doctorat de l`université de toulouse

THESE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Immunologie
Présentée et soutenue par Laurence Ordonez
Le 24 Septembre 2009
Titre : ETUDES PHENOTYPIQUES ET FONCTIONNELLES
DES SOUS-POPULATIONS T CD45RC CHEZ L’HOMME:
IMPLICATION DANS LE REJET DE GREFFE ET DANS L’AUTO-IMMUNITE
JURY
Pr Yoost VAN MEERWIJK Président du Jury
Pr Pierre TIBERGHIEN Rapporteur
Dr Alain LE MOINE Rapporteur
Dr Abdelhadi SAOUDI Directeur de Thèse
École doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologie
Unité de recherche : INSERM-U563
Directeur(s) de Thèse : Dr Abdelhadi SAOUDI
Rapporteurs : Pr Pierre TIBERGHIEN
Dr Alain LE MOINE
REMERCIEMENTS
Je souhaite remercier en tout premier lieu Abdel Saoudi qui a dirigé cette thèse dans
la continuité de mon stage de D.E.A. Tout au long de ces cinq années, tu as su me
faire partager avec enthousiasme et bienveillance ta passion pour la recherche. Je te
remercie aussi pour ta confiance, ta disponibilité et ton écoute compréhensive.
Je tiens à remercier le Dr Yoost Van Meerwijk, qui m'a fait l'honneur de présider le
jury de thèse de doctorat.
Je suis très reconnaissante au Dr Alain Le Moine et au Pr Pierre Tiberghien d'avoir
accepté le rôle de rapporteur et d’avoir évalué ce travail. J’ai beaucoup apprécié vos
discussions scientifiques lors de ma soutenance et je vous remercie de l’intérêt que
vous avez montré pour ce travail.
Je tiens ensuite à remercier tous mes collègues, complices des bons comme des
mauvais jours.
Isa, je voudrais te remercier de m’avoir initié aux joies de la recherche chez l’Homme
lors de mon DEA. Merci pour ta gentillesse et ta disponibilité. J’aimerais aussi
remercier Marianne, qui m’a très souvent acheté à coup de gâteau au chocolat et de
confiture aux fraises. Merci beaucoup pour ton aide précieuse. Merci aussi à Céline,
Anne, Christophe et Laure pour votre présence amicale et pour votre soutien lors des
baisses de régimes…notamment lors de pauses café/clopes. Je vous souhaite à tous
une bonne continuation et beaucoup de bonheur. Bien sûr, je n’oublie pas notre
grande Christine, qui a trouvé son bonheur ailleurs mais qui nous manque beaucoup.
Un grand merci à Len, pour tous les moments passés à discuter, avec toi, de la
science et de l’avenir incertain. Merci pour ta très grande disponibilité, pour ton
soutien constant…et pour les nombreuses corrections de mon anglais écrit. Merci
aussi à ton homologue Polonais, Maciek. Nous n’avons eu que trop peu l’occasion de
parler ensemble, mais heureusement les séances de grand nettoyage de la salle de
culture m’ont permis de te connaître. J’ai beaucoup apprécié nos discussions et ton
grand sens de l’humour.
Merci aussi à toutes les autres personnes de la grande famille RL avec qui j’ai aussi
partagé de très bons moments: Sabine, Flo, Béa, Tanja, Nico, Lise, Cécile, Carine et
Greg.
Je tiens à remercier Roland et Daniel pour vos discussions et vos conseils avisés
relatifs à la science et à la recherche.
J’ai eu également le plaisir de collaborer avec Jean-François Subra à Angers, Jan
Damoiseaux à Maastricht, Olivier Andréoletti à l’ENVT et nos statisticiennes favorites
Valérie Lauwers-Cances et Christelle Cristini. Je vous remercie tous pour votre grand
professionnalisme.
Je remercie aussi toutes les personnes de l’animalerie avec un salue particulier à
Patrick pour avoir si bien pris soin de mes souris «si délicates». Merci aussi à Talal et
Florence pour toutes ces lames d’histo.
Cette thèse m’a aussi permis de rencontrer des personnes exceptionnelle avec qui j’ai
pu partager les très bons moments comme les mauvais. Je tiens à remercier
Christine, Audrey, Fatima, Lucile et Mariléna d’avoir simplement été là, toujours
sincères et vraies. Je ne vous oublierais pas et je compte sur vous pour la suite de
nos aventures. Notre «cottage» vous attend très bientôt.
Je souhaiterais aussi remercier mon amie Laetitia qui a toujours été là et qui m’a
permis de libérer l’excédent d’énergie, durant la rédaction de cette thèse, en me
faisant courir des heures malgré mes ampoules douloureuses.
Je remercie aussi mes parents et Patricia pour m’avoir soutenue pendant ces longues
années de thèses. Un pensée émue pour ma grand-mère qui m’a toujours si bien
compris et pour Lucas mon petit frère que j’adore.
Merci aussi à mes plus vieilles amies Audrey, Nathalie et Céline de m’avoir soutenue
tout au long de ces 12 années d’amitiés.
Pierre, il est impossible de résumer en quelques lignes tout ce que tu m’as apporté et
que tu continue de m’apporter tous les jours. Merci d’être tel que tu es, surtout ne
change rien.
RÉSUMÉ _________________________________________________________________ 5
LISTE DES ILLUSTRATIONS ______________________________________________ 7
LISTE DES ABRÉVIATIONS _______________________________________________ 9
AVANT PROPOS _________________________________________________________ 11
INTRODUCTION_________________________________________________________ 12
I.
RÉPONSE IMMUNITAIRE NORMALE__________________________________ 12
1. L'activation des lymphocytes T _________________________________________ 12
1.1. Le contact entre CPA et lymphocyte T________________________________ 12
1.2. Transduction du signal et voies de signalisation ________________________ 14
a.
Voie de signalisation calcique____________________________________ 16
b.
Voie de la PKCθ_______________________________________________ 16
c.
Voie des MAPKinases __________________________________________ 17
d.
Voie de la Pi3K _______________________________________________ 18
1.3. Co-stimulation____________________________________________________ 18
1.4. CD45____________________________________________________________ 21
a.
Rôle de CD45 dans l’activation des lymphocytes T __________________ 21
b.
Les différents isoformes de CD45 ________________________________ 24
c.
Rôle des différents isoformes de CD45 ____________________________ 25
d.
Régulation de CD45 ___________________________________________ 29
2. Les sous-populations lymphocytaire T ___________________________________ 31
2.1. Lymphocytes T CD4 effecteurs ______________________________________ 31
a.
Caractéristiques des lymphocytes Th1, Th2 et Th17 _________________ 31
b.
Les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes T CD4 ____ 33
2.2. Lymphocytes T CD8 effecteurs ______________________________________ 38
a.
La dichotomie Tc1/Tc2 _________________________________________ 38
b.
Les Tc17 _____________________________________________________ 39
2.3. Les lymphocytes T mémoires________________________________________ 40
a.
Phénotype et propriétés fonctionnelles des TCM et des TEM ____________ 40
b.
La génération et le maintien des TCM et des TEM _____________________ 44
II. LA RÉPONSE IMMUNE PATHOLOGIQUE: AUTO-IMMUNITÉ: ___________ 46
2
1. Tolérance immunologique______________________________________________ 48
1.1. Tolérance centrale_________________________________________________ 48
1.2. Tolérance périphérique ____________________________________________ 51
a.
Tolérance périphérique passive __________________________________ 51
b.
Tolérance périphérique dominante _______________________________ 53
c.
Les lymphocytes T CD4 régulateurs ______________________________ 55
d.
Les lymphocytes T CD8 régulateurs ______________________________ 61
2. Auto-immunité : les vascularites à ANCA_________________________________ 65
2.1. Rôle de l’immunité humorale dans les vascularites à ANCA ______________ 67
2.2. Rôle de l’immunité cellulaire dans les vascularites à ANCA ______________ 69
III. REPONSE IMMUNE PATHOLOGIQUE : REJET DE GREFFE _____________ 73
1. Transplantation d’organe solide_________________________________________ 73
1.1. Rejet Hyper-aigu (ou rejet aigu médié par les anticorps)_________________ 73
1.2. Rejet cellulaire aigu _______________________________________________ 73
1.3. Rejet chronique___________________________________________________ 74
2. Les mécanismes du rejet de greffe _______________________________________ 74
2.1. Les alloantigènes __________________________________________________ 74
a.
Les molécules du CMH _________________________________________ 75
b.
Les antigènes mineurs d'histocompatibilité ________________________ 76
2.2. Les voies de présentation des alloantigènes ____________________________ 78
a.
La présentation directe des alloantigènes __________________________ 78
b.
La présentation indirecte des alloantigènes ________________________ 80
c.
La présentation semi directe ____________________________________ 81
2.3. Mécanismes effecteurs du rejet de greffe allogénique____________________ 81
a.
initiation du rejet______________________________________________ 81
b.
Les lymphocytes T alloréactifs ___________________________________ 82
OBJECTIFS______________________________________________________________ 90
RÉSULTATS _____________________________________________________________ 91
I.
Le niveau d’expression de CD45RC permet d’identifier des sous-populations T
fonctionnellement distinctes dont la distribution varie entre des individus sains et des
patients atteints de vascularites à ANCA. ______________________________________ 91
3
II. Le niveau d’expression de CD45RC sur les lymphocytes T humains est un
biomarqueur du risque de rejet d’allogreffe rénale. ____________________________ 104
DISCUSSION générale ET PERSPECTIVES _________________________________ 127
I.
Sous-populations T CD45RC humaines dans l’auto-immunité ________________ 127
II. Sous-populations T CD45RC humaines et allotransplantation ________________ 130
1. Le niveau d’expression de CD45RC permet de prédire le rejet de greffe rénale
chez l’Homme _________________________________________________________ 130
2. Le niveau d’expression de CD45RC permet de prédire la GvHD dans un modèle de
souris humanisées ______________________________________________________ 135
III. PROPRIÉTÉS RÉGULATRICES DES SOUS-POPULATIONS T CD45RC
HUMAINES_____________________________________________________________ 141
IV. ÉTUDE DU CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DES SOUS-POPULATIONS T CD45RC
HUMAINES ET DE FOXP3 _______________________________________________ 147
RÉFÉRENCES __________________________________________________________ 149
4
RESUME
Les allogreffes permettent de traiter de nombreuses pathologies liées à des déficiences
de fonctions vitales ou des cancers. L’utilisation de traitements immunosuppresseurs a permis
d’améliorer considérablement le taux de réussite des greffes. Mais, en déprimant l’ensemble
du système immunitaire, ils entraînent des effets secondaires importants. Actuellement, tous
les receveurs sont soumis à de tels traitements, indépendamment du risque de rejet du greffon.
Il est donc essentiel de posséder un outil diagnostique permettant d’identifier les lymphocytes
T alloréactifs pathogènes, cellules responsables de ces pathologies, et ainsi de prédire le rejet
afin de pouvoir limiter l’utilisation de ces immunosuppresseurs.
Chez le rat, l’intensité d’expression membranaire de CD45RC définit 2 populations de
lymphocytes T CD4 et CD8. Les lymphocytes T CD4 et CD8 CD45RChigh sont pathogènes et
sont capables d’induire une maladie auto-immune multi-organes ainsi que la réaction du
greffon contre l’hôte (GvHD), alors que les lymphocytes T CD45RClow préviennent ces
pathologies. De plus, la proportion de ces populations varie en fonction des souches de rats et
cette variabilité est contrôlée génétiquement. Ceci souligne la possibilité d’utiliser le rapport
CD45RChigh/CD45RClow au sein des lymphocytes T, pour prédire l’apparition de maladies
auto-immunes ainsi que le développement de la GvHD et du rejet de greffe allogénique.
Au cours de ma thèse, j’ai montré que CD45RC permet de séparer les lymphocytes T
humains en sous-populations phénotypiquement et fonctionnellement distinctes. Le niveau
d’expression de CD45RC est hétérogène aussi bien à la surface des lymphocytes T CD4 que
des lymphocytes T CD8 et la proportion de ces populations est très variable d’un individu à
un autre. Les cellules T CD45RChigh produisent des cytokines de type 1, alors que les
cytokines de type 2, régulatrice et l’IL-17 sont produites essentiellement par les cellules T
CD45RClow, en réponse à une stimulation polyclonale. Étant donné la production exclusive
des cytokines de type 2 et d’IL-17 par les CD45RClow, nous avons étudié l’implication de
cette sous-population dans les vascularites à ANCA, une pathologie où ces cytokines jouent
un rôle important. Et nous avons montré que les patients atteints de cette pathologie possèdent
une plus forte proportion de CD45RClow que des individus sains. De plus, l’étude des réponses
alloréactives montre que ces sous-populations possèdent aussi des propriétés alloréactives
différentes. En effet, comme chez le rat, les lymphocytes T CD45RChigh contiennent les
cellules alloréactives pathogènes. Nous avons alors analysé le profil CD45RC d’échantillons
sanguins provenant de patients receveurs de greffe rénale avant la greffe, et nous avons
montré que l’incidence de rejet se révèle plus importante chez les receveurs possédant une
forte proportion de CD45RChigh.
Le niveau d’expression de CD45RC pourrait donc être utilisé comme un outil
diagnostique prédictif du risque de rejet lors de greffe d’organe solide ou de la réaction du
greffon contre l’hôte lors de greffe de cellules souches hématopoïétiques et pourrait permettre
une stratification des patients pour les traitements immunosuppresseurs.
5
ABSTRACT
Allotransplantation is the treatment of choice for several several diseases linked to
vital function deficiency or cancer. The use of immunosuppressive therapy has drastically
increased the graft success rate. However, by weakening all the immune system, they induce
important secondary effects. Nowadays, all recipients receive such treatments, independently
of the risk of graft rejection. Therefore, one of the new challenges in transplantation is the
identification of simple, reliable and noninvasive surrogate markers for the deleterious
alloreactive immune responses. This would represent a crucial step toward the development
of clinical approaches to improve the care of organ allograft recipients. This has potentially
major clinical implications for tailoring immunosuppressive treatments according to the
patient needs.
In rats, the level of CD45RChigh expression on CD4 and CD8 T cells defines two
subsets. The CD45RChigh subsets within CD4 and CD8 T cells are pathogenic and induce
wasting disease as well as graft versus host disease (GvHD) upon adoptive transfer whereas
the CD45RClow T cell subset prevents these diseases. Moreover, the relative proportion of
these populations varies between rat strains and this variability is genetically controlled.
These data highlight the possibility to use the CD45RChigh/CD45RClow ratio within T cell to
predict autoimmunity as well as GvHD and allograft rejection.
During my PhD, I have shown that CD45RC expression allows the segregation of
human CD4 and CD8 T cells in phenotypically and functionally different subsets that are
highly variable between individuals. Under polyclonal stimulation, CD45RChigh T cells
produce type 1 cytokines, while type 2 and regulatory cytokines, as well as IL-17 are mainly
produced by the CD45RClow subset. Taking into account the exclusive production of type 2
cytokines and IL-17 by CD45RClow T cells, we studied the involvement of this subset in
ANCA vasculitis, a pathology where these cytokines play an important role. We showed that
patients affected by this disease have a higher proportion of CD45RClow than healthy
individuals. Moreover, we have shown that these CD45RC subsets exhibit different
alloreactive properties and that CD45RChigh T cells contain alloreactive pathogenic cells.
Then, by analyzing the relative proportion of CD45RC subsets in blood samples from graft
recipients before transplantation, we showed that the rejection incidence is higher in
recipients with a high proportion of CD45RChigh CD8 T cells.
Therefore, the expression level of CD45RC can be used as a diagnostic tool to predict
graft rejection in the context of solid organ transplantation and may allow stratification of
patients for immunosuppressive therapy.
6
LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1. Contact entre cellule dendritique et lymphocyte T.
Figure 2. Représentation schématique des voies de transduction du signal mises en place suite
à l’engagement du TCR.
Figure 3. Structure de la molécule CD45.
Figure 4. Rôle de CD45 dans l’activation des lymphocytes T : régulation des protéines
tyrosines kinases.
Figure 5. Altération de l’expression de CD45 et maladies.
Figure 6. Régulation de CD45 par l’homodimérisation différencielle des différents isoformes.
Figure 7. Hétérogénité des sous-populations T CD4.
Figure 8. Les voies cytotoxiques de lymphocytes T CD8.
Figure 9. Sous-populations de lymphocytes T mémoires.
Figure 10. Hétérogénéité phénotypique des lymphocytes T mémoires humains.
Figure 11. Modèle de la génération des lymphocytes T mémoires selon l’intensité du signal
de la stimulation antigénique.
Figure 12. Les voies de la tolérance.
Figure 13. Mécanismes passifs de la tolérance périphérique passive des lymphocytes T.
Figure 14. Marqueurs des lymphocytes T CD4 régulateurs naturels.
Figure 15. Mécanismes suppresseurs majeurs des lymphocytes T régulateurs.
Figure 16. Origine multifactorielle des maladies auto-immunes.
Figure 17. Sites vasculaires impliqués dans les différentes vascularites.
Figure 18. Organes impliqués dans les vascularites à ANCA (AAV).
Figure 19. Modèle schématique des mécanismes innés et adaptatifs supposés impliqués dans
la pathogénèse des vascularites à ANCA.
Figure 20. Voies de reconnaissance des alloantigènes.
Figure 21. Mécanismes cellulaires de la réponse alloréactive.
Figure 22. Les PBMC humains contenant une forte proportion de CD45RChigh.sont
responsables du développement de la xéno-GvHD chez les souris SCID/bg.
7
Figure 23. Les sous-populations T CD8 CD45RC ne contrôlent ni la prolifération ni la
sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4.
Figure 24. Les sous-populations T CD8 CD45RC inhibe l’activation des CPA allogénique.
