THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Paul Sabatier Toulouse III Discipline ou spécialité : Innovation Pharmacologique Présentée et soutenue par: Carine Duffaut Le: 16 Juillet 2009 Les lymphocytes du tissu adipeux humain: caractérisation et rôles JURY Professeur Dominique Langin- Président Docteur Anne-Marie Cassard Doulcier- Rapporteur Docteur Annie Quignard-Boulangé- Rapporteur Dr Anne Bouloumié-Directeur de thèse Ecole doctorale Biologie Santé Biotechnologies Toulouse Unité de recherche INSERM U858 Directeur(s) de Thèse : Dr. Anne Bouloumié et Dr. Jean Galitzky Remerciements Je tiens à remercier les docteurs Anne-Marie Cassard Doulcié et Annie Quignard-Boulangé d’avoir accepté d’évaluer ce travail en tant que rapporteur. J’exprime également ma gratitude au professeur Dominique Langin pour avoir gentiment accepté de participer à ce jury de thèse. Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr Anne Bouloumié, qui m’a encadrée durant cette thèse tu m’as donnée ma chance et j’ai beaucoup appris sous ta direction. Merci pour m’avoir poussé dans mes retranchements parfois, pour m’avoir communiqué ton enthousiasme pour la science et pour avoir vécu d’aussi près les diverses rédactions d’article. Je remercie le Dr Jean Galitzky pour ses conseils techniques et scientifiques très avisés et constructifs, t’es un peu le mac gyver du labo , merci de m’avoir appris toutes tes petites techniques qu’on ne retrouve pas dans les protocoles officiels, merci pour ta gentillesse qui fait que personne ne t’en veut même si ta paillasse est une zone de non droit, pour ta sensibilité, et ton humour. Je tiens également à remercier Max Lafontan, tous les gens vous ayant côtoyé garderont sûrement la même impression que moi, le plaisir de la discussion, j’ai appris de chacune de nos discussions aussi bien en terme de sciences que de politique ou d’économie, que ce soit au comptoir d’un bistrot ou autour du thé de 17h, merci pour vos conseils toujours avisés mais aussi pour votre gentillesse. Je remercie également l’ex équipe de Jules, Alec pour sa disponibilité et son franc-parler, tu sais tout faire, on a partagé quasiment le même bureau en bordel puis l’amour du FACs, ta bonne humeur, je te laisse mes bébés lymphocytes en toute confiance je sais que tu en prendras grand soin. MarieAdeline pour m’avoir appris la lipolyse c’était pas gagné et m’avoir supportée ronchonner pendant toutes ces heures de manip mais aussi comment mettre un coup de casque à quelqu’un, comment tout dire avec le sourire, la recette du riz au lait au chocolat, parce que (presque) rien ne te met en colère, pour ta bonne humeur communicative et tes conseils. Michel (maintenant je n’oublierais jamais qui est Claude Bernard), Virginie pour son sens de l’écoute et sa sensibilité, Coralie pour ses conseils et son humour, Babeth qui nous manque parfois(!!), Marie pour les searchers girls, les apéros aux allées, les quiz (qu’on a jamais gagné) et autres délires doctoresques, Mathieu pour les pauses aux allées et les apéros, Pauline pour son aide à tous les instants, pour avoir été mes mains manquantes quand j’en ai eu besoin, pour les barquettes repas qu’on a partagé pendant 3ans, pour son coté schtroumph grognon (même pas vrai que j’ai le même!!). David qui est là depuis moins longtemps mais je te remercie pour ton écoute et ton soutien, dans cette dernière année tu as toujours été là pour moi dans les nombreux moments difficiles et tu as aussi été ma deuxième paire de bras même pour les isolements jusqu’à 23h… Auré pour la psychorigidité partagée (mais pourquoi personne ne comprend que les cônes se prennent de droite à gauche et de bas en haut ?!), les nombreuses pauses cafés au labo et les nombreuses pauses bières en dehors, pour les longues conversations sur la vie, la recherche, l’amour, les heures improbables à passer au labo et les lendemains difficiles. Je remercie aussi Mattéo pour les soirées, les week ends et les jours fériés passés au labo, ça semble presque normal quand on n’est pas tout seul à galérer. Sans oublier «ceux de Rangueil» qui étaient là au tout début de l’aventure: Estelle, Marion, Sandy, Carine, Anne, Charlotte, Sandra, Danièle, MarieFrançoise Philippe et Jean Sébastien. Je remercie mes parents qui m’ont toujours encouragée dans mes études et dans mon projet professionnel, vous m’avez permis d’arriver là où j’en suis et quoi qu’il se passe par la suite, cette expérience aura été bénéfique pour moi. Merci de m’avoir laissé piller votre frigo quand je n’avais pas le temps d’aller faire les courses, de m’avoir laissé squatter votre WE en amoureux à Venise parce que j’avais besoin de vacances, merci de m’avoir rendu la vie plus facile pendant ces 4 années de thèse et avant aussi. Je remercie ma sœur préférée (comment ça j’en ai qu’une?!) Céline qui est toujours là pour moi (même si ces quatre dernières années, moi je n’étais pas trop là), pour la mise en page de mon manuscrit jusqu’à 2h du mat parce qu’on fait toujours tout au dernier moment, pour tout ce qu’on partage depuis 26ans que les mots ne sauraient décrire, les marmots Juliette et Valentin, je suis pas la tante idéale vu que je peux jamais les garder mais promis quand vous serez grands je vous emmènerais voir des concerts!! Sans oublier Erik, parce que même si on est jamais d’accord on partage certains gouts musicaux, l’amour de ma sœur adorée, du vin et de la bonne nourriture… Je remercie les expatriés qui m’ont gardé une place dans leur cœur et qui étaient là malgré tout le jour J, c’est bon de savoir qu’après des années on a pas tant changé: les thésardes parisiennes Karima tu ne peux pas savoir à quel point les délires sur facebook m’ont fait me sentir moins seule pendant la rédaction, et claire parce le temps n’affaiblit pas notre amitié, parce que c’est toujours un plaisir de se voir même si ce n’est qu’une fois par an , parce qu’un certain WE de Mars 2008 toi et Manu vous m’avez un peu sauvée, t’es au bout de tes peines toi aussi alors quand est-ce qu’on repart en vacances ensemble ??? Florence, courage le bout du tunnel se rapproche, la vie te fait souvent prendre les choses du bon coté, faut faire pareil avec la thèse, merci pour les aprems shopping, les longues conversations téléphoniques à se plaindre, les grands débats sur grey’s anatomy et d’autres séries inavouables, Ludo, mon grand frère d’adoption parce qu’on se retrouve toujours avec plaisir même quand on se voit pas pendant des mois j’espère que ça durera, la grande Claire pour toutes ces soirées à écumer les bars toulousains, pour le super we qu’on a passé à Grenoble, pour les 11années d’amitié qui ne sauraient se résumer en quelques lignes, les pintades parisiennes Sophie et Agnès, le club loose c’est fini mais finalement les bancs de l’amphi et les soirées mojito sont pas si loins, merci d’être vous!! Je remercie aussi les présents tout au long du parcours Pierre, Mary, Niko, Marianne, Phillippe, Fred, Damien grâce à qui je ne suis pas la plus râleuse du groupe, pour m’avoir appris qu’on ne nait pas tous égaux devant l’alcool, pour toutes ces soirées chez Roger, toutes ces longues conversations sur le sens de la vie. Bien sur je remercie Fab toujours présent pour moi pendant ces trois dernières années , pour les soirées dvds, bières, pour les concerts où tu voulais pas aller, pour les WE à AX, pour m’avoir appris ce qu’était la peuf (ou puf ou puff bref…), pour m’avoir soutenue, épaulée sur la fin comme personne, pour avoir toujours cru en moi, et pour ta persévérance parce que tu savais que ça en valait la peine. A présent j’ai du temps à nous consacrer. Enfin je remercie Anne, on a vécu cette thèse ensemble depuis le début (même le concours!!) et un peu moins à la fin. On a englouti des km pour de sombres festivals, des concerts semi privés, des week ends ou des vacances à l’autre bout du monde, du marché st aubin au camden market, merci pour les fou rires et les crises de larmes, pour continuer à croire au prince charmant ;), pour penser que les pâtes et les pizzas sont le sommet de la gastronomie, pour m’avoir appris à apprécier les films nuls pour les filles, (je sais pas si je dois vraiment te remercier!), pour me supporter sur la plage (fait trop chaud et d’abord je m’ennuie), pour savoir à un de mes regards que ça ne va pas et parce que tout le monde cherche l’amitié parfaite…. Je remercie les beautés vulgaires pour le soutien musical (certes involontaire) apporté durant ces 3 années de labeur (fallait pas y aller….), la dame de la coccinelle pour ses brownies la cafet de l’hôpital qui a la bonne idée de faire des muffins en cas de coup dur, les bars de la ville rose qui ont épongé les mauvais coups et les bons! Greys anatomy et domino’s pizzas pour avoir agrémenté les soirées entre copines, Roger parce que le killarney est devenu comme une 2nde maison et le bikini qui fait revire la scène musicale à Toulouse, sans concerts je ne serais pas allée au bout! 2 Sommaire Liste des figures………………………………………………………………………………..6 Liste des tableaux………………………………………………………………………………7 Principales abréviations utilisées………………………………………………………………8 Avant-propos…………………………………………………………………………….…....10 Partie 1 Contexte scientifique et Problématique……………………………….…….12 I Le système immunitaire…………...…………………………………………………....13 I-1L’immunité innée………………………………………………………………...………14 I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs……………………………….15 I-1.1 a Les macrophages……………………………...……………….………17 I-1.1 b Les cellules dendritiques………………………………………………19 I-1.2 Les cellules cytotoxiques…………………………………………………….….20 I-1.2.a Les cellules Natural Killer (NK)……………………………………....20 I-1.2.b Les cellules NKT……………………………………………………...22 I-1.3 Les lymphocytes γδ..............................................................................................22 22 I-2 L’immunité adaptative………………………………………………………………….23 I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale…………………………………24 I-2.1.a Les lymphocytes B………………………………………………….…24 I-2.1.b Déroulement de la réponse B………………………………..………...25 I-2.2 La réponse immunitaire à médiation cellulaire ………………………………...26 I-2.1.a Les lymphocytes T…………………………………………………….26 I-2.2.b Induction de la réponse CD4+……………………………………...….28 I-2.2.c Induction de la réponse CD8+ ……………………………………..…..32 I-2.3 La mémoire immunitaire………………………………………………………..33 II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire…….………...37 II-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc ….………………………………...37 II-1.1 Le tissu adipeux blanc : organe de stockage énergétique………………………38 II-1.1 a La lipogenèse……….……………………….………………………..38 II-1.2 b La lipolyse……………………….……………………..…………….41 II-1.2. Le tissu adipeux blanc: Organe hétérogène…….…...….………………………….43 3 II-1.2 a L’adipocyte…………………………………………………………...43 II-1.2 b Les cellules progénitrices…………………...………………………..44 II-1.2 c L‘adipogenèse…………………………………..……………………44 II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire……..……………..46 II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique…………………………………...46 II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë…………………………………...47 II-2.1 a Modifications du métabolisme lipidique……………………………..47 II-2.1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline…………………………...48 III-1.2 Réponse de phase aiguë et anorexie…………………………………………...48 II 3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire………………………………....49 II-3.1 L’état nutritionnel altère la réponse immune……………………………….….49 II-3.1 a Effets des acides gras…………………………………………………49 II-3.1 b Malnutritions et infections………………………………………........53 II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux………………………………….....54 II-3.2 a L’obésité……………………………………………………………...54 II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité………....55 II-3.2 c L’insulinorésistance………………………………………………..…57 II-3.2 d La leptine ………………………………………………………….....58 II 4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire ….……..…..60 II-4.1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire….……...…60 II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux…………………….....……61 Les macrophages du tissu adipeux……………………………………………………61 Les lymphocytes du tissu adipeux………………………………………...………….63 Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux……………………………….……64 Objectifs …………………………………………………………………………..….65 Partie 2 Résultats……………………………………………………….……..66 I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le métabolisme et la différenciation adipocytaire……………….………………...67 4 Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity:CCL20 as an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators.......................................69 Discussion de l’article 1............................................................................................................70 II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux……………74 II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des lymphocytes T......74 II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité………………...79 II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu adipeux humain 83 III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles sur le développement de l’obésité……………………………….……………...87 Article 2: Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity........................................................................................................................87 Discussion de l’article 2:……………………….……………………………………………..88 Partie 3:Conclusion générale et perspectives……………………….……….….91 I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain…………….………………....92 II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain……………….……...92 III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain…….…….94 IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux……………………………………………95 V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain…………………………...……..96 VI Différences observées avec les modèles murins………………………………………..97 Partie 4: Références Bibliographiques…………………………..………….…100 Titre et résumé en anglais…………………………………………………………………114 5 Liste des Figures Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs Figure 2: La différenciation en macrophage Figure 3: Le procédé de missing self recognition Figure 4: La réponse B thymo-dépendante Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR Figure 6: La synapse immunologique Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain Figure 11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides gras alimentaires peut influencer la réponse immune Figure 12: Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et de l’immunité Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire Figure 15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux humain Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux par cytométrie en flux Figure 18: Expression d’IL-15 et IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants Figure 21: Expression d’IL-17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux Figure 22: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la différenciation des précurseurs adipocytaires Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les régulations des transcrits macrophagiques 6 Liste des Tableaux Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés Tableau 3: Classification des IMC selon l’OMS et définition de l’obésité Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées chez les sujets de race blanche (selon l’OMS) 7 Principales abréviations utilisées Ac Anticorps Ag Antigène AA Acide arachidonique AGL Acide gras libre AGNE Acide gras non estérifié BCR B Cell Receptor (récepteur des cellules B) CD Cluster de différenciation CMH Complexe majeur d’histocompatibilité CPA Cellules présentatrice d’antigène CTL Cytotoxic T lymphocyte (lymphocyte T cytotoxique) EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis (encéphalomyélite autoimmune expériementale) FAS Fatty acid synthase (synthase des acides gras) FSV Fraction stroma vasculaire HDL High density lipoprotein HLA Human leucocyte antigen (Antigène des leucocytes humains) Ig Immunoglobuline IL Interleukine IMC Indice de masse corporelle INFγ Interferon γ ITAM Immunoreceptor tyrosine based activation motif (motif d’activation à la base des tyrosines des immunorécepteurs) KIR Killer-cell Ig-like receptor (récepteur aux Ig des cellules tueuses) LDL Low density lipoprotein (lipoprotéine de faible densité) LHS Lipase hormono sensible LPL Lipoprotéine lipase LPS Lipopolysaccharide LT Leucotriène M-CSF Macrophage colony stimulating factor (facteur de croissance des macrophages) NK Natural Killer (tueur naturel) 8 NKT Natural Killer T cell PAMP Pathogen associated molecular pattern (motif moléculaire associé aux pathogènes) PG Prostaglandine PRR Pattern recognising receptor (récepteurs de reconnaissance des motifs moléculaires) TCR T cell receptor TG Triglycéride TGF Tumor growth factor TLR Toll like receptor TNFα Tumor necrosis factor Treg Lymphocyte T régulateur 9 Avant-propos Les systèmes métaboliques et immunitaires sont parmi les plus fondamentaux requis pour la survie. Plusieurs réponses métaboliques et immunitaires ou systèmes sensibles aux pathogènes et aux nutriments ont été conservés au cours de l’évolution à travers les espèces. De ce fait, la réponse immune et la régulation métabolique sont hautement intégrées et la fonction propre de chacune est dépendante de l’autre. Cette interface peut être vue comme un mécanisme central homéostatique dont la dysfonction peut créer un ensemble de désordres associés. La malnutrition est une cause de déficit immunitaire sévère. L’excès de masse grasse à l’origine de l’obésité va avoir des conséquences immunes en initiant une inflammation chronique systémique ainsi qu’un état inflammatoire de bas niveau au sein du tissu adipeux. Cet état inflammatoire est considéré pour être à l’origine des pathologies associées à l’obésité telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Dans l’introduction de ce manuscrit nous allons décrire le système immunitaire dans une première partie puis les interactions entre la fonction immune et le métabolisme. Elles seront abordées d’une part via les effets des cytokines et des hormones sécrétées et d’autre part, par des contacts directs entre les dépôts de tissu adipeux et les cellules immunitaires. L’essentiel de ce travail de thèse s’attache à caractériser les populations lymphocytaires présentes au sein du tissu adipeux, l’évolution de leur nombre et de leur phénotype lors de l’extension de la masse adipeuse, ainsi qu’avec la localisation anatomique des dépôts adipeux. Cette caractérisation repose sur des études globales de la fraction stroma vasculaire isolée de tissu adipeux de patients ayant eu recours à la chirurgie esthétique et de patients obèses morbides avant une chirurgie bariatrique. Nous avons ensuite tenté de comprendre les mécanismes de recrutement et/ou de prolifération de ces lymphocytes, ainsi 10 que leurs rôles potentiels sur le développement du tissu adipeux et sur le métabolisme des adipocytes. Nous évaluerons également leur incidence sur les autres populations cellulaires présentes au sein du tissu adipeux à l’aide d’expériences in vitro, par des méthodes originales de sélection des cellules à partir de la fraction stroma vasculaire du tissu adipeux. Enfin, l’emploi de modèles animaux nous a permis d’avoir une approche in vivo des rôles potentiels des lymphocytes dans le développement de l’obésité. Nous avons pu suivre l’évolution des cellules immunes dans le tissu adipeux au cours de l’installation de l’obésité et étudier l’impact d’une déficience en lymphocytes sur la prise de poids. 11 Partie 1 : Contexte scientifique et problématique 12 I Le système immunitaire Le système immunitaire est chargé de la défense de notre organisme contre les éléments extérieurs (virus, bactéries, parasites, champignons,..) et de l’élimination des substances étrangères à l’organisme. Il consiste en un ensemble de moyens (organes, tissus, cellules et molécules) permettant de répondre rapidement, de façon souvent spécifique et efficace aux agressions de nombreux pathogènes auxquels nous sommes confrontés. En effet, notre organisme est en contact permanent avec des pathogènes potentiels véhiculés par l’air, les aliments, les contacts avec les autres ou à l’occasion de blessures. Les voies d’entrées sont donc multiples: voie respiratoire, tractus digestif, peau, sang. Les épithéliums et les substances qu’ils secrètent tels que le lysozyme par exemple, limitent considérablement l’entrée de ces pathogènes. Toutefois, lorsque ces barrières physiques et chimiques sont franchies, un ensemble de mécanismes complémentaires se met en place: la réponse immunitaire. Il s’agit d’un système intégré mettant en jeu des cellules produites dans la moelle osseuse et circulant dans notre sang ou résidant dans nos tissus. Ce système est organisé en différentes lignes de défense que l’on peut définir comme l’immunité innée ou naturelle et l’immunité acquise ou adaptative (Tableau 1). Ces deux réponses vont agir en interaction permanente lors d’une réponse immunitaire et certaines cellules bien que définies dans un type de réponse, jouent souvent un rôle dans les deux types d’immunité. 13 Immunité innée: min, heures non spécifique Cellules présentatrices d’antigène (macrophages, cellules dendritiques) Immunité adaptative : jours spécifique IL10 Cytokines effectrices : IFNγ Activation lymphocytes T Production cytokines Cellules NK: Destruction des cellules Lymphocytes T CD8 cytotoxiques Destruction des cellules cibles Lymphocytes B sécrétion infectées Production IFNγ Cellules NKT : Lymphocytes Tγδ (cytotoxiques et Lymphocytes T CD4 auxiliaires: Cytokines régulatrices : IL4, d’Anticorps circulants cytokines IFNγ, TNFα, IL-4 immuno-régulateurs) Tableau 1: Principales cellules du système immunitaire I-1 L’immunité innée C’est la première ligne de défense de l’organisme et la plus rapide, qui est mise jeu en quelques heures. Constitutive, elle repose sur la dégradation non spécifique des pathogènes. En effet les cellules de l’immunité innée n’ont pas de récepteur spécifique de l’antigène, mais sont efficacement dirigées contre des motifs des pathogènes conservés au cours de l’évolution: les PAMPs (Pathogen Associated Molecular Pattern), tels que l’ADN viral, le LPS (lipopolysaccharide) ou encore le mannose (1). Les récepteurs à ces composants, les PRRs (Pattern Recognising Receptor) sont présents essentiellement à la surface des cellules 14 phagocytaires. Bien que non spécifique, la réponse innée présente l’avantage d’avoir à sa disposition de façon immédiate un grand nombre de cellules portant les PRRs et donc prêtes à combattre un pathogène et ce, sans l’avoir rencontré auparavant. D’une part, les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les neutrophiles sont les phagocytes les plus efficaces. D’autre part, les voies du complément ainsi que la lyse cellulaire par les cellules cytotoxiques vont intervenir également dans cette réponse. Tous ces composants vont agir d’une part en vue de la dégradation des pathogènes ou du non soi et d’autre part en stimulant les voies de la réponse immune adaptative. I-1.1 Les cellules présentatrices d’antigènes ou CPAs Les CPAs telles que les macrophages et les cellules dendritiques ont la capacité d’internaliser les pathogènes par endocytose, phagocytose ou pinocytose, de les dégrader puis d’en présenter les antigènes à leur surface et de sécréter une grande variété de médiateurs inflammatoires et de cytokines afin d’activer leurs partenaires cellulaires. La phagocytose est l’internalisation de larges particules qui va être permise par la détection de motifs PAMPs par les PRRs présents à la surface des CPAs. Au niveau du site d’ingestion, il va y avoir une polymérisation du réseau d’actine qui va permettre l’internalisation de la particule. Piégée dans la membrane plasmique, elle devient un phagosome qui va subir une succession de fusions et de fissions avant de fusionner avec un ou plusieurs lysozomes pour former un phagolysozome (2). Après dégradation, les peptides antigéniques de la particule phagocytée vont se coupler à des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité ou CMH de classe II et être dirigés à la surface de la membrane pour être présentés aux lymphocytes T auxiliaires. Les molécules du CMH désignent un ensemble de glycoprotéines membranaires de structure comparable dont la fonction consiste à présenter 15 des antigènes aux lymphocytes T. Les molécules du CMH humain sont désignées par le “système HLA (Human Leukocyte Antigen)”. Il en existe 2 grandes familles majeures: le CMH de classe I est présent à la surface de toutes nos cellules à l’exception des globules rouges et des sites immuno-privilégiés (neurones, œil,..). Une fois associées à des peptide antigéniques, ses molécules sont reconnues par les lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (3). le CMH de classe II est présent à la surface des CPAs, lorsqu’il s’associe à un peptide antigénique, il est reconnu par les lymphocytes T auxiliaires CD4+ (3). Les pathogènes intracellulaires se répliquant à l’intérieur des CPAs sont transportés dans le réticulum endoplasmique et couplés à des protéines du CMH I afin d’être présentés à des lymphocytes T cytotoxiques (4) (Figure1). Les CPAs ayant ingéré un pathogène sur un site d’infection, s’activent et sont alors transportées par la lymphe afin de présenter les antigènes aux lymphocytes naïfs circulants dans les Voie endogène lymphoïdes secondaires. Voie exogène Pathogène extracellulaire Protéines virales Présentation des antigènes aux lymphocytes cytotoxiques organes Virus Phagosome Cross présentation? Noyau Réticulum endoplasmique CMH de classe I CMH de classe II Présentation des antigènes aux lymphocytes auxiliaires TAP Protéasome Figure 1: Présentation des pathogènes intra et extra cellulaires par les CPAs d’après Roy et al.(4) 16 I-1.1 a Les macrophages Les macrophages identifiés par le marqueur CD14 sont des cellules issues de la lignée myéloïde. La stimulation des précurseurs macrophagiques par M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor) et GM-CSF (Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) va les conduire à se différencier en monocytes. Ces monocytes circulants vont, en réponse à des stimuli inflammatoires, quitter la circulation et migrer vers les tissus, où ils acquièrent les propriétés des macrophages. Les monocytes ne sont pas une population homogène, ils peuvent être classés en deux types de populations : les monocytes inflammatoires d’une part identifiés par les marquages CD14+ CD16- chez l’homme et Gr1+ CX3CR1 (récepteur aux chimiokines CX3C de type 1 ou Ly6) faiblement positif chez la souris, qui peuvent se différencier en cellules dendritiques inflammatoires et repeupler les compartiments cellulaires de macrophages résidents (5). D’autre part, les monocytes appelés « résidents » (CD14+ CD16+ chez l’homme et Gr1- CX3CR1+ chez la souris) qui patrouillent dans les vaisseaux sanguins et vont permettre l’invasion rapide des tissus en cas de dommages ou d’inflammation (6). Dans les tissus, deux grands types de macrophages existent (Figure 2). Les macrophages résidents se retrouvent dans le foie (cellules de Kupffer), dans la peau (cellules de Langherans) et dans les conjonctifs associés au tractus digestif entre autres. Le phénotype de ces cellules reste mal défini mais semble être très dépendant du tissu et du microenvironnement dans lequel elles résident. Les macrophages résidents cessent de proliférer mais leur synthèse d’ARNm et de protéines est très active (7). Les macrophages recrutés au cours d’une inflammation sont à courte durée de vie. Ils peuvent être activés de manière classique ou alternative en réponse à un antigène et peuvent également s’activer de façon non spécifique d’un antigène en réponse à un corps étranger ou à un agent inflammatoire stérile (7, 8). 17 Moelle osseuse Sang Tissus Ganglions lymphatiques Cellules dendritiques myéloïdes Macrophages endothéliaux Macrophages résidents M-CSF GM-CSF Cellules de Langherans (peau) Cellules de Kupfer (foie) Ostéoclastes (os) Microglia (SNC) Réponse non spécifique d’un antigène Cellule progénitrice myéloide Monocytes Intégrines β1 et β2 Membres de la famille des Immunoglobulines Sélectines Récepteurs EGF-TM7 Voie d’activation antigénique alternative Macrophages recrutés Voie d’activation antigénique classique Figure 2: La différenciation en macrophage d’après Gordon et al.