3.correction bmcp 18_02

BMCP – Apoptose ou mort cellulaire programmée
18/02/2014
LETOUCHE Marie-Lou L2
BMCP
Pr. M. GASTALDI
[email protected]
18 pages
Relecteur n°3
Apoptose ou mort cellulaire programmée
Plan :
A. Introduction – Définition
B. Description morphologique et biochimie
C. Mécanismes moléculaires
I. Gênes de l'apoptose : de C. elegans aux mammifères
II. Les caspases
III.
Ced-4 et ses homologues
IV. La famille Bcl-2
V. Mitochondries et cytochrome C
VI.
Nucléases
VII.
Les récepteurs de mort cellulaire
VIII.
Régulation de l'apoptose
D. Exemples d'apoptose
E. Conclusion : apoptose et pathologies
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BMCP – Apoptose ou mort cellulaire programmée
A. Introduction - Définition
L'apoptose est un mécanisme au cours duquel les cellules meurent (physiologique et pathologique).
→ Pourquoi avons-nous eu un intérêt tardif pour la mort cellulaire (années 90) ?
Historique : (il n'y aura pas de question dessus mais il permet de mieux comprendre le phénomène)
1842 : C'est un processus normal au cours du développement des vertébrés (Vogt).
1951 : Gluckman en fait une description morphologique grâce au développement des techniques.
1964 : On emploi le terme de « mort cellulaire programmée » chez les invertébrés qui est un processus
prévisible dans des tissus donnés à des stades précis du développement.
1969 : On fait un parallèle morphologique chez les vertébrés et les invertébrés. On fait l'hypothèse qu'il existe un
processus commun entre ces deux groupes.
1972 : A partir de maintenant ça s'accélère. On utilise le terme d'apoptose chez les vertébrés par analogie avec la
chute des feuilles des arbres en automne.
1974 : C'est un phénomène biochimique avec activation d'enzymes et de dégradation de l'ADN.
Les endonucléases sont identifiées seulement 23 ans plus tard !
1982 : La description d'un programme génétique spécifique est faite (C. elegans).
1988 : Il y a identification de la protéine Bcl-2 qui est une protéine anti-apoptotique chez les mammifères. Bcl-2
est une des protéines analogues aux vers et aux mammifères.
Depuis, on a découvert l'implication d'altérations de l'apoptose au cours de nombreuses pathologies chez
l'homme.
Importance physiologique de l'apoptose :
La vie ne peut exister sans mort des cellules et la régénération de nouvelles cellules au cours du temps !!
L'apoptose est un processus normal au cours de :
développement des organismes pluricellulaires
homéostasie tissulaire (renouvellement tissulaire : nombre de cellules néo-formées comparable au nombre
de cellules qui disparaissent)
• défense contre des agents pathogènes
Donc c'est un processus normal tout au long de la vie et pas seulement pendant le développement.
•
•
Apoptose et développement... :
→ Modelage d'organes :
– Formation des doigts et espaces interdigitaux : ces espaces doivent disparaître par apoptose.
– Mise en place d'une cavité au sein d'un organe initialement plein (cavité pré-amniotique) par apoptose des
cellules au centre de cet organe.
→ Elimination de structures : Elimination de structures “vestiges” nécessaires à une espèce ancestrale :
– à un stade donné du développement (ex : la queue du têtard)
– dans un sexe donné (ex : les canaux de Muller éliminés chez les mâles et les canaux de Wolf éliminés chez
les femelles)
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→ Ajustement du nombre de cellules :
50% des neurones et des cellules gliales vont mourir au cours du développement du système nerveux.
→ contrôle de la qualité des cellules :
– Elimination des cellules anormales, non fonctionnelles, mal localisées ou dangereuses pour l'organisme
(95% des cellules du système immunitaire).
–
Elimination des cellules endommagées ne pouvant être réparées
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… Mais aussi dans les tissus adultes :
Elle permet le maintien de l'homéostasie. Il y a un équilibre entre prolifération et mort cellulaire.