8
LISTE DES ABREVIATIONS
AAV
Vascularite à ANCA
AICD
Activation Induced Cell death
ANCA
Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies
AIRE
Auto-immune regulator
BN
Brown Norway
CD
Classe de Différenciation
CMH
Complexe Majeur d'Histocompatibilité
CPA
Cellule présentatrice d’antigène
CSH
Cellules souches hématopoïétiques
CSS
Syndrome de Churg-Strauss
CTL
Cytotoxic T lymphocyte
CTLA-4
Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4
DC
Cellule dendritique
DTH
Réaction d’hypersensibilité retardée
EAE
Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale
Fc
Fragment constant des immunoglobulines
GvHD
Réaction du greffon contre l’hôte
GvT
Réaction du greffon contre la tumeur
HvG
Réaction de l’hôte contre le greffon
HLA
Human Leucocyte Antigen
HO
Heme Oxygenase
IDO
Indoleamine 2,3 dioxygenase
IFN-γ
Interféron-γ
Ig
Immunoglobuline
IL
Interleukine
ILT
Immunoglobulin Like Transcript
ITAM
Immunoreceptor tyrosine-based activation motifs
LEW
Lewis
MAPK
Mitogen-Activated Protein Kinase
miHA
Antigène mineur d'histocompatibilité
MPA
Polyangite microscopique
MPO
Myéloperoxidase
9
mTEC
Medullar thymic epithelial cell
NK
Cellule Natural Killer
NO
Monoxyde d’azote
PBMC
Peripheral Blood mononuclear cells
PR3
Protéinase 3
SCID
Severe combined immunodeficiency
STAT
Signal Transducer and Activator of Transcription
TCR
Récepteur du lymphocyte T
TGF-β
Transforming Growth Factor-β
Th
Lymphocyte T Helper
Tc
LymphocyteT cytotoxique
TCM
Lymphocyte T central mémoire
TEM
Lymphocyte T effecteur mémoire
TLR
Toll Like Receptor
TNF
Tumor Necrosis Factor
Treg
Lymphocyte T régulateur
VGI
Vascularite granulomateuse idiopathique
10
AVANT PROPOS
Souvent confronté aux attaques extérieures (infection virale ou bactérienne) et parfois
à la déficience de ses propres cellules (cancer) ou encore lors de greffe allogénique,
l’organisme se défend en activant son système immunitaire. La première barrière de défense
de l’organisme est orchestrée par l’immunité innée. Dépourvue de mémoire, elle veille en
permanence afin de détecter les pathogènes, les cellules anormales, tumorales ou infectées.
Dans de nombreuses situations, les cellules de l’immunité innée comme les cellules
dendritiques, les macrophages ou les cellules NK sont suffisantes pour éradiquer l’agent
pathogène. Cependant, le défaut de spécificité de ces cellules limite leur efficacité. Les
cellules de l’immunité innée requièrent alors l’aide de cellules hautement spécifiques aux
antigènes comme les lymphocytes T.
Afin de faire face au très large spectre d’agents pathogènes, les récepteurs des
lymphocytes T sont générés aléatoirement par recombinaison génique. Cependant, ce
processus conduit à l’émergence de lymphocytes T autoréactifs et donc potentiellement
dangereux pour l’organisme. Des mécanismes de tolérance centrale et périphérique se mettent
alors en place pour éliminer ou inactiver ces cellules. Cependant, des mutations génétiques,
des agents pathogènes ou des substances chimiques peuvent entraîner un dysfonctionnement
de ce processus et le développement de pathologies auto-immunes.
Les lymphocytes T peuvent être responsables d’autres pathologies immunes. En effet,
le vaste répertoire T obtenu par réarrangement aléatoire des gènes du TCR peut aussi contenir
des lymphocytes T alloréactifs. Lors d’une allogreffe, les cellules du tissu ou de l’organe
greffés sont reconnues comme étrangères par ces lymphocytes T alloréactifs et peuvent
entraîner le rejet du greffon. Lors de greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH), une
deuxième complication peut apparaître. Il s’agit de la réaction du greffon contre l’hôte
(GvHD) où les lymphocytes T contenus dans le greffon peuvent détruire les tissus du receveur
conduisant parfois au décès de l’individu.
Afin de mieux comprendre le développement de ces pathologies, il apparaît important
de disposer d’un marqueur biologique permettant d’identifier ces lymphocytes T pathogènes.
L'expression de la molécule CD45RC sur les lymphocytes T serait un candidat potentiel pour
distinguer des sous-populations ayant des propriétés autoréactives et allogéniques différentes.
Mon travail de thèse a consisté à étudier l’implication des sous-populations T CD45RC dans
l’auto-immunité, le rejet de greffe et la GvHD. Avant de présenter les résultats de cette étude,
je rappellerai brièvement nos connaissances sur le développement de la réponse immunitaire
des cellules T ainsi que leur rôle dans le développement des réponses immunes pathologiques.
11
INTRODUCTION
I.
RÉPONSE IMMUNITAIRE NORMALE
Dans un contexte inflammatoire, lors de la rencontre entre un lymphocyte T et une
cellule présentatrice d’antigène (CPA), la reconnaissance par le TCR (T Cell Receptor) d’un
complexe CMH (Complexe Majeur d’Histocompatibilité)/peptide entraîne l’activation du
lymphocyte T. L’engagement du TCR et de différentes molécules membranaires conduit à
une série de modifications moléculaires à la membrane plasmique, dans le cytoplasme, et
dans le noyau permettant au final au lymphocyte T d’acquérir ses fonctions effectrices. Ces
évènements conditionneront la mise en place et la spécificité des fonctions effectrices des
lymphocytes T. Ces mécanismes finement régulés permettront une réponse immunitaire
adaptée aux stimuli antigéniques ainsi que la mise en place d’une protection à long terme
appelée mémoire immunologique. Ce chapitre a pour objectif de présenter les mécanismes
d’activation d’un lymphocyte T par une CPA, les principales voies de signalisation en aval du
TCR ainsi que les fonctions effectrices des lymphocytes T.
1. L'activation des lymphocytes T
L’interaction moléculaire entre le TCR de la cellule T et le CMH porté par la CPA
active différentes voies de signalisation. Ces voies de signalisation auront pour finalité
d’activer plusieurs facteurs de transcription qui décideront de la réponse de la cellule T:
prolifération, différenciation, production de cytokines ou encore mise en place du potentiel
cytotoxique.
1.1. Le contact entre CPA et lymphocyte T
Les CPA sont des cellules du système immunitaire capables de présenter aux
lymphocytes T, des antigènes sous forme de peptides portés par les molécules du CMH. Les
CPA constituent une famille hétérogène de cellules regroupant les lymphocytes B, les
macrophages et les cellules dendritiques (DC). Elles ont en commun la capacité d’internaliser
efficacement les antigènes extracellulaires, d’apprêter les antigènes exogènes ou endogènes en
peptide de 10 à 20 acides aminés, de les charger sur les molécules du CMH et de présenter le
12
Lymphocyte T
CPA
Signal 1
Signal 2
Figure 1. Contact entre cellule dendritique et lymphocyte T.
Les cellules présentatrices d’antigène (CPA) matures adhèrent aux lymphocytes T naïfs par
l’interaction de CD2 et LFA-3 (CD48). La liaison de faible affinité entre LFA-1 et ICAM-1
est alors facilitée. La liaison du TCR au complexe CMH/peptide donne au lymphocyte T le
signal 1. Puis la liaison de CD28 à CD80/CD86 apporte le signal de costimulation (signal 2)
qui va conduire à l’activation complète du lymphocyte T.
D’après Huppa JB et al. (1).
13
complexe CMH/peptide à la surface cellulaire (2). Cependant, de nombreuses évidences
définissent les cellules dendritiques comme les principales CPA professionnelles. En effet, les
DC possèdent les capacités les plus appropriées pour présenter les antigènes aux lymphocytes
T naïfs et induire leur différenciation en cellules effectrices. Par exemple, les complexes
CMH/peptide sont 10 à 100 fois plus nombreux sur les DC que sur les autres CPA telles que
les lymphocytes B et les monocytes (3). Les cellules dendritiques capturent les antigènes dans
les tissus périphériques et migrent ensuite vers les organes lymphoïdes secondaires pour
devenir des cellules présentatrices d’antigènes compétentes initiant ainsi une réponse
immunitaire spécifique d’antigène (4). La reconnaissance du complexe CMH peptide de la
DC par la cellule T constitue le signal 1 de l’activation du lymphocyte T (Figure 1).
L’agrégation T-DC est entraînée par de nombreuses molécules d’adhésion, sur l’une et l’autre
des cellules, telles que CD2/ LFA-3 (Leucocytes Function Ag-3), ICAM-1 (Intercellular Cell
Adhesion Molecule-1 ou CD54) et ICAM-2 (CD50) /LFA-1, ICAM-3/DC-SIGN. L’ensemble
de ces interactions stabilisent le contact entre DC et lymphocytes T pour permettre
l’association entre le TCR et le complexe CMH/peptide. Parallèlement, l’engagement du
corécepteur CD4 ou CD8 qui se lie respectivement au domaine ß2 du CMH de classe II
(CMH-II) ou au domaine α3 du CMH de classe I (CMH-I) augmente l’affinité du TCR pour
le complexe CMH/peptide. Cet engagement potentialise alors l’activation de la cellule T d’un
facteur 100 (5). En retour, les lymphocytes T peuvent activer les DC via CD40 ligand
(CD40L). La liaison de CD40L à CD40 conduit alors à l’augmentation de l’expression des
molécules de costimulation CD80/CD86 et la sécrétion de cytokines telles que l’IL-1, le TNFα, l’IL-12 et des chimiokines (6).
1.2. Transduction du signal et voies de signalisation
La liaison du TCR avec le complexe CMH/peptide entraîne tout d’abord le
recrutement et l’activation des Src kinases, Lck et Fyn. Ces protéines kinases vont
phosphoryler les tyrosines des motifs ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation
Motifs) des domaines intracytoplasmiques des chaînes du complexe CD3 (Figure 2) (7). La
tyrosine kinase ZAP-70 se fixe alors à ces ITAMs phosphorylés via son domaine SH2 (Src
homology 2). Parmi les plus importantes cibles de ZAP-70, figurent la protéine
transmembranaire adaptatrice LAT (Linker for the Activation of T cells) et la protéine
adaptatrice cytosolique SLP-76 (SH2 domain containing Leucocytes Phosphoprotein of
14
Figure 2. Représentation schématique des voies de transduction du signal mises en place
suite à l’engagement du TCR.
Lors de l’activation d’un lymphocyte T, quatre voies principales sont engagées, chacune
identifiée par une couleur différente : la voie Ca2+/calcineurine en violet, la voie de la PKCθ
en orange, la voie Ras/Erk en vert et la voie Vav-1/Jun en bleu. Toutes les protéines
adaptatrices sont en marron. Toutes ces voies de signalisation convergent vers le noyau de la
cellule T où des facteurs de transcription vont pouvoir induire l’expression de certains gènes
(IL-2, …).
Extrait de Valitutti et al. (8).
15
76 kDa). Ces 2 protéines jouent un rôle central dans la mise en place et la connexion des
différentes voies de transduction du signal. En effet, la phosporylation sur de nombreuses
tyrosines de ces protéines conduit à l’activation de différentes voies de signalisation
dépendantes de la PLC-γ (Phospholipase C-γ) et de la Pi3K (Phosphatidylinositol-3-OH
Kinase). Suite à l’activation du TCR, la PLC-γ est recrutée au niveau du complexe SLP-76,
Vav1 et LAT où elle est ensuite phosphorylée par la kinase Itk (IL-2-inducibleT-cell kinase)).
Une fois activée, la PLC-γ hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2)
conduisant à la formation de deux seconds messagers : l’inositol-1,4,5-triphosphate (IP3)
médiant la voie de signalisation calcique et le diacylglycérol (DAG) responsable de
l’activation de la voie de la PKC-θ (Protein Kinase C-θ) et de la voie des MAPK (MitogenActivated Protein Kinase).
a. Voie de signalisation calcique
L’IP3 se fixe à des récepteurs de la membrane du réticulum endoplasmique ouvrant
ainsi des canaux calciques qui vont relarguer le calcium dans le cytoplasme (Figure 2) (9).
Cette augmentation rapide mais transitoire de calcium conduit à l’ouverture de canaux
calciques de la membrane plasmique du lymphocyte T, les CRAC (Calcium Release
Activated Calcium Channels). L’ouverture des CRAC permet une entrée du calcium depuis le
milieu extracellulaire, maintenant ainsi une concentration cellulaire en calcium élevée. Le
calcium se fixe alors sur la calmoduline. Le complexe calcium/calmoduline active alors la
calcineurine, une phosphatase, qui va à son tour déphosphoryler le facteur de transcription
NFAT (Nuclear Factor of activated T cells) et ainsi conduire à sa translocation au noyau.
Dans le noyau, NFAT coopère avec de nombreux autres facteurs de transcription conduisant à
l’expression différentielle de nombreux gènes dont celui de l’IL-2. La voie calcique, en
agissant sur les protéines du cytosquelette, contribue aussi à l’immobilisation de la cellule T
lors de la rencontre avec une CPA, formant ainsi la synapse immunologique mature .
b. Voie de la PKCθ
Le DAG mais aussi Lck vont favoriser l’activation de la PKCθ (isoforme θ de la
protéine kinase C) ainsi que son recrutement membranaire au niveau de la synapse
16
immunologique (Figure 2) (10). Une fois activée, la PKCθ active la kinase IKK qui à son tour
phosphoryle IκB du complexe IκB/NFκB induisant ainsi la dégradation d’IκB. Ceci permet la
translocation nucléaire du facteur de transcription NFκB. La PKCθ induit aussi l’activation du
facteur de transcription AP-1 (Activator Protein-1), mais les mécanismes impliqués dans cette
voie sont encore mal connus. L’activation de NFκB et du complexe AP-1 conduit alors à
l’activation de gènes impliqués dans la survie, la différenciation, l’homéostasie et les
fonctions effectrices des lymphocytes T (11).
c. Voie des MAPKinases
La voie des MAP kinases, utilisée par toutes les cellules de l’organisme, fait partie des
voies de signalisation les plus anciennes et les plus conservées dans l’évolution. Elle permet
de réguler divers processus cellulaires allant de la différenciation cellulaire à l’apoptose. Chez
les mammifères, les MAPK sont impliquées dans tous les aspects de la réponse immunitaire,
allant de l’initiation de la réponse innée à l’activation de la réponse adaptative jusqu’à la mort
cellulaire (12). Il existe 3 groupes majeurs de MAPK chez les mammifères : ERK 1 et 2
(extracellular signal-regulated protein kinases), les p38 MAPK et les JNK (c-Jun NH2terminal kinases). L’activation des MAPK résulte de l’enchaînement d’une cascade de
phosphorylations sur des résidus sérine ou thréonine. Les MAPK sont phosphorylées par des
MAP kinase kinases (MAPKK) qui sont elles-mêmes phosphorylées par des MAP kinase
kinase kinases (MAPKKK).
Suite à l’engagement du TCR, la protéine LAT va recruter et fixer la protéine
adaptatrice GRB2 (Figure 2) (7). GRB2 est elle-même constitutivement associée à SOS, une
GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) qui permet l’activation de la GTPase Ras. La
protéine Ras active alors les MAPKKK induisant la cascade des MAP kinases qui conduit à la
translocation nucléaire de ERK 1 et 2. Les kinases ERK vont activer le facteur de
transcription Elk qui contribue à l’activation du complexe de transcription AP-1 (c-Jun/c-Fos)
via la régulation de c-Fos. La costimulation par CD28 permet l’activation de Vav-1
conduisant à la phosphorylation de c-Jun par JNK qui pourra alors s’associer à c-Fos.
De plus, le DAG, en induisant le recrutement à la membrane de la GEF RasGRP,
permet aussi l’activation de Ras. Récemment, il a été montré que RasGRP catalyse l’activité
de SOS, résultant en une boucle de contrôle positive et une activation robuste de Ras
amplifiant ainsi le signal (13).
17
d. Voie de la Pi3K
Une quatrième voie de transduction du signal implique l’intervention d’une lipide
kinase, la phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) qui phosphoryle le PIP2 membranaire pour
générer du PIP3 (Figure 2) (14). La Pi3K est un hétérodimère composé d’une sous-unité
catalytique de 110 kDa (p110) et d’une sous-unité régulatrice de 85 kDa (p85). Après
activation du TCR, la Pi3K est recrutée à la membrane plasmique via le domaine SH2 de sa
sous-unité p85. Il a été montré que la Pi3K pouvait se fixer aux tyrosines phosphorylées des
queues cytoplasmiques des molécules de costimulation CD28 et ICOS . Le recrutement de la
sous-unité p85 via les tyrosines phosphorylées ne contribue pas seulement à sa localisation à
la membrane plasmique, mais permet aussi son activation. L’activation de la Pi3K se fait dans
les secondes qui suivent l’activation du lymphocyte T, précédant même le flux calcique.
Le lipide membranaire PIP3 permet le recrutement à la membrane plasmique de
nombreuses enzymes à domaine PH (Pleckstrin Homology) dont la sérine-thréonine kinase
AKT qui semble la plus importante. AKT joue un rôle important, notamment dans la
croissance et la prolifération cellulaires, la survie et la production de cytokines. Les Tec
kinases, protéines qui possèdent aussi des domaines PH, dont Itk peuvent aussi être recrutées
à la membrane et être activées. Elles permettent alors d’activer la PLC-γ et donc de créer une
connexion entre la voie de la Pi3K et la voie calcique. Il a aussi été suggéré que AKT et ITK
pouvaient réguler la différenciation en Th1 et Th2 respectivement (15).
De plus, la voie de la Pi3K semble impliquée dans la sensibilité des T effecteurs à la
suppression des lymphocytes T régulateurs (16).