(7) Des molécules d’adhésion contrôlent la migration des cellules sanguines à travers l’endothélium. Ces molécules incluent des intégrines (β1 et β2 entre autres), des molécules de la famille des immunoglobulines (comme CD31), des sélectines et des récepteurs de type facteur de croissance épidermique à 7 domaines transmembranaires comme (EGF-TM7). On distingue classiquement deux voies d’activation des macrophages : • Les macrophages M1 pro-inflammatoires induits par l’IFNγ (Interferonγ) et le LPS qui vont exprimer le CD16: récepteur à la fraction constante des anticorps et vont produire des cytokines pro-inflammatoires comme le TNFα (Tumor Necrosis Factor), l’interleukine 23 (IL-23), l’IL-12, et l’IL-6. Leur mission sera la destruction des pathogènes et des cellules tumorales. • La seconde population de macrophages recrutés en réponse à des stimuli de type IL-4/IL-13 sera plutôt anti-inflammatoire ou réparatrice. Ces macrophages M2 vont exprimer le récepteur au mannose CD206 et produire de faibles quantités de cytokines pro-inflammatoires mais de grandes quantités d’anti-inflammatoires comme IL-10, IL-6 et IL-1. Ces macrophages vont être impliqués dans les 18 mécanismes d’allergie, d’immunorégulation et de remodelage de la matrice extracellulaire et des tissus en fin de réaction immunitaire (9, 10). Il est à noter que cette classification a été réalisée à partir de données obtenues dans des modèles murins ou sur des lignées macrophagiques et/ou sur des monocytes sanguins différenciés in vitro en macrophages. Chez l’homme on dispose de très peu de données sur les macrophages tissulaires. I-1.1 b Les cellules dendritiques Identifiées par le marqueur CD11c, les cellules dendritiques constituent une population très hétérogène de CPAs. Leur capacité principale et conservée dans tous les types de cellules dendritiques est leur fonction de présentation d’antigène à des cellules T naïves alors que les macrophages et les lymphocytes B ne peuvent activer que des cellules T préactivées. Les fonctions des cellules dendritiques sont hétérogènes, dépendent de leur maturation, des interactions avec les autres cellules et de l’environnement cytokinique dans lequel elles se trouvent. Elles jouent un rôle dans la polarisation des lymphocytes en Th1 ou Th2. Selon leur maturité et leur modulation elles peuvent activer ou supprimer les réponses T auxiliaires ou encore induire l’anergie des lymphocytes T (7). Les cellules dendritiques immatures ont de faibles capacités à présenter l’antigène après maturation (activation par les ligands des TLRs ou par les cytokines) elles vont migrer dans les organes lymphoïdes, leur CMH II va être redistribué à la membrane et les molécules de co stimulation vont être activées (11). Leur fonction peut être régulée par les cellules NK qui peuvent soit tuer les cellules dendritiques immatures soit au contraire entrainer leur activation et leur maturation via la synthèse d’IFNγ et de TNF (12). Les cellules dendritiques sont très présentes dans certains tissus notamment l’intestin, où elles jouent un rôle aussi bien 19 dans la tolérance à la microflore commensale que dans la génération d’une immunité protective contre les pathogènes (13). I-1.2 Les cellules cytotoxiques I-1.2 a Les cellules Natural Killer (NK) Initialement décrites comme une population de lymphocytes tueurs spécialisés dans la lutte contre les tumeurs, les cellules NK constituent une population hétérogène de cellules lymphoïdes. Elles représentent 10 à 15% des lymphocytes du sang périphérique et sont décrites comme de grands lymphocytes granuleux contenant des granules lytiques: perforine et granzymes. Les cellules NK sont sélectionnées au cours du développement pour leur réponse au CMH I. Elles peuvent ainsi distinguer une cellule normale, exprimant le CMH I, d’une cellule stressée qui ne l’exprime plus, afin de détruire cette dernière. C’est le procédé de «missing self recognition», il est assuré par une famille de récepteurs inhibiteurs: les KIRs (Killer Cell Ig-like receptor) (Ly 49 chez la souris) qui vont inhiber l’activation des cellules NK si elles entrent en interaction avec le CMH I d’une cellule (Figure 3) (14). Les cellules NK sont également capables de détecter des antigènes de non soi présentés par le CMH I à la surface de cellules infectées. Lorsqu’elles sont activées, les cellules NK vont détruire la cellule cible à l’aide du système perforine/granzymes. La perforine va s’insérer dans la membrane de la cellule cible et y créer des pores. La formation de ces pores n’est pas suffisante pour tuer la cible mais va permettre l’entrée des granzymes dans la cellule. Les granzymes sont des protéases qui vont cliver de nombreux substrats dans la cellule cible et conduire à la mort de celle-ci (15). 20 Protection CMH de classe I Ligands d’activation Sensibilité CMH de classe I Pas d’activation KIR inhibiteur Ligands d’activation Activation Récepteurs activateurs Tolérance au soi KIR inhibiteur Récepteurs activateurs Surveillance immune Figure 3: Le procédé de «missing self recognition» d’après Vivier et al.(14) Le marqueur CD56 (ou N-CAM pour Neural Cell Adhesion Molecule) va discriminer deux populations de cellules NK différentes. Tout d’abord, les cellules exprimant faiblement le CD56 et positives pour le CD16, sont les cellules majoritaires dans le sang. Elles expriment des marqueurs d’adressage pour les sites d’inflammation que sont les récepteurs aux chimiokines CXCR1 et CX3CR1 ainsi que de la perforine pour médier rapidement la cytotoxicité. L’autre population de cellules NK exprimant fortement CD56 mais pas CD16, est très majoritaire dans les organes lymphoïdes secondaires pour lesquels elle va exprimer les molécules d’adressage CCR7, CD62-L et CXCR3. Cette seconde population est peu cytotoxique mais va produire de hauts niveaux de cytokines: IFNγ, TNFβ, IL-10 et IL-13 (16). 21 I-1.2 b Les cellules NKT Les cellules NKT sont des lymphocytes T possédant des fonctions de l’immunité adaptative et des caractéristiques des cellules NK dont l’expression du marqueur CD56 chez l’homme et NK1.1 chez la souris C57Bl6 (17). Ces cellules peuvent réagir avec des antigènes glycolipidiques présentés sur des molécules de surface non classiques: les CD1 qui présentent de fortes ressemblances avec les molécules du CMH mais dont les gènes non polymorphes n’appartiennent pas au CMH. Plusieurs types de cellules NKT ont maintenant été identifiés selon leur reconnaissance au CD1 et leurs marqueurs de surface associés (18). Ces cellules sont impliquées dans les réponses immunes contre les agents infectieux, les tumeurs mais aussi dans de nombreuses maladies auto-immunes et inflammatoires (19). Ce sont de grandes productrices de cytokines immunorégulatrices comme l’IFNγ, le TNFα et l’IL-4 (17). Elles représentent moins de 1% des cellules immunitaires présentes dans le sang chez l’homme et chez la souris (20, 21) mais sont présentes de façon préférentielle dans certains tissus, représentant 20 à 30% des cellules T dans le foie et la moelle osseuse et 10 à 20% des thymocytes matures chez la souris (22). I-1.3 Les lymphocytes γδ Les lymphocytes T γδ sont des cellules issues de la lignée lymphoïde qui expriment à leur surface un TCR (T cell receptor) constitué d'un hétérodimère γδ associé à deux molécules de CD3. Au moment du développement, les chaines γδ du TCR sont réarrangées à la place des chaînes αβ classiques (cf I-2.2). Contrairement aux lymphocytes T αβ, les lymphocytes T γδ ont un biais dans la distribution de leur répertoire et chaque réarrangement préférentiel au niveau des gènes codant le TCR, constitue une sous population aux caractéristiques fonctionnelles particulières. Le sous-type le plus décrit chez l’homme est le lymphocyte T γδ exprimant un TCR Vγ9Vδ2 (23). Chez l'homme et la souris, les lymphocytes T γδ sont des 22 populations minoritaires par rapport aux lymphocytes T αβ. Les lymphocytes T γδ sont des cellules cytotoxiques et/ou régulatrices dont la réactivité est multiple et très étendue. Ils interviennent aussi bien dans l'élimination de cellules infectées par un pathogène intracellulaire que dans la défense antitumorale. Ce sont des cellules effectrices essentiellement cytotoxiques (24) qui lysent leur cible notamment grâce au système perforine/granzymes. Les lymphocytes T γδ humains sécrètent aussi de nombreuses cytokines le plus souvent de type Th1 (25). Chez l'homme, les lymphocytes T γδ reconnaissent dans la majorité des cas leur antigène directement, sans molécules du CMH (26, 27). Ils ont aussi la particularité de reconnaître des antigènes solubles non peptidiques que l’on nomme phosphoantigènes (28). Enfin, ils se retrouvent préférentiellement dans les tissus en contact direct avec le milieu extérieur comme la peau, les poumon (29) et l’épithélium intestinal et où ils représentent 20% des lymphocytes intraépithéliaux. (30). I-2 L’immunité adaptative C’est la seconde ligne de défense de l’organisme, elle se met en place plus lentement (4 à 8 jours) et repose sur la détection spécifique d’antigènes étrangers conduisant à des mécanismes d’élimination des microorganismes portant ces antigènes tout en restant tolérant aux antigènes du soi. La réponse adaptative présente deux volets: la réponse humorale, basée sur la production d’immunoglobulines par les plasmocytes issus de la différenciation des lymphocytes B et la réponse cellulaire basée sur l’action des lymphocytes T qui coordonnent les différents axes de la réponse immunitaire et détruisent les cellules infectées. La mise en jeu de ces différentes cellules nécessite une organisation spatiale et temporelle particulière qui implique des organes spécialisés dans la maturation des lymphocytes (les organes lymphoïdes 23 primaires), des organes spécialisés dans la rencontre entre les lymphocytes et leurs antigènes (les organes lymphoïdes secondaires), des cellules spécialisées dans la présentation des antigènes aux lymphocytes (les CPAs) et enfin une recirculation efficace des lymphocytes dans l’ensemble des tissus. Les lymphocytes au repos qu’ils soient T ou B présentent tous la même apparence; le seul moyen de les différencier est de se baser sur l’expression de leurs protéines membranaires. Contrairement à la réponse innée, la réponse adaptative est différente lors d’une primo-infection ou d’une réinfection. Lors d’une primo-infection, la réponse primaire va permettre à un individu de développer un état de mémoire immunologique, qui, si le même pathogène (ou un pathogène très proche) est rencontré à nouveau, déclenchera une réponse secondaire plus rapide et de plus forte intensité. I-2.1 La réponse immunitaire à médiation humorale I-2.1.a Les lymphocytes B Les lymphocytes B naissent et se développent dans la moelle osseuse. Au cours de ce développement, ils acquièrent l’expression de leur récepteur spécifique: le BCR (B-cell receptor) et du complexe moléculaire CD21/CD19. Le BCR reconnaît l’antigène dans son état natif, c’est à dire non dégradé par une CPA, sous forme soluble ou lié à une membrane. Chaque BCR fonctionnel (ou immunoglobuline membranaire: IgM), protéine ne possédant pas de queue cytoplasmique donc pas de fonction de signalisation, est associé à un hétérodimère immunoglobuline α-β transmembranaire portant les motifs ITAMs (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) qui lanceront la cascade de transduction du signal (31). Le complexe CD21/CD19 va assister la reconnaissance d’antigènes (32). Les lymphocytes B sécrètent les immunoglobulines et exercent à ce titre une fonction importante 24 dans la réponse adaptative. Ils peuvent également internaliser un pathogène et le présenter sur le CMH II. Cette fonction de CPA est indispensable aux lymphocytes B pour recevoir l'aide des lymphocytes T (33). I-2.1 b Déroulement de la réponse B L’activation et la prolifération des lymphocytes B ont lieu dans les organes lymphoïdes secondaires où des CPAs présentent l’antigène aux petits lymphocytes naïfs circulants. Les cellules ainsi activées arrêtent alors leur migration, entrent en division et vont former des clones qui vont se différencier en cellules effectrices, les plasmocytes, qui vont migrer par chimiotactisme vers les sites d’infection grâce aux cytokines libérées dans les sites inflammatoires. Après activation, l’expansion clonale dure 4 à 5 jours, ce qui explique le délai nécessaire à une réponse adaptative pour être efficace. Les lymphocytes B assurent également une fonction de mémoire: ils sont issus de lymphocytes B déjà sélectionnés qui ont subi l’expansion clonale. Dans de rares cas, l’interaction d’une cellule B naïve avec son antigène suffit à la différenciation du lymphocyte B en plasmocyte (34). Cependant, le plus souvent, les antigènes sont thymo-dépendants et l’activation des cellules B requiert la présence d’un lymphocyte T. Dans ce cas, les lymphocytes B qui ont interagi avec l’antigène par l’intermédiaire de leur BCR régulent positivement des molécules CD40 ainsi que de CMH de classe II associées à des peptides antigéniques. Ces complexes peptide/CMH pourront être reconnus par un lymphocyte T CD4+ et l’interaction entre les CD40L du lymphocyte T CD4 et les CD40 du lymphocyte B va constituer le signal de co-stimulation nécessaire aux cellules B (33). Le lymphocyte B se différencie alors en effecteur capable de secréter des immunoglobulines, de subir la commutation isotypique et la maturation d’affinité (Figure 4). 25 Motif antigénique Ly B T CD4 CD40 CD40L Cytokines Plasmocyte Figure 4 : La réponse B thymo-dépendante d’après Janeway et al. (1) L’antigène qui se fixe au récepteur de la cellule B (LyB) la stimule tout en étant ingéré et apprêté en peptides qui vont activer les lymphocytes T auxiliaires armées. Les signaux provenant de l’antigène et de la cellule T CD4 vont déclenchent la prolifération et la différenciation de la cellule B en plasmocyte sécréteur d’anticorps spécifiques. I-2.2 La réponse immune à médiation cellulaire I-2.2 a Les lymphocytes T Les lymphocytes T αβ sont les principaux lymphocytes T circulants. Ils désignent un ensemble de cellules d’origine hématopoïétique dont la différenciation se déroule dans le thymus. La reconnaissance spécifique des lymphocytes Tαβ se fait via son TCR (35), récepteur à développement extracellulaire, constitué de deux chaînes: α et β. Les chaînes du TCR sont associées à deux complexes multicaténaires, les CD3 (composés de deux chaînes ε, deux ζ, une δ et une γ). Ces chaînes contiennent, dans leur région cytoplasmique, un ou plusieurs motifs ITAMs (Figure 5). Ces régions (une sur chaque chaîne ε, δ et γ, et trois pour chaque chaîne ζ) sont responsables de la transduction du signal dans les lymphocytes T en induisant, après l’engagement du TCR, une cascade de phosphorylations aboutissant à l’activation de la cellule. Parmi les lymphocytes T, on distingue deux sous-populations importantes. Les lymphocytes T auxiliaires exprimant le CD4 sont les cellules coordinatrices majeures du système immunitaire. Les lymphocytes T cytotoxiques exprimant le CD8 participent 26 uniquement à la réponse cellulaire. Ces deux populations diffèrent de façon fondamentale dans leurs modalités de reconnaissance de l’antigène et dans les fonctions régulatrices ou effectrices qu’elles exercent. TCRα CD3ε CD3γ TCRβ CD3δ CD3ε ITAM (CD3ζ)2 Figure 5: Schéma d’une molécule de TCR d’après Schumacher et al.(36) Dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T explorent la surface des CPAs afin d’analyser les peptides antigéniques présentés. La reconnaissance des antigènes protéiques par les lymphocytes T nécessite leur apprêtement par les CPAs, sur les molécules du CMH. Lorsqu’ils reconnaissent le complexe peptide/CMH dont ils sont spécifiques, l’interaction se stabilise et il se forme alors une zone étroite de contact et d’échange entre les deux cellules (la synapse immunologique voir Figure 6) où le lymphocyte T réorganise sa membrane plasmique et son cytosquelette sous-jacent. L’activation du lymphocyte T est un 27 terme qui regroupe les évènements de la signalisation menant à la survie de la cellule, sa prolifération, le réarrangement de son cytosquelette, l’augmentation de son métabolisme et la variation de son profil d’expression génique. Elle nécessite l’enregistrement de deux signaux distincts et synergiques: l’engagement du TCR (qui va déclencher la phosphorylation des motifs ITAMs présents sur ses chaînes CD3 et ζ et provoquer le recrutement d’un ensemble d’enzymes) et l’engagement des molécules de co-stimulation. Il existe de nombreux costimulateurs et co-inhibiteurs; c’est la sommation de ces signaux et le passage d’un seuil qui déclenchent ou non le deuxième signal (37). Figure 6: La synapse immunologique d’après Boes et al.(38) I-2.2 b Induction de la réponse CD4+ L’interaction d’un lymphocyte T CD4+ naïf et d’une CPA activée conduit à l’expression par le lymphocyte de la molécule CD28 capable d’interagir avec B7 (CD80/CD86) sur la CPA et qui potentialise le signal. La surexpression de la molécule CD40L va induire la mise en place de l’interaction CD40L/CD40 qui va maintenir la CPA dans un état activé. Le lymphocyte naïf se différencie alors en lymphocyte effecteur, Th1 ou Th2 (39, 40), capable de produire des cytokines spécifiques et de réguler la réponse 28 immunitaire. La décision de la différenciation en Th1 ou Th2 est multifactorielle et dépend du contexte cytokinique, des molécules de co-stimulation exprimées par la CPA et de la concentration de peptide/CMH. Ainsi, la nature du stimulus reconnu par les CPAs, en modulant la production de cytokines, influence fortement la polarisation T. De nombreuses études indiquent que la polarisation Th1/Th2 est influencée par les types de microorganismes que reconnaissent les CPAs via les PRRs qu’elles expriment ainsi que par l’environnement des CPAs (41, 42). Une vision simple de la dichotomie Th1/Th2 indique que les lymphocytes Th1, auxiliaires des lymphocytes T CD8+, sont impliqués dans la réponse cytotoxique et les lymphocytes Th2, auxiliaires des lymphocytes B, initient des réponses humorales (43). La production d’un type de cytokines par les lymphocytes d’un type cellulaire inhibe le développement de l’autre population. Il a été montré plus récemment qu’il existait une autre voie de différenciation pour les lymphocytes T auxiliaires naïfs, la voie des Th17 (44). Ces différentes sous-populations sont «sous le contrôle» d’un autre type de cellules T CD4+, les lymphocytes T régulateurs (Treg). Les principales caractéristiques de ces différents types de cellules auxiliaires sont résumées ci-dessous (Figure7). Cellules T régulatrice CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg IL-10 TGFβ, CD4+ IL-12 Th1 IL-2 IL-2 IFNγ TNFα Naïve CD4+ Naïve IL-2 IL-2 CD4+ Naïve CD4+ Naïve TGFβ, IL-6 IL-23 IL-4 IL-10 TGFβ, Th17 IL-17 Th2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 Immunité à médiation cellulaire pathogènes intracellulaires Auto-immunité organe spécifique Bactéries de l’intestin Arthrite Inflammation chronique Immunité à médiation humorale Allergies, Atopie Treg Figure 7: La différenciation des lymphocytes auxiliaires d’après Cooke et al (45) 29 Lymphocytes Th1: Ce sont les pro-inflammatoires principaux. Ils sont induits dans un contexte IL-12, ΙFΝγ (46, 47), produisent des cytokines inflammatoires comme l’IL-2, l’IFNγ ou le TNFα (48) et induisent le déclenchement des réponses immunitaires cellulaires mettant en jeu en particulier les T cytotoxiques. Ils recrutent les macrophages dans les sites d’infection et les activent afin de détruire les pathogènes internalisés (39). Ils se développent préférentiellement durant les infections par les bactéries intra cellulaires et les maladies chroniques inflammatoires et sont impliqués dans l’auto-immunité organe-spécifique (49). L’IFNγ qu’ils sécrètent possède de nombreuses propriétés effectrices. D’une part, il stimule la capacité microbicide des macrophages et des monocytes, d’autre part, il a des propriétés antivirales importantes. En effet, il stimule l’expression du CMH et la présentation des antigènes, optimisant la reconnaissance des cellules infectées par les lymphocytes T. Lymphocytes Th2: Ils sont induits en présence d’IL-4 et produisent essentiellement les interleukines 4, 5, 6, 10 et 13. Les cellules Th2 participent à l’immunité humorale en apportant une aide aux lymphocytes B pour qu’ils se développent en cellules productrices d’anticorps. Ils vont également activer les éosinophiles (granulocytes cytotoxiques de l’immunité innée) en vue d’une réponse indépendante des phagocytes (50). Ces lymphocytes prédominent dans les réponses aux allergènes (49). Lymphocytes Th17: Découverts en 2005 par l’équipe de Langrich dans un modèle murin d’EAE (Experimental autoimmune encephalomyelitis), cette nouvelle classe de lymphocytes auxiliaires se caractérise par la production d’IL-17 (51). Ces cellules se développent en présence de TGFβ (Tumor growth factor) et d'IL-6 et nécessitent la présence d’IL-23 pour leur expansion (52, 53). Elles sont très pro-inflammatoires et 30 peuvent jouer un rôle dans les maladies auto-immunes (54). Chez l’homme, une étude récente a caractérisé les Th17 isolés de l’intestin de patients atteints de la maladie de Crohn: ces lymphocytes Th17 expriment le récepteur de l’IL-23, CCR6 et le facteur de transcription RORγt (55). Ces cellules Th17 sont impliquées dans des maladies autoimmunes telles que l’arthrite induite par le collagène et l’encéphalite autoimmune expérimentale entre autres. L’IL-17 promeut l’inflammation en induisant la production de nombreuses cytokines et chimiokines, en recrutant les neutrophiles, en augmentant la production d’anticorps et en activant les cellules T (56). Chez l’homme, contrairement à la souris, il a été décrit l’existence de lymphocytes Th17 produisant de l’IFNγ, dénommés Th17/Th1 (55). Le rôle de cette population partageant des caractéristiques communes aux cellules Th1 et aux cellules Th17 est encore inconnu. Lymphocytes T régulateurs (Treg): Ils expriment CD25 (qui est le récepteur de l’IL2) et CTLA-4 (Cytotoxic T lymphocyte associated protein 4) (57). Comme ces marqueurs ne leur sont pas propres, le seul marqueur fiable des Treg est le facteur de transcription Foxp3 dont l’invalidation va conduire à une absence totale du développement de ce sous-type cellulaire (58, 59). Ils représentent 5 à 10% des lymphocytes T CD4+ chez l’homme et la souris. Impliqués dans la tolérance, ils peuvent être induits par des CPAs dites tolérogènes (60, 61), on parle alors de Treg induits. Cependant, il existe également une population de Treg dits naturels qui se développent directement à partir des précurseurs thymiques. Tous ces lymphocytes ne sécrètent pas de cytokines pro-inflammatoires mais de l’IL-10 et du TGFβ (62). Ils possèdent la capacité d’inhiber l’activation des cellules T soit par des mécanismes directs de contact cellule/cellule, soit indirectement en modulant négativement l’activation de la CPA (63). 31 I-2.2 c Induction de la réponse CD8+ L’induction de la réponse CD8 nécessite la présence d’un lymphocyte T CD4+ activé. La CPA présente des antigènes simultanément par le CMH de classe I et de classe II aux cellules T CD8+ et T CD4+ respectivement. La présence de la cellule CD4+ maintient un état d’activation élevée de la CPA qui permet une co-stimulation efficace des cellules CD8+. A la suite de cette interaction, le T CD8+ naïf se différencie en lymphocyte T Cytotoxique (CTL) exprimant la perforine et les granzymes dans des vésicules intracellulaires et, capable de produire des cytokines. Parfois, la CPA activée est suffisante à l’activation du lymphocyte T CD8+, on parle alors de réponse CD8 indépendante des CD4. Cependant, il faut que la CPA possède une très forte activité de co-stimulation intrinsèque pour induire la production d’IL-2 par les T CD8+ et provoquer la prolifération et la différenciation de ces derniers. La cytotoxicité des lymphocytes T: Les cellules T CD8+cytotoxiques ont la capacité de lyser les cellules présentant l’antigène dont elles sont spécifiques. Cette cytotoxicité nécessite un contact cellulaire entre le lymphocyte T et sa cible. Ce contact initié par l’interaction du TCR avec le complexe peptide/CMH, est renforcé par l’interaction de la molécule CD8 avec le TCR et également par des molécules d’adhésion cellulaire. La lyse repose sur 3 grands mécanismes. Le plus rapide (quelques minutes) et souvent le plus efficace met en jeu la perforine et les granzymes secrétés par le lymphocyte T cytotoxique. Un second mécanisme met en jeu la protéine FasL membranaire ou secrétée par le lymphocyte T, qui va se fixer sur un récepteur Fas situé sur la cible. La liaison de FasL à Fas va déclencher la cascade des caspases, un programme intracellulaire conduisant au suicide de la cible (15). Ce mode de lyse est plus lent (plusieurs heures) et souvent moins efficace. Enfin, le TNFα secrété par le lymphocyte T va pouvoir se fixer sur un récepteur au TNF conduisant aux mêmes types de 32 conséquences que l’interaction FasL/Fas (64). Dans tous les cas, la cellule cible meurt par apoptose. I-2.3 La mémoire immunitaire Un des attributs cardinaux du système immunitaire adaptatif est le développement de la mémoire immunitaire antigène spécifique. Les cellules mémoires sont celles qui survivent après la phase de rétractation de la réponse immunitaire, c’est à dire après le moment où le pathogène est éliminé et pendant lequel plus de 90% des cellules T effectrices meurent par apoptose. Le compartiment mémoire T est constitué des T CD4+ et T CD8+ qui peuvent acquérir rapidement des fonctions effectrices pour tuer les cellules infectées ou sécréter des cytokines inflammatoires (65). Ce compartiment mémoire doit être au moins aussi diversifié dans ses capacités fonctionnelles que le compartiment des effecteurs qui émergent après la première exposition aux antigènes. Les lymphocytes T mémoires ont une grande capacité migratoire (66). Ces cellules peuvent être classées en 2 types de cellules mémoires (Figure 8): • les CM (central memory) expriment CCR7 et sont fortement positives au CD62-L. Ces deux protéines ont des rôles précis. CCR7 (CC-chemokine receptor 7) va se lier à CCL19 et CCL21 exprimés sur les cellules endothéliales dans les ganglions lymphatiques. Il s’agit donc d’un marqueur d’adressage aux organes lymphoïdes. CD62-L ou L-sélectine interagit avec PNAd (Peripheral-node adressin) sur les veinules endothéliales qui favorisent l’attachement et le «rolling» des lymphocytes, ce qui permet l’adressage aux tissus périphériques. Les cellules mémoires CM sont retrouvées dans les organes lymphoïdes, la moelle osseuse, le sang et la rate mais sont absentes des tissus non lymphoïdes (67). Ces cellules semblent être destinées à 33 activer les CPAs. Quand elles sont réactivées, elles peuvent repartir dans la circulation, perdre le CCR7 et devenir des effecteurs mémoires (66, 68). • les EM (effector memory) n’expriment pas CCR7 et sont faiblement positives au CD62-L. Présentes dans le sang, la rate et les tissus non lymphoïdes, ces cellules peuvent répondre rapidement à l’antigène en produisant des molécules effectrices (68). Contrairement aux cellules naïves, elles expriment de manière constitutive, de forts taux d’ARNm de gènes codant pour l’IFNγ, ou la perforine et les granzymes. La synthèse de ces protéines sera régulée de manière «on-off» par le contact avec l’antigène et les protéines pourront être produites de façon beaucoup plus rapide que par les cellules naïves (65). La réponse mémoire est une réponse accélérée et plus agressive provoquant une expansion locale de cellules T antigène-spécifiques à un niveau maximum et une expression renouvelée de la plupart des fonctions associées à la réponse immune primaire initiale (66). Les cellules mémoires sont maintenues pendant plusieurs années par un processus de prolifération homéostatique qui maintient le nombre de cellules mémoires relativement constant. Les cytokines qui régulent la prolifération des lymphocytes T CD8 sont l’IL-2, l’IL15 et l’IL-7 mais leurs rôles relatifs ne sont pas complètement définis (69). La survie des lymphocytes T CD4+ quant à elle ne dépend pas des IL-2, IL-15 ou IL-4 mais seulement de l’IL-7 (68). Cet ensemble de cellules mémoires CD4+ va diminuer lentement avec le temps. 