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ÉCOLE NATIONALE VÉTÉRINAIRE D’ALFORT
Année 2015
CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE DU GÈNE
Hacd1 DANS LA RÉTINE CHEZ LA SOURIS
THÈSE
Pour le
DOCTORAT VÉTÉRINAIRE
Présentée et soutenue publiquement devant
LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE CRÉTEIL
Le 28 octobre 2015
par
Marion Cécile Fanny DAVIDSON
Née le 08 juillet 1990 à Paris 14ème
JURY
Président : Pr. Eric SOUIED
Professeur à la Faculté de Médecine de CRÉTEIL
Membres
Directeur : Dr Fanny PILOT-STORCK
Maître de conférences à l’ENVA
Assesseur : Dr Sabine CHAHORY
Maître de conférences à l’ENVA
REMERCIEMENTS
Au Pr. Éric SOUIED, Président de thèse
Professeur à l’Université de Créteil et chef du service d'Ophtalmologie à l'Hôpital
Intercommunal de Créteil, qui nous a fait le très grand honneur d’accepter la
présidence de notre jury de thèse.
Hommage respectueux.
À Madame Fanny PILOT-STORCK, Directrice de thèse
Maître de conférences à l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort, qui m’a proposé ce sujet
de thèse, et qui m’a fait l’honneur de superviser l’étude expérimentale et la thèse dans
son ensemble.
Merci pour votre gentillesse, votre enthousiasme, votre disponibilité et votre soutien.
A Madame Sabine CHAHORY, Assesseur de thèse
Maître de conférences à l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort et chef du service
d’Ophtalmologie du CHUVA, qui a accepté de faire partie de mon jury de thèse et de
m’aider pour la correction du manuscrit.
Sincères remerciements
À toute l’équipe du laboratoire de Génétique Fonctionnelle et Médicale de
l’ENVA pour votre accueil chaleureux. Un grand merci à M. Laurent TIRET et Mme
Marie ABITBOL qui m’ont régulièrement conseillée dans mon travail et à Mme
Stéphanie GADIN et M. Laurent GUILLAUD qui ont pris part à certaines
expérimentations. Merci également aux étudiants stagiaires dans le laboratoire, en
particulier à Michaël MARTINEAU qui a participé à l’analyse des clichés de rétine.
À toute l’équipe de l’unité d’Anatomie Pathologique de l’ENVA et, en particulier, à
Mme Sophie CHATEAU-JOUBERT et M. Jean-Luc SERVELY, qui ont joué un rôle
essentiel dans la préparation des coupes de rétine et la réalisation des clichés
nécessaires à l’analyse morphométrique fine. Hommage respectueux.
Au Pr. Isabelle RANCHON-COLE et à Mme Claire SZCZEPANIAK, employées de
l’Université d’Auvergne, ainsi qu’à l’équipe du Pr. ANDERSON qui nous ont
respectivement épaulés dans la réalisation des électrorétinogrammes, des
observations en microscopie électronique à transmission et pour les analyses
lipidiques.
À mes parents, qui m’ont appris à vivre mes rêves, à prendre confiance en moi et qui
ont toujours fait preuve d’un soutien inconditionnel. Je vous aime fort !
À ma petite sœur Camille’Ours, pour nos grands fous rires et nos petites querelles.
Je suis extrêmement fière de toi et je serai toujours là pour toi. J’espère qu’on restera
toujours aussi proches malgré les kilomètres et les océans qui nous séparent parfois!
À François D’OLIVEIRA, merci d’avoir été à mes côtés ces 10 dernières années et
d’avoir toujours su me redonner le sourire dans les moments difficiles. Désolée de ne
pas pouvoir te consacrer beaucoup de temps cette année mais promis on se rattrapera
au plus vite.
À mes grands parents, qui m’ont appris des valeurs essentielles comme le courage, la
détermination, la rigueur et le travail. Vous nous avez quittés trop tôt mais nous
pensons encore à vous très fort ! Je ferai toujours de mon mieux pour que vous soyez
fiers de moi.
À mon groupe de clinique : Marie, Alexane, Fiona, Marjolaine, pour toutes nos
rigolades et ces moments inoubliables passés ensemble au Chuva. Vivement les
prochaines soirées entre filles !
À ma coloc Sarah et à David, merci de m’avoir supportée pendant une année et de
nous avoir préparé des topos malgré vos emplois du temps déjà bien chargés. Les
soirées Sushi, reines du shopping et mousse au chocolat me manquent déjà !
À Alex, parce que les mamans ont toujours raison et que je tiens énormément à notre
amitié. Grâce à toi ces deux années de prépa sont passées très vite et les bons
souvenirs se bousculent (Patatoïde, Bourriquet, Satan, les schémas de bio…).
Dommage que tu sois remonté dans le Nord, je te jure qu’il y en a aussi des vaches à
soigner sur Paris !
À mes amis : Juliette, Solène, Bertille, et aux amateurs de Licorne (Sandrine, Olivier,
Alexandre, Claire, Sadim, Alexis et Geoffrey) pour tous les bons moments passés
ensemble et ceux à venir.
À ma poulotte Émilie et Adrien, merci de vous être toujours aussi bien occupé de JiJi.
Émilie sache que je serai toujours là pour te guider et te conseiller.
À Inès BARTHELEMY, à Marie PONS ainsi qu’à Alix BARBARINO, merci pour votre
bonne humeur contagieuse. Ce fut un réel plaisir de travailler avec vous et je vous suis
très reconnaissante de m’avoir soutenue et encouragée au cours de ma formation
vétérinaire.
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES ---------------------------------------------------------------- 9
LISTE DES TABLEAUX ----------------------------------------------------------- 11
LISTE DES ANNEXES ------------------------------------------------------------- 12
LISTE DES ABRÉVIATIONS ----------------------------------------------------- 13
INTRODUCTION ------------------------------------------------------------------ 19
PARTIE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ------------------------------------- 21
I. Structure, fonction et évaluation de la rétine -------------------------------23
1.
Introduction sur l’œil et la rétine------------------------------------------------------------------ 23
2.
Histologie de la rétine -------------------------------------------------------------------------------- 26
a. La rétine, une extension du système nerveux central ------------------------------------- 26
b. La rétine, un tissu stratifié ----------------------------------------------------------------------- 27
c. Les caractéristiques histologiques des photorécepteurs, cellules sensorielles de la
rétine ------------------------------------------------------------------------------------------------- 29
3.
Fonctionnement de la rétine ----------------------------------------------------------------------- 32
a. La réception du signal lumineux et la transmission de l’information au cortex visuel
--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
b. La rétine, un système complexe d’intégration de l’information ------------------------ 34
4.
Évaluation clinique de la rétine chez la Souris ------------------------------------------------- 36
a. Observation de l’animal à distance - évaluation fonctionnelle de la vision ---------- 37
i. Test du labyrinthe, maze based test et ses dérivés ------------------------------------------------ 37
ii. L’Actimétrie -------------------------------------------------------------------------------------------------- 38
iii. Réflexion sur la sensibilité et la spécificité des tests du labyrinthe et d’actimétrie et
facteurs de confusion -------------------------------------------------------------------------------------- 38
iv. Placer visuel -------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
v. Test de la boule de coton ou du mouvement conjugué des yeux ------------------------------ 40
[1]
b. Réflexes photomoteurs -------------------------------------------------------------------------- 41
c. Évaluation des structures oculaires ----------------------------------------------------------- 42
i. Évaluation de la transparence du segment antérieur, reflet du fond d’œil ----------------- 42
ii. Examen du fond d’œil ------------------------------------------------------------------------------------- 42
d. Électrorétinogramme ----------------------------------------------------------------------------- 46
i. Description d’un protocole chez la Souris ------------------------------------------------------------ 47
ii. Spécificités des électrorétinogrammes chez la Souris --------------------------------------------- 53
iii. Grille de lecture d’un électrorétinogramme chez la Souris -------------------------------------- 53
iv. Paramètres mesurables sur les tracés d’électrorétinogramme chez la Souris-------------- 56
v. Origine des variations observables dans les tracés d’électrorétinogramme ---------------- 58
5.
La Souris, modèle d’étude des dégénérescences rétiniennes------------------------------ 60
a. Les différents types de dégénérescence rétinienne --------------------------------------- 60
b. Caractéristiques cliniques et histologiques des dégénérescences rétiniennes ------ 62
II. Les Acides Gras À Très Longue Chaîne dans la rétine ----------------------65
1.
Nomenclature des acides gras --------------------------------------------------------------------- 65
2.
Synthèse des Very Long Chain Fatty Acids et des Ultra Long Chain PolyUnsaturated
Fatty Acids----------------------------------------------------------------------------------------------- 67
3.
Rôles des Very Long Chain Fatty Acids et des Ultra Long Chain-PolyUnsaturated
Fatty Acids à l’échelle cellulaire ------------------------------------------------------------------- 70
a. Le rôle des sphingolipides comportant des Very Long Chain Fatty Acids ------------- 70
b. Le rôle des Ultra Long Chain Fatty Acids dans la plasticité des membranes
cellulaires -------------------------------------------------------------------------------------------- 72
c. Les Ultra Long Chain Fatty Acids dans les sécrétions des glandes de Méibomius -- 73
d. Rôles spécifiques des Very Long Chain Fatty Acids polyinsaturés ---------------------- 75
4.
Rôle des Very Long Chaîn Fatty Acids et Ultra Long Chaîn Fatty Acids à l’échelle de
l’organisme---------------------------------------------------------------------------------------------- 76
a. Effet de l’inactivation du gène Kar chez la Souris ------------------------------------------ 76
b. Effet de l’inactivation des gènes Elovl chez la Souris -------------------------------------- 77
c. Effet d’une mutation du gène Ter-------------------------------------------------------------- 79
d. Effet d’une mutation du gène Hacd1 --------------------------------------------------------- 79
5.
Composition et rôles des Ultra Long Chain Poly-Unsaturated Fatty Acids dans la
rétine ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 80
a. Distribution des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids dans la rétine ----- 80
b. Le rôle des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids dans la rétine ------------ 80
[2]
i. La maladie de Stargardt 3 chez l’Homme ------------------------------------------------------------ 80
ii. Étude d’Elovl4 chez la Souris ----------------------------------------------------------------------------- 81
iii. Conclusion sur le rôle des ULC-PUFA dans la rétine ----------------------------------------------- 85
c. Évolution des concentrations en Ultra Long Chain Poly-Unsaturated Fatty Acids
dans la rétine avec l’âge -------------------------------------------------------------------------- 86
III. HACD1 et la synthèse des Acides Gras À Très longue chaîne -----------87
1.
Une mutation dans le gène HACD1 à l’origine d’une myopathie chez des Labradors -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
a. Historique de la découverte du gène --------------------------------------------------------- 87
i. Étude phénotypique d’une colonie expérimentale de Labradors myopathes --------------- 87
ii. Étude génétique, la découverte d’une mutation dans le gène PTPLA/HACD1 -------------- 88
b. Conséquences de la mutation sur le profil de transcription du gène ------------------ 89
c. La fonction enzymatique de HACD1 ----------------------------------------------------------- 91
2.
Une mutation du gène HACD1 à l’origine d’une myopathie chez l’Homme------------ 92
3.
La Souris, modèle fonctionnel dans l’étude du gène Hacd1-------------------------------- 93
a. La Souris, un bon modèle d’étude expérimental ------------------------------------------- 93
b. Obtention de souris mutantes pour le gène Hacd1---------------------------------------- 94
4.
Expression tissulaire des gènes Hacd------------------------------------------------------------- 97
IV. Étude préliminaire de l’expression et du rôle du gène Hacd1 dans la
rétine-------------------------------------------------------------------------------------99
1.
Évaluation de l’expression du gène Hacd1------------------------------------------------------ 99
a. Techniques utilisées ------------------------------------------------------------------------------- 99
b. Résultats obtenus avec la coloration X-Gal ------------------------------------------------ 101
c. Résultats obtenus grâce à la technique de RT-PCR -------------------------------------- 103
2.
Examen histologique des yeux ------------------------------------------------------------------- 103
a. Techniques utilisées ----------------------------------------------------------------------------- 103
b. Comparaison des structures histologiques entre Souris contrôle et mutantes --- 104
3.
Évaluation électrophysiologique du fonctionnement de la rétine---------------------- 105
a. Techniques utilisées ----------------------------------------------------------------------------- 105
b. Résultats des électrorétinogrammes -------------------------------------------------------- 106
4.
Discussion à partir de ces résultats préliminaires ------------------------------------------- 108
[3]
PARTIE 2 : POURSUITE DE LA CARACTÉRISATION DU RÔLE DU GÈNE
HACD1 DANS LA RÉTINE ----------------------------------------------------- 109
I. Introduction-------------------------------------------------------------------------- 109
a. Hypothèses d’étude ----------------------------------------------------------------------------- 109
b. Description des quatre axes d’étude -------------------------------------------------------- 110
c. Implication personnelle :----------------------------------------------------------------------- 112
II. Matériel et méthodes ------------------------------------------------------------- 113
1.
Description des lots d’animaux utilisés -------------------------------------------------------- 113
2.
Étude clinique et fonctionnelle de la rétine des Souris ------------------------------------ 116
a. Examen ophtalmologique des souris - examen du fond d’œil ------------------------ 116
b. Étude fonctionnelle de la rétine par électrorétinographie ----------------------------- 117
i. Souris incluses dans l’étude et critère d’exclusion ----------------------------------------------- 117
ii. Préparation des souris----------------------------------------------------------------------------------- 117
iii. Mise en place des souris -------------------------------------------------------------------------------- 118
iv. Protocole de stimulation lumineuse pour les électrorétinogrammes-flash --------------- 118
v. Traitement des données -------------------------------------------------------------------------------- 119
3.
Prélèvement et fixation des yeux --------------------------------------------------------------- 119
a. Technique de prélèvement des yeux -------------------------------------------------------- 119
b. Fixations des yeux ------------------------------------------------------------------------------- 120
i. Fixation par formadhéhyde ---------------------------------------------------------------------------- 120
ii. Fixation par milieu de Davidson ou Excalibur ----------------------------------------------------- 121
iii. Congélation en isopentane ----------------------------------------------------------------------------- 121
4.
Préparation des coupes ---------------------------------------------------------------------------- 122
a. Réalisation des coupes au microtome ------------------------------------------------------ 122
i. Paraffinage ------------------------------------------------------------------------------------------------- 122
ii. Coloration à l’Hémalun-Éosine-Safran -------------------------------------------------------------- 122
iii. Préparation de coupes fixées au formaldéhyde pour immunofluorescence ou hybridation
in situ --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 123
iv. Coupes au cryostat en vu des hybridations in situ ----------------------------------------------- 123
5.
Analyse morphométrique de la structure des rétines de souris ------------------------ 124
a. Photographies des coupes colorées à l’Hémalun-Éosine-Safran --------------------- 124
b. Mesures morphométriques réalisées à partir des clichés de rétine ----------------- 126
i. Observation des clichés d’œil entier – repérage des artéfacts et des lésions ------------- 126
[4]
ii. Mesures réalisées à partir des clichés au grossissement 20 ----------------------------------- 129
iii. Mesures réalisées à partir des clichés au grossissement 40 ----------------------------------- 130
c. Étude statistique --------------------------------------------------------------------------------- 131
6.
Marquages par immunofluorescence ---------------------------------------------------------- 131
a. Protocole général -------------------------------------------------------------------------------- 132
b. Les anticorps utilisés ---------------------------------------------------------------------------- 132
i. Étude de la structure histologique des synapses à ruban de la rétine avec un anticorps
anti-CtBP2 --------------------------------------------------------------------------------------------------- 132
ii. Étude de la structure histologique des segments externes des photorécepteurs avec un
anticorps anti-rhodopsine ------------------------------------------------------------------------------ 133
iii. Marquage indirect de l’expression du gène Hacd1 à l’aide d’un anticorps anti-β-Gal - 133
iv. Double immunofluorescence afin d’identifier les cellules exprimant le gène Hacd1 --- 134
c. Observation des coupes et prise de clichés------------------------------------------------ 134
7.
Hybridation in situ : marquage direct de l’expression du gène Hacd1 ---------------- 136
a. Préparation de l’hybridation in situ – Synthèse des sondes acides ribonucléiques
marquées par la digoxigénine ---------------------------------------------------------------- 137
i. Choix des sondes ------------------------------------------------------------------------------------------ 137
ii. Synthèse des précurseurs acides désoxyribonucléiques des sondes par réaction de
polymérisation en chaîne) ------------------------------------------------------------------------------ 137
iii. Synthèse des sondes acides ribonucléiques marquées par digoxigénine ------------------ 139
b. Protocole d’hybridation in situ --------------------------------------------------------------- 140
8.
Observation des rétines par microscopie électronique ----------------------------------- 141
9.
Analyse de la composition lipidique des rétines et des sécrétions des glandes de
Méibomius -------------------------------------------------------------------------------------------- 142
III. Résultats et Discussion ----------------------------------------------------------- 145
1.
Étude clinique et fonctionnelle de la rétine des souris mutées pour le gène Hacd1-------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 145
a. Résultats de l’examen ophtalmologique --------------------------------------------------- 145
i. Observation de la cornée et des structures intraoculaires autres que la rétine ---------- 145
ii. Observation du fond d’œil------------------------------------------------------------------------------ 147
b. Discussion concernant l’examen ophtalmologique -------------------------------------- 148
i. Aspects techniques --------------------------------------------------------------------------------------- 148
ii. Bilan des observations de la cornée et du fond d’œil ------------------------------------------- 149
c. Résultats de l’étude fonctionnelle de la rétine par électrorétinographie ---------- 150
i. Résultats de l’étude des électrorétinogrammes Flash ------------------------------------------ 150
[5]
ii. Résultats de l’étude des potentiels oscillatoires -------------------------------------------------- 151
d. Discussion concernant l’évaluation fonctionnelle de la rétine : comparaison du
protocole et des résultats entre notre étude et l’étude préliminaire --------------- 152
i. Comparaison de l’aspect des tracés des électrorétinogrammes ----------------------------- 152
ii. Comparaison des protocoles employés ------------------------------------------------------------- 156
2.
Analyse structurale des rétines de souris ----------------------------------------------------- 160
a. Analyse morphométrique : observation des clichés d’œil entier de coupes colorées
à l’Hémalun-Éosine-Safran -------------------------------------------------------------------- 160
i. Résultats de l’analyse morphométrique globale ------------------------------------------------- 160
ii. Discussion sur la pertinence des critères de distinction entre artéfacts et lésions réelles ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 162
b. Analyse morphométrique fine des coupes colorées à l’Hémalun-Éosine-Safran - 163
i. Résultats de l’analyse morphométrique fine ------------------------------------------------------ 163
ii. Aspect technique------------------------------------------------------------------------------------------ 165
c. Bilan concernant les analyses morphométriques :--------------------------------------- 165
d. Observation des rétines au microscope électronique à transmission --------------- 167
i. Atlas de cliché de microscopie électronique à transmission----------------------------------- 167
ii. Discussion – aspects techniques ---------------------------------------------------------------------- 170
e. Analyse structurale par immunofluorescence -------------------------------------------- 173
i. Résultats des différents marquages par immunofluorescence ------------------------------- 173
ii. Discussion - Comparaison des rétines suite aux marquages par immunofluorescence 174
3.
Étude de l’expression du gène Hacd1 dans la rétine de Souris -------------------------- 176
a. Marquage indirect de l’expression du gène Hacd1 par immunofluorescence --- 176
b. Marquage direct de l’expression de Hacd1 par hybridation in situ ------------------ 179
i. Hybridation in situ sur coupes congelées en isopentane --------------------------------------- 179
ii. Hybridations in situ sur coupe fixées par formaldéhyde --------------------------------------- 179
4.
Analyse de la composition lipidique des rétines -------------------------------------------- 183
iii. Discussion concernant les aspects techniques de l’analyse lipidique ----------------------- 185
CONCLUSION ET PERSPECTIVES ------------------------------------------- 187
1.
Bilan de nos quatre études ----------------------------------------------------------------------- 187
a. Bilan des analyses cliniques et fonctionnelles -------------------------------------------- 187
b. Bilan de l’analyse structurale des rétines -------------------------------------------------- 189
c. Bilan de l’analyse de l’expression du gène Hacd1 ---------------------------------------- 189
d. Bilan des analyses lipidiques ------------------------------------------------------------------ 189
2.
Perspectives ------------------------------------------------------------------------------------------ 190
[6]
a. Observation de la vascularisation rétinienne --------------------------------------------- 190
b. Dosage de la rhodopsine ----------------------------------------------------------------------- 191
c. Dark adaptometry ------------------------------------------------------------------------------- 192
BIBLIOGRAPHIE ---------------------------------------------------------------- 193
[7]
[8]
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Organisation de l'œil en 3 tuniques. Représentation schématique et coupe histologique
correspondante ........................................................................................................................25
Figure 2 : Représentation schématique des différentes couches de la rétine et comparaison avec
une coupe histologique de la rétine colorée à l'Hémalun-Éosine-Safran. ......................................28
Figure 3 : Représentation schématique (A) et illustration histologique (B) des photorécepteurs. ...30
Figure 4 : Illustration de la notion de rétine inversée ...................................................................32
Figure 5 : Représentation schématique de la cascade de signalisation intervenant lors de la
phototransduction au niveau d'un bâtonnet. ..............................................................................34
Figure 6 : Illustration de l'ophtalmoscopie directe (A) et indirecte (B). ..........................................44
Figure 7 : Photographie d'un fond d'œil normal de souris C56Bl/6J observé à l'ophtalmoscope
indirect. ....................................................................................................................................45
Figure 8 : Matériel utilisé pour la réalisation d'un électrorétinogramme. ......................................50
Figure 9 : Origine des 3 ondes visibles sur l'électrorétinogramme de Souris. .................................54
Figure 10 : Les 3 composantes de l'électrorétinogramme de Ganzfeld d’une souris C57Bl/6J et leurs
mesures ...................................................................................................................................56
Figure 11 : Illustration des paramètres mesurables à partir d'un électrorétinogramme obtenu en
condition scotopiques . .............................................................................................................57
Figure 12 : Caractérisation des dégénérescences rétiniennes chez la Souris . ................................64
Figure 13 : Exemples de deux acides gras à très longue chaîne polyinsaturés de la famille des ω6,
l’acide arachidonique, et des ω3, l’acide docosahexanoïque. .......................................................66
Figure 14 : Cycle d'élongation des acides gras à très longue chaîne chez les mammifères . ............67
Figure 15 : Voies d'élongation des acides gras à très longue chaîne chez l'Homme. .......................69
Figure 16 : Structure des sphingolipides. ....................................................................................70
Figure 17 : Métabolisme des sphingolipides ...............................................................................71
Figure 18 : Modèles de fortes courbures membranaires favorisées par la présence d’acides gras à
ultra longue chaîne asymétriques ..............................................................................................72
Figure 19 : Anatomie de la paupière supérieure. .........................................................................74
Figure 20 : Le gène PTPLA/HACD1 (A), ses transcripts (B) et l'allèle muté (C) dans la myopathie
centronucléaire du Labrador. ....................................................................................................89
Figure 21 : Représentations schématiques des transcrits du gène HACD1 dans le muscle
squelettique avec et sans mutation. ..........................................................................................90
[9]
Figure 22 : Configuration du locus Hacd1 après événement de recombinaison homologue ...........96
Figure 23 : Expression du gène Hacd1 dans l'œil chez la Souris .................................................. 102
Figure 24 : Analyse structurale en l'absence de Hacd1 dans l'œil des souris Hacd1-KO . .............. 104
Figure 25 : Diminution de la fonction rétinienne en l'absence de Hacd1 .................................... 107
Figure 26 : Illustration du protocole appliqué lors de la réalisation des clichés des coupes d’œil
colorées en vu de l’analyse morphométrique............................................................................ 125
Figure 27 : L’observation des clichés d’œil entier et distinction des artéfacts et des lésions
histologiques. ......................................................................................................................... 127
Figure 28 : Illustration de la technique employée pour calculer le nombre de noyaux des couches
nucléaires interne et externe par unité de surface à l'aide d'Image J. ......................................... 130
Figure 29 : Aspect des sécrétions des glandes de méibomius chez la souris à température ambiante
(20°C environ) (A) et à température corporelle (B). .................................................................. 143
Figure 30: Comparaison des 3 tracés électrorétinogrammes types obtenus à l'ENVA en 2012 et à la
faculté de Clermont-Ferrand en 2014. ...................................................................................... 153
Figure 31 : Comparaison de l'amplitude des ondes b chez les Hacd1-KO et sauvages en fonction de
l'intensité du flash lumineux. ................................................................................................... 155
Figure 32 : Aspect de l'épithélium pigmentaire en microscopie électronique à transmission........ 167
Figure 33 : Aspect de la limite entre la couche nucléaire externe et le segment interne des
photorécepteurs en microscopie électronique à transmission. .................................................. 168
Figure 34 : Aspect des segments externes des photorécepteurs en microscopie électronique à
transmission. .......................................................................................................................... 169
Figure 35 : Possibles anomalies observées en microscopie électronique à transmission sur les
rétines des souris Hacd1-KO .................................................................................................... 171
Figure 36 : Marquages par immunofluorescence des rétines de souris Hacd1-KO ....................... 175
Figure 37 : Marquages par immunofluorescence de coupes de rétines par un anticorps ............. 177
Figure 38 : marquages par immunofluorescence de coupes de rétines, anticorps ....................... 178
Figure 39 : Illustration de la grille de notation des différents niveaux de marquage observés par
hybridations in situ.................................................................................................................. 181
Figure 40: Différents niveaux de marquage observés sur une même coupe suite à une hybridation
in situ pour le gène Hacd1 ....................................................................................................... 182
Figure 41 : Composition relative en phosphatidylcholines des rétines des souris du lot E. ........... 184
Figure 42 : Marquage et témoin négatif lors d'immunofluorescence .......................................... 204
[10]
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Présentation des souris utilisées pour l'étude de la fonction et de l'expression de Hacd1
dans la rétine. ......................................................................................................................... 114
Tableau 2 : Résumé des caractéristiques des différentes expériences réalisées dans le cadre de
cette thèse ...................................................................................................................................... 115
Tableau 3 : Caractéristiques et séquences des amorces utilisées pour synthétiser les précurseurs
ADN des sondes d'hybridation in situ ....................................................................................... 138
Tableau 4 : Réactions de polymérisation en chaîne réalisées afin de synthétiser les précurseurs
ADN des sondes d'hybridation in situ. ...................................................................................... 138
Tableau 5 : Résultats des observations de la cornée et des structures intraoculaires à la lampe à
fente. Effectif de 39 souris provenant des lots C, D et E. ............................................................ 146
Tableau 6 : Résultats de l'observation des fonds d'œil pour un effectif de 36 souris. ................... 147
Tableau 7 : Comparaison des tracés d'électrorétinogrammes flash obtenus chez les souris
sauvages (+/+) et les souris mutantes (-/-) à l'ENVA en 2012 et à la faculté de Clermont-Ferrand en
2014....................................................................................................................................... 153
Tableau 8 : Comparaison des lots étudiés par électrorétinographie. .......................................... 156
Tableau 9 : Comparaison des principales caractéristiques des deux protocoles d'acquisition des
électrorétinogrammes. ............................................................................................................ 158
Tableau 10 : Observation des clichés d’œil entier et recherche d'anomalie majeure ................... 161
Tableau 11 : Synthèse des différents niveaux de marquages observés sur les rétines de souris
testées par hybridation in situ. ................................................................................................. 180
Tableau 12 : Protocole de déparaffinage .................................................................................. 201
Tableau 13 : Caractéristiques des différents anticorps utilisés. .................................................. 205
Tableau 14 : Protocole d'hybridation in situ adapté aux rétines et mis au point pendant la thèse.207
Tableau 15: Suivi et caractéristiques des souris utilisées dans le cadre de cette thèse ................. 213
[11]
LISTE DES ANNEXES
ANNEXE 1 : Protocole d’immunofluorescence sur rétine ......................................................... 201
ANNEXE 2 : Résumé des caractéristiques des anticorps utilisés pour les marquages par
immunofluorescences ........................................................................................................... 205
ANNEXE 3 : Synthèse des sondes d’hybridation in situ par réaction de polymérisation en chaîne206
ANNEXE 4 : Protocole d’hybridation in situ ............................................................................ 207
ANNEXE 5 : Formulation des différents tampons utilisés pour l’hybridation in situ ................... 209
ANNEXE 6 : Protocole d’inclusion des rétines en vue d’une observation au microscope
électronique à transmission .................................................................................................. 212
ANNEXE 7 : Tableau de suivi des souris .................................................................................. 213
[12]
LISTE DES ABRÉVIATIONS
β-Gal (Béta-Galactosidase) : enzyme codée par le gène Lac-Z capable d'hydrolyser des
β-galactosides en monosaccharides. Elle est souvent utilisée comme marqueur
indirect de l’expression d’un gène d’intérêt.
ω3 et ω6 (oméga 3 et 6) : familles d’acides gras polyinsaturés, comportant plusieurs
doubles liaisons et caractérisés par la localisation de leur première double liaison à
partir de l’extrémité méthyle. Ainsi, les ω3 ont leur première double liaison à partir du
3ème carbone.
ADN (Acide DésoxyriboNucléique) : support de l’information génétique.
ARN (Acide RiboNucléique) : molécule très proche de l’ADN servant d’intermédiaire
pour synthétiser les protéines.
ARNm (Acide RiboNucléique messager) : ARN produit suite à l’épissage, soit ne
comportant que des séquences codantes.
ADNc (Acide DésoxyriboNucléique complémentaire) : séquence simple brin produite
artificiellement à partir de l’ARNm et ne comportant donc que les régions codantes du
gène d’intérêt.
BSA (Bovine Serum Albumin ou albumine de sérum bovin) : protéine fréquemment
utilisée dans les expérimentations de biochimie (immunofluorescence, ELISA…)
Cd.s/m² (Candela seconde par mètre carré) : unité de mesure de la luminance
(dérivée de l’intensité lumineuse) au cours du temps, employée pour qualifier
l’intensité des flashs lumineux lors de la réalisation d’électrorétinogramme.
cKO (conditionnal Knock Out) : inactivation sélective d’un gène dans un ou plusieurs
type(s) cellulaire(s) chez une souris mutante.
Cx (ou x est un chiffre) : nomenclature biochimique pour une chaîne carbonée
comportant x atomes de carbone.
C57Bl/6N : nomenclature officielle d’une lignée de Souris de laboratoire Black 6
fréquemment utilisée lors de la genèse de modèles fonctionnels de maladies
humaines.
[13]
CNM (Myopathie CentroNucléaire) : maladie neuromusculaire congénitale se
traduisant par des anomalies structurales et fonctionnelles des muscles squelettiques
et caractérisée par une centralisation des noyaux de leurs fibres.
DAPI (4’,6’-DiAmidino-2-PhénylIndole) : molécule fluorescente capable de se lier
fortement aux bases adénines et thymines de l'ADN, souvent utilisée pour colorer les
noyaux lors de la réalisation de marquages d’immunofluorescence.
DHA (Acide DocosaHexaénoïque, C22:6) : Acide gras de la famille des omégas 3 (ω3).
DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à l’Age) : maladie dégénérative d’évolution
chronique touchant spécifiquement la région maculaire de la rétine responsable de la
vision centrale. C’est une maladie multifactorielle favorisée par des prédispositions
génétiques et/ou des facteurs environnementaux.
ELOVL (ELongation Of Very Long fatty acid) : enzyme catalysant la première étape,
étape de condensation, du cycle d’élongation des Very Long Chain Fatty Acids ou Acides
Gras À Très Longue Chaîne.
ENVA (École Nationale Vétérinaire d’Alfort) : une des quatre écoles vétérinaires de
France.
ERG (ÉlectroRétinoGramme) : examen électrophysiologique permettant d’analyser la
réponse électrique de la rétine à une stimulation lumineuse et donc d’évaluer son
fonctionnement.
FA (FormAldéhyde) : solution de fixation des tissus souvent utilisée en histologie à
une concentration de 4% en général.
GCL (Ganglion Cell Layer) : couche des cellules ganglionnaires, l’une des trois couches
nucléaires de la rétine.
Hacd1 (3-HydroxyAcyl-CoA Deshydratase 1) : gène codant pour une enzyme à activité
3-hydroxyacyl-CoA déshydratase (HACD) qui participe à la 3ème étape du cycle
d’élongation des acides gras à très longue chaîne. (HACD1, écriture du gène chez le
Chien et l’Homme, Hacd1 écriture du gène chez la souris).
HACD1-d5 : transcrit de HACD1 dépourvu de l’exon 5.
HACD1-fl (full length) : transcrit complet de HACD1.
[14]
HES (Hémalun-Éosine-Safran) : coloration des tissus utilisée en routine sur coupe
histologique.
HIS (Hybridation In Situ) : technique de laboratoire permettant de localiser une
séquence d’ARN messager connue sur une coupe histologique de tissu. Cela permet
d’étudier le profil d’expression d’un gène.
IF (ImmunoFluorescence) : technique d’immunomarquage permettant de visualiser
les molécules d’intérêt sur coupe histologique à l’aide d’anticorps dirigés contre ces
molécules et couplés à des fluorochromes.
ILM (Inner Limiting Membrane) : membrane basale délimitant la face interne de la
rétine et la séparant du vitré.
INL (Inner Nuclear Layer) : couche nucléaire interne de la rétine constituée des corps
cellulaires des cellules bipolaires, horizontales et amacrines.
IPL (Inner Plexiform Layer) : couche plexiforme interne de la rétine, c'est-à-dire la
couche synaptique entre les cellules bipolaires et les cellules ganglionnaires.
KAR (3-KétoAcylcoA Reductase) : enzyme catalysant la deuxième étape, étape de
réduction, du cycle d’élongation des Very Long Chain Fatty Acids ou Acides Gras À Très
Longue chaîne.
KO (Knock Out) : inactivation totale d’un gène chez une souris mutante.
MET (Microscopie Électronique à Transmission) : technique de microscopie basée sur
les informations fournies par un faisceau d’électrons « transmis » à travers un
échantillon très mince. Les effets de l’interaction entre les électrons et l’échantillon
donnent naissance à une image dont la résolution peut atteindre 0,08 nanomètre et un
grossissement supérieur à 200 000 (« Microscopie électronique en transmission »,
2015).
NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate) : source principale
d’électron utilisée dans les réactions de biosynthèse cellulaire.
NFL (Nerve Fiber Layer) : couche de la rétine constituée des axones des cellules
ganglionnaires cheminant vers l’émergence du nerf optique.
OCT (Optimal Cutting Temperature media) : milieu de montage utilisé pour réaliser
des cryo-sections de tissus.
[15]
OLM (Outer Limiting Membrane) : zone d’adhérence entre les segments internes des
photorécepteurs et les cellules de Müller.
ONL (Outer Nuclear Layer) : couche nucléaire externe de la rétine constituée des corps
cellulaires des photorécepteurs.
OPL (Outer Plexiform Layer) : couche plexiforme externe de la rétine, c'est-à-dire la
couche synaptique entre les photorécepteurs et les cellules bipolaires.
Pb (Paire de bases) : unité de mesure utilisée en génétique pour définir la taille d’une
séquence d’ADN.
PC (PhosphatidylCholine) : ce terme désigne les phospholipides composés d'une
choline, d'un phosphate, d'un glycérol et de deux acides gras.
PBS (Phosphate Buffer Saline) : tampon phosphate couramment utilisé en biochimie
pour ses propriétés d’isotonicité et d’innocuité.
PCR (Polymerase Chain Reaction) : méthode de biologie moléculaire permettant
d’amplifier in vitro une séquence d’ADN connue grâce à une réaction de
polymérisation en chaîne.
PTP (Protein Tyrosine Phosphatase) : enzyme déphosphorylant des résidus tyrosine
des protéines et jouant ainsi un rôle important dans des voies de transduction de
signal.
Ptpla (Protein Tyrosine Phosphatase-Like A) : autre nom du gène Hacd1.
RPM (Réflexe PhotoMoteur) : contraction pupillaire survenant de façon physiologique
suite à une exposition de l’œil à la lumière.
SINE (Short Interspersed Nuclear Element) : courtes séquences d’ADN, d’environ une
centaine de paires de bases, répétées et dispersées au sein du génome.
TCO (Tomographie par Cohérence Optique) : technique d’imagerie médicale mise au
point au début des années 90 permettant de révéler de manière non invasive les
structures internes de l’œil avec une définition micrométrique.
TER (Trans-2-Enoylcoa Reductase) : enzyme catalysant la quatrième et dernière
étape, étape de réduction, du cycle d’élongation des Acides Gras À Très Longue Chaîne.
[16]
ULCFA (Ultra Long Chain Fatty Acid) : acides gras comportant une chaîne carbonée de
26 carbones ou plus (sous-groupe appartenant aux Acides Gras À Très Longue
Chaîne).
ULC-PUFA (Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acid) : acides gras comportant
une chaîne carbonée de 26 carbones ou plus avec plusieurs insaturations
(sous-groupe appartenant aux ULCFA).
VLCFA (Very Long Chain Fatty Acid aussi nommés AGTLC, Acide Gras à Très Longue
Chaîne) : acides gras ayant une chaîne carbonée composée de 18 carbones ou plus.
[17]
INTRODUCTION
L’objectif de la partie expérimentale de cette thèse était d’analyser l’expression
du gène Hacd1 au niveau de la rétine de Souris ainsi que de caractériser les
conséquences phénotypiques de la mutation de ce gène dans cet organe. La Souris
servait ici de modèle d’étude pour la mutation de Hacd1 qui est à l’origine d’une
myopathie centronucléaire chez le Chien (Blot et al., 2002; Pelé et al., 2005) et chez
l’Homme (Muhammad et al., 2013). Cette mutation a été initialement découverte suite
à l’observation de cas spontanés de myopathie congénitale chez des Labradors
retrievers présentés en consultation de neurologie à l’école nationale vétérinaire
d’Alfort dans les années 1990 (Blot et al., 2002). Par la suite, de nombreuses études
réalisées chez le Chien puis chez la Souris ont permis de caractériser l’atteinte
musculaire et d’étudier l’expression du gène Hacd1 à l’échelle de l’organisme
(Blondelle et al., 2015; Blot et al., 2002; Fouchère et Taleb, 2012). Il a ainsi été
démontré que Hacd1 code pour une enzyme participant au cycle d’élongation des Very
Long Chain Fatty Acids (VLCFA) (Ikeda et al., 2008). Il a aussi été établi que
l’expression de ce gène était très forte dans certains tissus : les muscles striés
squelettiques et le cœur, ainsi que la rétine dans une moindre mesure (Blondelle,
2013). Plus récemment, une seconde série d’études portant sur Hacd1 et la rétine a
mis en évidence que les souris mutées présentaient un électrorétinogramme (ERG)
modifié compatible avec un phénomène de dégénérescence rétinienne (Blondelle,
2013; Fouchère et Taleb, 2012). Cela s’apparentait aux observations réalisées dans la
maladie héréditaire de Stargardt 3 liée à la mutation d’une enzyme ELOV4 participant,
elle aussi, au cycle d’élongation des VLCFA (Harkewicz et al., 2012; McMahon et al.,
2007). Cependant, de façon surprenante, aucune expression de Hacd1 n’a été mise en
évidence dans les photorécepteurs (Fouchère et Taleb, 2012), contrairement à
ELOVL4 (Lagali et al., 2003). Hacd1 s’exprimait dans la couche des cellules bipolaires
et ganglionnaires, sans que l’identité exacte des cellules l’exprimant ne fût déterminée
(Fouchère et Taleb, 2012).
[19]
Notre étude a été réalisée sur la base de ces résultats préliminaires et
présentaient des objectifs dans la continuité. En effet, dans un premier temps, nous
avons cherché à caractériser de façon plus précise les cellules rétiniennes dans
lesquelles s’exprime Hacd1 à l’aide de techniques de double immunofluorescence.
Nous avons aussi voulu confirmer que Hacd1 ne s’exprimait pas dans les
photorécepteurs en mettant au point une technique d’hybridation in situ. Par ailleurs,
nous avons réalisé des analyses histologiques sur les rétines des souris mutées dans le
but de confirmer l’hypothèse de dégénérescence rétinienne. Finalement, nous avons
réalisé des évaluations cliniques (reflet du fond d’œil et ÉlectroRétinoGramme, ERG)
sur un nouveau lot de souris, là encore pour confirmer l’hypothèse de dégénérescence
rétinienne. Cette évaluation clinique a été couplée à des analyses de composition
lipidique des rétines afin de pouvoir faire le lien entre l’atteinte fonctionnelle de la
rétine et un éventuel déficit en VLCFA dû à la mutation de Hacd1.
