BIO121 annales
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Université Joseph Fourier - Grenoble I Année 2007-2008 ère Epreuve de BIO121 – 1 session – mai 2008 Durée : 2 heures Les documents, la calculette et le téléphone portable ne sont pas autorisés. Total des points /100 1er sujet : ancre GPI et association aux rafts (64 points) Les membranes plasmiques des cellules animales sont des assemblages moléculaires complexes qui contiennent des lipides, des protéines et des glucides. Une catégorie des ces protéines, les protéines ancrées par un glycophosphatidyl inositol, sont associées au feuillet externe de la membrane plasmique. 1. Rappelez les différents constituants d’une ancre GPI (5 points) - - d’un phosphatidylinositol, donc de deux acides gras (enchassés dans le feuillet externe de la membrane), d’une molécule de glycérol, d’un inositol phosphate, (3 points, un pour chaque constituant) de plusieurs oses dont le mannose (1 point) d’’un autre phosphate qui fait le lien avec la protéine via une éthanolamine (1 point) (attention, j’ai oublié de citer l’éthanolamine en tant que composant dans au moins la moitié des amphis Le cœur oligosaccharidique des protéines GPI-ancrées est composé de 3 mannoses et d’une N-acétylglucosamine. 2. Représentez en formule semi-développée de Haworth et sous forme pyranique, l’enchaînement d’oses suivants : Man α 1 – 2 Man α 1- 6 Man α 1- 4 GlcNac α 1 – (10 points) Mannose : 2,5 points Nacetyl glucosamine : 3 points, mettre 1,5 points sur les 3, si glucose 1,5 points par liaison 1 3. Annotez sur le schéma ci-dessous les molécules sans nom ? (cercles, rectangles etc…) (3 points) 0,5 points par molécules Ethanolamine phosphate phosphate phosphate inositol Glycerol Ac gras 4. Représenter la structure d’une membrane plasmique en insérant votre protéine-GPI représentée selon le schéma ci-dessus (4 points). Bicouche lipidique : 1 point Orientation ; extra/intracellulaire : 1 point 2 Insertion correcte de la séquence via ces 2 ac gras : 2 points 5. Quels sont les autres moyens d’association d’une protéine avec les lipides membranaires ? (3 points) - Ajout d’un acide gras (N-myristoylation ou S-palmitoylation) - Ajout d’un isoprényl (farnésyl ou géranyl-géranyl) - Ajout d’un cholestérol (certaines protéines de signalisation) 1 point par moyen Les phosphatidyl inositol sont largement utilisés par les cellules eucaryotes en tant que médiateurs cellulaires. La plupart de ces molécules contiennent un acide gras insaturé sur le Carbone 2 du glycérol. Au contraire, les phosphatidyl inositol des ancres GPI contiennent un acide gras saturé en C2 du glycérol, ce qui est inattendu. 6. Donner la signification des termes « acides gras saturés » et « acides gras insaturés » (2 points) Ac gras saturé : pas de Double liaison (1 point) Ac gras insaturé : présence de Double liaison (1 point) 7. Représentez ci-dessous un phosphatidyl inositol utilisé pour la construction des ancres GPI. Numérotez les carbones du glycérol. (8 points) Inositol : 2 Points Phosphate : 1 point Glycérol : 2 point R1 et R2 : 1 Bonnes liaisons : 2 points R1 et R2 : ils doivent donner la formule d’un acide gras saturé, ex : le palmitique (C16 :0) ou l’acide stéarique (C18 :0) 3 L’addition de l’ancre GPI sur la protéine se fait une fois que la synthèse de la chaîne d’acides aminés est terminée, au niveau du réticulum endoplasmique de la cellule. Une petite séquence d’acides aminés située dans la partie C-terminale de la protéine (séquence appelée «séquence de reconnaissance pour l’addition d’une ancre GPI») est clivée, ce qui permet de la lier à l’ancre GPI par liaison covalente.En mettant à profit des mutations conduisant à des défauts d’attachement de l’ancre GPI sur les protéines, les chercheurs ont reconstitué une partie de la voie de biosynthèse des protéines GPIancrées. 1) au niveau du réticulum endoplasmique, les protéines-GPI contiennent un acide gras saturé et un acide gras poly-insaturé. 