1.3. Co-stimulation
Le signal fournit par le TCR n’est pas suffisant pour l’activation complète du
lymphocyte T. En effet, la liaison du TCR en l’absence de signal de co-stimulation induit
généralement l’apoptose ou un état d’anergie dans lequel les lymphocytes T sont incapables
de produire de l’IL-2 et de proliférer (17). La co-stimulation apporte un signal supplémentaire
requis pour dépasser l’état d’anergie et pour l’activation productive des lymphocytes T (signal
2) (Figure 1). Un grand nombre de co-récepteurs ont été décrits dont les mieux caractérisés
18
sont les molécules de la superfamille des immunoglobulines, CD28, et ICOS (Inducible
Costimulatory Molecule) (18, 19).
De nombreuses études ont montré que CD28 favorise la prolifération des lymphocytes
T, la production de cytokines et la survie cellulaire via notamment la production d’IL-2 (20).
La liaison de CD28 à ses ligands B7.1 (CD80) ou B7.2 (CD86) présents sur les CPA
augmente considérablement l’amplitude de la réponse en optimisant la plupart des voies de
signalisation induite par la liaison du TCR. Un des effecteurs clés est la Pi3K. Les souris
déficientes pour CD28 développent une réponse immunitaire amoindrie face à divers agents
infectieux. La signalisation via CD28 permet de réguler le seuil d’activation et de diminuer
fortement le nombre de TCR engagés nécessaire pour l’activation T. La fonction principale de
CD28 est d’augmenter et soutenir la réponse T initiée par le TCR, en promouvant la survie
cellulaire, l’expansion clonale et la différenciation (18). Une autre molécule est capable de se
lier à CD80/CD86, mais possède une activité opposée à CD28 : il s’agit de CTLA-4
(Cytotoxic T lymphocyte Antigen-4). L’expression de CTLA-4 est restreinte aux lymphocytes
T activés et mémoires. L’engagement du TCR et de CD28 conduit à une translocation rapide
de CTLA-4, des lysosomes vers la membrane plasmique. Cette molécule joue un rôle
régulateur de la réponse T en inhibant la synthèse d’IL-2 et la progression dans le cycle
cellulaire. La liaison de la molécule PD-1, sur les lymphocytes T avec son ligand PD-L1
présents sur les CPA semble jouer un rôle équivalent à celui de CTLA-4 (18).
Même si ces études montrent l’importance de la costimulation via CD28, toutes les
réponses immunes ne sont pas toutes affectées par la perte de CD28 montrant que d’autres
molécules peuvent co-stimuler les lymphocytes T. En effet, il existe de nombreuses autres
molécules de costimulation parmi lesquelles figurent CD2, CD5, CD30, 4-1BB, OX40, et
LFA-1 et ICOS (Inducible Costimulator).
ICOS, à l'inverse de CD28, n'est pas exprimé sur les lymphocytes T naïfs (19). En
effet, l’expression d’ICOS est rapidement induite sur les lymphocytes T après activation et est
influencée à la fois par la signalisation du TCR et de CD28. ICOS-L est exprimé
constitutivement sur les cellules dendritiques, les monocytes et les lymphocytes B non
stimulés, mais également sur des cellules non-hématopoïétiques comme le rein, le foie, le
cœur ou le cerveau (21). Même si la régulation d’ICOS-L n’est pas très bien connue, certaines
données suggèrent que l’expression d’ICOS-L puisse être induite par l’IFN-γ, le TNF-α et le
GM-CSF (Granulo-Monocytes-Colony Stimulating Factor). Lors de la phase d’initiation de
l’activation des lymphocytes T naïfs, les effets d’ICOS sur la prolifération et la production
d’IL-2 sont modestes. La co-stimulation du lymphocyte T via ICOS semble plus importante
19
Domaine riche en cystéine
Domaine Fibronectine type III
Domaine juxtamembranaire
Domaine PTP active D1
Domaine PTP inactive D2
Domaine riche en proline
Domaine riche en N-glycosilation
Figure 3. Structure de la molécule CD45.
Les domaines fonctionnels clés sont représentés. CD45 existent sous plusieurs isoformes
obtenus après épissage alternatif des exons 4, 5 et 6 qui codent pour trois régions désignées A,
B et C du domaine extracellulaire. Le domaine extracellulaire contient de multiples sites de
glycosilation et de sialyation. L’isoforme le plus lourd (CD45RABC) et le plus léger
(CD45RO) sont montrés de façon schématique. La région intracytoplasmique contient deux
domaine phosphatase (PTP) D1 et D2 dont seul D1 est actif.
D’après Hermiston et al. (22).
20
pour la régulation de la production de cytokines par les lymphocytes T récemment activés et
par les lymphocytes T effecteurs. En effet, la liaison de ICOS à ICOS-L peut entraîner une
augmentation de la production d'IL-4, d’IL-5, d’IL-6, d’IFN-γ, de TNF-α, et de GMCSF (23).
De plus, ICOS intervient aussi dans l’inhibition de l’apoptose.
1.4. CD45
Comme nous l’avons vu précédemment, la signalisation par le TCR entraîne un
ensemble de signaux qui activent de multiples voies effectrices. Afin de contrôler l’amplitude
et la durée de la réponse T, l’activation de ces voies est régulée par de nombreuses protéines,
dont CD45 fait partie.
a. Rôle de CD45 dans l’activation des lymphocytes T
La molécule CD45 appartient à la famille des protéines à activité tyrosine phosphatase
(PTPs) et constitue un composant essentiel dans la voie de signalisation des lymphocytes T et
B (24). CD45 est une des glycoprotéines les plus abondamment exprimées à la surface des
cellules nucléées d'origine hématopoïétique (plus de 10% de la surface cellulaire). La région
intracytoplasmique contient deux domaines tyrosine phosphatase en tandem : D1 et D2, mais
seule la partie D1 possède une activité phosphatase et est nécessaire pour la signalisation via
le TCR (Figure 3) (25). D2 permettrait la stabilisation et une activité optimale de CD45 (2628).
L'utilisation de cellules déficientes en CD45 et l'étude de souris invalidées pour le
gène codant pour CD45 ont montré que cette molécule est un régulateur important de la
maturation et de l'activation lymphocytaire. Chez l'homme et la souris, la perte d'expression
de CD45 est associée à une immunodéficience sévère combinée (29, 30). Les souris CD45-/ont un profond défaut de maturation thymique dû à une augmentation du niveau basal de
l'apoptose, et à un dysfonctionnement de la signalisation du pré-TCR et du TCR conduisant à
une accumulation des thymocytes au stade double négatif et double positif. Ceci provoque
une lymphopénie périphérique avec diminution de 80 % du nombre normal de lymphocytes T
périphériques (29, 31).
21
Figure 4. Rôle de CD45 dans l’activation des lymphocytes T : régulation des protéines
tyrosines kinases.
L’activité de la protéine Lck est un équilibre dynamique, entre les conformations actives et
inactives, dû à l’activité réciproque de CD45 et Csk. Au repos, la tyrosine 505 (Y505) de la
Lck est phosphorylée par Csk, ce qui engendre une fixation à son propre domaine SH2 et une
conformation repliée inactive. Après engagement du TCR, CD45 déphosphoryle Y505,
permettant un dépliement de la Lck et constituant ainsi un réservoir de Lck pré-activées. La
Lck peut alors s’autophosphoryler sur Y394 et devient active. La Lck active phosphoryle les
motifs ITAM des chaînes du complexe CD3. Les ITAM phosphorylés recrutent et activent la
protéine tyrosine kinase ZAP-70 qui phosphoryle et active des protéines adaptatrices et
d’autres enzymes aboutissant à l’activation cellulaire. Pour limiter l’activité kinase de la Lck,
CD45 déphosphoryle ensuite le site actif Y394, et le domaine Y505 est phosphorylé par Csk,
maintenant la Lck dans une conformation inactive.
D’après Hermiston ML et al. (24).
22
CD45 joue un rôle important dans l’activation lymphocytaire en régulant l’activité des
Src kinases telles que Lck et Fyn (Figure 4). L’activité de la kinase Lck est contrôlée par la
phosphorylation de 2 résidus tyrosines : une tyrosine inhibitrice située dans le domaine
COOH terminal (Y505) et une tyrosine activatrice dans le domaine à activité kinase (Y394).
La phosphorylation de Y505 de la Lck par la kinase Csk (C-terminal Src kinase) entraîne la
fixation de la Lck à son propre domaine SH2. Ce repliement bloque le site de liaison au
substrat rendant ainsi la Lck inactive. Après engagement du TCR, CD45 déphosphoryle
Y505, permettant un dépliement de la Lck qui s'auto-phosphoryle sur la tyrosine 394 et
devient alors active.
En déphosphorylant la Y394, CD45 peut aussi fonctionner comme un régulateur
négatif de la Lck (32-35). Mais le blocage dans le développement thymique, la très faible
réponse à la stimulation du TCR et le sauvetage par le transgène Lck Y505 muté (non
phosphorylable) dans les souris CD45-/- sont en faveur d’un rôle activateur prédominant de
CD45. Ces rôles, qui semblent paradoxaux, peuvent être conciliés dans un modèle où
l’activité de CD45 serait contrôlée par sa localisation par rapport à son substrat. Lorsque les
lymphocytes T sont au repos, CD45 déphosphoryle la tyrosine inhibitrice générant ainsi un
réservoir de Lck pré-activées. Après reconnaissance par le TCR, CD45 serait exclu de la
synapse immunologique permettant ainsi une activité soutenue de la Lck lors de la phase
d’initiation de la transduction du signal. Récemment, des travaux de McNeil et al. ont montré
que l’introduction d’un transgène CD45RO permettant une faible expression de CD45 dans
des souris CD45 déficientes entraîne une signalisation via le TCR diminué alors qu’une
expression intermédiaire (entre la souris CD45-/- et la CD45+/+) entraîne une hyperactivation
des lymphocytes T (36, 37). À des faibles niveaux d’expression de CD45, l’activité inhibitrice
de la pY505 domine, alors qu’à des niveaux d’expression intermédiaire, il y a une
augmentation de pY394 qui active Lck. Il semblerait donc que CD45 régule Lck de façon
différentielle. Ces données suggèrent que la sensibilité des lymphocytes T à la stimulation suit
une courbe gaussienne selon l’activité de CD45, avec un pic de réponse qui se situe au niveau
juste en dessous de l’expression normale de CD45. Il faut tout de même noter que l’étude ne
concerne que l’isoforme CD45RO et qu’il se peut que cette activité soit variable selon les
isoformes.
CD45 peut également réguler négativement la production de cytokines et la réponse
aux cytokines par la déphosphorylation des protéines Janus Kinases (JAKs) (38). La fixation
des cytokines à leurs récepteurs spécifiques induit l'autophosphorylation des JAKs qui sont
23
constitutivement associées à la région cytoplasmique des récepteurs. Les JAKs actives
agissent comme des régulateurs positifs de la signalisation des cytokines, en phosphorylant
les protéines STATs (signal transducer and activator of transcription). Les protéines STATs
phosphorylées vont dans le noyau et régulent l'expression de gènes impliqués dans la réponse
aux cytokines et aux chimiokines (prolifération, différenciation, ...) (39). Ainsi, la perte du
gène cd45, entraîne une hyper-phosphorylation de JAK2 et STAT3 ainsi qu’une augmentation
de leur activation, en réponse à l’IL-3 ou à l’IFN-α. (38). Elle peut aussi entraîner une
érythropoïèse et la formation de colonies de neutrophiles et macrophages en réponse à l’IL-3,
à partir de progéniteurs de la moelle osseuse. De plus, cette hypersensibilité à l’IFN-α protège
les souris CD45-/- de l’infection létale par le Coxsackevirus B3.
Une étude récente a attribué une nouvelle fonction à CD45. En effet, l’activation des
monocytes et granulocytes humain induit un clivage de la queue cytoplasmique de CD45, qui
est alors relarguée dans le milieu (40). La fixation de ce fragment de CD45 aux lymphocytes
T activés est alors capable d’inhiber leur prolifération, suggérant que le domaine
intracellulaire de CD45 peut fonctionner comme un régulateur intercellulaire de l’activation
T.
b. Les différents isoformes de CD45
Il existe plusieurs isoformes de CD45 qui proviennent de l'épissage alternatif des
exons 4, 5 et 6, codant pour des domaines contenus dans l'extrémité extracellulaire de la
molécule (Figure 3) (24, 41). Dans la nomenclature, les exons 4, 5 et 6 ont été désignés
respectivement par les lettres A, B et C. L’isoforme de plus haut poids moléculaire
(CD45RABC) contient les 3 exons et l’isoforme de plus bas poids moléculaire (CD45RO) est
le résultat de l'épissage de ces trois exons; la lettre R signifiant « restreint à ». L'exon 5
contient une séquence particulière dans son promoteur, qui empêche son excision lors de
l'épissage alternatif (42). Par conséquent, tous les isoformes, sauf CD45RO, expriment au
moins le domaine B : CD45RABC, CD45RAB, CD45RBC, CD45RB.
L'hétérogénéité du domaine extracellulaire de CD45 est également accentuée par
différentes glycosylations. Les trois domaines variables extracellulaires A, B et C portent
plusieurs sites de glycosylation à liaisons O-glycosidiques (O-glycosylations). Le domaine
constant extracellulaire porte, quant à lui, des sites de glycosylation à liaisons Nglycosidiques (N-glycosylations). Les motifs de glycosylation de CD45 dépendent non
seulement de la variabilité d'expression des exons A-B-C, mais aussi du type cellulaire, du
24
stade de développement ou de l'état d'activation de la cellule. Ceci suggère un intérêt
fonctionnel à ces glycosylations (43). Ainsi, la molécule CD22 (lectine de type I), exprimée
par les lymphocytes B, peut interagir avec les acides sialiques contenus dans les Nglycosylations de CD45 exprimées par les cellules T, contribuant à l'adhésion cellulaire (44).
Il a été également montré que les résidus oligomannosidiques des N-glycosylations de CD45
exprimé par les thymocytes immatures CD4+CD8+CD3low, interagissent spécifiquement avec
la protéine sérique liant le mannose (mannan binding protein). Ceci peut conduire à la
modulation du développement et de la maturation des thymocytes (45).
L'expression cellulaire des différents isoformes est fortement régulée. Différents
facteurs activateurs, en cis ou en trans, contrôleraient l'épissage alternatif des exons codant
pour les domaines extracellulaires de CD45, et réguleraient les niveaux d'expression
physiologique de chaque isoforme. Des facteurs activateurs en cis, ont été montrés comme
gouvernant la commutation de l'isoforme de CD45 RA->R0, pendant l'activation des
lymphocytes T (46). Chez le rat, l'intensité d'expression de l'isoforme CD45RC sur les
lymphocytes T CD4 et T CD8 est contrôlée génétiquement par des facteurs trans-activateurs
situés en dehors du locus de CD45, sur les chromosomes 9 (locus Cec1) et 20 (locus Cec2).
Ainsi, les lymphocytes T des rats Lewis (LEW), contiennent plus de cellules exprimant
fortement CD45RC (CD45RChigh), tandis que les lymphocytes T des rats Brown-Norway
(BN) contiennent plus de cellules exprimant faiblement CD45RC (CD45RClow) (47, 48).
Récemment, Oberdoerffer et al. ont montré que la protéine ribonucléaire hnRNPLL
(heterogeneous ribonucleoprotein L-like) était un régulateur inductible important de
l’épissage alternatif de CD45 (49). En effet, l’expression de hnRNPLL est augmentée dans les
lymphocytes T activés et se fixe alors sur les transcripts CD45 pour permettre l’épissage
alternatif. La déplétion ou la surexpression de hnRNPLL dans des lignées T et B et dans des
lymphocytes T primaires entraîne l’altération de l’expression de CD45RA et CD45RO.
c. Rôle des différents isoformes de CD45
Même si les fonctions exactes des différents isoformes ne sont pas encore connues,
leur niveau d’expression a été associé à différentes fonctions. L'expression cellulaire des
différents isoformes de CD45 dépend du type cellulaire, du stade de développement ou de
l'état d'activation de la cellule (24, 50-52). Elle permet de distinguer les cellules T naïves des
cellules T mémoires, et de distinguer des sous-populations de cellules ayant des fonctions
différentes (53-55). Les cellules T naïves expriment les isoformes de haut poids moléculaires
25
Maladie/Population
Nombre Total
Nombre Total
patients
controles
(fréquence
allele, %)
Nombre Total
Nombre Total
patients
controles
(fréquence
(fréquence
(fréquence
allele, %)
allele, %)
allele, %)
Exon 4 C77G
Exon 4 C77G
Hépatite
Histiocytose à
Autoimmmune
cellules de
Iran
70 (0.0)
140 (0.4)
Langerhans
Allemagne
178 (3.2)a
207 (0.7)
Italie
41 (3.7)a
199 (0.3)
197 (2.8)a
236 (0.9)
67 (3.7)a
205 (0.7)
98 (2.0)
205 (0.7)
175 (9.0)a
176 (23.7)
126 (19.8)
176 (23.7)
Hepatitis B
113 (11.9)a
176 (23.7)
Hepatitis C
173 (19.4)
176 (23.7)
VIH
Diabetes
Allemagne
228 (0.2)
196 (1.3)
Royaume-Uni
Allemagne
165 (1.2)
220 (1.1)
Sclérose
systémique
Graves' disease
Allemagne
a
Maladie/Population
297 (1.3)
196 (1.3)
Allemagne
Sclérose en
Lupus
plaques
erythémateux
Allemagne
327 (3.2)a
303 (0.0)
systémique
Allemagne
76 (3.3)a
119 (0.4)
Allemagne
Allemagne
454 (0.8)
347 (1.4)
Exon 6 A138G –
Italie
194 (1.3)a
222 (0.0)
Italie
448 (1.2)
529 (0.9)
Suède
1044 (1.4)
630 (1.5)
Royaume-Uni
330 (2.6)
197 (2.0)
Etats-Unis
122 (1.6)
244 (0.4)
Etats-Unis
450 (1.7)
253 (1.2)
Japon
Graves' disease
Hashimoto
thyroiditis
Associations significativement significative de polymorphismes de CD45 C77G ou A138G avec des maladies.