[20]
PARTIE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Cette première partie a été conçue afin d’introduire les différentes notions qui
seront nécessaires à la compréhension de la partie expérimentale. Le premier point
évoqué concerne la rétine, son anatomie, son fonctionnement et son évaluation
clinique. Finalement, un paragraphe décrit les dégénérescences rétiniennes, affections
provoquant une perte visuelle irréversible et pouvant être à l’origine de la
modification de l’électrorétinogramme observé précédemment chez les Hacd1-KO
pour Hacd1. Le deuxième point abordé concerne les VLCFA : leur métabolisme, leurs
rôles à l’échelle cellulaire, à l’échelle de l’organisme et au niveau de la rétine. Étant
donné que Hacd1 code une enzyme intervenant dans le cycle d’élongation des VLCFA
(Ikeda et al., 2008), nous avons émis l’hypothèse que les souris mutées présenteraient
des taux plus faibles en VLCFA. Il est donc intéressant de connaître leur rôle en temps
normal, en particulier dans la rétine. Le troisième point évoqué dans la bibliographie
porte sur le gène Hacd1 en lui-même : sa découverte, son rôle, son expression
tissulaire. Finalement, une dernière partie est consacrée aux résultats préliminaires
obtenus dans le laboratoire de Génétique Fonctionnelle et Médicale de l’ENVA par
Myriam Taleb, Renaud Fouchère et Jordan Blondelle concernant l’expression de Hacd1
dans la rétine ainsi que les analyses morphologiques précédemment réalisées sur les
rétines de Hacd1-KO pour ce gène.
[21]
I.
STRUCTURE, FONCTION ET ÉVALUATION DE LA RÉTINE
1. Introduction sur l’œil et la rétine
Chez les mammifères, l’œil, ou plus précisément le globe oculaire, est divisé en
3 tuniques : la tunique fibreuse, la tunique vasculaire et la tunique nerveuse (Figure 1)
(Chahory, 2014; Ross et Pawlina, 2011).
La tunique fibreuse est la couche la plus externe. Elle comporte la sclère,
blanche, et la cornée, transparente. Elle est essentiellement composée de tissu
conjonctif riche en collagène ce qui lui confère une solidité importante. Cette couche
forme l’armature du globe et permet de protéger les couches plus internes.
La tunique vasculaire, ou uvée, est la couche intermédiaire. Elle est
constituée du corps ciliaire, de l’iris et de la choroïde. Cette tunique assure l’irrigation
des différentes structures de l’œil et participe au renouvellement des substances
impliquées dans le fonctionnement de cet organe. La choroïde, qui tapisse la partie
postérieure de l’œil, assure plus particulièrement l’irrigation de la rétine. Elle est très
foncée, ce qui permet de limiter les réflexions de lumière à l’intérieur du globe
oculaire.
La tunique nerveuse, ou rétine, est la tunique la plus interne. Elle est
constituée de l’épithélium pigmentaire et de la neurorétine. Chez les animaux
pigmentés, l’épithélium pigmentaire contient une grande quantité de mélanine
permettant d’absorber les rayons lumineux. Il contribue aussi au renouvellement des
pigments photosensibles servant au codage visuel (partie du cycle visuel) et forme
une barrière protectrice entre la choroïde et les photorécepteurs (barrière
hématorétinienne) (Veleri et al., 2015). La neurorétine, quant à elle, capte le signal
lumineux grâce aux photorécepteurs, cônes et bâtonnets, puis transmet l’information
[23]
reçue au cortex visuel via le nerf optique. Chez les vertébrés, la rétine provient d’une
évagination du diencéphale ; en ce sens, elle fait partie du système nerveux central. Au
centre de la rétine se trouve une zone circulaire correspondant à l’émergence du nerf
optique appelée papille. Le nerf optique est constitué des axones des cellules
ganglionnaires qui se dirigent vers l’encéphale. La papille optique est traversée par les
vaisseaux qui irriguent la rétine.
Le rôle essentiel de l’œil est d’assurer la convergence des rayons lumineux sur
la rétine (Richard et Orsal, 2001). Une des caractéristiques principale des régions
antérieures et internes de l’œil est donc la transparence. L’œil comporte aussi deux
dioptres oculaires : la cornée et le cristallin qui permettent normalement de faire
converger les rayons lumineux provenant d’un objet sur la rétine, quelle que soit sa
position (Richard et Orsal, 2001).
Remarque : l’œil de l’Homme et de la Souris sont relativement similaires. Une
différence notable porte sur la forme et la taille du cristallin. Celui-ci est rond et
proportionnellement plus volumineux chez la Souris où il occupe environ 75% de
l’espace intraoculaire (Smith et al., 2001; Treuting et al., 2012; Veleri et al., 2015).
Aussi, la Souris ne possède pas de fovéa (Müller, 2002), dépression située à proximité
du centre optique de la rétine et constituée essentiellement de cônes (Ross et Pawlina,
2011). Cette région permet chez l’Homme d’améliorer la netteté et les couleurs de
l’image perçue. Finalement, la vascularisation rétinienne est beaucoup plus
développée chez la Souris que chez l’Homme.
Dans la suite de l’exposé, nous nous focaliserons sur l’étude de la rétine, sur
laquelle porte notre étude expérimentale.
[24]
Figure 1 : Organisation de l'œil en 3 tuniques. Représentation schématique et coupe histologique correspondante
A : Représentation schématique d’une coupe sagittale d’œil humain (d’après Mojo, 2013).
B : Représentation schématique d’une coupe sagittale d’œil de Souris (d’après Veleri et al, 2015).
C : Coloration Hémalun-Eosine-Safran d’une coupe histologique de 4 μm d’épaisseur d’œil de Souris. (Cliché
d’une de nos coupes de rétine réalisée par le laboratoire d’anatomie pathologique de l’ENVA).
[25]
2. Histologie de la rétine
a. La rétine, une extension du système nerveux central
La neurorétine, comme la majorité des autres structures du système nerveux
central, comporte de nombreux types de neurones différents (Masland, 2001). Les
cinq principaux types de cellules neuronales observées dans la rétine sont les
photorécepteurs (cônes et bâtonnets), les cellules bipolaires, horizontales,
ganglionnaires et amacrines (Ross et Pawlina, 2011). Chacune de ces grandes classes
de cellules neuronales est subdivisée en sous-populations. Ainsi, chez la plupart des
vertébrés, il existe par exemple trois types de cônes et dix types de cellules bipolaires
(Müller, 2002). En tout, chez les mammifères, la rétine est constituée d’environ 55
types de neurones présentant tous une fonction différente (Masland, 2001).
En plus des cellules neuronales, la rétine comporte des cellules gliales : cellules
de Müller, cellules microgliales et astrocytes (Chen et al., 2002). Ces cellules jouent un
rôle dans l’homéostasie cellulaire ainsi qu’un rôle de protection de la rétine. Par
exemple, les cellules de Müller forment les deux membranes limitantes. La membrane
limitante interne délimite la rétine neurale du vitré et la membrane limitante externe
sert de support aux photorécepteurs (Lahunta et al., 2014; Ross et Pawlina, 2011).
D’autre part, les cellules de Müller entourent les corps des cellules neuronales, en
particulier des cellules ganglionnaires, et sont indispensables à leur survie.
Finalement, les cellules gliales participent aussi à la défense immunitaire innée de la
rétine : elles la protègent contre l’invasion par des microorganismes et participent à
l’élimination des cellules lésées. Ainsi, lors d’atteinte neurodégénérative à l’origine de
lésions des photorécepteurs, les cellules gliales sont capables de s’activer en se
dédifférenciant. Elles peuvent alors se déplacer vers le segment externe des
photorécepteurs afin de faciliter l’élimination des cellules abîmées en phagocytant les
débris cellulaires (Chen et al., 2002).
[26]
b. La rétine, un tissu stratifié
La rétine est un tissu stratifié d’épaisseur comparable, environ 150 à 200 µm,
quelle que soit l’espèce et ce indépendamment de la taille de l’œil lui-même
(Glickstein et Millodot, 1970; Wisden et Morris, 2002). L’observation d’une coupe
obtenue suite à une section perpendiculaire à la surface de la rétine permet de
visualiser 10 couches bien délimitées comme l’illustre la Figure 2. Les couches les plus
proches de la source lumineuse sont qualifiées d’«internes » (ou « inner » en anglais) ;
les segments plus en arrière sont qualifiés d’« externes » (ou « outer » en anglais). Par
ailleurs, toutes les rétines de vertébrés comportent trois couches nucléaires
constituées de corps cellulaires de neurones et deux couches de synapses intercalées.
Les différentes structures rencontrées dans la rétine en partant de l’extérieur vers
l’intérieur sont (Gartner et Hiatt, 2007; Ross et Pawlina, 2011) :
1. l’épithélium pigmentaire ;
2. les segments externes et internes des photorécepteurs ;
3. la membrane limitante externe (OLM), il ne s’agit pas réellement d’une
membrane mais d’une zone d’adhérence entre les segments internes des
photorécepteurs et les cellules de Müller ;
4. la couche nucléaire externe (ONL), constituée des corps cellulaires des
photorécepteurs (cônes et bâtonnets) ;
5. la couche plexiforme externe (OPL), couche synaptique reliant les cellules
bipolaires, les cellules horizontales et les photorécepteurs ;
6. la couche nucléaire interne (INL) constituée des corps cellulaires des cellules
bipolaires, horizontales et amacrines ;
7. la couche plexiforme interne (IPL), couche synaptique reliant les cellules
ganglionnaires, les cellules bipolaires et les cellules amacrines ;
8. la couche des cellules ganglionnaires (GCL), constituée majoritairement de
cellules ganglionnaires ;
9. la couche des fibres optiques (NFL) constituées des axones des cellules
ganglionnaires rejoignant la papille, région d’émergence du nerf optique ;
10. la membrane limitante interne (ILM), membrane basale délimitant la face
interne de la rétine et la séparant du vitré.
[27]
Figure 2 : Représentation schématique des différentes couches de la rétine et comparaison avec une coupe histologique de la
rétine colorée à l'Hémalun-Éosine-Safran. D’après Herbert, 2008.
(schéma inspiré de http://www.bio.miami.edu/tom/courses/protected/bil265/retina.jpg)
[28]
c. Les caractéristiques histologiques des photorécepteurs, cellules
sensorielles de la rétine
Les photorécepteurs sont les cellules responsables de la transduction du signal
lumineux en signal électrique, ce sont donc les cellules sensorielles de la rétine
(Gartner et Hiatt, 2007; Ross et Pawlina, 2011; Sjaastad et al., 2003). Il en existe deux
types : les cônes et les bâtonnets. Leur structure histologique est très spécifique et
adaptée à leur fonction. Chaque photorécepteur est subdivisé en 3 parties : un
segment externe, un segment interne et l’extrémité synaptique (Sjaastad et al., 2003).
Le segment externe est le lieu de réception et de transduction du signal
lumineux (Sjaastad et al., 2003). Il est situé au contact de l’épithélium pigmentaire.
Celui-ci absorbe les rayons lumineux après qu’ils aient stimulé les photorécepteurs
afin de limiter le phénomène de réflexion qui aurait un impact négatif sur la netteté de
l’image perçue (Ross et Pawlina, 2011). Le segment externe est reconnaissable à ses
très nombreux disques membranaires empilés permettant d’augmenter sa surface
membranaire. En effet, sa membrane joue un rôle très important car elle contient les
pigments photosensibles qui permettent de transformer le signal lumineux en signal
chimique. La forme du segment externe varie en fonction du type de photorécepteurs :
les bâtonnets ont un segment externe très long et de forme cylindrique alors que les
segments externes des cônes sont plus courts et de forme conique (Figure 3). Par
ailleurs, les segments externes des bâtonnets sont constitués d’un plus grand nombre
de disques membranaires, ce qui leur confère une plus grande sensibilité à la lumière
(Sjaastad et al., 2003).
Le segment interne contient les organites nécessaires au métabolisme
cellulaire ainsi que le noyau de la cellule (Risse, 1999; Sjaastad et al., 2003). La partie
du segment interne comportant le noyau forme la couche nucléaire externe, 6ème
couche de la rétine. Les segments interne et externe sont rattachés par un cil
connecteur.
[29]
La terminaison synaptique est plus ou moins complexe en fonction du type
de photorécepteur. Un bouton synaptique met en contact le photorécepteur avec une
cellule bipolaire et deux cellules horizontales, on parle de triade (Richard et Orsal,
2001). Le pied des bâtonnets ne contient qu’une seule triade, par contre les pieds de
cônes comportent plusieurs dizaines de triades. Chaque cône est donc relié à un très
grand nombre de cellules neuronales. Par ailleurs, ces synapses sont des synapses à
ruban caractérisées par la présence de corps ou rubans synaptiques arrimant les
vésicules synaptiques (Risse, 1999). Cette configuration particulière permet une
neurotransmission plus rapide, précise et efficace. Ce type de synapse n’a été
actuellement observé que dans les organes sensoriels (photorécepteurs, cellules
bipolaires, cellules cochléaires entre autres) (Petit, 2010; Sterling et Matthews, 2005).
Figure 3 : Représentation schématique (A) et illustration histologique (B) des
photorécepteurs. D’après Dubuc, 2013.
[30]
Les segments externes des photorécepteurs sont en relation très étroite avec
l’épithélium pigmentaire (Ross et Pawlina, 2011; Veleri et al., 2015). Ce dernier leur
apporte les nutriments et prend en charge leurs déchets puisque les photorécepteurs
ne sont pas en contact avec des vaisseaux sanguins. Il participe aussi au cycle visuel en
assurant la régénération des pigments photosensibles. Environ 10% du segment
externe est phagocyté par l’épithélium pigmentaire chaque jour dans le cadre du
renouvellement membranaire. Le segment externe est donc entièrement renouvelé
tous les 10 à 15 jours (Veleri et al., 2015). L’épithélium pigmentaire est aussi
nécessaire au bon fonctionnement et à la survie des photorécepteurs.
[31]
3. Fonctionnement de la rétine
a. La
réception
du
signal
lumineux
et
la
transmission
de
l’information au cortex visuel
La réception du signal lumineux se fait au niveau des segments externes des
photorécepteurs (Ross et Pawlina, 2011). Cependant, comme indiqué précédemment,
les cellules ganglionnaires constituent les couches les plus internes de la rétine alors
que les photorécepteurs sont situés vers l’extérieur. La lumière doit donc traverser
l’ensemble de la rétine avant d’activer les cônes et les bâtonnets ; on parle de rétine
inversée (Richard et Orsal, 2001) (Figure 4).
Figure 4 : Illustration de la notion de rétine inversée
Schéma réalisé à partir d’un cliché de rétine de souris C57Bl6 pris par le laboratoire
d’anatomie pathologique de l’ENVA.
La stimulation des photorécepteurs dépend de l’intensité lumineuse. La vision
nocturne est assurée par les bâtonnets qui sont plus sensibles à la lumière que les
cônes. Cependant, ceux-ci ne permettent pas de différencier les couleurs. À la lumière
du jour, les bâtonnets sont saturés et les cônes prennent le relais (Sjaastad et al.,
2003). Il existe différents types de cônes qui sont sensibles à des longueurs d’onde
différentes, cela permet une vision en couleur. Chez l’Homme, il existe 3 types de
cônes : L (564nm), M (533nm) et S (437nm) (Ross et Pawlina, 2011; Veleri et al.,
2015). Chez la Souris, il n’en existe que deux (les M et les S) (Veleri et al., 2015). La
[32]
proportion de cônes par rapport aux bâtonnets dans la rétine varie en fonction des
espèces et des conditions de luminosité dans laquelle vit l’animal (Sjaastad et al.,
2003). Ainsi, la région périphérique de la rétine des espèces nocturnes est
essentiellement constituée de bâtonnets. Chez la Souris, les cônes ne représentent que
3% des photorécepteurs de la rétine (Pinto et Enroth-Cugell, 2000).
La transduction du signal (ou phototransduction dans ce contexte) est permise
par des pigments sensibles à la lumière localisés dans la membrane des segments
externes des photorécepteurs (Ross et Pawlina, 2011; Sjaastad et al., 2003). Il existe
un seul type de pigments pour les bâtonnets : la rhodopsine. Il en existe plusieurs,
sensibles à des longueurs d’onde différentes, en fonction du type de cône. Ces
pigments sont tous formés d’une même molécule de rétinène, ou rétinal, attaché sous
sa forme cis à une opsine. Suite à une stimulation lumineuse, le rétinène change de
conformation et est libéré dans le cytoplasme où il active une cascade de signalisation
faisant intervenir une protéine G (Figure 5) (Sjaastad et al., 2003; Veleri et al., 2015).
Cette cascade aboutit à la fermeture des canaux sodiques, ce qui entraîne une
hyperpolarisation de la cellule et une diminution de la libération de glutamate, le
neurotransmetteur de la synapse à ruban (Gartner et Hiatt, 2007; Richard et Orsal,
2001; Sjaastad et al., 2003). Cela signifie donc que, de façon surprenante, il y a une
plus grande libération de neurotransmetteur dans l’obscurité qu’à la lumière.
Le trans-rétinal, molécule inactive formée suite à la stimulation lumineuse du
segment externe des photorecepteurs, est transporté jusqu’à l’épithélium pigmentaire
où il est recyclé en cis-rétinal (Veleri et al., 2015). Il retourne ensuite dans les
photorécepteurs où il pourra de nouveau participer à la cascade de transduction du
signal lumineux. L’épithélium pigmentaire joue donc un rôle essentiel dans le
renouvellement des photopigments.
[33]
Figure 5 : Représentation schématique de la cascade de signalisation intervenant lors
de la phototransduction au niveau d'un bâtonnet (d'après Veleri 2015).
b. La rétine, un système complexe d’intégration de l’information
Le signal électrique généré par les photorécepteurs est ensuite transmis
successivement aux différentes couches de neurones de la rétine, nommés neurones
d’intégration, jusqu’à atteindre les cellules ganglionnaires qui transmettent le signal
au système nerveux central (Richard et Orsal, 2001). Les cellules bipolaires servent
d’intermédiaires entre les photorécepteurs et les cellules ganglionnaires. Les cellules
horizontales, quant à elles, relient latéralement plusieurs synapses de la couche
plexiforme externe. Elles permettent donc de transmettre des informations en
provenance des photorécepteurs situés en périphérie. De plus, plusieurs cellules
horizontales communiquent par jonctions gaps, ce qui augmente l’étendue des
connexions latérales. Le fonctionnement est équivalent pour les cellules amacrines qui
forment des triades avec les cellules bipolaires et ganglionnaires dans la couche
plexiforme interne (Richard et Orsal, 2001). Au bilan, la multiplication des neurones
[34]
d’intégration et des synapses permet un premier traitement de l’information dans la
rétine.
Finalement, une fois l’information reçue par les cellules ganglionnaires,
celles-ci transmettent le signal codé en potentiels d’action jusqu’au cortex visuel
(Richard et Orsal, 2001). Les potentiels d’action suivent leurs axones qui forment le
nerf II, nerf optique, seul nerf afférent de l’œil. Les voies visuelles impliquées par la
suite, ainsi que le traitement central de l’information ne seront pas détaillés dans ce
manuscrit.
[35]
4. Évaluation clinique de la rétine chez la Souris
Les animaux de laboratoire sont très régulièrement utilisés dans le cadre
d’études de médecine comparative afin d’étudier des maladies humaines touchant les
structures oculaires. Le modèle murin est, par exemple, un modèle de choix dans
l’étude des dégénérescences rétiniennes, ensemble de maladies neurodégénératives
touchant la rétine et se caractérisant par un déficit visuel voire une cécité d’apparition
plus ou moins lente (Chang, 2013; Veleri et al., 2015). Ces études peuvent avoir
différents objectifs tels que déterminer les mutations causales ou la pathogénie des
maladies encore mal caractérisées ou bien tester l’efficacité de nouveaux traitements.
Dans tous les cas, il est nécessaire de pouvoir qualifier, voire quantifier de la manière
la plus objective et reproductible possible, le niveau de vision de l’animal.
Contrairement à l’Homme, il est difficile de déterminer si un animal présente
un déficit visuel ou non. Chez les animaux de compagnie, l’anamnèse et les
propriétaires peuvent orienter le diagnostic (Martin, 2001) mais cela est moins vrai
avec les animaux de laboratoire. L’évaluation de la vision chez l’animal nécessite donc
un examen ophtalmologique souvent complété par une évaluation fonctionnelle de la
rétine.
Afin de ne rien oublier, l’examen clinique se déroule toujours dans le même
ordre. Le plan utilisé ci-dessous suit justement la chronologie d’un examen
ophtalmologique normalisé fréquemment rencontré dans la littérature (Martin,
2001). Cependant, seuls les tests permettant d’évaluer la fonction ou les voies
visuelles chez la Souris, notre animal d’étude, sont décrits ici.
[36]
a. Observation de l’animal à distance - évaluation fonctionnelle de la
vision
Comme tout examen clinique, l’évaluation d’un éventuel déficit visuel
commence avec l’observation de l’animal à distance. Cela permet une évaluation
fonctionnelle de la vision. Chez la Souris, cet examen consiste généralement en des
mises en situation de l’animal.
La Souris est un modèle de choix dans l’étude de nombreuses maladies
oculaires, dont les maladies héréditaires. La mise au point de techniques d’évaluation
fonctionnelle de la vision adaptées aux Souris représente donc un enjeu important ces
dernières années. Il existe différentes variantes de tests de la vision fonctionnelle
adaptées au modèle murin (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Ces tests se basent sur
l’utilisation de cages spécialement aménagées avec des obstacles et un système de
récompenses. Il est alors possible d'étudier les déplacements de l'animal en direct ou
de les filmer. L'examinateur pourra aussi mesurer à l'aide de logiciels l’activité de
l'animal (mesure de la distance parcourue et de la vitesse de locomotion…). Les
prochains paragraphes comportent quelques exemples de protocoles adaptés au
modèle murin décrits dans la littérature (Pinto et Enroth-Cugell, 2000; Prusky et al.,
2004, 2000; Thompson et al., 2008a).
i.
Test du labyrinthe, maze based test et ses dérivés
Une première série de tests mise au point à la fin des années 1990 consiste à
entraîner des souris à se déplacer en direction d’un stimulus visuel donné (Prusky et
al., 2000). L’image est ensuite modifiée et l’examinateur observe si la souris se trompe.
Une récompense est remise seulement si la souris se dirige du bon côté. Le principal
inconvénient de cette technique est lié au temps et à la main d’œuvre nécessaires à
entraîner puis tester chaque souris. Ce test n’est donc pas facilement réalisable à
grande échelle.
[37]
Une autre version du test consiste à mettre une souris sur une vitre
transparente légèrement en hauteur (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). D’un côté, la
plateforme est reliée à une cachette normalement visible par la souris. De l’autre côté,
la cachette est elle aussi visible pour l’animal mais elle n’est pas directement reliée à la
vitre. L’examinateur relève ici la tendance de l’animal à se déplacer vers la bonne ou la
mauvaise cachette. Notons toutefois que des souris saines se trompent dans environ
10% des cas.
ii.
L’Actimétrie
Les deux tests du labyrinthe sont intéressants mais compliqués à mettre en
œuvre. L’équipe de recherche de S. Thompson a donc récemment (2008) fait valider
un protocole d’évaluation de la vision fonctionnelle chez la Souris s’appuyant sur une
mesure de l’activité des rongeurs dans leur cage. Plus précisément, ils mesuraient
l’utilisation d’une roue par des souris C57Bl/6 dans différentes conditions de
luminosité et réalisaient une comparaison avec des conditions d’obscurité complète
simulant une cécité. Ces expériences ont permis de démontrer que l’activité des souris
était diminuée dans l’obscurité complète, les auteurs en ont conclu qu’une perte de
vision est corrélée à une diminution de l’activité chez cette espèce (Thompson et al.,
2008b).
iii.
Réflexion sur la sensibilité et la spécificité des tests du labyrinthe et
d’actimétrie et facteurs de confusion
Les résultats de ces deux tests dépendent aussi du tempérament, des
conditions d’expérimentation et de l’état clinique de l'animal. Ainsi, un animal très
peureux ou présentant une douleur risque de ne pas vouloir bouger ou de sembler
hésitant. De plus, la majorité de ces tests ne sont pas très sensibles. Les animaux ne
présentant qu'une perte de vision partielle ou unilatérale peuvent réussir le test sans
trop de difficulté (Martin, 2001). De même, une vieille souris aura une activité réduite
par rapport aux jeunes souris. Finalement, la familiarisation de l’animal avec le
[38]
matériel d’étude (roue…) doit aussi être pris en compte (Thompson et al., 2008a).
Dans le cadre de cette thèse, la mutation d’intérêt, mutation du gène Hacd1, provoque
une myopathie chez les individus homozygotes mutés. Cette maladie musculaire
s’exprime cliniquement par une faiblesse musculaire et une fatigabilité à l’effort
importante. En conséquence, les Hacd1-KO présentent un niveau de locomotion
diminué par rapport aux souris contrôles et la myopathie représente donc un facteur
de confusion important rendant ce test inexploitable.
Influence des conditions de luminosité dans l’évaluation fonctionnelle de la
vision chez la Souris : chez les animaux domestiques, les tests de types « parcours
d’obstacle » sont réalisés dans un premier temps en lumière vive puis en lumière
atténuée (Chahory, 2014). En effet, lors d’atrophies progressives de la rétine, les
bâtonnets responsables de la vision dans l’obscurité sont les premières cellules
touchées, ce qui se traduit par un déficit visuel observable d’abord en lumière
atténuée. Toutefois, chez la Souris, les conditions lumineuses dans lesquelles sont
réalisées les mesures d’activité locomotrice doivent être réfléchies afin d’éviter
qu’elles n’entraînent un biais de confusion (Thompson et al., 2008b). En effet, la
luminosité peut fortement influencer le comportement des souris. Ces animaux étant
des proies, leur niveau d’activité est augmenté dans des conditions de lumière
tamisée, on parle de masquage positif, et diminué en lumière vive afin de ne pas être
repéré par d’éventuels prédateurs, on parle de masquage négatif (Thompson et al.,
2008a). De fait, il s’agit d’animaux nocturnes. Cet élément peut aussi être pris en
compte dans l’évaluation de la vision chez la Souris. Les animaux ayant des déficits
visuels pourraient présenter un niveau d’activité indépendant des conditions de
luminosité (absence de diminution de l’activité en lumière vive et vice versa)
(Thompson et al., 2008b).
iv.
Placer visuel
Il s’agit ici d’attraper la souris par la queue et de la soulever à environ 15 cm
au-dessus d’une grille placée horizontalement. La souris est ensuite abaissée
[39]
progressivement afin de mesurer la distance entre le museau de l’animal et la surface
à partir de laquelle l’animal étend ses membres antérieurs en direction de la grille
(Pinto et Enroth-Cugell, 2000). En cas de déficit visuel la souris réagira plus tard, à une
distance plus faible de la grille. Ce test est utilisé comme test de référence dans le
cadre du protocole SHIRPA consistant en un dépistage des troubles de la vision sur les
souris de laboratoire de Harwell. L’avantage de ce test est qu’il est facile et rapide à
mettre en œuvre. Il est donc facilement réalisable sur un grand nombre d’individus.
v.
Test de la boule de coton ou du mouvement conjugué des yeux
Ce test est souvent utilisé pour évaluer la vision chez les animaux domestiques,
en particulier chez le Chat. Il s’agit de laisser tomber une boule de coton ou de
déplacer un objet dans le champ visuel de l’animal, à environ 50 cm de sa tête, afin de
capter son attention (Martin, 2001). Le mouvement des yeux doit normalement suivre
le déplacement de l’objet et les deux yeux doivent présenter un mouvement conjugué
(Chahory, 2014).
Ce test est praticable chez la Souris mais sa répétabilité et donc son
interprétation semble difficile étant donnée la grande nervosité de l’espèce. Par
ailleurs, les Souris ont des iris très larges qui occupent quasiment toute la surface
visible de l’œil (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Il est donc difficile de suivre leur
mouvement et il faut alors se concentrer sur le mouvement de la pupille. Ce test a été
utilisé sur différentes lignées de Souris dans les années 1980 et a permis d’identifier
plusieurs mutants présentant des résultats anormaux. Il n’est toutefois pas assez
précis pour pouvoir être considéré comme un test de référence pour l’évaluation de la
vision fonctionnelle chez les rongeurs.
Réflexion sur la sensibilité et spécificité de ce test : les animaux se lassent
assez rapidement de ce test, la première impression est donc meilleure (Martin,
2001).
[40]
b. Réflexes photomoteurs
En raison de la sensibilité et de la spécificité moyennes des tests précédents, les
réflexes photomoteurs doivent être systématiquement contrôlés. De plus, en cas de
déficit visuel avéré, ces réflexes orientent dans la localisation de l’atteinte des voies
visuelles (Gelatt, 2013). En effet, ce réflexe fait intervenir la rétine pour la perception
du stimulus lumineux. Le nerf optique transmet le signal au tronc cérébral (région
prétectale puis noyaux parasympathiques du nerf III). Finalement, les nerfs
oculomoteurs transmettent le signal moteur entraînant la constriction pupillaire
réflexe des deux yeux.
Les réflexes photomoteurs s’évaluent en lumière atténuée afin que les pupilles
de l’animal soient dilatées au départ (Wilhelm, 1998). L’examinateur dirige pendant 3
à 4 secondes un faisceau lumineux (transilluminateur, par exemple) sur l’un des yeux
et observe le diamètre des deux pupilles. La manœuvre est ensuite répétée en
éclairant l’autre œil après que les pupilles ont repris leur diamètre normal. En temps
normal, l’illumination d’un œil entraîne la constriction de la pupille éclairée (réflexe
photomoteur direct) et la constriction de la pupille controlatérale (réflexe
photomoteur indirect ou consensuel) (Chahory, 2014; Gelatt, 2013).
Ainsi,
par
exemple,
en
cas
d’atteinte
sévère
rétinienne
bilatérale
(dégénérescence rétinienne par exemple, notre objet d’étude par la suite), les réflexes
photomoteurs direct et consensuel sont tous deux absents et ce quel que soit l’œil
stimulé. Au contraire, une atteinte rétinienne unilatérale entraînera une perte des
réflexes photomoteurs direct et consensuel lorsqu’on éclaire l’œil lésé et une
persistance des deux réflexes lorsqu’on éclaire l’œil non lésé.
Le réflexe photomoteur varie suivant les espèces. Chez la Souris, le réflexe
photomoteur normal est rapide, complet (myosis serré) et constant pendant toute la
durée d’éclairage (Hussain et al., 2009). Le diamètre de la pupille est plus ou moins
resserré en fonction de l’intensité du faisceau lumineux (Pennesi et al., 1998).
[41]
Réflexion sur la sensibilité et spécificité de ce test : bien qu’il s’agisse d’un
test facile à réaliser, la sensibilité de ce test n’est pas très bonne. En effet, il a été
démontré chez le rat que ce réflexe fait intervenir une voie qui comprend un petit
nombre de cellules ganglionnaires spécialisées situées spécifiquement dans le cadran
ventral et nasal de la rétine (Young et Lund, 1998). Or ces cellules ne feraient pas
partie des voies visuelles principales (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Il se pourrait
donc qu’une atteinte localisée de la rétine dans une autre région n’entraîne pas de
défaut des réflexes photomoteurs.
c. Évaluation des structures oculaires
i.
Évaluation de la transparence du segment antérieur, reflet du fond d’œil
Lorsqu’un animal présente un déficit visuel, l’examen des structures oculaires
peut commencer par rechercher le reflet du fond d’œil : reflet de la lumière émise par
le transilluminateur de Finoff sur le fond d’œil (Chahory, 2014; Martin, 2001).
L’observation de ce reflet indique que les milieux antérieurs sont suffisamment
transparents pour permettre la diffusion des rayons lumineux jusqu’à la rétine, ce qui
signifie que, le cas échéant, la cécité est d’origine rétinienne ou post-rétinienne. A
l’inverse, l’absence de visualisation de ce reflet doit entraîner un examen plus poussé
des structures antérieures à la rétine : cornée, chambre antérieure, cristallin, vitré.
ii.
Examen du fond d’œil
Dilatation de la pupille
Afin de réaliser un examen du cristallin, du segment postérieur ou de la rétine, tel que
l’examen du fond d’œil, il est nécessaire d’obtenir une mydriase des pupilles de
l’animal. Pour cela on peut utiliser un collyre mydriatique tel que le tropicamide
[42]
(Mydriaticum® collyre 0,5 %, antagoniste muscarinique) ou la phényléphrine
(Néosynéphrine® collyre 2,5 %, agoniste adrénergique) qui ont une durée d’action de
5 à 6h chez les carnivores domestiques et d’environ 5 à 10 minutes chez la souris
(Peachey et Ball, 2003; Tanimoto et al., 2009; Weymouth et Vingrys, 2008). Il est aussi
possible d’appliquer de l’atropine 1% (parasympatholytique) mais en pratique cette
molécule est rarement utilisée car sa durée d’action est plus longue.
Méthodes d’observation du fond d’œil chez la Souris
Une fois la pupille dilatée, l’observation du fond d’œil peut se faire à l’aide d’un
ophtalmoscope direct (dioptrie 0 ou -1) ou indirect (Figure 6).
L’ophtalmoscope direct est un appareil grossissant qui produit un faisceau lumineux
qui est réfléchi par le fond d’œil et retourne ainsi à l’œil de l’examinateur en passant
par une lentille contenue dans l’appareil (Chahory, 2014; Gelatt, 2013). Elle ne
nécessite pas toujours de dilater la pupille au préalable mais cela facilite l’observation.
Cette technique permet également d’observer les autres structures intraoculaires en
réglant la lentille sur différentes dioptries. Globalement, il s’agit une technique simple
à mettre en œuvre mais elle ne permet d’obtenir qu’une image partielle de la rétine et
elle ne permet pas une vision en relief (Gelatt, 2013).
L’ophtalmoscopie indirecte consiste quant à elle à interposer une lentille convergente
entre la source lumineuse, généralement un ophtalmoscope binoculaire fixé sur le
front de l’examinateur, et l’œil de la souris. L’image obtenue est alors une image
inversée de la rétine. Cette technique permet de visualiser un champ d’observation
étendu et en relief mais elle nécessite une plus grande maîtrise de la part du
manipulateur. L’ophtalmoscopie indirecte est la technique de référence employée en
recherche clinique afin de visualiser le fond d’œil chez la Souris. Les articles de
référence recommandent d’utiliser une lentille Volk 90D mais précisent que les
lentilles Volk 60D ou 78D fonctionnent aussi chez la Souris (Chang, 2013; Hawes et al.,
1999).
[43]
L’un des inconvénients de l’ophtalmoscopie, directe ou indirecte, consiste en le
fait qu’il faille que l’ophtalmoscope produisant la source lumineuse soit parfaitement
aligné avec l’œil de l’animal. Chez les rongeurs, cela peut s’avérer particulièrement
compliqué étant donné la taille de l’œil et la gêne occasionnée par la lumière vive. Une
technique basée sur l’utilisation d’une loupe binoculaire a donc aussi été mise au point
chez la Souris (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Cette technique permet d’observer le
fond à plus gros grossissement, d’obtenir une image en relief et de prendre des photos
plus facilement. Cependant, elle nécessite d’anesthésier les souris, cela prend donc
plus de temps à réaliser et il faut prendre en compte le risque anesthésique qui n’est
pas négligeable chez ces espèces.
Figure 6 : Illustration de l'ophtalmoscopie directe (A) et indirecte (B).
D’après les sites : www.medicalexpo.fr et www.animaleyedoctor.fr ainsi que Gelatt,
2013.
Aspect normal du fond d’œil chez la Souris
L’examen du fond d’œil permet d’évaluer l’aspect de la rétine de l’animal. Cependant,
celle-ci est transparente, ce sont donc les structures sous-jacentes qu’on observe en
temps normal. Le fond d’œil se compose de la papille, émergence du nerf optique et de
[44]
la vascularisation. L’examinateur observe aussi la couleur du fond d’œil. L’aspect d’un
fond d’œil normal est illustré Figure 7 (Ramalho et al., 2002). Notons que chez la
Souris, contrairement aux carnivores domestiques, il n’y a pas de tapis. La couleur du
fond d’œil varie donc entre le noir pour les souris pigmentées et le rouge pour les
souris albinos (Chang, 2013).
Figure 7 : Photographie d'un fond d'œil normal de souris C56Bl/6J observé à
l'ophtalmoscope indirect.
La flèche indique la papille optique. La couleur globale du fond d’œil est marron et il
n’y a pas de tapis réfléchissant. Les veines (v) sont plus larges que les artères (a).
(illustration d’après Ramalho, 2002)
L’examen du fond d’œil permet de diagnostiquer différentes affections
rétiniennes. Les lésions du fond d’œil évocatrices d’une dégénérescence rétinienne
seront décrites un peu plus loin, paragraphe 5b, dans la partie consacrée à ces
maladies.
Remarque sur la spécificité et la sensibilité du fond d’œil : l’aspect
physiologique du fond d’œil est très variable en fonction des espèces et des individus.
Il faut faire attention à ne pas confondre les variations physiologiques avec des
variations pathologiques.
[45]
d. Électrorétinogramme
L’électrorétinographie (ERG) est un examen qui consiste à enregistrer l’activité
électrique de la rétine après une stimulation lumineuse (Gelatt, 2013; Risse, 1999).
C’est une technique diagnostique non invasive utilisée à la fois en clinique et en
recherche (DeMarco et al., 2007; Tanimoto et al., 2009). Elle permet d’obtenir des
informations sur le fonctionnement de la rétine. Chez les animaux de laboratoire,
l’électrorétinographie est utilisée afin de dépister des maladies touchant la rétine, de
caractériser les atteintes fonctionnelles associées aux différents types de
dégénérescence rétinienne, d’évaluer l’efficacité d’un traitement, etc (Peachey et Ball,
2003; Tanimoto et al., 2009).
Dans le cadre des études expérimentales de médecine comparative,
l’électrorétinographie a été très largement développée ces dernières années chez la
Souris. En effet, cette espèce est actuellement devenue le modèle de choix pour les
nombreuses maladies oculaires d‘origine génétique (Chang, 2013; Peachey et Ball,
2003). De plus, les tracés d’ERG sont comparables chez la Souris et chez l’Homme
(Geller, 2005; Tanimoto et al., 2013) et la manipulation génétique des Souris permet
d’obtenir régulièrement de nouveaux modèles à étudier. Cependant, bien qu’il s’agisse
d’une technique peu invasive, qui nécessite néanmoins une anesthésie, elle reste
relativement complexe à mettre en œuvre, surtout dans le cadre d’études
expérimentales. Par exemple, le protocole employé doit être normalisé afin que les
résultats soient comparables avec les données de la littérature et reproductibles
(Bayer et al., 2001). Par ailleurs, le matériel nécessaire aux mesures coûte
relativement cher et n’est donc pas disponible en dehors de grands centres
hospitaliers ou d’unités de recherche spécialisées. De plus, la réalisation et
l’interprétation des tracés d’ERG nécessitent une réelle expertise.
[46]
i.
Description d’un protocole chez la Souris
Étapes 1 – choix des souris témoins : Dans le cadre d’une étude
expérimentale, il est important de bien choisir les souris témoins afin que les deux lots
(muté/témoin) soit comparables. Par exemple, il a été démontré que les tracés ERG
variaient avec l’âge (C. Li et al., 2001) ; il faut donc étudier des souris d’âges similaires.
Globalement, lors de la réalisation d’ERG, de très nombreux facteurs entrent en jeu et
peuvent être à l’origine d’une variabilité non négligeable (Peachey et Ball, 2003;
Tanimoto et al., 2009). Afin de limiter l’introduction de biais de sélection, il est donc
fortement recommandé d’utiliser comme témoins des souris sauvages ou
hétérozygotes saines provenant des mêmes portées que les souris malades afin que
leurs génotypes et les conditions d’élevage soient le plus similaires possible.
Étapes 2 - Phase d’adaptation : dans un premier temps, il est nécessaire de
préparer les animaux en les plaçant à l’obscurité (adaptation scotopique). Cela permet
d’adapter les bâtonnets avant de réaliser les mesures. La durée de cette phase
d’adaptation est variable en fonction de l’espèce (Ropstad et Narfström, 2007). En
général, les animaux sont accoutumés à l’obscurité au cours de la nuit précédant
l’expérience, soit 12h au moins (Weymouth et Vingrys, 2008) mais selon certaines
études, 2h d’adaptation à l’obscurité peuvent suffire chez la Souris (Pinto et al., 2004).