2) au niveau de l’appareil de Golgi, grâce à une enzyme, la phospholipase A, elles sont d’abord converties en lyso-GPI. 8. Quel est le rôle d’une phospholipase? (2 points) 9. Indiquer en quoi un lyso-phosphatidyl inositol diffèere d’un phosphatidyl inositol(2 points) R2 n’existe pas 3) Puis, la lyso-GPI est modifiée par l’addition d’un acide stéarique. La protéine modifiée est ensuite transportée vers le feuillet externe de la membrane plasmique où elles se retrouvent associées aux rafts lipidiques (radeaux lipidiques).Si elle n’est pas modifiée par l’acide stéarique, la lyso-GPI est rapidement clivée par une lyso-phospholipase D de surface puis sécrétée dans le milieu extracellulaire. 10. Rappelez quels sont les types de lipides que l’on retrouve en abondance au niveau des rafts (2 points). Cholestérol (1 point) 4 Shingolipides (1 point) Afin de préciser quels sont les facteurs qui contrôlent la distribution des protéines GPIancrées dans les rafts, les chercheurs ont utilisé des systèmes de membranes reconstituées avec des quantités équimolaires de : - -sphingomyéline dont l’acide gras est soit le C18 :0 soit le C16 :0 - cholestérol - dioléyl phosphatidylcholine (DOPC) (acide oléique : C18 : 1(9)). La membrane dipeptidase (MDP) est utilisée comme une protéine modèle GPI-ancrée dans ces systèmes de membranes. L’analyse de la distribution de cette enzymes est possible grâce à une technique particulière de microscopie appelée « Atomic Force Microscopy ». 12. Quels sont les noms usuels du C16 :0 et du C18 :0 ? A quelle famille de lipides appartiennent-ils ? (3 points) C16 :0 acide palmitique (1 point) C18 :0 : acide stéarique (1 point) Ce sont des acides gras saturés (1 point) 13. Représentez les formules semi-développées des trois types de molécules constitutives des membranes modèles utilisées par les chercheurs (9 points) 3 points par molécule Sphingomyéline contenant le C16 :0 Nervonate à remplacer par leC16 :0 Phosphatidylcholine 5 cholestérol Alcool 1 insaturation secondaire en C3 Dioléyl phosphatidyl choline CH3 HO-CH2-CH2-N+-CH3 CH3 R = acide oléique C18 : 1(9) Dioléyl phosphatidyl choline lécithines (jaune d’œuf) Les résultats obtenus grâce à la technique de « Atomic Force Microscopy » présentés sur les figures a et b (ci-dessous), ont permis de mettre en évidence la distribution de la MDP dans les deux types utilisés de membranes modèles. Les points blancs qui apparaissent sur les figures a et b représentent les molécules de MDP. 14. Annotez sur les photos a et b ci-dessous où se trouvent les différentes catégories de lipides utilisés pour former les membranes modèles. Annotez les rafts sur chacune des deux photos (4 points) 6 1 point par case Rafts . .. Lipides ? DOPC Molécules de MDP . . . . . . Lipides ? DOPC lipides ? Cholestérol SM lipides ? Cholestérol SM (a) membranes reconstituées avec de la sphingomyéline dont l’acide gras est le C16 : 0. (b) membranes reconstituées avec de la sphingomyéline dont l’acide gras est le C18 : 0. Echelle : 1 µm 15. Quelles observations pouvez vous faire à partir des ces clichés. Donnez vos conclusions. (3 points) La MDP est associée aux rafts seulement lorsque ceux-ci comprennent de la sphingomyéline dont l’acide gras est le C18 :0. Donc la longueur de la chaîne de carbones constitutive de l’acide gras influe sur l’association de la MDP (et peut être plus généralement des protéines GPI-ancrées) aux rafts. 16. En rassemblant vos connaissances ainsi que l’ensemble des informations collectées au travers de cet exercice, complétez le plus précisément possible sur le schéma de la cellule représentée ci-dessous, la voie de biosynthèse des protéines GPI-ancrées : depuis leur séquence en ADN jusqu’à leur localisation terminale dans la cellule, indiquez dans quels compartiments on trouve leurs précurseurs. NB : le cas d’une protéine GPI-ancrée ainsi que d’une protéine modifiée par une lyso-GPI doivent être considérés (6 points). 7 Réticulum Endoplasmiqu Noya 1- Noyau : synthèse de l’ARNm codant pour la protéine (1 point 2- Reticulum : traduction de l’ARNm en chîne d’acides aminés et reconnaissance de la séquence C-terminale, clivage et addition covalente d’un ancre GPI contenant un acide gras saturé et un acide gras insaturé (2 points) 3- Golgi : clivage de l’acide gras poly-insaturé par la phospholipase A et formation d’une protéine modifiée par une lyso-GPI. (1 point) Vésicules de Appareil de Golgi Membrane plasmique 4- addition d’un acide stéarique sur le glycérol de la protéine modifiée par la lyso-GPI (1 point) 4’- protéine modifiée par une lyso-GPI : clivage par la lyso-phospholipase D et sécrétion de la protéine dans