Etude de l`expression génique de deux pathologies thyroïdiennes

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
FACULTE DE MEDECINE
Institut de Recherche Interdisciplinaire en Biologie Humaine et Moléculaire
(IRIBHM)
THESE
En vue de l’obtention du grade de Docteur en Science Biomédicales
Présentée et soutenue publiquement par
Sandrine Wattel
le 10 octobre 2007
Directeur de Thèse :
Dr. Carine Maenhaut
Membres du jury:
Pr. Magali Waelbroeck (Présidente)
Pr. Laurence Leenhardt
Pr. Marie-Christine Many
Pr. Daniel Glinoer
Dr. Pierre Heimann
Dr. Christos Sotiriou
Etude de l'expression génique de deux pathologies
thyroïdiennes : les adénomes autonomes
hyperfonctionnels et les cancers papillaires.

Remerciements
Je commencerai par remercier les différentes personnes qui auront permis la réalisation
et l’aboutissement de ce travail. Je continuerai avec quelques mots plus personnels pour
ceux qui, d’une façon ou d’une autre, apportent la joie dans ma vie.
Je remercie bien évidemment les professeurs J. E. Dumont et G. Vassart de m’avoir
accueillie au sein du laboratoire. Monsieur Dumont, un grand merci pour l’intérêt que
vous avez accordé à ce travail et pour le temps que vous y avez consacré.
Carine, je te remercie également pour tout le temps que tu as consacré à ma thèse. Je te
suis surtout reconnaissante pour la lecture du manuscrit, ce qui n’était certainement pas
toujours du plus facile. Cependant, c’était sans aucun doute une très bonne occasion
pour moi de progresser dans le domaine de l’écriture en langue française. Merci aussi
pour tes conseils avisés et ta confiance.
Je remercie sincèrement le Professeur Franc qui m’a consacré beaucoup de son temps
vers la fin de ma thèse, et sans qui toute la partie sur les tissus-array n’existerait pas. Je
remercie également tous les autres collaborateurs qui ont de près ou de loin contribué à
l’élaboration de ce travail. Je pense à Hortensia, Vincent, David Venet, Chantal,
Monsieur Andry, Madame Thomas, Monsieur Rocmans, Nathalie Hutsebaut, Vanessa
Vanvooren, Monsieur Paul Van Hummelen,… et au service de génétique pour m’avoir
permis d’employer leur ‘machine taqman’.
Je remercie également tous les membres de l’IRIBHM pour les sourires stimulants
échangés au détour des couloirs, pour leur disponibilité et leur bonne humeur. Merci à
Jing, Ling, Song, Milutin, Geneviève, Isabelle, Sarah D, Maria, Danielle, Joëlle, Daniel,
Christian, Claude, Stéphane, Xavier, Colette, Sandrine P., Thalie, Jacqueline, Hugues,
Maxime, Laurence, Audrey, Katia, et tous les autres. Merci à Jingwei de m’avoir tenu
compagnie le soir. Mes remerciements vont tout particulièrement aux occupants du
bureau C4.124, ceux qui l’ont quitté ‘je pense à Nathalie, Fabrice, Christine’ ainsi que
ceux qui y sont encore, Julie, Sandra, Laurent et Nicolas, le grand nouveau. Il y aura
toujours régné une ambiance extrêmement sympathique. Je n’oublierai jamais les très
bons moments passés dans et hors du bureau, voir du labo… Je pense aussi à Wilma,
Sheela, Aline, Sara, Séverine, Tanja, Delphine et David qui ont également contribué à
mon plaisir de venir au labo. J’espère sincèrement vous revoir régulièrement et je vous
remercie pour tous les bons moments, les discussions de tout genre et les
encouragements. Et non Alexandra, je ne t’ai pas oublié. C’était un plaisir pour moi
d’avoir fait ta connaissance et j’espère bien te revoir prochainement.
Je tiens tout particulièrement à remercier mes ami(e)s de toujours : Kristina, Ilona,
Kristel en Veerle, ik weet dat ik op elk moment op jullie kan rekenen en dat ik deze
laatste tijden niet veel voor jullie aanwezig was, maar ik beloof dat we elkaar nu meer
zullen zien. Ik waardeer echt ons vriendschap en ben uiterst blij jullie ontmoet te hebben.
Valérie et Claude, à part réécrire le texte en français, je pense exactement la même chose
pour vous. (Claude, je me ferai un plaisir de te faire la traduction.) Je remercie également
Nathalie pour son amitié, sa gentillesse et son aide généreuse. Finalement, je tiens à
remercier Olivier, qui m’a soutenue à plusieurs moments très difficiles et qui était
toujours là pour moi. Je lui en serai toujours reconnaissante. Merci, merci à tous… merci
pour les excellents moments partagés ensembles.