Figure 5. Altération de l’expression de CD45 et maladies.
Fréquence de variants C77G et A138G chez des groupes de malades et de contrôles.
D’après Tchilian EZ et al. (56).
26
contenant le domaine A, (cellules CD45RA+). Mais suite à l’activation, l’isoforme CD45RO
est exprimé à la surface cellulaire. CD45RO est aussi exprimé par les cellules mémoires. La
forte expression de l’isoforme contenant l'exon B (CD45RBhigh chez la souris) ou l'exon C
(CD45RChigh chez le rat), sur les lymphocytes T CD4, est associée à un phénotype de type 1,
avec production d'IL-2 et d'IFN-γ. Tandis qu’une faible expression de CD45RB (CD45RBlow
chez la souris) ou CD45RC (CD45RClow chez le rat) est associée à un phénotype de type 2,
avec la production d'IL-4, d'IL-10 et d'IL-13 (47, 57, 58). De plus, le transfert de lymphocytes
T CD4 CD45RChigh, chez des animaux histocompatibles athymiques, provoque des
manifestations auto-immunes (syndrome de dépérissement, thyroïdite, diabète), alors que le
co-transfert de cette sous-population avec des lymphocytes T CD4 CD45RClow prévient le
développement de ces maladies (59-61). Le traitement de souris avec un anticorps
monoclonal agoniste anti-CD45RB, induit la surexpression de CTLA-4 sur les lymphocytes T
CD4, associée à la survie d'une greffe d'organe (62). Les différents isoformes de CD45 sont
associés à des différences de phosphorylation des protéines intracellulaires et d’activité de
Lck, mais les résultats sont assez contradictoires selon les groupes (63-69). Chez l'homme,
l'expression aberrante de CD45 a été associée à plusieurs maladies incluant la cholestasie
infantile, le lupus systémique érythémateux, l'arthrite rhumatoïde, la maladie d'Alzheimer
(Figure 5) (70-74). La mutation remplaçant une cytosine par une guanine en position 77
(C77G) dans l'exon 4, prévient l'épissage de cet exon et altère l'expression de l'isoforme
CD45RA (75). Cette mutation dont la fréquence varie de 1 à 4 % dans la population humaine,
conduit à un maintien de l'expression de CD45RA sur les cellules T de phénotype CD45RO+
(cellules activées ou mémoires). Ces lymphocytes T présentent une hyperactivation
consécutive à une augmentation de l'activité tyrosine kinase de la protéine Lck, après
stimulation par le TCR (76-78). Ce polymorphisme d'expression est associé à une
augmentation de la fréquence de maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le
diabète, le lupus systémique érythémateux, et de maladies infectieuses (VIH) (75). À
l'inverse, la mutation A138G de l'exon 6, dont la fréquence dans la population peut atteindre
22 %, est associée à une protection contre les maladies auto-immunes (thyroïdite) et
infectieuses (hépatite B). Cette mutation conduit à une augmentation de l'expression de
CD45R0 sur les lymphocytes T.
27
Figure 6. Régulation de CD45 par l’homodimérisation différencielle des différents
isoformes.
L’isoforme CD45RABC existe de façon prédominante sous la forme monomérique où la
phosphatase est active alors que l’isoforme CD45RO facilite la dimérisation. L’efficacité de
l’homodimérisation de CD45RO rend CD45 moins active, augmentant ainsi le seuil du signal
de transduction et permettant alors de diminuer la réponse immunitaire.
Extrait de Herminston et al. (24).
28
d. Régulation de CD45
L’organisation du domaine extracellulaire, très conservé dans l’évolution et semblable
à celle des récepteurs à activité tyrosine kinase, laisse présumer que l’expression de CD45
pourrait être régulée par l’interaction avec un ligand. Cependant, malgré de nombreuses
recherches, aucun ligand spécifique n’a été identifié. Il a été montré que des anticorps
monoclonaux dirigés contre différents épitopes de CD45, diminuaient l'activité phosphatase
de la molécule (79). De nombreuses glycoprotéines, telles que CD22 (80), galectine-1 (81),
glucosidase II (82) et MGL une lectine C (83), se fixent de façon non spécifique aux
glycoprotéines des lymphocytes T comme CD45. La façon dont elle régule l’activité de CD45
n’est pas claire. Une des possibilités serait que ces protéines régulent la localisation de CD45
à la surface cellulaire et ainsi la dimérisation et l’accessibilité à ses substrats (22, 43).
En effet, il a été proposé, à partir du modèle d'un autre récepteur protéine tyrosine
phosphatase (RPTPα), que la dimérisation de CD45 régule l'activité tyrosine phosphatase de
la molécule par inhibition du site catalytique (Figure 6) (84, 85). L'homo-dimérisation
pourrait être spontanée ou influencée par le domaine extracellulaire puisque les isoformes de
faible poids moléculaire dimérisent plus rapidement et plus efficacement en comparaison aux
isoformes lourds. Cependant, ce mécanisme de régulation n'est pas encore bien vérifié, et les
études sont contradictoires (22). L'étude structurale récente de CD45, montre que le domaine
intracellulaire de la molécule ne peut pas se dimériser (86).
Un autre mécanisme de régulation, alternatif ou additionnel, serait la modification de
la localisation cellulaire de CD45. Par exemple, des études de cinétique de ségrégation
proposent que l’exclusion de CD45 des sites d’engagement du TCR est un des premiers
évènements de l’initiation de la transduction du signal. Différents modèles de régulation de la
localisation de CD45 semblent possibles : l’exclusion stérique, l’interaction intracellulaire
avec d’autres protéines ainsi qu’avec le cytosquelette membranaire (22).
29
Figure 7. Hétérogénité des sous-populations T CD4.
Le processus de différenciation des lymphocytes T CD4 est initié par le signal fournit par les
CPA aux lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques, conduisant à leur division et leur
différenciation. La défense de l’hôte est orchestrée par trois populations majeures, les Th1,
Th2 et Th17. Les sous-populations de lymphocytes T CD4 matures et leur facteur de
transcription sont représentés. Les cytokines jouent un rôle important dans l’induction des
différents lignages. En présence d’IL-12, d’IL-4 ou d’IL-6/TGF-ß, les Th0 vont se
différencier en lymphocytes Th1, Th2 et Th17 respectivement. Les lymphocytes T CD4
matures doivent ensuite quitter les ganglions lymphatiques et migrer vers les tissus infectés
pour exercer leur fonction. Certains lymphocytes peuvent migrer vers les follicules B pour
promouvoir la commutation isotypique des anticorps qui conviendra le mieux à la réponse
immunitaire.
Adapté de Abbas, AK et al. (87).
30
2. Les sous-populations lymphocytaire T
2.1. Lymphocytes T CD4 effecteurs
Après leur activation par les DC, les lymphocytes T CD4 naïfs peuvent se différencier
en trois sous-populations effectrices Th1 (T helper 1), Th2 et Th17 (Figure 7). Ces différentes
populations se caractérisent par leur profil de sécrétion de cytokines qui leur permet
d’orchestrer la réponse immunitaire face à différents pathogènes (88-90).
a. Caractéristiques des lymphocytes Th1, Th2 et Th17
Les Th1 et Th2
En 1986, Mosmann et al. montrent que des clones de lymphocytes T CD4 murins
peuvent être divisés en 2 populations distinctes, les Th1 et les Th2, selon leur profil de
production de cytokines (88).
•
Les lymphocytes T CD4 Th1 sécrètent de l'IFN-γ, de l’IL-2, du TNF-α, et du TNF- ß. Il
est classiquement admis que les lymphocytes Th1 favorisent plus particulièrement
l'éradication des pathogènes intracellulaires (virus, bactéries et parasites intracellulaires),
(Figure 7). La cytokine caractéristique des Th1, l’IFN-γ possède deux rôles clés (87, 89). Tout
d’abord, elle permet l’activation des macrophages et augmente ainsi leur activité
phagocytaire, l’expression des CMH-I et II, l’induction d’IL-12, de NO (Nitric Oxide) et la
production d’anion superoxide, importants pour l’élimination des pathogènes intracellulaires
(91, 92). L'IFN-γ favorise la commutation isotypique en IgG2a et IgG3 chez la souris (93, 94)
correspondant probablement aux IgG1 et IgG3 chez l’Homme. Cette cytokine va donc
favoriser la production d’IgG qui en se fixant aux Fcγ-récepteur et au complément entraîne
l’opsonisation et la phagocytose de certains pathogènes. Cependant, les Th1 sont aussi
responsables de la réaction d'hypersensibilité retardée où l’IFN-γ et le TNF-ß induisent une
forte inflammation et des lésions tissulaires. De plus, les Th1 peuvent acquérir des capacités
cytolytiques suite à l’expression de FasL à leur surface. Les cytokines qu'elles produisent
comme l'IL-2 et l'IFN-γ vont promouvoir la différenciation des lymphocytes T CD8 en
cellules cytotoxiques actives. Historiquement, les lymphocytes Th1 ont été fortement reliés à
31
de nombreux syndromes auto-immuns comme la sclérose en plaques, le diabète et le lupus
érythémateux disséminé (95). Mais ces données ont récemment été remises en question par la
découverte des Th17 (96). Les Th1 semblent aussi impliqués dans les maladies
inflammatoires de l’intestin comme la maladie de Crohn (95).
•
Les lymphocytes T CD4 Th2, quant à eux, sont impliqués dans l'élimination de
pathogènes extracellulaires comme le toxoplasme, les leishmanias, ou les parasites
intestinaux (les helminthes), (Figure 7). Ils sont caractérisés par la production d'IL-4, d’IL-5
et d’IL-13. Les lymphocytes Th2, en produisant l’IL-4, favorisent la commutation isotypique
en IgE, isotype qui joue un rôle prépondérant dans la dégranulation des mastocytes. Les Th2
aide aussi les lymphocytes B à produire la sous-classe IgG1 chez la souris et son homologue
IgG4 chez l’Homme, sous classes qui ne fixent pas le complément. L’IL-5 est la principale
cytokine responsable de la différenciation, de l’activation et du recrutement des éosinophiles.
Quant à l’IL-13, elle est, comme l’IL-4, importante pour stimuler la croissance et la
différentiation des lymphocytes B en plasmocytes producteurs d’IgE. Mais les lymphocytes
Th2 peuvent aussi être à l’origine de maladies allergiques. En effet, les IgE et les mastocytes
provenant de l’activation de Th2 spécifiques d’allergènes peuvent entraîner des réactions
allergiques et de l’asthme (97-99). Les individus atteints d’atopie sévère ont des taux élevés
d’IgE spécifiques d’allergènes. Chez certains patients, il existe une forte corrélation entre le
taux sérique d’IgE et la fréquence de Th2 spécifique d’allergènes qui peuvent se disséminer
dans le sang périphérique (97).
Les Th17
Récemment, le paradigme Th1/Th2 a été étendu à la suite de la découverte d’une
troisième sous-population effectrice de lymphocytes T CD4 producteur d’IL-17, les Th17
(Figure 7) (100, 101). Cette population joue un rôle dans l’élimination de certains pathogènes
spécifiques qui requièrent une inflammation massive et que les Th1 et Th2 ne peuvent pas
contrôler. Les Th17 sont caractérisés par la production d’IL-17 (IL-17A), d’IL-17F, d’IL-21
et d’IL-22. Chez la souris, les Th17 peuvent aussi produire du TNF-α et de l’IL-6. La
cinétique d’apparition des lymphocytes Th17 sur le site de l’inflammation est rapide. Grâce à
l’induction de nombreuses chimiokines, les lymphocytes Th17 peuvent relier l’immunité
innée et adaptative et attirer d’autres sous-populations T auxiliaires sur le site de
l’inflammation. L’IL-17 et l’IL-17F sont des cytokines pro-inflammatoires. Ces cytokines
32
stimulent les fibroblastes, les macrophages, les cellules endothéliales et les cellules
épithéliales, à produire de multiples médiateurs pro-inflammatoires, comme l’IL-1, l’IL-6, le
TNF-α, l’oxyde nitrique, des métalloprotéases et des chimiokines. Toutes ces molécules
conduisent à l’induction d’une inflammation (102). Ces cytokines sont aussi responsables du
recrutement de neutrophiles, eux-mêmes producteurs d’IL-17 (103). De nombreux modèles
expérimentaux ont permis de montrer l’implication des lymphocytes Th17 et des cytokines
dans des maladies infectieuses, des réactions d’auto-immunité, d’alloréactivté, d’allergie et
des cancers. Des études chez l’Homme suggèrent l’importance des Th17 dans le psoriasis,
l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, la colite, l’asthme ainsi que certaines infections
bactériennes et fongiques (100). Récemment, un rôle protecteur des Th17 a été apporté dans
un modèle de colite (104). En effet, le transfert de cellules CD45RBhigh CD25-CD4+,
provenant de souris IL-17A déficientes, chez des souris RAG-/-, accélère et aggrave la
maladie et cela est associé à une augmentation de la réponse Th1.
b. Les facteurs influençant la différenciation des lymphocytes T CD4
Chaque sous-population est capable de promouvoir son propre développement et
d’inhiber le développement des autres sous-populations via les cytokines qu’elles sécrètent.
L'orientation des réponses immunitaires est donc sous le contrôle d'un équilibre entre les voies
Th1 Th2 et Th17, et un déséquilibre vers l'une de ces voies est donc susceptible d'affecter le
développement de la réponse immunitaire protectrice.
Immédiatement après l’engagement du TCR, de nombreux facteurs influencent la
différenciation vers un lignage Th1, Th2 ou Th17: les cytokines présentes dans
l’environnement (105), la nature et la dose de l'antigène (106), le type de cellules
présentatrices d'antigène (107), et leurs degrés de différenciation ou de maturation (108). Les
facteurs les mieux décrits restent les cytokines présentes dans l’environnement lors du
processus de différenciation.
La différenciation Th1
L’IL-12 a été initialement caractérisée comme une cytokine importante dans la
différenciation Th1 (Figure 7) (109). Par la suite, l’implication d’autres cytokines telles que
l’IFN-γ et l’IL-18 a été mise en évidence (110, 111). L’IL-12 est un hétérodimère composé de
33
deux sous unité, p35 et p40. Cette cytokine est sécrétée par les CPA activées telles que les
macrophages, les monocytes et les DC (109, 112). L’IL-12 se fixe sur son récepteur dont les
deux chaînes IL-12Rß1 et IL1-2Rß2 sont induites par l’activation via le TCR. Cela va induire
l’activation de JAK2 puis Stat4 nécessaire à la différenciation optimale des cellules T naïves
en cellules Th1 productrices d’IFN-γ (95). L’IL-12 joue un rôle central en promouvant la
différenciation des lymphocytes T CD4 naïfs en cellules effectrices Th1 matures. De plus,
l’IL-12 stimule les cellules NK (Natual Killer) et les lymphocytes T CD8 à produire de l’IFNγ. L'IL-4 inhibe l'expression de l'IL-12 par les DC, ainsi que l'expression de la chaîne ß2 du
récepteur à l’IL-12 par les lymphocytes T CD4 (113).
L’IFN-γ est une cytokine pléïotropique qui joue un rôle essentiel à la fois dans la
réponse immunitaire innée et adaptative (95, 110). Même si les NK, les T CD8 et CD4 Th1
sont les sources les plus importantes d’IFN-γ, les macrophages, les cellules dendritiques, les
lymphocytes T CD4 naïfs et les lymphocytes B sont aussi des producteurs de cette cytokine.
L’IFN-γ se fixe sur son récepteur composé de 2 chaîne R1 et R2 et active les Janus kinases
Jak1 et Jak2 qui vont à leur tour activer STAT1. Stat1 induit alors l’expression de T-bet,
facteur de transcription essentiel au développement des Th1 (114), qui va remodeler la
chromatine du gène de l’IFN-γ et permettre sa transactivation (115). Ceci conduit à une
augmentation d’IFN-γ dans l’environnement local créant ainsi une boucle de régulation
positive de la différenciation Th1. T-bet induit aussi l’expression d’IL12-Rß2, permettant à
l’IL-12 produite par les CPA, d’activer STAT4 (116). STAT4 et T-bet induisent l’expression
d’IFN-γ qui renforce alors l’engagement en Th1 via STAT1. En parallèle, T-bet va réprimer
GATA-3, un facteur clé de la différenciation Th2 (117), ainsi que le gène de l’IL-4 (118) et
inhiber ainsi la différenciation Th2. Des données récentes suggèrent que la fonction majeure
de T-bet serait de réguler négativement GATA-3 plutôt que de favoriser la transcription du
gène de l’IFN-γ (119). Les souris invalidées pour le gène T-bet sont incapables de développer
une réponse Th1 après infection par Leishmania major. Les souris déficientes pour l’IFN-γ,
IFN-γR1, IFN-γR2 ou STAT1 ont des réponses immunitaires affaiblies, conduisant à une
augmentation de la susceptibilité à certains pathogènes (120-122). Chez l’Homme, une
mutation dans un des composants de la voie de signalisation de l’IFN-γR est associée à une
immunodéficience profonde face à des bactéries intracellulaires (123, 124). La production de
l'IFN-γ, par les lymphocytes T CD4, peut être également induite par la stimulation du TCR
indépendamment de la voie IL-12/STAT-4, et favorise une réponse Th1 (125).
L’IL-18 sert de co-facteur pour l’induction des Th1 via l’IL12 et pour l’augmentation
de la production d’IFN-γ par les Th1 effecteurs. L’IL-18 est produite essentiellement par les
34
macrophages et les cellules dendritiques. Le récepteur de l’IL-18 est absent sur les cellules T
CD4 naïves et son expression est induite sur les Th1 (111). Même si l’IL-18 n’est pas
essentielle à la différenciation Th1, elle peut faciliter le développement des Th1 induit par
l’IL-12 en optimisant la production d’IFN-γ.