L’opérateur peut aussi choisir de laisser les animaux en lumière vive (adaptation
photopique) pour évaluer le fonctionnement des cônes mais cette technique est moins
fréquemment employée chez la Souris dont la rétine est très majoritairement
composée de bâtonnets. En fonction du type d’adaptation, les tracés ne sont pas
interprétables de la même façon. Une adaptation dans des conditions scotopiques
permet d’étudier à la fois la réponse des bâtonnets et des cônes en fonction de
l’intensité du stimulus lumineux, alors qu’une adaptation dans des conditions
photopiques ne permet d’étudier que les cônes (DeMarco et al., 2007; Ropstad et
Narfström, 2007).
[47]
Étape 3 - Préparation des souris : lors de la réalisation de l’examen, il faut
que les pupilles de la souris soient en mydriase. Un collyre mydriatique doit donc être
appliqué environ 10 min avant le début des mesures. Par ailleurs, lors de
l’enregistrement, l’animal doit être immobile ; les souris sont donc anesthésiées. Les
molécules généralement utilisées pour anesthésier les souris sont un mélange de
kétamine, dissociatif (à des concentration comprises entre 67 et 80 mg/kg en fonction
des données de la littérature) et xylazine, α2-agoniste (de 12 à 16 mg/kg) (Peachey et
Ball, 2003; Tanimoto et al., 2009). L’injection du mélange anesthésique se fait par voie
intra-péritonéale. Ce protocole est adapté pour réaliser des mesures pendant 30 à
40 min ; si l’enregistrement dure plus longtemps, il faut augmenter les doses d’environ
20%. D’autres protocoles peuvent être utilisés mais il faut veiller à ne pas utiliser de
barbituriques qui peuvent avoir un effet sur le fonctionnement de la rétine et plus
particulièrement sur le fonctionnement des cellules bipolaires et des cellules de
Müller (Green et al., 2012; Kapousta-Bruneau, 1999).
Étape 4 - Mise en place du montage
Positionnement des souris
La partie de la pièce où seront installées les souris doit se trouver le plus loin
possible de tout parasite électrique pouvant interférer avec les tracés. En particulier, il
est préconisé que le matériel de mesure et les souris soient disposés dans une cage de
Faraday (Risse, 1999; Weymouth et Vingrys, 2008).
Une fois endormie, la souris est placée en position sternale sur un support
généralement situé à l’intérieur d’une coupole de Ganzfeld. Ce matériel permettra par
la suite une stimulation homogène de l’intégralité de la rétine (Tanimoto et al., 2009).
La coupole de Ganzfeld a été mise au point et sert de référence en médecine humaine
mais c’est aussi devenu l’une des sources lumineuses la plus fréquemment employée
chez la Souris (Bayer et al., 2001).
Finalement, étant donné que l’animal est anesthésié pendant les mesures, il
faut mettre en place des mesures de réchauffement pour maintenir la température
corporelle des souris (tapis chauffant, bouillottes…). Cela permet de limiter la
[48]
mortalité per-anesthésique mais c’est aussi important pour ne pas fausser les
mesures. En effet, il a été démontré que l’amplitude de l’ERG diminue quand la
température corporelle baisse (Kong et Gouras, 2003).
Positionnement des électrodes
Une électrode est ensuite positionnée au centre de chaque cornée. Cette
électrode, dite active, permet d’enregistrer de manière non invasive les courants
électriques intraoculaires reflétant l’activité de la rétine (Gelatt et al., 2013; Risse,
1999). Il existe différents types d’électrodes actives telles que les fibres Dawson Trick
Litzkowou ou des fils métalliques formant une boucle au contact de la cornée
(Peachey et Ball, 2003). Ces fils peuvent aussi être inclus dans un système de lentille.
Quelle que soit l’électrode utilisée, il est important de bien placer l’électrode au
contact de la cornée. Il faut aussi s’assurer que l’électrode ne bouge pas au cours des
mesures et que la position est à peu près similaire d’une souris à l’autre. En effet, bien
que l’influence de la position centrale de l’électrode n’ait pas été étudiée chez la souris,
il a été démontré que l’amplitude de l’ERG variait en fonction de la position de
l’électrode chez le Chien (Peachey et Ball, 2003). Il est conseillé d’humidifier la cornée
avec du sérum physiologique ou gel lacrymal avant de placer l’électrode.
Finalement, en plus des électrodes actives placées sur chaque cornée, deux
aiguilles inoxydables sont placées en position sous-cutanée au niveau du front et en
région lombaire proche de la queue de la souris. Ces aiguilles servent respectivement
d’électrode de référence et d’électrode de terre. Un exemple de montage réalisé pour
des mesures d’électrorétinogramme chez la souris est illustré Figure 8.
Les courants électriques perçus par l’électrode au niveau de la rétine étant de
très faible intensité, il est nécessaire de connecter l’électrode à un amplificateur
(Gelatt et al., 2013; Risse, 1999). Cet amplificateur permet aussi d’isoler les signaux
correspondant à l’activité électrique de la rétine en fonction de leur fréquence grâce à
un filtre passe-bande configuré par l’opérateur. Une fois le signal traité par l’amplificat
eur, les données sont récupérées par le biais d’un logiciel informatique
spécialisé. De plus, l’ensemble du montage doit être placé dans une cage de Faraday
[49]
afin de limiter les interférences extérieures qui peuvent entraîner des trémulations de
la ligne de base de l’ERG. Finalement, avant de lancer les mesures, il faut contrôler la
valeur de l’impédance des électrodes et l’aspect de la ligne de base de l’ERG. L’objectif
est d’avoir une impédance faible et stable pendant tout l’examen (Risse, 1999). Si
l’impédance est trop importante (> 10 mégohms) cela signifie que le contact ne se fait
pas correctement (Tanimoto et al., 2009). Si elle est trop faible (< 6 mégohms), il se
peut que l’électrode appuie trop fortement sur la cornée. Dans les deux cas, il faut
repositionner l’électrode. Le contact entre l’électrode et la cornée joue aussi sur la
ligne de base de l’ERG ; si le contact est bon celle-ci reste à peu près stable (Tanimoto
et al., 2009).
Figure 8 : Matériel utilisé pour la réalisation d'un électrorétinogramme.
(D’après Fouchère et Taleb 2012, photographies réalisées à l’ENVA, matériel du
Dr Chahory)
A. Vue d’ensemble. PM : plaque mobile chauffée à 37°C ; CG : coupole de Ganzfeld.
B. Disposition des électrodes. EA : électrodes actives ; ER : électrodes de référence ; ET :
électrode de terre.
A
B
Remarque : l’ordre de passage des animaux est important car de nombreux
facteurs extérieurs peuvent être à l’origine de variation dans les tracés ERG (humidité,
interférences électriques…). Certains auteurs recommandent de ne pas réaliser les
mesures à l’aveugle mais de passer les souris contrôles en alternance avec les souris
[50]
d’intérêt afin de limiter les biais liés aux conditions expérimentales (Tanimoto et al.,
2009).
Étape 5 – Stimulation lumineuse de la rétine et acquisition des données :
la stimulation lumineuse de la rétine peut être réalisée de différentes manières. En
général, la rétine est stimulée de façon homogène et dans son intégralité, on parle
d’ERG en champ total ou d’ERG Ganzfeld (Risse, 1999; Tanimoto et al., 2013). Ces ERG
nécessitent l’utilisation d’une coupole de Ganzfeld (décrite précédemment) dont les
parois sont hyper réfléchissantes (Tanimoto et al., 2009). Il est aussi possible de ne
stimuler qu’une partie de la rétine mais ce type de protocole n’est que très rarement
utilisé chez la Souris (Bayer et al., 2001).
Les stimulations lumineuses consistent en une succession de salves de flashs
lumineux blancs. Lors d’ERG réalisés en condition scotopique, les salves de flashs sont
d’intensité croissante au fur et à mesure de l’enregistrement afin de stimuler dans un
premier temps les bâtonnets seuls avec des intensités faibles puis les cônes et les
bâtonnets pour des intensités plus importantes et enfin les cônes seulement pour les
plus fortes intensités. Le protocole de stimulation le plus fréquemment rencontré
dans la littérature consiste en 10 séries de 10 flashs d’une même intensité (Tanimoto
et al., 2009). Les 10 flashs permettent d’obtenir une réponse moyenne pour une
intensité donnée et de limiter ainsi l’impact de la variabilité de la réponse en fonction
de l’environnement. Deux séries de flashs sont séparées par un intervalle permettant
la régénération des pigments photosensibles soit entre 5 et 30 secondes en fonction
de l’intensité de la série. La première série est réalisée à environ -4 log(cd.s/m²) et
l’intensité est accrue de 0.5 log(cd.s/m²) à chaque nouvelle série. La stimulation
lumineuse de la rétine se fait donc en général avec des intensités comprises entre -4 et
1.5 log(cd.s/m²) (Tanimoto et al., 2009). D’après les directives publiées par
l’ « International Society for Clinical Electrophysiology of Vision », il ne faut pas
dépasser un stimulus de 2 à 3 cd.s/m² ou 0,2 à 0,3 log(cd.s/m²) si on veut évaluer le
fonctionnement des bâtonnets (Gelatt et al., 2013; Marmor et al., 2008). Cependant, en
fonction des protocoles, il peut y avoir des variations concernant l’intensité minimale
et maximale testée, le nombre de séries réalisées, l’intervalle de temps ou d’intensité
[51]
entre deux séries de flashs ou encore le nombre de flashs par série. Ces nombreux
facteurs de variations rendent difficiles les comparaisons d’une étude à l’autre (Bayer
et al., 2001).
Suite à la stimulation lumineuse, le signal électrique relevé par l’électrode sur
la cornée est traité au niveau de l’amplificateur. Celui-ci reçoit un signal électrique de
très faible intensité, il le filtre, l’amplifie puis de le transmet à l’équipement
informatique (Risse, 1999). Les amplificateurs utilisés pour les ERG ont deux
caractéristiques très importantes (Risse, 1999). Ils sont différentiels, ce qui signifie
qu’ils n’amplifient que la différence de potentiel perçue entre l’électrode active et
l’électrode de référence. Cela permet d’éliminer les signaux parasites enregistrés par
les deux électrodes. Ils ont aussi un grand gain permettant de multiplier cette très
faible différence de potentielle par un facteur 1000 voire plus. Par ailleurs, l’étape de
filtration modifie l’aspect du tracé obtenu en fonction du filtre utilisé. Pour un ERG
standard, il faut sélectionner une bande passante de 0.3 à 300 Hz, soit le même filtre
que celui utilisé en médecine humaine (Tanimoto et al., 2009). En modifiant ce filtre, il
est possible d’observer d’autres composantes de la réponse rétinienne tels que les
potentiels oscillatoires qui sont visibles en choisissant une bande passante de 75 à
300 Hz (Tanimoto et al., 2009).
Pour finir, le signal transmis par l’amplificateur à l’équipement informatique
est transformé en une valeur numérique par un convertisseur analogique-numérique
(Risse, 1999). Les opérateurs disposent aussi souvent de programmes permettant de
faire de réaliser un filtrage numérique ou la moyenne de signaux obtenus après des
stimulations successives. En particulier, en faisant la moyenne de signaux successifs,
on améliore le rapport signal/bruit car le bruit de fond est aléatoire mais le signal est
corrélé à la stimulation.
[52]
ii.
Spécificités des électrorétinogrammes chez la Souris
Étant donné que les yeux de la Souris sont localisés sur le côté, contrairement
aux primates par exemple, il est recommandé de réaliser les mesures sur les deux
yeux en même temps (Tanimoto et al., 2009). Cela permet entre autres d’utiliser un
œil comme contrôle afin de détecter d’éventuels artéfacts ou anomalies oculaires
indépendantes de la maladie étudiée. Ainsi, lorsque les tracés des deux yeux diffèrent,
il faut contrôler le positionnement des électrodes et rechercher la présence d’une
lésion acquise unilatérale. Par exemple, il se peut qu’une lésion acquise du globe
oculaire telle qu’une opacification cornéenne soit à l’origine de l’aspect anormal
unilatéral du tracé. La majorité des lésions acquises sont en effet unilatérales,
contrairement aux atteintes congénitales (Tanimoto et al., 2009). Par précaution, il est
aussi recommandé de réaliser un examen oculaire complet avant l’ERG afin de
contrôler systématiquement l’absence de lésion des segments antérieur et postérieur
pouvant entraîner une modification des tracés. L’enregistrement des deux yeux peut
aussi s’avérer utile dans le cadre de tests thérapeutiques : seul un des yeux peut
recevoir le traitement, ce qui permet d’utiliser l’autre œil comme témoin (Tanimoto et
al., 2009).
iii.
Grille de lecture d’un électrorétinogramme chez la Souris
L’ERG est un signal global et complexe. Toutes les catégories de cellules de la
rétine participent à sa genèse (Pinto et al., 2007) comme l’illustre la Figure 9.
L’interprétation d’un ERG dépend des conditions d’adaptation préalables, du type de
stimulation, du type d’électrode et de la fréquence d’enregistrement de la réponse de
la rétine (Bayer et al., 2001). La fréquence d’enregistrement de la réponse de la rétine
permet d’obtenir soit un tracé de type ERG, soit des potentiels oscillatoires. Chez la
Souris, lors de la réalisation d’un ERG après une phase d’adaptation à l’obscurité et
avec une stimulation généralisée de la rétine, on obtient un tracé avec 3 ondes
reconnaissables (Peachey et Ball, 2003). La première onde générée par la rétine,
nommée onde a, correspond à une dépolarisation de la rétine. La seconde onde, onde
[53]
b, est une repolarisation brève et elle est suivie d’une repolarisation plus longue
nommée onde c (Figure 10).
Figure 9 : Origine des 3 ondes visibles sur l'électrorétinogramme de Souris.
D’après Donnell 2014.
L’étude de l’onde a permet d’obtenir une mesure quantitative qui traduit des
modifications des courants ioniques directement corrélée à l’activité électrique des
photorécepteurs (Pinto et al., 2007; Risse, 1999). A l’obscurité, les canaux ioniques
situés dans les segments externes des photorécépteurs sont ouverts : il y a alors un
flux entrant de Na+ (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Lors d’une stimulation lumineuse
de la rétine ces canaux se ferment ce qui entraîne une hyperpolarisation de la cellule.
L’onde a est donc le reflet direct de l’hyperpolarisation des segments externes en
réponse à la lumière. Cette hyperpolarisation est dépendante de l’intensité lumineuse.
Ainsi, plus l’intensité lumineuse est forte, plus les photorécepteurs sont
hyperpolarisés. De plus, chez la Souris, les cônes ne représentent que 3% des
photorécepteurs (Pinto et Enroth-Cugell, 2000). La réponse liée aux cônes est donc
généralement considérée comme négligeable lors de la réalisation d’un ERG
scotopique. L’onde a est donc parfois considérée comme représentative de l’activité
des bâtonnets seuls.
[54]
L’origine de l’onde b n’est pas aussi bien comprise que celle des ondes a et c.
Les hypothèses selon lesquelles cette onde serait liée à une accumulation de K + dans
les cellules de Müller ont été réfutées dans les années 1990. Des études réalisées plus
récemment chez diverses espèces (humains, amphibiens, chats…) aboutissent à la
conclusion que cette onde serait plutôt le reflet de l’activité des cellules bipolaires
(Pinto et Enroth-Cugell, 2000). Par ailleurs, l’onde b apparaît pour des intensités
lumineuses plus faibles que l’onde a (Peachey et Ball, 2003; Risse, 1999). Cela serait
en partie dû au fait qu’il y a une amplification du signal lors de la transmission de
l’information des photorécepteurs aux cellules bipolaires (Pinto et al., 2007). Ainsi,
l’onde b masque en grande partie l’onde a.
L’onde c est une grande onde lente qui intervient après l’onde a et l’onde b. Elle
serait le résultat de deux phénomènes opposés : d’une part, l’hyperpolarisation de
l’épithélium pigmentaire, de l’autre la dépolarisation des cellules gliales (Pinto et al.,
2007; Pinto et Enroth-Cugell, 2000). L’hyperpolarisation de l’épithélium pigmentaire
est liée à une diminution de la concentration en K + dans l’espace intercellulaire à
proximité du segment externe des photorécepteurs. En effet, ces derniers s’étant
hyperpolarisés à la réception du signal lumineux, la sortie de K + dans le milieu
extracellulaire a été diminuée. En conséquence, le gradient de K + entre le milieu
extracellulaire et la membrane de l’épithélium pigmentaire est modifié et conduit à
une hyperpolarisation des cellules épithéliales. L’onde c étant la somme de deux
courants opposés, elle peut présenter une polarité positive ou négative toutefois, la
plupart du temps, c’est l’épithélium pigmentaire qui prend le dessus et l’onde apparait
positive.
[55]
Figure 10 : Les 3 composantes de l'électrorétinogramme de Ganzfeld d’une souris
C57Bl/6J et leurs mesures d'après Pinto et al, 2007.
A : caractéristiques et mesures des ondes a, b et c à partir d’un tracé
électrorétinogramme obtenu suite à un stimulus de forte intensité lumineuse.
B : variation de l’aspect du tracé électrorétinogramme en fonction de l’intensité
lumineuse du stimulus. L’onde b est la première onde détectable (tracé rouge).
C : extrapolation - aspect que les ondes a, b et c pourraient avoir s’il était possible de les
mesurer séparément.
iv.
Paramètres mesurables sur les tracés d’électrorétinogramme chez la Souris
A partir d’un tracé d’ERG, il est possible de quantifier plusieurs paramètres. Ces
paramètres permettent de décrire plus précisément les trois ondes et apportent donc
des informations sur l’activité des photorécepteurs, des cellules bipolaires ou le
fonctionnement de l’épithélium pigmentaire. L’amplitude ainsi que le temps de
culmination (aussi nommé temps de latence ou « implicite time » en msec) de chaque
onde sont les paramètres de référence très fréquemment utilisés dans la littérature
(Risse, 1999). Ils sont directement quantifiables à partir des tracés d’ERG comme
[56]
l’illustre la Figure 11. L’amplitude de l’onde b est souvent nommée Vmax et elle est
donnée en μV. Certains autres paramètres, tels que le scotopic threshold response, ont
été définis pour les besoins de nouvelles études, ils nécessitent des protocoles
d’enregistrement d’ERG particuliers et ils ne seront pas détaillés ici (Ropstad et
Narfström, 2007; Saszik et al., 2002). L’extrapolation de ces différentes données à
partir des courbes permet d’obtenir des données quantifiables et objectives qui
facilitent la comparaison des lots témoins et d’étude ou encore de deux études
différentes.
Figure 11 : Illustration des paramètres mesurables à partir d'un électrorétinogramme
obtenu en condition scotopiques (d’après l’institut clinique de la souris).
[57]
v.
Origine des variations observables dans les tracés d’électrorétinogramme
Variations liées à l’expérimentation : les tracés ERG varient en fonction de
l’intensité du flash émis pour stimuler la rétine. En effet l’amplitude des ondes
augmente et les temps de latence diminuent quand l’intensité du flash augmente
(Geller, 2005).
Variations physiologiques : Il existe de nombreuses causes de variations
physiologiques d’un ERG (Peachey et Ball, 2003; Tanimoto et al., 2013). Il est
important d’en tenir compte pour éviter toute surinterprétation. Une des premières
sources de variation physiologique des ERG est l’âge de l’animal. En effet, il a été
démontré que l’amplitude des tracés ERG diminuait avec l’âge (C. Li et al., 2001;
Peachey et Ball, 2003). Le sexe de l’animal pourrait aussi être une cause de variation
des tracés (Rigaudière, 2009). Par ailleurs, s’il semble évident que les ERG soient
variables en fonction des espèces, il a aussi été démontré qu’il existait des variations
physiologiques en fonction des lignées de Souris. Ainsi, la Souris C57Bl/6J présente
une onde c plus marquée et plus positive que d’autres lignées. La différence
d’amplitude entre l’onde a et l’onde b est aussi plus importante dans cette lignée
(Pinto et al., 2007). Un dernier facteur de variation dans le tracé ERG serait la
température corporelle de l’animal (Kong et Gouras, 2003). En effet, il a été démontré
que l’amplitude des ondes serait diminuée sur un animal en hypothermie. Il faut donc
bien contrôler la température des animaux au cours des enregistrements. Cette liste
de facteurs de variations physiologiques des ERG n’est pas exhaustive mais elle
illustre les point devant être pris en compte lors de la mise au point d’un protocole
expérimental afin de ne pas introduire de biais de confusion potentiel.
Variations liées à des artéfacts : l’application de sérum physiologique en
excès sur la cornée peut entraîner une distorsion de l’aspect des ondes et une
instabilité marquée de la ligne de base (Pinto et al., 2007). Un mauvais positionnement
de l’électrode peut avoir un effet similaire sur le tracé d’ERG. Dans les deux cas, il est
possible de corriger le problème en séchant l’œil et en replaçant l’électrode.
[58]
Variations pathologiques : Les maladies héréditaires affectant la rétine sont
aussi à l’origine de nombreuses variations dans les tracés ERG chez la Souris qui
représente un modèle de choix pour ces affections. Ces variations ne sont pas
détaillées ici mais ont été décrites dans un article de revue paru en 2003 : (Peachey et
Ball, 2003). Les tracés y sont aussi présentés et peuvent s’avérer utiles à titre de
comparaison.
[59]
5. La Souris, modèle d’étude des dégénérescences
rétiniennes
Les dégénérescences rétiniennes sont un ensemble de maladies d’origine et de
forme clinique variées qui ont pour caractéristique commune une perte plus ou moins
progressive de la vision due à un phénomène neurodégénératif touchant
principalement les photorécepteurs (Veleri et al., 2015). Ceux-ci peuvent notamment
être lésés directement, ou secondairement à une atteinte de l’épithélium pigmentaire.
En effet, l’épithélium pigmentaire ayant pour rôle d’assurer les apports en nutriment
et la détoxification des photorécepteurs, tout dysfonctionnement de cet épithélium a
un impact négatif sur ces derniers. Actuellement, les dégénérescences rétiniennes font
partie des causes les plus fréquentes de cécité incurable chez l’Homme (Athanasiou et
al., 2013; Veleri et al., 2015). Le modèle murin est donc très largement utilisé afin
d’identifier les gènes impliqués et de caractériser les différentes formes de maladies
dégénératives rétiniennes d’origine génétique. Ce modèle n’est toutefois pas idéal car,
contrairement à l’Homme, la Souris ne présente pas de fovéa et la proportion de cônes
est très faible.
a. Les différents types de dégénérescence rétinienne
Il existe de nombreuses causes de dégénérescence rétinienne mais, dans la
majorité des cas, il est possible de les classer en deux sous-groupes : les maladies
d’origine génétique monogénique (maladies mendéliennes) ou les maladies
multifactorielles (complexes) (Veleri et al., 2015). Les maladies mendéliennes les plus
fréquentes sont les formes de rétinite pigmentaire ; la maladie multifactorielle la plus
fréquente est la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Il est aussi possible de qualifier
les maladies dégénératives de la rétine en fonction du type de cellules touchées en
premier (cônes ou bâtonnets). Cette information sert au diagnostic différentiel
puisque, lors d’atteinte primaire des bâtonnets, la vision nocturne est perdue en
premier. Finalement, certaines dégénérescences rétiniennes mendéliennes sont
systémiques, c'est-à-dire que la rétine n’est pas le seul organe touché. Le tableau
[60]
clinique est alors bien plus complexe comme, par exemple, dans le cas du syndrome
d’Usher caractérisé par une perte d’audition en plus de la déficience visuelle (Veleri et
al., 2015).
En ce qui concerne les dégénérescences rétiniennes mendéliennes, de très
nombreux gènes ont été mis en cause au cours de la dernière décennie. On en
dénombre actuellement plus de 200 avec près de 1500 mutations causales différentes
(Veleri et al., 2015). Le mode de transmission de ces maladies ainsi que leur forme
clinique sont très variables. Ainsi, différentes mutations d’un même gène peuvent
entraîner des formes cliniques différentes alors que des mutations de gènes différents
donnent parfois des formes cliniques similaires.
La forme la plus fréquente de maladie dégénérative rétinienne chez l’Homme
est la rétinite pigmentaire. Cette maladie touche environ 1 personne sur 3000-7000 et
se caractérise par l’atteinte des bâtonnets dans un premier temps (Veleri et al., 2015).
La première mutation identifiée comme étant responsable de rétinite pigmentaire
touchait le gène codant pour la rhodopsine ; actuellement 25% des mutations à
l’origine de rétinite pigmentaire touchent ce gène (Athanasiou et al., 2013).
En plus de prédispositions génétiques, la rétine est soumise à de nombreux
stress et facteurs environnementaux (tels qu’une lumière trop intense ou le stress
oxydatif) qui peuvent être à l’origine de son altération (Athanasiou et al., 2013). Ces
facteurs interviennent généralement dans le cadre des maladies multifactorielles telle
que la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Notons que les photorécepteurs sont les
cellules rétiniennes les plus sensibles à ce type de stress. Il a ainsi été démontré que
l’exposition à une lumière trop vive pouvait léser les photorécepteurs et l’épithélium
pigmentaire et donc induire une dégénérescence rétinienne à plus ou moins long
terme.
[61]
b. Caractéristiques cliniques et histologiques des dégénérescences
rétiniennes
Les dégénérescences rétiniennes se caractérisent cliniquement par une cécité
généralement bilatérale, d’apparition le plus souvent progressive. Chez les animaux, il
est toutefois rare de détecter la maladie en cours d’évolution car il est difficile pour les
propriétaires ou les animaliers d’observer cette perte progressive de la vision. Elle est
donc diagnostiquée à des stades relativement tardifs.
En plus des signes de cécité observables lors de l’examen ophtalmologique, les
dégénérescences rétiniennes sont à l’origine de lésions caractéristiques visibles à
l’examen du fond d’œil Figure 12 (Chang, 2013; Pinto et al., 2004; Veleri et al., 2015). Il
y a généralement un amincissement, voire une disparition dans les stades les plus
avancés, des vaisseaux rétiniens et le fond d’œil présente une couleur hétérogène.
Si, à la suite de l’examen ophtalmologique, une forme de dégénérescence
rétinienne est suspectée, il est recommandé de réaliser un ERG (Chang, 2013; Pinto et
al., 2004). En effet, l’ERG permet tout d’abord de confirmer que l’atteinte se situe bien
au niveau de la rétine. Cela permet aussi de déterminer le type de photorécepteur
atteint. Par exemple, étant donné que les bâtonnets sont les premières cellules
touchées lors de rétinite pigmentaire à un stade débutant, l’ERG est plat pour des
flashs de faibles intensités lumineuses alors qu’il est quasiment normal pour des
flashs de fortes intensités lumineuses qui ne font normalement intervenir que les
cônes. Lors de rétinite pigmentaire très évoluée les cônes sont aussi touchés. L’ERG a
alors un tracé plat quelle que soit l’intensité des flashs lumineux comme l’illustre la
Figure 12
Finalement, lors de suspicion de dégénérescence rétinienne, l’obtention de
données histologiques sur la rétine permet d’obtenir un diagnostic de certitude. En
effet, les dégénérescences rétiniennes se traduisent histologiquement par un
amincissement, voire une disparition de la couche des photorécepteurs de la rétine
[62]
(Veleri et al., 2015). Cela est dû à une mortalité de ces cellules par apoptose (Remé et
al., 2000). Cependant, la rétine étant une structure située en profondeur de l’œil,
obtenir des informations sur son épaisseur n’est pas facile. Ce type d’information peut
être obtenu à partir de coupes histologiques des yeux ex vivo. Toutefois, cela nécessite
que la souris soit décédée ou ait été euthanasiée pour les besoins de l’étude. Au début
des années 90, une technique d’imagerie médicale nommée TCO (Tomographie par
Cohérence Optique) a été mise au point. Ce dispositif permet de révéler de manière
non invasive les structures internes de l’œil, entre autres, avec une définition
micrométrique (Figure 12) (Sacchet, 2010). Le TCO est donc rapidement devenu un
outil indispensable au diagnostic de dégénérescences rétiniennes chez l’Homme. Cette
technique d’imagerie présente aussi l’avantage de permettre un suivi des lésions au
cours du temps chez un même individu ce qui est particulièrement intéressant lors
d’essai thérapeutique par exemple (Q. Li et al., 2001). Malgré tout le TCO reste une
technique difficilement accessible dans le cadre d’études expérimentales sur animaux
de laboratoire (matériel encore peu disponible, nécessitant un certain niveau
d’expertise).
[63]
Figure 12 : Caractérisation des dégénérescences rétiniennes chez la Souris (d'après Veleri et al. 2015).
i : Photographie du fond d’œil et coupe de la rétine par tomographie par cohérence optique (TCO) d’une souris saine (phénotype sauvage).
ii : Photographie du fond d’œil et coupe de la rétine par TCO d’une souris mutante rd1 présentant une dégénérescence rétinienne. Sur le fond
d’œil, on observe une disparition de la vascularisation rétinienne et des plages de couleur hétérogène. L’image en TCO révèle une rétine
nettement amincie et une quasi-disparition de la couche des photorécepteurs.
iii : Électrorétinogramme sur une souris sauvage (tracé noir) et d’une souris mutée rd1 (tracé rouge) dans différentes conditions de luminosité
afin de tester la réponse des bâtonnets et celle des cônes. Les deux types de photorécepteurs sont lésés chez la souris présentant la
dégénérescence rétinienne (aucune activité n’est enregistrée quelles que soient les conditions de mesure
[64]
II.
LES ACIDES GRAS À TRÈS LONGUE CHAÎNE DANS LA RÉTINE
1. Nomenclature des acides gras
Par définition, un acide gras est un acide carboxylique à chaîne aliphatique. La
chaîne carbonée comporte le plus souvent un nombre pair de carbones compris entre
4 et 36 (Cuvelier et al., 2004). En effet, les acides gras sont synthétisés par addition
itérative de deux carbones à l’acyl-Coa. Chez les mammifères, une partie des acides
gras sont produits par les cellules, le reste provient des apports alimentaires.
Il existe une très grande variété d’acides gras dans le monde du vivant. Ils sont
classés suivant le nombre de carbones de leur chaîne aliphatique et suivant leur
nombre d’insaturations. Toutefois, ces classifications évoluent encore de nos jours au
fil des découvertes scientifiques.
La classification que j’ai choisie d’utiliser par la suite a été définie à partir du
mode de synthèse des acides gras. En effet, les acides gras jusqu’à 16 carbones sont
synthétisés par la fatty acid synthase dans le cytosol. Au delà, l’élongation des acides
gras nécessite de recourir à d’autres enzymes localisées dans le réticulum
endoplasmique. Les acides gras comportant au moins 18 carbones sont donc nommés
Very Long Chain Fatty Acids (VLCFA), ce qui se traduit en français par acides gras à
très longue chaîne (Jakobsson et al., 2006). Bien que présents chez la majorité des
êtres vivants, des mammifères aux bactéries et champignons, les VLCFA ne
représentent qu’une faible fraction des acides gras dans un organisme, à savoir moins
de 10% (Tvrdik et al., 2000). Le groupe des VLCFA est ensuite subdivisé en deux
sous-groupes : d’un côté les C22 et les C24 qui sont ubiquitaires, de l’autre les VLCFA
comportant au moins 26 carbones, nommés Ultra Long Chain Fatty Acids (ULCFA). Ces
derniers se retrouvent spécifiquement dans certains tissus tels que la peau,
l’encéphale, les glandes oculaires de Méibomius, les testicules et la rétine.
[65]
Les acides gras sont aussi classés suivant leur nombre d’insaturations. Ils sont
qualifiés de :
-
saturés (Saturated Fatty Acid, SFAs) : si la chaîne carbonée ne comporte
aucune double liaison carbone-carbone, tous les carbones sont alors saturés
en hydrogène,
-
monoinsaturés (MonoUnsaturated Fatty Acids, MUFAs) : s’il n’y a qu’une
seule double liaison,
-
polyinsaturés (PolyUnsaturated Fatty Acids, PUFAs) : s’il y a plusieurs
doubles liaisons. Les VLC-PUFA sont subdivisés en sous-catégories en fonction
de la position de leur première insaturation, la plus proche du groupe méthyle
terminal (Cuvelier et al., 2004). Les séries ω6 et ω3 sont respectivement
constituée des acides gras dont la première double liaison est située entre le 6 e
et le 7e carbone ou entre le 3e et le 4e carbone (Figure 13).
Figure 13 : Exemples de deux acides gras à très longue chaîne polyinsaturés de la famille
des ω6, l’acide arachidonique, et des ω3, l’acide docosahexanoïque. (D’après Shaikh and
Edidin, 2006).
Écriture : (n : mx,y) où n correspond au nombre de carbones de l’acide gras, m au nombre
d’insaturation et les exposants (x, y) décrivent la position de ces insaturations. Les notations
(n-6) et (n-3) indiquent la position de la première insaturation à partir de l’extrémité
aliphatique, il s’agit donc respectivement d’acides gras de la série des ω6 et ω3.
[66]
2. Synthèse des Very Long Chain Fatty Acids et des Ultra
Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids
Contrairement aux acides gras plus courts synthétisés dans le cytosol, la
synthèse des VLCFA a lieu dans le réticulum endoplasmique à partir d’acides gras à
longue chaîne. Ces derniers peuvent avoir été formés par la cellule elle-même,
provenir d’autres cellules ou de l’alimentation. Afin d’obtenir des VLCFA, les acides
gras à longue chaîne subissent plusieurs cycles d’élongation identiques. La chaîne
carbonée initiale est ainsi rallongée de deux carbones par cycle. Ce cycle d’élongation
est composé de 4 étapes : condensation, réduction, déshydratation et une seconde
réduction, comme l’illustre la Figure 14. Les étapes de condensation et de
déshydratation catalysées respectivement par les isoenzymes ELOV 1 à 7 et les
isoenzymes HACD 1 à 4 sont les deux étapes limitantes du cycle (Sassa et Kihara,
2014). Les deux étapes de réduction nécessitent l’oxydation parallèle de NADPH.
Figure 14 : Cycle d'élongation des acides gras à très longue chaîne chez les mammifères
d’après Sassa et Kihara, 2014.
N
[67]
Notons qu’il existe sept isoenzymes d’ELOVL. Ces isoenzymes présentent des
spécificités de substrat, comme l’illustre la Figure 15 (Sassa et Kihara, 2014), ou ne
s’expriment pas dans les mêmes tissus. Ainsi, par exemple, ELOVL4 est la seule ELOVL
capable de réaliser une condensation sur un substrat comportant une chaîne carbonée
polyinsaturée de 24 carbones ou plus. Cette enzyme est donc nécessaire à la formation
des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acid, ULC-PUFA. Cette enzyme est aussi
exprimée dans certains tissus comme la peau, l’encéphale, les testicules et la rétine qui
contient des ULCFA. Une étude d’Elovl4 a d’ailleurs mis en évidence que son
expression au niveau de la rétine était conservée chez de nombreux mammifères et
qu’elle était principalement localisée au niveau des photorécepteurs chez l’adulte
(Lagali et al., 2003).
[68]
Figure 15 : Voies d'élongation des acides gras à très longue chaîne chez l'Homme
d’après Sassa et Kihara, 2014.
Les isoenzymes ELOV capables de catalyser chaque étape sont indiqués : E1 à E7. Les ∆
représentent des désaturases.
Légende
Cn:m où n correspond au
nombre de carbone et m au
nombre d’insaturation
ULCFA : Ultra Long Chain
Fatty Acid (au moins 26
carbones)
Séries ω6 et ω3 : acides gras
polyinsaturés dont la
première insaturation se
trouve au niveau du 6e et 3e
carbone respectivement.
[69]
3. Rôles des Very Long Chain Fatty Acids et des Ultra Long
Chain-PolyUnsaturated Fatty Acids à l’échelle cellulaire
a. Le rôle des sphingolipides comportant des Very Long Chain Fatty
Acids
La principale particularité fonctionnelle des VLCFA tient au fait qu’ils
participent à la formation des sphingolipides (Hannun et Obeid, 2008; Posse de
Chaves et Sipione, 2010). En effet, très peu de VLCFA restent sous forme non estérifiée
après avoir été synthétisés. La majorité des VLCFA intracellulaires sont estérifiés pour
former différents dérivés lipidiques, en particulier des sphingolipides et dans une
moindre mesure des glycérophospholipides (Agbaga et al., 2010; Tvrdiket al., 2000).
Les sphingolipides résultent de la condensation d’une base sphingoïde (base
aminée à chaîne longue) avec un VLCFA et un radical plus ou moins complexe. La
sphingosine est la base sphingoïde la plus fréquemment rencontrée chez les vertébrés.
La structure des sphingolipides est illustrée Figure 16 (Malagarie-Cazenave et al.,
2002). Les céramides sont les sphingolipides les plus simples puisque leur radical est
un atome d’hydrogène. La production des sphingolipides plus complexes se fait à
partir des céramides (Denic et Weissman, 2007) (Figure 17).
Figure 16 : Structure des sphingolipides, d’après Malagarie-Cazenave et al., 2002.
AGTLC : Acides Gras À
Très Longue Chaîne,
aussi nommé Very Long
Chain Fatty Acids (au
moins 18 carbones)
[70]
Figure 17 : Métabolisme des sphingolipides (D’après Denic et Weissman, 2007)
Légende :
AG : Acides Gras
AGLC : Acides Gras à Longue
Chaîne (14 à 20 carbones)
AGTLC : Acides Gras à Très
Longue Chaîne aussi nommé
Very Long Chain Fatty Acids
(au moins 18 carbones)
Les sphingolipides sont des acteurs essentiels à de nombreuses fonctions
cellulaires. Ainsi, il a été démontré qu’un défaut de synthèse des sphingolipides
entraîne un arrêt de la croissance cellulaire chez les levures et des cellules de
mammifère (Tvrdik et al., 2000). La grande majorité des sphingolipides sont localisés
dans les membranes cellulaires où ils présentent la propriété de former des radeaux
lipidiques : nanodomaines membranaires plus rigides que le reste de la membrane et
enrichis en cholestérol (Posse de Chaves et Sipione, 2010). Ces domaines modulent
l’activité de nombreuses voies de signalisation et de trafic membranaire.
Une seconde étude réalisée sur des levures déficitaires en sphingolipides a
démontré que des glycérophospholipides contenant des VLCFA pouvaient reproduire
des structures similaires à celles des sphingolipides et ainsi rétablir la croissance
cellulaire (Tvrdik et al., 2000). Ce résultat suggère que la très longue chaîne des
VLCFA joue un rôle structural majeur, qu’elle soit présente dans des sphingolipides ou
des phospholipides.
[71]
b. Le rôle des Ultra Long Chain Fatty Acids dans la plasticité des
membranes cellulaires
Une
dernière
étude
a
démontré
que
les
ULCFA
précurseurs
de
phosphatidylinositols jouent à rôle essentiel dans la stabilisation de l’enveloppe
nucléaire chez la levure. Une des hypothèses émises afin d’expliquer le rôle des ULCFA
dans la stabilisation membranaire repose sur le fait qu’à partir de 24 carbones, les
acides gras ont la capacité de s’interdigiter dans les deux couches lipidiques d’une
membrane. Cela peut avoir deux conséquences : d’une part une réduction de
l’épaisseur de la membrane et d’autre part un encombrement asymétrique d’une des
deux bicouches. Dans ce dernier cas, cela favorise une forte courbure membranaire
que les VLCFA soient localisés dans une des couches ou l’autre comme le montre la
Figure 18. Les fortes courbures membranaires telles que celles des photorécepteurs
pourraient être favorisées par la présence d’ULCFA (Schneiter et al., 2004).
Figure 18 : Modèles de fortes courbures membranaires favorisées par la présence
d’acides gras à ultra longue chaîne asymétriques (d’après Schneiter et al., 2004).
A. Aspect d’une membrane fortement courbée en l’absence d’ULCFA. Les flèches en A
indiquent des espaces libres qui déstabilisent cette configuration.
B. Aspect d’une membrane fortement courbée grâce à la présence d’ULCFA saturés
interdigités dans la couche externe de la membrane. Les phospholipides ne contenant
qu’un VLCFA sont en effet assymétriques, avec un encombrement stérique externe plus
important.