Le corps humain détruit environ 60 x 109 cellules par jour par apoptose en réponse à des stimuli physiologiques,
pathogènes ou cytotoxiques. C'est autant de cellules qui devront être renouvelées !
B. Description morphologique et biochimie
Ce schéma est à savoir ++++++ !
-L'apoptose est un processus actif, il est donc énergie-dépendant (ATP dépendant) et met en jeu des synthèses
protéiques. Elle est permise pas l'activation de cascade enzymatiques spécifiques (caspases).
-Elle implique la translocation des résidus de phosphatidylsérine PS (phospholipide complexe qu'on retrouve au
niveau des membranes cellulaires et particulièrement au niveau de la membrane interne et qui donc dans ce
processus d'apoptose passe du côté externe de la membrane). C'est d'ailleurs un bon moyen de mettre en évidence
l'apoptose. Il y a également modification de la perméabilité des mitochondries et libération de facteurs
mitochondriaux dans le cytosol. On peut aussi noter la fragmentation spécifique de l'ADN, internucléosomique.
→ Il est important de savoir que l'apoptose n'est pas une réaction inflammatoire !
✔ Mise en évidence de l'apoptose : Effet de TUNEL
Elle utilise la mise en évidence de la fragmentation de l'ADN.
On met en culture des cellules avec une enzyme particulière, la terminale transferase, qui permet de rajouter au
niveau des extrémités 3'-OH libres du dUTP marqué qui va combler les coupures de l'ADN lors de sa dégradation
(phénomène systématique lors de l'apoptose).
Seuls les noyaux apoptotiques sont mis en évidence, on peut alors quantifier les cellules apoptotiques (et effectuer
le calcul d'un pourcentage).
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✔ Mise en évidence de l'apoptose : Iodure de propidium et cytométrie de flux
La cytométrie de flux est un trieur de cellules en fonction de la taille et de l'existence ou non du marqueur.
Le principe repose sur la coupure entre les nucléosomes et donc sur l'ADN fragmenté.
On va effectuer une quantification avec un fluorochrome intercalant spécifique, par exemple l'iodure de
propidium (IP).
On met en culture des cellules perméabilisées et de l'IP et on analyse en cytométrie de flux.
La plupart des cellules sont en phase G1 (étape la plus longue) où les cellules sont diploïdes (2n).
→ Ce qu'il faut retenir ce que le pic des cellules apoptotiques a une quantité d'ADN < à n (cellules
normales).
✔ Mise en évidence de l'apoptose : Annexine V
Ici, on détecte les flip-flop des PS de la membrane plasmique par l'annexine V couplée au fluorochrome.
Lors de l'apoptose, la PS est transloquée de la face cytosolique à la face extracellulaire de la membrane plasmique.
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Par ce phénomène de flip-flop, la PS devient accessible puisqu'elle passe au niveau de la membrane externe, il peut
donc y avoir reconnaissance par l'annexine V marquée par FITC ou IP (ce sont deux fluorochromes).
On met en culture des cellules non perméabilisées marquées à l'annexine V +/- IP puis on analyse en cytométrie
flux.
L'annexine V est une protéine Ca2+ dépendante, elle a une haute affinité pour la PS.
✔ Mise en évidence de l'apoptose : Caspases (enzymes)
Dans cette méthode on va détecter les caspases activées.
On utilise un inhibiteur, le FLICA qui se lie de façon covalente et irréversible aux caspases activées, (au niveau
des cystéines) et inhibe leur activité enzymatique. Le FLICA non lié est éliminé par lavage.
Le signal fluorescent vert est proportionnel à la quantité de caspases activées présentes.
D
L
A
Les nuages de points indiquent : L : les cellules vivantes ; A : les cellules apoptotiques ; D : les cellules mortes
ndCR : il faut connaître ces méthodes de mise en évidence pour les TP et l'exam.