La différenciation Th2
L'IL-4 est la cytokine clé du développement des lymphocytes Th2 comme le montrent
les souris invalidées pour le gène codant pour l'IL-4 ou pour son récepteur : ces souris ne
développent pas de réponse Th2 (Figure 7) (126). Les lymphocytes T CD4 naïfs semblent en
être la source initiale. Même s’ils n’en produisent que de très faibles quantités en comparaison
aux lymphocytes Th2, ils peuvent en produire assez pour initier leur différenciation en Th2
(127). La liaison du TCR des lymphocytes T naïfs conduit à l’augmentation d’expression des
ARNm de l’IL-4 et de GATA-3 (GATA binding protein 3). L'IL-4 peut-être également
produite par les mastocytes (128), les basophiles (129), les éosinophiles (130) et les cellules
NKT (131). Très récemment, il a été montré que les basophiles peuvent fonctionner comme
cellules présentatrices d’antigènes et sont requises pour l’induction de réponse Th2 in vivo en
réponse à des allergènes (132, 133) et à des infections par les helminthes (134). Le récepteur
de l’IL-4 est exprimé par les lymphocytes T naïfs. La fixation de l'IL-4 sur son récepteur
conduit à l'activation du facteur de transcription STAT-6 (135), qui avec NFAT, AP-1 et
NFκB induisent l'expression de l’IL-4 et du facteur de transcription GATA-3, un facteur de
régulation majeur de la différenciation Th2 (136). STAT6, en se fixant sur le promoteur du
gène de l’IL-4, modifie la structure de la chromatine et facilite l’accès du gène aux facteurs de
transcription et augmente ainsi la transcription de l’IL-4. GATA-3, lui, favorise la réponse
Th2 en induisant la transcription de l’IL-5 et de l’IL-13, situé sur le locus Il4. Mais GATA-3
prévient aussi le développement de la réponse Th1 en inhibant l’expression de la chaîne ß du
récepteur à l’IL-12 via STAT-4. Après l’activation T, l’IL-2 est nécessaire pour stabiliser
l’expression du gène de l’Il4 via STAT5, dans les Th2 en développement (137).
La différenciation Th17
En 2006, trois études indépendantes ont montré que la combinaison du TGF-ß et de
l'IL-6 est essentielle pour induire la production d’IL-17 par les T CD4 naïves (Figure 7) (13835
140). Le TGF-ß est une cytokine régulatrice aux fonctions variées dans le développement,
l’homéostasie et la tolérance des lymphocytes T (141). Étant produit par de nombreux
lignages de lymphocytes et par les cellules stromales, il est difficile de déterminer la source de
TGF-ß essentielle au développement des Th17. Mais il semblerait que la production de cette
cytokine par les lymphocytes T eux-mêmes soit importante à la génération des lymphocytes
Th17 (100, 142). Les DC semblent aussi jouer un rôle dans l’augmentation du TGF-ß activé
dans l’environnement local, même si elles ne sont pas la source première de TGF-ß (143).
Comme le TGF-ß, l’IL-6 possède beaucoup de fonctions en dehors du système immunitaire
(144). L’IL-6 est produite par de nombreuses cellules telles que les DC, les monocytes,
macrophages, mastocytes, lymphocytes B et des sous-populations de lymphocytes T activés
mais aussi par les fibroblastes, les cellules endothéliales et kératinocytes. L’interaction entre
l’IL-6 et le TGF-ß dans l’induction du programme transcriptionnel n’est pas entièrement
comprise. L’IL-6 via la signalisation STAT3 semble requise pour la fonction de RORγt
(retinoic-acid-receptor-related orphan receptor-γt), facteur de transcription impliqué dans la
différenciation des Th17 (100, 145). L’induction complète de RORγt n’est terminée qu’en
présence de TGF-ß. Le TGF-ß inhibe la différenciation en Th1 et Th2, et promeut la
différenciation en Th17 et en lymphocytes T régulateurs (Treg) en induisant les facteurs de
transcription RORγt et Foxp3 requis pour respectivement les Th17 et les Treg (139, 146, 147).
En l’absence d’IL-6 Foxp3 inhibe RORγt bloquant ainsi la différenciation Th17. En présence
d’IL-6, STAT3 est activé et inhibe l’expression de Foxp3 (148). L’IL-21 en présence de TGFβ est aussi capable d’induire la différenciation en Th17 via RORγt, même si in vivo il
semblerait que l’IL-6 ait un rôle dominant (149, 150). L’IL-21 produite par les Th17 pourrait
agir de façon autocrine, en amplifiant la fréquence de précurseurs Th17.
Les lymphocytes Th17 ont été mis en évidence par la découverte d’une nouvelle
cytokine l’IL-23. L’IL-23 est un hétérodimère composé de la sous-unité p19 et la sous-unité
p40 partagée par l’IL-12. Les souris déficientes pour la sous-unité p19, contrairement aux
souris déficientes pour la sous-unité p40 de l’IL-12, sont résistantes à l’Encéphalomyélite
Auto-immune Expérimentale (EAE) et leurs cellules sécrètent peu d’IL-17. Une relation forte
entre ces deux cytokines a été établie lorsqu’une étude a montré que l’IL-23 promouvait la
production d’IL-17 par les T activés et que les T amplifiés avec IL-23 étaient capables de
transférer l’EAE et l’arthrite. Mais l’IL-23R n’est pas exprimé par les lymphocytes T naïfs et
après l’identification des facteurs nécessaires à la différenciation des Th17 (TGF-ß, IL-6 et
IL-21), il est devenu clair que l’IL-23 n’était pas impliquée dans la différenciation des Th17.
L’IL-23 pourrait servir à l’expansion et à la stabilisation de la réponse Th17.
36
a
b
perforine
granzyme
lymphocyte T
lymphocyte T
FasL
Fas
Espace extracellulaire
Mannose 6phosphate/insuline-like
growth factor receptor
Pore de
perforine
DISC
Pro-caspase-8
FADD
Caspase-8 active
cellule
cible
cellule
cible
Granzymes
Caspase-8
Bid
Voie mitochondriale de mort cellulaire
(cytochrome-c, APAF1 et caspase-9)
Activation de la voie en aval des
caspases effectrices (caspases 3 et 10)
Substrat de mort
Apoptose
Figure 8. Les voies cytotoxiques de lymphocytes T CD8.
a. La voie cytotoxique Fas/FasL s’active par la liaison du complexe trimérique FasL exprimé
par la cellule effectrice et du complexe trimérique Fas exprimé par la cellule cible. Ceci
conduit à la formation d’un complexe autour du domaine intracytoplasmique de Fas (DISC).
DISC est composée d’une protéine adaptatrice contenant un domaine de mort (FADD) et la
protéine pro-caspase 8. L’autoclivage de la pro-caspase 8 en caspase 8 active conduit à
l’activation de différents effecteurs en aval de caspase 8 (voie des caspase 3 à 10, voie des
mitochondries) conduisant à l’apoptose. b. Les protéines perforine et granzyme sont stockées
dans des granules cytotoxiques dans le cytoplasme de la cellule effectrice. La reconnaissance
de la cellule cible conduit au relargage des protéines stockées dans ces granules. La perforine
monomérique s’insère dans la membrane de la cellule cible et s’agrège pour former un canal.
Ces pores permettent la lyse osmotique de la cellule cible et permettent l’entrée de granzyme
B dans son cytoplasme. Granzyme B induit l’apoptose à travers différentes voies effectrices
dont la voie des caspases. Granzyme B peut également entrer dans la cellule en se liant au
récepteur II du mannose-6-phosphate/insulin like growth factor, et est alors endocyté.
D’après van den Brink MR et al. (151).
37
Il a été montré, très récemment, que l’IL-17 pouvait directement inhiber la
différenciation des Th1 in vitro en inhibant l’expression de T-bet (104). De plus, lorsque les
souris sont invalidées pour le gène de l’IL-17, ces dernières développent une réponse Th1
exacerbée (104, 152).
2.2. Lymphocytes T CD8 effecteurs
La fonction principale des lymphocytes T CD8 est cytolytique, en provoquant la mort
par apoptose de leurs cibles spécifiques. Ces lymphocytes T sont appelés CTL pour "cytotoxic
T lymphocytes". Les lymphocytes T CD8 possèdent plusieurs mécanismes distincts pour tuer
leurs cibles : le système Fas/FasL, et le système perforine/granzyme qui est le plus utilisé par
les CTL (Figure 8) (153). Lorsqu'un CTL est en contact direct avec la cellule cible, qu'il a
reconnue, il relâche les granules de perforine et de granzyme B stockées dans des vésicules
dans le cytoplasme. Les molécules de perforine forment des pores qui d'une part permettent
l'entrée des molécules de granzyme B dans le cytoplasme de la cellule cible, et d'autre part
permettent une lyse osmotique. Les molécules de granzyme B induisent l'apoptose de la
cellule cible par la voie des caspases. L'engagement de Fas et de son ligand FasL, induit un
signal intracellulaire qui provoque l'activation des caspases et induit l'apoptose de la cellule
cible. Les cellules T CD8 participent aux réponses contre les virus, les bactéries à
développement intracellulaire, les tumeurs ou encore les greffes allogéniques ou
xénogéniques. Les lymphocytes T CD8 ont besoin de l'aide des lymphocytes T CD4 pour être
efficacement activés par les CPA, notamment pour promouvoir la différenciation des T CD8
en cellules mémoires (154, 155).
a. La dichotomie Tc1/Tc2
La polarisation des lymphocytes T a été initialement centrée sur les lymphocytes T
CD4, mais il est apparu que les lymphocytes T CD8 étaient aussi capables d’acquérir un
phénotype similaire aux lymphocytes T CD4 (156-159). Les termes Tc1/Tc2 ont été introduits
par le groupe de Mosmann, qui a montré que les lymphocytes T CD8 murins pouvaient se
différencier en lymphocytes producteurs de cytokine de type 1 (IL-2 et IFN-γ) ou de type 2
(IL-4, IL-5, IL-6, et IL-10) (160).
Les lymphocytes T CD8 Tc1 et Tc2 possèdent des profils de production de cytokines
différents. Les lymphocytes Tc1 sécrètent de l'IFN-γ, du TNF-α, et parfois de l'IL-2. Les
38
lymphocytes Tc2 produisent de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-10. Malgré des propriétés générales
similaires entre les Tc1/Tc2 et Th1/Th2, les Tc2 produisent généralement moins d’IL-4 et
peuvent continuer à produire de l’IFN-γ.
L'IFN-γ et l'IL-12 induisent la différenciation en cellules CD8 Tc1, et l'IL-4 entraîne la
différenciation en cellules CD8 Tc2. Une étude réalisée in vitro montre que les cellules Tc1
sont incapables de fournir de l'aide aux lymphocytes B pour produire des immunoglobulines.
Ils sont plus efficaces que les Tc2 pour réguler négativement la production d'IgE (161), pour
éliminer les cellules tumorales (162) et les infections virales pulmonaires (163). Les cellules
CD8 Tc2 interviennent dans l'aide aux lymphocytes B pour la production des
immunoglobulines associées aux réponses de type 2 (164). Chez l'homme, les Tc2 expriment
plus fortement CD40L et sont moins sensibles à l'AICD (Activation Induced Cell death) que
les cellules Tc1 (165). Dans un modèle de diabète auto-immun chez la souris, les cellules Tc1
sont plus efficaces que les lymphocytes Tc2 pour induire la maladie, bien que les deux souspopulations de lymphocytes T CD8 aient des fonctions cytotoxiques équivalentes (166). Cette
différence viendrait d'une expression différentielle des récepteurs aux chimiokines, apportant
des capacités migratoires au niveau de l'organe cible. Les cellules CD8 Tc1 expriment
préférentiellement CCR5, alors que les cellules Tc2 expriment CCR4, CCR7.
b. Les Tc17
Des lymphocytes T CD8 producteurs d’IL-17 (Tc17) ont aussi été décrits. En effet,
même s’ils sont présents en moindre quantité que les Th17, les Tc17 ont été trouvés dans les
muqueuses pulmonaires et digestives (167). De même, de nombreux Tc17 possèdent une
activité anti-tumorale (168) et ont été retrouvés chez des souris porteuses de tumeurs (169).
Dans un modèle d’hypersensibilité de contact, la sensibilisation par un allergène induit des
lymphocytes T producteur d’IFN-γ et d’IL-17 (170). Ces cellules existent aussi chez
l’Homme. En effet, des Tc17 sont retrouvés parmi les lymphocytes T infiltrants les lésions de
la sclérose en plaque (171) et parmi les cellules mémoires d’individus sains (172). De plus,
des Tc17 peuvent être obtenus in vitro, à partir de cellules naïves humaines en présence d’IL1, d’IL-6, d’IL-23 et de TGF-ß (172). Très récemment, Huber M et al. ont montré que ces
cellules étaient aussi présentes dans un modèle d’EAE chez la souris (173). Caruso et al. ont
montré que les T CD8 de la muqueuse gastrique d’individus infectés par Helicobacter pylori
produisaient de l’IL-17 (174). L’ensemble de ces résultats suggèrent que les Tc17 jouent un
39
rôle dans diverses pathologies. Ces cellules n’expriment pas la perforine, ni le granzyme B
chez la souris et possèdent une faible activité cytotoxique (168, 173, 175, 176).
De même que pour les Th17, l’IL-6 semble importante pour l’induction des Tc17,
responsables de colites chez la souris (177). Le TGF-β et l’IL-6 peuvent stimuler les TCD8 à
se différencier en cellules non cytotoxiques productrices d’IL-17 (178). L’IL-21 semble aussi
nécessaire à la différenciation des Tc17 (176). Ces cellules expriment les facteurs de
transcription RORγt mais pas T-bet et GATA-3 (176). Le développement des Tc17 semble
être également dépendant de l’IL-23 et de STAT3 (173-175, 179).
2.3. Les lymphocytes T mémoires
Après une première rencontre avec l'antigène, les cellules T naïves prolifèrent et
acquièrent des fonctions effectrices. Dès que l'infection est contrôlée, la majorité des
lymphocytes ayant participé à la réponse immune primaire, meurent, tandis qu'une petite
population cellulaire est maintenue pour former le compartiment des cellules T mémoires. La
mémoire immunologique résulte de l'expansion clonale et de la différenciation de
lymphocytes spécifiques d'antigène qui s'accumulent et persistent toute la vie. Les cellules
mémoires confèrent une protection immédiate dans les tissus périphériques et sont
responsables de la réponse secondaire rapide et intense aux antigènes, dans les organes
lymphoïdes secondaires. Cette fonction de mémoire est portée par deux types cellulaires
distincts (180). La mémoire protectrice est exercée par des cellules T effectrices mémoires
(TEM) qui migrent dans les tissus périphériques enflammés et exercent une fonction effectrice
immédiate. Tandis que la mémoire réactive est portée par les cellules T centrales mémoires
(TCM) qui migrent vers les organes lymphoïdes secondaires, et ont peu ou pas de fonction
effectrice.
a. Phénotype et propriétés fonctionnelles des TCM et des TEM
Chez l’Homme, les cellules mémoires sont caractérisées par l'expression de CD45R0
et une absence d'expression de CD45RA. Ces cellules ont un faible seuil d'activation,
permettant de répondre rapidement et intensément lors d’une réponse secondaire. Les cellules
TCM et TEM sont définies selon la présence ou l'absence de fonctions effectrices immédiates, et
selon l'expression de récepteurs dits de « homing » qui permettent aux cellules de migrer dans
40
Naïf
TCM
TEM
TEMRA
Lymphocytes
T CD4
CD45RA+
CD45ROCD62Lhi
CCR7+
Lymphocytes
T CD8
Naïf
CD45RA+
CD45ROCD62Lhi
CCR7+
CD45RACD45RO+
CD62Lhi
CCR7+
TCM
CD45RACD45RO+
CD62Lhi
CCR7+
CD45RACD45RO+
CD62Lhi/lo
CCR7-
TEM
CD45RACD45RO+
CD62Llo
CCR7-
CD45RA+
CD45RO+
CD62Lhi/lo
CCR7-
TEMRA
CD45RA+
CD45RO+
CD62Llo
CCR7-
Figure 9. Sous-populations de lymphocytes T mémoires.
Chez l’Homme, plusieurs sous-populations de lymphocytes T CD4 et CD8 ont été
caractérisées sur la base de leur expression de CD45, CD62L et CCR7. Les cellules mémoires
T CD4 et CD8 contiennent trois sous-populations : les cellules central mémoires (TCM), les
cellules effectrices mémoires (TEM) et les cellules TEM qui exprime CD45RA (TEMRA).
Adaptée de Seder, RA et al. (181).
41
les organes lymphoïdes secondaires ou vers les tissus non lymphoïdes (Figure 9) (180).
•
Les TCM sont des cellules mémoires qui expriment constitutivement CCR7 et CD62L,
deux récepteurs qui sont également caractéristiques des cellules T naïves, et qui sont
nécessaires à la migration vers les zones T des organes lymphoïdes secondaires (182), (Figure
9). Comparées aux cellules naïves, les TCM ont une plus haute sensibilité aux stimulations
antigéniques, sont moins dépendants des molécules de costimulation, et expriment CD40L de
façon plus importante. Ceci permet une stimulation plus efficace des cellules dendritiques et
des lymphocytes B. Après l'engagement du TCR, les TCM produisent principalement de l'IL-2,
mais après prolifération, ils se différencient efficacement en cellules effectrices et produisent
de grandes quantités d'IFN-γ ou d'IL-4. Les TCM sont hétérogènes dans leur capacité à se
différencier. Il a été montré que des TCM pouvaient se différencier en cellules Th1 ou Th2
après stimulation en présence d'IL-12 ou d'IL-4. Par contre, dans des conditions neutres,
certaines cellules peuvent se multiplier sans acquérir de fonction effectrice, alors que d'autres
cellules, représentant des pré-Th1 et pré-Th2, peuvent se
différencier spontanément en cellules productrices d'IFN-γ ou d'IL-4.
