image correcte, passez sur un balayage lent (il se peut que vous ayez alors à retoucher le gain et l’offset) - Augmentez l’échantillonnage (1024*1024) Lorsque vous modifiez le zoom et l’échantillonnage, il est préférable de stopper le scan pour réduire le risque de plantage de l’ordinateur. -Vous pouvez ensuite faire une moyenne sur plusieurs passages (Kalman [8]) pour faire l’image que vous enregistrerez Image confocale en acquisition simultanée Si vous utilisez un mode simultané, vous imagez tout les canaux en même temps. En conséquence, la puissance du laser sera la même pour les deux canaux, tenez en compte lors des réglages. En simultané il y a un risque important de recouvrement spectral à l’émission, c'est-à-dire qu’une partie de la fluorescence verte sera captée dans le canal rouge. Pour corriger cette « fuite », le logiciel permet de faire de la compensation de fluorescence (voir en annexe). Ce mode est utile pour imager des objets en mouvement car il ne présente pas de décalage temporel entre les deux canaux et est plus rapide. Image confocale en acquisition séquentielle En mode séquentiel, les canaux sont imagés les uns après les autres ce qui supprime le problème du recouvrement spectral d’émission, il est à utiliser dans la majeure partie des cas. 7 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ - Dans channels, sélectionnez le canal de travail L’icône lance un scan dans ce canal (une seule raie laser est active) L’icône lance le scan successif de tous les canaux. Sauvegarde et récupération de données - Sauvegarde Pour sauvegarder l’image affichée , allez dans le menu file/save… ou cliquez sur XXCNX. Les images doivent obligatoirement être enregistrées dans le répertoire D :Experiments Créez un dossier à votre nom dans ce répertoire (avec windows). Tout les fichiers inconnus ou mal placés serons effacés. - Récupération L’ordinateur est dépourvu de sorties USB, vous devez transférer les fichiers via le réseau sur la station de travail Offline 1. - Allumez offline 1 et démarrez une session (ID :piq PWD:biorqd) - Sur l’ordinateur du confocal ouvrez le dossier de partage Offline 1, identifiez vous comme piq le mot de passe est biorad - Recopiez vos fichiers dans une répertoire a votre nom dans Partage/PIQ users - Vous pouvez récupérer vos fichiers sur la station Offline 1 avec une clé USB depuis le répertoire D:Partage/PIQ users - Effacez les données de l’ordinateur du confocal - Format des images Dans le dossier créé par le logiciel, les images sont au format .pic qui est reconnu par la pluspart des logiciels de traitement d’images. Pour une image 2D, les différents canaux sont enrigistrés dans le même fichier. Pour le simages 3D, un stack est crée par canal. 8 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ 3ème partie Fonction A) avancées Faire une image tridimensionnelle - Pour faire un stack 3 D vous devez utiliser le moteur du focus, cliquez sur On pour l’activer. Ne modifiez pas le focus manuellement tant que le moteur est en marche pour ne pas le forcer, cliquez sur Off avant de toucher aux molettes de focus. - Déplacez le focus avec les flêches de Position, le pas du déplacement peut être ajusté dans Step. - Quand vous arrivez à la limite haute du volume à imager, cliquez sur Start pour l’enregistrer. - Déplacez vous ensuite jusqu'à la position basse et cliquez sur Stop. Middle, replace automatiquement le focus au mileu du stack. - Cliquez sur l’icône - Dans l’onglet Focus Motor, cochez Enabled. - Entrez l’espace entre chaque coupe dans Step. Le nombre de coupes est indiqué dans Sections (Total Images tient compte des canaux) - Cliquez sur Start pour lancer l’acquisition du stack. Pour faire une bonne reconstruction 3D, ils ne doit pas y avoir d’espace vides entre les plans de coupes, ceux-ci ne doivent pas non plus trop se superposer (suréchantillonnage) Selon le principe d’échantillonnage de Shannon Nyquist, chaque plan doit superposer de moitié celui qui le précède. Sur les confocaux rescents, il est possible d’ajuster automatiquement le pas en fonction du pinhole, d’après le calcul de l’épaisseur de la section. LaserSharp ne propose pas cette option, il faut régler le pas à l’œil, il doit être de l’ordre de 0.300µM pour un pinhole de 1. 9 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ B) Faire une image en lumière transmise Principe Dans Channel,, il s’agit du PMT nommé Trans 1.. Il est situé au dessus du condenseur, devant la lampe halogène. Pour l’utiliser, on inverse le trajet optique : on illumine l’échantillon avec le laser par l’objectif (qui joue le rôle de condenseur) ett le condenseur projette l’image sur le PMT Trans (il joue le rôle d’objectif) Alignement du condenseur Basculez le miroir du condenseur vers la gauche (voir le schéma au début de ce manuel) et vérifiez que la platine de contraste est bien sur la position « A » (voir [1] ci-dessous) [1]Platine de contraste [2]Diaphragme de champ [3]Focus du condenseur [4]Molettes de centrage [5]Diaphragme d'ouverture a) Faites la mise au point sur un échantillon et fermez ensuite au maximum le diaphragme de champ [2] b) Réglez le focus du condenseur [3] afin