Je tiens également à faire un clin d’œil amical à toute la bande de cousins, tous très
sympathiques et avec qui j’ai passé de très bons moments.
Je remercie également mes dernières colocataires, Laura et Claire, qui m’ont connue et
parfois aussi subie pendant la rédaction de ma thèse. Je les remercie pour leur discrétion,
leur gentillesse et leur soutien lors des moments un peu plus difficiles.
Je remercie finalement toute ma famille. Je veux tout particulièrement remercier mes
parents pour leur amour, leur présence, leur soutien et leur confiance. Je remercie
François et Sheela, Alexia et Eric et nos deux rayons de soleil Thylia et Enguéran, d’être
simplement présent. Je suis heureuse de faire partie de cette famille. Je remercie
également tous les autres membres de la famille, qui ont également cru en moi.
Ce travail a été réalisé grâce aux soutiens financiers de la Fondation David et Alice Van
Buren, de la Fondation Rose et Jean Hoguet, de la bourse de la fondation Anspach-
Wiener et du Télévie.

Résumé
La technologie des microarrays est une technique d’analyse d’expression génique à grande échelle qui
permet d’analyser simultanément l’expression de milliers de gènes dans différentes cellules et
différentes conditions physiologiques, pathologiques ou toxicologiques (Shena et al, 2000). Dans notre
étude nous avons employé cette technique pour mieux comprendre deux pathologies thyroïdiennes: les
carcinomes papillaires (PTC) et les adénomes autonomes hyperfonctionnels.
L’étude des profils d’expression génique de 9 carcinomes papillaires thyroïdiens sporadiques et de 13
carcinomes papillaires post-Chernobyl a été effectuée en utilisant les lames commerciales de Perkin-
Elmer (comportant 2400 cDNA) et en les comparant à leurs tissus normaux adjacents. Les PTC post-
Tchernobyl constituent une population de cancers à cause bien définie puisqu’ils sont directement
reliés à l’exposition du même agent mutagène, pendant une même période. L’étude des profils
d’expression indique qu’il n’y a pas de signature génique spécifique permettant de distinguer les
carcinomes papillaires sporadiques des post-Tchernobyl. La comparaison de ces profils d’expression à
celui obtenu avec 13 adénomes autonomes a permis de mettre en évidence une signature de 6 gènes
(créatine kinase B, annexine A1, clusterine, métallothionéine 1x, Fc fragment of IgG binding protein
et tissue inhibitor of metalloproteinase 1) séparant les carcinomes papillaires malins des adénomes
autonomes bénins.
Nous avons également analysé l’expression génique sur des mélanges de tumeurs et de leurs contrôles
respectifs sur des lames à 17000 cDNA fabriquées au MAF (VIB Microarray Facility, Leuven). Un
mélange de 14 cancers papillaires sporadiques, un mélange de 20 cancers papillaires provenant de la
région de Tchernobyl et un mélange de 5 adénomes autonomes ont été analysés par microarray et
comparés aux études existantes comme celles effectuées sur les lames Perkin-Elmer ou par d’autres
groupes (Huang et al, 2001 ; Wasenius et al, 2003 ; Jarzab et al, 2005 ; Eszlinger et al, 2004).
De ces données microarray ont résulté des listes de gènes sur- et sous-exprimés dans les tumeurs
comparées à leurs tissus normaux adjacents. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont déjà été
confirmés dans différentes études réalisées aussi bien dans notre laboratoire que dans d’autres. Nous
avons confirmé la modulation de plusieurs gènes intéressants par RT-PCR en temps réel (Taqman)
ainsi que certaines modulations au niveau protéique (par Western Blot ou immunohistochimie).
L’étude immunohistochimique nous a donné également des informations sur la distribution cellulaire
et tissulaire de ces protéines.
La modulation d’expression génique dans ces tumeurs reflète des caractéristiques physiopathologiques
connues (comme l’hyperactivité fonctionnelle, la faible augmentation de l’AMPc ou encore la
diminution de l’apoptose dans les adénomes autonomes et la dédifférenciation ou l’invasivité dans les
carcinomes papillaires), mais elle nous a également permis d’identifier des caractéristiques
physiopathologiques jusqu’ici encore inconnues de ces tumeurs (comme la surexpression de la N-
cadhérine et la diminution de la cavéoline1, deux marqueurs présumés de malignité, dans les tumeurs
bénignes et un changement de population cellulaire aussi bien dans les adénomes autonomes que dans
les carcinomes papillaires). Ces études nous ont donc permis de définir des gènes potentiellement
importants dans la pathologie des différentes tumeurs étudiées, mais également des nouveaux
marqueurs diagnostiques potentiels. Ainsi, l’étude immunohistochimique sur des tissu-arrays nous a
permis de confirmer la surexpression de l’annexine A1 dans les carcinomes papillaires et de la créatine
kinase B dans les adénomes autonomes et pas dans les autres tumeurs thyroïdiennes étudiées.
L’immunomarquage de ces protéines nous a également aidé à définir la malignité d’une série
d’adénomes atypiques. L’annexine A1 est un marqueur potentiel particulièrement intéressant car cette
protéine n’est fortement exprimée que dans les carcinomes papillaires. Une hypothèse, encore à
confirmer, sur sa fonction dans cette pathologie est décrite dans ce travail. Finalement, nous avons
émis une hypothèse expliquant la raison pour laquelle les réarrangements Ret/PTC mènent à la
formation de carcinomes papillaires, tandis qu’une mutation activatrice de Ras, l’effecteur directe du
récepteur à activité tyrosine kinase Ret, mène à la formation de tumeurs folliculaires.