•
Les TEM sont des cellules qui ont perdu l'expression constitutive de CCR7 et sont
hétérogènes pour l'expression de CD62L (Figure 9). Ils présentent un ensemble caractéristique
de récepteurs aux chimiokines et des molécules d'adhésion qui sont nécessaires pour leur
migration dans les tissus enflammés. Les TEM sont caractérisés par une fonction effectrice
rapide. Les CD8 TEM contiennent de grandes quantités de perforine, et les CD4 comme les
CD8, produisent de l'IFN-γ, de l'IL-4 et de l'IL-5 dans les heures qui suivent la stimulation
antigénique. Les TEM, qui sont exclus des organes lymphoïdes secondaires, peuvent être
stimulés par des antigènes présentés par des CPA non professionnelles. Quelques CD8 TEM,
chez l'homme, expriment CD45RA et sont désignés sous le nom de TEMRA. La fonction de ces
cellules TEMRA est encore mal définie. Les TEMRA apparaissent tardivement lors de la réponse
immune. La population des TEM contient les lymphocytes T CD4 Th1, Th2, Th17 et les CTL
(183). Ces polarisations ne sont pas figées. Dans des conditions neutres, les TEM conservent
leur phénotype Th1 ou Th2. Par contre sous des conditions polarisantes, la plupart des TEM
Th1 ou Th2 acquièrent la capacité de produire à la fois les cytokines de type 1 et de type 2.
La proportion des TEM et TCM dans le sang est différente selon les lymphocytes T CD4
et T CD8 : les TCM sont prédominants dans les lymphocytes T CD4 et les TEM dans les
lymphocytes T CD8. De plus, la distribution des TCM et TEM dans les tissus est caractéristique :
les nœuds lymphatiques sont enrichis en TCM alors que les poumons, le foie et les intestins
42
Compartiment T CD4
Compartiment T CD8
Figure 10. Hétérogénéité phénotypique des lymphocytes T mémoires humains.
Le compartiment des cellules T CD4 et CD8 mémoires et hétérogènes et peu être défini selon
différents marqueurs. La proportion de chaque marqueur sur les cellules mémoires est donnée
à titre indicatif et correspond à un donneur sain adulte. Mais il existe une très grande
variabilité interindividuelle.
D’après Sallusto, F et al. (180).
43
contiennent une plus forte proportion de TEM (180). Cependant la proportion relative de ces
populations peut varier selon le type d’infection. La présence de sous-populations de cellules
mémoires avec des propriétés migratoires distinctes a aussi été décrite chez la souris.
Les TCM et les TEM sont hétérogènes et contiennent des sous-populations de
lymphocytes T mémoires pouvant être identifiées selon l'expression combinée de différentes
molécules de surface (Figure 10) (180). Les molécules CD27 et CD28, exprimés sur les
cellules naïves sont aussi exprimées sur certaines cellules mémoires. Le compartiment des
TEM peut être aussi sous divisé selon l'expression de récepteurs de chimiokines
caractéristiques des cellules Th1 et Th2. Ainsi dans le compartiment TEM, CCR5 et CXCR6
identifient les cellules Th1 et CTL alors que CCR3 et CRTh2 identifient les Th2. CXCR3 et
CCR4 sont exprimés respectivement par les lymphocytes Th1 et Th2, mais peuvent aussi être
exprimés par des sous-populations TCM distinctes. Même si certaines sous-populations de TCM
et TEM, fonctionnellement différentes, peuvent être mises en évidence à l’aide de différents
marqueurs, il faut noter que l’expression de certains de ces marqueurs est rapide et transitoire
après activation cellulaire.
b. La génération et le maintien des TCM et des TEM
Différents modèles ont été proposés pour expliquer le développement des souspopulations de cellules T mémoires. Le groupe de Lanzavecchia a suggéré que la
différenciation des cellules T mémoire repose sur le modèle de l'intensité du signal de la
stimulation antigénique (Figure 11) (180). Au début de la réponse immune, un grand nombre
de DC matures présente une forte densité d'antigène et sécrète une grande quantité de
cytokines polarisantes. Ces conditions induiraient une prolifération massive de cellules naïves
spécifiques de l'antigène qui se différencient en cellules effectrices, dont certaines persisteront
comme TEM. À des moments plus tardifs de la réponse immune, les conditions de stimulations
changent avec le recrutement d'un petit nombre de DC qui présente une faible densité
d'antigènes et qui a épuisé sa capacité à produire des cytokines. Ces conditions conduiraient à
l'expansion de cellules non effectrices qui vont donner naissance aux TCM. Suivant ce modèle,
les précurseurs des TEM seraient générés à des temps précoces alors que ceux des TCM seraient
générés à des temps tardifs de la réponse immunitaire (184). Ce modèle est en accord avec
l’observation que les cellules mémoires ne sont pas présentes au pic de la réponse
44
Figure 11. Modèle de la génération des lymphocytes T mémoires selon l’intensité du
signal de la stimulation antigénique.
Selon ce modèle, l’intensité du signal délivré par le TCR détermine le devenir de la cellule
naïve. La durée et l’intensité de la stimulation antigénique sont indiquées par la longueur et
l’épaisseur de la flèche pleine. Au début de la réponse immune les conditions de forte
stimulation induisent une prolifération massive de cellules naïves spécifiques de l’antigène
qui se différencient en cellules effectrices, dont certaines persisteront comme TEM. À des
moments plus tardifs de la réponse immune, les conditions de stimulation plus faibles
conduisent à l’expansion de cellules non effectrices qui vont donner naissance au TCM. Les
TCM peuvent se différencier en TEM après stimulation antigénique ou en réponse aux cytokines
homéostatiques.
D’aprés Sallusto F et al. (180).
45
immunitaire mais apparaissent progressivement pendant la phase de contraction (185). Dans
un modèle murin d’infection par le LCMV (Lymphocytic Choriomeningitis Virus), il a été
montré que les TEM étaient présents de façon transitoire et qu’après transfert, ils étaient tous
convertis en TCM en réexprimant CCR7 et CD62L (186). Ces résultats suggèrent un modèle de
différenciation linéaire en T mémoire : T naïf -> T effecteur-> TEM -> TCM -> TEMRA (181). Ces
résultats sont en apparente contradiction avec la persistance et la stabilité des TCM et TEM chez
l’Homme (187) et avec le fait que les TEM ne peuvent pas réexprimés CCR7 in vitro (188).
Ceci suggère une différence entre les espèces ou encore une différence due au type d’infection
(aiguë ou chronique). Ces données sont en accord avec les résultats de Willinger et al. qui
proposent le modèle suivant : TCM -> TEM -> TEMRA. (189)
La prolifération des cellules T mémoires peut être dirigée non seulement par la
stimulation antigénique, mais aussi par les cytokines. Ainsi, sous des conditions d'état stable,
les cellules T mémoires se renouvellent lentement en absence d'antigène (180). In vivo, des
études ont montré que l'IL-7 et l'IL-15, qui sont constitutivement produites par une variété de
cellule, jouent un rôle essentiel dans le maintien des CD4 et CD8 mémoires (190).
II.
LA RÉPONSE IMMUNE PATHOLOGIQUE: AUTO-IMMUNITÉ
Le système immunitaire est constitué d'un ensemble des moyens biologiques
permettant à un organisme, d'une part, de reconnaître et de tolérer ce qui lui appartient (le
soi), et d'autre part de reconnaître et de rejeter tout ce qui lui est anormal ou étranger (le non
soi) : les molécules étrangères, les agents infectieux, mais aussi ses constituants altérés
comme les cellules tumorales. Le système immunitaire assure ainsi l'intégrité des cellules et
des tissus qui le constituent. Cette fonction principalement gérée par les lymphocytes T
implique une capacité de distinction entre les molécules du "soi" et les molécules du "non
soi". Mais lorsque la moindre défaillance a lieu, ces lymphocytes peuvent alors devenir
pathogènes et attaquer les tissus du soi : il s’agit de l’auto-immunité.
Les maladies auto-immunes sont dues à des failles de la balance entre réponse
autoréactive et autorégulation du système immunitaire. Une telle dysrégulation va conduire à
une attaque des tissus du soi, via la réponse anticorps ou médiée par les lymphocytes T. La
prévalence globale des maladies auto-immunes (5% de la population dans les pays
occidentaux), bien que certaines d'entre elles soient très rares, fait de ce groupe de maladies
un problème de Santé Publique, au même titre que les maladies cardiovasculaires et
cancéreuses. De plus, la mortalité associée à ces maladies est très élevée et la fréquence de ces
46
Précurseurs
hématopoïétiques
Sélection positive du
repertoire T
Sélection négative des
lymphocytes T
autoréactifs
Thymus
Périphérie
Une fraction de lymphocytes
T autoréactifs échappent à la
délétion
Mécanismes passifs de
tolérance :
• Ignorance
• Anergie
• Déviation phénotypique
• Apoptose
Mécanismes actifs de tolérance :
• Cellules dendritiques
tolérogènes
• Lymphocytes T régulateurs
Figure 12. Les voies de la tolérance.
Les précurseurs hématopoïétiques migrent vers le thymus où ils vont subir la sélection
positive et négative sur la base de l’interaction entre leur TCR et les complexe peptide/CMH.
Certains lymphocytes T autoréactifs sont éliminés à ce stade, mais vont échapper à la
sélection négative et aller en périphérie où ils seront contrôlés par les mécanismes de
tolérance périphérique.
D’après Walker LSK, et al. (191).
47
maladies n’a cessé d’augmenter depuis ces 30 dernières années. Les maladies auto-immunes
les plus fréquentes sont la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de graves, le diabète de type 1,
l’anémie de Biermer, le lupus érythémateux disséminé et la sclérose en plaques. À elles
seules, ces six pathologies représentent 50% de toutes les maladies auto-immunes. Ces
maladies peuvent être schématiquement divisées en maladies auto-immunes spécifiques
d'organes ou de tissus (comme les thyroïdites auto-immunes, diabète de type 1 et la
myasthénie) et en maladies auto-immunes non spécifiques d'organes encore appelées maladies
systémiques comme le lupus érythémateux aigu disséminé, la polyarthrite rhumatoïde et les
vascularites à ANCA (Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies). Une meilleure
compréhension de leur physiopathologie a permis des progrès considérables dans la
thérapeutique des plus graves d'entre elles. Bien que les lymphocytes B y jouent aussi un rôle
important, ce chapitre décrira essentiellement l’implication des lymphocytes T dans le
développement des maladies auto-immunes.
1. Tolérance immunologique
La tolérance au soi dans le répertoire T est exercée à différents niveaux. Tout d’abord,
le développement et la sélection de lymphocytes T dans le thymus préviennent fortement le
développement d’un répertoire T naïf autoréactif : c’est la tolérance centrale (Figure 12).
Ensuite, les lymphocytes T matures vont subir une seconde sélection en périphérie, c’est la
tolérance périphérique. Cette dernière a lieu sous deux formes : la tolérance dite passive
(délétion, anergie, déviation phénotypique) et la tolérance dite dominante qui met en jeu les
lymphocytes T régulateurs (Treg).
1.1. Tolérance centrale
Les lymphocytes T se développent dans le thymus à partir de précurseurs provenant de
la moelle osseuse. Le réarrangement des gènes de leur TCR se produit lors de ce
développement conduisant à l’établissement d’un large répertoire T. La sélection positive
permet de conserver les thymocytes capables de reconnaître via leur TCR un peptide associé à
une molécule du CMH du soi (192). Au cours de ce processus, les cellules épithéliales du
cortex thymique présentent aux cellules T des complexes CMH/peptide, et fournissent un
signal de survie aux cellules capables d’interagir avec les molécules du CMH du soi. Les
48
cellules T qui reconnaissent les molécules du CMH du soi de manière trop faible meurent par
apoptose dans le cortex. Lors de cette étape, plus de 90% des thymocytes sont éliminés. Le
répertoire T va ensuite subir différents mécanismes de tolérance.
La première forme de tolérance mise en œuvre est dite centrale car elle est induite
dans le thymus. Il s’agit de la sélection négative qui entraîne l’élimination de plus de la moitié
des thymocytes sélectionnés positivement (193). En effet, la sélection positive enrichit le
compartiment lymphocytaire T en cellules ayant une forte affinité pour les antigènes du soi :
potentiellement autoréactives, elles représenteraient une menace pour l’organisme si elles
s’activaient en périphérie. L’ensemble des mécanismes concourant à préserver l’organisme
d’un excès de réponse immune et de l’attaque de ses composants constitue la tolérance.
L’existence d’une tolérance centrale des thymocytes, restreinte par le CMH, a été mise en
évidence il y a plus de 20 ans, par Matzinger et Rammensee (194, 195). Les thymocytes dont
le TCR reconnaît des ligands CMH/peptide du soi avec une certaine affinité sont éliminés
(délétion clonale) (196) ou inactivés (anergie) (197). La délétion clonale serait induite par les
DC colonisant la medulla alors que les cellules de l’épithélium médullaire seraient
responsables de l’anergie (198). Ce dogme a cependant été remis en cause par différents
groupes. Il a notamment été montré que l’épithélium médullaire était susceptible d’induire la
délétion partielle des thymocytes spécifiques de superantigènes (199) ou d’antigènes
tissulaires (200).
L’impact crucial de la medulla sur la sélection négative s’explique par une propriété
exclusive aux cellules épithéliales thymiques médullaires (mTEC), qui est la capacité de
présenter des antigènes de façon ectopique. Les mTEC ont effectivement été identifiées
comme des CPA spécialisées dans la transcription de gènes normalement exprimés dans les
tissus périphériques, comme l’insuline, la thyroglobuline, la MBP (Myelin Basic Protein),
…(201, 202). Le facteur de transcription AIRE (auto-immune regulator) exprimé par les
mTEC semble être requis pour cette expression ectopique d’antigènes périphériques (203). De
l’absence d’AIRE découle l’échappement de thymocytes auto-spécifiques à la délétion
clonale (204). La déficience en facteur AIRE conduit chez l’Homme à un syndrome autoimmun polyendocrinien appelé APECED (auto-immune polyendocrinopathy-candidiasisectodermal dystrophy) (205). En outre, l’implication d’une déficience dans l’expression
ectopique d’un antigène a été démontrée dans de très nombreuses pathologies auto-immunes
(206). Des souris déficientes pour AIRE ont alors été générées. Elles développent
spontanément des maladies auto-immunes très proches du syndrome humain (207).
Cependant, il a été estimé que le nombre de mTEC exprimant un type d’antigène spécifique
d’organes était très faible : 50 à 500 mTEC par thymus chez la souris et de l’ordre du millier
49
a. Ignorance
b. Anergie
c. Déviation phénotypique
d. Apoptose
Cellule T anergique
Cellule T activées
avec un phénoytpe
cytkine/chimiokine-recepteur
non pathogène
Cellule T apoptotique
LT
LT
LT
CPA
CPA
CPA
LT
CPA
Figure 13. Mécanismes passifs de la tolérance périphérique passive des lymphocytes T.
a. Les lymphocytes T (LT) autoréactifs ne rencontreront peut-être jamais la protéine du soi
pour laquelle ils sont spécifiques et resteront donc dans un état d’ignorance. b. La rencontre
de l’antigène avec la protéine du soi peut induire l’anergie du lymphocyte T, en impliquant
probablement l’interaction entre les molécules CTLA-4 ou PD-1 du lymphocyte T avec leur
ligand (CD80/CD86, PDL1/2). c. L’interaction du lymphocyte T avec la protéine du soi peut
entraîner l’activation complète du lymphocyte T, mais peut développer un phénotype non
pathogène en termes de production de cytokines et de récepteurs aux chimiokines qu’il
exprime. Dans ce cas, les lymphocytes T autoréactifs s’activent mais n’induisent pas de
dommages tissulaires. d. Les lymphocytes T autoréactifs peuvent être éliminés suite à
l’interaction avec la protéine du soi par l’AICD (Activation Induced Cell Death) impliquant
l’augmentation d’expression de FasL et la signalisation qui découle de son interaction avec le
récepteur de mort Fas.
D’après Walker LSK et al. (191).
50
chez l’homme (208). Ceci implique qu’un thymocyte devra scanner l’ensemble de ces mTEC
pour avoir une vision globale du répertoire des peptides du soi. Pour faciliter cette tâche et
accroître l’efficacité de présentation de ces antigènes, les mTEC semblent collaborer avec les
DC. En effet, il a été montré que les DC présentent les antigènes spécifiques de tissus capturés
à partir des mTEC, induisant à leur tour la délétion des thymocytes autoréactifs (200).
1.2. Tolérance périphérique
La présentation d’une vaste variété d’antigènes du soi permet donc de sélectionner
négativement les lymphocytes T auto-spécifiques. Cependant, tous les antigènes tissulaires ne
sont pas exprimés dans le thymus , ou sont exprimés à des niveaux insuffisants pour induire la
délétion de l’ensemble des cellules auto-spécifiques. Il en résulte la sortie de lymphocytes T
matures auto-spécifiques, du thymus, et donc potentiellement autoréactifs (209, 210).
Différents mécanismes de tolérance périphérique, mutuellement non exclusifs, permettent
alors de neutraliser ces lymphocytes en périphérie, protégeant ainsi l’organisme des maladies
auto-immunes (Figure 13).
a. Tolérance périphérique passive
L’ignorance : Plusieurs mécanismes peuvent être responsables de ce phénomène d’ignorance.
Chez l’adulte, l’ignorance réside principalement dans la séquestration des antigènes dans des
sites dits "privilégiés", non accessibles aux cellules T autoréactives, tels que l’oeil ou les
testicules (211). De plus, les molécules de CMH de classe I sont absentes ou faiblement
exprimées à la surface des neurones et des cellules oculaires permettant une protection de ces
cellules vis-à-vis des lymphocytes T CD8 cytotoxiques. L’ignorance peut aussi être due à une
trop faible expression des antigènes, qui ne permet pas l’activation des lymphocytes T. Bien
qu’elle permette l’absence de développement de maladie auto-immune à court terme,
l’ignorance n’est pas un mécanisme suffisant de tolérance. En effet, il contribue à la
persistance physique de lymphocytes T autoréactifs fonctionnels en périphérie. Ce
phénomène peut donc être dangereux pour l’organisme. Par exemple, des signaux
stimulateurs induits lors d’infection virale peuvent conduire à la levée de l’ignorance
conduisant alors au développement de maladies auto-immunes (212, 213).