de voir les bords du diaphragme de champ net. c) Centrez le diaphragme de champ avec les molettes de centrage [4]. d) Rouvrez le diaphragme de champ [2] pour ajuster la zone d'illumination au champ d'observation. Le diaphragme d'ouverture Le diaphragme d’ouverture est l’équivalent de l’ouverture numérique de l’objectif. On l’ouvrant on augmente la résolution l’intensité de lumière receuillie. En le fermant, on augmente la profondeur de champs et le contraste (le focus est plus facile à faire) 10 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ C) La compensation de fluorescence Il arrive souvent qu’il y ait un recouvrement spectral de l’émission des différentes sondes fluorescentes. Dans ce cas, une partie du signal collecté dans un canal viens de l’autre fluorophore (en acquisiton simultanée) On peut corriger cette « fuite » par la compensation de fluorescence. Elle consite a illuminer une seule sonde et à regarder les deux cannaux, l’image dans le bon canal est ensuite soustraite à l’image dans le second canal dans la proportion nécessaire pour y avoir un signal nul. Méthode : - Une fois les canaux paramètrés, coupez la lumière d’excitation du canal à compenser - Cliquez sur - Sélectionnez le canal à corriger (Onglets Pane) - Laissez le Mixer Mode sur PMT. - Dans Photo Multiplier Tube,, activez les PMT à mixer. Le PMT correspondant à ce canal doit être à 100% - Lancez un scan continu - Attribuez une valeur négative au PMT du canal illuminé jusqu'à ce que l’image du canal corrigé soit nulle. Faites attention à ne pas trop pousser la correction, sinon vous retirez du signal là où il n’y a pas lieu. L’image du canal illuminé ne doit pas appaître « en négatif » c'est-à-dire en pixels verts. Compensation excessive Compensation correcte 11 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Annexe 1 Qualité de l'image Les critères de qualité de l'image sont: - La résolution (dont la résolution axiale) - Le contraste, la dynamique (répartition des niveaux de gris) doit être exploitée au maximum. - Le rapport signal sur bruit. - Le photoblanchissement. Les priorités de ces critères sont très différentes selon le type d'image et de traitement post acquisition. Paramètre Gain des photomultiplicateurs Effet (de l'augmentation) Il augmente le signal mais génère du bruit. Evitez d'aller au-delà de 1300V Permet de baisser le bruit de fond donnant une valeur nulle aux pixels d'une intensité inférieure à un seuil en conservant l'étendue de la dynamique. Améliore le rapport signal sur bruit. Puissance du laser Accélère le photobleaching. Diminue le photoblanchiment Vitesse de scan Augmente le bruit et diminue l'intensité (baisse de la dynamique) La qualité de la résolution se fait au détriment du temps d'acquisition et du Echantillonnage photobleaching. Baisse de la résolution, en particulier sur Z (diminution de la réjection du signal) Ouverture du pinhole Augmente considérablement le signal. Diminue la surface de balayage en conservant le même nombre de pixel. Zoom Augmente l’échantillonnage et le photobleaching. Améliore le rapport signal sur bruit. Moyenne Augmente le temps d'acquisition et le photobleaching. Offset Quelques pistes: ► Pour une image de présentation (observation "simple"): - Saturer légèrement l'image pour exploiter toute la dynamique. - Chercher une résolution maximale. - Moyenner plusieurs images s'il n'y a pas d'éléments mobiles. ► Pour une mesure quantitative (collocalisation…) ou une image destinée à la déconvolution : - L’image ne doit présenter aucun pixel saturé - Adapter la résolution à l'échelle des structures observées. - Préférer une acquisition séquentielle pour être sûr que les émissions des différents marqueurs n'interfèrent pas. ► Pour une image 3D - Adapter l'ouverture du pinhole à l'épaisseur des coupes - Limiter le photobleaching, il se produit sur toute l'épaisseur de l'échantillon bien que l'on observe qu'une coupe optique. ► Pour un time lapse - Selon la dynamique du phénomène observé, la vitesse peut être primordiale. - Limiter le photobleaching 12 Plateforme d'Imagere Quantitative http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Annexe 2 Résumé des caractéristiques du système Statif : Olympus Eclipse TE 300 , Lampe Xe 100W Laser : Ar/Kr 15mW 488,568, et 647 nM Objectifs : 10x0.3 Air Plan Fluo DIC L 20x0.75 Water,Glycerol Plan Fluor Mmlm 40x 1.30 Oil Plan Fluor DIC H 60x1.20 Water Plan Apo Wl Tête confocale : Biorad MRC 1024 Détecteurs : 2 PMT pour l’imagerie confocale et 1 PMT pour la transmission Domaines de détection - Configuration classique (filtres installés par défaut) : Canal 1 : 585- ++ Canal 2 : 505-540nM - Des filtres pour du FRET sur le couple CFP/YFP sont également disponibles. Contacter le PIQ La réservation des instruments sur ActivPlaning est obligatoire: http://activplanning.u-strasbg.fr/ En cas de problème, pour toute demande de formation ou de projet, adressez vous à l’ingénieur du plateau : Romain Vauchelles: 0368854298 [email protected] Site du plateau d’imagerie quantitative: http://imageriepiq.u-strasbg.fr/ Responsables scientifiques: Philippe Rondé: 0368854184 Jan De Mey : 0368854290 13
