Intérêt du test d`activation des basophiles dans l`exploration de l
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BIOLOGIE DE L’ALLERGIE 9h -10h15: L'exploration de l'hypersensibilité de type I: des extraits allergéniques aux allergènes moléculaires- F.Bienvenu 10h15 -10h45: Présentation d'un dossier clinique. O. Marchand 10h45 -11h00: Discussion – Pause 11h00 -11h30: Le test d'activation des basophiles: intérêt et limites J.Bienvenu 11h30 -12h00: L'exploration de l'hypersensibilité de type IV: application à l'immunité antituberculeuse- L.Garnier 1 INTERET DU TEST D’ACTIVATION DES BASOPHILES DANS L’EXPLORATION DE L’ALLERGIE MEDICAMENTEUSE --- Biologie de l’allergie Lyon - 20 Février 2014 J. Bienvenu , S. Viel , P. Rouzaire , L. Garnier , et F. Bienvenu Laboratoire d’Immunologie CHU Lyon-Sud 2 … LES REACTIONS D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS Introduction Réactions d’hypersensibilité aux médicaments Hypersensibilité Allergique (HSA) Hypersensibilité Non-Allergique (HSNA) 3 LES REACTIONS Introduction D’HYPERSENSIBILITE AUX MEDICAMENTS Réactions d’hypersensibilité aux médicaments Hypersensibilité Allergique (HSA) Hypersensibilité Immédiate (HSI) < 1 heure IgE médiée Hypersensibilité Non-Allergique (HSNA) Hypersensibilité Retardée (HSR) 24 à 72 heures lymphocytes T 4 Biologie de l’hypersensibilité aux médicaments Biologie de l’hypersensibilité immédiate 9 Dosages de médiateurs solubles au moment de l’accident 9 Dosages d’IgE spécifiques 9 Techniques d’activation ex vivo de basophiles Biologie de l’hypersensibilité retardée 9 Tests de transformation lymphocytaire 9 Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie 9 Tests de détection de cytokines ( ELISPOT) 5 Biologie de l’hypersensibilité immédiate 9 Dosages de médiateurs solubles au moment de l’accident 9 Dosages d’IgE spécifiques 9 Techniques d’activation ex vivo de basophiles Biologie de l’hypersensibilité retardée 9 Tests de transformation lymphocytaire 9 Tests d’activation lymphocytaire en cytométrie 9 Tests de détection de cytokines ( ELISPOT) 6 Physiopathologie de l’hypersensibilité de type I : Phase de déclenchement Phase de sensibilisation IL-4,IL-5 CD4 Cellule Th2 Cellule B + allergène Basophile ou mastocyte sensibilisé DEGRANULATION IgE Plasmocyte But : activer in vitro des basophiles porteurs d’IgE spécifiques de l’allergène 7 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Pourquoi étudier le basophile ? 9 Activation des mastocytes et des basophiles à l’origine des réactions d’hypersensibilité immédiate 9 Accessibilité : Les basophiles sont présents dans le sang circulant contrairement aux mastocytes dont ils présentent la majorité des propriétés, en particulier pour détecter une sensibilisation 9 Les basophiles présentent à leur surface des récepteurs de forte affinité pour les IgE (FcεRI). Après «pontage» de ces récepteurs par l’allergène, les médiateurs libérés déclenchent les phénomènes allergiques 8 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile La signalisation… 9 Wu LC, J Biol Chem, 2011 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Concrètement pour nous… 2. Pontage des récepteurs RcεRI par l’allergène (via les IgE spécifiques de celui-ci) 1. Incubation des basophiles sensibilisés avec l’allergène ayant provoqué la réaction Expression constitutive faible de CD203c à la surface 3. Libération des médiateurs et modifications du phénotype du basophile Expression de CD63 à la surface Surexpression de CD203c à la surface 9 Dosage des médiateurs libérés 9 Mesure des modifications phénotypiques en cytométrie Relargage de médiateurs solubles 10 Cytométrie en Flux / Principes Suspension cellulaire Liquide de gaine Filtres dichroïques PMT 2 PMT 1 Filtres Laser Photodiode Granulosité (SSC) Taille (FSC) 11 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Principales stratégies utilisées : 9 Anti-IgE : Première stratégie décrite Peu spécifique (monocytes, éosinophiles, cellules dendritiques) Variation inter- et intra-individuelle de la densité des récepteurs des IgE 9 CD203c et anti-IgE : CD203c présent uniquement sur les basophiles au niveau du sang 9 CD123 et HLA-DR : CD123+ : IL3-R HLA-DR- : exclusion des monocytes 9 CCR3 et faible SSC : CCR3 présent sur les basophiles, éosinophiles, détectable sur les lymphocytes Th1 et Th2 9 CRTH2 et CD3 : CRTH2+ : récepteur de la prostaglandine D2 exprimé par les Th2, éosinophiles et basophiles CD3- : exclusion des lymphocytes Th2 12 Principe Applications CCR3 - faible SSC : Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile CRTH2 - faible SSC - CD3 : Eosinophiles A CRTH2 Lymphocytes Th2 Basophiles 13 Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Principe Applications CD203c et CD63 sont les plus utilisés CD203c CD63 Nom Ectonucleotide Pyrophosphatase Phospho-diesterase (E-NPP3) Lysozyme Associated Membrane Protein (LAMP-3) Exprimé par Basophiles, mastocytes PBMCs, plaquettes Basophiles quiescents Expression constitutive faible - Non exprimé