✔ Modèles animaux : (la prof est passée très rapidement, connaître juste le nom des animaux, ce qui est écrit
dessous sont les découvertes que ces animaux ont permis de faire )
→ C.Elegans :
• régulation de l'apoptose
• lignage des cellules
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→ Drosphile :
• régulation de l'apoptose
→ Souris :
• étude d'un organisme à durée de vie longue
• protéines pro- et anti-apoptotiques
→ Xenopus laevis :
• analyse biochimique
• signalisation
C. Mécanismes moléculaires
I. Gênes de l'apoptose : de C. elegans aux mammifères
Découverte des “cell death genes” (ced) : Prix Nobel en 2002 pour Bob Horvitz, John Sulston et Sydney Brenner.
Modèle : Caenorhabditis elegans (C.elegans)
C'est un animal transparent. Il possède une reproduction rapide, un développement prévisible, constant, un
plan de différenciation identique et une cinétique déterminée.
Le marquage et le suivi de chaque cellule est possible.
Il existe un équilibre entre gènes pro- et anti-apoptotiques :
Sur 1090 cellules, 959 se développent et 131 meurent par apoptose (pour les nématodes)
Ci-dessous : tableau avec les gènes/protéines homologues entre nématodes et vertébrés.
Rappel : les caspases sont des protéases à cystéine et Bcl-2 est un inhibiteur des caspases puisque c'est une
protéine anti-apoptotique.
→ L'apoptose est un processus régulé, séquentiel et systématique.
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Il existe 2 voies pour l'apoptose :
• une voie non mitochondriale = voie extrinsèque qui repose sur l'activation des récepteurs de “mort” et
• une voie mitochondriale = voie intrinsèque qui repose sur la perte d'intégrité membranaire de la
mitochondrie (avec libération de facteurs pro-apoptotiques).
Les acteurs moléculaires sont :
• Les récepteurs membranaires de “mort” (ex: TNFR: TNF Receptor [TNF: Tumor Necrosis Factor]) et
les protéines recrutées par les récepteurs (FADD: Fas-Associating protein with Death Domain)
• Les protéines de la famille Bcl-2
• Les protéines cytosoliques:
– Les protéines Apaf-1 : apoptotic-peptidase activating factor (apoptosome)
– Les caspases
– Les protéines régulatrices : IAP: inhibitor of apoptosis
– Le récepteur leurre (FLIP)
• Les protéines mitochondriales
– Le cytochrome C
– La protéine régulatrice (Smac/DIABLO)
– La protéine AIF : apoptosis inducing factor
• La protéine p53 (« évidement, elle est de partout celle là! »)
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II. Les caspases
Il en existe 14 différentes chez l'homme.
Ce sont des protéines cytosoliques qui sont au départ sous forme de pro-caspases immatures et qui vont être
activées par des coupures protéolytiques et vont ainsi pouvoir exercer leurs fonctions.
On distingue 2 grandes familles :
•
•
les caspases initiatirices (les caspases 2, 8, 9, 10) qui ont la propriété d'auto-activation
les caspases effectrices (les caspases 3, 6, 7) qui sont activées par les caspases initiatrices et qui ont la
propriété de protéolyser des substrats spécifiques.
Les caspases sont des cystéines-protéases cytosoliques qui clivent de nombreux substrats, elles sont sous la forme
de pro-enzymes activées par clivages en cascades activatrices puis homo ou hétéro-dimérisation.
La prof a répété 3 fois cette diapo …
Sur le schéma de la page suivante, le pro-domaine que l'on peut voir en gris correspond à un site de coupure.
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Substrat des caspases :
Les caspases initatrices ont pour substrat d'autres caspases alors que les caspases effectrices ont pour substrat des
protéines cellulaires dont la dégradation est observée au cours de l'apoptose. Il peut s'agir de :
•
•
•
•
protéines structurales (lamines ...)
protéines de signalisation
protéines du métabolisme ARN/ ADN
protéines “facteurs nucléaires” et du cycle cellulaire
Le clivage des substrats des caspases peut avoir des conséquences variées selon la cellule considérée.
III.Ced-4 et ses homologues / Apaf-1 (apoptotic peptidase activating factor 1)...
Ced-4 chez les invertébrés et Apaf-1 chez les vertébré. Ce sont des protéines activatrices des caspases.