C. Aspect d’une membrane fortement courbée grâce à la présence d’ULCFA dans la
couche interne. Les VLCFA fortement insaturés présentent en effet un grand
encombrement stérique de par les coudes conférés par les doubles liaisons.
A
B
C
[72]
c. Les Ultra Long Chain Fatty Acids dans les sécrétions des glandes de
Méibomius
En temps normal, la cornée est recouverte d’un film lacrymal qui l’hydrate, la
protège et forme une surface lisse et régulière permettant une meilleure réfraction de
la lumière (Sassa et Kihara, 2014). Ce film est composé de 3 phases : la phase
mucinique, interne, qui permet l’adhérence du film sur la cornée, la phase aqueuse,
phase majoritaire, et la phase lipidique, externe qui limite l’évaporation de la phase
aqueuse. Chaque phase est sécrétée par des glandes différentes et, en particulier, ce
sont les glandes de Méibomius (Figure 19), aussi nommées glandes tarsales, qui
produisent la majorité de la phase lipidique, aussi nommé méibum. Chez l’Homme, il
existe une soixantaine de glandes de Méibomius qui s’abouchent au niveau du bord
libre des paupières supérieures et inférieures.
Les principaux composants de méibum sont des esters de cholestérol et des
cires (McMahon et al., 2014; Sassa et Kihara, 2014). Chacune de ces deux composantes
représente environ 30% de cette phase. Les principaux acides gras retrouvés dans
cette phase lipidiques sont des ULCFA saturé ou monoinsaturés. En comparaison et
contrairement à ce qui a été observé dans la rétine, le méibum contient très peu de
ULC-PUFA. Selon (Agbaga et al., 2010), cela pourrait être due à la fragilité des acides
gras polyinsaturés dont les doubles liaisons sont très sensibles aux stress oxydatif. Or,
les sécrétions lacrymales sont particulièrement exposées aux ultraviolets et autres
facteurs environnementaux. Il en est de même pour la peau qui contient aussi très peu
de ULC-PUFA. D’autre part, une étude portant sur la composition lipidique du méibum
chez l’Homme, la Souris, le Chien et le Lapin a révélé que le méibum le plus proche de
celui de l’Homme est celui de la Souris (Butovich et al., 2012).
Le rôle exact des ULCFA dans le mébium n’est pas encore parfaitement compris
mais il semblerait qu’une atteinte des glandes de Méibomius ou qu’une modification
quantitative ou qualitative de la composition lipidique du méibum puisse contribuer
au déclenchement d’un syndrome de l’œil sec, ou dry eye dysfunction, maladie de
[73]
forme chronique qui affecte des millions de personnes chaque année (McMahon et al.,
2014). D’autre part, selon une étude récente de McMahon et son équipe, il apparait
que le gène Elovl4, qui code la première enzyme du cycle d’élongation des VLCFA, est
fortement exprimé au niveau des glandes de Méibomius. Une mutation de ce gène
avait des conséquences directes sur la composition lipidique du film et entraînait un
syndrome de l’œil sec chez les souris mutées, en plus de la maladie de Stargardt 3
décrite un peu plus bas. Ce syndrome se traduisait chez les souris, comme chez
l’Homme, par une augmentation de la fréquence de clignement des paupières ainsi
que du taux de recouvrement de l’œil par les paupières et par des modifications
histologiques des glandes de Méibomius.
Figure 19 : Anatomie de la paupière supérieure.
À gauche : représentation schématique d’une coupe de paupière supérieure (d’après
Yaw-Jong, 2012).
A droite : cliché histologique, l’annotation M indique l’emplacement des glandes de
Méibomius et l’annotation Orb indique l’emplacement du muscle orbiculaire (« Eye Anatomy of eyelid », 2007).
[74]
d. Rôles spécifiques des Very Long Chain Fatty Acids polyinsaturés
Certains VLCFA exercent des fonctions spécifiques grâce à leurs nombreuses
insaturations. Par exemple, les VLCFA polyinsaturés de la série des ω3 (tel que l’acide
docosahexaénoïque ou DHA C22:6, illustré Figure 13) sont des substrats participant à
la synthèse de facteurs anti-inflammatoires (Shaikh et Edidin, 2006). Les VLCFA
polyinsaturés de la série des ω6 participent quant à eux à la formation de facteurs
pro-inflammatoires.
Le rôle des VLCFA polyinsaturés dépend aussi de leur nombre de carbones.
Ainsi, les VLCFA polyinsaturés comportant au moins 26 carbones (ULC-PUFA) ne sont
observés que dans certains tissus et exercent là encore des fonctions qui leurs sont
spécifiques. Contrairement aux autres acides gras qui sont pour la plupart
ubiquitaires, les ULC-PUFA se retrouvent essentiellement dans trois tissus :
l’encéphale, les testicules et la rétine (Sassa et Kihara, 2014). Ces ULC-PUFA
participent à la formation de la myéline et à l’établissement de domaines
membranaires particuliers que sont les segments externes des photorécepteurs, les
jonctions entre cellules de Sertoli et la membrane plasmique et externe de l’acrosome
de la tête des spermatozoïdes (Kihara, 2012).
Dans le cadre de notre étude portant sur la rétine, nous nous intéresserons plus
particulièrement aux ULC-PUFA et à leur rôle dans les segments externes des
photorécepteurs. Cela sera détaillé un peu plus loin dans le paragraphe 5, dédié à la
composition et au rôle des ULC-PUFA dans la rétine.
[75]
4. Rôle des Very Long Chaîn Fatty Acids et Ultra Long
Chaîn Fatty Acids à l’échelle de l’organisme
La détermination du rôle des VLCFA à l’échelle de l’organisme a débuté avec
des études nutritionnelles : expériences d’enrichissement ou, à l’inverse, de carences
réalisées à la fois chez l’Homme et chez l’Animal (Agbaga et al., 2010; Shaikh et Edidin,
2006). Ces premières études ont permis en particulier d’établir le rôle essentiel des
VLC-PUFA dans l’encéphale, la rétine et les testicules.
Ces premières informations ont, par la suite, été complétées par des études
portant sur des inactivations et mutations de gènes codant pour les enzymes de
synthèse de ces VLCFA. Pour rappel, quatre enzymes participent au cycle d’élongation
des VLCFA (Figure 14) : la condensation est catalysée par les isoenzymes ELOVL1 à 7,
la première réduction par l’enzyme KAR, la déshydratation par les isoenzymes HACD1
à 4, et la seconde réduction par l’enzyme TER (Sassa et Kihara, 2014). Les étapes de
condensation et de déshydration sont les deux étapes limitantes du cycle. Une
mutation touchant l’un des gènes codant pour ces enzymes aura pour conséquence
une diminution, voire une absence, de VLCFA à l’échelle de l’organisme ou d’un tissu.
En étudiant les conséquences de ces mutations, il est donc possible de déduire les
principaux rôles des VLCFA ou ceux des produits de leur métabolisme.
a. Effet de l’inactivation du gène Kar chez la Souris
Il existe un seul gène codant pour l’enzyme 3-Ketoacyl-CoA Reductase, KAR
aussi nommée Hydroxysteroid (17β) Dehydrogenase 12, catalysant la première
réduction du cycle d’élongation des VLCFA. Chez la Souris, l’inactivation de ce gène a
pour conséquence une létalité embryonnaire à cause de défaut d’organogenèse
(Rantakari et al., 2010). Cela signifie que les VLCFA sont indispensables au
développement embryonnaire.
[76]
b. Effet de l’inactivation des gènes Elovl chez la Souris
Il existe sept isoenzymes ELOVL qui catalysent la condensation, première étape
du cycle d’élongation des VLCFA (Sassa et Kihara, 2014). On pourrait donc s’attendre à
ce que la mutation d’un des gènes Elovl n’entraîne pas de conséquence phénotypique
majeure. En effet, il est possible de supposer que les autres isoenzymes puissent
compenser ce déficit. Cependant, les différentes études réalisées sur des souris
mutantes pour les Elovl ont démontré que cette compensation n’était que partielle
(Jakobsson et al., 2006; Shimano, 2012; Zadravec et al., 2011, 2010). En effet, ces
isoenzymes présentent des spécificités de substrat, comme l’illustre la Figure 15, ou
ne s’expriment pas dans les mêmes tissus. L’inactivation de l’un des gènes Elovl est
donc à l’origine de phénotypes partiels et variables en fonction de l’isoenzyme
inactivée. Ces phénotypes partiels sont particulièrement informatifs car ils permettent
de déduire certains rôles des VLCFA qui seraient masqués par une létalité
embryonnaire observée en cas d’absence complète de synthèse des VLCFA (cas de la
mutation Kar par exemple, cf. paragraphe précédent).
L’inactivation des gènes Elovl1 ou Elovl4 entraîne la mort des souris dans les
heures suivant la naissance (Sassa et al., 2013; Vasireddy et al., 2007). Ces animaux
souffrent de déshydratation sévère due à un défaut de fonctionnement de la barrière
cutanée, par déficit en céramides comprenant des ULCFA. Ces derniers sont en effet
indispensables au bon fonctionnement de la barrière cutanée.
L’inactivation du gène Elovl2 entraîne, quant-à elle, une infertilité chez les
individus mâles en raison d’un arrêt de la spermatogenèse après le stade de formation
des spermatides secondaires (Zadravec et al., 2011). L’étude de la composition
lipidique des testicules des souris mutées a montré que cette infertilité est corrélée à
un déficit en VLCFA polyinsaturés. Or, à l’échelle cellulaire, il a été évoqué que les
testicules comportent des ULC-PUFA qui leur sont spécifiques et qui participeraient à
l’établissement de domaines membranaires particuliers au niveau des cellules de
[77]
Sertoli et sur les spermatozoïdes. Un déficit dans ces ULC-PUFA serait donc à l’origine
de cette infertilité.
Finalement, les mutations touchant les gènes Elovl 3 et 6 ont des conséquences
phénotypiques modérées. Les souris mutées pour les gènes Elovl3 et Elovl6 présentent
une meilleure tolérance au glucose en cas d’alimentation hypercalorique (Shimano,
2012; Zadravec et al., 2010). D’autre part, les souris mutantes pour le gène Elovl5
présentent une stéatose hépatique secondaire à une stimulation de la lipogenèse.
L’impact de ces trois mutations témoigne du rôle des VLCFA dans le métabolisme
lipidique et glucidique.
Finalement, il n’existe actuellement pas d’étude concernant les effets de
l’inactivation du gène Elovl7.
Remarque : En parallèle, chez l’Homme, une mutation du gène ELOVL5 a
récemment été identifiée comme étant la mutation causale d’une ataxie
spinocérébelleuse, une maladie neurodégénérative (Di Gregorio et al., 2014). De
même, des mutations du gène ELOVL4 sont responsables de la maladie de Stargardt 3,
dégénérescence maculaire juvénile, chez l’Homme. Nous reviendrons en détail sur
cette maladie et son modèle murin dans le paragraphe 5 consacré au rôle des ULCFA
dans la rétine.
[78]
c. Effet d’une mutation du gène Ter
Le gène Ter est le seul gène qui code pour l’enzyme responsable de la 4ème
étape du cycle d’élongation des VLCFA. L’inactivation de ce gène n’a a priori pas été
étudiée chez la Souris mais une mutation de ce gène serait à l’origine d’un retard
mental non syndromique chez l’Homme. Étant donné qu’un seul gène code pour cette
enzyme et sachant que l’absence totale de synthèse des VLCFA est létale précocement,
il est vraisemblable qu’il s’agisse d’une mutation hypomorphe, c’est-à-dire que l’allèle
muté est moins exprimé ou qu’il donne lieu à une enzyme moins active. Cette
mutation permet de confirmer que les VLCFA sont essentiels au fonctionnement de
l’encéphale.
d. Effet d’une mutation du gène Hacd1
Les gènes Hacd codent pour des enzymes catalysant l’étape de déshydratation
du cycle d’élongation des VLCFA. Une mutation dans le gène HACD1, à l’origine d’une
myopathie centronucléaire, a été découverte chez le labrador dans les années
1990(Blot et al., 2002; Pelé et al., 2005). L’étude de cette mutation chez le Chien et la
Souris a permis de montrer que HACD1 joue un rôle essentiel dans le développement,
la physiologie musculaire et en particulier dans la fusion des myoblastes(Blondelle et
al., 2015). Une partie entière de la bibliographie (paragraphe III) est consacrée à
l’étude des gènes Hacd et de la mutation de Hacd1, étant donné qu’il s’agit du gène
étudié dans la partie expérimentale.
Aucune étude fonctionnelle des autres gènes Hacd n’est disponible à ce jour.
[79]
5. Composition et rôles des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids dans la rétine
a. Distribution des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids dans
la rétine
Dans la majorité des tissus chez les mammifères, les acides gras à moins de 18
carbones représentent plus de 90% des acides gras totaux (Tvrdik et al., 2000). Dans
la rétine et en particulier au niveau des photorécepteurs, les ULC-FA sont
sur-représentés. Ces ULC-FA se trouvent majoritairement sous forme polyinsaturée
(ULC-PUFA) et ils sont incorporés dans des phosphatidylcholines en position sn-1
(Harkewicz et al., 2012). Dans la plus part des cas, la position sn-2 est occupée par une
molécule de DHA, 22:6n-3. Les glycérophospholipides ainsi formés sont concentrés au
niveau de la membrane des segments externes des photorécepteurs. Ainsi, il a été
montré que 13% des phosphatidylcholines situées dans la membrane du segment
externe des photorécepteurs comportaient un ULC-PUFA alors que les ULC-PUFA ne
représentent qu’environ 2% des acides gras totaux de la rétine (Agbaga et al., 2010).
b. Le rôle des Ultra Long Chain PolyUnsaturated Fatty Acids dans la
rétine
i.
La maladie de Stargardt 3 chez l’Homme
L’importance fonctionnelle des ULC-PUFA dans la rétine a été démontrée grâce
à des études nutritionnelles et à la découverte de la mutation à l’origine de la maladie
de Stargardt 3 chez l’Homme. Le gène mis en cause dans cette maladie code ELOV4,
enzyme responsable de l’étape de condensation dans le cycle d’élongation des ULCFA.
Les individus porteurs d’un allèle muté présentent une dégénérescence maculaire
juvénile, caractérisée par une perte de vision centrale irréversible à un jeune âge.
[80]
La mutation du gène ELOVL4 est à l’origine de l’apparition d’un codon stop
prématuré : l’allèle muté code donc une protéine tronquée ne possédant plus le signal
de rétention dans le réticulum endoplasmique où a lieu la synthèse des VLCFA
(Agbaga et al., 2014; Bennett et al., 2014b). L’enzyme tronquée s’accumule alors dans
les disques des segments externes des photorécepteurs.
Le mécanisme par lequel l’enzyme ELOVL4 tronquée est à l’origine d’une
dégénérescence rétinienne n’est pas encore bien compris, en particulier car il s’agit
d’une mutation dominante. Différentes hypothèses ont été émises à ce sujet. Ainsi, il se
pourrait que l’intégrité de la membrane des segments externes des photorécepteurs
soit compromise par la présence et l’accumulation anormale de cette enzyme ELOVL4
mutée. Une autre hypothèse serait que la protéine ELOVL4 mutée empêche l’enzyme
ELOVL4 sauvage de rester dans le réticulum endoplasmique (Harkewicz et al., 2012;
McMahon et al., 2007). En conséquence, la production de VLC-PUFA serait fortement
réduite et ce déficit serait directement à l’origine de la dégénérescence rétinienne
observée.
Les lésions histologiques caractéristiques de la maladie de Stargardt 3 chez
l’Homme sont une accumulation de lipofuscine dans l’épithélium pigmentaire associée
à une dégénérescence des photorécepteurs et une atrophie de l’épithélium
pigmentaire (Harkewicz et al., 2012; Karan et al., 2005) .
ii.
Étude d’Elovl4 chez la Souris
Afin de mieux comprendre le rôle de l’enzyme ELOVL4 et, plus
particulièrement, des VLC-PUFA dans la rétine, de nombreux modèles de souris
génétiquement modifiées ont été produits et étudiés au cours des dix dernières
années. Quelques uns des ces modèles sont présentés ci-dessous. Notons que la Souris
présente une expression clinique de la maladie de Stargardt 3 réduite par rapport à
[81]
l’Homme. En effet, cette espèce ne possède pas de macula et les cônes représentent
moins de 3% des photorécepteurs de la rétine.
Un des premiers modèle étudié correspond à des souris transgéniques
exprimant la protéine ELOVL4 humaine tronquée (Karan et al., 2005). Dans ce modèle,
les souris porteuses du transgène présentaient des signes de dégénérescence
rétinienne caractérisées par :
-
une diminution du nombre de photorécepteurs et une atrophie de
l’épithélium pigmentaire observables en histologie,
-
une détérioration de la réponse fonctionnelle des cônes et des bâtonnets
détectable en électrorétinographie,
-
une accumulation de phagosomes non digérés visualisable en microscopie
électronique à transmission
-
une accumulation de lipofuscine dans l’épithélium pigmentaire visualisable en
microscopie électronique à transmission par autofluorescence en microscopie
optique.
Une seconde étude a été réalisée par Anne McMahon et son équipe en 2007 sur
un modèle de souris knockin afin de remplacer un allèle de la souris par la forme
mutée chez l’Homme (McMahon et al., 2007). Ainsi, ils ont pu faire exprimer à ces
souris une enzyme ELOVL4 ayant la même configuration C-terminal que l’enzyme
tronquée humaine à l’origine de la maladie de Stargardt 3. Les individus homozygotes
mutants n’étant pas viable en raison de défaut de barrière cutané, seuls les individus
hétérozygotes ont pu être étudiés à l’échelle de la rétine. Ces souris hétérozygotes
présentaient de nouveau une accumulation de lipofuscine dans l’épithélium
pigmentaire ainsi qu’une atteinte fonctionnelle des cônes et des bâtonnets. Toutefois,
les auteurs n’ont observé d’altération de la structure rétinienne à l’échelle
histologique contrairement à ce qui avait été décrit précédemment chez les souris
transgénique, probablement en raison d’un niveau d’expression plus faible de l’allèle
muté par rapport au transgène.
[82]
Finalement, les trois études les plus récentes ont été réalisées sur des souris
knockout conditionnelles (cKO), pour lesquels le gène était spécifiquement inactivé
dans les photorécepteurs (Bennett et al., 2014a, 2014b; Harkewicz et al., 2012). Voici
une synthèse des résultats de ces trois études.
Dégradation de la réponse des bâtonnets et des cellules bipolaires à l’ERG
Dans ces trois études, les mesures d’électrorétinographie chez les souris Elovl4-cKO
ont révélé une atteinte fonctionnelle nette des bâtonnets et des cellules bipolaires
(diminution significative de l’amplitude des ondes a et b associée à une augmentation
des temps de latence). D’autre part, la diminution de l’onde b était plus marquée et
plus précoce que celle de l’onde a (Bennett et al., 2014a). Le défaut de réponse des
cellules bipolaires ne serait donc pas une simple conséquence de l’atteinte des
photorécepteurs. Finalement, les potentiels oscillatoires, reflets de l’activité des
cellules amacrines, horizontales et bipolaires, ainsi que le scotopic threshold response,
reflet de l’activité des cellules ganglionnaires et de Müller, étaient également
diminuées (Bennett et al., 2014b).
Absence d’atteinte fonctionnelle significative des cônes
L’activité des cônes a elle aussi été évaluée dans ces études. Cependant, les résultats
obtenus sont contradictoires. Globalement, il ne semble pas évident que leur
fonctionnement ait été affecté (Bennett et al., 2014a).
Altération fine de l’épithélium pigmentaire
Comme dans le modèle knockin, la structure rétinienne des souris mutées était
globalement conservée. En particulier, la structure des disques des segments externes
des bâtonnets était préservée bien que les ULC-PUFA y soient très concentrés et qu’ils
y joueraient a priori un rôle de stabilisation membranaire (Bennett et al., 2014b;
Harkewicz et al., 2012). Seule une légère diminution du nombre de bâtonnets a été
observée. Par contre, une accumulation de lipofuscine et de gouttelettes lipidiques
dans l’épithélium pigmentaire a de nouveau été notée (Harkewicz et al., 2012).
[83]
Notons qu’une autre étude sur des souris Elovl4-cKO n’aurait pas mis en évidence de
conséquence de la mutation sur la structure ni la fonction des photorécepteurs
(Barabas et al., 2013). Cette étude a été réalisée sur des souris plus jeunes comparées
aux souris des trois études décrites précédemment, souris âgées de moins de 6,5 mois.
Or d’après Bennett et al. 2014, les conséquences de la mutation augmenteraient avec
l’âge des souris, avec des premiers signes détectables qu’à partir de 6 mois.
Une architecture synaptique modifiée
En l’absence d’anomalie majeure de la structure rétinienne et des segments externes
des photorécepteurs en particulier, Lea Bennett et son équipe se sont intéressées à la
capacité des photorécepteurs à transmettre le signal lumineux perçu aux cellules
bipolaires (Bennett et al., 2014b). L’analyse des courants calciques au niveau des
bâtonnets ainsi que des courants dépendants des récepteurs au glutamate des cellules
bipolaires n’a révélé aucune anomalie. Cela suggérait donc que le problème serait
plutôt lié aux synapses sous-jacentes. L’analyse lipidique des synapses rétiniennes a
confirmé que les ULC-PUFA y étaient aussi présents en très grande quantité. Ces
éléments ont donc motivé une analyse structurale fine des terminaisons synaptiques
des photorécepteurs.
L’analyse structurale fine a été réalisée en immunofluorescence et microscopie
électronique à transmission (Bennett et al., 2014b). Cette dernière technique a révélé
que les vésicules retrouvées au niveau des terminaisons synaptiques des bâtonnets
étaient de plus petites tailles, anguleuses et en quantité moindre chez les souris
Elovl4-cKO. Ces anomalies pourraient affecter le déplacement des vésicules au sein de
la synapse, entre autres. De plus, une augmentation du nombre de noyaux de
bâtonnets en apoptose, une diminution du nombre de terminaison synaptiques et de
synapses à ruban ainsi que la présence de synapses de contraste anormal ont été
notées chez les souris Elovl4-cKO. Finalement, les dendrites et synapses des cellules
bipolaires présentaient une localisation ectopique dans la couche plexiforme externe.
Ce type de lésion est fréquemment rencontré chez les souris mutantes pour des gènes
pré-synaptiques contrôlant la libération de glutamate (Bennett et al., 2014b). Cela
témoignerait de la recherche d’une synapse fonctionnelle par les dendrites des
cellules bipolaires. L’ensemble de ces éléments semble prouver qu’un déficit en ULC[84]
PUFA a pour conséquence une forte réorganisation synaptique de la couche
plexiforme externe. D’autres éléments sembleraient en faveur d’une possible
réorganisation synaptique de la couche plexiforme interne associée.
Modifications dans la composition lipidique des rétines des souris Elovl4-cKO.
Des analyses de la composition lipidique ont montré qu’il y avait significativement
moins d’ULC-PUFA et inversement plus d’acides gras de moins de 22 carbones, leurs
précurseurs, dans les rétines des souris Elovl4-cKO comparé aux souris contrôles. Par
ailleurs, les concentrations des autres acides gras, et en particulier en DHA, n’étaient
pas affectées par la mutation (Bennett et al., 2014a). Le taux d’ULC-PUFA restait faible
tout au long de la vie de l’animal et la différence entre les souris Elovl4-cKO et les
souris sauvages était exacerbée avec l’âge (Bennett et al., 2014a). Les photorécepteurs
ne sont donc pas capables de compenser ce défaut de synthèse par des apports en
ULC-PUFA produits par d’autres cellules dans lesquelles l’enzyme est fonctionnelle.
Cela signifie aussi qu’un éventuel phénotype lié à un déficit en ULC-PUFA de la rétine
devrait être plus marqué avec l’âge.
iii.
Conclusion sur le rôle des ULC-PUFA dans la rétine
Les différentes études décrites dans les paragraphes précédents montrent que
la perte de fonction de l’enzyme ELOVL4 dans la rétine est associée à diminution de la
concentration des ULC-PUFA et a pour conséquence une diminution de la réponse
fonctionnelle des bâtonnets et des cellules bipolaires. Les publications divergent
quant à une possible atteinte des cônes associée. L’ensemble des études s’accorde
aussi pour dire que des accumulations de lipofuscine ont été observées en
microscopie électronique à transmission ou par autofluorescence au niveau de
l’épithélium pigmentaire. La fonction des ULC-PUFA n’est toutefois pas encore bien
identifiée. Il semblerait qu’ils soient essentiels au niveau de la terminaison synaptique
des photorécepteurs et des bâtonnets, en particulier. Ils pourraient y jouer un rôle
dans la stabilisation des membranes des vésicules pré-synaptiques et intervenir dans
les phénomènes d’endo- ou exo-cytose de ces vésicules. Par contre, le niveau de déficit
[85]
obtenu pourrait ne pas altérer la stabilisation des membranes des segments externes
contrairement à ce qui avait été suggéré précédemment dans la littérature.
Finalement, le phénotype lié au déficit en ULC-PUFA serait plus marqué avec l’âge.
c. Évolution des concentrations en Ultra Long Chain Poly-Unsaturated
Fatty Acids dans la rétine avec l’âge
Deux études réalisées chez le Rat et chez l’Homme ont révélé que la quantité
d’ULC-PUFA diminue avec l’âge. Ce phénomène est associé à une diminution globale
du nombre d’insaturations (Agbaga et al., 2010). Des hypothèses ont été émises quant
à un possible lien entre cette diminution des ULC-PUFA dans la rétine et la diminution
de l’amplitude des ERG observée avec l’âge. La diminution des ULC-PUFA dans la
rétine avec l’âge pourrait être un facteur prédisposant à une dégénérescence
maculaire liée à l’âge (maladie multifactorielle). Cette hypothèse n’a toutefois pas été
validée pour l’instant.
Par ailleurs, selon l’étude de Bennet décrite dans le paragraphe
précédent, une éventuelle diminution des ULC-PUFA avec l’âge ne masquerait pas la
diminution du taux d’ULC-PUFA chez les souris Elovl4-KO (Bennett et al., 2014a). Au
contraire, l’atteinte fonctionnelle des photorécepteurs ne serait détectable qu’à partir
de 6 mois et serait bien plus nette à un an.
[86]
III.
HACD1 ET LA SYNTHÈSE DES
ACIDES GRAS À TRÈS LONGUE
CHAÎNE
1. Une mutation dans le gène HACD1 à l’origine d’une
myopathie chez des Labradors
a. Historique de la découverte du gène
Dans les années 1990, le Dr Blot, directeur de l’unité de neurobiologie à l’ENVA,
a observé en consultation des cas spontanés de myopathie congénitale chez des
Labradors retrievers. Il a alors fondé une colonie expérimentale à partir de ces
animaux afin d’étudier leur profil phénotypique et génétique.
i.
Les
Étude phénotypique d’une colonie expérimentale de Labradors myopathes
Labradors
myopathes,
dits
« CNM »,
présentent
un
défaut
de
développement des masses musculaires qui se traduit par une faiblesse musculaire à
la fois posturale et locomotrice associée à une intolérance à l’effort d’apparition rapide
dès 3 à 6 mois. L’expression clinique de la myopathie évolue jusqu’à l’âge d’un an
environ puis se stabilise. L’intensité des symptômes est variable suivant les individus.
Avec une surveillance médicale appropriée, l’espérance de vie de ces animaux est
similaire à celle des chiens sains (Blot et al., 2002).
Les analyses histologiques de biopsies musculaires prélevées chez ces chiens
ont révélé une centralisation ou une internalisation élevée des noyaux des fibres
musculaires squelettiques d’apparition tardive, après quelques années. Elles ont aussi
dévoilé une prédominance des fibres de type I, c’est-à-dire lentes, une hétérogénéité
précoce du calibre des fibres musculaires et l’évolution vers une fibrose et une
infiltration adipeuse des muscles après plusieurs années d’évolution. L’ensemble de
[87]
ces éléments ont permis de classifier cette affection au sein des Myopathies
CentroNucléaires (CNM) (Blot et al., 2002; Maurer et al., 2012).
ii.
Étude génétique, la découverte d’une mutation dans le gène PTPLA/HACD1
L’étude génétique de la colonie de chiens CNM a été réalisée par l’équipe de
Laurent Tiret, dans l’unité de Génétique Fonctionnelle et Médicale de l’ENVA.
L’analyse du pédigrée de la colonie a permis de montrer, dans un premier temps, que
la myopathie se transmettait en suivant un modèle autosomique récessif (Tiret et al.,
2003). L’analyse des génomes des individus atteints a ensuite permis de localiser la
mutation causale dans un gène alors nommé PTPLA pour Protein Tyrosine
Phosphatase-like A (Pelé et al., 2005). En 2008, ce gène fut renommé HACD1 pour
3-HydroxyAcyl-CoA Deshydratase 1, après la découverte de la fonction de l’enzyme qu’il
code dans le cycle d’élongation des VLCFA (Ikeda et al., 2008). HACD1 est un gène de
plus de 20 kilobases, constitué de 7 exons (Figure 20 A) et situé en région
centromérique du chromosome 2 canin. La mutation à l’origine de la myopathie dans
la colonie d’Alfort correspond à l’insertion d’un élément SINE de 236 paire de bases
(pb) dans l’exon 2 du gène (Figure 20 B).
Par la suite, une étude réalisée sur des Labradors sains et mutés provenant de
9 pays situés sur les continents américain et européen, dont la France, a prouvé que
tous les Labradors atteints de cette forme de myopathie centronucélaire présentaient
la même mutation du gène HACD1. Cela signifie donc que ces animaux présentaient
tous un ancêtre commun fondateur né, d’après les estimations, entre 1950 et 1960
soit il y a environ 17,5 générations (Maurer et al., 2012). Un test diagnostique a depuis
été mis au point pour permettre aux éleveurs d’éviter les croisements entre chiens
porteurs susceptibles de faire naître des individus malades (« Centronuclear
Myopathy Disease Test | Labrador DNA Testing »).
[88]
Figure 20 : Le gène PTPLA/HACD1 (A), ses transcripts (B) et l'allèle muté (C)
dans la myopathie centronucléaire du Labrador. D’après Pelé et al. 2005.
A. Les tailles des exons et des introns sont indiquées respectivement au-dessus et
au-dessous de la barre horizontale (en paires de bases).
B. Chaque rectangle correspond à un exon, l’élément SINE est inséré au niveau de
l’exon 2.
b. Conséquences de la mutation sur le profil de transcription du gène
En temps normal, HACD1 est exprimé dans les muscles striés, cœur compris,
sous deux isoformes : HACD1-fl (full-length) possédant les sept exons du gène et
HACD1-d5 dépourvue de l’exon 5 (Figure 20). La forme complète prédomine dans les
muscles squelettiques matures et le cœur, la seconde forme prédomine dans les
muscles squelettiques immatures et les muscles lisses (Blondelle et al., 2015).
L’insertion de l’élément SINE dans l’exon 2 du gène (Figure 20 B) perturbe
fortement le profil d’épissage. Cette mutation engendre la synthèse de cinq nouveaux
transcrits contenant tous les exons 6 et 7 tandis que les transcrits normaux sont
quasiment absents des muscles des chiens homozygotes mutés. De plus, sur les cinq
nouveaux transcrits, quatre possèdent un codon stop prématurés et seul le dernier,
constitué des exons 1, 6 et 7 et nommé Hacd1-167, peut donner lieu à la synthèse
d’une protéine tronquée.
[89]
Figure 21 : Représentations schématiques des transcrits du gène HACD1 dans le
muscle squelettique avec et sans mutation. D’après Pelé 2005.
A. Représentation des deux transcrits obtenus en temps normal dans le muscle
squelettique.
B. Représentation des cinq nouveaux transcrits retrouvés dans les muscles des
Labradors homozygotes et hétérozygotes pour l’allèle muté.
Les flèches indiquent le positionnement de codons stop prématurés.
[90]
c. La fonction enzymatique de HACD1
Le nom initial de PTPLA, Protein Tyrosine Phosphatase-like A, a été attribué à ce
gène en raison de la présence dans sa séquence codante d’un site caractéristique des
protéine tyrosine phosphatases (PTP) (Uwanogho et al., 1999). Cependant, ce site est
très vraisemblablement inactif en raison d’une mutation ayant entraîné le
remplacement d’un résidu arginine par un résidu proline, d’où le terme de PTP-like.
PTPLA possède 3 paralogues chez les mammifères : PTPLB, PTPLAD1 et PTPLAD2
(HACD1-3) qui présentent tous ce site catalytique muté. Des hypothèses quant à un
possible rôle de pseudo-phosphatase, c’est-à-dire un rôle régulateur des phosphatases
actives par compétition de substrat par exemple, a été évoqué mais n’a jamais été
démontré.
La réelle avancée concernant la fonction de PTPLA fut la découverte d’une forte
similarité de séquence avec le gène Phs1, son orthologue chez la levure Saccharomyces
cerevisiae. Ce dernier code une enzyme à activité 3-hydroxyacyl-CoA déshydratase
(HACD) qui réalise la 3ème étape du cycle d’élongation des VLCFA détaillé
précédemment et illustré Figure 14. La perte de fonction de ce gène est létale pour la
levure et conduit à une accumulation des acides gras à longue chaîne et à une
diminution des lipides complexes comprenant des VLCFA tels que les sphingolipides
(Denic et Weissman, 2007; Kihara et al., 2008). Suite à la découverte de cette
homologie de séquence, il a été démontré que les protéines codées par les gènes
orthologues de Phs1 chez les mammifères possédaient tous une activité HACD in vitro
mais que seuls PTPLA et PTPLB étaient capables de restaurer la croissance des
levures déficientes en Phs1. Les quatre gènes furent donc renommés HACD1 à 4 (Ikeda
et al., 2008).
[91]
2. Une mutation du gène HACD1 à l’origine d’une
myopathie chez l’Homme
En 2013, une myopathie congénitale a été diagnostiquée chez une famille
bédouine présentant de nombreux mariages consanguins (Muhammad et al., 2013).
La maladie touchait 13 individus de la famille et l’étude de cette maladie a portée sur 8
individus présentant des signes cliniques et âgés de six mois à 35 ans. Les individus
atteints souffraient tous d’une forme de myopathie sévère à la naissance. Une
amélioration progressive des symptômes avec l’âge a été observée par l’équipe
médicale chez plusieurs enfants et chez un adulte. Ainsi, le patient âgé de 35 ans était
chauffeur de camion et était capable de livrer des colis lourds sans aucune difficulté.
Ce résultat doit toutefois être relativisé car un seul patient adulte a été étudié.
L’étude de l’arbre généalogique de la famille a révélé que la maladie se
transmettait de façon autosomique récessive. L’étude des prélèvements histologiques
réalisés sur deux patients de 2 ans a montré que les fibres de type 1 étaient présentes
en plus grand nombre et que leur taille était diminuée. Cependant, aucune
centralisation des noyaux n’était visible. L’anomalie la plus marquée était une très
forte hétérogénéité dans le calibre des fibres, d’où la classification de cette affection
dans le groupe des myopathies à disproportion de taille de fibres.
Afin de déterminer le gène responsable de cette myopathie, une étude
génétique des patients par l’étude des régions d’homozygotie a été réalisée et a permis
de localiser trois gènes candidats dont HACD1. Il a ensuite été démontré que les
patients atteints de myopathie étaient tous homozygotes pour une mutation non-sens
dans la séquence du gène HACD1. A l’inverse, leurs parents sains étaient
hétérozygotes pour cette mutation et aucun des 134 bédouins sains testés ne
présentaient la mutation. De plus, une étude de la protéine codée par ce gène muté, a
révélé que l’enzyme n’était pas fonctionnelle chez les individus malades. L’ensemble
de ces éléments a donc permis de démontrer que la mutation de HACD1 était à
l’origine d’une myopathie chez l’Homme (Muhammad et al., 2013).
[92]
Notons que la mutation découverte dans cette famille diffère sur certains
points de la mutation à l’origine de la myopathie centronucléaire du Labrador
retriever. Si l’absence de centralisation des noyaux est possiblement due au jeune âge
des patients sur lesquels ont été réalisées les biopsies, une autre différence avec le
modèle canin consiste en une possible amélioration du phénotype avec l’âge chez
l’Homme. L’étude de cette maladie chez l’Homme n’ayant pour l’instant porté que sur
un individu adulte, cette observation restera à confirmer. Les auteurs de l’étude ont
émis des hypothèses afin d’expliquer cette possible amélioration du phénotype avec
l’âge chez l’Homme. On retiendra, en particulier, la possible influence d’autres gènes
chez l’Homme et la probable importance des apports en acides gras dans
l’alimentation.
Les nombreux éléments cliniques et histologiques communs avec les CNM
humaines ainsi que la découverte du rôle du gène HACD1 dans une myopathie
humaine font de la CNM du Labrador un très bon modèle de médecine comparée. De
plus, de nouveaux modèles de mutations de Hacd1 ont été générés par manipulation
génétique chez la Souris afin de pouvoir compléter l’étude de ce gène.
3. La Souris, modèle fonctionnel dans l’étude du gène
Hacd1
a. La Souris, un bon modèle d’étude expérimental
En parallèle de l’observation de cas spontanés de myopathies centronucléaires
chez l’Homme et l’animal, de nombreux modèles de CNM ont été générés par
manipulation génétique, que ce soit en lignées cellulaires, chez des levures, le
poisson-zèbre ou la Souris (Cowling et al., 2012). Ces modèles ont été créés dans le but
de caractériser la fonction normale des gènes mis en cause et les conséquences de leur
mutation.
[93]
L’utilisation de la Souris comme modèle fonctionnel des maladies humaines
présente plusieurs intérêts. Tout d’abord, la Souris est une espèce dont le génome est
entièrement séquencé et qui est facilement manipulable génétiquement. Ensuite, il
s’agit d’un animal génétiquement assez proche de l’Homme, en comparaison avec la
levure ou le poisson-zèbre. Son élevage en captivité est facile, bon marché et prend
peu de place. De plus, son cycle de reproduction est sans saison creuse et rapide : la
mise à la reproduction peut commencer à 8-10 semaines, la durée de gestation est
d’une vingtaine de jours et les chaleurs sont fréquentes. Cela permet d’obtenir
beaucoup d’individus en peu de temps et de former de nouvelles lignées d’individus
consanguins facilement.
b. Obtention de souris mutantes pour le gène Hacd1
L’obtention de souris mutantes s’est faite par recombinaison homologue entre
un vecteur choisi et le chromosome de la Souris comportant le gène d’intérêt, ici
Hacd1. Dans le cadre de l’étude du gène Hacd1, la recombinaison homologue a été
réalisée par le laboratoire de Génétique Fonctionnelle et Médicale de l’ENVA, en
collaboration avec le Centre d’Ingénierie de Génétique Murine de l’Institut Pasteur, sur
des Souris C57Bl/6N, Souris Black 6. Le vecteur employé, présenté Figure 22,
comprenait le gène LacZ, une cassette de résistance à la néomycine et des sites FRT et
LoxP.
Le gène LacZ sert de gène rapporteur afin de visualiser l’expression précise du
gène Hacd1. En effet, grâce à la recombinaison homologue, son expression est sous
contrôle du promoteur d’Hacd1, ce qui veut dire que LacZ s’exprime dans les mêmes
cellules et avec la même intensité que le gène d’intérêt. Le gène LacZ code une
β-Galactosidase, une enzyme dont l’activité est facilement visualisable sur coupe
histologique. En effet, cette enzyme donne lieu à un précipité coloré en présence
d’X-gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-béta-D-galactopyranoside).
Des
anticorps
anti-β-gal ont également été développés afin de pouvoir marquer la protéine par
[94]
immunofluorescence. Ce gène rapporteur permet de déterminer quelle population
cellulaire exprime Hacd1 au sein d’un organe. C’est une technique de mesure indirecte
de l’expression de Hacd1 chez les individus porteurs d’un allèle muté par opposition à
l’hybridation in situ qui permet une visualisation directe chez les individus sauvages
des ARNm du gène.
La cassette de résistance à la néomycine a permis la sélection positive in vitro
des clones de cellules embryonnaires souches ayant recombiné. Après vérification par
PCR (Polymerase Chain Reaction) de la recombinaison homologue, deux clones
indépendants de cellules embryonnaires souches ont été injectés dans des
blastocystes et les descendants issus de ces cellules ont permis de fonder les colonies
de Hacd1-KO.