51
L’anergie : L’anergie est un état d’inactivation fonctionnelle de la cellule T, qui devient
réfractaire à toute re-stimulation par l’antigène (214). Elle peut être induite in vitro par une
forte stimulation des cellules T via leur TCR en l’absence de second signal de costimulation.
L’état anergique se caractérise par une incapacité des cellules T à proliférer et à produire de
l’IL-2, et il peut être levé par l’addition d’IL-2 (17). Bien que la simple absence de
costimulation suffise à induire l’anergie in vitro, l’engagement de CTLA-4 semble être
nécessaire pour permettre l’anergie des lymphocytes T naïfs in vivo. En effet, le blocage de
CD80 et CD86 inhibe l’induction de tolérance et le blocage de CTLA-4 perturbe l’induction
d’anergie (215). La molécule PD-1, fortement exprimée sur les cellules anergiques, a
également été reconnue pour son implication dans l’induction d’anergie (216). Des souris
déficientes pour cette molécule développent différents syndromes auto-immuns. Il a été
suggéré que PD-1 fonctionnerait en inhibant la sécrétion de cytokines ou en induisant l’arrêt
du cycle cellulaire. Il a aussi été décrit que de faibles stimulations pouvait aussi engendrer un
état d’anergie mais uniquement sur des cellules T mémoires (217). Ces cellules anergiques
peuvent jouer un rôle immunosuppresseur en inhibant la prolifération de cellules T naïves
(tolérance infectieuse) (218) ou en inhibant la capacité des DC à stimuler des lymphocytes T
naïfs (219).
La délétion : La façon la plus directe et sans doute la plus efficace de prévenir l’autoimmunité est l’élimination physique des lymphocytes T autoréactifs (ou délétion) nommée
AICD, et fait intervenir principalement le système Fas/FasL. L’importance de cette voie est
soulignée chez des souris déficientes pour l’expression de Fas ou de FasL, dont le défaut
conduit à une maladie auto-immune proche du lupus érythémateux (220, 221). De même chez
l’Homme, un défaut dans la signalisation induite par Fas est à l’origine d’un syndrome
lymphoprolifératif auto-immun important (ALPS) (222). L’apoptose en périphérie n’est pas
exclusivement dépendante de Fas. D’autres mécanisme peuvent être mis en jeu comme le
récepteur au TNF qui joue un rôle identique à Fas (223).
Déviation phénotypique: La déviation phénotypique et fonctionnelle est basée sur
l’orientation vers une réponse immune peu agressive, inadaptée ou favorable aux cellules qui
la promeuvent. La déviation immune est le processus selon lequel un tissu manipule la
réponse immunitaire pour se préserver des lésions inflammatoires, ce qui aboutit à privilégier
la fonction humorale et inhiber l’inflammation et la cytotoxicité. D’autre part, la diversion
phénotypique est l’orientation, notamment par la sécrétion de cytokines, vers une réponse qui
bien qu’effectrice est non pathogène ou inadaptée. Ainsi, la mise en place d’une réponse Th2
52
peut s’avérer protectrice contre les pathologies de type I, et vice-versa (224). L’illustration en
est donnée par l’étude des rats LEW et BN, dont la réponse immune est génétiquement
orientée (225). Le premier, qui développe préférentiellement une réponse de type I, n’est pas
susceptible aux désordres de type allergique et aux infections parasitaires, tandis que le
second, dont la réponse est orientée Th2, est résistant à l’induction de l’EAE. Cette diversion
de la réponse est couramment utilisée comme mécanisme d’échappement par les cellules
tumorales et les agents infectieux qui favorisent une réponse inadaptée à leur élimination
(226).
b. Tolérance périphérique dominante
Contrairement aux autres mécanismes de tolérance périphérique passive, il s’agit d’un
processus actif dans lequel une population de cellules contrôle ou régule l’activité d’une autre
population. À l’heure actuelle, différentes populations de lymphocytes T ont été identifiées
comme dotées de capacités régulatrices leur permettant de contrôler les réponses immunitaires
normale et pathologique. Ces cellules jouent un rôle indiscutable dans la tolérance
périphérique, notamment en prévenant le développement de maladies auto-immunes. Ces
cellules T régulatrices sont classées selon deux catégories : les cellules induites dans des
conditions de stimulations particulières et les cellules T régulatrices naturellement présentes
dans l’organisme. Parmi les lymphocytes T induit figurent les Tr1 et les Th3. Les cellules Tr1
ont été décrites par le groupe de Roncarolo qui a montré que des cellules T CD4+ murines
activées en présence d’IL-10 se différencient en cellules régulatrices produisant de forts taux
d’IL-10, capables d’inhiber la colite auto-immune (227). Les Th3 sont des cellules qui ont été
identifiées initialement chez la souris, où l’administration orale de MBP les protégeait du
développement de l’EAE (228), puis chez l’Homme (229). Elles sont caractérisées par leur
forte production de TGF-ß.
Les principales cellules régulatrices naturelles décrites sont des lymphocytes T CD4+,
mais des cellules régulatrices ont également été décrites dans la population T CD8+ et dans
d’autres types cellulaires, comme les cellules NKT (230, 231) et les cellules T γδ (232, 233).
De plus, les cellules dendritiques sont fortement impliquées dans la tolérance et dans
l’induction des cellules régulatrices (234, 235).
53
% parmi les lymphocyte T CD4+
0
20
40
60
80
100
CD5high
CD45RBlow
GITRhigh
CTLA-4+
CD25+
Foxp3+
CD25+
CD127-
Figure 14. Marqueurs des lymphocytes T CD4 régulateurs naturels.
Le marqueur le plus spécifique et le plus fiable des lymphocytes T régulateurs naturels CD4+
est le facteur de transcription Foxp3, qui est exprimé par la majorité des cellules T CD4+
CD25+ et par une partie des lymphocytes T CD4+ CD25-. Les lymphocytes T CD4
CD45RBhigh, GITRhigh ou CTLA-4+ contiennent la population cellulaire Foxp3+ chez les
souris naïves. Mais Foxp3 étant un marqueur intracellulaire, son utilisation reste limitée. Le
marqueur membranaire CD127 couplé au CD25 (CD127low/CD25High) permet une meilleure
discrimination des cellules régulatrices.
D’après Sakaguchi et al. (236).
54
c.
Les lymphocytes T CD4 régulateurs
Au début des années 70, le concept de lymphocytes T régulateurs (Treg), capables
d’inhiber une réponse immunitaire, est apparu. Le groupe de Gershon et Kondo a, en effet,
montré que certains lymphocytes T, qu’il nomme lymphocytes T suppresseurs, différents des
lymphocytes "helpers", pouvaient diminuer l’intensité de la réponse immune (237). Dès 1969,
Nishizuka et al. montrent que la thyméctomie néonatale chez la souris induit le
développement de manifestations auto-immunes spécifiques d’organes qui peuvent être
prévenues par le transfert de cellules spléniques de souris normales adultes (238). Cependant,
l’incapacité à identifier un marqueur de surface pour ces cellules ou des médiateurs solubles
associés à leur fonction a conduit à l’essoufflement des recherches dans ce domaine, et à la
contestation de l’existence des cellules T suppressives (Figure 14). Ce n’est qu’en 1982 puis
1985 que Sakaguchi et al. ont amené de nouvelles évidences dans la caractérisation des
lymphocytes T suppresseurs en montrant que les cellules responsables pouvaient être
restreintes au marqueur CD5high (ou Lyt-1high) (239, 240). Puis les recherches toujours plus
précises ont conduit à la découverte de nombreux marqueurs. Tout d’abord, Powrie et al. ont
montré que l’injection de la sous-population T CD4 CD45RChigh à des rats congéniques
athymiques induit le développement de pathologies auto-immunes multi-organes (59-61,
241). Au contraire, le transfert de cellules T CD4 CD45RClow ne conduit à aucune maladie et
le co-transfert de ces cellules avec les T CD4 CD45RChigh prévient le développement de la
maladie multi-organes. Ainsi, la population lymphocytaire T CD4 CD45RClow contient des
cellules capables de contrôler diverses manifestations auto-immunes. Des résultats similaires
ont été décrits chez la souris où les cellules T CD4 séparées sur la base de l’expression
différentielle de CD45RB induisent ou contrôlent une maladie intestinale sévère
(Inflammatory Bowel Disease) (242, 243).
Dans le milieu des années 90, les travaux de Sakaguchi et de ses collaborateurs ont
donné un regain d’intérêt au concept de lymphocytes T régulateurs. Ils ont décrit pour la
première fois le phénotype d’une population de cellules T CD4+ suppressives, définies par
l’expression de la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25), cruciales pour le contrôle des
cellules T in vivo (244, 245). De nombreux autres marqueurs de surface ont été proposés pour
mieux définir les Treg tels que GITR, CTLA-4, CD62L, CD27. Mais l’expression de ces
marqueurs est également modifiée après activation rendant alors impossible la distinction
entre les Treg et les lymphocytes T conventionnels. Récemment, il a été montré que
55
a. Cytokines inhibitrices
b. Cytolyse
TGF-ß
membranaire
Granzyme A ou B
Pore de perforine
Lymphocyte
Treg
Cellule effectrice
c. Perturbation métabolique
Cellule effectrice
apoptotique
d. Mécanismes mettant en jeu
les cellules dendritiques
Mort due à la
déprivation en
cytokines
A travers les
jonctions gap
Inhibition de la maturation
et de la fonction des DC
Figure 15. Mécanismes suppresseurs majeurs des lymphocytes T régulateurs.
Description des différents mécanismes suppresseurs de lymphocytes T régulateurs centrés sur
quatre modèles d’actions. a. Les lymphocytes T régulateurs peuvent sécréter des cytokines
suppressives (IL-10, IL-35 et TGF-ß) qui peuvent inhiber les fonctions des cellules T
répondeuses. b. Les cellules Treg activées peuvent agir comme cellules cytotoxiques et tuer
les cellules effectrices notamment via la voie perforine/granzymes. c. Les lymphocytes Treg
expriment avec une forte proportion la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25) et ont la
capacité d’entrer en compétition avec les lymphocytes T effecteurs. Cette privation en
cytokines va entraîner à l’apoptose de la cellule cible. Les Treg peuvent aussi inhiber les
lymphocytes T effecteurs par la production d’adénosine qui va se fixer à son récepteur
(A2AR). d. Les lymphocytes Treg peuvent exprimer à leur surface des molécules telles que
CTLA-4 et LAG-3 qui peuvent interagir avec les DC et inhiber leur maturation et leur
fonction. Ces molécules peuvent aussi entraîner la production d’une molécule
immunosuppressive, l’indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) par les DC.
D’après Vignali, DAA et al. (246).
56
l’utilisation de CD127 (chaîne alpha du récepteur à l’IL-7) couplé au marqueur CD25
(CD127low/CD25High) permet une meilleure discrimination des cellules régulatrices par rapport
aux cellules activées (247, 248). Un autre grand pas a été franchi dans l’identification des
Treg avec la découverte du facteur de transcription Foxp3 (forkhead box P3) (249-251).
Foxp3, un nouveau membre de la famille des régulateurs transcriptionnels forkhead/winged
helix, a été identifié comme un facteur de transcription majeur pour le contrôle du
développement et de la fonction des cellules Treg. En effet, l’expression ectopique de Foxp3
dans des cellules CD4+CD25- leur confère un phénotype et une activité de cellules
suppressives (249-251). Les souches de souris Scurfy possèdent une mutation invalidant le
gène Foxp3. Les souris mâles portant cette mutation (sur le chromosome X) développent une
hyperactivation des lymphocytes T avec une surproduction de cytokines pro-inflammatoires
et meurent dans les 1 mois après la naissance (252). Les individus exprimant une protéine
Foxp3 mutée développent un syndrome IPEX (Immunedysregulation Polyendocrinopathy
Enteropathy X linked ) associé à une immunodéficience associée à une maladie auto-immune
dans plusieurs organes endocriniens (comme un diabète de type 1 et une thyroïdite), une
maladie inflammatoire de l’intestin, une dermatite atopique et des infections fatales (253255). Cependant, la localisation intracellulaire de Foxp3 ne permet pas son utilisation pour
identifier les Treg et chez l’Homme, son expression peut augmenter de façon transitoire dans
les lymphocytes T activés sans pour autant leur conférer des fonctions régulatrices (256). La
relation entre l’expression de Foxp3 par les lymphocytes T activés et la mise en place des
fonctions suppressives reste un sujet de débat. Walker et al. montrent que l’expression de
Foxp3 par les T CD4 CD25- activés est suffisante pour les convertir en cellules régulatrices
(257). Or Gavin et al. montrent au contraire que la population Foxp3 induite n’est ni
anergique, ni suppressive in vitro et que l’expression de Foxp3 est transitoire (258). Cette
expression décline dans le temps lors de cultures prolongées.
Les Treg sont générés dans le thymus puis rejoignent les organes lymphoïdes
secondaires (236). Ils ont la capacité de migrer dans les sites d’inflammation ou au niveau des
tumeurs (259). Les mécanismes moléculaires précis par lesquels les cellules régulatrices
inhibent l’activation et la prolifération d’autres cellules sont très controversés. À l’heure
actuelle, plusieurs mécanismes de suppression ont été décrits : suppression par l’intermédiaire
des cytokines, par interaction entre la cellule régulatrice et les cellules effectrices ou les CPA,
et enfin la lyse des cellules effectrices par les Treg (Figure 15) (246).
57
•
Les principales cytokines décrites comme médiateurs de la suppression des Treg sont
l’IL10 et le TGF-ß (246). Le rôle de l’IL10 secrété par les Tregs a été montré dans différents
types de maladies auto-immunes (260). Dans des modèles d’allergie, d’asthme, de colites et
dans certaines infections (hépatite B), l’IL-10 sécrétée par les Treg semble contribuer aux
mécanismes de suppression des Treg (246). Mais son rôle dans la suppression médiée par les
Tregs CD4+CD25+Foxp3+ reste encore controversé. En effet, des études in vitro utilisant des
anticorps neutralisants contre l’IL-10 ou des lymphocytes T incapables de répondre à l’IL-10
suggèrent que cette cytokine ne joue pas un rôle essentiel dans la fonction des Treg.
Différentes études réalisées dans des modèles de diabète et de gastrite comme dans certaines
infections (Mycobacterium tuberculosis, toxoplasma gondii) montrent que l’IL-10 produite
par les Treg n’est pas nécessaire à la protection des animaux (261). L’importance relative de
la production d’IL-10 par les Treg comme mécanisme de suppression semble finalement
dépendre du tissu, de la maladie et du système expérimental. L'IL-10 conduit à un blocage de
la transcription des gènes des cytokines et à une inhibition de l'accumulation de leurs ARNm
(262). Les effets inhibiteurs de l'IL-10 passent aussi par une inhibition de la phosphorylation
de CD28 lors de la stimulation du récepteur de l'IL-10 (263). L'IL-10 a de nombreux effets
biologiques sur d'autres types cellulaires du système immunitaire comme les macrophages et
les cellules dendritiques (264). Elle module l’expression des cytokines (IL-1α, IL-1β, IL-6,
IL-12, IL-18, GM-CSF, TNF, …), des chimiokines (MCP1, MIP-1α, MIP-1β, Rantes, IL-8,
…) et des molécules de surface (CCR1, CCR2, CCR5, CMH de classe II, ICAM-1, CD80,
CD86), avec des conséquences importantes sur la capacité de ces cellules à s’activer et à
initier des réponses immunes et inflammatoires.
Le rôle du TGF-β est lui aussi très discuté. Piccirillo et collaborateurs ont montré que
le TGF- ß n’est pas requis pour la fonction suppressive in vitro (265) par contre son rôle dans
le contrôle de la colite et du diabète chez la souris a été fermement établi (266-269). Le TGFß produit par les Treg semble aussi impliqué dans le contrôle de la réponse immunitaire à
Mycobacterium tuberculosis et dans la suppression des réponses allergiques (261). Dans un
modèle de colite, les Treg déficients pour le TGF-ß sont toujours capables d’enrayer le
développement de la pathologie, mais l’injection simultanée d’anticorps anti-TGF-ß annule
cette protection (270). De plus, si les lymphocytes T CD4 colitogènes expriment un dominant
négatif du récepteur au TGF-ß de type II, les lymphocytes Treg ne sont plus capables de
prévenir le développement de la colite. Ceci démontre que l’expression d’un récepteur
fonctionnel du TGF-ß par les lymphocytes T effecteurs est nécessaire pour l’effet inhibiteur
des Treg. Mais les Treg ne sont pas l’unique source de cette cytokine suppressive. Les Treg
doivent donc stimuler la sécrétion de TGF-ß par une autre population cellulaire. Certaines
58
études ont suggéré que les cellules Treg CD4+CD25+ activées exprimaient à leur surface une
forme membranaire du TGF-β, et qu’elles pourraient ainsi délivrer du TGF-β aux cellules
répondeuses directement par contact cellulaire (271). Le TGF-ß inhibe la prolifération des
lymphocytes T, soit par inhibition de la signalisation par le récepteur de l'IL-2, soit par
inhibition de la sécrétion d’IL-2 (272). Le TGF-β supprime la production d’IFN-γ et de TNFα par les cellules T. De plus, il antagonise l'effet de l'IFN-γ et du TNF-α sur les macrophages,
supprime la production de NO et d'ions superoxydes. Le TGF-β altère l'expression des
molécules de costimulation, diminue l'expression des molécules du CMH de classe I et II sur
les CPA (272, 273) et altère l'expression de nombreuses molécules d'adhésion, comme la Eselectine, modifiant ainsi les capacités d'adhésion des lymphocytes et des neutrophiles sur les
cellules de l'endothélium vasculaire (274).