34 + antigène Cellule T naïve + antigène Cellule effectrice « précoce » Cellule effectrice « tardive » Pas d’antigène Pas d’antigène CCR7+ CD62Lfort CCR7Pas d’antigène Cellule mémoire centrale (tissus lymphoïdes) CD62Lfaible- Cellule effectrice mémoire (tissus non lymphoïdes) Figure 8: Voies de différenciation des cellules mémoires d’après Kaech et al. (70) 35 Marqueur Fonction protéique Cellules qui expriment ce marqueur CD3 Co-récepteur du TCR Lymphocytes T, cellules NKT CD4 Reconnaissance de l’antigène présenté Lymphocytes T CD4 sur le CMH de classe II Reconnaissance de l’antigène présenté CD8 Lymphocytes T CD8 sur le CMH de classe I CD14 Récepteur au LPS Monocytes, macrophages granulocytes (plus faiblement), neutrophiles CD16 Récepteur à la fraction constante des NK, macrophages, mastocytes anticorps CD19 Co-récepteur du BCR Lymphocytes B, cellules dendritiques CD45 Protéine tyrosine phosphatase, régule Cellules hématopoïétiques sauf la transduction de signaux notamment érythrocytes, thymocytes ceux du TCR et du BCR CD45RA Isoforme de CD45 contenant l’exon A Lymphocytes T naïfs, lymphocytes B, monocytes CD45RO Isoforme de CD45 ne contenant pas Lymphocytes B, lymphocytes T les exons A, B et C mémoires, monocytes, macrophages, cellules dendritiques, granulocytes CD56 CD62L NCAM neural cell adhesion molecule NK, NKT, lymphocytes larges et (NCAM) granulaires L-sélectine (permet l’adressage des Lymphocytes T naïfs lymphocytes aux tissus périphériques) CD127 Récepteur à l’IL-7 Lymphocytes T effecteurs et mémoires CD206 Récepteur au mannose Macrophages (type M2), cellules dendritiques, cellules endothéliales Tableau 2: Récapitulatif des principaux marqueurs de différenciation utilisés 36 II Les relations entre le tissu adipeux et le système immunitaire Il existe une relation intime entre le système immunitaire et le système métabolique qui présentent en termes d’évolution beaucoup de similitudes. Le développement parallèle des tissus adipeux et lymphoïdes dans les fœtus et les nouveaux nés chez les mammifères a été mis en évidence il y a plus de 50 ans (71). L’unité fonctionnelle qui contrôle les clés du métabolisme et des fonctions immunes dérive d’une structure commune ancestrale. Une de ces structures est le corps gras de la drosophile qui incorpore les homologues mammifères du tissu hépatique, hématopoïétique et immun. De manière intéressante, ce site est également reconnu comme représentant l’équivalent du tissu adipeux des mammifères en partageant des voies de développement et de fonctionnement similaires. Au cours de l’évolution, les organes ont été individualisés dans les organismes plus évolués, le tissu adipeux, le foie et le système immunitaire se sont spécialisés dans différentes fonctions, unités ou organes (72). Il n’est donc pas surprenant de retrouver des cellules immunitaires dans le tissu adipeux, ou encore du tissu adipeux englobant les ganglions lymphoïdes. II-1 Les principales fonctions du tissu adipeux blanc Le tissu adipeux blanc constitue le tissu adipeux principal chez l’homme adulte. Outre son rôle d’isolant thermique et mécanique, c’est la principale réserve énergétique de l’organisme. Chez l’homme moyen de 70kg, il va représenter 15kg soit 21% de sa masse corporelle, ce pourcentage est augmenté chez la femme et au cours de l’obésité. Chez l’homme, le tissu adipeux est localisé principalement en sous-cutané entre le derme et l’aponévrose musculaire. Mais il existe également du tissu adipeux interne comprenant: le 37 tissu adipeux viscéral, (thoracique et abdominopelvien) et le non viscéral (paravertébral et intramusculaire) (73, 74). Le rôle du tissu adipeux blanc est de réguler la balance énergétique en stockant l’énergie en surplus sous forme de triglycérides (TGs) qui restent mobilisables pour les autres tissus en fonction des besoins métaboliques. Globalement la gestion de l’énergie se fait grâce à deux voies métaboliques principales: II-1.1 Le tissu adipeux blanc : Organe de stockage énergétique II-1.1 a La lipogenèse Le stockage des lipides dans l’adipocyte se fait par 2 voies (Figure 9). La première voie correspond à la capture directe des TGs associées aux chylomicrons et aux lipoprotéines de très faible densité (ou VLDL «very low density lipoprotein») circulants, provenant de l’alimentation ou de la lipogenèse hépatique. La LPL (lipoprotéine lipase), produite et sécrétée par les adipocytes, ancrée à la surface endothéliale va hydrolyser les lipoprotéines (75). Les acides gras non estérifiés issus de ce clivage sont ensuite recaptés par l’adipocyte à l’aide d’un transporteur (CD36/FAT «fatty acid translocase» (76), FATP «fatty acid transport protein» (77), ou FABP «fatty acid binding protein») (78) puis transformés en acyl-CoA par une acyl-coA synthétase. Ils seront ré-estérifiés en TGs en présence de glycérol. La deuxième voie correspond à la lipogenèse de novo. Le terme de lipogenèse proprement dit désigne la néosynthèse d’acides gras à partir du glucose. Après l’entrée du glucose dans l’adipocyte, grâce à des transporteurs spécifiques (GLUT-1 et 4), le glucose est dégradé en pyruvate par le processus de la glycolyse. A partir du pyruvate, l’acétyl-CoA carboxylase (ACC) et la synthase des acides gras (FAS, « fatty acid synthase ») interviennent de façon successive pour catalyser la formation des acides gras à longue chaîne saturée. L’action des différentes désaturases permet de synthétiser des acides gras plus ou moins saturés. Comme 38 précédemment, ces acides gras sont ensuite ré-estérifiés pour donner les TGs. Il est nécessaire de préciser que chez les rongeurs, la lipogenèse est réalisée dans le foie et le TA. En revanche, chez l’homme, la lipogenèse est majoritairement hépatique et elle n’est qu’accessoire dans le TA (79). L’insuline, les cathécholamines l’hormone de croissance et la leptine contrôlent de manière extrêmement précise le métabolisme de l’adipocyte. L’insuline est l’hormone antilipolytique par excellence. Elle exerce un rôle positif sur le stockage par plusieurs mécanismes : Elle stimule la synthèse de LPL et son exportation vers la face interne des capillaires sanguins favorisant ainsi la captation adipocytaire des acides gras (80). Elle contrôle positivement la translocation des transporteurs GLUT-4 des compartiments intracellulaires vers la membrane plasmique, ce qui permet l’entrée de glucose dans l’adipocyte et son catabolisme dans la glycolyse afin de fournir les substrats nécessaires à la lipogenèse et à l’estérification (81). Elle agit positivement sur la lipogenèse en contrôlant directement l’activité de certaines enzymes comme par exemple l’ACC via des mécanismes de phophorylationdéphosphorylation. L’insuline agit également au niveau de l’expression des gènes qui codent pour les enzymes, par des mécanismes de régulation transcriptionelle. Le facteur de transcription SREBP1c (sterol responsive binding element protein 1c) a été identifié comme médiateur d’une grande partie des effets transcriptionnels de l’insuline dans l’adipocyte (82). Les catécholamines s’opposent aux effets de l’insuline sur la LPL, à l’activation des enzymes de la lipogenèse et à l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de SREBP-1c. De façon intéressante, les effets inhibiteurs de la leptine et de l’hormone de croissance sur le stockage des TGs passent par l’inhibition des effets stimulateurs de l’insuline (82). 39 Glucose Figure 9: Lipogenèse et synthèse des triglycérides dans l’adipocyte GLUT: glucose transporter; DHAP: dihydroxyacétone phosphate; TG: triglycérides; ACC: acétyl Coenzyme A (CoA) carboxylase; FAS: fatty acid synthase; AGNE: acide gras non estérifié; LPL: lipoprotéine lipase; VLDL: very low density lipoprotein (83). 40 II-1.1 b La lipolyse La lipolyse assure la dégradation des TGs contenus dans les vacuoles lipidiques de l’adipocyte, en glycérol et acides gras non estérifiés (AGNE). Plusieurs lipases interviennent de façon séquentielle dans cette hydrolyse des réserves lipidiques. La lipase hormonosensible (LHS) clive les TGs en diglycérides puis les diglycérides en monoglycérides, et constitue l’enzyme limitante du processus lipolytique. La lipase des monoglycérides (LMG) dégrade ensuite les monoglycérides en glycérol et acides gras non estérifiés. Cependant, la mise en évidence d’une activité lipolytique diminuée mais toujours présente chez des souris invalidées pour le gène de la LHS a laissé supposer l’existence d’au moins une autre lipase capable d’hydrolyser les TGs dans les adipocytes (84). Trois laboratoires différents ont identifié une nouvelle lipase dénommée « adipocyte triacyglycerol lipase » (ATGL) (85-87). L’ATGL présente une spécificité de substrat pour les TGs dix fois supérieure à son affinité pour les DGs ainsi qu’à l’affinité de la LHS pour les TGs (88). Elle joue un rôle limitant dans la première étape de la lipolyse basale tandis que la LHS est limitante pour l’hydrolyse des DGs (88). Les mécanismes susceptibles de réguler l’activité de la LHS sont bien connus et sont présentés dans la Figure 10 (89). L’activité de cette lipase dépend spécifiquement de sa phosphorylation réversible par une kinase dépendante de l’AMPc (PKA) (90) ou du GMPc (PKG) (91). La phosphorylation de la LHS active l’enzyme, en démasquant son site catalytique. Par ailleurs, cette phosphorylation permet une redistribution de la lipase du cytoplasme vers la vacuole lipidique. Les périlipines, protéines abondamment exprimées à la surface des gouttelettes lipidiques, interviennent dans la localisation et la stabilisation de la LHS à la surface des vacuoles. La phosphorylation des périlipines par la PKA et la PKG réduit leur ancrage à la gouttelette lipidique et favorise ainsi l’accès de la LHS à ses substrats lipidiques (92). 41 La régulation de l’ATGL est moins connue, elle est présente à la surface des vésicules lipidiques à des quantités comparables à l’état basal comme activé (87), et son activité est fortement augmentée par ABHD5/CGI58 (alpha, beta hydrolase domain containing protein 5/ comparative gene identification 58 (93). Il semble que lorsque les adipocytes ne sont pas stimulés, CGI58 soit lié à la périlipine A et incapable d’activer l’ATGL. Lorsque les adipocytes sont stimulés, les périlipines sont phosphorylées, entraînant la dissociation de CGI58 qui va interagir avec l’ATGL et activer l’hydrolyse des TGs (94, 95). Une fois dans la circulation, les acides gras libres (AGLs) vont être véhiculés par l’albumine et vont servir de carburant pour les tissus métaboliquement actifs via leur oxydation et la synthèse d’ATP. La βoxydation qui génère de l’ATP et des acétyl coenzyme A à partir des acides gras est le procédé le plus important qu’utilisent les cellules pour obtenir de l’énergie à partir des AGLs. Le glycérol généré par l’hydrolyse des AGLs est converti par la glycérol kinase du foie et va ainsi fournir la fraction de glycérol nécessaire pour la synthèse des TGs (96). Figure 10: Contrôle de la lipolyse dans l’adipocyte humain d’après Lafontan et al.(97) 42 II-1.2 Le tissu adipeux blanc : organe hétérogène Le tissu adipeux n’est pas composé uniquement d’adipocytes mais également d’une fraction stroma-vasculaire (FSV) non adipocytaire. Il est aisé de séparer les adipocytes de la FSV par digestion à la collagénase (98) ou à la libérase. Après centrifugation, les adipocytes flottent à la surface et le culot contient les cellules de la FSV. Par une approche de cytométrie en flux et le choix de marqueurs membranaires spécifiques, notre équipe a mis en évidence différentes populations au sein de la FSV (99) (100) (101) du tissu adipeux blanc chez l’homme; des cellules endothéliales microvasculaires (CD34+/CD31+); des cellules progénitrices (CD34+/CD31-) et des macrophages (CD34-/CD31+/CD14+). Les travaux menés sur la comparaison des capacités de production des adipokines, notamment les chimiokines et les cytokines, entre les adipocytes et la FSV ont mis en évidence que ces sécrétions étaient majoritairement dues aux cellules non adipocytaires (102). II-1.2 a L’adipocyte L’adipocyte mature est la cellule spécifique du tissu adipeux, grosse cellule sphérique pouvant atteindre 100 à 200µm. Son cytoplasme est largement occupé par une vacuole lipidique qui repousse le noyau en périphérie contre la membrane plasmique (96). L’adipocyte présente deux fonctions principales, le stockage des lipides selon le processus de lipogenèse ainsi que celui de la synthèse des TGs, et la mobilisation des lipides via le processus de lipolyse. Ces activités métaboliques sont étroitement régulées par des signaux neurohumoraux. L’adipocyte mature est incapable de proliférer, l’augmentation du tissu adipeux observée lors de l’obésité est due à une augmentation du volume (hypertrophie) et du nombre de ces adipocytes (hyperplasie) par différenciation des préadipocytes présents en grande quantité dans la FSV (103). 43 II-1.2 b Les cellules progénitrices La présence de cellules progénitrices dans le tissu adipeux humain est reconnue depuis les travaux de Bjorntop sur l’évolution de la cellularité de la masse adipeuse avec le développement de l’obésité. Les travaux réalisés dans notre laboratoire ont montré que la FSV du tissu adipeux humain contient des cellules caractérisées par l’expression du marqueur CD34 et l’absence du marqueur CD31 qui, en conditions adipogéniques, vont exprimer des transcrits spécifiques des adipocytes. De plus, ces cellules différenciées présentent des activités fonctionnelles, métaboliques et sécrétoires des adipocytes matures (100). D’autre part, ces cellules peuvent donner naissance à des cellules qui expriment des marqueurs phénotypiques des cellules endothéliales lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux adaptés (101). De nombreux laboratoires ont montré par la suite que les cellules de la FSV humaine pouvaient également acquérir in vitro des marqueurs biochimiques caractéristiques de lignages cellulaires variés: ostoégénique (104), chondrogénique (105), myogénique (106) entre autres. De plus, l’analyse des capacités de différenciation des cellules dérivant d’une cellule unique après de multiples passages, a montré que plusieurs clones cellulaires pouvaient se différencier en plusieurs lignages. Ces résultats suggèrent la présence de cellules souches adultes de type multipotentes au sein du tissu adipeux humain (107 , 108 , 109). II-1.2 c L’adipogénèse La différenciation adipocytaire proprement dite ou adipogenèse représente le passage du préadipocyte à l’adipocyte mature au sein du tissu adipeux. Après une phase de croissance exponentielle, le précurseur déterminé vers la lignée adipocytaire ou adipoblaste marque un arrêt de croissance à confluence. Ces cellules deviennent alors des préadipocytes et s’engagent dans l’adipogenèse proprement dite. Tout au long du processus d’adipogenèse, vont se succéder différents événements morphologiques, biochimiques et moléculaires, que 44 l’on regroupe en deux catégories; on distingue les événements précoces et tardifs. Il est à noter que les mécanismes de différenciation adipocytaire ont été déterminés principalement à partir d’approches réalisées sur des modèles murins et sur des lignées préadipocytaires murines issues de la lignée de fibroblastes 3T3. Les événements précoces concernent en particulier le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) et du cytosquelette. Au cours de la différenciation adipocytaire, la composition de la MEC est fortement modifiée. D’une structure riche en fibronectine, sa composition va évoluer vers une structure de type lame basale, composée essentiellement de laminine, de collagène IV et d’entactine (110). Des changements dans la forme de la cellule sont possibles par une réorganisation du réseau intracellulaire d’actine (111). L’ensemble de ces remodelages matriciels, du cytosquelette et de la forme de la cellule permet alors aux préadipocytes de subir une étape d’expansion clonale liée à une série de réplications de l’ADN ou mitoses dites post-confluentes. A la suite de ces événements précoces, les préadipocytes sont dits « engagés dans la différenciation adipocytaire ». Enfin, une étape de maturation terminale permet d’obtenir les adipocytes matures. Les changements morphologiques majeurs qui accompagnent la différenciation adipocytaire, tels que l’arrondissement des cellules et l’accumulation progressive de vacuoles lipidiques dans le cytoplasme, sont la conséquence de variations d’expression d’un très grand nombre de gènes. Cette reprogrammation génétique profonde est sous le contrôle de facteurs de transcription pro- ou anti-adipogéniques dont les principaux sont les facteurs PPARs (Peroxisome proliferator-activated receptors), les C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) et le facteur ADD1/SREBP-1c (Adipocyte determination and differentiation factor 1/sterol regulatory element binding protein-1c) (112 , 113). 45 II-1.2 d Les cellules endothéliales et le réseau vasculaire Les cellules endothéliales capillaires sanguines régulent les échanges de métabolites, d’hormones et de cellules entre les compartiments adipeux et sanguins. Le développement du tissu adipeux est dépendant de sa vascularisation (114). L’importance du réseau vasculaire sanguin dans la croissance du tissu adipeux est soulignée par des expériences réalisées in vivo chez la souris. Ces travaux montrent que l’inhibition du remodelage des vaisseaux sanguins par l’utilisation de composés anti-angiogéniques (115, 116) ou proapoptotiques dirigés contre la vasculature du tissu adipeux (117) conduit à une prévention du développement du tissu adipeux et à une réversion de l’obésité. Chez l’homme, peu de données sont disponibles quant à l’organisation des systèmes vasculaires sanguins du tissu adipeux humain, et leurs rôles potentiels dans le développement du dépôt adipeux. Notre équipe a récemment montré que le tissu sous-cutané humain possède un réseau capillaire très développé dont l’extension suit le développement de la masse grasse lors de l’installation de l’obésité. Des analyses d’expression génique au sein du laboratoire, ont permis de montrer que les cellules endothéliales fraîchement isolées du tissu adipeux à l’aide des marqueurs de surface CD34/CD31, sont dans un état d’activation angiogénique et légèrement inflammatoire (données non publiées Villaret 2009). II-2 La réponse immunitaire altère l’état métabolique La réponse immunitaire, par ses fonctions de défense et de réparation des tissus, a pour conséquence de réorienter les substrats énergétiques et azotés de la périphérie (muscles et tissus adipeux) vers le foie et les tissus agressés. Ils induisent des modifications métaboliques, endocriniennes et le syndrome inflammatoire. Les médiateurs de l’inflammation augmentent la réponse catabolique 46 II-2.1 Conséquences de la réponse de phase aiguë L’infection et l’inflammation induisent la réponse de phase aiguë (APR) conduisant à de multiples altérations protéiques ainsi que du métabolisme des lipides et des lipoprotéines. Les protéines de la phase aiguë: protéine C réactive (CRP), protéine amyloide sérique (SAA) (118) et fibrinogène sont augmentées tandis qu’une diminution des protéines comme l’albumine, la tranferrine ou l’alpha-fœto protéine est observée (119). Ces changements sont dus à l’altération des taux de synthèse protéique hépatique (118) mais aussi extra hépatiques. L’augmentation de ces protéines de phase aiguë va permettre la neutralisation des microorganismes, la participation à la réponse immune ainsi qu’à la régénération des tissus et le «remplacement» des protéines utilisées lors du processus inflammatoire. Les variations de la synthèse des protéines de phase aiguë sont médiées par les cytokines (TNFα, TNFβ, interleukines, IFN α, β et γ) produites en réponse à une variété de stimuli dans de multiples types cellulaires (macrophages, monocytes, lymphocytes T et cellules endothéliales). II 2 1 a Modifications du métabolisme lipidique L’inflammation s’accompagne d’altérations du métabolisme des lipides et des lipoprotéines induites par les cytokines. Ainsi, une altération précoce et consistante du métabolisme se traduit par l’augmentation des taux de triglycérides sériques (120), en réponse à une augmentation de la production hépatique de TGs. Cette augmentation de production résulte d’une plus grande disponibilité des d’acides gras non estérifiés (AGNE) relargués par la lipolyse stimulée dans les dépôts adipeux sous l’action du TNFα, d’IL-1 et de l’IFNα, β et γ. Elle résulte également d’une augmentation de la synthèse hépatique d’acides gras dans le foie en réponse au TNFα, et β à l’IL-1 et 6 et à l’IFNα (121 , 122). 47 Les infections produisent également des altérations dans la composition et la fonction des lipoprotéines, incluant des changements dans les concentrations en sphingolipides et une augmentation de l’oxydation des lipides. On observe également une diminution des HDL, et une variation des protéines associées au métabolisme des HDL (121, 122). II 2 1 b Modifications de la sensibilité à l’insuline Sous l’influence des cytokines pro-inflammatoires telles qu’ IL-1β, IL-6 et TNFα apparaissent également une néoglucogenèse augmentée, une production d’hormones et une diminution de la sensibilité à l’insuline. Paradoxalement, l’insensibilité à l’insuline qui peut contribuer au processus des pathologies peut exercer un effet bénéfique au cours de la réponse aux infections (123). La néoglucogenèse augmente sous l’influence des cytokines proinflammatoires, ainsi que l’utilisation de glucose par les cellules immunes. Le glucose et la glutamine sont les principales sources d’énergie pour les cellules du système immun. La création d’un état d’insensibilité à l’insuline pourra réduire l’utilisation de glucose par les tissus insulino-dépendants au profit des tissus pour lesquels le processus est insulinoindépendant comme les cellules immunes (124-126). II 2 2 Réponse de phase aiguë et anorexie Enfin, l’anorexie qui apparaît au cours de l’infection est une part de la réponse de phase aiguë. En effet, la suppression de la faim permet d’éliminer la dépense énergétique de recherche de nourriture. De plus, l’anorexie réduit la disponibilité des micro-nutriments provenant de la nourriture essentiels à la croissance des micro-organismes (127). Plusieurs cytokines pro inflammatoires dont IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNFα, IFNα et IFNγ inhibent la prise de nourriture après administration parentérale, ce qui suggère que l’augmentation de leur 48 production au cours de la réponse immune contribue à l’anorexie survenant au cours de l’infection (128, 129). II-3 Impact du métabolisme sur le système immunitaire. II-3.1 L'état nutritionnel altère la réponse immunitaire En dehors de tout état pathologique, la nutrition peut influencer le système immunitaire. Les effets du glucose, des protéines et des vitamines sur le système immunitaire ont été largement décrits mais au cours des quinze dernières années le rôle crucial des lipides alimentaires a commencé à émerger. De nombreuses pathologies sont aujourd’hui connues pour être dues aux effets immunomodulateurs des lipides, celles-ci incluent le diabète, l’athérosclérose et le syndrome d’insulino-résistance. Ainsi, l’exposition augmentée du système immun aux acides gras pourrait potentiellement altérer les réponses immunes innées et acquises (130). II-3.1 a Effets des acides gras La composition en acides gras (quantité et nature) de la ration lipidique alimentaire modifie la réponse immunitaire. Les phospholipides des cellules immunes contiennent 15 à 20% d’acides gras (131, 132). En modifiant la composition en acides gras de la nourriture, on entraîne une modification de la composition en acides gras des cellules immunes: avec une augmentation de l’apparition d’acides gras avec lesquels la nourriture a été enrichie (133, 134). Les acides gras ont plusieurs rôles dans la fonction des cellules immunes. Ils agissent comme substrats énergétiques et composants des phospholipides des membranes en contribuant à leurs propriétés physiques et fonctionnelles. Ils agissent aussi comme 49 modificateurs des structures protéiques en influençant la structure et la fonction de ces protéines. Enfin, ce sont des régulateurs de l’expression génique par des effets sur l’activité des récepteurs nucléaires et ils interfèrent avec les voies de transduction du signal intracellulaire ou la transcription des facteurs d’activation. Altérations des acides gras de l’alimentation Altérations de la composition des phospholipides des cellules immunes Altérations des membranes Rafts, ordre, circulation Voies de transduction du signal/ Expression génique Médiateurs lipidiques Altérations des fonctions des cellules immuns Altérations de la réponse immune Figure11: Représentation des mécanismes par lesquels une modification des acides gras alimentaires peut influencer la réponse immune d’apreès Calder et al.(135) Acides gras poly-insaturés Les acides gras poly-insaturés l’acide dihomo-γ-linolenique (DGLA; 20:3n-6), l’acide arachidonique (AA; 20:4n-6), l’acide docosahexexaénoique (DHA; 22:6n-3) et l’acide 50 eicosapentanoique (EPA 20:5n-3) sont des précurseurs de la synthèse des éicosanoides (135). Ils sont relargués des membranes par l’action de la phospholipase A2 activée en réponse à des stimuli cellulaires. Comme les membranes de la plupart des cellules immunes contiennent des grandes quantités d’AA (n-6), c’est en général le principal précurseur de la synthèse des éicosanoides. Ils incluent la prostaglandine (PG), les thromboxanes, les leucotriènes (LT), les lipoxines. Les effets principaux de la prostaglandine et des leucotriènes sont résumés dans la figure 12. Acide arachidonique Leucotriènes + -Vasoconstriction + -Activité des cellules NK PGE2 - -Fièvre -Production de TNFα, -Perméabilité vasculaire -Douleur IL-1 et IL-6 -Chimiotactisme des -Vasodilatation -Production de cytokines leucocytes -Perméabilité vasculaire de type Th1 -Activité des neutrophiles -Production d’IgE par les -Production de TNFα, IL-1 cellules B et IL-6 -Prolifération des -Production de cytokines de lymphocytes type Th1 -Activité des cellules NK -Prolifération des -Expression du CMH II lymphocytes Figure 12 : Rôles des principaux éicosanoides dans la régulation de l’inflammation et de l’immunité d’après Calder et al (135) PGE = prostaglandine E 51 Ainsi les dérivés de l’AA principalement pro-inflammatoires, peuvent également exercer des effets anti-inflammatoires et être impliqués dans la résolution de l’inflammation. L’effet physiologique final sera gouverné par la concentration locale de ces médiateurs, leur délai de production et la sensibilité des cellules cibles à leurs effets. Les acides polyinsaturés n-3 (EPA, DHA) quant à eux, vont s’incorporer dans les membranes de manière temps et dose dépendante au détriment de l’AA et des acides gras n-6. Leurs propriétés anti-inflammatoires sont dues à l’inhibition de la production des éicsoanoides dérivés de l’AA et à la production de familles alternatives d’éicosanoides de type antiinflammatoire comme les résolvines et PGE3 (136). D’autre part, EPA et DHA peuvent inhiber la production de cytokines pro-inflammatoires (TNFα, IL-1β, IL-6 et IL-8) par les monocytes, les macrophages et les cellules endothéliales. Ces inhibitions semblent passer par des altérations de l’activité des facteurs de transcription NF-ΚB et PPARγ. Enfin, l’activation de PPARγ par les acides gras n-3 a été décrite entre autre pour avoir un rôle dans la prévention du développement de l’insulino-résistance (137). Acides gras saturés Les acides gras saturés sont impliqués dans l’inflammation et dans le développement de l’insulinorésistance dans le tissu adipeux et le muscle. Ils activent les TLR dans les adipocytes et les macrophages murins provoquant ainsi l’activation et de NF-κB et de JNK et la production de cytokines. Les acides gras saturés augmentent également l’inflammation et l’apoptose dans le tissu adipeux blanc via le stress du réticulum endoplasmique, la génération de céramides et d’espèces réactives de l’oxygène. De plus, ils inhibent la voie de signalisation de l’insuline en diminuant l’activation de IRS1, PIK3 et Akt et sont donc des facteurs potentiels de développement de l’ insulinorésistance (138). 52 II 3 1 b Malnutrition et infections La malnutrition est une cause commune de déficit immunitaire secondaire et de susceptibilité aux infections chez l’humain. Les malnutritions sévères affectent le développement du thymus conduisant à son involution qui se répercute en périphérie par une plus grande proportion de lymphocytes immatures circulants associée à une diminution du nombre de lymphocytes T matures. Ces modifications sont sous contrôle neuroendocrine. En effet, il a été montré que l’atrophie du thymus était associée à une augmentation des taux de circulants de glucocorticoïdes ainsi qu’à une diminution de ceux de leptine. L’importance de celle-ci a été confirmée car son injection limite l’atrophie du thymus et diminue les taux de glucocorticoïdes en parallèle (139). L’immunodéficience représente un facteur clé dans la susceptibilité aux infections. Chez les patients atteints de malnutrition sévère les fonctions de l’immunité innée sont également touchées. Les composés du complément, notamment la fraction C3, sont moins disponibles affectant le processus de phagocytose (140). Chez la souris, on observe une diminution de la capacité des macrophages à phagocyter et à produire des espèces réactives de l’oxygène ainsi qu’une altération de la capacité des cellules dendritiques à présenter des antigènes aux cellules T. Le nombre de cellules au sein de la population lymphocytaire CD4 est globalement réduit (141). D’autre part, on observe aussi des altérations des capacités de migration et d’extravasion des lymphocytes T qui vont présenter un phénotype intermédiaire (CD45RO faible CD45RA faible) plutôt qu’un phénotype de cellules mémoires (142). De plus, ces cellules sont orientées vers un phénotype de type Th2 avec une moindre sécrétion d’IFNγ/IL-2 et une augmentation d’IL-4/IL-10 (143). 