Les sites FRT et LoxP sont des sites de recombinaison pour des enzymes
recombinases microbiennes, respectivement la flippase et la cre recombinase. Après
croisement avec des souris porteuse de la cre recombinase de manière ubiquitaire, les
exons 2 à 4 sont éliminés générant un allèle dit knockout, comme l’illustre la Figure 22.
Dans un premier temps, la recombinaison homologue a permis d’obtenir des
individus hétérozygotes pour l’allèle Hacd1-flox illustré Figure 22. Le croisement de
ces souris avec des souris exprimant la Cre recombinase a ensuite permis d’obtenir
l’allèle Hacd1-KO.
[95]
Figure 22 : Configuration du locus Hacd1 après événement de recombinaison homologue
A. Allèle flox, issu de la recombinaison homologue.
B. Allèle Hacd1-KO, généré par recombinaison de l’allèle flox par une Cre recombinase. Les
exons 2, 3 et 4 sont éliminés.
β-gal : séquence du gène Lac-Z codant pour la β-galactosidase.
FRT, LoxP : sites de recombinaison pour des enzymes recombinases microbiennes,
respectivement la flipase et la cre recombinase.
βact::neo : gène codant une résistance à la néomycine sous cont rôle du promoteur de la β-actine.
Des croisements entre souris porteuses de l’allèle Hacd1-KO ont ensuite permis
d’obtenir des lots de souris homozygotes mutées, dites Hacd1-KO, ou hétérozygotes
ou homozygotes sauvages, dites sauvages. Ces deux derniers types d’individus ont
servi de témoins alors que les individus homozygotes Hacd1-KO permettaient
d’étudier les conséquences d’une perte totale de fonction de Hacd1. Des souris
porteuses de l’allèle flox ou Hacd1-KO ont permis de préciser l’expression d’Hacd1
grâce au gène rapporteur LacZ.
[96]
4. Expression tissulaire des gènes Hacd
Les différents modèles d’étude de Hacd1 ont permis entre autres de déterminer
dans quel tissu s’exprime Hacd1 et ses 3 paralogues au cours de l’embryogénèse puis
chez l’adulte. Il a ainsi été démontré que ces quatre gènes ne s’expriment pas dans les
mêmes tissus ou en quantité variable (Blondelle, 2013; Ikeda et al., 2008; Wang et al.,
2004).
Chez l’adulte, HACD2 et HACD3 ont une expression large. HACD4 est
principalement exprimé par les leucocytes mais il s’exprime aussi faiblement au
niveau du placenta, du cœur, de la rate, des reins et des poumons (Ikeda et al., 2008;
Wang et al., 2004). L’expression de Hacd1 est quant à elle un peu plus complexe car
l’intensité de l’expression et le type de transcrit varient en fonction de l’âge de l’animal
et du type de tissu. Ainsi, le transcrit Hacd1-d5 (isoforme sans exon 5) a été retrouvé
dans toutes les lignées cellulaires ce qui signifie que Hacd1 a une expression très large
(Blondelle, 2013). Cependant, Hacd1-fl (transcrit complet, seule isoforme codant une
protéine catalytiquement active) n’a été détectée qu’au niveau des muscles striés
squelettiques et cardiaque et dans l’œil. Une expression très faible est aussi retrouvée
dans les poumons. Au cours du développement embryonnaire et plus précisément lors
de la maturation des fibres musculaires, l’expression d’Hacd1-fl augmente fortement.
Récemment, l’équipe a démontré un rôle de l’isoforme Hacd1-fl dans la fusion des
myoblastes au cours du développement musculaire via des modifications dans la
composition et la fluidité de la membrane (Blondelle et al., 2015). Par ailleurs,
HACD1-D5 jouerait un rôle antagoniste par rapport à l’isoforme active. En conclusion
de l’étude, Hacd1 s’exprime de façon ubiquitaire dans l’organisme mais présente un
épissage variable en fonction de la période du développement et du type cellulaire,
avec une expression restreinte aux muscles striés et à l’œil pour l’isoforme active.
L’étude de l’expression d’Hacd1 dans la rétine a été débutée par Renaud
Fouchère et Myriam Taleb dans le cadre de leur thèse de doctorat vétérinaire. Les
résultats de leur étude sont détaillés ci-après, dans le paragraphe IV.
[97]
IV.
ÉTUDE PRÉLIMINAIRE DE L’EXPRESSION ET DU RÔLE DU GÈNE
Hacd1 DANS LA RÉTINE
Dans le cadre de leur thèse expérimentale vétérinaire, réalisée sous la direction
de Fanny Storck et présentée le 4 octobre 2012, Renaud Fouchère et Myriam Taleb ont
commencé à étudier l’expression et le rôle du gène Hacd1 dans le testicule et la rétine
(Fouchère et Taleb, 2012). Leur étude a ensuite été complétée par les travaux de
Jordan Blondelle doctorant au sein du laboratoire de Génétique Fonctionnelle et
Médicale de 2010 à 2013 (Blondelle, 2013). Cette étude préliminaire comportait 3
expériences, décrites ci-dessous.
1. Évaluation de l’expression du gène Hacd1
a. Techniques utilisées
L’étude de l’expression du gène Hacd1 dans l’œil a été faite à la fois au stade
embryonnaire (à 10,5 et 12,5 jours) et sur des yeux de souris adultes. Elle reposait sur
un marquage X-Gal (Blondelle, 2013; Fouchère et Taleb, 2012). Il s’agissait d’un
marquage indirect de l’expression de Hacd1 grâce au gène rapporteur LacZ inséré
sous contrôle du promoteur du gène Hacd1 chez les souris porteuses de l’allèle
Hacd1-flox ou KO.
Le marquage X-Gal a été réalisé sur embryon entier et sur des coupes
au cryostat d’embryon ou d’œil. L’épaisseur des coupes utilisées variait entre 10 et
50 µm.
[99]
Un immunomarquage de la protéine β-Gal avait été tenté, sans succès, en
raison d’un manque de spécificité et de sensibilité des deux anticorps testés.
Les animaux inclus dans cette étude étaient :
-
3 embryons +/+ et 4 embryons +/-
-
8 souris mâles adultes +/+ et 8 souris mâles adultes +/-
-
1 souris femelle adulte +/- et 1 souris femelle adulte +/+
Les Souris +/+, appelées sauvages, servaient de contrôle puisqu’elles ne
possédaient pas le gène rapporteur Lac-Z. Les souris +/-, appelées hétérozygotes,
présentaient quant à elles, un allèle comportant le gène LacZ sous contrôle du
promoteur du gène Hacd1.
Remarque : aucune Souris -/- n’a été utilisée pour cette étude car la mutation
pourrait s’avérer délétère pour les cellules dans lesquelles s’exprime le gène en temps
normal. La mort de ces cellules pourrait alors entraîner des modifications
histologiques plus ou moins importantes. De plus, les cellules qui auraient dû
exprimer le gène Hacd1 pourraient avoir changé de destin cellulaire, ce qui fausserait
également toute interprétation. La myopathie causée par la mutation du gène Hacd1
étant à transmission autosomique récessive, on considère que l’allèle sain chez les
souris hétérozygotes suffisait à éviter ce facteur de confusion.
Pour finir, des RT-PCR ont été réalisées à partir d’yeux de souris afin de
déterminer quels étaient les transcrits de Hacd1 exprimés dans cet organe et dans
quelles proportions (Blondelle, 2013). Cette technique a aussi été employée afin
d’étudier l’expression des 3 paralogues de Hacd1 : Hacd2, Hacd3, Hacd4.
[100]
b. Résultats obtenus avec la coloration X-Gal
La coloration des embryons(de 10,5 et 12,5 jours) hétérozygotes entiers a
révélé une forte expression du gène rapporteur dans le cœur et une expression un peu
plus modérée dans les ébauches musculaires, la chaîne ganglionnaire paravertébrale,
l’encéphale et l’œil.
La coloration des coupes histologiques d’yeux prélevés sur des souris
hétérozygotes adultes a révélé un marquage net de deux couches cellulaires situées
dans la rétine (Figure 23). Une double coloration X-Gal – DAPI a permis d’identifier
avec précision les couches cellulaires dans lesquelles s’exprimait Hacd1. Il s’agissait de
la couche des cellules bipolaires et la couche des cellules ganglionnaires. Les
photorécepteurs n’étaient pas marqués.
[101]
Figure 23 : Expression du gène Hacd1 dans l'œil chez la Souris (d’après Blondelle, 2013)
(A) Coupe histologique rétinienne vue au microscope et représentation schématique
de sa structure (www.bioon.com). L’épithélium pigmentaire est aussi appelé rétine
pigmentaire. L’ensemble des autres couches forme la rétine neurale
(B, C) Coloration d’un embryon âgé de 10,5 jours au X-Gal (B) et grossissement sur
l’œil (C).
(D) Expression de Hacd1 dans la rétine adulte révélée par coloration X-Gal. (D’)
Section sagittale d’une rétine. 1 : couche des cellules photoréceptrices, 2 : couche des
cellules bipolaires, 3 : couche des cellules ganglionnaires. L’actine est marquée en
rouge, l’ADN en bleu (DAPI) et le marquage X-Gal en noir. (D’’)
Marquage de l’ADN. (D’’’) Marquage X-Gal.
[102]
c.
Résultats obtenus grâce à la technique de RT-PCR
La RT-PCR a permis de montrer que les 3 isoformes de Hacd1 étaient
exprimées dans l’œil de souris, avec une prédominance de Hacd1-d5 (Figure 24 A).
Cette technique a aussi permis de contrôler l’absence d’expression du gène chez les
souris Hacd1-KO (Figure 24 A). En effet, aucun des deux transcrits sauvages n’a été
retrouvé chez les souris Hacd1-KO. Finalement, les trois paralogues de Hacd1, Hacd2,
Hacd3, Hacd4 étaient exprimés dans des proportions similaires dans les yeux des
souris Hacd1-KO et des souris contrôles (Figure 24 A). La perte de Hacd1 chez les
souris Ko n’influait donc pas sur l’expression de ces 3 paralogues.
2. Examen histologique des yeux
a. Techniques utilisées
L’examen histologique des yeux a été réalisé par le Dr Reyes-Gomez, service
d’anatomie pathologique de l’ENVA, sur les souris adultes. Pour cela, les yeux prélevés
ont été fixés 1h dans du PFA 4% puis ont été conservés dans de l’éthanol 70% en
attendant le paraffinage. Une fois les blocs de paraffine obtenus, les yeux ont été
coupés au microtome à une épaisseur de 3 µm puis ont été colorés à l’HES (HémalunÉosine-Safran) (Fouchère et Taleb, 2012). Le lot utilisé pour cette partie de l’étude
était constitué de quatre souris mâles +/+, de deux souris mâles +/- et de six souris
mâles -/-. Étant donné que cette myopathie présente une transmission autosomique
récessive, les Souris sauvages et hétérozygotes servaient de contrôle.
[103]
b. Comparaison des structures histologiques entre Souris contrôle et
mutantes
Bien qu’il ait été démontré qu’Hacd1 s’exprimait dans la couche des cellules
ganglionnaires et dans la couche des cellules bipolaires de la rétine, aucune différence
structurale n’a été mise en évidence lors de la comparaison des yeux entre les
différents groupes (Figure 24).
Figure 24 : Analyse structurale en l'absence de Hacd1 dans l'œil des souris Hacd1-KO
(d’après Blondelle, 2013).
(A) Étude par RT-PCR de l’expression des isoformes de Hacd1 et des autres gènes
Hacd (Hacd2, 3 et 4) dans l’œil des souris contrôles et Hacd1-KO. CycloB était utilisé
comme normalisateur.
(B, C) Coupes histologiques de rétines de souris contrôles (B) et Hacd1-KO (C)
colorées à l’Hémalun‐Éosine-Safran.
Barre d’échelle : 50μm.
[104]
3. Évaluation électrophysiologique du fonctionnement de
la rétine
Afin de tester le phénotype lié à la mutation d’un point de vue fonctionnel cette
fois-ci, une dernière expérience a été menée. Elle consistait en l’évaluation de la
fonction électrophysiologique de la rétine chez des souris Hacd1-KO grâce à
l’obtention d’un électrorétinogramme (ERG).
a. Techniques utilisées
Les ERG ont été réalisés par le Dr Chahory, responsable du service
d’ophtalmologie de l’ENVA. La nuit précédant l’examen, les souris femelles, âgées de
un an, étaient placées dans l’obscurité et la suite des manipulations a été réalisée sous
lampe inactinique.
Environ 15 min avant l’examen, les pupilles des souris étaient dilatées par
installation d’une goutte de Tropicamide (anti-muscarinique) sur la cornée de chacun
des deux yeux. Une fois les pupilles dilatées, les souris était anesthésiées à l’aide d’un
mélange à 2% xylazine et 10% kétamine dilués dans du NaCl 0,9%. Elles étaient
ensuite placées sur une plaque chauffante à 37°C. Une électrode de terre était placée
en position sous-cutanée au niveau du dos de l’animal et deux électrodes de référence
étaient placées en position sous-cutanées à la base des deux oreilles. Les deux
électrodes actives étaient quant à elles posées sur la cornée des deux yeux et
stabilisées par un bras articulé. Par ailleurs, les cornées étaient hydratées avec du
VISKYAL® Collyre (hyaluronate de sodium) avant les mesures afin d’éviter leur
dessiccation tout en améliorant le contact électrode/cornée. L’animal était finalement
avancé dans une coupole de Ganzfeld disposée dans une cage de Faraday afin de
limiter les interférences avec des ondes électriques parasites. Les cinq électrodes
étaient reliées à un appareil RetiPort32 (Roland Consult Gmbh), lui-même relié à un
ordinateur. Le logiciel RetiPort 32 a été utilisé pour la récupération et le traitement
[105]
des données. L’impédance des électrodes était vérifiée (<10kOhms) avant de lancer
les mesures afin de limiter les artéfacts.
Les rétines de souris ont ensuite été stimulées par 10 séries de 10 flashs de
lumière blanche. Les stimulations étaient d’intensité croissante entre deux séries
allant de 0,0003 cd.s/m² lors de la première série à 10cd.s/m² pour la dernière série.
Les stimulations étaient binoculaires mais la réponse de chaque rétine était
enregistrée individuellement. La courbe obtenue reflétait l’activité rétinienne en
fonction du temps.
b. Résultats des électrorétinogrammes
Les résultats semblaient homogènes au sein de chaque groupe de souris,
groupe contrôle et groupe homozygote muté et la comparaison des tracés entre les
deux groupes révélait une diminution globale de l’amplitude du tracé ERG (Figure 25)
chez les souris Hacd1-KO (Blondelle, 2013). En particulier, l’amplitude de l’onde a
présentait une diminution de 41% et celle de l’onde b de 31%. D’autre part, une
augmentation du temps de culmination de l’onde a de 36% a été constatée pour une
stimulation lumineuse maximale de 10 cd.s/m² (Figure 25). Ces résultats reflètaient
une altération du fonctionnement de la rétine en l’absence de Hacd1 chez la Souris.
Plus précisément, ils semblaient témoigner d’une altération fonctionnelle des cellules
bipolaires (onde b) ainsi que des photorécepteurs (onde a).
[106]
Figure 25 : Diminution de la fonction rétinienne en l'absence de Hacd1 (d'après
Blondelle, 2013).
(A) Tracé représentatif d’un électrorétinogramme-flash (ERG-Flash) de l’œil d’une
souris contrôle et d’une souris Hacd1-KO.
(B, C) Amplitude des ondes a (B) et des ondes b (C) enregistrées chez les souris
contrôles (WT) et chez les souris Hacd1-KO en fonction de l’intensité lumineuse.
(D) Temps de culmination de l’onde a en fonction de l’intensité lumineuse
* p<0,05 ; ** p<0,01 ; *** p<0,001.
[107]
4. Discussion à partir de ces résultats préliminaires
Tout d’abord, l’évaluation de l’expression du gène Hacd1 chez la souris a
permis de démontrer que ce gène s’exprimait dans les couches des cellules bipolaires
et ganglionnaires de la rétine mais pas dans les photorécepteurs. Pourtant, les
résultats de l’ERG ont montré que les souris mutées présentaient une altération
fonctionnelle des cellules bipolaires mais aussi des photorécepteurs. L’atteinte
fonctionnelle des photorécepteurs est donc ici surprenante. Différentes hypothèses
peuvent être émises afin de chercher à comprendre ce résultat. Tout d’abord, il se peut
que l’évaluation de l’expression du gène Hacd1 dans l’œil de souris n’ait pas été assez
sensible. Un faible niveau d’expression du gène dans les photorécepteurs aurait alors
pu passer inaperçu d’autant plus que cette évaluation reposait sur un marquage
indirect. Une seconde hypothèse serait qu’une perte de fonction de l’enzyme HACD1
exprimée au niveau des cellules bipolaires et des cellules ganglionnaires ait des
conséquences sur le fonctionnement des photorécepteurs. Cela serait possible si, par
exemple, les VLCFA étaient formés au niveau des cellules ganglionnaires ou bipolaires
avant d’être acheminés jusqu’aux photorécepteurs. Ce résultat étant surprenant, notre
étude avait, entre autres, pour objectif de vérifier l’absence d’expression du gène
Hacd1 dans les photorécepteurs. Pour cela nous avons employé une technique de
marquage directe de l’expression, l’hybridation in situ, de l’expression de ce gène.
Finalement, l’analyse histologique globale des rétines des souris mutées n’a pas
permis de mettre en évidence d’anomalie structurale flagrante. Toutefois, étant
données les anomalies fonctionnelles révélées lors des ERG et étant donné le rôle
essentiel des VLCFA dans la stabilisation des courbures membranaires, il ne semblait
pas prudent de conclure à l’absence d’anomalie histologique à ce stade. Il semblait en
effet nécessaire de compléter cette étude par une analyse fine de l’organisation des
cellules à l’intérieur des couches et de l’aspect des membranes, en particulier au
niveau du segment externe des photorécepteurs qui présentent de nombreux replis.
[108]
PARTIE 2 : POURSUITE DE LA CARACTÉRISATION DU
RÔLE DU GÈNE Hacd1 DANS LA RÉTINE
I.
INTRODUCTION
Cette thèse expérimentale avait pour but de poursuivre la caractérisation du
rôle du gène Hacd1 dans la rétine à partir du modèle murin décrit paragraphe III.
Cette étude s’inscrivait dans le prolongement des études réalisées par Renaud
Fouchère et Myriam Taleb en 2012 et par Jordan Blondelle en 2013 dont les résultats
ont été décrits précédemment (paragraphe IV). La caractérisation du rôle du gène
Hacd1 dans la rétine des souris a été décomposée en quatre grands axes : une
évaluation clinique et fonctionnelle ainsi qu’une analyse histologique et une
caractérisation de la composition lipidique de la rétine des souris Hacd1-KO et une
étude fine de l’expression de Hacd1 dans ce tissu.
a. Hypothèses d’étude
Au vu des résultats préliminaires obtenus au laboratoire ainsi que de la
littérature portant en particulier sur la maladie de Stargardt 3, qui nous a servi de
référence étant donné les rôles complémentaires des enzymes ELOVL4 et HACD1,
nous avons émis différentes hypothèses que nous avons cherché à valider au cours de
nos travaux.
Tout d’abord, nous avons supposé que les anomalies fonctionnelles révélées à
l’ERG (Blondelle, 2013) témoigneraient d’un défaut de fonctionnement de la rétine
éventuellement révélateur d’une dégénérescence rétinienne. Cela pourrait être
secondaire à un déficit en VLCFA dans la rétine, comme cela a été démontré pour la
maladie de Stargardt 3 (Harkewicz et al., 2012).
[109]
D’autre part, bien que les études préliminaires n’aient pas permis de déceler de
lésions histologiques globales de la rétine, nous avons voulu rechercher des lésions
histologiques fines en particulier au niveau des photorécepteurs ou au niveau de
l’épithélium pigmentaire. En effet, d’après des études histologiques de souris modèles
de la maladie de Stargardt 3, bien que la structure de la rétine soit globalement
conservée, une légère diminution du nombre de photorécepteurs ainsi qu’une
accumulation de gouttelettes lipidiques et de granules de lipofuscine dans l’épithélium
pigmentaire étaient notées (Bennett et al., 2014a; Harkewicz et al., 2012). Une
désorganisation des terminaisons synaptiques des bâtonnets a aussi été mise en
évidence dernièrement (Bennett et al., 2014b). Nos analyses structurales ont donc
portés plus particulièrement sur ces couches rétiniennes. De plus, les VLCFA semblant
jouer un rôle essentiel dans la stabilisation des replis membranaires, nous avons plus
particulièrement recherché des anomalies dans les régions présentant de fortes
courbures membranaires telles que les synapses et les segments externes.
Finalement, au vu des résultats d’études de souris modèles de la maladie de
Stargardt 3, nous avons supposé que l’expression clinique et les lésions histologiques
seraient accentuées avec l’âge (Bennett et al., 2014a). Cela nous a donc poussé à
réaliser cette nouvelle étude sur des souris plus âgées.
b. Description des quatre axes d’étude
Le premier axe de notre étude portait sur une évaluation clinique et
fonctionnelle de la rétine de nos souris. Cette évaluation était réalisée, à la demande
du Pr Anderson, en prévision de l’analyse lipidique afin de s’assurer du phénotype de
nos souris. Cette étude a comporté une observation de la cornée, une analyse de fond
d’œil et la réalisation d’ERG. L’observation de la cornée et des fonds d’oeil avait pour
objectif de déceler toute anomalie ou défaut de transparence pouvant altérer le tracé
ERG par la suite. Les ERG étaient effectués afin de s’assurer de la présence d’un
phénotype fonctionnel avant de réaliser l’analyse lipidique. Cette partie de l’étude
[110]
était aussi l’occasion de rechercher des éléments en faveur d’une dégénérescence
rétinienne chez les souris Hacd1-KO (fond d’œil d’aspect hétérogène avec des
vaisseaux amincis voire absents, amplitudes des ondes a et b diminuées à l’ERG). Pour
une question de disponibilité du matériel entres autres, les tracés ERG ont été réalisés
en partenariat avec l’équipe de biophysique neurosensorielle de l’Université
d’Auvergne.
La seconde partie de l’étude consistait en une analyse structurale approfondie
de la rétine des souris Hacd1-KO. Cette étude histologique reposait sur 3 types
d’observations. Dans un premier temps, nous avons effectué une étude
morphométrique de coupes histologiques de rétines de souris colorées à l’HémalunÉosine-Safran. Nous avons ensuite comparé l’aspect des rétines après avoir procédé à
des marquages de cellules ou structures rétiniennes par immunofluorescence.
Finalement, nous avons observé des rétines en microscopie électronique afin de
visualiser avec plus de précision l’ultrastructure de la rétine.
La troisième partie de cette étude consistait en une analyse de l’expression du
gène Hacd1. Cette analyse a été réalisée dans l’objectif de déterminer avec précision
dans quelles cellules s’exprime le gène et, en particulier de vérifier l’absence
d’expression dans les photorécepteurs. En effet, les marquages X-Gal réalisés sur les
coupes de rétine aux cours des études préliminaires ont montré que Hacd1 ne
s’exprimait a priori pas au niveau des photorécepteurs mais qu’il s’exprimait dans
d’autres cellules de la rétine n’ayant pas pu être identifiées avec précision. L’absence
d’expression de Hacd1 dans les photorécepteurs étant très surprenante nous avons ici
cherché à vérifier cette observation à l’aide d’une technique de marquage direct de
l’expression du gène Hacd1 par hybridation in situ. L’identification plus précise des
cellules exprimant le gène Hacd1 devait quant à elle reposer sur la réalisation d’un
double marquage à l’aide d’un anticorps anti-β-Gal, révélant l’expression du gène
rapporteur LacZ, et d’anticorps spécifiques de certaines lignées cellulaires. Faute de
temps et suite à quelques difficultés techniques, cette partie de la thèse n’a pas pu
aboutir mais des résultats préliminaires seront présentés.
[111]
Finalement, le quatrième et dernier axe de l’étude consistait en une analyse de
la composition lipidique des rétines de Souris. Pour cela des dosages du contenu
lipidique des rétines des souris ont été réalisés par l’équipe du Professeur R.
Anderson, au Dean McGee Eye Institute, Oklahoma.
c. Implication personnelle :
Dans le cadre de cette thèse, j’ai participé à l’acquisition et au traitement des
données de la très grande majorité des expériences décrites. J’ai ainsi eu l’occasion de
réaliser de nombreuses immunofluorescences, de participer à la mise au point d’un
protocole d’hybridation in situ adapté à la rétine, d’observer la réalisation d’une partie
des ERG, d’analyser les clichés de rétine en microscopie optique et en microscopie
électronique à transmission.
Cependant, il y a quelques étapes auxquelles je n’ai pas pu assister en raison de
contraintes géographiques entre autres. Ainsi, je n’ai pas pu assister à l’acquisition de
la seconde moitié des tracés des ERG à Clermont-Ferrand, à la réalisation des analyses
statistiques à partir de ces tracés, ni à la préparation des rétines en vu de l’observation
en MET. L’ensemble de ces étapes ont été réalisées par le laboratoire de biophysique
de l’université de Clermont-Ferrand. De même, je n’étais pas présente lors de la
réalisation des analyses de composition lipidique de la rétine qui ont été réalisées au
Dean McGee Eye Institute, Oklahoma.
À terme, ma participation à la rédaction d’un article à partir de nos résultats est
envisageable. Toutefois, il nous manque actuellement certaines données essentielles
pour une publication, tels que les résultats de l’hybridation in situ.
[112]
II.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
1. Description des lots d’animaux utilisés
Plusieurs lots de souris ont été utilisés dans le cadre de cette thèse. Le Tableau
1 présente les souris utilisées et le tableau figuré en ANNEXE 7 leur répartition dans
les différentes études décrites par la suite. Les souris d’un même groupe ont été
euthanasiées au même moment et dans le même objectif. En général, elles étaient
aussi nées à la même période mais ce n’était pas toujours le cas. Par contre, faute de
moyen et/ou de temps, il arrivait parfois que certaines analyses ne soient réalisées
que sur une partie des souris d’un même groupe. D’autre part, notons que la majorité
des souris ont fait l’objet de plusieurs analyses afin d’avoir le plus de données possible
pour une même souris et de limiter le nombre de souris euthanasiées.
Par ailleurs, suite à une erreur dans la commande de l’alimentation, les souris
ont reçu une alimentation très riche en lipides pendant 2 mois fin 2013. La plupart des
souris utilisées dans nos études ont reçu cet aliment ; le Tableau 1 précise à quel âge.
Cet élément a été indiqué car il est possible qu’une telle alimentation ait des
conséquences sur le phénotype des souris en fonction de l’âge de l’apport lipidique.
Ainsi, par exemple, les frères des souris du groupe F, qui ont reçu l’alimentation au
cours de leur croissance, n’ont pas exprimé de phénotype musculaire. Ce point sera
abordé plus précisément dans la discussion.
[113]
Tableau 1: Présentation des souris utilisées pour l'étude de la fonction et de
l'expression de Hacd1 dans la rétine.
Allèle "+" désigne l’allèle sauvage
Allèle "-" désigne l’allèle Hacd1-KO
Allèle "flox" désigne l’allèle Hacd1-flox
[114]
Tableau 2 : Résumé des caractéristiques des différentes expériences réalisées dans le cadre de cette thèse
Légende : X désigne un lot en entier ; X désigne une partie du lot
+/+ : souris sauvages ; +/- souris hétérozygotes ; -/- souris Hacd1-KO
[115]
2. Étude clinique et fonctionnelle de la rétine des Souris
a. Examen ophtalmologique des souris - examen du fond d’œil
L’étude clinique de la rétine de nos souris a été effectuée par le service
d’ophtalmologie de l’École Nationale Vétérinaire d’Alfort. Ces examens ont été
réalisées sur les souris des lots C, E et F, souris mâles et femelles âgés de plus d’un an.
L’ensemble de l’examen était réalisé sur les animaux vigiles. Dans un premier temps,
le clinicien contrôlait la transparence de la cornée et du segment antérieur à l’aide
d’une lampe à fente. Il notait par la même occasion la présence éventuelle de taches
sur la cornée.
Une goutte de mydriaticum® était ensuite instillée dans chaque œil afin
d’obtenir une mydriase et de pouvoir observer le fond d’œil. Les souris étaient placées
pendant environ 15 min à l’obscurité. Une fois la mydriase obtenue, le Dr Sabine
Chahory visualisait le fond d’œil à l’aide d’un ophtalmoscope indirect. Elle qualifiait
alors l’aspect du fond d’œil, en particulier sa couleur et la taille des vaisseaux.
Au total, 39 souris, mâles et femelles, de plus d’un an ont été incluses dans cette
étude clinique. De plus, une simple observation des cornées et du segment antérieur a
aussi été réalisée sur 14 souris plus jeunes.
[116]
b. Étude fonctionnelle de la rétine par électrorétinographie
Les électrorétinogrammes (ERG) ont été réalisés en collaboration avec le
Professeur Isabelle Ranchon-Cole du laboratoire de biophysique de l’université
d’Auvergne (Clermont-Ferrand).
i.
Souris incluses dans l’étude et critère d’exclusion
Les ERG ont été réalisés sur deux lots de souris : le lot E comportant 18 souris
et le lot F comportant 15 souris. L’ensemble des souris était des souris femelles d’âge
compris entre 12 et 20 mois. Elles ont toutes subi un examen ophtalmologique dans
les deux mois précédant les ERG. Suite à cet examen ophtalmologique, les souris
présentant une opacification de la cornée ou une anomalie ayant gêné la visualisation
du fond d’œil ont été éliminées de l’étude par ERG. En effet, ces anomalies auraient
interféré avec l’obtention des tracés d’ERG.
ii.
Préparation des souris
Les souris ont été transportées, par un transporteur agréé, jusqu’à ClermontFerrand dans le mois précédant les mesures. De la nourriture était fournie par
l’animalerie d’origine afin de ne pas modifier leur régime alimentaire.
Les souris ont été adaptées à l’obscurité la nuit précédant la réalisation des
mesures. L’ensemble des manipulations ont ensuite été effectuées sous lumière
inactinique (> 650nm). Les souris ont été anesthésiées à l’aide d’un mélange de
kétamine (44mg/kg) et de xylazine (8mg/kg) injecté en intramusculaire. Les pupilles
des souris étaient ensuite dilatées par instillation d’une goutte d’Atropine sulfate 1%,
ALCON® dans chaque œil environ 10 min avant les mesures. Le niveau de dilatation
des pupilles était contrôlé avant de mettre la souris en place sur le montage.
[117]
iii.
Mise en place des souris
Les souris anesthésiées étaient placées en décubitus sternal sur une plaque
mobile chauffée à 37°C. L’œil droit était légèrement exorbité à l’aide d’un film
plastique troué réutilisé pour toutes les souris. Les trois électrodes nécessaires aux
enregistrements étaient ensuite positionnées sur l’animal. L’électrode de mesure était
constituée d’un fil d’argent (AgCl) en forme d’anneau et était fixée à la sphère
intégrante. Elle était posée contre la cornée, le plus centralement possible, et elle était
stabilisée au moyen de bras articulés. L’électrode de référence, une pastille de 2 mm
de diamètre en argent/chlorure d’argent, était placée sur la langue et maintenue en
place en refermant la bouche de la souris. L’ensemble de l’équipement était disposé
dans une cage de Faraday, ce qui permettait de s’affranchir des ondes électriques
parasites. Une fois l’ensemble en place, la lumière rouge était éteinte et les
manipulateurs passaient dans la pièce attenante contenant l’équipement informatique
à partir duquel ils lançaient les mesures.
iv.
Protocole de stimulation lumineuse pour les électrorétinogrammes-flash
Le protocole de stimulation lumineuse commençait avec un premier flash de
lumière blanche et d’intensité -3,5 log (cd.s/m2), soit en dessous du seuil de réponse.
Ce flash était suivi de neuf autres flashs d’intensité croissante jusqu’à atteindre une
valeur maximale de -1 log (cd.s/m2) pour le dernier flash. L’intervalle entre deux flashs
était de 30s. Chaque flash durait 10 μs et il n’y avait qu’un seul flash par intensité
lumineuse.
Le déclenchement du flash était piloté par un ordinateur situé dans une pièce
attenante à celle dans laquelle se trouvaient les souris et le montage. Le stimulus
lumineux était généré par un photostimulateur Type PS 33 (Grass, USA). Le flash
lumineux était ensuite acheminé par une fibre optique à une sphère intégrante
(Labsphère, North Sutton) qui éclairait de manière uniforme la totalité de la rétine
reproduisant ainsi des conditions de Ganzfeld.
[118]
Les trois électrodes étaient reliées à un amplificateur différentiel (Model 1700,
AM Systems, Paris). Le gain était réglé sur 1000 et la bande passante de 0,1 à 10 kHz
(afin d’obtenir un tracé ERG, la gamme de fréquence sélectionnée doit comprendre 0,3
à 300 Hz). Le signal ainsi amplifié était ensuite transmis à un logiciel informatique
permettant de convertir le signal analogique d’ERG en valeurs numériques. Grâce au
logiciel associé du même nom, l’impédance des électrodes était contrôlée avant de
lancer les mesures. Celle-ci devait être inférieure à 10 kOhms afin d’éviter les
artefacts. En cas d’impédance trop importante, la position des électrodes était
corrigée.
Un seul œil était stimulé à chaque fois. Le deuxième œil (œil gauche) était
stimulé après que l’ensemble des mesures ait été relevé pour le premier (œil droit).
Les réponses électrorétinographiques étaient donc recueillies de façon indépendante
pour chaque œil.
v.
Traitement des données
Le traitement des données a été réalisé par Isabelle Ranchon-Cole, Équipe de
Biophysique Neurosensorielle de l’INSERM, Université d’Auvergne, en appliquant les
méthodes décrites dans la littérature (Hood et Birch, 1996; Ranchon et al., 1998)
3. Prélèvement et fixation des yeux
a. Technique de prélèvement des yeux
Les souris étaient euthanasiées par dislocation cervicale suivant les
recommandations du guide des bonnes pratiques sur les animaux de laboratoire. Un
morceau de queue a été prélevé afin de vérifier le génotype des souris. Les yeux
[119]
étaient extériorisés de l’orbite en disséquant le tissu conjonctif peribulbaire à l’aide
d’une pince. Celle-ci était ensuite placée à l’arrière du globe oculaire et un mouvement
de traction était réalisé afin de rompre le nerf optique pour finir de libérer l’œil. L’œil
était alors rincé dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) et les éventuels restes de tissu
conjonctif ou adipeux étaient détachés à l’aide d’une pince et de ciseaux. Une partie du
nerf optique était conservée afin de faciliter l’orientation de l’œil par la suite.
Sur les souris du lot C, un fil de PROPYLЀNE 6-0 a été suturé dans la
conjonctive bulbaire à la commissure temporale des paupières avant extériorisation
de l’œil. Ce procédé a été testé afin de pouvoir orienter les yeux de façon reproductible
lors des coupes. Cependant, cette astuce n’a pas été reproduite par la suite en raison
des difficultés techniques rencontrées, avec un risque plus important de percer l’œil
notamment.
b. Fixations des yeux
Différents techniques de fixation ont été appliquées en fonction de l’utilisation
ultérieure des yeux. Pour la majorité des souris, les deux yeux étaient conservés de
manière différente afin de pouvoir réaliser des analyses différentes sur un même
animal. Les types de fixation utilisée pour chaque étude et pour chaque souris sont
précisés dans le Tableau 2 et ANNEXE 7 respectivement.
i.
Fixation par formadhéhyde
Une fois prélevés, les yeux étaient placés dans une cassette préalablement
identifiée. Ils étaient ensuite plongés dans une solution de PBS-formaldéhyde (PFA) à
4% et conservés à température ambiante dans l’attente du paraffinage. Ce type de
fixation était effectué en vu des immunofluorescences et de l’hybridation in situ.
[120]
ii.
Fixation par milieu de Davidson ou Excalibur
Une fois prélevés, les yeux étaient placés dans une cassette préalablement
identifiée. Ils étaient ensuite plongés dans une solution de Davidson ou d’Excalibur
puis maintenus à température ambiante pendant respectivement 48h et 72h. Les
cassettes étaient ensuite transférées dans une solution de PFA 4% et conservées à
température ambiante jusqu’au paraffinage. Ce type de fixation était réalisé en vu d’une
analyse morphométrique.
La composition du fixateur de Davidson est la suivante, pour un volume total de
900 mL : 300 mL d’eau distillée, 200 mL de formaldéhyde 37%, 100 mL d’acide
acétique glacial et 300 mL d’alcool à 95%.
Le fixateur Excalibur n’a été utilisé que sur les souris euthanasiées à ClermontFerrand (après l’analyse ERG). Ce fixateur est breveté, sa formulation n’est donc pas
connue mais il a été développé afin de préserver la structure d’organes fragiles tels
que de la rétine en vue d’analyses structurales (« Excalibur Pathology », 2013).
iii.
Congélation en isopentane
D’autres yeux étaient directement congelés dans de l’isopentane après avoir
été prélevés. Pour cela, un bécher contenant de l’isopentane était placé dans de l’azote
liquide. La température de l’isopentane était contrôlée régulièrement en vérifiant la
présence d’isopentane congelé au fond du bécher, la température était alors d’environ
-140°C. Les yeux étaient ensuite plongés et maintenus pendant une minute dans
l’isopentane liquide sous agitation. Ils étaient ensuite déposés dans des tubes
eppendorfs de 2 mL préalablement étiquetés et refroidis dans des vapeurs d’azote
liquide. Finalement, les tubes eppendorfs contenant les yeux étaient maintenus dans
les vapeurs d’azote liquide jusqu’à leur transfert à dans un congélateur à -80°C.
Ce type de fixation était réalisé en prévision des hybridations in situ, de
quelques immunofluorescences, des marquages X-Gal ou de futures colorations
lipidiques.
[121]
4. Préparation des coupes
a. Réalisation des coupes au microtome
i.
Paraffinage
L’étape de paraffinage était réalisée sur tous les yeux fixés afin de permettre la
découpe des blocs de paraffine au microtome par la suite. Cette étape était réalisée par
le laboratoire d’anatomie pathologique d’Alfort.
ii.
Coloration à l’Hémalun-Éosine-Safran
Les blocs de paraffine étaient débités à l’aide d’un microtome de sorte à obtenir
des coupes sagittales de l’œil de 4 μm d’épaisseur passant le plus près possible de la
papille (émergence du nerf optique dans la rétine). Pour cela, les yeux étaient
dégrossis jusqu’à ce que la région du nerf optique apparaisse. L’aspect des yeux était
régulièrement vérifié au microscope afin de ne pas manquer la zone d’intérêt. Une
dizaine de coupes passant à proximité de la papille étaient alors placées, à l’aide d’une
pince fine, dans un bain d’eau chauffée à 40°C afin de les lisser. Puis elles étaient
déposées sur des lames « Superfrost + » et mises à sécher pour la nuit dans une étuve
à 37°C.
Les lames étaient ensuite colorées à l’HES (Hémalun-Eosine-Safran). Il s’agit
d’une coloration histologique standard qui associe de l’hématoxyline et de l’éosine.
L’hématoxyline est un colorant basophile qui colore l’ADN, et donc les noyaux, en
violet alors que l’éosine est un colorant acidophile qui colore le cytoplasme en rose.
[122]
iii.
Préparation de coupes fixées au formaldéhyde pour immunofluorescence
ou hybridation in situ
Les blocs de paraffine étaient ensuite débités à l’aide d’un microtome de sorte à
obtenir une soixantaines de coupes sagittales de l’œil de 4μm d’épaisseur passant à
proximité de la papille (émergence du nerf optique dans la rétine). Les coupes
obtenues étaient déposées, à l’aide d’une pince fine, dans un bain d’eau chauffée à
40°C afin de les lisser. Puis, elles étaient alors récupérées sur des lames sériées
« Superfrost + », à raison de deux coupes d’un même oeil par lame. Finalement, les
lames étaient mises à sécher la nuit dans une étuve à 37°C. Elles étaient ensuite
conservées dans un réfrigérateur à -4°C dans l’attente de la réalisation des marquages
d’immunofluorescence ou d’Hybridation In situ.
iv.