Liste des abréviations :
AA Adénome Autonome
ADN, -c, -db = Acide DésoxyriboNucléique, complémentaire, double brin
ADP Adenosine DiPhosphate
AKAP A-Kinase Anchoring Protein
AMPc 3’,5’-Adénosine Mono-Phosphate cyclique
ANXA1 annexin A1
AP-1 Adaptor Protein-1
APC Adenomatosis Polyposis Coli
ARA70 70 kDa androgen receptor coactivator (70 kDa AR-Activator)
ARN, -m Acide RiboNucléique, messager,
ATC Anaplastic Thyroid Carcinoma
ATF Activating Transcription Factor
ATP Adenosine TriPhosphate
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
bHLH basic Helix-Loop-Helix
BIRC5 Baculoviral IAP Repeat-Containing 5 (survivin)
C/EBP CCAAT Enhancer Binding Protein
CBP CREB Binding Protein
CDH2 cadherin 2, N-cadherin (neuronal)
CDK Cyclin Dependent Kinase
CDKi cyclin-dependent kinase inhibitor (CDKN1A)
CITED Cbp/p300-interacting transactivator with Glu/Asp-rich carboxy-terminal domain 1
CK19 CytoKeratin 19
CKB Creatine Kinase, brain
CLU CLUsterin
CNAP1chromosome condensation-related SMC-associated protein 1
CNG Cyclic Nucleotid Gated channel
CNK Connector enhancer of Kinase suppressor of Ras1
CRE cAMP Responsive Element
CREB CRE Binding Protein
CREM CRE Modulator
CTGF Connective Tissue Growth Factor
CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1
DAB 3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride.
DAG DiAcylGlycerol
DIT 3,5-DiIodoTyrosine
DOK DOwnstream of Kinase
Duox DUal OXydase (forme nucléotidique, protéique)
DUSP DUal SPecificity phosphatise
ECL ElectroChemiLuminescence
ECM ExtraCellular Matrix
EGF Epidermal Growth Factor
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
ELE1 RET oncogene fusion partner
ELKS Rab6-interacting protein 2
EPAC Exchange Protein directly Activated by cAMP
ERK Extracellular Regulated Kinase
EST Expressed Sequence Tag
FAS Fatty Acid Synthase
FcGBP Fc fragment of IgG Binding Protein
FGF Fibroblast Growth Factor
FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor
FN1 fibronectin 1