(la prof n'a pas traité cette partie, elle a juste dit ce que j'ai marqué au dessus ; voir tableau du C-I-)
IV. La famille Bcl-2
Ce sont des protéines anti-apoptotiques, c'est-à-dire des protéines de survie (Bcl-2, Bcl-X1,...), mais aussi des
protéines pro-apoptotiques, c'est-à-dire des protéines de mort (Bax, Bad, Bid,...).
Il va se former des homo- ou hétéro-dimères.
Elle a un rôle de contrôle de l'ouverture des pores de la membrane mitochondriale (sortie CytC) et ce sont aussi des
protéines d'ancrage pour les régulateurs de l'apoptose ( Bcl-X1 , CytC, Bcl-2, Apaf1,...).
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On note sur ce schéma qu'il existe des domaines homologues comme l'ancre membranaire par exemple.
→ Relation entre les protéines de la famille Bcl-2, les mitochondries, les caspases :
Bcl-2 est le prototype d’une famille de protéines impliquées dans la survie cellulaire.
Il existe 3 autres familles antagonistes : Bax, Bad/Bid, Bak.
Il y a association en dimères pro- ou anti-apoptotiques.
→ C’est le rapport entre le niveau des protéines pro- et anti-apoptotiques qui permet de déclencher ou non
l’apoptose : ce rapport détermine la susceptibilité à l'apoptose.
Ex : si Bcl-2 > Bax => survie ; si Bax > Bcl-2 => apoptose.
Au niveau des mégapores de la mitochondrie, c'est la sortie de cytochrome C qui active les caspases.
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V. Mitochondrie et cytochrome C
Des mécanismes vont être mis en jeu pour empêcher ou permettre la sortie du cytochrome C de la mitochondrie.
Dans des conditions normales, Bcl-2 est libre sur la mitochondrie et il n'y a pas de libération de cytotochrome C.
Dans des conditions apoptotiques, Bcl-2 est inhibé, il y a alors libération de cofacteurs, de cytochrome C et
activation de procaspases en caspases.
Ensuite il y a formation d'un apoptosome contenant 3 partenaires : Apaf1, caspase 9 et le CytC :
→ La libération cytosolique du cytochrome C de l'espace inter-membranaire est due à l'augmentation de la
perméabilité de la membrane mitochondrial (PMM).
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Il y a induction de l'ouverture d'un pore transitoire de perméabilité par Bax avec rupture partielle de la
membrane externe OU interaction entre Bax et VDAC (protéine de la membrane externe) pour générer un
mégacanal.
Actuellement, on ne sait pas encore laquelle de ces 2 théories est la bonne !!
Lors d'un stimulus intrinsèque apoptotique, la protéine p53 augmente l'expression du gêne Bax et réprime celle
de Bcl-2.
VI. Les nucléases
Ce sont des endonucléases internucléosomiques (cf autres cours).
VII. Les récepteurs de mort cellulaire = voie extrinsèque.
Signalisation pro-apoptotique via les récepteurs Fas :
•
•
Fas : protéine transmembranaire de 45 kDa exprimée dans de très nombreux tissus.
Fas-L (Fas-Ligand) : glycoprotéine de surface de 40kDa dont l'expression est très restreinte (dans les
lymphocytes T activés, les cellules NK, les macrophages) Il est tissus (voire situation) – spécifique.
Signalisation via les récepteurs TNF-R1
•
TNF (Tumor Necrosis Factor) α : produite par les macrophages activés et les lymphocytes T en réponse à
une infection (médiateur physiologique majeur de l'inflammation). Les réponses cellulaires sont variées
(prolifération, différentiation, activation de l'apoptose) et les effets sont principalement médiés par le TNFR1.
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Signalisation via les récepteurs TRAIL-R
•
TRAIL (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand)
La liaison de ces récepteurs à leur ligand déclenche la signalisation apoptotique.
Assemblage du complexe DISC (Death Signaling Complex) = ligand + récepteur + FADD.
VIII.
Régulation de l'apoptose
Il faut noter l'importance de la régulation de l'apoptose, puisque les cellules ont plusieurs possibilités :
DIFFERENCIATION
PROLIFERATION
Cellules
APOPTOSE
SENESCENCE
Le nombre de population cellulaire est contrôlé par la prolifération, la différenciation et la sénescence en plus de
l'apoptose.
