CHAPITRE 3 : LES PUCES À ADN I) Les différents types de puces à ADN 1.1. Puces génomique et puces à expression de gènes 1.2. Densité des puces et applications - Puces basse densité : 5 à 100 sondes par puces, puces génomiques utilisées en diagnostic Puces moyenne densité : 100 à 1000 sondes par puce, utilisées pour des études très ciblées comme la mutation d’un gène (délétion…) Puces haute densité : jusqu’à une centaine de milliers de sondes, pour les études de transcriptomes 1.3. Différents types de puces à ADN haute densité Plusieurs types en fonction : - du support utilisé (membrane de nylon, lame de verre) - de la nature des sondes de capture (PCR, oligos) - de la façon de fixer (« spotter ») les sondes au support (robot, photolithographie) - du type de marquage des cibles (élément radioactif, dUTP biotinylé permettant une détection colorimétrique ou fluorescente, dUTP couplé au Cy3 ou Cy5 = carbocyanines fluorescente) Ces expériences sont faites pour l’analyse des facteurs de transcription, on veut savoir où ils se fixent et donc quels gènes ils vont réguler. On traite les cellules vivantes au formaldéhyde, ce qui crée des liaisons covalentes entre le facteur de transcription et l’ADN. Après ce traitement, on extrait l’ADN des cellules et on le coupe en morceau, puis on va réaliser une immunoprécipitation. On ajoute l’anticorps lié directement ou indirectement au gel d’agarose puis on fait une centrifugation à basse vitesse, dans le culot la bille est liée à l’Ac qui est lié au facteur de transcription qui est lié à l’ADN d’intérêt, le surnageant va être jeté et on va analyser le culot. On se débarrasse des protéines fixées à l’ADN puis on réalise plusieurs PCR pour tester plusieurs gènes, on peut ainsi savoir si le facteur de transcription est lié au promoteur d’un gène. Dans le Chip-on-chip, on fait une PCR multiplexe puis on passe les produit sur une puce au lieu de les passer sur un gel, les spots s’allument et on sait où le facteur de transcription s’est fixé. CGH : hybridation génomique comparative : CGH : utilisée pour regarder le génome de cellules cancéreuses et voir s’il y a des amplifications de séquences ou des pertes de séquences. On marque l’ADN tumoral et l’ADN d’une cellule normale, on prend des chromosomes en métaphase et les fragments d’ADN des deux cellules vont s’hybrider sur le chromosome, on va ensuite rajouter un fluorochrome vert lié par exemple à la steptavidibiotine. La steptavidine et la biotine ont une forte affinité entre elles, on peut incorporer un nucléotide lié à la biotine qui ne gène pas l’hybridation puis une vidine déjà liée à un ou des flurochromes (la vidine comportant 4 sites de fixation à la biotine). On ajoute ensuite un Ac antidioxygénine couplé à un fluorochrome rouge pour reconnaître l’ADN normal. Si les deux ADN se sont fixés, on va avoir une fluorescence orange. Si la fluorescence est entièrement verte, il y a peut-être plusieurs chromosomes dans l’ADN tumoral. Si le bras long est rouge, il y a une délétion des bras longs dans les cellules tumorales. Si une bande apparaît en vert, il y a une amplification de ce fragment tumoral. SNP : Single Nucleotide Polymorphism. Sur une séquence, un nucléotide peut être variable d’un individu à l’autre, on peut donc faire une carte SNP. II) Les étapes de l’analyse par puces à ADN 2.1. Fabrication de la puce La synthèse des ADN de capture se fait par PCR ou par oligonucléotides en plaques 96 puits, puis cet ADN est déposé par un robot sur une lame de verre, par une synthèse d’oligonucléotides in situ ou directement sur une lame par photolithographie. Technologie d’Affymétrix, synthèse in situ d’oligonucléotides sur les puces : 2.2. Préparation et marquage de l’ADN cible - Puce génomique : on extrait l’ADN de l’échantillon et on amplifie les séquences d’intérêt par PCR - Puce à expression de gènes : on extrait les ARN de l’échantillon et on les rétrotranscrit en ADNc Le marquage se fait par incorporation d’un dNTP marqué par un élément radioactif ou par un fluorochrome ou par de la biotine. 2.3. Hybridation des ADN cibles aux ADN de capture fixés sur la puce Cette hybridation est suivie d’un lavage. 2.4. Détection lecture par un scanner (adapté au type de marquage de l’échantillon) relié à un ordinateur qui analyse les données III) Applications des puces 3.1. Puces génomiques 3.1.1. Applications agro-alimentaire/environnement - détection d’OGM analyse microbiologique de l’eau de consommation, d’aliments compositions d’aliments (quel type de viande : port, bœuf, dinde) 3.1.2. Applications médicales - - Diagnostic biologique de maladies infectieuses et recherche de résistance (par exemple due à des polymorphismes pour les rétrovirus qui sont résistants aux antiviraux ciblant la transcriptase inverse), par exemple une puce basse densité dédiée à la détection des pathogènes responsable de mammites chez la vache Analyse de mutations génétiques (maladies génétiques) Recherche pharmaceutique (pharmacogénomique) pour s’adapter au profil de chaque individu, exemple des cytochromes P450 (au niveau du foie) qui diffèrent selon les individus 3.2. Puces à expression de gènes 3.2.1. Applications médicales - Identifier des gènes spécifiquement actifs ou inactifs dans les tissus malades Recherches pharmaceutiques (pharmacogéniques) pour mieux comprendre l’action des médicaments, pour réaliser un criblage médicamenteux ou pour identifier rapidement de possibles effets secondaires ou toxiques