à la surface cellulaire - Exprimé à la surface des granules intracytoplasmiques Basophiles activés Sur-expression Expression à la surface cellulaire Cinétique Rapide (5-15 min) Plus lente (10-25 min) Effet de l’IL-3 Non induit par l’IL-3 (ou processus lent, >90min) Induction par l’IL-3 Magnitude de variation Fonction Données contradictoires dans la littérature Inconnue Associée à la libération des médiateurs 14 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile CD203c et CD63 sont les plus utilisés 9 NB : d’autres marqueurs « d’activation » décrits : : • CD63 « like » : CD107a , plus associés à la dégranulation • CD203c « like » : CD13, CD164 , plus associés au « priming » et à l’activation 15 Ebo DG, Allergy, 2006 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Protocole de routine au laboratoire : Témoin négatif PBS Témoin positif Tubes tests 20 µL Anti-IgE 20 µL Allergène dilué 20 µL CRTH2-FITC 10 µL 10 µL 10 µL CD203c-PE 10 µL 10 µL 10 µL CD3-PC5 10 µL 10 µL 10 µL Solution d’activation 100 µL 100 µL 100 µL Sang (EDTA) 100 µL 100 µL 100 µL 9 Vortexer et incuber 15 minutes à 37°C. 9 Ajouter 2mL de solution de lyse 9 Vortexer et incuber 10 minutes à température ambiante 9 Centrifugation 5 minutes à 200g - Laver en PBS 9 Reprendre avec du PBS / 0,1% PFA 9 Vortexer 5 secondes et analyser au cytomètre 16 Principe Applications Considérations générales Marqueurs d’identification du basophile Marqueurs d’activation du basophile Conditions importantes à respecter : 9 Réalisation de contrôles: • Contrôle négatif: en présence de tampon seul • Contrôle positif : stimulation par anti-IgE ou anti-récepteur FcεRI N.B. ≈ 10% de non répondeurs ( ↓ Syk) 9 Réalisation des dilutions de médicaments: • Au moins 3 dilutions en se basant sur le Prick Test et couvrant 3 log • Utiliser des formes injectables • Vérifier l’absence de toxicité pour les basophiles 9 Critères d’interprétation des résultats: • Expression en % de basophiles activés et/ou index de stimulation • Seuil de positivité: 10% voire 5%, à définir pour chaque médicament • Activation beaucoup plus faible que pour les allergènes protéiques 17 Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire 9 Allergènes protéiques : excellente sensibilité à visée diagnostique pour le suivi de désensibilisation avant une réintroduction ou un TPO 9 Très utile lorsque les tests de détection d’IgE spécifiques ne sont pas disponibles pour les molécules impliquées : fréquent pour les médicaments 9 Médicaments : haptènes : monovalents le plus souvent Sous-entend donc la liaison à une protéine porteuse pour pouvoir ponter deux IgE et induire le signal d’activation Beaucoup plus difficile 18 Introduction Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… Pour quelles molécules ? 9 Béta-lactamines : Ebo DG et al., Expert Review, 2011 19 Introduction Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… Pour quelles molécules ? 9 β−lactamines : exemple de résultats Contrôle positif (anti-IgE) Allergène (Clamoxyl®) CD203c Contrôle négatif CRTH2 20 Introduction Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… Pour quelles molécules ? 9 Curares : Ebo DG et al., Expert Review, 2011 21 Introduction Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… Pour quelles molécules ? 9 La question des AINS : Ebo DG et al., Expert Review, 2011 Controversé, du fait du mécanisme non-IgE médié d’activation dans la plupart des cas : Déviation de la cascade de l’acide arachidonique vers la production de leucotriènes Résultats positifs chez des sujets sains tolérants Dose dépendant 22 Demande de TAB au laboratoire d’Immunologie du CHLS entre 2012 et 2013 (n=1840) Curares Augmentin Platines Clamoxyl Pyostacine Autres Rocephine Produits de Contraste 30% curares 3% 5% Antibiotiques 1% 2% 3% 9% 47% Introduction Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… Principe Applications Pour quelles molécules ? 34 patients 9 Les quinolones : BAT negative negative positive 17 patients 17 patients skin test skin test positive negative 4 patients 13 patients 3x contraindicated 13x 2x 1x challenge test challenge test challenge test 13x negative 2x negative 1x positive 15 patients with non-allergic hypersensitivity 13 patients 4 patients 2x contraindicated positive 13 patients with high probability of allergic hypersensitivity 1 patient with allergic hypersensitivity 25 Rouzaire P et al., Int Arch Allerg and Clin Immunol, 2012 Introduction Principe Applications Considérations générales Hypersensibilités médicamenteuses Ce qu’il reste à faire… En conclusion : 9 Mise au point TAB aux médicaments difficile : médicaments = haptènes monovalents le plus souvent 9 Très utile lorsque la détermination des IgE spécifiques n’est pas possible 9 Intérêt pour la prise de décision de réintroduction d’un médicament 9 Utilité pour le choix d’une molécule qui ne donne pas de réaction croisée 9 Sensibilité faible, 9 Spécificité excellente 9 Nécessité d’augmenter la sensibilité 9 Nécessité de standardiser le test 26