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2 voies principales conduisent à l'apoptose :
Interrelation entre les 2 voies :
• La protéine Bid permet le contrôle de la voie mitochondriale par la voie non mitochondriale
• La protéine IAP permet le contrôle de la voie non mitochondriale par la voie mitochondriale
Role de la p53 : C'est la gardienne de l'intégrité cellulaire.
La protéine p53 permet d'une part l'induction de la transcription des gênes pro-apoptotiques et d'autre part la
répression de la transcription des gênes anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-X1).
→ La protéine p53 est une protéine pro-apoptotique.
Les miRNA :
Au moins 30 miRNA sont impliqués dans l'apoptose, ils sont surtout étudiés dans les lignées cellulaires
cancéreuses.
Certains sont anti-apoptotiques, c'est-à-dire qu'ils protègent les cellules de l'apoptose.
D'autres sont pro-apoptotiques, c'est-à-dire que leur expression induit l'apoptose, souvent en relation avec la p53.
En fait, ils seront anti- ou pro-apoptotiques en fonction du type cellulaire et du panel de gênes exprimé par la
cellule.
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D. Exemples d'apoptose
Apoptose et développement du Système Nerveux :
→ Expérience de Rita Levi Montalcini :
Lorsque l'embryon de poulet a une aile normale, les ganglions qui innervent l'aile sont plus grands que ceux qui
innervent le reste du thorax.
Si on sectionne l'aile, alors la taille des ganglions diminue.
Enfin, si on greffe une aile supplémentaire, la taille des ganglions augmente.
Sur ce schéma, il faut juste regarder le nombre de fibres nerveuses, pour quantifier la taille du ganglion
correspondant.
La première image est la référence, la seconde montre l'expérience où on coupe l'aile et la dernière celle où on
greffe une aile supplémentaire.
L'apoptose est nécessaire au cours du développement :
• La disparition de la queue du têtard
• La formation des doigts du fœtus (apoptose des membranes inter-digitées)
• La formation de la cavité utérine (formation d'un organe creux à partir d'un élément plein par apoptose)
• La formation des connections entres les neurones
L'apoptose est nécessaire pour détruire des cellules :
• Cellules infectées par les virus
• Cellules du système immunitaire régulant certaines populations cellulaires
• Cellules dont l'ADN est trop endommagé
• Cellules cancéreuses
Chez l'homme adulte :
• Renouvellement de l'épithélium intestinal, l'endomètre, l'épiderme
• Elimination des granulocytes matures dans le sang au bout de 1 à 2 jours
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Elimination des lymphocytes en surnombre après la réaction immunitaire.
Apoptose
Cellules
Prolifération
clonale
Réponse
immunitaire
spécifique
Mémoire
L'apoptose peut être un processus bénéfique (apoptose des neurones pendant le développement du cerveau) ou non
bénéfique (dans la maladie d'Huntington, on trouve un excès d'apoptose).
E. Conclusion : apoptose et pathologies
(Ce tableau est donné à titre indicatif, pas la peine de le savoir par coeur !)
Exemples d'approche thérapeutique anticancéreuses :
• Bcl-2 surexprimé dans certains cancers (prostate, ovaire, col de l'utérus, pancréas...) et résistance des
cellules cancéreuses aux drogues cytotoxiques corrélées au taux de Bcl-X1.
•
Réduction de l'expression de Bcl-2 par oligonucléotides antisens : ce sont des essais prometteurs chez la
souris (les mélanomes diminuent de taille !!). Ce sont des antisens bispécifiques : Bcl-2 et Bcl-X1 qui sont
testés.
On en est encore à l'étape expérimentale. 2 approches sont développées : l'augmentation ou la diminution de
l'expression de protéines pro-apoptotiques (Bax, Bid... ) ou anti-apoptotiques (Bcl-2...).
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Aux “pas hypes” ♥, à Nou qui embrouille toutes nos conversations et à la préhension du sol qui laisse à désirer
(hein Gess ?!) !
Utérus Peace Love !
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