Coupes au cryostat en vu des hybridations in situ
Les yeux congelés dans l’isopentane ont été découpés à l’aide d’un cryostat
Leica CM3050S. La température de la chambre ainsi que celle du porte-objet étaient
fixées à -22°C. Les yeux, sortis du congélateur à -80°C, étaient directement plongés
dans de l’OCT (Optimal Cutting Temperature) qui en solidifiant permettait de les
rattacher à un porte-objet. Cette manipulation était réalisée dans la chambre du
cryostat. L’orientation du prélèvement lors de l’inclusion permettait la réalisation de
coupes sagittales de l’œil. Les prélèvements étaient ensuite coupés au cryostat à une
épaisseur de 14 μm en vue des hybridations in situ. Les coupes étaient ensuite
déroulées et déposées sur des lames Superfrost+ à raison de 2 à 3 coupes par lame.
Une quarantaine de lames étaient réalisées pour chaque œil. L’observation régulière
des lames au microscope permettaient de réorienter le prélèvement si nécessaire et
de noter les coupes les plus moins abimées qui étaient utilisées en priorité par la suite.
Les lames étaient ensuite séchées dans la chambre du cryostat. L’ensemble des lames
était alors transféré dans le congélateur à -80°C, jusqu’à leur utilisation.
[123]
5. Analyse morphométrique de la structure des rétines
de souris
a. Photographies des coupes colorées à l’Hémalun-Éosine-Safran
Le protocole suivant était répété pour chacun des yeux :
Les différentes coupes colorées à l’HES étaient observées au Microscope Zeiss,
microscope entièrement motorisé à lumière transmise (LED) géré par le logiciel ZEN
(Zeiss Efficiency Navigation) version 2012, et équipé d'une caméra à très haute
résolution AxioCam HRc (Carl Zeiess S.A.S., Le Pecq, France). Les clichés étaient
ensuite effectués à l’aide du logiciel Axio Imager Z1. Cinq clichés étaient réalisés : un
cliché en mosaïque de l’œil entier au grossissement 2,5, deux clichés au grossissement
20 à une distance d’environ 600 μm de part et d’autre du nerf optique (soit 1,5
champs d’observation au grossissement 20) et 2 clichés au grossissement 40 en leur
centre (Figure 26). La résolution des clichés, nombre de pixels, était prédéfinie pour
chacun des grossissements : les clichés de l’œil entier et au grossissement 20 était
effectués à la résolution de 2776 x 2080 pixels et les photos au grossissement 40 en
1388 x 1040 pixels.
[124]
Figure 26 : Illustration du protocole appliqué lors de la réalisation des clichés des coupes d’œil colorées en vu de l’analyse
morphométrique (schéma réalisé à partir de clichés pris par le laboratoire d’anatomie pathologique de l’ENVA).
[125]
b. Mesures morphométriques réalisées à partir des clichés de rétine
i.
Observation des clichés d’œil entier – repérage des artéfacts et des lésions
Dans un premier temps, une observation globale du cliché de l’œil entier était
réalisée. Cette première observation avait pour but de relever la présence d’anomalies
structurales évidentes ou d’observer d’éventuels artéfacts justifiant de ne pas utiliser
l’œil dans la suite des analyses. En effet, il était possible que l’œil soit percé lors de son
prélèvement ou de sa manipulation. Or, en raison de la forte pression appliquée lors du
paraffinage, les rétines des yeux percés pouvaient présenter des aspects anormaux. Il
est difficile de savoir si une anomalie de rétine observée est d’origine artéfactuelle ou
s’il s’agit d’une vraie lésion. Après avoir demandé conseils aux spécialistes d’anatomie
pathologique, nous avons considéré que la présence de plis dans la rétine était un
artéfact alors que l’absence ou la réduction d’une couche cellulaire entière de la rétine
était une lésion (Figure 27).
[126]
Figure 27 : L’observation des clichés d’œil entier et distinction des artéfacts et des lésions histologiques.
A. Cliché x2,5 d’une coupe sagittale d’un œil de souris du lot C (mise en place d’une suture) en coloration Hémalun-Éosine-Safran après fixation
par le milieu de Davidson. La rétine est fortement plissée et le cristallin occupe l’ensemble du globe oculaire (chambres antérieure et
postérieure non visibles). Suspicion d’anomalie d’origine artéfactuelle probablement liée à la surpression générée lors du paraffinage sur un
œil qui était vraisemblablement percé.
B. Cliché x2,5 d’une coupe sagittale d’un œil de souris en coloration HES après fixation par le milieu de Davidson. Aspect normal, pas de lésion
ou d’artéfact notable.
C. Cliché x2,5 d’une coupe sagittale de l’œil d’une souris présentant une atrophie rétinienne marquée à l’observation du fond d’œil, coloration
HES et fixation par le milieu de Davidson. Les chambres antérieure et postérieure sont bien délimitées mais la rétine présente un aspect
anormal : amincissement global de la rétine par absence de la couche des photorécepteurs, amincissement de l’épithélium pigmentaire par
endroit. Ces éléments sont caractéristiques d’une dégénérescence rétinienne avancée. Il s’agit donc de toute évidence d’une lésion histologique
et non d’un artéfact.
[127]
ii.
Mesures réalisées à partir des clichés au grossissement 20
De nombreux paramètres ont été mesurés à partir des clichés au grossissement 20 :
-
épaisseur globale de la rétine,
-
rapports entre l’épaisseur de chaque couche et l’épaisseur globale de la rétine,
-
épaisseurs maximale et minimale des couches nucléaires interne et externe,
-
nombre de noyaux sur l’épaisseur de la couche des photorécepteurs et de la
couche des cellules bipolaires,
-
nombre de noyaux présents de manière anormale dans les couches plexiformes
interne et externe,
-
nombre de cellules ganglionnaires visibles par champs d’observation.
Les différentes mesures nécessaires pour calculer ces paramètres étaient
obtenues à l’aide de la fonction « mesure » du logiciel Image J et suivant les protocoles
décrits ci-dessous. D’autre part, elles étaient systématiquement réalisées à l’aveugle,
sans savoir si le cliché provenait d’un œil de souris mutée ou sauvage.
Dans un premier temps, les épaisseurs des différentes couches (épithélium
pigmentaire, segment externe des photorécépteurs, couche nucléaire externe, couche
plexiforme externe, couche nucléaire interne, couche plexiforme interne, couche des
cellules ganglionnaires et épaisseur totale de la rétine) étaient mesurées le long de
trois axes perpendiculaires à la rétine, répartis sur le cliché. De plus, les 3 axes étaient
placés de manière comparable entre les souris, permettant des comparaisons entre
mesures pour un même axe. La rétine s’amincissant lorsqu’on s’éloigne du nerf optique
les valeurs brutes ne pouvaient pas être comparées directement. Un rapport était donc
calculé entre l’épaisseur de chaque couche et l’épaisseur globale de la rétine pour
tenter d’éliminer ce biais de confusion. D’autre part, le nombre de noyaux dans la
couche des photorécepteurs et des cellules bipolaires selon ces trois axes était relevé.
[129]
Par la suite, le nombre de noyaux situés dans les couches plexiformes interne et
externe et dans la couche des cellules ganglionnaires était calculé sur l’ensemble du
champ d’observation. Étant donné que la rétine est courbe, la longueur de rétine
visible sur un cliché était variable. La longueur des différentes couches était donc
mesurée sur chaque cliché et le rapport du nombre de noyaux par pixel en était déduit
afin d’obtenir des valeurs comparables.
iii.
Mesures réalisées à partir des clichés au grossissement 40
Les clichés au grossissement 40 étaient principalement réalisés afin de
comptabiliser le nombre de noyaux par unité de surface dans les couches nucléaires
externe et interne. La délimitation de la zone de décompte était réalisée à l’aide de la
fonction « grid » (quadrillage) d’Image J, en fixant la trame du quadrillage à 20 000
pixels²/carreau pour les cellules bipolaires et 40 000 pixels²/carreau pour les
photorécepteurs, comme l’illustre la Figure 28.
Figure 28 : Illustration de la technique employée pour calculer le nombre de noyaux des
couches nucléaires interne et externe par unité de surface à l'aide d'Image J.
[130]
Le nombre de cellule était ensuite comptabilisé dans trois des carreaux
délimités par la grille à l’aide de l’outil « comptage cellulaire » d’Image J.
c. Étude statistique
Seuls quelques uns des paramètres mesurés ainsi à partir des clichés ont fait
l’objet d’une étude statistique. Ces paramètres avaient été sélectionnés lors de la mise
en place du protocole de mesure à la vue de la littérature portant sur le rôle des VLCFA
dans la rétine. Selon des études de Bennett, 2014 et Harkewicz, 2012, un déficit en
VLCFA aurait pour conséquence une légère diminution du nombre de photorécepteur
(de l’ordre de 10%) et une désorganisation des couches plexiformes de la rétine. Nous
avons donc choisi de comparer l’épaisseur relative de la couche nucléaire externe, des
segments externes et internes des photorécepteurs ainsi que le nombre de noyaux de
photorécepteur et de cellules bipolaires par unité de surface.
6. Marquages par immunofluorescence
L’ImmunoFluorescence (IF) est une technique d’immunomarquage qui permet
de visualiser une molécule d’intérêt sur une coupe histologique à l’aide d’un anticorps
dirigé contre cette molécule couplé à un fluorochrome. Cette technique peut présenter
différentes applications. Entre autres, elle peut servir dans le cadre d’études
histologiques. En effet, il est possible de réaliser un marquage fluorescent de molécules
spécifiquement localisées au niveau d’une structure d’intérêt pour la visualiser.
L’immunofluorescence permet aussi d’étudier l’expression d’un gène pour le marquage
du produit du gène d’intérêt ou du produit d’un gène rapporteur.
[131]
a. Protocole général
Il existe plusieurs types de protocole d’IF. Les plus fréquemment utilisés sont
les protocoles d’IF directe, utilisation d’un seul anticorps directement couplé à un
fluorochrome, et l’IF indirecte (Harlow et Lane, 1999; Odell et Cook, 2013). Dans le
cadre de cette thèse, seuls des marquages par IF indirecte ont été réalisés. Il s’agit
d’utiliser
successivement
deux
anticorps.
Le
premier
anticorps
reconnait
spécifiquement la protéine d’intérêt. Le second est dirigé contre l'anticorps primaire
(Coons et al., 1955). La technique d’IF indirecte est plus sensible que l’IF directe car
elle permet une amplification du signal. Le protocole général de ces IF se trouve en
ANNEXE 1. Ce protocole ainsi que les différentes dilutions des anticorps nous ont été
recommandés par Christel Masson-Garcia de l’Unité de Recherche en Neurologie et
Développement du CNRS à Orsay.
b. Les anticorps utilisés
i.
Étude de la structure histologique des synapses à ruban de la rétine avec un
anticorps anti-CtBP2
Le marquage par IF a été employé, dans un premier temps, afin d’étudier la
structure histologique de la rétine des souris et plus particulièrement des synapses à
ruban. Les synapses à ruban ont une conformation particulière permettant une
neurotransmission plus rapide, précise et efficace (Petit, 2010; Sterling et Matthews,
2005). A ce jour, ces synapses n’ont été observées qu’au niveau des organes sensoriels
et, en particulier, au niveau de la couche plexiforme externe où se situent les synapses
entre des photorécepteurs et des cellules bipolaires. Nous avons supposé ici qu’en cas
de modifications fines de la structure de la rétine des souris mutante, non visibles lors
des évaluations morphométriques globales, les synapses à ruban pourraient présenter
[132]
des anomalies. Nous avons donc cherché à marquer ces synapses à l’aide d’un
anticorps anti-CtBP2, une protéine au niveau de ces synapses.
Il s’agissait d’un anticorps monoclonal commercialisé par le laboratoire BD
Transduction (référence : 612044). Il a été utilisé à une dilution de 1/50. C’était un
anticorps IgG1 de Souris, l’anticorps secondaire était donc un anticorps polyclonal
anti-souris.
ii.
Étude
de
la
structure
histologique
des
segments
externes
des
photorécepteurs avec un anticorps anti-rhodopsine
La rhodopsine est un photopigment spécifiquement localisé au niveau des
segments externes des photorécepteurs. L’anticorps utilisé était un anticorps
monoclonal commercialisé par le laboratoire Abcam (référence : ab3267). Il a été
utilisé à une dilution de 1/2000. Il s’agissait d’un anticorps IgG1 de Souris, l’anticorps
secondaire était donc un anticorps polyclonal anti-souris.
iii.
Marquage indirect de l’expression du gène Hacd1 à l’aide d’un anticorps
anti-β-Gal
Le génotype de nos souris d’étude a été modifié de telle sorte à insérer le gène
de la β-Galactosidase, LacZ, sous le même promoteur que celui de Hacd1. Ainsi, la
β-Galactosidase s’exprime dans les mêmes cellules et en quantité équivalente à notre
gène d’intérêt. La mise en évidence de cette enzyme par IF peut donc servir de
marquage indirect de l’expression de Hacd1.
[133]
Deux anticorps anti-β-Gal ont été testés, dans un premier temps un anticorps
produit par d’Abcam puis un second produit par Cappel. De plus, plusieurs
concentrations différentes ont été essayées (1/50, 1/100, 1/200, 1/400).
iv.
Double immunofluorescence afin d’identifier les cellules exprimant le gène
Hacd1
Afin de déterminer quelles cellules de la couche des cellules bipolaires et
ganglionnaires exprimaient le gène rapporteur LacZ, nous avons voulu réaliser des
doubles IF avec un anticorps anti-β-Gal et au anticorps marquant spécifiquement les
cellules bipolaires ou ganglionaires, soit respectivement un anticorps anti-PKCα et un
autre anti-Neun.
Remarque : ce double marquage n’était possible que si les anticorps primaires
étaient produits par des espèces différentes afin que les anticorps secondaires,
spécifiques d’espèces, ne reconnaissent pas les deux anticorps primaires. Les anticorps
secondaires étaient alors couplés à des fluorochromes émettant dans des longueurs
d’onde différentes. S’il n’était pas possible de réaliser le double marquage sur une
même coupe, il était tout de même possible de réaliser les deux marquages sur des
coupes sériées permettant de comparer deux coupes successives.
c. Observation des coupes et prise de clichés
Une fois marquées, les coupes étaient observées au microscope inversé
Apotome Axio Observer Z1 (Zeiss) dans la semaine suivant la réalisation de l’IF.
L’acquisition des clichés était réalisée à partir du logiciel Zen (Zeiss). Les clichés
étaient pris au grossissement 20. L’intensité lumineuse (mV) ainsi que le temps
d’exposition (ms) lors d’une série de prises de clichés étaient choisis au début des
[134]
acquisitions et conservés pour toutes les coupes marquées avec l’anticorps donné pour
éviter d’introduire un biais de mesure. L’intensité était choisie de telle sorte à ne pas
saturer les images des coupes les plus fortement marquées afin de ne pas perdre
d’information. Les clichés étaient réalisés dans une zone comportant le moins
d’artéfacts liés à la fixation possible et de telle sorte à être dans des zones
comparables. L’analyse des clichés était réalisée à l’aveugle dans les suivantes.
[135]
7. Hybridation in situ : marquage direct de l’expression
du gène Hacd1
L’Hybridation In Situ (HIS) permet la visualisation directe de la localisation des
ARNm d’un gène (Wilkinson, 1998). Ce procédé repose sur l’utilisation de sondes
anti-sens complémentaires de notre séquence d’intérêt qui se fixent sur celle-ci
(Blackshaw, 2013). Nous avons choisi ici une méthode de visualisation des sondes non
radioactives basée sur l’utilisation de phosphatases alcalines couplées à des anticorps
anti-digoxigénine (Tautz et Pfeifle, 1989).
Nous avons cherché à réaliser des HIS afin de vérifier nos premières
observations quant à l’expression du gène Hacd1 dans la rétine. L’utilisation d’une
technique de marquage direct de l’expression du gène Hacd1, telle que l’HIS, était
recommandée étant donné le caractère surprenant de l’absence d’expression du gène
dans les photorécepteurs. La technique d’HIS est une technique complexe à mettre en
œuvre d’autant plus que la rétine est un tissu particulièrement fragile nécessitant la
mise au point d’un protocole d’HIS adapté. Nous avons eu besoin de plusieurs essais
pour mettre au point ce protocole à partir de celui qui nous a été fourni par Giorgia
Egidy, chercheuse au laboratoire.
[136]
a. Préparation de l’hybridation in situ – Synthèse des sondes acides
ribonucléiques marquées par la digoxigénine
i.
Choix des sondes
La séquence des sondes utilisées pour l’HIS a été choisie à partir de la séquence
complémentaire de l’ARNm d’intérêt (ADNc) de manière à respecter deux règles. Tout
d’abord, cette sonde devait reconnaître de manière spécifique l’ARNm d’intérêt. Il ne
fallait donc pas que cette séquence apparaisse ailleurs dans le génome. D’autre part, la
sonde et l’ARNm devaient former un hybride très stable. La stabilité d’un hybride
dépend entre autre de sa longueur et des bases formant sa séquence, soit le taux de
guanines et cytosines qui forment des liaisons plus fortes. Finalement, la taille des
sondes devait être comprise entre 200 et 500 pb.
ii.
Synthèse des précurseurs acides désoxyribonucléiques des sondes par
réaction de polymérisation en chaîne)
La réaction de polymérisation en chaîne, ou PCR, permet d’amplifier de l’ADN à
l’aide d’une ADN polymérase et d’amorces pour commencer l’amplification. Les
séquences et les caractéristiques des amorces choisies sont présentées dans le Tableau
3 ci-dessous. Les produits PCR servait à synthétiser ensuite des sondes ARN simple
brin à l’aide d’une ARN polymérase, T7. Une séquence promotrice pour la T7
polymérase a été insérée dans l’une des amorces pour chaque PCR. La séquence T7
dans l’amorce sens permettait de synthétiser ensuite une sonde ARN sens, servant de
témoin négatif pour l’HIS. La séquence T7 dans l’amorce antisens permettait de
synthétiser une sonde antisens capables de s’hybrider aux ARNm du gène Hacd1.
[137]
Tableau 3 : Caractéristiques et séquences des amorces utilisées pour synthétiser les
précurseurs ADN des sondes d'hybridation in situ
Taille de la
N°
Nom et séquence
Température de
Taux de
fusion (Tm en °C)
GC (%)
20pb
61,4°C
60%
43pb
74,2°C
48,8%
24pb
57,6°C
37,5%
47pb
71,2°C
38,3%
séquence
(paires de bases)
1
Mouse Hacd1 Sens
ATGGCGTCCAGTGAGGAGGA
2
T7 Mouse Hacd1 Sens
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
ATGGCGTCCAGTGAGGAGGA
3
Mouse Hacd1 Antisens
GGGTTTTATACTGTGAGTAATGAG
4
T7 Mouse Hacd1 Antisens
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
GGGTTTTATACTGTGAGTAATGAG
Protocole des cycles d’amplification de l’ADN par PCR : ce protocole est détaillé en
ANNEXE 3 et la méthode de synthèse des précurseurs ADN est détaillés ci-dessous,
Tableau 4.
Tableau 4 : Réactions de polymérisation en chaîne réalisées afin de synthétiser
les précurseurs ADN des sondes d'hybridation in situ.
Matrice pour la
Tube N°
Gène
Amorce 1 (SENS)
Amorce 2 (ANTISENS)
1
Mouse Hacd1
Mouse Hacd1 Sens
T7 Mouse Hacd1 Antisens
Anti-sens
2
Mouse Hacd1
T7 Mouse Hacd1 Sens
Mouse Hacd1 Antiens
Sens
sonde
Purification des produits PCR : la purification des produits PCR a été effectuée à
l’aide du kit GeneJet PCR purification #K0701 5 (Thermo Scientific).
[138]
Électrophorèse – vérification et quantification des produits PCR obtenus
Les produits PCR obtenus ont été vérifiés en réalisant une migration sur gel d’agarose
à 1,5% en TAE (Tris, Acétate, EDTA). La quantification des produits a été permises
grâce au marqueur de poids moléculaire de 100pb (Fermentas).
iii.
Synthèse des sondes acides ribonucléiques marquées par digoxigénine
La synthèse des sondes ARN à partir des produits ADN et le marquage par la
digoxigénine (DIG) ont été réalisés à l’aide du kit T7 de Proméga et DIG de Roche. Pour
cela, nous avons réalisé le mélange suivant (volume final de 40 µL) :
•
20 μL de matrice ADN (produit PCR) soit environ 2µg,
•
4 µL Transcription Buffer 5X,
•
4 µL de NTP Labelling Mix,
•
4 µL RNApol T7,
•
2 µL RNase inhibitor,
•
6 µL Eau milliQ autoclavée (RNase free).
Le mélange a été incubé 2h à 37°C au bain marie, puis les sondes ARN étaient
purifiées sur colonnes GE Healthcare (volume récupéré 40 μL). Un dosage des
échantillons était ensuite réalisé à l’aide du Nanodrop et 1uL d’ARN, soit entre 200 et
500 ng, était mis à migrer sur gel, suivant le même protocole que décrit précédemment
pour les produits PCR, afin de vérifier la qualité de nos échantillons. Les sondes ARN
étaient ensuite stockées à -20°C.
[139]
b. Protocole d’hybridation in situ
Les HIS sur rétine ont été testées dans un premier temps à partir d’yeux
congelés en isopentane. Cependant, ce protocole ne permettait pas une bonne
conservation des rétines qui étaient endommagées au fur et à mesure des nombreux
lavages. Nous avons donc modifié le protocole afin de faire les HIS sur coupe fixées en
formaldéhyde. L’étape de fixation initiale nécessaire sur les coupes congelées a été
remplacée par une étape de déparaffinage. Le protocole d’HIS mis au point après ces
différents essais ainsi que les formulations des différents tampons sont décrits en
ANNEXE 4 et ANNEXE 5. Ce protocole était réalisé sur trois jours et nécessitait la
préparation des différents tampons en avance. En effet, la majorité des tampons devait
être autoclavée afin d’obtenir des solutions ARNase free.
[140]
8. Observation des rétines par microscopie électronique
Les yeux des souris étaient prélevés comme décrit précédemment, paragraphe
II.3. La fixation et l’inclusion des rétines a ensuite été réalisée au Centre Imagerie
Cellulaire Santé de la Faculté de Médecine-Pharmacie de Clermont-Ferrand, dirigé par
Claire SZCZEPANIAK, en suivant le protocole décrit en ANNEXE 6. Tous les produits
utilisés lors de cette étape provenaient de chez EMS (Electron Microscopy Science)
distribué par Delta Microscopies en France.
Une fois incluses, les rétines ont été observées dans ce même laboratoire à
l’aide d’un MET Hitachi H-7650 équipé d’un système de camera AMT 40 Hamamatsu.
Différents clichés représentatifs de l’échantillon ont été pris pour chaque coupe de
telle sorte à visualiser l’ensemble des photorécepteurs et de l’épithélium pigmentaire.
Le reste de la rétine n’a pas été étudié faute de temps.
Après avoir observé l’ensemble des coupes au MET, des clichés des zones
pouvant paraître anormales ont été effectués par Isabelle Ranchon-Cole et moi-même.
Ces clichés ont été présentés à une spécialiste de la MET, Mme Claire Szczepaniak, afin
de tenter de faire la part des choses entre des variations physiologiques et de possibles
anomalies structurales des photorécepteurs ou de l’épithélium pigmentaire.
[141]
9. Analyse de la composition lipidique des rétines et des
sécrétions des glandes de Méibomius
Cette analyse a été réalisée en collaboration avec le Professeur Robert Anderson
du laboratoire de biophysique du Dean McGee Eye Institute, États-Unis. Étant donné la
complexité du transfert des rétines et les coûts induits, seules les compositions
lipidiques des rétines de 14 souris ont été analysées dans un premier temps. Les souris
utilisées pour cette étude, souris du lot E, étaient des souris femelles âgées d’environ
18 mois. Elles ont toutes subi un examen clinique (cornée et fond d’œil) préalable et
un examen ERG environ un mois plus tard. L’ensemble des ERG ont été réalisés sur
deux jours et les souris ont été euthanasiées dans l’après midi du deuxième jour par
dislocation cervicale et un morceau de queue a été prélevé pour contrôle du génotype.
Les souris étaient ensuite placées sous une lampe binoculaire et les paupières
étaient compressées à l’aide de pince afin d’extérioriser le contenu des glandes de
Méibomius (Figure 29) (Butovich et al., 2012). Le matériel ainsi obtenu était récupéré
à l’aide d’une aiguille et placé dans un tube eppendorf. Faute de temps et en raison de
difficultés techniques rencontrées, cette étape n’a finalement été réalisée que sur la
moitié des souris du lot E. Les analyses lipidiques n’ont donc pas été effectuées à partir
de ces échantillons.
L’œil droit était ensuite prélevé suivant la technique exposée paragraphe II.3. Il
était placé sous une lampe binoculaire et un second manipulateur s’occupait d’isoler la
rétine. Pour cela, l’œil était ouvert par section autour de la cornée. Le cristallin était
mis de côté et la rétine, matériel gélatineux apparaissant derrière le cristallin, était
récupérée et placée dans un tube eppendorf préalablement identifié.
[142]
En parallèle, le premier manipulateur prélevait l’œil gauche qui était fixé en
milieu Excalibur pour une analyse histologique comme indiqué précédemment,
paragraphe II. 4-5.
Figure 29 : Aspect des sécrétions des glandes de méibomius chez la souris à
température ambiante (20°C environ) (A) et à température corporelle (B). D’après
Butovich et al. 2012.
Les flèches indiquent la position des orifices des glandes de méibomius
Les deux tubes eppendorfs contenant respectivement la rétine et les sécrétions
des glandes de Méibomius étaient remplis d’argon et congelés à -80°C afin conserver
leur contenu sans affecter leur composition lipidique. Ces tubes ont finalement été
envoyés au laboratoire de biophysique du Dean McGee Eye Institute en carboglace
pour analyse.
[143]
III.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Dans ce paragraphe, les souris homozygotes mutées pour le gène Hacd1 (-/-)
sont nommées « Hacd1-KO », les souris homozygotes sauvages (+/+) seront nommées
« sauvages » et on utilise le terme de souris « hétérozygotes » pour les souris +/-. En
général, le lot de souris contrôle était constitué de souris sauvages et hétérozygotes.
1. Étude clinique et fonctionnelle de la rétine des souris
mutées pour le gène Hacd1
a. Résultats de l’examen ophtalmologique
i.
Observation de la cornée et des structures intraoculaires autres que la
rétine
Les résultats des observations de la cornée et des structures intraoculaires à la
lampe à fente sont présentés dans le Tableau 5.
On note, en particulier, que la présence d’une opacité cornée ponctiforme
bilatérale a été significativement plus souvent observée parmi les souris Hacd1-KO
que parmi les souris contrôles, avec un risque relatif RR = 6 et p < 0.01. Ces opacités
étaient le plus souvent situées en miroir en région paraventrale et nasale. Elles étaient
de relativement petite taille, environ 0,5 mm de diamètre en moyenne.
[145]
Tableau 5 : Résultats des observations de la cornée et des structures
intraoculaires à la lampe à fente. Effectif de 39 souris provenant des lots C, D et E.
Génotype
Absence
Opacification cornéenne ponctiforme
Autre
Total
d’anomalie
anomalie
unilatérale
bilatérale
Souris +/+
8
1
1
0
10
Souris +/8
3
1
4
16
Souris -/3
1
6
3
13
Total
19
5
8
7
39
Exemples d’autres anomalies observées : opacification généralisée de la cornée, microphtalmie,
kératite, discories, cataracte.
** : significatif,
p < 0.01
Notons qu’il s’agit là d’une découverte fortuite. À l’origine, l’observation de la
cornée de nos souris avait été réalisée en prévision des examens électrorétinographie
afin de s’assurer de l’absence d’anomalie de la cornée pouvant interférer avec
l’évaluation fonctionnelle de la rétine. Sur l’ensemble des souries des lots E et F, seules
trois souris hétérozygotes, appartenant au lot E, présentaient des anomalies justifiant
leur exclusion de l’étude ERG. Ces trois souris avaient des opacifications massives et
unilatérales de la cornée empêchant la visualisation du fond d’œil.
Une observation de la cornée à la lampe à fente a aussi été réalisée sur le lot G,
composé de six jeunes souris, deux Hacd1-KO et quatre sauvages, mâles et femelles
âgées d’environ six mois au moment des mesures. Sur l’ensemble des six souris,
aucune ne présentait d’opacification de la cornée. Ce lot n’a pas été pris en compte au
même titre que les autres en raison de l’importante différence d’âge et de son faible
effectif. En effet, selon la littérature, les déficits en VLCFA seraient à l’origine de
phénotypes accentués avec l’âge (Bennett et al., 2014a). Il se pourrait donc que ces
[146]
jeunes souris n’aient pas encore développé les anomalies observées chez les souris
Hacd1-KO plus âgées.
ii.
Observation du fond d’œil
Les résultats de l’observation des fonds d’œil sont synthétisés dans le Tableau 6.
Tableau 6 : Résultats de l'observation des fonds d'œil pour un effectif de 36
souris.
Génotype
Fond d’œil
normal
Fond d’œil
douteux
Atrophie
rétinienne
modérée
Atrophie
rétinienne
marquée
Total
Souris +/+
10
0
0
0
10
Souris +/Souris -/-
9
1
2
4
0
3
(2)
5
13
13
Total
20
6
3
5
36
« Fond d’œil douteux » : fond d’œil pâle mais vaisseaux normaux ou fond d’œil normal mais
vaisseaux de calibre réduit.
« Atrophie rétinienne modérée » : vaisseaux visibles mais de calibre diminué, fond d’œil
éclairci.
« Atrophie rétinienne marquée » : disparition des vaisseaux et fond d’œil pâle présentant
éventuellement des plages de couleur hétérogène ou fond d’œil bien pigmenté (*), plutôt
évocateur d’une dégénérescence rétinienne liée à l’âge.
** : significatif,
p < 0.001
[147]
La proportion de souris présentant des signes d’atrophie complète ou modérée,
liée à l’âge ou non, était bien plus importante parmi les souris Hacd1-KO de
l’échantillon : RR = 7 avec p < 0.0015. Notons, en particulier, que sur les 10 souris
présentant des signes d’atrophie rétinienne (modérée ou marquée), 8 étaient des
souris Hacd1-KO. Finalement, les deux autres présentaient un phénotype légèrement
différent, fonds d’œil hyperpigmentés et non pâles, évoquant plutôt une
dégénérescence rétinienne liée à l’âge, d’après le Dr Chahory.
b. Discussion concernant l’examen ophtalmologique
i.
Aspects techniques
Les examens de la cornée et du fond d’œil ont été réalisés par un seul
examinateur : le Dr Sabine Chahory, spécialiste en ophtalmologie vétérinaire exerçant
sur l’ENVA. Nous avons donc fortement confiance en ses observations. Cependant, les
examens ont été réalisés sur souris vigiles. L’observation du fond d’œil était donc plus
difficile car les souris bougeaient régulièrement la tête. Ce point n’a pas semblé
perturber l’examinatrice mais il est possible qu’elle aurait réussi à voir des anomalies
plus fines avec une meilleure contention des souris, éventuellement une sédation.
Notons que si cela entraîne un biais, il s’agirait d’un biais de classement non
différentiel ce qui ne remettrait, a priori, pas en cause nos conclusions.
D’autre part, nous aurions aimé pouvoir prendre des clichés des fonds d’œil
pour les faire relire à l’aveugle par un second examinateur et pour illustrer les
différents phénotypes. Toutefois, nous ne disposions pas d’une caméra adaptée.
Dernièrement, une technique de prise de cliché des fonds d’œil à l’aide d’une loupe
binoculaire a été mise au point (Pinto et Enroth-Cugell, 2000) (celle-ci est décrite dans
la partie bibliographie). Il serait intéressant de la tester sur nos souris étant donné
qu’elle semble relativement facile à mettre en œuvre et ne nécessite pas de matériel
particulier. Notons toutefois que cette technique nécessite de sédater l’animal, ce qui
peut présenter un léger risque.
[148]
ii.
Bilan des observations de la cornée et du fond d’œil
Notre étude semble montrer que les souris Hacd1-KO de cet échantillon étaient
prédisposées à une atrophie rétinienne (RR = 7) et qu’elles avaient plus de risques de
présenter des opacifications ponctiformes bilatérales de la cornée, principalement
localisées en région paraventrale et nasale (RR = 6).
L’observation d’opacifications ponctiformes bilatérales sur les cornées de nos
souris Hacd1-KO n’était pas attendue. Nous avons émis différentes hypothèses quant à
la nature de ces dépôts et, en particulier, nous avons envisagé la possibilité que ce soit
des dépôts lipidiques secondaires à une accumulation de précurseurs des acides gras
à très longue chaîne au niveau des yeux ou dans les glandes de Méibomius. Afin de
confirmer cette hypothèse, il serait intéressant de rechercher la présence de lipides au
niveau de ces dépôts. Pour cela, il serait possible de réaliser des colorations des
cornées par du red oil ou soudan noir, colorant histologiques permettant de marquer
les graisses. Notons toutefois que des opacifications des cornées ont précédemment
été décrites chez de nombreuses souches de souris de laboratoire (Percy et Barthold,
2013). En général, ces opacifications sont des conséquences de phénomènes
inflammatoires aigus ou chroniques de type kératites, ulcères cornéens… et le rôle de
facteurs environnementaux, dont le taux d’ammoniac, semble prépondérant. Ici, la
prédominance de ces opacifications parmi les souris Hacd1-KO de la cohorte ainsi que
l’aspect bilatéral des lésions seraient plutôt en faveur d’un lien direct avec notre
mutation d’étude et non d’une conséquence environnementale. Par ailleurs, les
niveaux d’ammoniac et les paramètres d’ambiance sont bien maîtrisés au sein de
notre animalerie et les souris Hacd1-KO sont mélangées aux souris contrôles dans les
cages.
Finalement, les souris Hacd1-KO de notre étude ont présenté significativement
plus de lésions du fond d’œil compatibles avec une atrophie rétinienne plus ou moins
marquée. Ce résultat est particulièrement intéressant étant donné qu’il a été
démontré que la mutation d’ELOVL4 est à l’origine d’une dégénérescence maculaire
juvénile chez l’Homme.
[149]
Remarque : nous aurions aussi pu choisir de tester la significativité de
l’atrophie marquée (disparition totale des vaisseaux, liée à l’âge ou non) en
considérant que les phénotypes intermédiaires n’étaient pas suffisants pour être pris
en compte. Si on réalise alors un test de Fisher avec les nouvelles répartition, on
obtient p = 0.07 avec un RR = 4. La différence ne serait donc plus significative et une
telle répartition de l’atrophie chez nos souris pourrait être due au hasard. Toutefois, la
taille de notre échantillon ainsi que l’incidence de la maladie (atrophie rétinienne
marquée) étant relativement faibles, il est possible que nous ayons juste manqué de
puissance statistique pour mettre en évidence une différence réelle.
c. Résultats
de
l’étude
fonctionnelle
de
la
rétine
par
électrorétinographie
i.
Résultats de l’étude des électrorétinogrammes Flash
L’amplitude et le temps de latence de l’onde a et de l’onde b ont été extrapolés,
par Isabelle Ranchon-Cole, à partir des ERG obtenus sur les 30 souris des lots E et F.
Les statistiques ont été réalisées sur les deux lots pris séparément étant donné que les
conditions environnementales influencent fortement les tracés et que les mesures ont
été faites avec trois mois d’écart. Les souris présentant des valeurs très différentes
comparées aux autres souris d’un même génotype n’ont pas été prises en compte dans
le calcul des moyennes et des écarts types. Ainsi, par exemple, les souris à ERG nul ont
été mises à part. Il s’agissait de souris présentant une atrophie rétinienne complète
lors de l’examen du fond d’œil ; ce cas particulier a donc déjà été identifié et discuté
précédemment.
Contrairement à ce qui avait observé lors de l’étude préliminaire réalisées en
2012 sur l’ENVA, aucune différence significative n’a été observée concernant
l’ensemble de ces paramètres, analysés sur les lots E et F à Clermont-Ferrand. Une
tendance semble toutefois se dégager concernant l’onde b dont l’amplitude est
[150]
légèrement diminuée chez les souris Hacd1-KO, en particulier à partir d’une
luminance supérieure ou égale à -0.76 log(cd.s.m-2) comme l’illustre la Figure 30. Cette
observation a été réalisée à partir des données du lot F mais n’a pas pu être vérifiée en
ce qui concerne le lot E pour lequel les données brutes ne sont pas disponibles.
Figure 30 : Amplitudes moyennes de l'onde b en fonction de l’intensité du flash
lumineux.
Mesures réalisées chez les souris Hacd1-KO (-/-), hétérozygotes (+/-) et sauvages (+/+).
Les barres d’erreur correspondent aux écarts types.
1000
900
800
Amplitude (µV)
700
+/+
600
+/-
500
-/-
400
300
200
100
0
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
Flash Luminance (log(cd.s.m-2))
ii.
Résultats de l’étude des potentiels oscillatoires
En plus des tracés ERG, des mesures de potentiels oscillatoires ont été réalisées
sur les souris du lot F. Suite à ses mesures, nous avons pu comparer les amplitudes
des quatre potentiels : OP1, OP2, OP3, OP4 et leur temps de latence respectif. Les
seules différences significatives notables concernaient l’amplitude d’OP1. Ainsi, l’effet
[151]
du génotype était significatif (p = 0.035) avec en particulier une différence fortement
significative entre les souris sauvages et Hacd1-KO (p1 = 0,0184). Les différences entre
les souris sauvages et hétérozygotes ou entre les souris Hacd1-KO et hétérozygotes
n’étaient pas significatives (p2 = 0,059 et p3 = 0,3 respectivement).
d. Discussion concernant l’évaluation fonctionnelle de la rétine :
comparaison du protocole et des résultats entre notre étude et
l’étude préliminaire
Aucune anomalie notable n’a été mise en évidence lors de cette nouvelle série
d’ERG. Ces résultats sont surprenants au vu des résultats de l’étude préliminaire,
comme l’illustre la comparaison de ces deux études détaillés ci-dessous.
i.
Comparaison de l’aspect des tracés des électrorétinogrammes
La Figure 31 illustre les trois différents types de tracés obtenus lors de la
réalisation des ERG sur Alfort en 2012 (étude préliminaire) et sur Clermont-Ferrand
en 2014. Seul le tracé d’une souris sauvage est présenté en ce qui concerne notre
étude car les Hacd1-KO avaient des tracés très similaires. D’autre part, le Tableau 7
compare les différents paramètres d’intérêt extrapolés à partir de ces trois tracés ERG.
Nous tenterons d’expliquer les différences observées dans le paragraphe suivant.
La première différence notable est la différence d’échelle entre les
électrorétinogrammes obtenus à l’ENVA et à la faculté de Clermont-Ferrand. Ainsi, par
exemple, les tracés d’ERG obtenus chez les souris sauvages au cours de notre étude
variaient entre [-400 ; 600]μV contre [-100 ; 150]μV lors de l’étude préliminaire. De
même, les temps de latence étaient plus longs dans les ERG réalisés à ClermontFerrand.
[152]
Figure 31: Comparaison des 3 tracés électrorétinogrammes types obtenus à l'ENVA en
2012 et à la faculté de Clermont-Ferrand en 2014.
Tableau 7 : Comparaison des tracés d'électrorétinogrammes flash obtenus
chez les souris sauvages (+/+) et les souris mutantes (-/-) à l'ENVA en 2012
et à la faculté de Clermont-Ferrand en 2014.
[153]
Une seconde différence notable était l’absence de différence significative dans
les amplitudes et temps de latence des ondes a et b entre les tracés des souris
mutantes et contrôles lors des mesures réalisées à Clermont-Ferrand. Pour rappel,
lors de l’étude préliminaire des différences significatives importantes avaient été
notées notamment en ce qui concernait l’amplitude des ondes a et b (p < 0,05 pour
plusieurs intensités de stimulation différentes (Blondelle, 2013)) (Figure 32). Notons
que lors de notre étude, les résultats de deux souris Hacd1-KO n’ont pas pu être pris
en compte dans les calculs statistiques car elles présentaient des ERG plats quelle que
soit l’intensité de stimulation.
Finalement, dans cette dernière étude, nous n’avons observé aucun phénotype
d’ERG intermédiaire. Nous nous attendions pourtant à observer de tels phénotypes en
cas de début de dégénérescence rétinienne, ce que suggérait l’étude clinique décrite
précédemment. Par contre, les deux souris qui semblaient présenter une atrophie
rétinienne marquée à l’examen du fond d’œil correspondent bien aux deux souris qui
ont présenté un ERG plat.
[154]
Figure 32 : Comparaison de l'amplitude des ondes b chez les Hacd1-KO et
sauvages en fonction de l'intensité du flash lumineux.