le milieu extracellulaire. (1 point) 5- export de la protéine GPI-ancrée à la membrane plasmique et association aux rafts (1 point) 13. Proposez une hypothèse pour expliquer l’importance de l’acide stéarique dans l’ancre GPI (1 point). On a vu que les rafts doivent comprendre de la sphingomyéline avec un acide gras à 18 carbones pour permettre l’association de protéines GPI-ancrées et que les acides gras de l’ancre GPI contiennent au moins un acide gras à 18 carbones. L’adaptation des deux types de chaînes carbonées permet peut être d’établir des liaisons hydrophobes sur toute la longueur de la chaîne carbonée et donc de stabiliser l’ensemble. 8 2ème sujet : Exemple d’une protéine GPI-ancrée, la protéine PrP (30 points) La protéine prion (PrP), appartenant à la famille des protéine GPI, est constituée de 209 résidus organisés en deux domaines : une région N-terminale sans structure secondaire et un coeur structuré présentant 3 hélices α et un petit feuillet β anti-parallèle (positions respectives dans la chaîne d’acides aminés : 128-131 et 161-164). La substitution d’un résidu à la position 129 par un autre résidu est à l’origine d’une forme génétique des maladies humaines à prion: la maladie de Creutzfeldt-Jakob. 1) Définir la notion de structure secondaire (2 points) Structure locale, répétitive et relativement compacte impliquant des acides aminés très proches dans la structure primaire 2) Citer les différents types de liaisons capables de stabiliser la structure secondaire (1 point) Liaisons hydrogènes A partir de la PrP, on définit le peptide A 128-131, A’ le peptide substitué à la position 129 et B le peptide 161-164. Sur A, l’action du DNFB permet d’identifier DNP-Tyr après hydrolyse acide. Le traitement par la carboxypeptidase A permet de libérer successivement un acide aminé dépourvu de carbone asymétrique et leu ; le bromure de cyanogène donne deux peptides dont un absorbe dans l’UV. L’action de la chymotrypsine sur A’ suivie de celle du chlorure de dansyl puis de l’hydrolyse acide fournit trois acides aminés dont un est dansylé : DANS-Val. Pour B, trois cycles successifs d’addition de phenylisothiocyanate libèrent successivement PTHAsn, PTH Gln puis PTH-Val. La protéolyse de B par la carboxypeptidase A libère un acide aminé dont la longueur d’onde d’émission de la fluorescence est de 300 nm. 3) Donner la séquence de A et justifier votre réponse (5 points) DNFB : Nterm (1 point) soit Tyr qui absorbe dans UV Carboxypeptidase A : cterm (1 point) gly leu AA sans Carbone assymétrique : Gly (1point) Bromure de cyanogène : c term met (1 point) Sequence : 1 point Tyr-Met-Leu-Gly 9 4) Donner la séquence de A’ et justifier votre réponse (5 points) Chymotrypsine : Cterm aromatique, ici c’est la tyr : (1 point) Clhorure de dansyl : Nterm (1 point) Derriere Tyr il y a une valine (1 point) Sequence : 2 points à part le valine les autres aa sont conservés (cf énoncé) 5) Tyr-Val-Leu-Gly Conclure sur l’origine de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (2 points) Mutation de Met et substitution par Val 6) Donner la séquence de B et justifier votre réponse (5 points) Phenylisothiocyanate (Nterm); 1 point Carboxypeptidase A : Cterm (1 point) Longueur d’onde 300 nm= tyr (1 point) Asn-Gln-Val-Tyr (2 points) 7) Ecrire l’ équilibre ionique et calculer le pHi du peptide A (6 points). Données : Pka αCOOH= 2,4 ; PKa αNH2= 9,1, PKa R= 10,1 * Attribution des bons pkA : 1,5 points : Pka αCOOH= 2,4 de la Tyr ; PKa αNH2= 9,1 de la Gly , PKa R= 10,1, chaine lateral Tyr * Double flèche pour équilibre : 1 point * Equilibre : 1 point * pHi = charge nulle (0,5 point) pHi= (Pka1 +PKa2)/2 Ici (2,4 + 9,1)/2= 11,5/2= 5,75 (2 points dont 1 pour la formule) 10 8) Donner la structure du feuillet β anti-parallèle de la protéine PrP à pH physiologique. Pour cela, écrire les formules des acides aminés sous forme semi-développée. Indiquer et annoter les liaisons formées entre les acides aminés (10 points). Tyr Met Leu Gly CH3 S ONH3+ CH C CH2 (CH2)2 O N CH O- - C H+ N CH H+ CH2 C H N CH COO- CH NH3+ H+ CH CH3 CH3 L.H OH COO- CH N CH2 H+ L.H L.H O- O- CH3 CH3 CH O- C CH C N H+ CH N (CH2)2 H+ C CH2 C O Tyr OH Val Gln C NH2 O NH2 Asn 1 point par acide amine (soit 7 points) 1 point pour liaison peptidique 2 points pour liaisons Hydrogènes correctes 11