53 II-3.2 Les pathologies associées au tissu adipeux II-3.2.a L’obésité L’obésité correspond à une surcharge pondérale résultant du développement excessif du tissu adipeux. Elle est définie par l’indice de masse corporelle IMC (voir tableau 3). Cet indice n’est pas correct pour les enfants, les sportifs et n’est pas indicatif de la quantité de masse grasse mais cette classification reste néanmoins la plus utilisée car la plus simple à déterminer. D’autres paramètres peuvent également être pris en compte pour définir l’augmentation de la masse grasse viscérale : • Le rapport taille /hanche: seront considérés obèses les hommes ayant un rapport > 1,0 et les femmes > 0,85 • Le périmètre abdominal mesuré seul à mi-distance de la cage thoracique et de la crête illiaque (voir tableau 4) Classification IMC (kg/m2) Sous-poids < 18,5 Poids normal 18,5-24,99 Surpoids 25,00-29,99 Obésité ≥ 30,00 Obésité de classe I 30,00-34,99 Obésité de classe II 35,00-39,99 Obésité de classe III ≥ 40,00 Tableau 3: Classification des IMC et définition de l’obésité selon l’OMS (144) 54 Risques de complications métaboliques Périmètre abdominal (cm) Hommes Femmes Augmenté ≥ 94 ≥ 80 Sensiblement augmenté ≥ 102 ≥ 88 Tableau 4: Périmètre abdominal par sexe et risque de complications métaboliques associées chez les sujets de race blanche (selon l’OMS) (144) L’incidence de l’obésité a dramatiquement augmenté durant ces dernières décennies de sorte que l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés constituent une menace sérieuse pour la population mondiale. L’OMS estime que plus d’un milliard d’adultes sont en surpoids et parmi eux 300 millions sont cliniquement obèses (Rapport OMS 2002). L’obésité prédispose les individus à une augmentation des risques de développer de nombreuses maladies comme l’athérosclérose, le diabète de type 2, la stéatose hépatique non alcoolique, certains cancers et des désordres médiés par le système immunitaire comme l’asthme (145). II-3.2 b L’inflammation chronique du tissu adipeux liée à l’obésité L’obésité est associée à une réponse inflammatoire chronique définie comme une réponse inflammatoire qui n’est pas classique mais plutôt un état inflammatoire dit de bas bruit qui serait à l’origine des pathologies associées à l’obésité (72). Le premier lien établi entre l’inflammation et l’obésité est la découverte de la surproduction de TNFα par le tissu adipeux des modèles de rongeurs obèses (146). Comme c’est le cas chez les rongeurs, le TNFα est également produit en importante quantité dans le tissu adipeux humain des 55 personnes obèses (147, 148). On peut noter que certaines études n’ont pas retrouvé d’augmentation de la production de TNFα chez l’homme (149). Le TNFα est décrit pour altérer la fonction de transduction du signal du récepteur à l’insuline (150). Il inhibe également la LPL et stimule la lipolyse dans les adipocytes. D’autre part, l’administration de TNFα à des préadipocytes murins différenciés ou à des modèles animaux diminue l’effet de l’insuline alors que les modèles de souris obèses déficientes pour le TNFα ou ses récepteurs ont une sensibilité à l’insuline améliorée par rapport à leurs contrôles (151). Enfin, le tissu adipeux des sujets obèses produit une quantité élevée de cytokines comme le TNFα, l’IL-6, l’IL-1β, le MCP-1 et il est le siège d’une accumulation de cellules immunes (voir chapitre II 4). Dans le tissu adipeux viscéral décrit pour être le tissu adipeux le plus impliqué dans les complications métaboliques, l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires IL-6, IL1β, IL-8 et MCP-1 ainsi que des gènes relatifs à l’inflammation est augmentée (152). Différenciation adipocytaire IL-1/IL-1Ra, IL-6, TNFα, MCP-1 Régulation de la prise alimentaire Sensibilité à l’insuline Homéostasie énegétique TNFα, IL-6, IL-1/IL-1Ra, Contrôle du poids Adiponectine, Leptine , Résistine Leptine , IL-6, IL-1/IL-1Ra Métabolisme Tissu adipeux blanc Inflammation Protection cardiovasculaire Adiponectine, IL-1Ra, IL-10 Inflammation vasculaire? IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10, Résistine Contrôle de l’inflammation IL-1/IL-1Ra, TNFα,IL-6, IL-8, MCP-1, RANTES, IP-10 Figure 13: Les sécrétions du tissu adipeux (d’après Juge-Aubry (153)) 56 L’état inflammatoire chez les sujets obèses se caractérise par une plus forte concentration plasmatique des protéines de la phase aiguë de l’inflammation telles que le fibrinogène, la CRP (154), la SAA, le PAI-1, l’angiotensinogène, le facteur tissulaire, l’alpha1 glycoprotéine acide, l’antagoniste du récepteur de l’IL1 (IL1Ra). On notera également une élévation des taux plasmatiques de cytokines pro-inflammatoires MCP-1, IL-6, IL-8, leptine, TNFα et des formes solubles des récepteurs aux cytokines comme les TNF-R ou l’IL1R ainsi que des molécules d’adhésion E-sélectine, ICAM1 et VCAM1 (155, 156). Les données épidémiologiques supportent l’idée que l’obésité est associée à des altérations de la fonction immune (157) (158) (159). Dans la circulation des sujets obèses, a été rapportée une augmentation du nombre de leucocytes, de monocytes et des lymphocytes T et B mais sans variation de cellules NK (157). Les CD4+ sont décrits pour être augmentés et les CD8+ augmentent seulement chez les obèses morbides (159). Cependant, ces données sont controversées et décrites pour être plus liées au syndrome métabolique qu’à l’obésité (158). De plus, d’autres études décrivent une lymphopénie associée à l’obésité chez l’homme (160). Cette lymphopénie s’observe également chez l’animal et se caractérise par une diminution de la population de cellules B et une suppression de l’activité NK (161, 162). II-3.2 c L’insulinorésistance L’insulinorésistance est définie comme une diminution de la réponse des tissus périphériques à l’action de l’insuline. Les individus insulinorésistants sont prédisposés à développer un diabète de type 2. L’augmentation de l’insulinorésistance a été reconnue comme un élément à part entière du syndrome métabolique qui inclut l’intolérance au glucose, la résistance à l’insuline, l’obésité, l’hypertension, un taux faible de HDL, une hypertriglycéridémie et une accélération de l’athérosclérose. Il a été montré qu’il y avait une 57 relation de cause à effet entre l’inflammation, l’insulinorésistance et le diabète de type 2 (163). L’inflammation systémique chronique est proposée comme ayant un rôle important dans la genèse de l’insulinorésistance associée à l’obésité. Les bio-marqueurs de l’inflammation comme le TNFα, la CRP ou l’IL-6 sont présents à des taux croissants chez les patients obèses et insulino-résistants et ces bio-marqueurs prédisent le développement du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires (153). II-3.2 d La leptine La leptine est à l’interface du système métabolique et immun. Principalement produite par le tissu adipeux, elle régule la fonction neuroendocrine, l’homéostasie énergétique, l’hématopoïèse et l’angiogenèse mais cette adipocytokine est aussi un médiateur important des processus inflammatoires (164). En effet, les souris déficientes en leptine (ob/ob) ou en leptine récepteur (db/db) présentent un panel d’anomalies immunitaires (165). Les souris ob/ob ont un thymus involué, des défauts dans la réponse des cellules T (166, 167) ainsi qu’une capacité réduite des cellules dendritiques à présenter l’antigène aux cellules T (168, 169). De plus, chez l’homme la déficience congénitale en leptine entraînant l’obésité, est associée à une lymphopénie et une diminution de la réponse T (170). Elle agit sur le système immunitaire aussi bien inné qu’adaptatif (Figure 14). Au niveau de l’immunité innée, elle est susceptible de réguler l’activation des neutrophiles en augmentant le chimiotactisme et l’activation des cellules présentatrices d’antigène par l’expression accrue des molécules du CMH, et des molécules d’adhésion de la phagocytose. D’autre part, elle va moduler la production macrophagique de cytokines pro-inflammatoires comme TNFα, IL-1 et IL-6 et jouer un rôle sur la cytotoxicité en augmentant la production de perforine par les cellules NK (171, 172). 58 Au niveau de l’immunité adaptative, la leptine régule la prolifération des cellules T notamment naïves et inhibe leur apoptose. Elle peut aussi influencer la réponse Th1/Th2 en stimulant la production de cytokines Th1 (IFNγ, IL-2) et en inhibant la production de cytokines Th2 (IL-4) (173). Enfin, les lymphocytes T et B expriment constitutivement de faibles taux du récepteur à la leptine. Cette expression est régulée de manière positive (en terme de pourcentage de cellules positives et de densité du récepteur) en réponse à l’activation des cellules B, T et des macrophages (165). De plus, les souris db/db montrent une capacité proliférative des CD4+ réduite comparées aux hétérozygotes, ce qui suggère que le récepteur à la leptine est important pour la prolifération et l’expansion des CD4+ lors de la stimulation médiée par le TCR. Cependant, malgré les données in vitro, les résultats sur les modèles animaux et l’évidence d’un effet pro-inflammatoire, la manière dont la leptine influence les réactions inflammatoires chez l’homme reste encore à élucider (145). Immunité innée Immunité adaptative Activation des neutrophiles Chimiotactisme H2O2 Induction des cytokines par les monocytes/macrophages réponse de la phase aigue anorexie inflammatoire fièvre Homéostasie thymique nombre deethymocytes cellules CD4+ CD8+ cellules CD4+ CD8apoptose O2- Prolifération Cellules T naïves TNF IL-2 TNF IL-1 IL-6 Stimulation cellules Th1 Switch IgG2-a Aide aux cellules CD8+ Activation macrophages Leptine Activation des CPAs molécule du CMH molécules d’adhésion Phagocytose TNF Leucotriène B4 leptine Th1 IFNγ Cyclo-oxygenase 2 Effets anti-apoptotiques sur les cellules T et les précurseurs hématopoïétiques Macrophage NK Cytotoxicité Perforine Th2 IL-2 IL-10 IL-4 Stimulation cellules Th2 Switch IgG1 Figure 14: Effets de la leptine sur le système immunitaire d’après La Cava et al. (164) 59 II-4 Interactions directes entre le tissu adipeux et le système immunitaire II-4 1 Le rôle nutritionnel du tissu adipeux pour le système immunitaire Tous les immunologistes expérimentaux le savent: les ganglions lymphatiques sont intégrés dans du tissu adipeux. Les tissus adipeux péri ganglionnaires sont une caractéristique anatomique conservée uniquement chez les mammifères. (174) Les adipocytes qui sont anatomiquement associés aux ganglions lymphatiques présentent des propriétés particulières qui leur permettent d’interagir localement avec les cellules lymphoïdes. Généralement plus petits que la moyenne, ils accumulent et stockent de façon sélective certains acides gras notamment des polyinsaturés (175), précurseurs essentiels des eicosanoides et des docosanoides et les relarguent en réponse à des signaux lipolytiques locaux. D’autre part, ces tissus adipeux répondent beaucoup mieux que les non péri ganglionnaires aux stimulations lipolytiques des cellules immunes (176). Les acides gras et le glycérol ainsi produits vont être une ressource nutritive pour les ganglions et les cellules immunes qu’ils contiennent: lymphocytes et cellules dendritiques. Le contrôle paracrine de la lipolyse par les cellules lymphoïdes réduit la compétition pour l’utilisation de l’énergie avec les autres tissus (177). Cet approvisionnement énergétique local des tissus lymphoïdes affranchit partiellement la fonction immune de changements dans la quantité et la composition de la nourriture (Figure 15) (178). Les vaisseaux des ganglions lymphatiques sont organisés en réseau très fin de sorte que la surface de contact avec le tissu adipeux soit importante pour récupérer les produits lipolytiques relargués par les adipocytes adjacents dans l’espace extracellulaire. Dans le tissu adipeux viscéral et dans la moelle osseuse, les tissus lymphoïdes sont également en contact direct avec les adipocytes. Les expérimentations animales démontrent que l’inflammation chronique peut entraîner une altération de la composition en acides gras et une hypertrophie 60 des tissus adjacents particulièrement l’omentum et le mésentérique (179). Mais ces interactions paracrines restent difficiles à déterminer/observer chez l’humain, étant donné qu’elles n’ont pas de répercutions sanguines. Cependant, elles jouent certainement un rôle dans certains changements de distribution des tissus adipeux associés à l’inflammation chronique (174). Vaisseau lymphatique afférent Adipokines Cellules souches Cellules dendritiques Tissu adipeux péri ganglionnaire Adipocytes Capsule Sinus Ganglion lymphatique Cortex Figure15: Anatomie du tissu adipeux entourant les ganglions lymphatiques d’après Knight et al. (178) II-4.2 Les cellules immunitaires au sein du tissu adipeux Les macrophages du tissu adipeux Il est décrit dans la littérature que des macrophages sont présents dans le tissu adipeux, depuis 2003, où il a été montré une augmentation de l’expression des gènes relatifs aux macrophages dans le tissu adipeux de divers modèles animaux obèses (163, 180) tandis que 61 des expériences d’immunohistochimie révélaient des corrélations positives entre les marqueurs F4/80 et CD68 et le poids et la taille des adipocytes chez la souris et chez l’homme (180). Ces résultats ont été confirmés chez l’homme (99, 181, 182) en microscopie et par des expériences de cytométrie en flux révélant qu’environ 10% de la FSV du tissu adipeux de l’homme était constituée de macrophages CD14+ (99) et qu’ils étaient positivement corrélés avec l’IMC. Les expériences d’immunohistochimie ont montré que les macrophages étaient localisés en couronne autour des adipocytes (180). Les récentes études menées chez la souris sur la caractérisation des macrophages du tissu adipeux ont montré qu’il existait des macrophages M1 recrutés ainsi que des M2 résidents impliqués respectivement dans la promotion et l’atténuation de l’insulinorésistance. Dans plusieurs modèles de souris obèses, il a été montré que les macrophages recrutés M1 étaient dans un état plus pro-inflammatoire que la population résidente M2 observée chez les souris contrôles. De plus, ces macrophages recrutés expriment les marqueurs de surface F4/80, CD11b et CD11c et sont organisés en agrégats entourant les adipocytes nécrotiques tandis que les résidents sont plus interstitiels (183, 184). Les résultats de notre équipe montrent que les macrophages du tissu adipeux humain expriment des marqueurs M1 et M2, et que seuls les macrophages M2 résidents (CD14+CD206+CD16-) s’accumulent avec l’obésité. De plus, avec l’augmentation de l’IMC les macrophages diminuent leur expression de marqueurs M1 au profit de marqueurs M2 (185). Ces résultats sont en accord avec les travaux de Zeyda et al. qui montrent que les macrophages du tissu adipeux (CD14+CD206+) sont dans un état anti-inflammatoire tout en étant capables de produire des médiateurs pro-inflammatoires (186). Dans le tissu adipeux viscéral, cette accumulation de macrophages est augmentée et positivement corrélée avec les paramètres cliniques de comorbidité de l’obésité (152, 182). Ces travaux montrent que la polarisation des macrophages dans le tissu adipeux humain n’est pas clairement orientée dans 62 une voie. Ainsi les phénotypes observés diffèrent entre les modèles animaux et l’homme. Il est important de rester critique quant à l’obésité génétique chez l’animal ou celle induite par un régime gras. Il se peut qu’elle ne soit pas toujours un modèle représentatif de l’obésité et de l’état inflammatoire chronique associé qui se sont installés au cours des ans chez les patients obèses. Les lymphocytes du tissu adipeux Bien que les macrophages aient fait l’objet de nombreuses études, leurs principaux partenaires cellulaires au cours d’une réaction immunitaire c’est à dire les lymphocytes n’ont été que partiellement étudiés chez l’animal et très peu chez l’homme. Les récentes données sur le sujet sont décrites dans la revue suivante. 63 Revue: Les lymphocytes du tissu adipeux (soumis) 64 Les lymphocytes T du tissu adipeux The adipose tissue T lymphocytes Carine Duffaut, Virginie Bourlier et Anne Bouloumié Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n°1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France 1 Résumé L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de ces conditions pathologiques. Le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que source et site de l’inflammation. Les macrophages ont été clairement impliqué dans la genèse de l’état inflammatoire du tissu adipeux mais récemment certaines données mettent en lumière une autre population cellulaire immune : les lymphocytes T. Cette revue décrit les observations relatives aux relations entre adipocytes et lymphocytes T, présente les données montrant une accumulation des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité et propose des mécanismes impliqués dans cette accumulation. Le rôle potentiel des lymphocytes du tissu adipeux dans la genèse des pathologies associées à l’obésité est décrit. 2 Abstract Obesity and more specifically the accumulation of adipose tissue in the visceral and abdominal subcutaneous locations is a well defined risk factor for cardiovascular pathologies such as hypertension and atherosclerosis and metabolic disorders such as type 2 diabetes. In the last few years, the concept of metabolic triggered inflammation has emerged as a major process responsible for the clustering of these conditions. The adipose tissue appears as a key player as site and source of inflammation. The macrophages have clearly been involved in the genesis of the inflammatory state of the fat mass. However recently, evidences have shed new light on another immune cell population, i.e. the adipose tissue T lymphocytes. The present review describes the observations that are relative to the inter-relation between adipocytes and T lymphocytes, to the accumulation of T lymphocytes within the adipose tissue with obesity and the mechanisms underlying such a process as well as the potential pathogenic role of the adipose tissue T lymphocytes. 3 Introduction L’obésité et plus spécifiquement l’accumulation de tissu adipeux dans les localisations viscérale et sous-cutanée abdominale est un facteur de risque majeur pour le développement de pathologies cardiovasculaires dont l’hypertension et l’athérosclérose, et de désordres métaboliques tels que le diabète de type 2. Au cours de ces dernières années, le concept d’inflammation métabolique a émergé comme un processus clé impliqué dans l’ensemble de ces conditions pathologiques [1]. Alors que divers organes métaboliquement actifs tels que le foie, le muscle et plus récemment l’intestin et la flore intestinale jouent certainement un rôle dans la genèse et l’entretien de cet état inflammatoire chronique de bas niveau associé à l’obésité, le tissu adipeux apparaît comme un acteur clé en tant que source et site de l’inflammation [2]. L’accumulation de macrophages dans le tissu adipeux a été bien décrite dans les conditions d’obésité dans des modèles murins et chez l’homme. De plus, l’acquisition d’un phénotype inflammatoire par les macrophages du tissu adipeux a été directement impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline systémique chez la souris. Finalement, le lien causal entre l’inflammation et la résistance à l’insuline a été mis en évidence par l’utilisation de modèles murins invalidés spécifiquement dans les cellules progénitrices myéloides pour des gènes impliqués dans la transduction du signal intracellulaire de la réponse inflammatoire [1]. Récemment, certains travaux suggèrent que les cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement les lymphocytes T pourraient également jouer un rôle dans l’établissement de l’état inflammatoire associé à l’obésité et dans la genèse des pathologies qui lui sont associées [3]. Les lymphocytes et le tissu adipeux Les relations entre tissu adipeux et lymphocytes sont décrites depuis les travaux de C Pond concernant les interactions entre ganglions lymphatiques et tissu adipeux [4]. En effet d’un point de vue anatomique; les ganglions lymphatiques sont intégrés dans le tissu adipeux, 4 caractéristique conservée uniquement chez les mammifères. Le tissu adipeux périganglionaire est considéré comme une réserve énergétique dédiée au fonctionnement du ganglion lymphatique. Les adipocytes péri-ganglionnaires ont été montrés comme accumulant de façon sélective certains acides gras notamment poly insaturés, précurseurs essentiels des eicosanoïdes et des docosanoïdes, second messagers majeurs des cellules immunes. De plus, ces adipocytes sont sensibles aux stimulations lipolytiques du tumor necrosis factor alpha (TNFα) et d’interleukine 6 (IL-6) sécrétés par les cellules immunes. Ainsi les échanges locaux entre adipocytes et lymphocytes permettraient d’affranchir partiellement la fonction immune des changements quantitatif et qualitatif nutritionnels [5]. En retour, la leptine, adipokine majeure produite spécifiquement par les adipocytes de façon dépendante de leur taille, exerce des effets puissants sur les lymphocytes [6]. Les souris déficientes en leptine (ob/ob) ou en récepteur à la leptine (db/db) présentent de nombreuses anormalités au niveau de leurs systèmes lymphocytaires [7] dont une involution du thymus et une hypo activation des lymphocytes T. Chez l’homme, la déficience congénitale en leptine est associée avec une lymphopénie et une diminution de la réponse T [8]. La leptine serait ainsi impliquée dans le contrôle de la prolifération, de la différenciation et de l’activation des lymphocytes T de type Th1 [6]. Accumulation de lymphocytes T dans le tissu adipeux avec l’obésité Les lymphocytes constituent une famille étendue de types cellulaires distincts impliqués dans l’immunité adaptative et innée. La présence de lymphocytes résidents dans le stroma de tissu adipeux de rongeurs a été montrée par des analyses en cytométrie en flux sur la fraction stroma-vasculaire de dépôts adipeux sous-cutanés et épidydimaires [9]. De façon intéressante, les dépôts adipeux présentent une répartition différente des populations de lymphocytes selon leur localisation, avec une prédominance des lymphocytes du système inné (lymphocytes γδ, les cellules natural killer (NK) et NKT) dans les dépôts épididymaires alors que les dépôts 5 sous-cutanés montrent une majorité de lymphocytes du système adaptatif (lymphocytes B et T) [9]. Le développement de l’obésité chez la souris soumise à un régime enrichi en lipides ou dans des modèles d’obésité génétique s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T (CD3+) présents dans le tissu adipeux qui s’organisent en clusters autour de certains adipocytes [10,11, 12]. Toutefois ces données restent controversées [9, 13]. De plus, la nature même des lymphocytes T qui s’accumulent avec l’obésité reste à être clairement définie puisque certaines données suggèrent un effet spécifique aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ [11] alors que d’autres travaux décrivent l’accumulation conjointe de lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques CD8+ [12, 14]. Les différentes méthodes d’identification des types cellulaires par immunohistochimie, cytométrie en flux et/ou expression génique de marqueurs spécifiques lymphocytaires associées à une expression des résultats normalisée par surface adipocytaire, par gramme de tissu et/ou par dépôt entier peuvent être à l’origine des résultats divergents. Le fond génétique des souris mais également le type de régime hyperlipidique et la période de mise sous régime peut également influencer l’accumulation de lymphocytes dans le tissu adipeux. Nos résultats montrent que sous un fond génétique C57Bl6 avec un régime composé à 40% de lipides; les lymphocytes T et B, identifiés par cytométrie en flux et dont le nombre est exprimé par dépôt épidydimaire entier, présentent un trafic cellulaire dans le tissu adipeux qui est fonction de la période de mise sous régime [15]. Enfin des différences sexuelles et territoriales ont été mises en évidence avec une infiltration lymphocytaire plus marquée chez les mâles que chez les femelles [10] et plus importante dans les tissus périgonadiques que sous-cutanés [16]. Concernant les études chez l’homme, une accumulation de lymphocytes CD3+ a été mise en évidence par des analyses d’expression géniques de marqueurs de lymphocytes T [11] et des analyses d’immunohistochimie [17] [18] dans les tissus adipeux sous-cutanés et viscéraux de patients obèses par rapport à des patients normopondérés. 6 Les chimiokines et leurs récepteurs représentent un élément critique dans le trafic cellulaire immun. Le tissu adipeux produit de nombreuses chimiokines dont la production est modulée par le degré d’obésité. RANTES (Regulated upon activation normal T cell express sequence) et SDF1α (Stromal derived factor 1) ont été suggéré comme pouvant jouer un rôle dans l’adressage des lymphocytes au tissu adipeux. En effet, les expressions de RANTES et de son récepteur CCR5 sont augmentées avec l’obésité dans des modèles murins et chez l’homme [10]. La chimiokine SDF-1α est exprimée dans les cellules de la fraction stroma-vasculaire chez l’homme [11, 19] et via son interaction avec son récepteur CXCR4 pourrait favoriser l’accumulation de lymphocytes dans le tissu adipeux [11]. Récemment, la production par des préadipocytes murins différenciés de deux chimiokines spécifiques des lymphocytes, IP-10 et MIG, ont été décrites en réponse à des stimulations par des facteurs lymphocytaires [12]. Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux pourraient participer à une boucle d’auto-recrutement via leurs effets stimulateurs sur les adipocytes. Enfin, une molécule d’adhésion exprimée à la surface endothéliale VAP1/SSAO semble jouer un rôle déterminant dans l’infiltration des lymphocytes dans le tissu adipeux puisque la souris invalidée pour ce gène présente une accumulation réduite des lymphocytes dans le tissu adipeux avec l’obésité [20]. Phénotype et rôles des lymphocytes T du tissu adipeux Les lymphocytes T effecteurs sont considérés comme des éléments clés dans le contrôle de l’évolution de la cascade inflammatoire selon le type de cytokines prédominantes qu’ils produisent. De façon classique, les lymphocytes T de type Th1 vont orienter la réponse vers une immunité à médiation cellulaire stimulant les cellules présentatrices d’antigènes dont les macrophages alors que les lymphocytes T de type Th2 dirigent une réponse à médiation humorale en stimulant la production d’anticorps par les lymphocytes B. La démonstration de la production plus importante d’interféron gamma (IFNγ), cytokine marqueur d’un état Th1, par les lymphocytes T activés de tissu adipeux de souris obèses par rapport aux souris 7 contrôles [12] suggère que les lymphocytes T du tissu adipeux obèse présentent un phénotype de type Th1. Chez l’homme, aucune étude directe n’a été réalisée, cependant une corrélation positive entre l’expression de l’ IFNγ et l’index d’adiposité (tour de taille) a été montrée [11]. Le rôle des lymphocytes du tissu adipeux reste à être clairement établi, notamment lorsque l’on considère que leur nombre dans le tissu adipeux est très inférieur à celui des macrophages. Cependant certaines observations ont suggéré leur implication en tant que orchestrateur de la réponse inflammatoire associée à l’obésité. En effet, des études cinétiques réalisées chez la souris soumises à un régime hyperlipidique montrent que l’accumulation des lymphocytes précède celle des macrophages [11,15]. De plus, les souris invalidées pour l’IFNγ présentent une inflammation réduite du tissu adipeux et une meilleure sensibilité à l’insuline. L’IFNγ stimule sur les lignées préadipocytaire murine l’expression de diverses chimiokines dont MCP-1 [11,12]. En plus de ces effets médiés par des facteurs solubles, les lymphocytes interagissent avec les adipocytes via des contacts cellules/cellules impliquant le couple CD40 ligand/CD40 exprimé par les adipocytes humains [17]. Ainsi, les lymphocytes pourraient, par la stimulation de la production de chimiokines adipocytaires, être à l’origine de l’infiltration macrophagique du tissu adipeux, macrophages eux-mêmes impliqués dans le développement de la résistance à l’insuline. Les travaux récents réalisés sur des souris présentant une hyperlipidémie due à un fond ApoE-/- associée à une suractivation du type Th1 des lymphocytes dus à la perte du contrôle exercé par le TGFβ (CD4dnTbR) apportent quelques éléments en faveur d’une telle hypothèse. En effet, les souris maigres CD4dnTbR ApoE-/- présentent une inflammation marquée dans le tissu adipeux similaires à celle d’animaux obèses [21]. Il est toutefois à noter que la sensibilité à l’insuline n’est pas modifiée dans ce modèle. Il serait donc intéressant d’étudier ce modèle placé en régime hyperlipidique afin de définir réellement l’impact des lymphocytes activés Th1 sur la résistance à l’insuline induite pas l’obésité. Afin de définir le rôle potentiel des lymphocytes dans l’accumulation macrophagique du tissu adipeux, les souris invalidées pour le gène RAG2 (conduisant à une 8 absence de maturité des lymphocytes T et B) ont été placées en régime hyperlipidique. Les souris immunodéficientes développent une obésité et une résistance à l’insuline similaire à celles des souris sauvages [15]. Par contre, une augmentation drastique des cellules NK, autres cellules productrices d’interféron gamma, et des macrophages est observée dans le tissu adipeux des souris RAG2-/- [15]. Donc les lymphocytes T ne sont pas les seules cellules causales de l’inflammation associées avec l’obésité. Leur absence pourrait être compensée par une accumulation des cellules NK. De plus, ces résultats suggèrent que les lymphocytes pourraient être des éléments protecteurs contre le développement d’une réaction inflammatoire innée excessive dans le tissu adipeux lors de l’obésité induite par un régime hyperlipidique. Enfin une étude a suggéré que le tissu adipeux péri-vasculaire est un réservoir pour les cellules T effectrices activées qui pourraient en retour promouvoir une dysfonction vasculaire et l’hypertension [22]. Ainsi des interactions locales entre adipocytes et lymphocytes T pourraient également participer à la genèse des pathologies vasculaires. Conclusion L’ensemble des travaux récents réalisés sur différents modèles murins mettent en lumière l’implication potentielle des cellules de l’immunité adaptative et plus particulièrement des lymphocytes T dans le développement de l’inflammation du tissu adipeux associée à l’obésité et dans la genèse des pathologies associées à l’obésité. Le développement du tissu adipeux dans les modèles murins d’obésité induite par un régime hyperlipidique ou génétique s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T qui présentent une activation de type Th1. Par leur production de facteurs solubles pro-inflammatoires et via des contacts cellules/cellules, les lymphocytes T pourraient moduler le phénotype inflammatoire des adipocytes et participer au développement des pathologies associées à l’obésité (Figure). Cependant les différences de fond génétique, du type et de la période de régime doivent être 9 prises en compte afin de mieux définir le rôle de cette population cellulaire dans l’établissement de l’obésité et des pathologies associées. Les données obtenues chez l’homme sont moins nombreuses et nécessitent d’être approfondies. Les résultats obtenus sur les macrophages du tissu adipeux montrent que ces cellules immunes ne présentent pas le même phénotype dans les modèles murins et chez l’homme. En effet, le phénotype des macrophages du tissu adipeux murin obèse est très clairement polarisé M1 inflammatoire [23] alors que chez l’homme leurs caractéristiques sont celles de cellules impliquées dans des réactions inflammatoires chroniques (phénotype mixte inflammatoire et pro-angiogénique) [24]. Ainsi la définition du phénotype des lymphocytes qui s’accumulent dans le tissu adipeux humain, les mécanismes responsables de cette accumulation, i.e. recrutement actif et/ou prolifération locale, et leurs rôles restent à être clairement définis. 10 Références [1] G. S. Hotamisligil, Inflammation and metabolic disorders, Nature 444 (2006) 860-867. [2] A. Bouloumie, C. A. Curat, C. Sengenes, K. Lolmede, A. Miranville, and R. Busse, Role of macrophage tissue infiltration in metabolic diseases, Curr Opin Clin Nutr Metab Care 8 (2005) 347-354. [3] A. Bouloumie, L. Casteilla, and M. 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Monocytes VAP1/SSA0, SDF-1α Sang Cellules endothéliales Tissu adipeux RANTES, SDF1α, IP-10, MIG Lymphocytes CD3+ CD4+ Th1 / CD8+? Macrophages Prolifération locale? IFNγ, autres? ? Adipocytes Interactions croisées locales? Objectifs Les données de la littérature suggèrent de très fortes interactions entre le système métabolique et le système immunitaire au niveau des réponses inflammatoires aussi bien que dans la régulation du métabolisme. Le tissu adipeux est lui-même le siège d’une réponse inflammatoire de bas niveau et de l’accumulation de cellules immunes. La présence de lymphocytes dans le tissu adipeux humain a été très peu étudiée et les phénotypes précis ainsi que l’état inflammatoire de ces lymphocytes n’est pas décrit. Comme nous l’avons vu en introduction, les populations de l’immunité adaptative sont variées et les marqueurs qu’elles expriment sont indicateurs de leurs fonctions. Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes attachés à caractériser précisément les lymphocytes présents dans le tissu adipeux de manière qualitative et quantitative. Les types de cellules nous informent sur l’état d’activation inflammatoire dans lequel ils se trouvent au sein du tissu adipeux humain et nous permettent d’émettre des hypothèses quant à leur rôle potentiel sur le métabolisme et dans le développement de l’obésité. Nous avons également étudié ces variations de phénotype en fonction de l’IMC et de la localisation du tissu adipeux (viscéral versus sous cutané) sur un grand nombre de patients. De plus, nous avons tenté d’apporter des précisions sur leurs rôles potentiels au sein du tissu adipeux via des effets des sécrétions de ces cellules sur les autres cellules du tissu adipeux (les macrophages, les cellules progénitrices et les adipocytes). L’utilisation de modèles animaux en régime enrichi en lipides pendant des temps variables nous a permis d’étudier les lymphocytes mais aussi les autres populations immunes dans le développement précoce de l’obésité. Enfin, l’étude de modèles déficients en lymphocytes nous renseigne sur le rôle potentiel des lymphocytes sur le développement de l’obésité et sur le recrutement des autres cellules immunitaires dans le tissu adipeux. 65 Partie 2: Résultats 66 I Caractérisation des lymphocytes du tissu adipeux humain et de leur rôle sur le métabolisme et la différenciation adipocytaire Nous avons tout d’abord étudié la présence de lymphocytes dans le tissu adipeux d’un grand nombre de patients d’indice de masse corporelle (IMC) variés ayant eu recours à la lipoaspiration ou à la dermolipectomie abdominale, par des expériences de cytométrie en flux et d’immunohistofluorescence. Ces expériences nous permettent de déterminer la localisation des lymphocytes au sein du tissu, les sous-populations de lymphocytes présents dans le tissu adipeux ainsi que les modulations de leurs nombres avec l’index d’adiposité (défini par l’IMC). D’autre part, un second groupe de patients obèses morbides ayant eu recours à la chirurgie bariatrique nous donne accès à des prélèvements pairés de tissu sous-cutanés et viscéraux. Ainsi nous avons pu explorer si la localisation viscérale reconnue pour être plus délétère en terme de syndrome métabolique (187) affecte le nombre ainsi que les caractéristiques des lymphocytes présents au sein du tissu adipeux. Afin de compléter cette caractérisation, des analyses des transcrits exprimés par les lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par une technique d’immunosélection/déplétion comparés à des lymphocytes sanguins, nous renseignent sur l’état inflammatoire et la polarisation des lymphocytes présents dans le tissu adipeux, ainsi que sur les variations de ces paramètres avec l’index d’adiposité. Une fois cette caractérisation achevée, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel des lymphocytes dans le tissu adipeux en terme de régulation de la différenciation et du métabolisme adipocytaire en étudiant les effets de facteurs solubles des lymphocytes du tissu adipeux humain sur l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31-, sur la lipolyse et la lipogenèse des adipocytes matures. 67 Enfin nous avons étudié les cytokines et les chimiokines sécrétées par les adipocytes humains matures et les autres cellules de la fraction stroma-vasculaire (cellules progénitrices, macrophages, cellules endothéliales) qui pourraient interagir avec les lymphocytes afin de tenter d’expliquer le recrutement et la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux. 68 Article 1 Interplay between human adipocytes and T lymphocytes in obesity: CCL20 as an adipochemokine and T lymphocytes as lipogenic modulators Dans ce manuscrit, nous avons caractérisé les lymphocytes dans le tissu adipeux humain souscutané de patients avec des indices de masse corporelle variables et nous avons regardé l’impact de la localisation viscérale et sous-cutanée du tissu adipeux de patients obèses morbides sur leur nombre et sous-types. Puis nous avons étudié l’effet des facteurs solubles issus des lymphocytes T du tissu adipeux humain sur la lipolyse et sur la lipogenèse des adipocytes matures humains d’une part, et défini d’autre part, une voie potentielle de recrutement des lymphocytes via le système CCL20-CCR6. 69 Interplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytes in Obesity: CCL20 as an Adipochemokine and T Lymphocytes as Lipogenic Modulators Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie Maumus, Patrick Chiotasso, Coralie Sengenès, Max Lafontan, Jean Galitzky and Anne Bouloumié Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009;29;1608-1614; originally published online Jul 30, 2009; DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.192583 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology is published by the American Heart Association. 7272 Greenville Avenue, Dallas, TX 72514 Copyright © 2009 American Heart Association. All rights reserved. Print ISSN: 1079-5642. Online ISSN: 1524-4636 The online version of this article, along with updated information and services, is located on the World Wide Web at: http://atvb.ahajournals.org/cgi/content/full/29/10/1608 Data Supplement (unedited) at: http://atvb.ahajournals.org/cgi/content/full/ATVBAHA.109.192583/DC1 Subscriptions: Information about subscribing to Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology is online at http://atvb.ahajournals.org/subscriptions/ Permissions: Permissions & Rights Desk, Lippincott Williams & Wilkins, a division of Wolters Kluwer Health, 351 West Camden Street, Baltimore, MD 21202-2436. Phone: 410-528-4050. Fax: 410-528-8550. E-mail: [email protected] Reprints: Information about reprints can be found online at http://www.lww.com/reprints Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Interplay Between Human Adipocytes and T Lymphocytes in Obesity CCL20 as an Adipochemokine and T Lymphocytes as Lipogenic Modulators Carine Duffaut, Alexia Zakaroff-Girard, Virginie Bourlier, Pauline Decaunes, Marie Maumus, Patrick Chiotasso, Coralie Sengenès, Max Lafontan, Jean Galitzky, Anne Bouloumié Objective—Adipose tissue (AT) plays a major role in the low-grade inflammatory state associated with obesity. The aim of the present study was to characterize the human AT lymphocytes (ATLs) and to analyze their interactions with adipocytes. Methods and Results—Human ATL subsets were characterized by flow cytometry in subcutaneous ATs from 92 individuals with body mass index (BMI) ranging from 19 to 43 kg/m2 and in paired biopsies of subcutaneous and visceral AT from 45 class II/III obese patients. CD3⫹ ATLs were composed of effector and memory CD4⫹ helper and CD8⫹ cytotoxic T cells. The number of ATLs correlated positively with BMI and was higher in visceral than subcutaneous AT. Mature adipocytes stimulated the migration of ATLs and released the chemokine CCL20, the receptor of which (CCR6) was expressed in ATLs. The expression of adipocyte CCL20 was positively correlated with BMI and increased in visceral compared to subcutaneous adipocytes. ATLs expressed inflammatory markers and released interferon gamma (IFN␥). Progenitor and adipocyte treatment with ATL-conditioned media reduced the insulinmediated upregulation of lipogenic enzymes, an effect involving IFN␥. Conclusions—Therefore, crosstalk occurs between adipocytes and lymphocytes within human AT involving T cell chemoattraction by adipocytes and modulation of lipogenesis by ATLs. (Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29:1608-1614.) Key Words: inflammation 䡲 visceral fat 䡲 macrophages 䡲 T lymphocyte subsets 䡲 CCR6 A dipocytes are the site of metabolic activity of adipose tissue (AT) ie, lipogenesis that corresponds to lipid storage and lipolysis that is responsible for triglyceride hydrolysis). In humans, lipogenesis is promoted by insulin, whereas lipolysis is mainly under the control of catecholamines.1 Besides their metabolic activity, adipocytes produce a wide range of factors grouped under the term adipokines. Obesity is associated with alterations of the metabolic and secretory activities of adipocytes and is characterized by a chronic low-grade inflammatory state.2 Chronic inflammation within the fat mass itself has been suspected to play a major role in systemic inflammation. Initial studies, focused on the myeloid cells (monocytes, macrophages and dendritic cells), have shown AT accumulation of these cells in obese conditions in both mice and humans.3–5 In mice, acquisition of a proinflammatory phenotype by the AT macrophages (ATMs) has been linked to the development of insulin resistance.6 In human obesity, however, ATMs appeared less polarized with proangiogenic abilities, hallmarks of cells involved in chronic nonresolved inflammatory processes.7 Murine fat depots contain lymphoid cells from the innate (natural killer [NK] cells, NKT cells and ␥␦T cells) and the adaptive (␣T and B cells) immune systems.8 Recent studies have described the accumulation of CD3⫹ T lymphocytes in the AT of obese mice9 –12 and patients.13 However, there are no data on the subsets and activation state of lymphocytes present in human AT. Chemokine secretion by adipocytes may promote lymphocyte homing within AT. Although T cell chemoattractants such as CCL5 and CXCL12 have been described to be expressed within AT,9,13 their cellular origin as well as the modulation of their expression according to adiposity are still unclear. The work of Pond et al has stressed the close interactions between lymphoid cells in lymph nodes and the surrounding AT in rodents.14 Recently, in mice models, lymphocytes have been involved in the regulation of the inflammatory response and insulin resistance associated with obesity through their production of interferon gamma.11 The present study was undertaken to characterize human ATLs in term of subsets and activation state and relate this with the degree of adiposity and anatomic location in human AT. The interrelation between Received March 11, 2009; revision accepted July 22, 2009. From the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France, Université Toulouse III Paul Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n°1 AVENIR (C.D., A.Z.-G., V.B., P.D., M.M., C.S., M.L., J.G., A.B.), Chirurgie générale et digestive (P.C.), CHU Purpan, Toulouse, France. Correspondence to Anne Bouloumié, Equipe 1 AVENIR/INSERM U858, Hôpital Rangueil Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France. E-mail [email protected] © 2009 American Heart Association, Inc. Arterioscler Thromb Vasc Biol is available at http://atvb.ahajournals.org DOI: 10.1161/ATVBAHA.109.192583 1608 Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells human ATLs and mature adipocytes was studied in terms of adipocyte-derived T cell chemoattractant and ATL-mediated metabolic effects. Materials and Methods Materials Chemicals were purchased from Sigma. Collagenase NB4 was purchased from Serva. Selection kits for CD34⫹, CD14⫹, and CD3⫹ cells were purchased from StemCell Technologies, and magnetic microbeads coupled with anti-CD31 antibodies were purchased from Dynal Biotech (Invitrogen). Culture media were from purchased Promocell. Antibodies for flow cytometry analysis were purchased from BD Biosciences. Isolation of the Stroma-Vascular Fraction (SVF) and Mature Adipocytes Human subcutaneous adipose tissue (AT) was obtained from healthy women undergoing elective procedures of fat removal for esthetic purposes. Their body mass index (BMI) ranged from 19 to 43 kg/m2 (n⫽92, mean BMI⫽27.2⫾0.6kg/m2, mean age⫽42.6⫾1.2 years). In addition, paired human omental and subcutaneous tissues were obtained from a group of class II/III obese nondiabetic patients undergoing bariatric surgery (n⫽45, 41 women/4 men, mean BMI⫽43⫾1kg/m2, mean age⫽42⫾1 years). The protocols of fat collection were approved by the Institutional Research Board of INSERM and Toulouse University Hospital Ethics committee. The cells from the stroma-vascular fraction (SVF) and mature adipocytes from human AT were obtained after collagenase digestion as previously described.5 Isolation of Human Adipose Tissue Lymphocytes The cells of the human AT-SVF were isolated using an immunoselection/depletion protocol as previously described5,15 with modifications to isolate the CD3⫹ ATLs. Briefly, after depletion of the progenitor cells (CD34⫹/CD31⫺) and AT macrophages (ATMs; CD34⫺/CD14⫹) from the AT-SVF, the CD34⫺/CD14⫺ cells were incubated with a CD3⫹ Stem Cell System positive cocktail (Grenoble;15 minutes at room temperature). After the addition of nanoparticles, cells were recovered by successive magnetic sorting steps. Freshly isolated CD34⫺/CD14⫺/ CD3⫹ defined as ATLs were counted, and either lysed (Qiagen) and stored at ⫺20°C until mRNA extraction, analyzed by flow cytometry, or cultured. Conditioned media (CM) from ATLs and ATMs were collected after 24-hour plating of the cells (200 000 to 250 000 cells/cm2) in basal medium (ECBM/0.5% bovine serum albumin free fatty acidsfree [FFA-free BSA]), centrifuged (20 000g, 3 minutes, room temperature), and the media was stored at ⫺20°C until further use. To isolate human blood CD3⫹ cells, peripheral blood was collected in heparinized tubes from 5 donors (3 women/2 men; mean BMI⫽20.7⫾0.6kg/m2; mean age⫽35⫾4 years). After isolation of blood mononuclear cells and removal of platelets by successive centrifugations, macrophages were depleted using magnetic CD14⫹ beads (Myltenyi Biotec), and the CD3⫹ cells were selected on the CD14 negative cell fraction with the same protocol described for the AT CD3⫹ cells. The blood CD3⫹ cells were then lysed (Qiagen) and stored at ⫺20°C until mRNA extraction. Flow Cytometry Analysis Human SVF cells, ATLs, or blood cells (100 000 cells) were incubated with FITC- (CD4, ␥␦TCR, CD25, CD62L) PerCP(CD45), PECy7- (CD45-RO), PE- (CD3, CD14, CD45-RA), APC(CD8, CD19, CD56) conjugated antibodies or respective isotype controls. For IFN␥ intracellular staining, ATLs were incubated in the presence or absence of brefeldin-A (BD Biosciences) and stained with FITC-CD4, PECy7-IFN␥ and APC-CD8 antibodies or respective isotype controls. Analyses were performed using a FACSCalibur flow cytometer and CellQuest Pro software (BD Bioscience). 1609 Confocal Fluorescence Microscopy Analyses After 1-hour fixation in 4% paraformaldehyde and extensive washing steps in PBS, pieces of human subcutaneous AT was incubated for 30 minutes at room temperature in PBS/2% BSA followed by a 2-hour incubation with the rabbit polyclonal antibody directed against human CD3 (Dako) (1:20). After washing (PBS/0.2% Tween and PBS) and 1-hour incubation with anti-rabbit antibody coupled to AlexaFluor488 (Invitrogen) (1:200), the tissues were placed on slides and a 3-dimensional reconstruction was performed using a Zeiss LSM 510 META confocal microscope. Lipolysis and Modulation of Lipogenic Enzyme Expression in Mature Adipocytes and Progenitor Cells For lipolysis measurement, mature adipocytes obtained after collagenase digestion of subcutaneous AT were plated in fibrin gels as previously described.5 After gel polymerization, basal medium, ATM-CM, or ATL-CM were added. After 24-hour incubation pharmacological agents (0.1 mol/L isoprotenerol [ISO] or 10 mol/L noradrenaline [NA]) were added to the media for 90 minutes at 37°C. At the end of the incubation period, aliquots of the media were taken for glycerol and FFA determination (Sigma-Aldrich and Wako Unipath, respectively). Total lipid content was determined gravimetrically after solvent extraction. For gene expression analysis, mature adipocytes in fibrin gels were treated with basal medium in the presence or absence of 50 ng/mL human recombinant IFN␥ or with ATL-CM in the presence or absence of 2 g/mL neutralizing antihuman IFN␥ antibody or its isotype control (BD Bioscience) or with ATM-CM. After overnight incubation, 0.1 mol/L insulin was or not added for 24 hours. Media was then removed and adipocytes were lysed in Qiazol (Qiagen) (v/v) for mRNA extractions. Freshly harvested AT-progenitor cells (CD34⫹/CD31⫺) were plated at a density of 120 000 cells/cm2 in ECBM supplemented with 10% fetal calf serum (FSC) for 24 hours at 37°C in an atmosphere of 5% CO2. Adipogenic differentiation was induced in defined medium (ECBM supplemented with 66 nmol/L Insulin, 10 g/mL Transferrin, 1 nmol/L Triiodothyronine, 1 g/mL Rosiglitazone, and 100 nmol/L cortisol). Cells were cultured either in a mixture (v/v) of 2⫻ defined medium and ATL-CM or in a mixture (v/v) of 2⫻ defined medium and ECBM/0.1% BSA (control). Media were changed every 4 days. At day 8, cells were lysed by sonication in PBS/0.2% Tween, and the triglyceride content was determined (GPO-trinder kit, Sigma, respectively), or lysed in Qiazol for mRNA extraction. Migration Assays Human ATL migration was assessed on 3 m-pore HTS FluoroBlock inserts (Falcon). After labeling for 60 minutes with 10 mol/L Calcein AM, ATLs (20 000 cells in 300 L ECBM/0.1%BSA) were incubated in the upper side of the insert and 800 L mature adipocyte-conditioned media, or conditioned media without cells (control) was added to the companion plate under the insert. ATL migration was evaluated by counting the number of labeled lymphocytes attached to the lower surface of the wells after 4 hours. Cytokine Detection The RayBio Human Cytokine antibody Array V (RayBiotech Inc, Cliniscience) provides antibody array membranes to detect expression of 79 cytokines. The experiment was performed according to the manufacturer’s instructions. Briefly, 1 mL of conditioned medium by human mature adipocytes originating (n⫽6) maintained in fibrin gels for 24 hours was added to the antibody-coated membrane and incubated on a plate shaker at 4°C overnight. After incubation with biotinylated antibodies and labeled streptavidin, the signal was detected from the membrane by chemiluminescence using Chemismart 3000 (Vilbert LourmatFrance). Data analysis was performed using Bio1D software (Vilbert Lourma). Positive controls were used to normalize the results from different membranes. Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 1610 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009 RNA Extraction and Real-Time PCR Total RNA was extracted from ATLs, adipocytes. and progenitor cells using the RNeasy kit (Qiagen). The RNA concentration was measured either by a spectrophotometer nanodrop威 ND-1000 (Labtech) or by fluorimetric assay (Ribogreen, Invitrogen). The RNA was reversetranscribed using the “Superscript II” kit (Invitrogen). Reverse transcription was also performed without the superscript enzyme on RNA samples to ensure the absence of contaminating genomic DNA. Primers for tumor necrosis factor ␣ (TNF-␣), IFN␥, RANTES (CCL5), CCL20, (CCR6), interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-6, perforin-1 (PRF-1), phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1), fatty acid synthase (FAS), lipoprotein lipase (LPL), and leptin receptor (Leptin-R) were from Applied Biosystems (Hs00174128_m1, Hs00174143_m1, Hs00174575_m1, Hs00171125_m1, Hs00171121_m1, Hs00174114_m1, Hs00174122_m1, Hs00174131_m1, Hs00169473_m1, Hs00381459_m1, Hs00188012_m1, Hs00173425_m1, Hs00174497_m1, respectively). The amplification reaction was done in duplicate on 15 ng of the cDNA samples in a final volume of 20 L in 96-well reaction plates (Applied Biosystems) in a GeneAmp 7500 detection system (Applied Biosystems). All reactions were performed under the same conditions: 50°C for 2 minutes, 95°C for 10 minutes, 40 cycles of 95°C for 15 seconds, and 60°C for 1 minute. Results were analyzed with the GeneAmp 7500 software and all the values were normalized to the levels of 18S rRNA. Statistical Analysis Values are given as mean⫾SEM for (n) separate experiments. Correlations were performed using a Spearman rank correlation. Comparisons between groups were analyzed by ANOVA for experiments with more than 2 subgroups followed by post hoc tests and the nonparametric Mann–Whitney test or using the Student t test, when appropriate (Prism 4, GraphPad Software, USA). Differences were considered significant when P⬍0.05. Figure 1. Characterization of the lymphocyte subsets in the human subcutaneous adipose tissue. A, Multicolour FACS analyses were performed on the SVF of subcutaneous AT using CD14 –PE, CD3-PE, CD56-APC, and CD19-PerCP-Cy5.5 antibodies. Results are means⫾SEM (n⫽92 for CD14, CD3, and CD56; n⫽41 for CD19). B, Three-dimensional reconstitution of confocal fluorescence microscopy analyses of human adipose tissue with an antibody directed against CD3. The upper and lower views of CD3⫹ cell clusters surrounding three adipocytes are shown. C, Multicolor FACS analyses were performed on immunoselected AT CD3⫹ cells using CD4-FITC and CD8-APC antibodies. A representative dot plot is shown. D, Multicolor FACS analyses were performed on immunoselected AT CD3⫹ cells with CD4-FITC/CD8-APC/CD45RO-PeCy7/CD45RA-PE antibodies. Results are means⫾SEM (n⫽9). Results Characterization of the Lymphocyte Subsets in the Human Subcutaneous Adipose Tissue Flow cytometry analysis performed on the stroma-vascular fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of human subcutaneous adipose tissue (AT) (n⫽92, mean BMI⫽27.2⫾0.6kg/m2) showed 2 main CD45⫹ leukocyte populations. A predominant CD14⫹ macrophage population (19⫾1% of total SVF cells) was identified. The lymphocyte population was mainly composed of CD3⫹ T lymphocytes (6⫾0.5% of total SVF cells), a minor CD56⫹ NK cell population (1.5⫾0.1% of total SVF cells), and few CD19⫹ B-lymphocytes (Figure 1A). Three dimensional reconstitution of confocal fluorescence microscopy analyses using anti-CD3 antibody revealed the presence of CD3⫹ cells organized in clusters around adipocytes (Figure 1B). Some individual CD3⫹ cells were identified in the stroma and few in the capillaries (data not shown). Flow cytometry analyses performed under the same conditions on the AT-SVF and peripheral blood showed that the CD3⫹ cells identified in the AT exhibited a lower size but a higher granularity than the blood CD3⫹ cells (supplemental Figure IA). Moreover, the expressions of the homing receptor CD62L and the naı̈ve T cells CD45RA markers were markedly lower in the AT SVF CD3⫹ cells compared to peripheral blood (supplemental Figure IB). To analyze the subsets of human AT CD3⫹ T lymphocytes, CD3⫹ cells were immunoselected from freshly-harvested SVF after depletion of the CD34 (progenitor and capillary endothelial cells) and CD14 (macrophages) positive cells. Helper CD4⫹ and cytotoxic CD8⫹ T cells were the major CD3⫹ T-lymphocyte subsets (Figure 1C). A minor subset of NKT cells (CD3⫹/CD56⫹) and few, if any, regulatory CD25⫹ and immature ␥␦T lymphocytes were detected (data not shown). The helper CD4⫹ T cells were mainly memory (CD45RO⫹) as well as effector T cells (CD45RO⫺/RA⫺), whereas the CD8⫹ cells were mainly effector cells (Figure 1D). Influence of the Degree of Adiposity and Fat Anatomic Location on the Number of Human Adipose Tissue T Lymphocytes The number of AT lymphocytes (ATLs) determined by flow cytometry analysis of the SVF of the subcutaneous AT (n⫽92) increased with the degree of adiposity. Indeed, a statistically significant correlation was detected between the number of AT CD3⫹, CD4⫹, as well as CD8⫹ cells and the BMI of the individuals (data not shown). The patients were grouped according to BMI, and obese patients (BMI ⱖ30) exhibited a statistically significant higher numbers of AT CD3⫹, CD4⫹, and CD8⫹ than lean patients (BMI ⱕ25; Figure 2A through 2C). The number of CD56⫹-NK cells within the subcutaneous AT remained constant whatever the BMI (data not shown). The analysis of the SVFs of paired biopsies of subcutaneous and visceral ATs from class II/III obese patients (n⫽45, mean BMI⫽43⫾1kg/m2) showed that the number of CD14⫹ cells (adipose tissue macrophages, ATMs) was slightly higher in visceral compared with subcutaneous AT (1.2-fold, P⬍0.05, Figure 3A). The number of AT CD3⫹ cells showed a marked increase in the visceral depot (3-fold, P⬍0.001, Figure 3A), because of a clear enhanced effector CD8⫹ cell number and a moderate increase in memory CD4⫹ cell numbers (Figure 3B through 3D). Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells 1611 Figure 3. Influence of fat mass location on the number of lymphocytes in class II/III patients. Multicolor FACS analyses were performed on the SVF obtained from paired biopsies from subcutaneous (open bars) and visceral (filled bars) AT of class II/III obese patients using CD14-PE, CD3-PE, CD4-FITC, CD8-APC, CD45RO-PeCy7, and CD45RA-PE antibodies. A, Number of ATMs (CD14⫹) and ATLs (CD3⫹; n⫽45). B, Numbers of CD4⫹ and CD8⫹ ATLs (n⫽45; C and D) Number of memory (CD45RO⫹), naı̈ve (CD45RA⫹), and effector (CD45RO-/RA-) CD4⫹ and CD8⫹ ATLs (n⫽19). Results are means⫾SEM. *P⬍0.05, **P⬍0.01 visceral vs subcutaneous. Figure 2. Influence of the degree of adiposity on the number of lymphocytes in the subcutaneous adipose tissue. The number of AT lymphocytes (normalized per gram of AT) was determined in the subcutaneous AT-SVF by flow cytometry analyses using (A) CD3-PE, (B) CD3-PE/CD4 –FITC, (C) CD3-PE/CD8-APC antibodies in lean (open bars, n⫽41), overweight (hatched bars, n⫽26), and obese (filled bars, n⫽25) patients. *P⬍0.05, **P⬍0.01 obese vs lean. Adipocyte Expression of the T Cell Chemoattractant CCL20 To assess whether adipocytes attracted ATLs, we studied the effects of the adipocyte-derived factors contained in the media from human mature adipocytes of subcutaneous AT included in fibrin gel for 24 hours on the migration of ATLs. As depicted in Figure 4A, ATLs exhibited a marked migratory responsiveness to human mature conditioned media (5.5-fold increase, P⬍0.01). The human mature conditioned media were analyzed on protein arrays allowing the simultaneous detection of 79 proteins (Figure 4B). As expected, strong positive signals were detected for the adipokine leptin and the cytokines and growth factors IL-6, vascular endothelial growth factor (VEGF), tumor growth factor beta 2 (TGF2), oncostatin M (OSM), as well as tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP-1). Concerning chemokines, positive signals were obtained for chemokines active on neutrophils (CXCL1, CXCL2, and CXCL8), for MCP-1/CCL2, RANTES/CCL5, and MCP-4/CCL13. Interestingly, the lymphocyte chemoattractant chemokine CCL20 was also identified. Notably, no signals above the baseline were detected for CCL1, CCL8, CCL17, CCL18, CXCL5, CXCL6, CXCL9, CXCL10, CXCL12, and CXCL13. To further characterize the adipocyte-derived CCL20, real-time RT-PCR analyses were performed on mature adipocytes from subcutaneous AT (n⫽18 women, age⫽44⫾2 years, BMI⫽27⫾1 kg/m2) and from subcutaneous and visceral AT from class II/III obese women (n⫽12, age⫽41⫾3 years, BMI⫽44.7⫾1.3kg/m2). The levels of CCL20 transcripts in adipocytes from subcutaneous AT correlated with the adiposity degree assessed by the BMI (Spearman r⫽0.5, P⬍0.05) but not with age. Adipocytes originated from obese individuals exhibited 7-fold more CCL20 transcripts than adipocytes from lean individuals (Figure 4C). The effects of conditioned media (CM) originating from native immunoselected human ATLs and ATMs on adipocyte CCL20 expression were studied. Although treatment of adipocytes with ATL-CM or IFN␥ did not modify CCL20 expression, ATM-CM induced a marked increase in the levels of CCL20 transcript (3.8-fold increase, P⬍0.05, Figure 4D). In class II/III obese women, the expression of CCL20 in visceral adipocytes was higher than in the paired subcutaneous adipocytes (5-fold increase, P⬍0.05, Figure 4E). Phenotype of the Human Adipose Tissue Lymphocytes Real-time RT-PCR analysis was performed on the native immunoselected ATLs and compared to immunoselected CD3⫹ cells from peripheral blood from different donors. The study was restricted to subcutaneous AT because the amount of cells recovered from the paired biopsies of subcutaneous and visceral AT of obese patients was too low. ATLs exhibited a marked higher transcript level for IFN␥, TNF␣, Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 1612 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009 Figure 4. Production and expression of the T cell chemoattractant CCL20 by human mature adipocytes. A, Migration of human ATLs to human adipocyte-conditioned media. Results are expressed as percentage of control (media without cells) and are means⫾SEM of n⫽6. B, Representative photomicrograph of a cytokine antibody array membrane performed on conditioned media from pooled human mature adipocytes (n⫽6). C, mRNA levels of CCL20 determined by real-time RT-PCR analyses on mature adipocytes from subcutaneous AT of 6 lean and 6 obese patients. Results are means⫾SEM. **P⬍0.01. D, mRNA levels of CCL20 determined by real-time RT-PCR analyses in adipocytes (n⫽4) treated or not (Control) with ATL-CM (n⫽4), 50 ng/mL IFN␥, or ATM-CM (n⫽12). Results are expressed as percentage of control and are means⫾ SEM. *P⬍0.05 vs control. E, mRNA levels of CCL20 determined by real-time RT-PCR analyses on mature adipocytes isolated from paired biopsies of subcutaneous and visceral AT of class II/III obese patients (n⫽12). **P⬍0.01. RANTES, IL-2, as well as perforin-1 (PRF-1) when compared with blood T lymphocytes (Table). The expression of IL-4 was not detected in ATLs. Interestingly, the expression of the CCL20 receptor CCR6 as well as the expression of the leptin receptor (Leptin-R) were markedly upregulated in human ATLs. The production of IFN␥ by ATLs was further analyzed by flow cytometry (Figure 5A). Both CD4⫹ and CD8⫹ cells produced IFN␥ (data not shown). Table. Gene Expression in Blood and Adipose Tissue T Cells Gene Blood CD3⫹ Cells Adipose CD3⫹ Cells IFN␥ 0.1⫾0.02 2.3⫾0.4* TNF␣ 0.2⫾0.06 8.1⫾1.3* CCL5 12⫾2 47⫾6* CCR6 5⫻10⫺3⫾1⫻10⫺3 47⫻10⫺3⫾6⫻10⫺3** Leptin-R 7⫻10⫺3⫾2⫻10⫺3 73⫻10⫺3⫾10⫻10⫺3* IL-2 1⫻10⫺3⫾0.2⫻10⫺3 IL-4 PRF-1 ⫺5 ⫺5 1.6⫻10 ⫾0.7⫻10 2⫾0.2 8⫻10⫺3⫾0.3⫻10⫺3* Nondetectable 5.8⫾0.8* Gene expression was determined by real-time RT-PCR. Results were normalized to the levels of 18S rRNA and expressed as 2⌬CT⫻10 000, blood CD3⫹ cells (n⫽5); adipose CD3⫹ cells (n⫽30 for IFN␥, TNF␣, CCL5, PRF-1, n⫽18 for CCR6 and Leptin-R, n⫽7 for IL-2 and IL-4), Results are mean⫾SEM. *P⬍0.05, **P⬍0.01. Figure 5. IFN␥ production by adipose tissue T lymphocytes and pararine effects on adipocyte metabolism. IFN␥ production by immunoselected ATLs was determined by multicolour FACS analyses using CD4⫺FITC/CD8-APC/IFN␥-PeCy7 antibodies. A, A representative dot plot is shown obtained on gated IFN␥ positive cells. B, FFA released by human mature adipocytes pretreated or not (open bars) by conditioned media from ATLs (filled bars, n⫽6) or from ATMs (hatched filled bars, n⫽6) and stimulated or not (basal) by 0.1 mol/L isoprotenerol (ISO) or 10 mol/L noradrenaline (NA). Results are expressed as percentage of the values obtained for the control nonstimulated adipocytes (basal) and are means⫾SEM. The mRNA levels of fatty acid synthase (FAS; C), lipoprotein lipase (LPL; D), phosphoinositide-3-kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; E) were determined by real-time RT-PCR analyses in adipocytes (n⫽4) treated or not (Control, filled bars) for 36 hours with ATL-CM in the presence (⫹Ab, hatched bars, n⫽4) or absence (open bars, n⫽12) of 2 g/mL neutralizing antihuman IFN␥ antibody or 50 ng/mL IFN␥ or ATM-CM (hatched filled bars, n⫽12), in the presence or absence of insulin for 24 hours. Results are means⫾SEM and are expressed as percentage of cells without insulin. *P⬍0.05, **P⬍0.01 vs control ⫹insulin. F, The mRNA levels of FAS and LPL as well as the triglyceride content (TG) of human progenitor cells treated or not with ATLCMs. Results are expressed as percentage of the control and are means⫾SEM of n⫽3. Specific Paracrine Effects of ATLs on Human Mature Adipocytes The effects of conditioned media (CM) originating from native immunoselected human ATLs and ATMs on adipocyte metabolism were studied. Pretreatment of human mature adipocytes with ATL-CM or ATM-CM did not alter either basal lipolysis or the lipolytic activity stimulated with isoprotenerol (ISO) or noradrenaline (NA), as assessed by the release of glycerol (data not shown) and free fatty acids (Figure 5B). Pretreatment of human mature adipocytes with ATL-CM altered the insulin responsiveness of the lipogenic enzymes fatty acid synthase (FAS) and lipoprotein lipase (LPL). Indeed, although ATL- and ATM-CMs did not alter Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Duffaut et al Characterization of the Human Adipose Tissue T Cells the basal expression of FAS and LPL in human mature adipocytes (data not shown), ATL-CMs strongly inhibited the insulin-mediated upregulation of FAS and LPL transcript levels (Figure 5C and 5D). Furthermore, it was associated with the downregulation of a key component of the insulindependent intracellular pathway, the phosphoinositide-3kinase, regulatory subunit 1 alpha (PIK3R1; Figure 5E). Such an ATL-mediated inhibitory effect on FAS, LPL, and PIK3R1 expression was reversed by a neutralizing IFN␥ antibody and mimicked by 50 ng/mL IFN␥ treatment. ATM-CM did not modulate the insulin responsiveness of the adipocyte under the same conditions (Figure 5C, 5D, and 5E). Human AT progenitor cells (CD34⫹/CD31⫺ cells) were treated with human ATL-conditioned media under adipogenic culture conditions. Human ATL-conditioned media led to a marked decrease of the expression of FAS and LPL that was associated with a lower triglyceride content (Figure 5F). Discussion The present study demonstrates that, in humans, the degree of adiposity is positively correlated with the accumulation of adipose tissue lymphocytes (ATLs). Flow cytometry analyses of the subcutaneous AT-SVF showed the presence of CD3⫹ T lymphocytes but few CD19⫹ B lymphocytes and innate lymphocytes (NK, NKT, and ␥␦T-cells). These results clearly show that human AT and murine AT are different in terms of relative proportion of T lymphocyte subsets within the SVF.8,16 Among the T lymphocytes, CD4⫹ and CD8⫹ cells were characterized as memory (CD45RO⫹) and effector (CD45RO⫺/RA⫺) cells. Compared to the blood cells, few naı̈ve CD45RA⫹ as well as CD62L T cells were identified in the human adipose tissue. Moreover, the mean size of the tissue lymphocytes was lower than the blood CD3⫹ cells, whereas the higher granularity of the ATLs compared to the blood suggested distinct activation states. The direct comparison in the expression of several activation markers in the immunoselected blood and AT CD3⫹ cells confirmed that human ATLs exhibited higher expression of inflammatory markers. Taken together, the low levels of B cells and of CD62L and naı̈ve T cells together with the high proportion of effector T cells demonstrate that the human ATLs exhibit a specific and distinct profile than the one found in peripheral blood. ATLs are therefore mostly infiltrated or resident cells. This was confirmed by confocal analyses that revealed that ATLs were localized in the stroma and more specifically surrounding some adipocytes. However, we cannot rule out the presence of a minor contamination from blood. Increased adiposity, assessed by BMI, was associated with a specific accumulation of CD4⫹ as well as CD8⫹ ATLs in subcutaneous AT, whereas the number of NK cells was not modulated. In addition to an adiposity-dependent increase of ATL numbers, an AT location-dependent pattern of ATLs was observed. Indeed, in paired biopsies from subcutaneous and visceral AT of classII/III obese patients, a marked increase in ATLs together with a modest increase in the number of adipose tissue macrophages (ATMs) was observed in visceral ATs. In mice, the AT infiltration of T lymphocytes during a high-fat diet has been speculated to involve several chemokines such as stromal-derived factor 1 alpha/CXCL1213 and 1613 RANTES/CCL5.9 In the present study, ATLs exhibited an enhanced migration in response to adipocyte-conditioned media. Protein arrays performed on conditioned media from human native mature adipocytes showed no adipocyte production of CXCL12. Both CCL5 and CCL20 were detected in the adipocyte conditioned media. Because CCL20 release by adipocytes has not been reported previously, we further analyzed the adipocyte expression of CCL20. Mature adipocytes from subcutaneous AT of obese individuals expressed higher levels of CCL20 than adipocytes from lean individuals. In class II/III obese patients, adipocytes from visceral AT expressed higher levels of CCL20 than subcutaneous adipocytes. Moreover, ATLs expressed the CCL20 receptor, CCR6. The ligand-receptor pair CCL20-CCR6 has been described to be responsible for the chemoattraction of effector/memory T-cells in skin and mucosal surfaces under homeostatic and inflammatory conditions, as well as in pathology, including cancer and rheumatoid arthritis.17 The present results suggest that the adipocyte CCL20 may also play a major role in the accumulation of T lymphocytes within the AT. Interestingly, CCL20 expression in adipocytes was increased in the presence of soluble factors originated from human ATMs, suggesting that ATMs may contribute via the stimulation of CCL20 expression in adipocytes to the accumulation of ATLs. Freshly immunoselected ATLs exhibited a proinflammatory profile of activation, with clear expression of TNF␣, IFN␥, and RANTES, whereas the expression of IL-4 (the TH2-type cytokine) was not detected. The mechanisms involved in the promotion of the ATL phenotype remain to be established. However, because ATLs were found to express high transcript levels of the leptin receptor and considering that leptin is well described to promote TH1 activation,18 we propose that leptin locally produced by human mature adipocyte may be involved in the activation of ATLs. The lack of B cells together with the accumulation of Th1 type effector T cells and the previously reported characterization of human ATMs that were strongly positive for MHC-II,7 suggest that a cell-mediated immune reaction takes place in the AT with obesity. However, additional experiments are clearly needed to define whether the T lymphocytes of human adipose tissue are selected toward specific antigens. Because the lymphocyte clusters identified by immunohistochemistry were localized in the vicinity of adipocytes, paracrine effects of ATLs on adipocyte metabolism were investigated and compared to that of human ATMs. Although ATL- as well as ATM-derived secretory products did not affect lipolysis, soluble factors originated from ATLs markedly inhibited the insulin-mediated upregulation of both lipogenic enzymes FAS and LPL. Such an effect was associated with the lower expression of PIK3R1 (encoding the 85kD regulatory subunit of PIK), a key component in the insulin-stimulated pathway.19,20 Moreover, the effect was specific to lymphocyte-derived products because conditioned media from human ATMs had no effect. Because human ATLs were shown to produce IFN␥, adipocytes were treated by IFN␥. IFN␥, as ATL-conditioned media, reduced the insulin sensitivity of FAS, LPL, and PIK3R1 and its neutralization in ATL-conditioned media reversed the effects. Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 1614 Arterioscler Thromb Vasc Biol October 2009 Therefore, IFN␥ produced by ATLs is a paracrine mediator of the T-cells on adipocyte metabolism. The experiments performed on the human progenitor cells confirmed the effects of ATLs on the expression of both LPL and FAS. Moreover, because a decreased triglyceride accumulation was also observed, it is suggested that ATLs interact with the insulinmediated promotion of triglyceride storage. Accumulation of visceral AT is now well recognized to be associated with an increased risk of developing type 2 diabetes. Visceral AT exhibits marked differences compared with subcutaneous AT in terms of metabolic and secretory activities,21 and increased local inflammation has been suspected to underlie such differences.22,23 It is therefore tempting to speculate that the increased accumulation of ATLs in human visceral AT participate in the pathogenic potential of the visceral AT via local paracrine effects on insulin-mediated lipogenesis. To conclude, the present study focused on a large number of normal weight, overweight, and obese patients and showed that the accumulation of helper CD4⫹ and cytotoxic CD8⫹ ATLs increases in parallel with adiposity and has a locationdependent pattern. We report a new adipochemokine, CCL20, the expression of which is modulated by the degree of adiposity and the anatomic location of AT. We also show that ATLs are potent local regulators of adipocyte metabolism and more specifically insulin-mediated lipogenesis. Acknowledgments The authors thank Dr Dylan Thompson (University of Bath, UK) for his critical reading of the manuscript and Marie-Adeline Marquès (INSERM U858, Team 4) for her technical support for the lipolysis experiments. We are grateful to the excellent technical support and advice of Bruno Payre (IFR31, Toulouse, France) for the confocal microscopy. Sources of Funding This study was supported by grants from INSERM (AVENIR), the Agence Nationale de la Recherche (ANR “RIOMA”), the European Union (FP7 ADAPT HEALTH-F2-2008-2010), and Pierre Fabre Laboratories. This work was sponsored by the University Hospital of Toulouse for regulatory and ethic submission (No. 06 029 03). Disclosures None. References 1. Lafontan M. 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Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Figure S1 17 15 13 11 9 CD3+ cell size (Mean FSC) CD3+ cell granularity (Mean SSC) A * 60 * 55 50 Blood AT Blood AT % CD3+ cells B 100 80 60 40 20 0 Blood ** ** AT Blood AT CD62L CD45RA Downloaded from atvb.ahajournals.org by on September 17, 2009 Discussion de l’article 1 Dans cette étude, nous avons caractérisé les lymphocytes du tissu adipeux humain sur un grand nombre de prélèvements issus de lipoaspirations et de dermolipectomies abdominales. Nous avons montré que des lymphocytes T (CD3+) sont présents dans le tissu adipeux humain et qu’ils constituent environ 7% de la fraction stroma vasculaire (FSV). Le nombre de lymphocytes T est positivement corrélé avec l’indice de masse corporelle (IMC). Ils sont constitués de cellules effectrices et mémoires auxiliaires CD4+ et cytotoxiques CD8+. Ils augmentent dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu souscutané de patients obèses morbides et plus particulièrement les lymphocytes cytotoxiques. Les lymphocytes B sont absents et les cellules NK et NKT, identifiées en faibles quantités, ne sont pas augmentées avec l’IMC. D’autre part, les expériences d’immunohistochimie, visualisées en microscopie confocale, montrent que les lymphocytes T se trouvent à l’extérieur des vaisseaux et organisés en amas de cellules immunes et en proche contact avec certains adipocytes. Cette organisation particulière nécessite d’être étudiée plus avant. Toutefois, la description récente de l’expression de CD40 par les adipocytes et l’observation d’interactions CD40/CD40 ligand entre adipocytes et lymphocytes d’origine sanguine pourrait expliquer cette association (188). La suite des nos études s’est focalisée sur les lymphocytes T. Après isolement par une technique d’immunosélection/déplétion à l’aide de nanobilles couplés à des anticorps anti CD3 (Figure 16), nous montrons que ces cellules présentent un phénotype d’activation proinflammatoire associé à une augmentation de l’expression de tous les marqueurs proinflammatoires étudiés par rapport aux lymphocytes sanguins, excepté pour l’IL-4. Ces analyses nous renseignent sur la polarisation des lymphocytes. En effet, l’absence d’expression d’IL-4 exclut la possibilité d’avoir des lymphocytes Th2 au sein du tissu adipeux et la présence d’IFNγ et d’IL-2 va dans le sens d’une polarisation Th1. 70 Les études de production de cytokines par les adipocytes humains matures maintenus en gel de fibrine mettent en évidence pour la première fois à notre connaissance une production de CCL20 par les adipocytes. Nous confirmons de plus la production de RANTES et de MCP-1 parmi les autres chimiokines ainsi que de leptine et d’IL-6 entre autres. L’expression de CCL20 déterminée par PCR en temps réel dans les adipocytes matures est augmentée avec l’IMC et la localisation viscérale. Les lymphocytes du tissu adipeux humain expriment CCR6, qui est le récepteur exclusif de CCL20. La stricte sélectivité de CCL20 pour CCR6 est une des exceptions à la règle générale de la proximité des chimiokines et de leurs récepteurs (189). CCR6 a été décrit comme étant exprimé notamment par les lymphocytes T effecteurs/mémoires (CD45RO+CCR7-) (190). CCL20 quant à lui, joue un rôle important dans l’arrêt du flux de cellules T au niveau des cellules endothéliales (191). Enfin, l’interaction CCR6/CCL20 est reconnue comme influençant le recrutement des lymphocytes dans les tissus au cours de nombreuses inflammations (192-194). De plus, nos données montrent que l’expression de CCL20 par les adipocytes est augmentée lorsqu’ils sont traités par des milieux conditionnés par les macrophages du tissu adipeux suggérant ainsi une boucle de régulation entre les macrophages et les lymphocytes via les adipocytes afin de favoriser le recrutement lymphocytaire. Afin d’analyser le rôle des lymphocytes au sein du tissu adipeux, nous avons évalué les effets des sécrétions des lymphocytes comparés aux macrophages, via des milieux conditionnés par les CD3+ et/ou les CD14+ (macrophages) isolés du tissu adipeux sur les adipocytes en culture primaire. Les résultats obtenus en ce qui concerne la lipolyse montrent d’une part que les milieux conditionnés par ces deux types cellulaires n’affectent pas l’expression des enzymes de la lipolyse (ATGL et LHS). D’autre part ils montrent que le prétraitement des adipocytes matures de manière aigue (1h30) ou chronique (24h), par ces milieux conditionnés ne modifie ni la lipolyse basale, ni l’activité lipolytique stimulée par 71 l’isoprotenerol, le peptide natriurétique, la noradrenaline ou encore l’adénosine déaminase et déterminée par le dosage du glycérol et des acides gras libres dans les milieux (certaines de ces données ne sont pas montrées). Nous montrons également que seuls les milieux conditionnés des lymphocytes bloquent les effets de l’insuline sur certaines des principales enzymes de la lipogenèse: la lipase des lipoprotéines (LPL pour lipoprotein lipase) et la synthase des acides gras (FAS pour Fatty acid synthase). Ces effets sont associés à une diminution de l’expression de PIK3R1 (codant pour la sous-unité p85 de PIK, composant clé de la réponse à l’insuline) (195, 196) et sont en partie inhibés en présence d’anticorps neutralisant anti-IFNγ. Ainsi l’IFNγ semble être un médiateur potentiel des effets de lymphocytes sur le contrôle du métabolisme adipocytaire et pourrait participer au développement de l’insulino-résistance via ses effets inhibiteurs sur la régulation de la lipogenèse par l’insuline. En résumé, cet article démontre que les lymphocytes présents dans le tissu adipeux sont des lymphocytes T auxiliaires et cytotoxiques effecteurs et mémoires principalement dont le nombre augmente avec l’obésité ainsi qu’avec la localisation viscérale. Ces lymphocytes pourraient être recrutés au moyen de l’interaction CCL20/CCR6 et leur état proinflammatoire via la production d’IFNγ, inhiberait la stimulation de la lipogenèse par l’insuline. Ainsi, les lymphocytes pourraient participer au développement de l’insulinorésistance liée à l’état inflammatoire chronique du tissu adipeux lors de l’obésité et ils pourraient également jouer un rôle limitant dans le développement de la masse grasse. 72 TA Digestion collagénase Adipocytes matures SVF Billes anti-CD34 CD34- CD34+ Progéniteurs Cellules capillaires endothéliales Billes anti-CD14 CD14+ Macrophages CD14 Billes anti-CD3 CD3+ Lymphocytes T Figure 16: Technique d’isolement des différentes populations cellulaires du tissu adipeux humain 73 II Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux II 1 Facteurs potentiels impliqués dans la survie et/ou prolifération des lymphocytes T Afin de caractériser plus précisément le statut des lymphocytes T présents dans le tissu adipeux, nous avons complété la caractérisation phénotypique par des expériences de cytométrie en flux (Figure 17). L’analyse des marqueurs CD62L (L-sélectine permet l’adressage aux tissus périphériques) et CCR7 (se lie à CCL19 et CCL21 (197) sur les cellules endothéliales des ganglions lymphatiques (198, 199)) montre que moins de 10% de ces lymphocytes sont positifs pour CD62L donc dans un état naïf (200) confirmant ainsi nos précédents résultats obtenus avec le marqueur CD45RA. De plus, ces deux marqueurs nous permettent de préciser le statut des cellules mémoires. Ce phénotype CD62L faible et CCR7correspond à des cellules effecteurs mémoires (TEM) qui sont infiltrées dans les tissus alors que les lymphocytes mémoires centraux (TCM) sont CD62L+/CCR7+ (68). Comme L’IL-7 est impliquée dans l’induction du phénotype mémoire, dans la survie et la prolifération des lymphocytes T (201), nous nous sommes intéressés à l’expression de son récepteur CD127 dans le tissu adipeux. En fait, plus de 50% des lymphocytes sont positifs pour CD127, dont 15% sont CD8+CD127+. Les combinaisons d’anticorps utilisés pour la cytométrie en flux ne nous ont pas permis d’utiliser les anticorps anti-CD4 en combinaison avec CD127, CD8 et CD3. Toutefois, le nombre de cellules NKT étant très faible dans le tissu adipeux humain, on peut penser que les 35% restants de CD3+ positifs pour CD127 représentent les cellules CD4+. Les travaux de Maury et al. ont récemment montré la présence de l’IL-7 dans le tissu adipeux humain ainsi que son augmentation avec l’obésité (202). Nous avons donc précisé sa spécificité d’expression par les autres cellules du tissu adipeux (Figure 18). Notre analyse montre que toutes les fractions cellulaires du tissu adipeux, excepté les adipocytes, expriment l’IL-7. 74 L’IL-15 a été impliquée dans la survie et la prolifération des lymphocytes CD8+ (69, 203). Les résultats d’analyses de transcrits (Figure 18) montrent que ce sont les macrophages qui expriment le plus d’IL-15 dans le tissu adipeux humain, en moyenne 7 fois plus que les adipocytes matures et 9 fois plus que les cellules progénitrices. Les lymphocytes l’expriment aussi en quantité moindre. Ces résultats pourraient donc partiellement expliquer la survie des lymphocytes T CD4+ par l’IL-7 et CD8+ par l’IL-15. De plus, nos données révèlent aussi un rôle potentiel des macrophages ainsi que des autres des cellules de la FSV dans la survie des lymphocytes, suggérant l’existence d’interactions entre ces types cellulaires. Il a été vu en introduction que la leptine avait des effets anti apoptotiques et proproliférants sur les cellules immunitaires (164). Nous nous sommes donc intéressés à l’expression génique de cette cytokine et de son récepteur. Nos résultats montrent que le récepteur à la leptine est exprimé dans les lymphocytes T du tissu adipeux. Son expression est augmentée avec l’obésité. De plus, les lymphocytes T isolés du tissu adipeux expriment la leptine qui est régulée de manière positive avec l’IMC croissant (Figure 19). Ainsi la leptine d’origine adipocytaire et dont la production augmente avec l’obésité pourrait maintenir les lymphocytes T du tissu adipeux dans un état prolifératif. De plus, l’expression de leptine décrite dans les Th1 (164) et que nous retrouvons dans cette étude pourrait réguler cette activation et cette production de manière autocrine. Il est cependant à noter que l’expression de la leptine par les lymphocytes du tissu adipeux est très inférieure à celle détectée dans les adipocytes matures. Ces résultats sont à confirmer par des études de production de leptine par les lymphocytes du tissu adipeux humain et par des approches in vitro sur le rôle de la leptine dans le contrôle de la prolifération des lymphocytes. 75 % de cellules CD3+ 60 50 40 30 20 10 0 CD127 CD8/127 CD62L CCR7 Figure 17: Caractérisation des lymphocytes isolés du tissu adipeux humain par cytométrie en flux Les lymphocytes du tissu adipeux de patients d’IMC variés ont été isolés comme décrit dans la figure 16, ils sont ensuite marqués à l’aide d’ anticorps couplés à des fluorochromes (FITC antiCD127 et antiCD62L; PECy7 antiCCR7; APC antiCD8). Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules positives ± SEM. 76 A B 0.015 0.020 Expression IL 15 (UA) Expression IL-7 (UA) 0.025 0.015 0.010 0.005 0.000 AM CES MO LY PROG 0.010 0.005 0.000 AM CES MO LY PROG Figure 18: Expression d’IL-15 et d’IL-7 dans les différentes fractions du tissu adipeux humain L’analyse des transcrits est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. L’IL-15 et l’IL-7 sont analysées dans les adipocytes matures (AM n=5 et 4 respectivement), les cellules endothéliales sanguines (CES n=5), les macrophages (MO n=15 et 5 respectivement), les lymphocytes (LY n=5) et les cellules progénitrices (PROG n=4) fraîchement isolés du tissu adipeux. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. 77 A B ** 0.020 0.015 * 0.010 0.35 Expression de Leptin-R (UA) Expression de Leptine (UA) 0.025 0.005 ** 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.000 Sang NP SP Ob Sang NP SP Ob Figure 19: Expression de la leptine et de son récepteur dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés (IMC≤25kg/m2 NP), surpoids (25≤IMC≤30kg/m2, SP) et obèses (IMC ≥30kg/m2, Ob). Les lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. Pour la leptine NP, n=12; SP, n=5 et Ob, n=12, pour le récepteur à la leptine (Leptin-R) NP, n=5; SP, n=7 et Ob, n=11 * P<0.05 ** P<0.01 CD3+ du tissu adipeux versus sang. 78 II.2 Expression de marqueurs d’activation et influence de l’état d’obésité L’étude de l’effet de l’IMC sur la caractérisation phénotypique des lymphocytes T isolés par immunosélection/déplétion à partir de tissu adipeux sous-cutané, montre des résultats assez inattendus en terme de marqueurs pro-inflammatoires, (Figure 20). En effet, le profil d’expression de TNFα, IFNγ, PRF-1 et RANTES présente une augmentation dans les lymphocytes de tissus adipeux de patients en surpoids et présente chez les sujets obèses des valeurs comparables aux sujets normopondérés. Ces données suggèrent l’existence d’un processus inflammatoire classique de type Th1 qui présente un état maximal chez les sujets en surpoids. Les lymphocytes T des sujets obèses, malgré leur accumulation plus forte, expriment moins de marqueurs de polarisation Th1. Ces résultats démontrent que l’indice d’adiposité module le phénotype des cellules T et suggère que les patients en surpoids présenteraient une activation inflammatoire plus marquée que les patients obèses. Ces résultats sont à confirmer sur des études regroupant plus de patients mais on peut émettre l’hypothèse que l’obésité installée s’accompagne d’une inflammation chronique du tissu adipeux et d’un phénotype particulier des cellules immunes. Cette particularité a déjà été observée pour les macrophages du tissu adipeux dans notre laboratoire (185) (données non publiées). Des études réalisées sur des cohortes de patients bien caractérisés en terme d’historique de leur obésité et de leurs surpoids devraient permettre de relier durée de l’obésité et/ou du surpoids et phénotype inflammatoire aigu ou chronique des cellules immunes de leurs tissus adipeux. De façon intéressante, des données récentes montrent que les tissus où siège une inflammation chronique sont hautement infiltrés par des lymphocytes Th17 qui expriment des taux élevés de CCR6 à leur surface (204). Nos résultats montrent que l’IL-17, cytokine principalement produite par les Th17 (52), est augmentée dans les lymphocytes T isolés du tissu adipeux de patients obèses (Figure 21). Ces résultats nous autorisent à penser qu’une partie des lymphocytes T du tissu adipeux des patients obèses 79 pourrait être constituée de lymphocytes Th17. Afin de déterminer réellement la présence d’un phénotype Th17, l’expression d’autres marqueurs Th17 comme le facteur de transcription RORγt (205) et l’IL-22 (204), pourrait être étudiée. On peut ainsi suggérer que le tissu adipeux des patients en surpoids présentent des lymphocytes T majoritairement polarisés Th1 et donc pro-inflammatoires alors que le tissu adipeux des patients obèses expriment des lymphocytes T de type Th17, moins inflammatoires mais marqueurs d’une inflammation chronique. Les facteurs responsables d’une telle modulation du phénotype des lymphocytes T du tissu adipeux avec l’index d’adiposité restent à être caractérisés. 80 A B 20 6 15 10 * * 5 Expression d'IFN γ (UA) Expression de TNFα (UA) ** ** 5 4 3 * * 2 1 0 0 Sang NP SP Sang Ob SP Ob D * 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 140 Expression de RANTES (UA) Expression de PRF-1 (UA) C NP 120 100 ** 80 60 40 20 0 Sang NP SP Ob Sang NP SP Ob Figure 20: Expression de marqueurs pro-inflammatoires dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux de patients d’IMC croissants L’expression génique est déterminée par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Les lymphocytes isolés du tissu adipeux (histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés (NP n=12), surpoids (SP, n=7) et obèses (Ob, n=13). Les lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5. 81 A B 0.125 0.100 ** 0.075 ** 0.050 0.025 Expression CCL20 (AU) Expression IL-17 (UA) 0.150 0.000 Sang NP SP Ob ** 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Sang LY Figure21: Expression d’IL17 et de CCL20 dans les lymphocytes sanguins et isolés du tissu adipeux Les expressions géniques d’IL-17 et de CCL20 sont déterminées par RT-PCR quantitative en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Pour IL-17, les lymphocytes isolés du tissu adipeux (LY histogrammes noirs) sont classés selon l’IMC des sujets en normopondérés (NP, n=11), surpoids (SP, n=7) et obèses (Ob, n=14). Pour CCL20 les lymphocytes sont isolés de tissu adipeux (histogrammes noirs) de patients d’IMC variés (n=14). Les lymphocytes isolés du sang sont représentés en blanc n=5. Les résultats sont exprimés en moyennes ± SEM. * P<0.05 ** P<0.01 LY versus lymphocytes sanguins 82 II 3 Effets des lymphocytes sur les autres populations cellulaires du tissu adipeux humain Nous avons étudié les effets des facteurs solubles issus des lymphocytes sur les autres partenaires cellulaires présents dans la fraction stroma-vasculaire plus particulièrement sur l’adipogenèse des cellules progénitrices CD34+/CD31- natives du tissu adipeux humain (Figure 22), ainsi que sur la régulation des transcrits macrophagiques. (Figure 23). Pour cela les cellules fraîchement isolées du tissu adipeux par la méthode d’immunosélection/déplétion décrite en figure 16 ont été traitées par des milieux conditionnés par les lymphocytes isolés du tissu adipeux humain. Nos résultats montrent que les milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux ont un effet anti adipogénique sur la différenciation des cellules progénitrices (Figure 22). En effet, après 8 jours de traitement en milieu adipogénique, on observe une diminution du contenu en triglycérides ainsi qu’une diminution de la quantité d’ADN des cellules progénitrices dus à un effet anti-proliférant ou apopototique des sécrétions lymphocytaires. De plus, l’expression des enzymes de la lipogenèse (LPL et FAS) est également diminuée par ce traitement, ce qui suggère un effet anti-adipogénique des lymphocytes sur les précurseurs des adipocytes. Ces résultats confirment ceux décrits sur la lignée murine de préadipocytes 3T3-L1 (206). Il est maintenant nécessaire de déterminer si cet effet anti-adipogénique est également médié par l’IFNγ comme cela a été décrit sur les préadipocytes de rongeurs (207). Il serait donc intéressant de traiter directement des cellules progénitrices en présence d’IFNγ et/ou par des milieux conditionnés en présence d’anticorps neutralisant. Toutefois, sachant que l’insuline est nécessaire à la différenciation adipocytaire, il est tentant de spéculer que les effets anti-adipogéniques des produits lymphocytaires pourraient être reliés à une altération de la voie de signalisation de l’insuline. Ainsi, les lymphocytes via leurs effets inhibiteurs sur la lipogenèse et l’adipogenèse pourraient 83 contribuer à la limitation de l’extension du tissu adipeux sous-cutané en diminuant ses capacités de stockage et contribuer ainsi à la genèse des pathologies associées à l’obésité. Enfin, les facteurs solubles produits par les lymphocytes isolés du tissu adipeux augmentent de façon significative l’expression des marqueurs M1 (IL-23) comme M2 (IL-10) et ont tendance à augmenter les marqueurs M1 (IL-6 et IL-1β) et le TGFβ (M1) dans les macrophages du tissu adipeux (Figure 23). De manière intéressante, l’IL-23 et l’IL-1β ont été décrites comme induisant «in vitro» un phénotype Th17 dans les lymphocytes humains, de même que le TGFβ qui régule indirectement la voie Th17 en inhibant la polarisation en Th1 et/ouTh2 (208). Les milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux n’induisent donc pas de phénotype M1 ou M2 particulier chez les macrophages du tissu adipeux. Toutefois, il semble que ces macrophages «activés» par les sécrétions lymphocytaires produisent un contexte cytokinique favorable à l’induction de cellules Th17 impliquées dans l’inflammation chronique. 84 A B C D 75 100 ** * 50 25 0 Expression génique (% du contrôle) % du contrôle 100 75 ** ** FAS LPL 50 25 0 TG ADN Figure 22: Effet des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur la différenciation des précurseurs adipocytaires Photos représentatives des cellules progénitrices humaines (CD34+/CD31-) issues du tissu adipeux cultivées pendant 8jours en conditions adipogéniques (A) en absence ou en (B) présence de milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux humain (MC-LY). (C) Les quantités de triglycérides (TG) et d’ADN ainsi que (D) les taux de transcrit de FAS et de LPL des cellules progénitrices du tissu adipeux humain sont exprimées en moyennes ± SEM des pourcentages du contrôle à J8 de traitement en conditions adipogéniques sans MC-LY pour 3 expériences différentes avec 3 MC différents par expérience. Les différences sont considérées comme significatives pour * P< 0.05, ** P < 0.01 versus contrôle. 85 Expression des cytokines par les MO (% du contrôle) 225 200 175 150 125 100 75 50 25 0 ** * Cont IL-6 IL-23 TGFβ IL-10 IL1β MC-LY Figure 23: Effets des milieux conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux sur les régulations de transcrits des macrophages isolés du tissu adipeux Les macrophages isolés du tissu adipeux sont traités pendant 24h avec des milieux contrôles (Cont) ou bien conditionnés par les lymphocytes du tissu adipeux (MC-LY). Les taux de transcrits des marqueurs M1 (IL-6 et IL-23) et M2 (IL-1β, IL-10 et TGFβ) sont ensuite analysés par RT-PCR en temps réel. Les résultats sont normalisés aux niveaux des 18S et exprimés comme 2∆CT×10000. Ils sont exprimés en moyennes ± SEM des pourcentages des cellules traitées par les milieux contrôles de 4 expériences distinctes. * P< 0.05, ** P < 0.01 versus contrôle. 86 III Cinétique d’accumulation des lymphocytes au sein du tissu adipeux et rôles sur le développement de l’obésité Article 2 : Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity Dans cet article, nous nous sommes intéressés au rôle des lymphocytes dans le développement du tissu adipeux au cours de l’obésité. Dans un premier temps, nous avons regardé comment évoluent les différentes cellules immunes au cours de l’induction de l’obésité en débutant les observations à un stade très précoce de prise de poids. Dans un second temps, nous avons regardé l’effet d’une déficience globale en lymphocytes sur le développement de l’obésité. Pour cela, nous avons travaillé sur un modèle de souris B6/RAG2(-/-) qui sont déficientes pour la RAG2 (Recombination activating gene 2), ces souris n’ont pas la capacité d’initier la recombinaison VDJ et n’ont donc pas de lymphocytes T et B matures (209). Ce modèle nous a permis d’étudier la prise de poids et le statut métabolique de souris déficientes en lymphocytes et d’étudier les autres populations immunes présentes dans le tissu adipeux. 87 ARTICLE IN PRESS Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx Contents lists available at ScienceDirect Biochemical and Biophysical Research Communications journal homepage: www.elsevier.com/locate/ybbrc Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity Carine Duffaut *, Jean Galitzky, Max Lafontan, Anne Bouloumié Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), U858, Toulouse, France Université Toulouse III Paul-Sabatier, Institut de Médecine Moléculaire de Rangueil, Equipe n°1 AVENIR, IFR31, Toulouse, France a r t i c l e i n f o Article history: Received 30 April 2009 Available online xxxx Keywords: Lymphocytes Macrophages NK cells Immunodeficient mice High fat diet Insulin resistance Innate cells Adaptive cells a b s t r a c t The primary inflammatory events occurring in the adipose tissue (AT) during high fat diet (HFD)-induced obesity are poorly defined. The present study was undertaken to characterize, in wild-type(+/+) and lymphocyte deficient RAG2( / ) mice under HFD, the changes in AT immune cells by flow cytometry analyses. In (+/+) mice, early accumulation of AT B-cells was observed, followed by increased AT T-cell numbers and finally by the appearance of insulin resistance and AT macrophage accumulation. Lack of lymphocytes in the RAG2( / ) mice did not affect the onset of obesity and the state of insulin resistance. However, a striking accumulation of AT NK cells and activated macrophages was detected. The present study demonstrates that AT is the site of an unexpected dynamic in innate and adaptive cells during diet-induced obesity and insulin resistance. Moreover it appears that early AT lymphocyte infiltration could be considered a protective process to temper adipose tissue inflammation. Ó 2009 Elsevier Inc. All rights reserved. Introduction Inflammation is now considered a common link between obesity and type 2 diabetes [1]. Several studies performed on a mouse model of diet-induced or genetic obesity as well as in humans have demonstrated that increased adipose tissue mass is associated with a moderate elevation in the plasma levels of several markers of inflammation. Moreover, in the obese state, adipose tissue produces more chemokines as well as pro-inflammatory cytokines that are known to interfere with insulin signaling [2]. Finally, in mice models of obesity as well as in humans, macrophages accumulation within the adipose tissue itself has been demonstrated together with the recently described increase in adipose tissue T-lymphocytes [3]. Altogether, these observations have led to the concept that the inflammatory process occurring within the adipose tissue may contribute to the settlement of a systemic and chronic low-grade inflammatory state responsible for insulin resistance and ultimately type 2 diabetes [4]. However, few data are available concerning the early primary inflammatory events occurring within the fat depots during the onset of diet-induced obesity. The present study was undertaken to characterize the changes in the major immune cells (macrophages, T- and B-lymphocytes * Corresponding author. Address: Equipe AVENIR/INSERM, U858, Hôpital Rangueil Bat L4, BP 84225, 31432 Toulouse Cedex 04, France. Fax: +33 (0) 5 61 32 56 21. E-mail address: [email protected] (C. Duffaut). and NK cells) in adipose tissue of wild-type C57BL/6 mice under a high fat diet (HFD) during the onset of obesity and insulin resistance. To further define the possible role of lymphocytes in the initiation of the obesity-associated inflammation, mice with no B- and T-lymphocytes due to RAG-2 deficiency (B6RAG2 / ) were investigated under normal diet (ND) and HFD. Material and methods Materials. Chemicals were purchased from Sigma (Saint-Quentin Fallavier, France). Collagenase worthington was purchased from Serlabo Technologies (Entraigues, France). Antibodies for flow cytometry analysis were purchased from BD Biosciences (Le Pont de Claix, France) or AbD serotec (Oxford UK). Animals. Animals were handled in accordance with the principles and guidelines established by the National Institute of Medical Research. C57BL6/J mice were obtained from Charles River Laboratory (l’Arbresle, France). Mice deficient in RAG2 (B6RAG2( / )) were kindly provided by Dr. Van Meerwijk (U563 INSERM, Toulouse, France). Mice were housed conventionally in a constant temperature (20–22 °C) and humidity (50–60%) animal room, with a 12/12 h light/dark cycle (lights on at 8:00 am) and free access to food and water. Mice were assigned to ND (C57BL6/J n = 16, RAG2( / ) n = 11) and HFD (C57BL6/J n = 15, RAG2( / ) n = 11) (DIO Research diet, Jackson Laboratory, Brogaarden, Denmark) for 3, 6 and/or 12 weeks. Due to the weak fertility of RAG2( / ) mice, 0006-291X/$ - see front matter Ó 2009 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002 Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002 ARTICLE IN PRESS C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx Results Lack of lymphocytes does not alter the onset of obesity and insulin resistance Wild-type and RAG2( / ) male mice fed under normal or high fat diet for 12 weeks exhibited similar weight gain (Fig. 1A). In wild-type mice, the total body fat mass assessed by EchoMRI statistically increased after 6 weeks HFD (2-fold-increase, Fig. 1B). After 12 weeks, both wild-type and RAG2( / ) exhibited a similar increase in total body fat mass when fed under HFD compared to ND (3.3-fold increase, Fig. 1B). The epidydimal adipose tissues of wild-type mice exhibited a marked increase in weight after 6 weeks HFD that was further enhanced after 12 weeks and was identical to that observed in RAG2( / ) mice (Fig. 1C). Glucose tolerance tests clearly showed the progressive development of insulin resistance in wild-type mice under HFD (Fig. 2). Indeed, the area under the curve of the glycemia concentration exhibited a timedependent increase in mice under a high fat diet that was statistically significant compared to animals fed with normal chow after A Body weight gain (g) 17.5 +/+ ND RAG2-/- ND +/+ HFD RAG2-/- HFD 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 0 B 2 4 6 8 Time (weeks) 10 Body fat mass (g) 12.5 C 12 ** 10.0 ** 7.5 * 5.0 2.5 0.0 Epidydimal depot (mg) the animals were studied only after 12 weeks of diet. Energy contents of the specific diets were (% kcals): 20% protein, 70% carbohydrate, and 10% fat for ND; 20% protein, 35% carbohydrate, and 45% fat for HFD. At 3, 6 and 12 weeks of either diet, an intra-peritoneal glucose tolerance test (1 g glucose/kg body weight) was performed after the deprivation of food overnight and the time course of glycemia was measured in the tail vein for 240 min with a glucometer (Accu-ChekÒ Roche France). At 3, 6 and 12 weeks, the body composition was determined by quantitative magnetic resonance using an EchoMRI-100TM 3 in 1 (Echo Medical Systems, Houston TX). At 3, 6 and/or 12 week of either diet, mice were sacrified by cervical dislocation and epididymal adipose tissues were taken and weighed. Isolation of the stroma-vascular fraction (SVF) from adipose tissue (AT) and flow cytometry analyses. The SVF cells were obtained by collagenase digestion of the adipose tissue as previously described [5]. After digestion, the suspension was filtered 150 lm filter and centrifuged (100g, 10 s) to collect the infranatant containing the SVF. The lower phase was centrifugated at 400g for 10 min and the pellet containing the SVF was incubated for 10 min in erythrocyte-lysing buffer (155 mM NH4Cl, 5.7 mM K2HPO4 and 0.1 mM EDTA), filtered through 40 lm filters and centrifugated again (400g, 10 min). The pellet was then resuspended in PBS containing 2 mM EDTA and 0.5% bovine serum albumin and the total number of cells was counted using trypan blue (Gibco, Courbevoie, France) and a neubauer hematocytometer (Poly Labo, Paul Block & Cie, Starsbourg, France). The cell count was confirmed by DNA determination using fluorimetric assay (Picogreen, Invitrogen Cergy Pontoise, France). 100 000 cells of the SVF were incubated with FITC-conjugated antibodies (CD4, F4/80), PE-conjugated antibody CD3, PerCP conjugated antibody CD45, PerCP–Cy5.5 conjugated antibody CD11b, APC-conjugated antibody (CD8, CD19 and NK-1.1) and respective isotype control. Analyses were performed using a FACSCalibur flow cytometer and the CellQuest Pro software (BD Bioscience). The total number of each leukocyte population present in the AT depot was calculated as a product of the percentage of each cell type determined by the flow cytometry analyses and the total number of SVF cells. Statistical analysis. Values are given as mean ± SEM for (n) separate experiments. Comparisons between groups were analysed by ANOVA for experiments with more than two subgroups followed by post hoc tests and the non-parametric Mann–Whitney test or Student’s t test, when appropriate (Prism 4, GraphPad Software, USA). Differences were considered significant when P < 0.05. +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks 3000 ** 2000 ** 1000 * 0 +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks Fig. 1. Onset of diet-induced obesity in wild-type and RAG2( / ) mice under high fat diet. (A) Body weight gain of wild-type(+/+) and RAG2( / ) mice under high fat diet (HFD filled symbol) or normal diet (ND open symbol) for 12 weeks. Values are means ± SEM ((+/+) n = 15; RAG2( / ) n = 11). (B) Body fat mass determined by quantitative magnetic resonance and (C) epidydimal fat pad weight of wild-type fed under normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and of RAG2( / ) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars, respectively, n = 11). Values are means ± SEM, *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND. 2.5×10 4 Glycemia Area under the curve 2 * 2.0×10 4 * 1.5×10 4 1.0×10 4 5.0×10 3 0 +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks Fig. 2. Glucose tolerance in wild-type and RAG2( / ) mice under high fat diet. Intra peritoneal glucose tolerance tests were performed in wild-type mice fed under normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in RAG2( / ) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars, respectively, n = 9). *P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND. Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002 ARTICLE IN PRESS 3 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx Lack of lymphocytes is associated with the promotion of the accumulation of innate cells within the adipose tissue B * 1.5×10 4 +/+ 3 AT T lymphocytes (Number/depot) 9.0×10 4 C +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks * 6.0×10 4 3.0×10 4 0 +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks ** 1.0×10 6 D * 7.5×10 5 5.0×10 5 * 2.5×10 5 0 Discussion +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks ** 9.0×10 5 AT NK cells (Number/depot) Studies on the inflammatory process in obesity and insulin resistance have mainly focused on the cells from the innate system and more specifically on macrophages. Indeed, mostly by the use of immunohistochemical analyses and macrophage-specific transcript expression analyses, it has been established that long-term HFD diet (20 weeks or more) is associated with an accumulation of proinflammatory macrophages within adipose tissue and insulin resistance [6,7]. Our studies performed in humans using flow cytometry showed a body mass index-dependent increase in macrophage number within the subcutaneous [5] as well as visceral [8] adipose tissues. Since treatments with anti-diabetic drugs [6] and mice deficient in chemokines or chemokine receptors [9,10] involved in the recruitment of blood monocyte into tissues were shown to affect both adipose tissue macrophage inflammatory phenotype and insulin sensitivity, it was concluded that the accumulation of adipose tissue inflammatory macrophages in the obese state was a major event involved in insulin resistance. These results were also supported by a decreased number of inflammatory cells after weight loss and parallel improvement in metabolic parameters observed in humans [11]. Several recent studies shed new light on another immune cell subset belonging to the adaptative immune system, namely the T-lymphocytes. Indeed, the studies of Caspar-Bauguil et al. [12] have clearly described the distinct lymphocytes subtypes present in fat depots. Recently, the work of Kintscher et al. [3] have shown mostly by the use of immunohistochemistry and gene expression analyses that T-lymphocyte specific markers are increased in mice fed under HFD. This precedes the appearance of enhanced macrophage-specific markers and was concomitant with the development of glucose intolerance. In * 3.0×10 4 0 AT macrophages (Number/depot) Flow cytometry analyses were performed on the stroma-vascular fraction (SVF) obtained after collagenase digestion of adipose tissues using CD19 as B-lymphocyte marker, both CD45 and CD3 to identify T-lymphocytes, the combination of CD11b and F4/80 as markers of activated macrophages and NK1.1 as a specific marker of natural killer cells. Adaptive immune B and T cells represented the minor populations of immune cells present in the fat depots of wild-type mice. B-lymphocytes increased after 3 weeks of HFD (3-fold increase in epidydimal compared to ND) and remained at similar levels for the next 9 weeks of HFD (Fig. 3A). T-lymphocyte numbers were enhanced after 6 weeks HFD (3-fold increase in epidydimal compared to ND) but decreased in the following 6 weeks of HFD (Fig. 3B). The numbers of macrophages were not modified during the first 6 weeks of diet but were markedly increased after 12 weeks HFD compared to ND (1.8-fold increase, Fig. 3C). The numbers of NK cells were not statistically modified by the diet (Fig. 3D). In RAG2( / ) mice, flow cytometry analyses demonstrated as expected the absence of B and T-lymphocytes within the SVF of the fat depots (Fig. 3A and B). A marked accumulation of activated macrophages was observed under HFD (3.6-fold increase compared to ND, Fig. 3C). Moreover RAG2( / ) mice under HFD exhibited a 4-fold increase in AT macrophage number compared to 12 weeks HFD wild-type mice (Fig. 3C). The number of NK cells was strongly increased under HFD (4.4-fold increase compared to ND, Fig. 3D). Moreover, RAG2( / ) mice under HFD exhibited a 9-fold increase in AT NK number compared to 12 weeks HFD wild-type mice (Fig. 3D). 