A. Mesures réalisées lors de l’étude préliminaire à l’ENVA en 2012.
Légende : ko, souris Hacd1-KO; wt, souris sauvages.
B. Mesures réalisées sur le lot E lors de notre étude à la faculté de Clermont-Ferrand en
2014. Légende : +/+, souris sauvages ; +/-, souris hétérozygotes ; -/-, souris Hacd1-KO.
Amplitude de l'onde b en uV
250,0
200,0
A
150,0
moyenne ko
moyenne wt
100,0
50,0
0,0
-3,5 -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0
0,5
1,0
Intensité Flash log (cds/m2)
Amplitude de l'onde b (µV)
1200
B
1000
800
600
+/+
+/-
400
-/200
0
-4
-3,5
-3
-2,5
-2
-1,5
-1
Intensité Flash log (cds/m²)
[155]
-0,5
0
ii.
Comparaison des protocoles employés
Suite à ces premières observations, nous avons cherché à comprendre l’origine
de telles différences entre l’étude préliminaire et notre étude. Pour cela, nous avons
commencé par comparer les deux protocoles.
Comparaison des souris d’étude
Dans un premier temps, nous avons cherché à comparer les caractéristiques
des deux lots de souris testées. Le Tableau 8 résume les caractéristiques des souris
utilisées dans ces deux études.
Tableau 8 : Comparaison des lots étudiés par électrorétinographie.
KO = souris Hacd1-KO, WT = souris sauvages, +/- souris hétérozygotes
Il existe deux différences notables entre ces lots de souris. La première
concerne l’âge des souris. En effet, les souris testées pour ma thèse étaient un peu plus
âgées que les premières en raison de contraintes d’emploi du temps concernant la
réalisation de ces ERG à Clermont-Ferrand. Cependant, il nous semble peu probable
que ces variations d’âge puissent expliquer de telles différences, d’autant plus que l’on
s’attendrait plutôt à une aggravation du phénotype avec l’âge. Afin de vérifier l’impact
réel de l’âge sur cette mutation, il serait intéressant de réaliser des comparaisons
entre des tracés ERG obtenus chez des mêmes souris à des âges différents.
[156]
La seconde différence concerne le type d’alimentation. En effet, les souris
appartenant aux lots testés à Clermont-Ferrand avaient reçu, par erreur, une
alimentation très riche en lipides alors qu’elles étaient âgées d’environ six mois pour
le lot E et d’un mois pour le lot F. D’autre part, une étude réalisée au sein du
laboratoire, en parallèle à la nôtre, a mis en évidence que les frères des souris du lot F,
ne présentaient pas le phénotype musculaire systématiquement rencontré chez les
souris Hacd1-KO. Cet apport nutritionnel avait sauvé le phénotype musculaire. Il se
peut donc que le phénotype rétinien ait lui aussi été en partie compensé par ces
apports lipidiques. Bien que conscients de cette erreur d’alimentation, nous avons
choisi de maintenir ces souris dans notre étude car les résultats obtenus lors de
l’étude clinique semblaient prometteurs. Les résultats de l’étude clinique et de l’étude
fonctionnelle semblent donc contradictoires en ce sens.
Comparaison des protocoles à proprement parler
Dans un second temps, nous avons comparé les protocoles ERG employés dans
ces deux études.
Le Tableau 9, résume les principales caractéristiques des deux protocoles mis
en place pour l’acquisition des électrorétinogrammes. On constate qu’il existe
plusieurs différences notables entre ces deux protocoles. Certaines, telles que le type
de mydriatique utilisé ou la bande passante, ne devraient pas permettre d’expliquer
les différences dans l’aspect des tracés. En effet, bien que les tracés obtenus sur Alfort
ressemblent un peu à des potentiels oscillatoires, ce sont bel et bien des ERG Flash car
la bande passante utilisée comprenait bien les signaux de 1 et 100 Hz.
[157]
Tableau 9 : Comparaison des principales caractéristiques des deux protocoles
d'acquisition des électrorétinogrammes.
Par contre, le nombre de flash par intensité pourrait avoir un impact important
sur l’aspect des tracés d’ERG si les souris mutées présentaient des difficultés à
régénérer leurs photopigments. Ainsi, lors du premier flash, la réponse de la rétine
serait quasiment normale chez toutes les souris, alors qu’elle serait diminuée voire
absente après plusieurs flashs si les photopigments n’avaient pas pu se régénérer à
temps. Par ailleurs, l’intervalle entre deux flashs d’intensités différentes étant plus
important qu’entre deux flashs successifs d’une même intensité, les photopigments
auraient possiblement le temps d’être régénérés à chaque changement d’intensité.
Selon cette hypothèse, les tracés d’ERG devraient être quasiment normaux si le
protocole ne comprend qu’un seul flash par intensité comme cela a été le cas à
Clermont-Ferrand. À l’inverse, lorsque les mesures consistent en une moyenne des
réponses obtenues suite à dix flashs d’une même intensité, des différences pourraient
apparaître chez les souris mutées. Cela permettrait éventuellement d’expliquer
pourquoi nous avons observé des différences à l’ENVA en 2012 mais pas à ClermontFerrand en 2014.
Malheureusement, le logiciel utilisé en 2012 ne permettait
d’enregistrer que la valeur moyenne des réponses. Ainsi, il ne nous a pas été possible
[158]
de contrôler les réponses obtenues pour chacun des dix flashs pris séparément, ce qui
aurait pu nous permettre de vérifier cette hypothèse. Il faudrait donc maintenant
réaliser deux séries d’ERG sur les mêmes souris, une avec un seul flash par intensité,
l’autre avec dix flashs par intensité sur une nouvelle version de logiciel permettant
d’obtenir les valeurs pour chaque flash.
Finalement, s’il s’avère que nos souris Hacd1-KO présentent bel et bien un
défaut de régénération de leurs photopigments, cela pourrait avoir deux origines.
Dans un premier temps, le cycle de régénération des photopigments implique les
photorécepteurs. Toutefois, en cas d’atteinte des photorécepteurs, nous aurions dû
observer des anomalies de l’onde a dès le premier flash. Les cellules de l’épithélium
pigmentaire sont le deuxième type cellulaire participant à la régénération des
photopigments. Notons de plus que ces cellules jouent aussi un rôle important dans la
survie des photorécepteurs. Une atteinte de l’épithélium pigmentaire pourrait donc
entraîner une atrophie rétinienne complète dans les formes les plus avancées, comme
celle observée chez deux des souris Hacd1-KO. Afin de vérifier cette hypothèse, il
serait intéressant de trouver un protocole permettant de tester spécifiquement le
fonctionnement de l’épithélium pigmentaire ou de tester la régénération des
photopigments, par dark adaptometry par exemple (Cf. paragraphe V sur les nouvelles
perspectives).
L’hypothèse d’une atteinte primaire de l’épithélium pigmentaire est
intéressante ici car elle permettrait d’expliquer pourquoi les souris mutées
présentaient une atteinte fonctionnelle des photorécepteurs, d’après les résultats de
l’étude préliminaire, sans que le gène ne s’exprime dans ce type cellulaire. Cependant,
il nous est pour le moment impossible de vérifier que le gène Hacd1 s’exprime dans
l’épithélium pigmentaire. En effet, comme son nom l’indique, les cellules de
l’épithélium pigmentaire sont très foncées ce qui rend le marquage de l’expression
d’un gène difficilement visualisable. En général, les études de l’épithélium pigmentaire
sont réalisées sur des souris albinos dont nous ne disposions pas.
[159]
2. Analyse structurale des rétines de souris
a. Analyse morphométrique : observation des clichés d’œil entier de
coupes colorées à l’Hémalun-Éosine-Safran
i.
Résultats de l’analyse morphométrique globale
Les résultats de l’observation des clichés d’œil entier sont synthétisés dans le
Tableau 10. En tout, les analyses morphométriques globales ont été réalisées sur 53
coupes de rétine de souris, 44 préparées avec une coloration HES et 9 préparées en IF.
En effet, la structure histologique globale de ces dernières rétines pouvait être
appréciée grâce au marquage des noyaux par le DAPI. Seules les coupes colorées en
HES ont servi par la suite aux analyses morphométriques fines. Finalement, faute de
temps, tous les clichés n’ont pas pu être analysés finement pour cette thèse.
Par ailleurs, sur l’ensemble de ces coupes de rétines, huit ont été éliminées de
l’étude en raison d’artéfacts (critères d’exclusion décrits dans la partie matériel et
méthodes). Parmi ces huit souris éliminées, sept faisaient partie du lot C sur lequel
nous avons tenté de placer un repère en suturant un fil en région nasale de la
conjonctive bulbaire. D’autre part, quatre étaient des souris sauvages, deux des souris
Hacd1-KO présentant une atrophie complète à l’examen du fond d’œil et deux des
souris hétérozygotes.
[160]
Tableau 10 : Observation des clichés d’œil entier et recherche d'anomalie
majeure
Absence d’anomalie majeure
Atrophie rétinienne
Total
Souris +/+
12
1
13
Souris +/-
13
0
13
Souris -/-
15
3
18
Total
40
4
44
Souris contrôles
Souris Hacd1-KO
96%
83%
17%
4%
Absence d’anomalie majeure
Atrophie rétinienne
On retiendra en particulier que 20% des souris Hacd1-KO présentaient une
atrophie rétinienne marquée contre seulement 4% des souris contrôles. D’après le
test de Fisher, cette différence n’est pas significative (p = 0,29). Toutefois, étant donné
la faible
incidence
des
signes
d’atrophie
objectivables
lors
de
l’analyse
morphométrique globale ainsi que les différences significatives observées lors des
analyses du fond d’œil, il se peut que notre échantillon ait été trop petit et que nous
ayions donc manqué de puissance statistique pour de révéler une différence réelle.
Notons, de plus, que sur les cinq souris présentant une atrophie marquée à l’examen
du fond d’œil, deux ont été éliminées de l’étude histologique en raison d’un artéfact et
les trois autres ont bien présenté une atrophie complète avec disparition de la couche
des photorécepteurs à l’analyse histologique.
[161]
ii.
Discussion sur la pertinence des critères de distinction entre artéfacts et
lésions réelles
Afin de différencier les artéfacts des véritables lésions lors des analyses
histologiques, nous avons considéré, sur les conseils d’un spécialiste en anatomie
pathologique, que l’aspect plissé des rétines devait être artéfactuel alors que
l’amincissement homogène voire la disparition d’une couche cellulaire de la rétine
devait être considérée comme une lésion. A posteriori, ces critères nous semblent
pertinents étant donnés que seuls des yeux qui présentaient un risque plus important
d’avoir été percés suite au positionnement d’un fil de propylène ont ainsi été éliminés
de l’étude. De plus, l’aspect plissé de la rétine était souvent associé à une disparition
des chambres antérieure et postérieure avec le cristallin qui occupait l’ensemble du
globe oculaire. Cette observation semble être un élément en faveur d’une origine
artéfactuelle car il serait possible d’expliquer cette anomalie si on considère que l’œil
a été percé. En effet, l’application d’une surpression sur un œil percé peut entraîner la
sortie du contenu des chambres antérieures et postérieures. Les parois du globe
oculaire se retrouveraient alors accolées à la structure solide du cristallin et les
chambres ne seraient plus visibles. De plus, du matériel rétinien a été retrouvé en
dehors de l’œil sur l’une des coupes. À l’inverse, la disparition de la couche des
photorécepteurs est une lésion histologique fréquemment rencontrée en cas de
dégénérescence rétinienne. De plus, cette anomalie n’a été observée que chez des
souris présentant une atrophie rétinienne marquée à l’examen du fond d’œil. Il semble
donc justifié de considérer cette anomalie comme étant une lésion et non un artéfact.
[162]
b. Analyse morphométrique fine des coupes colorées à l’HémalunÉosine-Safran
i.
Résultats de l’analyse morphométrique fine
Les données obtenues dans le cadre des analyses plus poussées de la structure
rétinienne au grossissement 20 et 40 n’ont pu être testées statistiquement faute de
données analysées. En effet, seules une dizaine de coupes ont pu être analysées dans
suivant le protocole décrit dans le paragraphe II dans les temps impartis. La Figure 33
illustre la comparaison des six paramètres morphométriques nous paraissant les plus
prometteurs au vu de la bibliographie. Aucune différence notable ne semble ressortir
entre les souris de génotype différent. Notons toutefois que ces graphiques ont été
réalisés à partir des données obtenues chez 9 souris (2 mutantes, 2 sauvages et 5
hétérozygotes). L’interprétation des clichés en double aveugle explique la
surreprésentation des souris hétérozygotes sachant que seule la moitié des clichés ont
pu être exploités à ce jour.
La seule impression qui ressort, à ce stade, de l’étude morphométrique fine
concerne la couche plexiforme externe. En effet, cette couche semblait parfois d’aspect
différent, avec des noyaux mal situés, chez les souris Hacd1-KO. Cette remarque
découle d’une impression subjective de l’examinateur, elle nécessite donc d’être
confirmer par une analyse quantitative avant de pouvoir conclure à ce sujet. Notons
que cette observation avait été réalisée avant que l’examinateur ne prenne
connaissance des études morphométriques réalisées chez les souris mutantes Elovl4.
Or ces souris présentent une désorganisation de la couche plexiforme externe.
[163]
Figure 33 : Comparaison des différents paramètres évalués lors de l'analyse
morphométrique fine chez les souris Hacd1-KO (mutantes), sauvages et hétérozygotes.
(Effectif = 9)
[164]
ii.
Aspect technique
Une des difficultés techniques majeures rencontrées dans cette étude a été de
déterminer la limite entre couches nucléaires et couches plexiformes. En effet, les
limites entre les couches rétiniennes ne sont pas toujours nettes et il était compliqué
de trouver un critère applicable à tous les clichés, permettant de dire si les noyaux
observés se trouvaient dans une couche nucléaire ou dans une couche plexiforme. Au
final, la limite a été fixée subjectivement par l’expérimentateur et, afin de ne pas
entraîner de biais de classement différentiel, les mesures étaient réalisées à l’aveugle
par un seul manipulateur. Ainsi, cette incertitude serait à l’origine d’un biais de
classement non différentiel pouvant provoquer une sous-estimation ou sur-estimation
globale de la fréquence de malposition des noyaux. Elle ne devrait toutefois pas avoir
de conséquence sur la différence possiblement observée entre les souris Hacd1-KO et
les souris contrôles.
Par ailleurs, l’utilisation de la fonction « grid » présentait deux avantages : cela
permettait de définir parfaitement et de manière reproductible la taille de la zone de
décompte et cela permettait de randomiser l’emplacement des zones de mesures.
c. Bilan concernant les analyses morphométriques :
Les analyses morphométriques globales et fines n’ont pas permis de mettre en
évidence d’anomalie notable dans les rétines des souris Hacd1-KO. Toutefois,
l’absence d’anomalie à cette échelle est à relativiser au vu des résultats des dernières
études concernant Elovl4. En effet, l’étude des souris Elovl4-cKO montrait un
dysfonctionnement des bâtonnets et des cellules bipolaires qui n’étaient pas associés
à des remaniements structuraux globaux observables à l’analyse histologique
(Bennett et al., 2014a; Harkewicz et al., 2012). Seules des anomalies structurales fines
avaient été mises en évidence par des techniques d’IF et de MET ; nous en discuterons
dans les paragraphes suivants.
[165]
Dégénérescence rétinienne liée à la mutation du gène Hacd1 ou liée à l’âge
Malgré l’absence de significativité, 20% des souris Hacd1-KO ont présenté des signes
de dégénérescence rétinienne avancée lors des analyses morphométriques globales
contre 4% chez les souris contrôles. De plus, d’après l’examen ophtalmologique d’œil,
les souris Hacd1-KO présenteraient des lésions du fond d’œil compatibles avec une
dégénérescence rétinienne significativement plus fréquemment que les souris
contrôles. Il nous semble important de se demander ici si les dégénérescences
observées chez nos Hacd1-KO sont bel et bien une conséquence de la mutation du
gène Hacd1 ou s’il ne s’agirait pas d’une forme de dégénérescence rétinienne autre
telle que la dégénérescence liée à l’âge, par exemple. En effet, la dégénérescence liée à
l’âge est une affection fréquemment rencontrée chez les souris de laboratoire.
L’observation de dégénérescence rétinienne liée à l’âge chez nos souris ne peut
pas être écartée dans un premier temps car nous avons choisi d’étudier des souris
âgées pour cette étude. De plus, lors de l’observation des fonds d’œil, le Dr Chahory
avait observé chez quelques souris contrôles une forme d’atrophie rétinienne
particulière, avec une nette diminution du calibre des vaisseaux associé à un fond
d’œil plus foncé, qui serait évocateur, selon elle, d’une dégénérescence liée à l’âge.
Chez les souris Hacd1-KO présentant une perte des vaisseaux, le fond d’œil était au
contraire plus pâle, signe caractéristique d’une atteinte de l’épithélium pigmentaire
Afin de confirmer que nous avons ici une forme de dégénérescence spécifique
liée à la mutation du gène Hacd1, il serait intéressant de trouver des critères
histologiques permettant de faire la différence entre la dégénérescence liée à l’âge et
la dégénérescence induite par la mutation du gène Hacd1.
La réalisation de fond d’œil systématiques, à partir de l’âge d’un an, permettrait
également d’accroître l’effectif étudié et de déterminer l’âge d’apparition de cette
forme de dégénérescence, le cas échéant.
[166]
d. Observation
des
rétines
au
microscope
électronique
à
transmission
i.
Atlas de cliché de microscopie électronique à transmission
L’observation des rétines de trois souris Hacd1-KO et trois souris sauvages par
microscope électronique à transmission (MET) a permis de réaliser un atlas de photos
illustrant les différents segments des photorécepteurs et l’épithélium pigmentaire
(Figure 34 à Figure 37).
Figure 34 : Aspect de l'épithélium pigmentaire en microscopie électronique à
transmission.
Clichés de l’épithélium pigmentaire chez trois souris contrôles (A, B, C) et trois souris
Hacd1-KO (D, E, F) (80kV). Absence d’anomalie de structure évidente.
Barre d’échelle : 2μm.
[167]
Figure 35 : Aspect de la limite entre la couche nucléaire externe et le segment interne
des photorécepteurs en microscopie électronique à transmission.
Souris contrôles : clichés A, B, C. Souris Hacd1-KO clichés D, E, F (80kVolts). Les noyaux
des photorécepteurs sont en bas et le segment interne des photorécepteurs en haut.
Absence d’anomalie de structure évidente.
Barre d’échelle : 5μm
Aucune anomalie de structure fine ne nous a paru évidente lors de
l’observation des rétines au MET. Toutefois des doutes subsistaient quant à :
-
La présence de possibles phagosomes ou lysosomes de taille très importante à
la jonction de l’épithélium pigmentaire et des segments externes des
photorécepteurs. Ce type de structure a été observé sur une rétine de souris
mutante, (Figure 37 B). Des structures similaires mais moins imposantes ont
aussi été notées à deux autres reprises, chez une souris mutante et une souris
contrôle (respectivement Figure 37 C et A).
[168]
-
Une possible désorganisation des membranes des segments externes des
photorécepteurs chez les souris Hacd1-KO. Cette observation est toutefois
difficile à confirmer en raison des variations dans l’angle de découpe de la
rétine (Figure 37 D à G).
Figure 36 : Aspect des segments externes des photorécepteurs en microscopie
électronique à transmission.
Souris contrôles : clichés A, B, C. Souris Hacd1-KO : clichés D, E, F. (80kV). Les segments
externes des photorécepteurs sont en haut, l’épithélium pigmentaire figure en bas des
clichés B, C et D. Absence d’anomalie de structure évidente.
Barre d’échelle : 2μm.
Notons que le nom des souris est conservé pour les Figures 32 à 34, c'est-à-dire que les trois
clichés A - Figures 32, 33 et 34 - proviennent de la rétine d’une même souris.
[169]
ii.
Discussion – aspects techniques
En raison du coût de la microscopie électronique à transmission et de la
lourdeur des prises de cliché, le nombre de souris utilisées pour l’étude est
relativement faible et ne permet pas de conclure sur d’éventuelles anomalies.
Toutefois, l’objectif était ici de déterminer s’il y avait une anomalie évidente justifiant
de lancer une étude MET plus poussée sur nos souris.
Par ailleurs, les observations de microscopie électronique nécessitent une
certaine expérience afin de faire la différence entre des anomalies réelles ou des
variations physiologiques, liées à l’âge par exemple, ou encore des artéfacts de
montage. Les clichés pris lors de ces observations ont été visualisés rapidement par
une spécialiste en MET du laboratoire d’imagerie de Clermont-Ferrand afin de
s’assurer qu’il n’y avait pas d’anomalies évidentes de nos rétines. Il nous est donc
possible d’affirmer que les rétines ne présentaient pas d’anomalie structurale majeure
des segments externes des photorécepteurs ni de l’épithélium pigmentaire. Toutefois,
au vu des études sur les souris Elovl4-cKO qui présentaient une désorganisation des
synapses des bâtonnets, il serait intéressant de reprendre les clichés afin d’analyser
plus particulièrement :
-
le nombre et l’organisation des terminaisons synaptiques,
-
le nombre de noyaux de bâtonnet en apoptose,
-
la présence ou non de gouttelettes lipidiques et de gouttelettes de lipofuscine
dans l’épithélium pigmentaire.
À ce jour, nous n’avons pas eu l’occasion d’organiser une relecture plus précise de nos
clichés par un spécialiste en MET dans cette optique. S’il s’avérait par la suite que l’un
de ces paramètres semble anormal, il sera éventuellement intéressant d’observer un
plus grand nombre de souris pour compléter l’étude.
[170]
Figure 37 : Possibles anomalies observées en microscopie électronique à transmission sur les rétines des souris Hacd1-KO
Souris Hacd1-KO : clichés B, C, F et G. Souris contrôles : clichés A, D et E. (80kV).
Sur la première ligne, clichés A, B et C : les astérisques indiquent de possibles phagosomes ou lysosomes. Ces structures
sont localisées au niveau des segments externes de photorécepteurs. Notons que la structure observée sur le cliché B, soit
chez une souris mutante, est particulièrement volumineuse et semble déformer légèrement l’épithélium pigmentaire.
La seconde ligne, cliché D à G, illustre des zones des segments externes de photorécepteurs nous semblant
particulièrement désorganisées chez une souris contrôle (D et E) et une souris mutante (F et G). Dans le cas de la souris
contrôle (D et E) il peut s’agir d’un artéfact de montage mais pour la souris Hacd1-KO (G) l’aspect nous semble plutôt
évocateur d’une lésion.
Barres d’échelle : 2μm.
[171]
e. Analyse structurale par immunofluorescence
i.
Résultats des différents marquages par immunofluorescence
Une illustration des différents marquages obtenus par IF, en dehors des
marquages β-Gal, est présentée Figure 38. Les marquages CtBP, Neun, PKCα et GFAP
semblaient avoir bien fonctionné et donnaient de beaux résultats. Une comparaison
rapide des résultats obtenus avec ces marquages chez les souris contrôles et Hacd1KO n’a pas permis de mettre en évidence des différences notables. Les marquages
CTBP2 ont permis de visualiser les synapses à ruban au niveau des couches
plexiformes interne et externe (Figure 38, A et C). Les marquages Neun, PKC et GFAP
nous semblaient intéressants à ce stade afin de localiser respectivement les cellules
ganglionnaires, bipolaires, et gliales sur les coupes de rétine. Ces anticorps pourraient
donc servir, à terme, à la réalisation de doubles marquages avec l’anticorps anti-β-Gal
dans l’objectif de caractériser avec plus de précision les cellules exprimant le gène
Hacd1. Notons que, n’ayant pas réussi à obtenir un marquage anti-β-Gal satisfaisant
pour le moment, ces doubles marquages devront être envisagés dans une prochaine
étude.
Les IF réalisées avec les anticorps anti-rhodopsine, marqueur des segments
externe des photorécepteurs, et de la nestine, marqueur des cellules gliales
dédifférenciées, n’ont pas été illustrés dans la Figure 38 en raison des difficultés
techniques rencontrées avec ces deux anticorps. En effet, le marquage de la
rhodopsine
semblait
difficilement
interprétable
en
raison
d’une
forte
autofluorescence des segments externes qui se superposait au signal. Ainsi, les coupes
réalisées en contrôle négatif (anticorps secondaire seul) apparaissaient aussi
marquées que les coupes ayant reçu les deux anticorps. Notons seulement que cette
autofluorescence était moins nette en rouge lointain qu’en vert. Le marquage
anti-nestine n’a quant à lui pas fonctionné malgré l’étape d’amplification. En effet,
aucune fluorescence n’a été notée lors de l’observation des diverses coupes.
[173]
ii.
Discussion - Comparaison des rétines suite aux marquages par
immunofluorescence
Malheureusement, faute de temps et de moyens, cette étude n’a pas pu aboutir.
Toutefois, ce début d’étude nous aura permis de tester différents protocoles, de
vérifier le fonctionnement des anticorps et d’avoir une idée du type de marquages
obtenus.
Les anticorps PKCα ainsi que CtBP avaient été testés précédemment par
l’équipe du Dr. Bennett sur les souris Elovl4-cKO (Bennett et al., 2014b). Ces deux
immuno-marquages auraient permis de montrer que les souris déficitaires en VLCFA
présentaient une désorganisation des synapses de la rétine. En particulier, l’auteur
avait observé un marquage spécifique des terminaisons synaptiques des cellules
bipolaires dans la couche nucléaire interne chez les souris Elovl4-cKO avec l’anticorps
PKCα et une possible désorganisation des couches rétiniennes plus internes avec
l’anticorps CtBP. Nous avons donc cherché à mettre en évidence des marquages
d’aspect similaires chez les souris Hacd1_KO. Cependant, faute de disponibilité de
l’anticorps PKCα et faute de temps, seuls six souris ont pu être marquées avec
l’anticorps CtBP et deux avec l’anticorps PKCα. Aucune différence de marquage ne
nous a paru évidente entre les souris Hacd1-KO et les souris contrôles. Toutefois, il
serait très intéressant de renouveler l’étude sur un plus grand échantillon de souris
afin de pouvoir conclure.
L’absence totale de marquage avec l’anticorps anti-nestine peut être dû à un
problème au niveau de l’anticorps en lui-même ou à l’absence de cellules gliales
activées sur nos coupes. Par ailleurs, la nestine est un marqueur d’un processus
inflammatoire alors que la dégénérescence rétinienne met plutôt en jeu un
phénomène d’apoptose. Dans le cadre de notre étude, il serait plutôt intéressant de
développer des marqueurs d’apoptose par la suite.
[174]
Figure 38 : Marquages par immunofluorescence des rétines de souris Hacd1-KO
Lecture en lignes :
- première ligne (clichés A, B, C, D) : anticorps anti-CTBP2,
- deuxième ligne (clichés E, F, G, H) : anticorps anti-Neun,
- troisième ligne (clichés I, J, K) : anticorps anti-PKCα,
- quatrième ligne (clichés L, M , N, O) : anticorps anti-GFAP.
Lecture en colonnes :
- première colonne (clichés A, E, I, L) : souris contrôles, anticorps secondaire seul,
- deuxième colonne (clichés B, F, J, M) : souris contrôles, anticorps primaire et secondaire,
- troisième colonne (clichés C, G, N) : souris Hacd1-KO, anticorps secondaire seul,
- quatrième ligne (clichés D, H, K, O) : souris Hacd1-KO, anticorps primaire et secondaire.
L’astérisque indique les zones de marquage non spécifique ou de bruit de fond, la tête de
flèche indique les zones de marquage spécifique de l’anticorps primaire.
Échelle = 50 μm.
[175]
3. Étude de l’expression du gène Hacd1 dans la rétine de
Souris
a. Marquage
indirect
de
l’expression
du
gène
Hacd1
par
immunofluorescence
Dans un premier temps, nous avons réalisé les marquages anti-β-Gal à l’aide
d’un anticorps obtenu fourni par Abcam afin de pouvoir réaliser des doubles
marquages avec les marqueurs des cellules bipolaires ou ganglionnaires (voir la partie
précédente). N’ayant que peu de documentation sur cet anticorps nous avons
commencé par tester différentes concentrations d’anticorps primaire sur nos coupes
(1/50, 1/100, 1/200 et 1/400) après fixation par le formaldhéhyde à 4%. Au vu des
premiers résultats, nous avons choisi d’utiliser la concentration 1/200 pour la suite de
notre étude (Figure 39). Nous avons observé une forte variabilité du niveau de
marquage au sein des souris contrôles et au sein des souris Hacd1-KO. Par ailleurs, on
constate que les souris sauvages (Figure 39, A-C), présentaient un marquage
important, voire plus fort que les souris Hacd1-KO (Figure 39, D et E) alors même
qu’elles ne possédaient pas le transgène LacZ. Nos coupes présentaient donc un
marquage non spécifique très important dû à une mauvaise spécificité de l’anticorps
primaire utilisé avec ce protocole. De plus, le marquage observé lors des études
préliminaires en coloration X-Gal n’était pas retrouvé chez les souris Hacd1-KO
porteuses de 2 copies du transgène LacZ. Cet anticorps présentait donc une sensibilité
insuffisante avec ce protocole.
[176]
Figure 39 : Marquages par immunofluorescence de coupes de rétines par un anticorps
anti-β-Gal d'Abcam dilué au 1/200 sur coupes fixées en formaldéhyde à 4%.
A à C : rétines de souris contrôles traitées avec l’anticorps primaire et l’anticorps
secondaire. D et E : rétines de souris Hacd1-KO traitées avec l’anticorps primaire et
secondaire. F : rétine de souris Hacd1-KO traitée avec l’anticorps secondaire seul en
contrôle négatif. Échelle = 50μm.
Étant donné cette mauvaise spécificité de l’anticorps anti-β-Gal d’Abcam, nous
avons testé, dans un second temps, un anticorps anti-β-Gal produit par Cappel sur
coupes congelées en isopentane car le bruit de fond était nettement plus faible dans
ces conditions. Un marquage spécifique des cellules ganglionnaires et bipolaires a été
noté sur les rétines des souris Hacd1-KO, sous forme de points très lumineux, comme
l’illustre la Figure 40.
[177]
Figure 40 : Marquages par immunofluorescence de coupes de rétines, anticorps
anti-β-Gal de Cappel dilué au 1/500 sur coupe congelées.
A : rétine de souris sauvage, B : rétine de souris Hacd1-KO. Grossissement (x20).
Les astérisques indiquent les différentes couches nucléaires de la rétine : * couche
nucléaire externe (photorécepteurs), ** couche nucléaire interne (cellules bipolaires), ***
couche de cellules ganglionnaires.
Les têtes de flèches indiquent un marquage β-gal spécifique dans les couches des cellules
bipolaires et ganglionnaires.
Ce marquage indirect spécifique donnait un résultat similaire aux observations
réalisées par coloration X-Gal lors des études préliminaires. Malheureusement, faute
de temps suite aux difficultés techniques rencontrées lors de la mise en place de ces IF
β-Gal, nous n’avons pas pu réaliser les doubles marquages avec PKCα, Neun ou GFAP
pour préciser les cellules marquées. Nous n’avons donc pas pu identifier avec
précision la nature des cellules qui exprimaient le gène.
[178]
b. Marquage direct de l’expression de Hacd1 par hybridation in situ
i.
Hybridation in situ sur coupes congelées en isopentane
Les HIS ont été testées dans un premier temps sur coupes congelées. Toutefois,
malgré l’étape de séchage préalable d’1h30 sous hôte à la sortie du congélateur et
malgré l’étape de fixation initiale (PFA 4% pendant 20 min) la qualité des coupes
diminuait au fur et à mesure des nombreux lavages et la rétine n’était même plus
visible lors de l’observation finale des coupes.
Suite à ces échecs, nous avons décidé de tester un protocole d’HIS sur coupe
fixée en formaldéhyde à 4%. Ce type de fixation avait été écarté dans un premier
temps car la réalisation des HIS sur coupes fixées peut être à l’origine de marquages
plus faibles. En effet, la sonde peut avoir du mal à accéder aux ARNm suite aux
pontages créés par le formaldéhyde.
ii.
Hybridations in situ sur coupe fixées par formaldéhyde
Les hybridations in situ, HIS, sur coupe fixées en formaldéhyde ont été réalisées
sur des lames provenant des souris du lot B, souris femelles âgées d’environ 2 ans.
Les résultats obtenus sont synthétisés dans le Tableau 11 et la Figure 41. L’ensemble
illustre la grande variabilité des marquages directs de l’expression du gène Hacd1
obtenus avec le protocole retenu.
[179]
Tableau 11 : Synthèse des différents niveaux de marquages observés sur les rétines de
souris testées par hybridation in situ.
Pour chaque souris, deux coupes de rétine (coupe 1 et 2) ont été marquées dans les
mêmes conditions afin de tester la reproductivité du marquage. Les niveaux de
marquage ont été notés suivant la grille suivante : 0 marquage nul, + marquage
douteux, ++ marquage moyen, +++ marquage important. (Figure 39).
Les éléments indiqués en rouge et vert correspondent à des résultats surprenants
(marquages non spécifiques par la sonde sens en vert ; marquage des souris Hacd1-KO
ou absence de marquage des souris sauvages par la sonde antisens en rouge).
L’absence totale de marquage au niveau d’une des rétines de souris sauvage est
vraisemblablement due à une erreur de manipulation.
La sonde sens est de même nature que la sonde antisens mais, ne pouvant
s’hybrider aux ARNm de Hacd1, elle permettait d’évaluer le niveau d’hybridation non
spécifique de notre protocole. L’obtention dans certains cas d’un marquage douteux
ou moyen avec la sonde sens nécessitait de ne tenir compte que des marquages plus
forts avec la sonde antisens, c'est-à-dire les marquages importants (+++).
[180]
Figure 41 : Illustration de la grille de notation des différents niveaux de marquage
observés par hybridations in situ
Première ligne : grossissement 5, seconde ligne : grossissement 20.
Les clichés A et A’ illustrent le niveau de marquage nul, les clichés B et B’ celui de
marquage douteux, les clichés C et C’ celui de marquage moyen et finalement, les
clichés D et D’ celui de marquage important.
D’autre part, contrairement à la révélation du transgène LacZ par IF ou
coloration X-Gal, lors de la réalisation d’HIS, seules les souris sauvages, et non les
souris Hacd1-KO, devaient être marquées. En effet, la sonde ARN était choisie de
manière à ce qu’elle soit complémentaire de la séquence des ARNm de Hacd1. Nous
avons pourtant parfois observé un marquage moyen des rétines de souris Hacd1-KO
(Tableau 11).
[181]
Finalement, nous avons aussi parfois observé des marquages d’intensité
variable au sein d’une même coupe (Figure 42).
Dans tous les cas, le marquage observé comprenait les couches des cellules
bipolaires, des cellules ganglionnaires et des photorécepteurs. Toutefois, l’ensemble
des éléments soulignés précédemment signifie que notre protocole, avec cette
séquence de sonde spécifique, ne présentait pas une grande spécificité. Ainsi, même si
un marquage important (+++) a été observé uniquement avec la sonde antisens sur
une souris sauvage, il est nécessaire de considérer l’expression observée dans toutes
les couches rétiniennes avec beaucoup de prudence. Cette expérience s’avère
néanmoins indispensable à recommencer pour conclure quant à l’expression du gène
Hacd1 dans les photorécepteurs, notamment en changeant de sonde et peut-être en
utilisant des souris plus jeunes.
Figure 42: Différents niveaux de marquage observés sur une même coupe suite
à une hybridation in situ pour le gène Hacd1
Grossissement : x20
[182]
4. Analyse de la composition lipidique des rétines
Les analyses de la composition lipidique, qui ont été réalisées au Dean A. McGee
Eye Institute, nous ont permis de quantifier les phosphatidylcholines (PC), les
phosphatidylsérines et les phosphatidyléthanolamines retrouvées dans les rétines de
nos souris. Il s’agit là des trois espèces de phospholipides les plus abondantes dans la
rétine.
Les
phosphatidylcholines
sont
celles
qui
nous
intéressent
plus
particulièrement car c’est sous cette forme qu’on retrouve les VLC-PUFA de la rétine.
Dans un second temps, les phospholipides ont été séparés en fonction de la taille de
leurs chaînes carbonées et leurs pourcentages relatifs ont été calculés au sein de
chacune de ces espèces.
Ces analyses n’ont pas révélé de différences significatives entre les souris
Hacd1-KO, les souris sauvages ou les souris hétérozygotes. Seules les rétines de deux
souris Hacd1-KO présentaient des compositions lipidiques très différentes de
l’ensemble des autres souris comme l’illustre la Figures 41. En effet, elles étaient
dépourvues des acides gras les plus longs avec en particulier une absence totale de
VLC-PUFA, comme l’illustre la Figure 43. Il s’agissait là des deux seules souris du lot
ayant présenté des signes d’atrophie complète à l’analyse du fond d’œil, un ERG nul
pour les deux yeux et une disparition de la couche de photorécepteurs à l’analyse
histologique. Cette composition lipidique modifiée est donc à mettre en lien avec leur
absence de photorécepteurs dont les segments externes sont très enrichis en acides
gras à très longue chaîne.
Notons qu’en raison de la très faible quantité de méibum récolté, l’analyse de la
composition lipidique des glandes de Méibomius n’a finalement pas été réalisée.
[183]
Figure 43 : Composition relative en phosphatidylcholines des rétines des souris du lot E.
A. Comparaison de la composition en phosphatidylcholines des rétines de souris sauvages,
hétérozygotes et mutantes.
B. Détail de la comparaison en ce qui concerne les phosphatidylcholines constituées d’acides
gras polyinsaturés de plus de 28 carbones.
A
35,000
30,000
Moyenne des souris
homozygotes
sauvages
25,000
Moyenne des souris
hétérozygotes
20,000
15,000
Moyenne des souris
homozygotes
mutantes *
10,000
Moyenne des souris
homozygotes
mutantes à atrophie
complète
5,000
0,000
Différentes molécules de phosphatidylcholines quantifiés dans nos échantillons
3,500
B
3,000
2,500
Pourcentage
Pourcentage par rapport à la quantité totale de
Phosphatidylcholine mesurée dans nos échantillons
40,000
Légende
2,000
+/+ : souris sauvages
1,500
+/- : souris hétérozygotes
1,000
-/- : souris Hacd1-KO
0,500
Ε : quantité très faible
0,000
+/+
+/-
-/- -/- atrophie totale
[184]
iii.
Discussion concernant les aspects techniques de l’analyse lipidique
Au cours de cette étude nous avons rencontrées principalement deux difficultés
techniques. La première était liée à des difficultés de prélèvement, en particulier, en ce
qui concernait le méibum. En effet, cette étape était très longue, à raison d’environ
30 min par souris, et elle devait être réalisée avant le prélèvement des yeux. Il y avait
donc un risque relativement important que la qualité de la rétine se dégrade pendant
ce temps. Par ailleurs, nous n’avons réussi à prélever que de très faibles quantités de
méibum, insuffisantes pour réaliser les analyses de composition lipidique. Étant
données les lésions cornéennes observées chez souris Hacd1-KO (paragraphe III.1.)
ainsi que l’importance des VLC-FA dans le méibum, il serait tout de même utile de
pousser les investigations jusqu’à obtenir des informations sur la composition
lipidiques des glandes de Méibomius chez nos souris Hacd1-KO. Il serait toutefois
nécessaire de trouver ou mettre au point un protocole de prélèvement du méibum
plus facile.
La deuxième difficulté rencontrée concerne le manque de précision des
résultats des analyses de la composition lipidique des rétines de nos souris. En effet,
ces analyses n’ont pu nous fournir le détail par chaîne des acides gras constituant les
PC. Seuls le nombre total de carbones et le nombre global d’insaturations des
phospholipides étaient connus. Il était alors possible d’en déduire, dans un second
temps, la taille et le nombre d’insaturations des VLC-PUFA des PC car ceux-ci sont
couplés à du DHA (C22:6n3). Ainsi, par exemple, les molécules de PC 54:12 sont
forcément constituées d’un DHA (C22:6n3) et d’un VLC-FA (C32:6). Toutefois,
l’analyse du nombre d’insaturations ou de carbones des autres acides gras constituant
des phospholipides n’était pas possible. Cela est dommage car des études de la
fonction du gène Hacd1 ont montré que la synthèse des acides gras C18:1n7 et
C18:1n9 étaient augmentée avec l’expression du gène. Or notre étude a mis en
évidence un léger déficit en PS et PE 36:2 qui pourraient être constituées de deux
acides gras de ce type. Nous ne pouvons cependant pas l’affirmer à ce stade. Il serait
donc intéressant de renouveler l’analyse de la composition lipidique des rétines des
souris Hacd1-KO en utilisant une autre technique, analyse FAMES, afin d’obtenir la
composition en acides gras des phospholipides.
[185]
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
1. Bilan de nos quatre études
a. Bilan des analyses cliniques et fonctionnelles
Au cours de cette étude, nous avons mis en évidence que nos souris Hacd1-KO
étaient prédisposées au développement d’opacifications cornéennes ponctiformes
bilatérales. Cette observation était le résultat d’une découverte fortuite et notre
principale hypothèse est que ces opacifications seraient la conséquence d’une
modification de la composition lipidique des glandes de Méibomius. Suite à des
difficultés techniques, nous n’avons pas pu tester cette hypothèse. Il serait intéressant
de réaliser des colorations des cornées de nos souris par le Red Oil et de mettre au
point un protocole de prélèvement du méibum afin d’avancer dans notre étude.
Lors de l’observation des fonds d’œil, nous avons aussi pu montrer que nos
souris Hacd1-KO étaient prédisposées à une atrophie rétinienne modérée ou marquée.
De façon surprenante, ce résultat ne fut que partiellement confirmé à l’analyse
histologique fine et à l’ERG. En effet, les souris présentant des signes d’atrophie
rétinienne marquée à l’examen du fond d’œil avaient aussi des anomalies structurales
majeures à l’analyse histologique, disparition de la couche des photorécepteurs, et
leurs ERG étaient plats. Par contre, aucun phénotype intermédiaire n’a été identifié à
l’analyse histologique ou à l’ERG chez les souris présentant pourtant des signes
d’atrophie rétinienne modérée à l’examen du fond d’œil. S’il a déjà été montré lors de
l’étude de la mutation Elovl4 que les anomalies fonctionnelles ne sont pas toujours
associées à des analyses structurales, il semble néanmoins surprenant que des souris
présentant des signes d’atrophie rétinienne modérée ne présentent pas d’anomalie
ERG.
[187]
Finalement, au cours de notre étude d’électrorétinographie et contrairement à
ce qui avait été observé lors de l’analyse préliminaire, nous n’avons pas pu mettre en
évidence d’anomalie significative dans le fonctionnement de la rétine chez nos souris
Hacd1-KO. Compte tenu des différences relevées entre les deux protocoles employés
nous pouvons émettre quatre hypothèses pour expliquer cela :
-
Un apport accidentel d’acides gras dans l’alimentation de nos souris aurait
corrigé le phénotype chez les souris testées au cours de cette étude,
-
Les VLC-PUFA joueraient essentiellement un rôle dans la régénération des
photopigments qui n’aurait pas pu être mis en évidence ici en raison des plus
grands intervalles entre deux flashs lors de cette étude,
-
Les gènes Hacd2-4, présentant aussi un niveau d’expression non négligeable
dans la rétine, ils suffiraient à compenser au moins partiellement la perte de
fonction du gène Hacd1.
-
Il n’existe pas de réel phénotype chez nos souris et les anomalies détectées
précédemment étaient dues au hasard.
Il n’est actuellement pas possible de trancher entre ces différentes hypothèses, il
faudrait donc réaliser de nouveaux ERG sur un plus grand nombre de souris et si
possible à des âges différents pour une même souris afin d’augmenter notre puissance
statistique. Il serait aussi intéressant de tester certains protocoles plus spécialisés afin
de tester spécifiquement la régénération des photopigments ou le fonctionnement de
l’un des types cellulaires de la rétine.
Ainsi par exemple les ERG conventionnels permettent de tester le
fonctionnement des cellules bipolaires et des photorécepteurs mais pas celui des
cellules ganglionnaires. L’expression de Hacd1 étant très importante dans cette
dernière
couche
cellulaire,
il
serait
intéressant
d’étudier
également
leur
fonctionnement. Il existe des techniques très particulières permettant d’étudier le
fonctionnement des cellules ganglionnaires, telles que le pattern-électrorétinogramme
(p-ERG), mais celles-ci ne sont pour l’instant pas disponibles dans notre laboratoire ou
chez nos collaborateurs.
[188]
b. Bilan de l’analyse structurale des rétines
Contrairement à ce qui avait été observé à l’analyse du fond d’œil, les analyses
structurales globales des rétines de nos souris, n’ont pas permis de montrer que les
souris Hacd1-KO présentaient significativement plus de risque d’avoir une atrophie
rétinienne que les souris contrôles. Cependant, il se peut que nous ayons juste manqué
de puissance statistique afin de mettre en évidence un événement rare.
Par ailleurs, au vu des résultats des analyses structurales des rétines des souris
Elovl4-cKO, il semblerait intéressant d’approfondir l’analyse des terminaisons
synapses des photorécepteurs ainsi que celle de l’épithélium pigmentaire chez les
souris Hacd1-KO. En effet, cette étude ne permet pas de conclure à ce sujet pour le
moment.
c. Bilan de l’analyse de l’expression du gène Hacd1
Faute de temps et en raison de difficultés techniques rencontrées, nous n’avons
pas réussi à mettre au point les doubles marquages IF de l’expression de notre gène
d’intérêt. Cependant, les derniers résultats des HIS semblent confirmer le gène Hacd1
s’exprime dans la rétine au niveau des couches de cellules ganglionnaire et de la
couche nucléaire interne mais pas au niveau des photorécepteurs. Une étude à plus
large échelle et employant éventuellement des sondes plus spécifiques et plus
sensibles sera nécessaire afin de confirmer ce résultat en vu d’une publication.
d. Bilan des analyses lipidiques
Les analyses lipidiques n’ont pas révélé de différences significatives entre les
souris Hacd1-KO, les souris sauvages et les souris hétérozygotes. Seules les rétines de
deux souris Hacd1-KO présentaient des compositions lipidiques particulières
caractérisées par une absence totale de VLC-PUFA. Ces deux souris avaient par
[189]
ailleurs présentées des signes d’atrophie rétinienne complète à l’analyse du fond
d’œil, un ERG nul pour les deux yeux et une disparition de la couche de
photorécepteurs à l’analyse histologique. Comme pour les ERG et l’analyse
morphométrique fine, et contrairement à l’observation des fonds d’œil, aucun
phénotype intermédiaire n’a été observé. La réalisation d’une analyse lipidique
FAMES semble recommandée afin d’obtenir la composition précise en acides gras des
différents phospholipides.
2. Perspectives
Notre étude a permis de mieux comprendre le rôle du gène Hacd1 au niveau de
la rétine. Toutefois, nous en sommes encore au stade des hypothèses. Au vu de nos
nouveaux résultats, il semble intéressant de réaliser des expériences plus spécifiques
afin d’approfondir certains points. Voici quelques exemples d’études qu’il semblerait
judicieux de réaliser dans un futur proche.
a. Observation de la vascularisation rétinienne
L’observation des fonds d’œil dans notre étude a mis en évidence que de
nombreuses souris Hacd1-KO présentaient des anomalies de vascularisation
rétinienne évocatrices de dégénérescence rétinienne plus ou moins marquée. En effet,
61% des souris Hacd1-KO présentaient des vaisseaux de diamètre réduit voire une
disparition complète de la vascularisation. Cependant, les analyses morphométriques
fines et structurales réalisées pour le moment ne nous ont pas permis d’étudier la
vascularisation de la rétine de nos souris.
[190]
Il existe différents protocoles permettant d’étudier la vascularisation des
rétines avec plus de précision. Ces protocoles sont réalisables in vivo ou ex vivo.
Toutefois, ces manipulations nécessitent du matériel relativement coûteux, que nous
n’avons actuellement pas à notre disposition. Le protocole de montage des rétines à
plat permet quant à lui de réaliser une étude de la vascularisation des rétines après
prélèvement. Il serait intéressant de tester ce protocole sur nos souris afin de vérifier
nos observations cliniques.
b. Dosage de la rhodopsine
Afin de mieux comprendre d’où provient le défaut de fonctionnement des
photorécepteurs observé à l’ERG lors des études préliminaires, il serait intéressant de
chercher à doser la quantité de rhodopsine dans les rétines de nos souris. En effet, la
rhodopsine est un photopigment qui permet la réception du signal lumineux. Une
quantité insuffisante de rhodopsine pourrait être à l’origine de la réduction de l’onde a
observée à l’ERG dans l’étude préliminaire. Compte tenu du lien étroit entre
l’épithélium pigmentaire et le segment externe des photorécepteurs ainsi que de
l’atteinte systématique de l’épithélium pigmentaire chez les souris mutantes pour
Elovl4, ce dosage serait sûrement pertinent.
Un protocole de dosage de la rhodopsine après prélèvement des rétines nous a
été proposé par le laboratoire de biophysiques de Clermont-Ferrand. Il repose sur la
mesure de l’absorbance de la rhodopsine par spectrophotométrie. Toutefois, ce
protocole présente de nombreuses difficultés techniques. Par exemple, il nécessite de
réaliser l’ensemble des manipulations, dont le prélèvement des rétines, sous lumière
inactinique. De plus, lors d’un test préliminaire, nous ne sommes pas parvenus à doser
les protéines totales de nos échantillons pour cause d’interférence avec le tampon
utilisé.
La mise au point d’un nouveau protocole serait intéressant dans un futur
proche afin de compléter notre étude.
[191]
c. Dark adaptometry
La dark adaptometry est un protocole d’ERG permettant d’évaluer la capacité
d’un individu à s’adapter à la pénombre et plus particulièrement à retrouver une
bonne sensibilité visuelle dans l’obscurité (Geller, 2005). La durée de cette phase de
récupération, après une phase de saturation en lumière vive, serait directement
corrélée à la capacité de régénération des photopigments. Une récupération ralentie
témoignerait alors d’un dysfonctionnement soit de l’épithélium pigmentaire soit des
enzymes impliquées dans le cycle de régénération de la rhodopsine.
Concrètement, la phase de récupération après saturation des photopigments en
lumière vive a été évaluée chez le rat en déterminant l’intensité seuil du flash
lumineux permettant d’obtenir une onde b d’amplitude prédéfinie à l’ERG (Geller,
2005). Cette technique permettrait aussi de faire la différence entre le temps de
récupération des cônes d’abord, puis des bâtonnets.
Il semblerait très intéressant de tester ce protocole chez nos souris afin de
vérifier l’hypothèse selon laquelle les souris Hacd1-KO présenteraient une atteinte de
l’épithélium pigmentaire ayant pour conséquence un déficit de régénération des
photopigments. Un protocole utilisable sur nos souris a été décrit par (Mata et al.,
2001).
[192]
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Yaw-Jong, J., 2012. Eye and Orbit. In : StudyBlue, Session 1 [en ligne].
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BERTRAND-MICHEL J, et al. Ablation of the very-long-chain fatty acid elongase
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ZADRAVEC D, TVRDIK P, GUILLOU H, HASLAM R, KOBAYASHI T, NAPIER JA,
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prerequisite for male fertility and sperm maturation in mice. J. Lipid Res.. 2011, 52,
245‑255.
[199]
ANNEXE 1 : Protocole d’immunofluorescence sur
rétine
Ce protocole est un protocole d’immunofluorescence indirecte, c'est-à-dire qu’il
nécessite l’utilisation successive de deux anticorps. Le premier reconnait
spécifiquement la protéine d’intérêt. Le second est un anticorps dirigé contre
l'anticorps primaire. Ce deuxième anticorps est attaché à un fluorochrome visualisable
au microscope à fluorescence.
Étape 1 : Déparaffinage (durée : environ 1 heure)
Les lames superfrost+ étaient sorties du réfrigérateur et mises à sécher à température
ambiante pendant 10 min. Les coupes étaient ensuite déparaffinées suivant le
protocole décrit dans le Tableau 12 ci-dessous :
Tableau 12 : Protocole de déparaffinage
Sous-Étapes
Solvant
Temps
1 et 2
Xylène
2 x 15 minutes
3 et 4
Éthanol 100%
2 x 5 minutes
5
Éthanol 70%
10 minutes *
6
Éthanol 50%
5 minutes
7
PBS
5 minutes
* Commencer à préparer le démasquage : préchauffer le tampon citrate et préparer la chambre
humide (placer du papier absorbant humidifié au fond d’un présentoir à lame horizontal).
Remarque : Si le démasquage ne se faisait pas tout de suite, les lames étaient laissées
dans du PBS.
Étape 2 : Démasquage des sites (durée environ 1h10)
[201]
Préchauffer environ 1,5 L de tampon citrate 1 X au four à microondes, 10 min à 300 W.
Tampon citrate 10 X , pH6 (0,1 M) : Acide monohydraté 21 g , compléter à 1L. Ajuster à
pH 6
Placer les lames déparaffinées dans un panier et les plonger rapidement dans le
tampon citrate chaud. Réchauffer l’ensemble 20 min à 500 W. Laisser refroidir une
bonne demi-heure. Rincer les lames dans du PBS. Sécher les lames et entourer de
Dako Pen (référence : S2002 , Dako).
Étape 3 : Perméabilisation des membranes
Déposer par coupe environ 40 µl de Triton 100 X dilué à 0,3 % dans du PBS. Laisser
agir 5 min. Laver 2 x 5 min en PBS.
Étape 4 : Blocage des sites non spécifiques
Éponger avec un papier absorbant autour de la rétine. Déposer 40 μL par coupe de
Bovine Serum Albumin (BSA) diluée à 3% dans du PBS. Laisser 30 min à température
ambiante.
Étape 5 : Anticorps primaire (Anticorps I)
Éponger avec un papier absorbant autour de la rétine. Déposer 40 µl par coupe
d’anticorps dilué dans de la BSA 3%. Placer les lames à 4°C pendant la nuit en
chambre humide.
Étape 6 : Anticorps secondaire (Anticorps II)
Le lendemain matin : Récupérer les anticorps I et les conserver en ajoutant de l’azide
de sodium à 0,01%. Laver 2x 5 min dans du PBS.
[202]
L’ensemble des étapes suivantes étaient réalisées à l’obscurité afin de protéger les
fluorochromes. Éponger avec un papier absorbant autour de la rétine. Mettre 40 μL
par coupe d’anticorps secondaire dilué au 1/500 dans du PBS. Laisser 1h à
température ambiante, à l’obscurité. Laver 3x 5 min dans du PBS.
Remarque : certains anticorps primaires nécessitent une amplification. Pour cela,
utiliser des anticorps secondaires biotinylés dilués au 1/200 dans du PBS puis placer
40 μL par coupe de streptavidine diluée à 1/1000 dans du PBS. Laisser agir 30 min.
Étape 7 : Coloration des noyaux
Éponger avec un papier absorbant autour de la rétine. Déposer 40 µl de DAPI
(1mg/ml, 62248, Thermoscientific) dilué au 1/1000. Rincer 2x 5 min dans du PBS.
Étape 8 : Montage de la lame
Éponger avec un papier absorbant autour de la rétine. Mettre deux à trois gouttes de
Vectashield « fluorescent mounting medium » pour IF. Placer une lamelle et laisser
sécher. Placer du vernis à ongle sur les contours de la lamelle afin de l’étanchéifier et
ainsi limiter l’évaporation du milieu. Cela permet de conserver les lames plus
longtemps.
Dans l’attente de l’observation des lames au microscope à fluorescence, celles–ci
pouvaient être conservées à 4°C, à l’abri de la lumière. Toutefois, les observations
ainsi que les prises de clichés devaient réalisées sous une à deux semaine car le
marquage des fluorochromes s’atténue avec le temps ce qui aurait pu fausser nos
interprétations.
Témoins négatifs
[203]
Chaque lame comportait deux coupes sériées. La première coupe était mise en
contact successivement avec l’anticorps I puis l’anticorps II selon le protocole décrit
précédemment. La seconde coupe n’était quant à elle mise en contact qu’avec
l’anticorps II (lors de l’étape 5, de la BSA 3% était déposée à la place de l’anticorps I
sur la coupe). Ainsi, la fluorescence détectée sur cette seconde coupe mettait en
évidence le niveau de marquage non spécifique de l’anticorps secondaire ainsi que
l’autofluorescence liée au tissu en lui-même (figure ci-dessous).
Figure 44 : Marquage et témoin négatif lors d'immunofluorescence
[204]
ANNEXE 2 : Résumé des caractéristiques des anticorps utilisés pour les
marquages par immunofluorescences
Tableau 13 : Caractéristiques des différents anticorps utilisés.
Anticorps I
β-Gal
CtBP2
Rhodopsin
Marquage
β-Galactosidase
Synapses à ruban
Photorécepteurs
PKCα
Cellules bipolaires
NeuN
Cellules ganglionnaires
Nestin :
NS-1
Cellules gliales
dédifférenciés
GFAP
Cellules gliales
Fournisseur
Abcam
Ref : ab9361
Cappel
Ref : 55976
BD
transduction
Ref : 612044
Abcam
Ref : ab3267
Millipore
Ref :
DAM1530428
Abcam
Ref : ab104225
Hybridoma
bank
Ref : rat-401
Ventana
Ref : EP672Y
Espèce
Dilution Ac I
Amplification ?
Anticorps II
Dilution AcII
Poulet
1/200
Non
De chèvre
anti-poulet
1/500
Lapin
1/500
Non
Anti-lapin
1/500
Souris
(IgG1)
1/50
Non
Anti-souris
1/500
Souris
(IgG1)
1/2000
Non
Anti-souris
1/500
Souris
(IgG1)
1/50
Non
Anti-souris
1/500
Lapin
1/1200
Non
Souris
(IgG1)
1/50
Oui
Lapin
1/1000
Non
[205]
De chèvre
anti-lapin
Biotin
anti-souris
IgG1
De chèvre
anti-lapin hight
1/500
1/200
1/500
ANNEXE 3 : Synthèse des sondes d’hybridation in
situ par réaction de polymérisation en chaîne
Contenu d’un tube pour 1 PCR :
Contenu du Mix pour 1 PCR :
46 μL de Mix
5 μL de tampon 10X
+ 2 μL plasmide (ADNc) 5μg/μL
+ 1 μL de dNTP (nucléotides)
+ 1 μL d’amorce sens à 10μM
+ 0,4 μL de Taq polymérase
+ 1 μL d’amorce antisens à 10μM
+ 39,6 μL d’eau distillée
Total : 50 μL
Programmation de la machine à PCR utilisée :
Étape 1 : 2 min à 94°C – dénaturation initiale
Étape 2 : 30 s à 94°C – dénaturation
Étape 3 : 30 s à 54°C – hybridation
Étape 4 : 45 s à 72°C – élongation
Étape 5 : 2 min à 72°C – élongation finale
Étape 6 : maintien à 15°C
[206]
Répétition sur 30 cycles
ANNEXE 4 : Protocole d’hybridation in situ
Tableau 14 : Protocole d'hybridation in situ adapté aux rétines et mis au point pendant
la thèse à partir des recommandations du Dr Giorgia Egidy, laboratoire de génétique
fonctionnelle médicale, ENVA. Les abréviations sont définies à la fin du tableau.
Étape
Étape 1 : déparaffinage
Step 1 : toluène
Step 3 : réhydratation
Étape 2 : prétraitement
Step 1 : action PK
Step 2 : rinçage
Étape 3 : postfixation
Step 1 : fixation
Step 2 : rinçage
Étape 4 : Acétylation
Step 1 : acétylation
Step 2 : rinçage
Step 3 : Dako Pen
Step 4 : pré-hybridation
Étape 5 : hybridation
Step 1 : sondes
Step 2 : dépôt sondes
Step 3 : hybridation
Détails
Durée / remarques
Rincer les lames au toluène 2x15min
1h30
Préchauffer incubateur à
70°C
Éthanol 100% => 2x 5min
Éthanol 70% => 10 min
Éthanol 50% => 5min
PBS => 5 min
Traitement PK, 8 à 10 min RT
Concentration PK : 0,01 mg/ml dilué dans
PK buffer soit 0,5 µL de PK à 20 mg/ml
pour 1 mL de Tampon
Rincer PBS à RT 5min
15min
Préchauffer HB buffer
20min
Placer les lames dans du PFA 4% RT 10 min
Rincer 2x 5 min dans du PBS
Sous agitation, ajouter l’acide acétique
anhydre dans le tampon triéthanolamine
(à raison de 50 µl pour 20 mL).
Placer les lames 15 min dans la solution
obtenue
Rincer 3x 5 min en PBS
Encercler les lames avec du Dako Pen
Placer 100 uL de HB buffer préchauffé par
coupe et placer 1h à 70°C
Mélanger 200 ng de sonde/100 µL HB x
nombre de coupes (soit 2 µL de
sonde/100 µL HB actuellement)
Dénaturation : 5 min à 95°C puis vortex 5 s
Placer sur glace
Déposer 100 μL du mélange HB + sonde /
coupe
Recouvrir d’une lamelle stérile
Placer les lames dans une chambre humide
Étanchéifier avec parafilm
[207]
1h40
Nettoyer la chambre humide
avant de l’utiliser :
Rincer avec NaOH à 3M
Rincer avec SDS 1%
Chambre humide PBS
Préparer les sondes
30 min + Over night
Chambre humide : SSC 2X
Étape 6 : rinçage
post-hybridation
Step 1 : retrait lamelle
Step 2 : rinçage
Step 3 : RNAse A
Step 4 : rinçage
Étape 7 : Détection
Step 1 : buffer B1
Step 2 : blocage
Step 3 : anti-DiG
Étape 8 : révélation
Step 1 : Rinçage B1
Step 2 : Rinçage B1
Step 3 : incubation B3
Step 4 : NBT/BCIP
Step 5 : arrêter la
réaction
Step 6 : Cliché au
microscope apotome
3h
Préchauffer la solution de SSC 2X à 60-65°C
Placer les lames dedans pendant 15 min
Laisser les lamelles se décoller seules
Rincer dans un nouveau bain de SSC 2X à
65°C 30 min
Rincer 1 min dans du STE
Retirer le STE et incuber avec la ARNase A
(15 µg/mL dilué dans STE) 30 min à 37°C (à
plat)
Rincer 2x 5 min avec du SSC 2X
Rincer 2x 30 min avec du SSC 0,2X à 65°C
(à plat, 100 μL de SSC 0,2X par coupe)
Rincer avec SSC 2x 5 min à RT
Rinçage 30 min à RT avec B1
Δ Penser à diluer B1 qui est préparé au
10X et à ajouter le tween !!!
Placer 200 μL de solution de blocage
/coupe
Solution de blocage = Buffer B1 + 20%
sheep serum
Incuber 30 min à RT
Retirer la solution de blocage
Ajouter 300 μL de phosphatase alkaline +
l’anticorps anti DIG dilué au 1/2000 dans
B1 + 10% sheep serum
Recouvrir d’une lamelle, placer en
chambre humide à 4°C
Rincer les lames et retirer les lamelles dans
B1 pendant 10 min à RT
Nouveau rinçage avec B1 10 min à RT
Incuber avec B3 30 min à RT
Placer les lames horizontalement et
ajouter 400 μL de NBT/BCIP et recouvrir
d’une lamelle
Maintenir dans le noir à RT ou 4°C et
vérifier la coloration à 30 min, 1h, 3h et 6h
Placer les lames dans du PBST => laisser
10 min puis laver avec eau et monter en
aquatex
Prendre les clichés dans la journée ou le
lendemain au plus tard (garder la même
intensité lumineuse pour toutes les
coupes)
Ne pas laisser les lames
refroidir entre deux
Penser à baisser la T à 60°C
Préchauffer le SSC 0,2X pour
s4.
Faire cette étape dans une
autre salle pour ne pas
contaminer le plan de travail
Chambre humide en PBS (ne
pas utiliser la boite d’HIS mais
celle d’IF car on a mis de
l’ARNase en s3)
1h + Over night
Préparer solution de blocage
Buffer B1 + 20% sheep serum
Lancer le plus tard possible
50 min + 5h environ
Préparer B3 pour s3.
Durée approximative à RT : 5
à 6 heures
Légende du tableau 13
HB : Hybridization Buffer
[208]
NBT/BCIP : nitro-blue tetrazolium and 5bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate, colorant
ANNEXE 5 : Formulation des différents tampons
utilisés pour l’hybridation in situ
Tampons de base à préparer en avance
NaCl 5M 500 mL :
 146,1g de NaCl
 qsp 500 mL d’eau mQ
Diluer progressivement les 146,1g de NaCl dans 450 mL d’eau puis compléter jusqu’à 500 mL.
MgCl2 1M 100 mL
 20,33g de MgCl2.6H2O
 qsp 100 mL d’eau mQ
Diluer progressivement les 20,33g de poudre dans 80 mL d’eau puis ajuster à 100 mL.
Tris HCl 1M pH7,5 250 mL
 30.27g de Tris base
 13 mL environ d’HCl 37%
 qsp 250 mL eau mQ
Diluer sous agitation le Tris dans 150 mL d’eau, ajuster le pH à 7,5 en rajoutant
progressivement l’HCl puis compléter jusqu’à 250 mL avec l’eau.
EDTA pH8 250 mL
 46,5g d’EDTA.Na2.2H2O
 5g environ de NaOH
 qsp 250 mL eau mQ
Diluer sous agitation l’EDTA dans 150 mL d’eau, ajuster le pH à 8 en rajoutant
progressivement la soude puis compléter jusqu’à 250 mL avec l’eau.
SSC 20X 100 mL



17,5g NaCl
8.8g trisodium citrate
qsp 100 mL eau mQ
Vérifier que le pH est compris entre 7 et 7,5.
Légende :
qsp = « quantité suffisante pour », signifie que le soluté doit être ajouté à la solution
en proportion aussi importante que nécessaire afin d'atteindre la quantité requise
de produit final.
Exemple : qsp 100 mL d’eau compléter la solution jusqu’à atteintre 100mL avec de l’eau
Eau mQ, ou eau milliQ : eau purifiée répondant
[209]aux recommandations internationales
définissant une eau « ultrapure », type 1
Tampons spéciaux à préparer en avance
Protéinase K PRÉ-Buffer 100 mL
 Tris HCl 1M pH7,5 : 5 mL
 EDTA 0,5M : 1 mL
 qsp 100 mL eau mQ
∆ Penser à ajouter la Protéinase K avant de l’utiliser sur les coupes !!
HB Buffer 100 mL
 50 mL Formamide RNAse free
 25 mL SSC 20X
 10 mL Denhardts 50X
 5 mL sperme de hareng (10mg/mL)
 2,5 mL ARN T (10mg/mL)
 qsp 100mL eau mQ autoclavée
Remarques : à préparer sous hôte, à conserver à -20°C (ne pas autoclaver !).
STE Buffer 100 mL



10 mL NaCl 5M
2 mL Tris HCl 1M pH7,5
200 μL EDTA 0,5M pH8
Buffer B1 10X 200 mL
 100 mL d’eau mQ
 17,5g NaCl
 23,2g acide maléique
 33,5 mL NaOH 10N ou 16g de NaOH solide
Ajuster le pH à 7,5 (attention saut de pH autour de 6-7, pente très rapide)
Qsp à 200 mL avec de l’eau mQ.
Tampons spéciaux à préparer juste avant leur utilisation
Triéthanolamine Buffer pH 8, 250 mL
 3 mL triéthanolamine
 0,75 mL environ de HCl 37%
 qsp 250 mL eau mQ
Remarque concernant le prélévement du triéthanolamine : substance très visqueuse (aspirer
doucement puis bien rincer la pipette avec l’eau). Réaliser le mélange sous agitation ! Ajuster
le pH à 8 à l’aide de HCl.
FAM/SSC Tween 500 mL

250 mL Formamide 50%
[210]
 250 mL SSC 4X autoclavé
 0,5 mL Tween 20
Remarque : à préparer sous hôte et dans des falcons. Tween visqueux et bien autoclaver le SSC
avant !
Buffer B3 200 mL
 20 mL de Tris HCl pH=9,5
 100 mL de MgCl2 1M
 1 mL NaCl 5M
 100 µL Tween 20
qsp à 200 mL avec de l’eau mQ.
Solution à autoclaver en prévision des manipulations










Protéinase K pré-buffer
STE buffer
SSC 20x
SSC 2x
Buffer B1
Tris HCl pH 9,5 (possiblement 7,5 aussi)
MgCl2 50 mL
NaCl 5M 50 mL
Eau mQ => 1,5 L
PBS 1X => 1, 5 L
[211]
ANNEXE 6 : Protocole d’inclusion des rétines en vue
d’une observation au microscope électronique à
transmission
1. Fixation des rétines dans un mélange de glutaraldéhyde 2% + paraformaldéhyde
0.5% en tampon cacodylate de sodium 0.2M pH 7.4. Durée : 2 jours à 4°C.
2. Rinçage : 3x10 min tampon cacodylate de sodium 0.2M pH 7.4.
3. Post-fixation dans du tetroxyde d'osmium (OsO4) 1% en tampon cacodylate de
sodium 0.2M pH 7.4. Durée : 1h00 à température ambiante.
4. Rinçage : 3x10 min tampon cacodylate de sodium 0.2M pH 7.4 .
5. Déshydratation dans de l’éthanol 70% la nuit à 4°C.
6. Déshydratation (suite) et imprégnation en résine épon automatisée dans AMW
(Automate à micro-ondes) de Leica.
7. Inclusion dans résine épon.
8. Polymérisation, soit durcissement de la résine, pendant 2 jours à 60°C.
9. Coupe : réalisation de coupes ultra-fines 70nm (ultramicrotome Leica UC6).
10. Coloration contrastante Acétate d'Uranyl puis Citrate de Plomb.
11. Évaporation carbone (stabilise coupe sous faisceau d'électrons) (Evaporateur C
E6500).
[212]
ANNEXE 7 : Tableau de suivi des souris
Tableau 15: Suivi et caractéristiques des souris utilisées dans le cadre de cette thèse
Date de
naissance
05/12/2011
05/12/2011
18/12/2011
27/10/2011
05/12/2011
18/12/2011
14/12/2011
26/06/2012
31/05/2012
15/04/2012
15/04/2012
12/04/2012
19/07/2012
02/05/2012
02/05/2012
01/05/2013
05/07/2013
05/07/2013
13/08/2013
27/04/2013
05/07/2013
31/01/2013
31/01/2013
31/01/2013
28/04/2013
31/01/2013
31/01/2013
?
Date
Fixation œil
d'euthanasie
n°1
29/01/2014
Davidson
29/01/2014
Davidson
29/01/2014
Davidson
29/01/2014
Davidson
29/01/2014
Davidson
29/01/2014
Davidson
13/03/2014
PFA
17/06/2014
PFA (D)
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
17/06/2014
PFA
27/10/2014
Davidson
27/10/2014
Davidson
27/10/2014
Davidson
27/10/2014
Davidson
29/10/2014
Davidson
29/10/2014
Davidson
29/10/2014
Davidson
31/10/2014
Davidson
31/10/2014
Davidson
31/10/2014
Davidson
31/10/2014
Davidson
31/10/2014
Davidson
30/10/2014
PFA
Fixation œil
n°2
?
Davidson
?
?
?
Isopentane
PFA
/
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
Isopentane
Isopentane
Isopentane
isopentane
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
Isopentane
Lot
ID
Génotype
Sexe
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C bis
F4-81-205
F4-81-206
F4-75-215
F3-72-177
F4-81-207
F4-75-217
F2-146-201
F4-175-327
F4-174-291
F4-197-295
F4-197-297
F4-196-282
F5-307-315
F2-154-311
F2-154-310
F7-355-386
F8-390-398
F8-390-400
F8-366-408
F6-354-375
F8-390-399
F7-344-378
F7-344-383
F7-344-382
F7-360-390
F7-344-379
F7-344-380
F9-405-447
+/+
+/+/+
-/-/-/F/F
+/+
+/+
-/-/-/+/+
+/+
+/+
+/-/-/+/+/-/+/+
+/+
+/+
-/+/+
+/+
-/-
F
F
F
F
F
F
M
F
F
F
F
F
F
F
F
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
F
C bis
F8-412-438
+/+
F
?
30/10/2014
PFA
Isopentane
D
D
D
D
D
D
D
D
D
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
E
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F
F7-352-366
F7-350-371
F7-350-372
F6-317-351
F6-359-366
F6-359-367
F7-352-364
F6-316-348
F5-324-357
F8-366-402
F8-390-396
F8-366-405
F8-366-407
F6-356-379
F8-366-406
F7-360-391
F8-366-404
F7-360-388
F8-366-403
F8-390-394
F6-354-373
F8-390-397
F8-390-395
F6-356-380
F7-355-389
F6-354-374
F7-355-387
F7-379-396
F7-379-395
F8-366-409
F8-366-416
F8-366-415
F7-379-389
F7-379-391
F7-379-392
F7-374-403
F7-374-402
F7-379-3
F7-379-4
F7-379-394
F8-366-412
+/+/-/-/+/+
+/+
+/+/+/+/+
-/+/+/+
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+/+
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Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Davidson
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
Argon
/
/
/
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
PFA
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
/
/
/
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
Excalibur
[213]
Numéro
d’histologie
14-0122-62 A
14-0122-62 B
14-0122-62 C
14-0123-08 A
14-0123-08 B
14-0123-08 C
14-0871-00 C
14-0871-00 F
14-0871-00 G
14-0871-00 H
14-0871-00 I
14-0871-00 J
14-0871-00 K
14-0871-00 L
14-0871-00 M
14-1280-33 N
14-1280-33 O
14-1280-33 P
14-1280-33 Q
14-1280-33 R
14-1280-33 S
14-1280-33 T
14-1280-33 U
14-1280-33 V
14-1280-33 W
14-1280-33 X
14-1280-33 Y
14-1280-33 AA
14-1280-33 AB
Expérience
HES
HES / IF
HES
HES
HES
HES
IF
IF
IF
IF
IF
IF
IF
IF
HES
Exclue HES
X gal
HES,
HES
HES
HES
Exclue HES
Exclue HES
Exclue HES
HES
Exclue HES
Exclue HES
X-Gal, ISH
ISH
14-1374-30 AC
14-1374-30 AD
14-1374-30 AE
14-1374-30 AF
Cornée,
14-1374-30 AG Fond d'œil,
14-1374-30 AH
HES,
14-1374-30 AI
14-1374-30 AJ
14-1374-30 AK
14-1377-70 US1
14-1377-70 US2
14-1377-70 US3
14-1377-70 US4
14-1377-70 US5
Cornée,
14-1377-70 US6
14-1377-70 US7 Fond d'œil,
14-1377-70 US8 ERG, HES,
Analyse
14-1377-70 US9
14-1377-70 US10 lipidique
14-1377-70 US11
14-1377-70 US12
14-1377-70 US13
14-1377-70 US14
14-1377-70 US15
/
Cornée,
/
Fond d’œil
/
(exclues
/
ERG
/
ERG
/
ERG
/
ERG, MET
/
ERG, MET
/
ERG, MET
/
ERG
/
ERG
/
ERG
/
ERG, MET
/
ERG, MET
/
ERG, MET
/
ERG, MET
/
ERG
CARACTÉRISATION FONCTIONNELLE DU GÈNE
Hacd1 DANS LA RÉTINE CHEZ LA SOURIS
NOM et Prénom : DAVIDSON Marion
Résumé :
La mutation du gène HACD1, anciennement nommé PTPLA, est à l'origine d'une myopathie
chez le Chien, la Souris et l’Homme et il a été démontré que ce gène code une enzyme
participant au cycle d'élongation des acides gras à très longue chaîne. Ces derniers ne
représentent qu'une faible proportion des acides gras d'un organisme mais ils sont
surreprésentés dans la rétine où ils semblent jouer des rôles essentiels à la fonction visuelle
comme l’illustrent les études de la maladie de Stargardt 3. Cette maladie génétique liée à une
mutation du gène ELOVL4, intervenant dans la 1re étape de la synthèse des acides gras à très
longue chaîne, est à l’origine d’une dégénérescence maculaire juvénile chez l’Homme. Les
souris modèles pour cette maladie présentent des réductions de leurs réponses en
électrorétinographie et une atteinte de l’épithélium pigmentaire.
Une étude préliminaire menée par Myriam Taleb, Renaud Fouchère et Jordan Blondelle a
révélé que le gène Hacd1 était aussi exprimé dans la rétine et que sa mutation chez la Souris
s’accompagnait d’une réponse réduite en électrorétinographie, sans atteinte histologique
majeure. Dans cette nouvelle étude expérimentale, nous avons cherché à approfondir l’étude
de l'expression du gène Hacd1 dans la rétine ainsi que les conséquences phénotypiques de sa
mutation. Des examens du fond d'œil ont mis en évidence que les atrophies rétiniennes
modérées et complètes étaient plus fréquemment rencontrées parmi les souris mutées que
parmi les contrôles. Les atrophies complètes ont été confirmées à l’électrorétinographie et à
l'analyse histologique cependant aucun phénotype intermédiaire n'a été retrouvé à
l'électrorétinographie ni objectivée à l’analyse histologique fine, par microscopie optique ou
électronique chez les autres souris mutées. Les analyses lipidiques n’ont pas révélé de
différence majeure dans la composition rétinienne des souris mutantes. En revanche, les
souris mutées présentaient plus fréquemment des opacifications cornéennes ponctiformes
bilatérales qui pourraient être la conséquence d’une modification de la composition en acide
gras du film lipidique des larmes. Des hypothèses permettant d’expliquer ces différentes
observations sont discutées et nous proposons en perspective plusieurs approches afin de
mieux cerner le rôle potentiel du gène Hacd1 dans la rétine.
Mots clés : GÈNE, HACD1, MUTATION, ENZYME, LIPIDE, ACIDES GRAS, PHOTORÉCÉPTEURS,
RÉTINE, ÉPITHÉLIUM PIGMENTAIRE, ATROPHIE
ÉLECTRORÉTINOGRAPHIE, RONGEURS, SOURIS.
RÉTINIENNE,
Jury :
Président : Pr Eric SOUIED
Directeur : Dr Fanny PILOT-STORCK
Assesseur : Dr Sabine CHAHORY
[214]
ÉTUDE
EXPÉRIMENTALE,
FUNCTIONAL ASSESSMENT OF THE Hacd1 GENE
IN MOUSE RETINA
SURNAME: DAVIDSON
Given name: Marion
Summary
A mutation in the gene HACD1, previously named PTPLA, is responsible for a myopathy in
Dogs, Mice and Humans and it has been proven that this gene codes for an enzyme that takes
part in the very long chain fatty acids elongation cycle. Very long chain fatty acids only
represent a small portion of the total fatty acid components of an organism. However, they
concentrate in the retina where they seem to be critical to vision as the studies of the
Stargardt 3 disease suggest. Indeed, this genetic disease has been linked to a mutation in the
ELOVL4 gene that also takes part in this elongation cycle. This mutation is responsible for a
juvenile macular degeneration in Humans. The mouse model of this disease presents
decreased electroretinography responses to light stimuli and an abnormal retinal pigment
epithelium.
Preliminary studies conducted by Myriam Taleb, Renaud Fouchère and Jordan Blondelle
revealed that the Hacd1 gene is expressed in the retina as well and that its mutation also
induces decreased electroretinography responses without any major histological
modification. The goal of this new experimental study was to gather more information on the
expression of the gene Hacd1 in the retina and to investigate the phenotypic consequences of
its mutation. Fundus examination showed signs of partial and complete retinal atrophies in
the mutant mice. Complete retinal atrophies were confirmed in the both the
electroretinography and histology studies. However, no partial phenotype was found in either
the electroretinography study or the morphological study, based on optical and electronic
microscopy, in the other mutant mice. The lipid analysis did not reveal any major differences
in the lipid contents of the retinas of mutant mice. We did however notice serendipitously that
the mutant mice often showed bilateral punctiform opacifications of the cornea, which could
possibly be a consequence of a modification in the fatty acid formula of the tear film. Different
hypotheses put forward to explain these results are discussed and we have suggested a few
interesting new prospective studies that could help investigate the impact of the Hacd1 gene
within the retina.
Keywords: GENE, HACD1, MUTATION, ENZYME, LIPID, FATTY ACID, PHOTORECEPTOR, RETINA,
RETINAL
PIGMENT
EPITHELIUM,
ELECTRORETINOGRAPHY, RODENT, MICE.
RETINAL
Jury:
President: Pr. Eric SOUIED
Director: Dr. Fanny PILOT-STORCK
Assessor: Dr. Sabine CHAHORY
[215]
ATROPHY,
EXPERIMENTAL
STUDY,