4.5×10 4 A AT B lymphocytes (Number/depot) 12 weeks. The RAG2( / ) mice fed for 12 weeks under HFD exhibited similar insulin resistance than the wild-type mice (Fig. 2). ** 6.0×10 5 3.0×10 5 0 +/+ 3 +/+ +/+ RAG2-/6 12 Weeks Fig. 3. Immune cells present in adipose tissues in wild-type and RAG2( / ) mice under high fat diet. Multicolour FACS analyses were performed on the AT stromavascular fraction (SVF) from wild-type(+/+) fed under normal (ND, open bars) and HFD (filled bars) for 3, 6 and 12 weeks (n = 5), and in RAG2( / ) mice after 12 weeks ND or HFD (hatched open and filled bars, respectively, n = 9). (A) Numbers of AT CD19+ B-lymphocytes, (B) number of AT CD45+/CD3+ T-lymphocytes, (C) number of F4/80+/CD11b+ AT macrophages and (D) number of AT NK1.1+ NK cells. * P < 0.05; **P < 0.01 HFD versus ND; RAG2( / ) versus +/+. agreement with such observations, the results obtained in the present study show that the accumulation of T-lymphocytes, identified by flow cytometry analyses, occurs after 6 weeks of HFD in mice exhibiting a slight glucose intolerance. The T-lymphocyte accumulation preceded the increase in macrophages detected after Please cite this article in press as: C. Duffaut et al., Unexpected trafficking of immune cells within the adipose tissue during the onset of obesity, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2009), doi:10.1016/j.bbrc.2009.05.002 ARTICLE IN PRESS 4 C. Duffaut et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications xxx (2009) xxx–xxx 12 weeks of HFD. Whereas the initial accumulation of T-lymphocytes was due to an active recruitment, enhanced retention and/ or increased proliferation of T-lymphocytes within the adipose tissue remains to be clearly established. However, the other major cell population involved in adaptive immune response, i.e. the B cells, was found to accumulate into the fat pads as early as 3 weeks after initiation of HFD, before any statistical modulation of fat mass. The presence of B cells in the murine fat depots has already been documented [12] but no study has been dedicated to the potential early changes in adipose tissue B cells with HFD. It is thus tempting to speculate that the HFD per se in mice induces an initial early adaptive cell-mediated immune reaction within the adipose tissue that is, once resolved and/or exceeded as a consequence of the chronic HFD treatment, followed by the activation of the innate system. Two recent studies have suggested that adipose tissue T-lymphocytes might be involved in the recruitment of adipose tissue macrophages through their production of interferonc (IFNc), a typical Th1 type cytokine [3,13]. Therefore, to further analyse the respective contribution of adipose tissue lymphocytes in macrophage accumulation and genesis of insulin resistance, we studied mice deficient in functional T-and B-lymphocytes, i.e. RAG2( / ) mice. After 12 weeks HFD, the RAG2( / ) mice exhibited a similar gain in total fat and adipose mass and insulin resistant state than the wild-type mice. It is therefore suggested that the adaptive cells alone are not necessary for the initiation of obesity-associated insulin resistance, in agreement with the recent study published during the preparation of the paper [14]. Interestingly, the lack of T-and B-lymphocytes was associated with a dramatic increase of cells from the innate system, both NK cells and macrophages, within the adipose tissue. Though primarily considered as an integral part of the innate immune response with potent cytotoxic effector functions, NK cells also produce chemokines and cytokines such as IFNc and TNFa [15]. Such products might thus be involved in macrophage recruitment and genesis of insulin resistance. Although the exact role of the NK cells in macrophage recruitment and the mechanisms responsible for accumulation of NK cells under HFD remain to be defined, the present results demonstrate that the lack of B- and T-lymphocytes promotes a marked innate immune reaction within the adipose tissue. A study performed in various strains of immunodeficient mice, including RAG mice, has shown that the lack of lymphocytes was associated with an over reaction of innate immunity and, more particularly, NK cells [16]. Based on these observations, it was suggested that lymphocytes may act as negative regulator of the innate system to control for an unwanted excessive inflammatory response. It is thus tempting to speculate that the early lymphocyte infiltration within the adipose tissue that was observed in wild-type mice might be considered a protective and specific process to temper the HFD-induced adipose tissue inflammation, rather than a positive reinforcement to the innate response. In conclusion, the present study demonstrates that the adipose tissue is the site of an unexpected dynamic in immune cell trafficking during the onset of diet-induced obesity and insulin resistance. It involves both adaptive B and T immune cells as well as innate NK cells and macrophages. Therefore, the settlement of the inflammatory profile described during the onset of diet-induced obesity and the relative roles of the adaptive and innate cells are certainly more complex and dynamic than previously suspected. Moreover, the clear delineations between early and late inflammatory events taking place within the adipose tissue as a consequence of acute and chronic changes of diet, obesity and/or insulin resistance are required to definitively understand the relative role of adipose tissue immune cells. Acknowledgments This study was supported by grants from the INSERM (AVENIR), Agence Nationale de la Recherche (ANR ‘‘RIOMA”), Seventh Framework Programme of the European Community (EC) for research (FP7 ADAPT) and Pierre Fabre Laboratories. We thank the staff of the animal facilities (IFR31, Toulouse, France) and the functional exploration team (S. Le Gonidec, IFR31, Toulouse, France). The authors thank Dr. Dylan Thompson (University of Bath, UK) for his critical reading of the paper. References [1] G.S. Hotamisligil, Inflammation and metabolic disorders, Nature 444 (2006) 860–867. [2] A. Bouloumie, C.A. Curat, C. Sengenes, K. Lolmede, A. Miranville, R. Busse, Role of macrophage tissue infiltration in metabolic diseases, Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 8 (2005) 347–354. [3] U. Kintscher, M. Hartge, K. Hess, A. Foryst-Ludwig, M. Clemenz, M. Wabitsch, P. Fischer-Posovszky, T.F. Barth, D. Dragun, T. Skurk, H. Hauner, M. Bluher, T. Unger, A.M. Wolf, U. Knippschild, V. Hombach, N. Marx, T-lymphocyte infiltration in visceral adipose tissue. A primary event in adipose tissue inflammation and the development of obesity-mediated insulin resistance, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (2008) 1304–1310. [4] A. Bouloumie, L. Casteilla, M. 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Dans notre étude, nous mettons en évidence une accumulation plus précoce des lymphocytes B à 3 semaines de régime enrichi en lipides qui précède celle des lymphocytes T à 6 semaines. A 12 semaines, lorsque l’obésité et l’insulinorésistance sont présentes, ce sont les macrophages qui augmentent dans le tissu adipeux épididymaire tandis que les cellules NK ne varient pas de manière significative. Ces résultats ne confirment pas exactement les premières études de cytométrie sur les lymphocytes dans le tissu adipeux dans lesquelles 12 semaines de régime enrichi en lipides ne modifiaient pas les pourcentages de lymphocytes T et diminuaient le pourcentage de cellules NK (211). Cependant, notre manière d’exprimer les données n’est pas similaire. En effet, dans cette étude, les auteurs exprimaient leurs résultats en pourcentage des cellules de la fraction stroma-vasculaire alors que nous exprimons les nôtres en nombre par dépôt entier. Nous pensons en effet qu’il est plus représentatif de ramener les pourcentages obtenus au nombre total de cellules de la fraction stroma-vasculaire par dépôt adipeux entier. Ceci permet d’évaluer dans le dépôt, la dynamique des cellules immunes indépendamment des autres cellules de la fraction stromavasculaire, cellules endothéliales et cellules progénitrices et indépendamment de l’état d’hypertrophie et/ou d’hyperplasie adipocytaire. Les résultats que nous avons obtenus suggèrent donc que le trafic des cellules immunes dans le tissu adipeux lors de l’établissement de l’obésité induite par un régime hyperlipidique est plus complexe que celui décrit. Il reste à déterminer si ces modulations de nombre de cellules sont dues à un recrutement actif et/ou prolifération et/ou apoptose et/ou une émigration cellulaire et à déterminer les mécanismes 88 impliqués. De plus, il conviendra de déterminer si ces modulations cellulaires sont liées à l’obésité per se et/ ou au régime. En effet, des études récentes suggèrent que le LPS associé au régime enrichi en lipide pourrait être à l’origine d’une inflammation du tissu adipeux (212). Les études de Kintscher et al. ont proposé l’hypothèse d’un rôle primaire des lymphocytes dans l’établissement de l’état inflammatoire du tissu adipeux avec l’obésité (210). De plus, les études de Rocha et al. ont suggéré que les lymphocytes via leur production d’IFNγ stimuleraient la production de facteurs chemoattractants des macrophages par les adipocytes et les préadipocytes (213). Afin d’étudier le rôle potentiel des lymphocytes sur le recrutement des macrophages dans le tissu adipeux avec l’obésité, nous avons évalué l’effet de la déficience en lymphocytes, chez les souris B6/RAG2(-/-), sur le développement de l’inflammation dans le tissu adipeux au cours de la mise en place de l’obésité et de la résistance à l’insuline. Les souris déficientes en lymphocytes ont à 12 semaines de régime enrichi en lipides, une prise de poids et une tolérance au glucose comparables à leurs homologues sauvages. Cependant, la déficience en lymphocytes, confirmée par cytométrie en flux, dans le tissu adipeux s’accompagne d’une augmentation massive de cellules NK et de macrophages. Ces résultats suggèrent donc que la présence des lymphocytes n’est pas nécessaire à l’installation de l’obésité et de l’insulinorésistance et sont en accord avec les travaux récents de Sultan et al. (214). Cependant, des mesures complémentaires seraient nécessaires, plus particulièrement sur l’expression de facteurs inflammatoires dans le tissu adipeux des souris RAG2(-/-) et des souris sauvages en régime hyperlipidique afin de déterminer si l’augmentation marquée du nombre des cellules du système inné s’accompagne ou non d’un développement plus marqué d’un phénotype inflammatoire associé à l’obésité comparé à celui des animaux sauvages. De plus, une étude permettant de suivre plus longtemps les animaux en régime hyperlipidique, devrait permettre de déterminer si cette 89 augmentation des cellules innées dans le tissu adipeux s’associe avec une apparition plus rapide d’un diabète de type 2. Enfin, le rôle des cellules NK reste à définir. Deux hypothèses peuvent être posées: • Les cellules NK compensent la déficience en lymphocytes. En effet, il a été décrit que la déficience en lymphocytes dans différents modèles murins (215, 216) s’accompagne d’une compensation par les cellules NK qui seraient capables de jouer le rôle de lymphocytes mémoires et à reconnaissance spécifique en répondant à une stimulation antigénique plus classique (215). De plus, les cellules NK sont capables de produire des cytokines proinflammatoires, comme les lymphocytes T activés, telles que l’IFNγ et le TNFα (217). Il serait donc intéressant d’analyser la présence potentielle de macrophages dans le tissu adipeux de souris déficientes en cellules NK afin de déterminer si les cellules NK ont un rôle dans le recrutement des macrophages. De plus l’analyse du nombre et de la taille des adipocytes matures isolés de ces souris ainsi que de leurs capacités lipolytiques et lipogéniques pourrait nous indiquer si l’absence de cellules NK provoque une altération du métabolisme adipoctyaire. • Les lymphocytes ont un rôle freinateur sur la réponse innée et en leur absence une réponse innée excessive se développe. Cette hypothèse a été posée par l’équipe de Kim et al. à partir d’observations réalisées sur des modèles de souris immunodéficientes. Dans ces souris, en l’absence de lymphocytes, se développe une réaction innée excessive due à la production massive de cytokines par les cellules NK et dendritiques (218). Ainsi dans nos modèles, RAG2(-/-) en régime hyperlipidique, la réponse innée non tempérée par la réponse adaptative pourrait se développer de manière excessive. 90 Partie 3 : Conclusion générale et perspectives 91 I Identification des lymphocytes du tissu adipeux humain Ce travail de thèse avait pour premier objectif de caractériser les lymphocytes du tissu adipeux humain. Ces travaux ont mis en évidence que les populations de lymphocytes présentes dans le tissu adipeux humain sont principalement des lymphocytes T (CD3+) auxiliaires (CD4+) et cytotoxiques (CD8+). Les lymphocytes B, identifiés par le marqueur CD19, et les cellules NKT (CD3+/CD56+) sont détectés à de très faibles niveaux dans le tissu adipeux. Quant aux lymphocytes de l’immunité innée, NK et γδ, ils sont également présents dans de faibles proportions. Les lymphocytes T sont des effecteurs (CD45RO-RA-) et des mémoires (CD45RO+). Nous avons également montré que les nombres de lymphocytes T CD4+ et CD8+ du tissu adipeux sont positivement corrélés avec l’indice de masse corporelle (IMC) comme index d’adiposité. En revanche, cet indice n’est pas associé à une modification du nombre de cellules NK et NKT au sein du tissu adipeux. Le nombre de lymphocytes T est également augmenté dans le tissu adipeux viscéral par rapport au tissu sous-cutané chez les obèses morbides. Les CD4+ mémoires ainsi que les CD8+ effecteurs et mémoires s’accumulent préférentiellement dans le tissu adipeux interne. Enfin il serait intéressant d’étudier l’influence de l’index d’adiposité des patients sur le nombre de lymphocytes T et de sous-types de cellules mémoires et effectrices. II Accumulation des lymphocytes T dans le tissu adipeux humain L’accumulation des lymphocytes au cours de l’obésité pourrait s’expliquer par un recrutement, une prolifération ou une anti-apoptose des lymphocytes dans le tissu adipeux. Nous avons montré que le tissu adipeux produit des chimiokines de lymphocytes comme CCL20 ou encore RANTES qui sont connues pour influencer le recrutement des lymphocytes 92 aux lieux d’infection (192-194, 206). CCL20, via son interaction avec son récepteur CCR6, dont nous avons montré l’expression spécifique par les lymphocytes du tissu adipeux humain, pourrait influencer le recrutement actif des lymphocytes au sein du tissu adipeux. En effet, son expression dans l’adipocyte mature est augmentée chez les patients obèses par rapport aux patients normo-pondérés et est plus forte dans les adipocytes viscéraux que sous-cutanés. Il est cependant nécessaire de confirmer ces résultats avec des approches permettant de quantifier les protéines correspondantes à l’aide d’ELISA sur des milieux conditionnés par les adipocytes matures et d’analyses par cytométrie en flux sur les lymphocytes isolés du tissu adipeux. De plus, nos résultats montrent que les macrophages du tissu adipeux pourraient augmenter l’expression de CCL20 dans l’adipocyte et suggèrent donc que les macrophages pourraient indirectement participer au recrutement des lymphocytes. Par ailleurs, l’accumulation de lymphocytes pourrait être due à une prolifération active des lymphocytes résidents dans le tissu. De fait, nous avons montré que les cellules de la fraction stroma-vasculaire expriment de l’IL-7 qui est impliquée dans l’induction du phénotype mémoire, dans la survie et la prolifération des lymphocytes T (201). De plus, nos résultats de cytométrie en flux montrent que plus de 50% des lymphocytes du tissu adipeux humain expriment le récepteur à l’IL-7. Nous avons également montré que les macrophages expriment également de l’IL-15 qui favorise la prolifération et la différenciation des lymphocytes T CD8+ (69). Pour finir, le tissu adipeux est le site principal de production de la leptine dont les propriétés pro-proliférantes sur certains types de lymphocytes et antiapoptotiques ont été décrites (164). Ainsi, les lymphocytes du tissu adipeux humain sont donc dans un contexte cytokinique favorisant leur prolifération et limitant leur apoptose qui pourrait participer à l’expansion de cette population. Des test de prolifération in vitro sur les lymphocytes isolés du tissu adipeux nous renseigneraient de manière plus précise sur l’effet in situ des ces différentes cytokines. 93 III Caractérisation phénotypique des lymphocytes du tissu adipeux humain L’approfondissement du phénotype des lymphocytes auxiliaires montre qu’ils ne sont pas Th2, l’absence d’expression d’IL-4 excluant cette voie. Ces lymphocytes sont plutôt engagés dans une voie Th1 (ils expriment IL-2 et IFNγ et produisent IFNγ) qui semble prédominante chez les patients en surpoids. Chez les obèses un nouveau phénotype Th17 pourrait apparaître puisque certains de ces lymphocytes expriment de l’IL-17. Il aurait été intéressant d’étudier les variations de phénotype liées à la localisation, malheureusement les très faibles quantités de lymphocytes isolés de tissu adipeux sous-cutané et viscéraux des patients obèses morbides n’ont pas permis cette étude. Les polarisations en Th1 et Th17 dépendent, comme nous l’avons vu en introduction, d’un contexte cytokinique très précis (45). Les autres cellules présentes au sein du tissu adipeux peuvent donc influencer ces polarisations. Nos résultats montrent que les macrophages du tissu adipeux traités par les sécrétions lymphocytaires expriment de l’IL-23 et de l’IL-1β reconnus pour stimuler chez l’homme la voie Th17 (219), et du TGFβ qui participe à l’initiation la voie Th17 de manière indirecte en inhibant les autres types de polarisation (208). Des travaux complémentaires sont nécessaires afin de préciser par détection intracellulaire la production d’IL-17 en cytométrie en flux et d’analyser les effets de milieux conditionnés par les macrophages mais également par les adipocytes sur le phénotype des lymphocytes. 94 IV Rôle des lymphocytes dans le tissu adipeux Au niveau histo-morphologique, les lymphocytes sont organisés dans le tissu adipeux en amas de cellules immunes à proximité des macrophages et des adipocytes comme le suggèrent nos résultats d’immunohistofluorescence ainsi que la littérature (188, 210). Ces contacts étroits au sein du tissu adipeux nous ont conduits à regarder les effets des lymphocytes sur les adipocytes et les macrophages via leur production de facteurs solubles. Nous avons montré que les lymphocytes influençaient l’expression de marqueurs macrophagiques M1 (IL-23) comme M2 (IL-10), on peut donc supposer qu’ils ne jouent pas un rôle direct sur la polarisation des macrophages mais plutôt un rôle indirect sur leur propre polarisation via l’expression de cytokines qui pourrait les induire dans une voie plutôt qu’une autre. Ces produits solubles affectent également les cellules progénitrices en inhibant leur différenciation. Ces observations sont en accord avec les études de Wu et al. montrant que la différenciation des précurseurs adipocytaires murins 3T3-L1 était inhibée en présence de lymphocytes T activés (206). Enfin, les sécrétions lymphocytaires ont un effet antilipogénique via l’inhibition de l’effet de l’insuline sur les enzymes de la lipogenèse. Cet effet, reversé par un anticorps neutralisant anti-IFNγ, semble du à l’IFNγ sécrété par les lymphocytes. Ces résultats nous autorisent à penser que les lymphocytes dans le tissu adipeux pourraient, en inhibant des voies métaboliques dépendantes de l’insuline, participer au développement de l’insulinorésistance associée à l’état inflammatoire du tissu adipeux. Il n’est pas exclu que les effets des lymphocytes puissent impliquer des interactions cellule/cellule au sein des amas cellulaires. De fait, les adipocytes expriment le CD40 et son activation par le CD40L exprimé par les lymphocytes altère le métabolisme de l’adipocyte en inhibant l’expression des gènes de la lipogenèse et en activant la lipolyse (188). 95 Nos expériences de microscopie révèlent que ces amas de cellules immunes sont localisés au contact de certains adipocytes dans le tissu adipeux. Ce résultat est en accord avec les études histo-morphologiques de Cinti et al. qui avaient déjà révélé que les macrophages se localisaient en couronne autour des adipocytes nécrotiques (220). Nous pouvons donc nous interroger sur l’initiation de ces contacts cellulaires. Les lymphocytes ne sont-ils localisés qu’à proximité des adipocytes en souffrance? Les adipocytes expriment-ils à leur surface un facteur spécifique qui va attirer les lymphocytes directement ou indirectement via l’attraction des macrophages qui pourraient recruter à leur tour les lymphocytes? V Spécificité des lymphocytes du tissu adipeux humain La présence des lymphocytes au sein du tissu adipeux et son augmentation par l’obésité pose la question de savoir si le recrutement est potentiellement un phénomène actif médié par une réaction immune spécifique dans laquelle les lymphocytes seraient impliqués. La présence de lymphocytes avec un phénotype particulier à l’intérieur du tissu adipeux trace le schéma d’une réaction immune classique où les CPAs pourraient présenter un antigène spécifique aux lymphocytes du tissu adipeux. Ce phénomène pourrait expliquer leur recrutement et leur prolifération au sein du tissu adipeux. Cet antigène pourrait être de nature peptidique présenté de manière classique par le CMH II présent sur les macrophages du tissu adipeux (185). La présentation d’un antigène peptidique requiert des CPAs qui sont présentes en grand nombre dans le tissu adipeux et dont le pourcentage est augmenté avec le développement de la masse grasse. Cette hypothèse est actuellement en cours d’étude dans le laboratoire par une analyse du répertoire TCR des lymphocytes isolés du tissu adipeux. En effet, il est possible d’analyser le répertoire TCRβ en utilisant des anticorps dirigés contre le domaine Vβ des molécules du TCRαβ qui couvrent 65-70% des domaines Vβ présents dans 96 les lymphocytes T circulants (221, 222). De plus, la découverte d’un antigène spécifique relié à l’activation et à la prolifération des lymphocytes au sein du tissu adipeux permettrait de cibler spécifiquement cette population dans un but thérapeutique, soit afin d’activer les lymphocytes de façon à permettre à la réaction immune de se mettre en place, soit au contraire de les inhiber afin de limiter leur entrée dans le tissu adipeux. Cette question sur la nécessité de les inhiber afin de freiner le développement de l’insulinorésistance ou bien au contraire de les activer afin de limiter l’extension de la masse grasse reste ouverte à ce niveau de nos investigations. VI Différences observées avec les modèles murins Les études menées sur les animaux nous ont permis de mettre en évidence que les populations cellulaires immunes du tissu adipeux étaient en partie différentes de celles présentes chez l’homme. On retrouve dans le tissu adipeux de souris soumises à un régime hyperlipidique des lymphocytes B, des cellules de l’immunité innée NK et NKT en plus des lymphocytes T et des macrophages. Ces différences montrent qu’il faut rester prudent lorsqu’on étudie l’obésité sur les modèles animaux qui ne sont pas toujours représentatifs des observations faites chez l’homme. De plus les temps de régime chez la souris nous permettent d’observer le développement de l’obésité et le début de son installation, mais ne sont pas indicateurs des évènements qui ont lieu dans le tissu adipeux humain lorsque l’état d’obésité s’est installé. Les résultats d’analyses des cellules de la fraction stroma vasculaire par cytométrie en flux chez la souris montrent une inflammation qui se développe très précocement avec la prise de poids, les premières cellules immunes ie les lymphocytes B augmentent dès 3 semaines de régime, suivis par les lymphocytes T à 6 semaines puis par les macrophages à 12 semaines. Ces résultats sont «en accord» avec le phénotype très inflammatoire observé chez les 97 lymphocytes isolés de patients en surpoids. L’absence d’informations précises sur l’historique de nos patients nous empêche de tirer des conclusions. Toutefois, chez l’homme, l’ensemble de nos résultats tend à montrer que le phénotype Th1, pro-inflammatoire des cellules T lors du développement de l’obésité, pourrait évoluer en phénotype chronique Th17 lorsque l’obésité est installée. Il serait intéressant de travailler sur des patients dont on connaît précisément l’historique de prise et de perte de poids ainsi que le nombre d’années d’obésité. Un modèle animal plus représentatif de l’homme serait de visualiser «l’effet yoyo» chez les souris en les mettant en alternance de régime gras et de régime normal. La méthode permettrait d’analyser l’effet de la prise et de la perte de poids successives sur les populations immunes du tissu adipeux. Enfin, l’utilisation de modèles animaux plus âgés, en régime enrichi en lipides pendant plusieurs mois, nous permettrait probablement d’accéder à des tissus dans lesquels une inflammation chronique a lieu. Pour finir nous avons tenté, dans un modèle animal déficient en lymphocytes, d’étudier le rôle précis des lymphocytes. Nos résultats sur ces souris semblent indiquer que l’absence de lymphocytes n’altère pas le développement de l’obésité, ni de l’insulinorésistance. Cependant, après 12 semaines de régime enrichi en lipides, les NK et les macrophages s’accumulent dans le tissu adipeux des souris RAG2(-/-). Ces résultats permettent de s’interroger sur le rôle des lymphocytes dans l’initiation de cet état inflammatoire chez l’animal. Il est possible que les lymphocytes soient des modérateurs d’une immunité innée qui réagit de manière (trop?) importante au développement du tissu adipeux. Il est également envisageable que les lymphocytes et les cellules NK jouent le même type de rôle pro-inflammatoire au sein du tissu adipeux et qu’une population soit capable de compenser l’autre lors d’invalidations génétiques. En effet il a été montré que les cellules NK pouvaient, dans certains cas d’immunodéficience, prendre le relais des lymphocytes et 98 répondre à une stimulation antigénique plus classique (215). Cette hypothèse est renforcée par les travaux menés chez l’homme qui ne présentent pas d’augmentation des cellules NK avec l’IMC. Afin de répondre à ces questions, il serait nécessaire de travailler sur des modèles de souris déficientes en cellules NK, par déplétion spécifique des cellules NK in vivo à l’aide d’anticorps dirigés contre NK1.1 ou encore AGM1 (223, 224) afin d’étudier leur réponse au régime en terme de métabolisme et de recrutement des autres partenaires immunitaires. 99 Partie 4 : Références Bibliographiques 100 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. Janeway, T., Walport Shlomchik. 2003. Immunobiology. Allen, L. A., and A. Aderem. 1996. Mechanisms of phagocytosis. Curr Opin Immunol 8:36. Minden, M. D., and T. W. Mak. 1986. The structure of the T cell antigen receptor genes in normal and malignant T cells. Blood 68:327. Roy, C. R. 2003. Immunology: professional secrets. Nature 425:351. Geissmann, F., S. Jung, and D. R. Littman. 2003. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity 19:71. Auffray, C., D. 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These cytokines are mainly produced by macrophages, previously described to accumulate in adipose tissue (AT) during obesity. My PhD work has been focussed on characterizing and analyzing the potential role of lymphocytes, immune partners of macrophages. Our results show that the number of lymphocytes presents in AT increases with the body mass index (BMI) and with the visceral AT location. Human AT lymphocytes are mainly effector and memory CD3+ CD4+ and CD3+ CD8+ T cells. A study on AT CD3+ lymphocyte-conditioned media allowed us to demonstrate an anti-adipogenic effect of lymphocytes on AT progenitor cells. In addition, these media inhibit the insulin-mediated effect on the expression of lipogenic enzymes from mature adipocytes. Murine models show a complex traffic of immune cells in adipose tissues during the onset of obesity and a marked accumulation of natural killer cells and macrophages in AT from immunodeficient mice. All these results allowed us to characterize the lymphocyte populations of the human AT and to demonstrate that their productions can modulate both the metabolism and the adipocyte differentiation. The data obtained on murine models suggest that adipose tissue lymphocytes could have a protective role limiting the development of an excessive innate inflammatory reaction. 114 Auteur : Carine DUFFAUT Titre : Les lymphocytes du tissu adipeux humain : caractérisation et rôles Directeur de thèse : Dr Anne BOULOUMIE et Dr Jean GALITZKY Lieu et date de soutenance : Toulouse, le 16 Juillet 2009 Résumé : L’obésité est associée à un état inflammatoire systémique de bas niveau et à une production excessive de cytokines pro-inflammatoires dans le tissu adipeux (TA). La principale source cellulaire de ces cytokines est le macrophage qui a été décrit pour s’accumuler dans le TA au cours de l’obésité. Ces travaux de thèse ont pour but de caractériser et d’analyser le rôle potentiel des partenaires immunitaires des macrophages, les lymphocytes dans le TA. Nos travaux montrent que le nombre de lymphocytes présents dans le TA humain augmente avec l’indice de masse corporelle (IMC) des patients ainsi qu’avec la localisation viscérale du TA. Les lymphocytes du TA humain sont majoritairement des cellules TCD3+, CD4+ et CD8+, effecteurs et mémoires. Nos études sur les milieux conditionnés par les lymphocytes CD3+ isolés du TA ont permis de démontrer que les lymphocytes ont un effet anti-adipogénique sur les cellules progénitrices. Sur les adipocytes matures, ils inhibent l’effet de l’insuline sur l’expression des enzymes de la lipogenèse. Les modèles animaux montrent une cinétique complexe de trafic des cellules immunes dans le TA au cours du développement de l’obésité et une accumulation forte de cellules natural killer et de macrophages dans le TA de souris immunodéficientes. L’ensemble de ce travail a permis de caractériser les populations lymphocytaires présentes dans le TA humain et de montrer que leurs productions peuvent moduler le métabolisme mais également la différenciation adipocytaire humaine. Les résultats obtenus sur les modèles murins suggèrent que les lymphocytes du TA pourraient exercer un rôle protecteur en limitant le développement d’une réaction inflammatoire innée excessive. Mots clés : lymphocytes, obésité, inflammation, tissu adipeux, lipogenèse Discipline : Innovation pharmacologique Intitulé et adresse du laboratoire : Equipe 1 - Réseau vasculaire, cellules progénitrices et cellules immunitaires du tissu adipeux- INSERM U858/I2MR, Bat L4 Hôpital de Rangueil, 1 avenue Jean Poulhès 31059 Toulouse 115