Une enzyme participant à la fonction des Treg a été mise en évidence, celle de l’HO-1
(heme oxygenase 1), enzyme de dégradation de l’hème dont l’expression serait contrôlée par
Foxp3 (275). L’effet anti-inflammatoire de cette molécule a été démontré dans l’asthme
allergique. Il pourrait être en partie médié par une induction de production d’IL-10 et de TGFß membranaire (276, 277).
Récemment, une nouvelle cytokine inhibitrice, l’IL-35, a été décrite. Cette cytokine
est préférentiellement exprimée par les Treg et semble requise pour une activité de
suppression maximale des Treg (278). En revanche, une récente étude, chez l’homme, a
montré que les Tregs humaines n’exprimeraient pas l’IL-35 de façon constitutive (279).
•
Les Treg peuvent aussi médiés leur effet suppresseur en entraînant des perturbations
dans le métabolisme des lymphocytes T effecteurs. Par exemple, la privation d’IL-2,
fortement consommée par les Tregs, jouerait aussi un rôle dans les mécanismes de
suppression en induisant l’apoptose des cellules effectrices (280). Cette diminution
d’expression pourrait être due, au moins en partie, à la consommation compétitive de la
cytokine par les Treg qui expriment le récepteur à un fort niveau (281). Les Treg peuvent
aussi inhiber l’activation des lymphocytes T in vitro en inhibant la production d’IL-2 (282). Il
faut cependant noter que les lymphocytes déficients pour CD25 restent sensibles à l’activité
suppressive des Treg (283).
Récemment, un autre mécanisme de suppression des Treg a été découvert: il s’agit du
transfert par les connexons (un pore par où diffusent les petites molécules hydrophiles ou les
ions capables d’y transiter) d’AMP cyclique au lymphocyte T cible (284). L’AMP cyclique
est un second messager jouant un rôle antagoniste sur la prolifération et la synthèse d’IL-2 par
le lymphocyte T. Bopp et al. ont montré que les Treg présentent un taux élevé d’AMP
59
cyclique, et que celui des lymphocytes T conventionnels augmente fortement lors de la
suppression. Cette hausse et l’activité des Treg sont reversées en présence d’un inhibiteur des
connexons. De plus, un des gènes les plus réprimés par Foxp3 est Pde3b (cyclic nucleotide
phosphodiesterase 3b), l’enzyme qui hydrolyse l’AMP cyclique (285). Son expression forcée
dans les Treg induit une perturbation de l’homéostasie et du programme transcriptionnel en
aval de Foxp3.
En 2007, il a également été établi que la génération locale d’adénosine par les Treg
contribuait à la création d’un microenvironnement suppresseur (286). L’adénosine relarguée
par les cellules apoptotiques lors de l’inflammation constitue un mécanisme physiologique de
rétrocontrôle sur les lymphocytes T activés qui expriment le récepteur à l’adénosine (A2AR).
Les travaux du groupe de Robson ont identifié les ecto-enzymes CD39 et CD73 comme
spécifiquement exprimées à la surface des Treg et participant à leur fonction régulatrice en
catalysant la production d’adénosine. Encore plus récemment, il a été montré que la
stimulation du récepteur A2A inhibait la production d’IL-2 et d’IL-6 au profit du TGF-ß. De
ce fait, la sécrétion d’adénosine orienterait les lymphocytes T vers le lignage régulateur tout
en inhibant les différenciations Th1 et Th17 (287).
•
Certaines études suggèrent que la suppression pourrait être exercée par une interaction
directe entre la cellule Treg et la cellule T effectrice ou la CPA, notamment par
l’intermédiaire de CTLA-4. Contrairement aux cellules T naïves, les cellules Treg
CD4+CD25+ expriment constitutivement la molécule CTLA-4 et ses ligands CD80 et CD86
sont exprimés par les CPA et les lymphocytes T CD4 activés. Le blocage de CTLA-4, par
l’administration d’un anticorps anti-CTLA-4 bloquant, induit chez la souris naïve des
maladies auto-immunes similaires à celles observées lors de la déplétion des cellules T
CD4+CD25+ (288). Les T CD4 CD25+ peuvent moduler les fonctions des CPA et les rendre
inaptes à activer un lymphocyte T effecteur par un mécanisme dépendant de CTLA-4. Par
exemple, il a été montré que les Treg pouvaient diminuer l’expression des molécules de
costimulation B7.1 et B7.2 exprimées par les DC (289). Fallarino et al. montrent que
l’expression de CTLA-4 par les T CD4 CD25+ peut induire l’expression de l’enzyme IDO
(Indoleamine2,3-Dioxigénase) par les DC (290). IDO catalyse la dégradation du tryptophane
et son expression est sous le contrôle transcriptionnel de l’IFN-γ (291). IDO possède un rôle
immunorégulateur (292). La privation en tryptophane et la présence de kinurenines proapoptotiques (produit de dégradation du tryptophane) inhibent l’expansion clonale et
augmentent la délétion des lymphocytes T.
60
•
Les cellules régulatrices sont aussi capables d'induire l'apoptose des cellules cibles par
des mécanismes cytolytiques. Ces mécanismes nécessitent que les cellules régulatrices soient
activées. Selon le mode de stimulation, les cellules régulatrices T CD4 CD25+ expriment les
protéines granzyme A ou granzyme B et lysent les cibles autologues, de façon dépendante ou
non de la perforine (293). Plus récemment, deux autres molécules ont été décrites comme
jouant un rôle dans la cytotoxicité médiée par les Tregs, Galectin-1 et TRAIL-DR5 (tumournecrosis-factor-related apoptosis-inducing ligand–death receptor 5) (294, 295).
d. Les lymphocytes T CD8 régulateurs
Les lymphocytes T CD8 CD28-
Les lymphocytes T CD8 CD28- ont été mis en évidence in vitro, après plusieurs cycles
de stimulation de lymphocytes humains du sang périphérique, par des CPA allogéniques
(296), xénogéniques (297) ou par des CPA syngéniques chargées avec des antigènes
peptidiques conventionnels (298). Plus récemment, il a été montré que ces cellules existent
aussi chez des souris naïves et ont la capacité d’inhiber la colite induite par les lymphocytes T
CD4 CD45RBhigh (299). Ces cellules régulatrices expriment de nombreux marqueurs
caractéristiques des cellules régulatrices naturelles comme : Foxp3, GITR, CTLA-4, CD103
et 4-1BB (300). Leur action suppressive est restreinte par le CMH de classe I et est spécifique
de l'antigène. Elle s'exerce sur les lymphocytes T CD4 en inhibant leur prolifération, leur
capacité à produire de l'IL-2 et leur capacité à exprimer CD40L (296). L'effet suppresseur des
cellules T CD8 CD28- implique l'interaction directe avec les CPA professionnelles
(dendritiques) et non professionnelles (endothéliales) (301). Ils inhibent la surexpression des
molécules de co-stimulation (CD40, B7.1 et B7.2), et augmentent l'expression de récepteurs
inhibiteurs ILT-3 et ILT-4 (Immunoglobulin Like Transcript 3 and 4) qui contrôlent
négativement la fonction co-stimulatrice de la CPA. Ces CPA ILT-3high ILT-4high sont
tolérogènes. Elles inhibent la réponse immune en induisant l’anergie des lymphocytes T CD4
spécifiques. L’équipe de Suciu-Foca a montré que ces CPA tolérogènes peuvent induire la
génération de cellules T CD4 régulatrices spécifiques d'antigène et la génération de nouvelles
cellules CD8 CD28- Foxp3+ (302).
Des cellules régulatrices T CD8 CD28- murines ont été mises en évidence dans un modèle
de résistance au développement de l'EAE chez des souris déficientes pour CD28 (303). Ces
61
cellules T CD8 CD28- inhibent la production d'IFN-γ par les lymphocytes T CD4 spécifiques
de MOG. Cette suppression nécessite un contact cellulaire qui prévient la surexpression des
molécules de co-stimulation par les CPA. Des cellules CD8+CD28- ont été retrouvées en
grande proportion chez des patients greffés rénaux, hépatiques ou cardiaques, ne présentant
pas de signe de rejet (304-306). Ces cellules sont régulatrices et peuvent, ex vivo, induire
l’expression des récepteurs inhibiteurs ILT-3 et ILT-4 par les CPA du donneur d’organe
(301). Leur fonction inhibitrice est restreinte au HLA de classe I du donneur, elles ne peuvent
pas modifier le phénotype ou la fonction des CPA contrôles. Enfin, les T CD8 CD28- de
patients qui rejettent la greffe n’ont pas de fonction suppressive. Ces résultats suggèrent que
leur capacité inhibitrice est étroitement associée à l’absence de rejet aigu.
Les T CD8 CD122+
Les cellules T CD8 CD122+ régulatrices sont caractérisées par l'absence d'expression
de CD25 et par l'expression constitutive de la chaîne ß (CD122) commune aux récepteurs de
l'IL-2 et de l'IL-15. L'expression de CD28 sur les CD8 CD122+, permet de les distinguer des
CD8 CD28-. Leur fonction suppressive a été mise en évidence dans un modèle d'hyperimmunité sévère chez des souris invalidées pour CD122 (307). Cette déficience conduit à
l'augmentation de la granulopoïèse et à une suppression de l'érythropoïèse, liées à une
expansion anormale de cellules T activées. Ces souris meurent 3 à 4 mois après la naissance.
Le transfert de cellules T CD8 CD122+ chez des souris CD122-/- nouveau-nées, prévient le
développement du syndrome, alors que le transfert de CD8 CD122- ou de cellules régulatrices
CD4 CD25+, est inefficace (308). Les cellules T CD8 CD122+ sont capables d'inhiber
l'expansion des CD4 et des CD8 déjà activés provenant de souris CD122-/-. Elles peuvent
aussi inhiber la production d'IFN-γ par les lymphocytes T CD4 et CD8 de souris normales,
stimulés avec un anticorps anti-CD3. Les CD8 CD122+ sont également capables d'inhiber la
production d'IL-2 et d'IFN-γ par des CD4 ou des CD8 spécifiques d'un antigène. Le transfert
des cellules T CD8 CD122- chez des souris RAG-2-/- conduit au développement d'un
syndrome similaire à l'hyper immunité sévère. Cette maladie est contrôlée par le co-transfert
des CD8 CD122+. L'activité régulatrice des CD8 CD122+ ne nécessite pas la présence de
CPA et passe par la production d'IL-10. Ces cellules n’expriment pas Foxp3 (309).
62
Les lymphocytes T CD8 CD25+
CD25 permet également d'identifier une population de lymphocytes T CD8
régulatrice. Chez une souris normale, les CD8 CD25+ sont présents à la fois au niveau du
thymus (1 % des CD8+ CD4-) et en périphérie (0,5 % des CD8), mais à des pourcentages très
faibles (310). Chez une souris invalidée pour le CMH de classe II, l'absence de CD4 fait que
la proportion de cette population est augmentée à des niveaux détectables, dans le thymus et
en périphérie. Dans le thymus humain, les cellules T CD8 CD25+ représentent environ 3-4 %
des thymocytes CD8+ CD4- (311). Les cellules T CD8 CD25+ présentent un phénotype et
des fonctions régulatrices similaires aux cellules CD4 CD25+. Les cellules T CD8 CD25+
expriment constitutivement CD28, CTLA-4, GITR et Foxp3. Elles produisent de l'IL-10 et
contrôlent la prolifération et la production d'IFN-γ par les lymphocytes T CD4 et T CD8, en
bloquant la transcription des ARNm codant pour l'IL-2. Cette suppression dépend d'un contact
cellulaire qui passe par l'expression de CTLA-4 et du TGF-ß membranaire (310, 311). À
l’inverse des lymphocytes T CD4 CD25+, les lymphocytes T CD8 CD25+ ne sont pas des
cellules anergiques et produisent de grandes quantités d'IFN-γ.
Les lymphocytes T CD8 CD45RClow
Récemment, une population de cellules Treg naturelle a été décrite dans le
compartiment CD8+ chez le rat (312). Ces cellules sont CD45RClow et expriment Foxp3 et
CTLA-4. In vitro, en présence de CPA allogéniques, elles produisent essentiellement de l’IL4, de l’IL-10 et de l’IL-13 et ne sont pas cytotoxiques. Elles peuvent supprimer la
prolifération et la différenciation de lymphocytes T CD4 de façon contact cellulaire
dépendant. Ces cellules ont aussi un pouvoir régulateur in vivo puisqu’elles sont capables
d’inhiber la GvHD induite par les lymphocytes T CD4. De plus, l’étude de rats congéniques
et des analyses de liaison ont permis de montrer que la proportion de cette population
régulatrice CD45RClow au sein de T CD8 est contrôlée génétiquement par une région située
sur le chromosome 9 et une région sur le chromosome 20 (48). Ces cellules semblent aussi
protéger du rejet de greffe cardiaque mais seulement après traitement avec une CD40Ig. En
effet, le transfert adoptif de cellule CD8+ CD45RClow provenant de rats traités avec de
CD40Ig, conduit à une survie à long terme du greffon en induisant la sécrétion d’IDO par les
cellules endothéliales du greffon (313).
63
a
Génotype
(ex: mutation dans AIRE)
Maladie
(ex: APECD)
b
Facteurs génétiques
Facteurs environnementaux
(ex: expostion à un pathogène)
Évènements
aléatoires
Défaut de la réponse
inée
Diminution de
l’expression d’Ag du
soi dans le thymus
Défaut de l’élimination
des lymphocytes T
autoréactifs
Niveau hormonal
Autres facteurs
environnementaux
(ex: tabac, alimentation)
Facteurs environnementaux
(ex: grossesse)
Figure 16. Origine multifactorielle des maladies autoimmunes.
a. Dans certains cas, la relation entre le génotype et la maladie est déterminante. b. Dans des
traits plus complexes, la maladie résulte d’interactions entre de multiples génotypes et
l’environnement. Les génotypes individuels peuvent affectés un ou plusieurs composants de
l’immunité innée ou adaptative conduisant à une réponse autoimmune.
D’après Rioux, JD et al. (314).
64
2. Auto-immunité : les vascularites à ANCA
Une défaillance des mécanismes centraux ou périphériques d’induction et de maintien
de la tolérance naturelle vis-à-vis des constituants du soi peut favoriser l’émergence d’une
maladie auto-immune, mais ne constitue pas habituellement une cause suffisante pour
déclencher ces pathologies. L’auto-immunité semble être le résultat d’une combinaison de
facteurs génétiques, environnementaux et d’évènements aléatoires (Figure 16). Ces facteurs
influencent la présentation et l’expression de l’antigène, la réactivité des cellules immunitaires
face à cet antigène ainsi que la réponse des tissus cibles. Un des exemples de ces nombreuses
maladies auto-immunes d’origine multifactorielle sont les vascularites à ANCA (AntiNeutrophil Cytoplasmic Antibodies).
Les vascularites sont une inflammation des parois des vaisseaux sanguins. Toutes
sortes de vaisseaux et n’importe quels organes peuvent être affectés. Ces maladies sont
classées en 3 catégories selon la taille des vaisseaux : les vascularites des petits vaisseaux
dont font partie les vascularites à ANCA (AAV), les vascularites des moyens vaisseaux
comme la maladie de Kawasaki et les vascularites des gros vaisseaux comme l’arthrite de
Takayasu (Figure 17) (315).
Les AAV sont des vascularites systémiques des petits et moyens vaisseaux les plus
répandues chez l’adulte. En Europe et aux Etats-Unis, l’incidence annuelle est de 1 à 5 cas
pour 100 000 (316). Ces vascularites à ANCA sont des maladies auto-immunes caractérisées
par des auto-anticorps, comme leur nom l’indique, dirigés contre les constituants
cytoplasmiques des neutrophiles (317). Elles conduisent à une occlusion des vaisseaux et à
des dommages importants dans de nombreux organes (315). Ces vascularites regroupent 3
maladies majeures : la vascularite granulomateuse idiopathique (VGI) anciennement nommée
vascularite de Wegener, la polyangite microscopique (MPA) et le syndrome de Churg-Strauss
(CSS). Ces 3 pathologies, dites nécrosantes car elles induisent une nécrose des vaisseaux,
impliquent surtout des veinules, des capillaires et des artérioles. Les vascularites à ANCA
forment un groupe très hétérogène car elles touchent différents organes et la fréquence
d’association avec les ANCA est très variable (Figure 18), (318). La VGI est associée à des
ANCA dirigés contre la Protéinase 3 (PR3) alors que la cible commune de la MPA et du CSS
est la Myéloperoxidase (MPO).
65
Vascularites des petits vaisseaux
(ie, polyangite microscopique, granulomatose de Wegener)
Vascularites des vaisseaux moyens
(ie, polyartérite noueuse, maladie de Kawasaki)
Vascularites des gros vaisseaux
(ie, artérite à cellules géantes, artérite de Takayasu’s)
capillaire
veinule
artèriole
veine
artère
Syndrome de Goodpasture
aorte
Polyangite microscopique, granulomateuse de Wegener et syndrome de Churg-Strauss
Figure 17. Sites vasculaires impliqués dans les différentes vascularites.
La largeur du trapèze indique la fréquence de l’implication des différentes portions de la
vasculature.
D’après Jenette JC et al.(315).
66
2.1. Rôle de l’immunité humorale dans les vascularites à ANCA
Des études in vitro et in vivo suggèrent fortement que les ANCA jouent un rôle direct
dans le développement de ces vascularites (319). D’un point de vue clinique, les ANCA sont
souvent reliés à l’activité de la maladie et aux rechutes (320), même si cela reste un argument
très débattu (321). Des traitements immunosuppresseurs (azathioprine) préventifs lors de
l’augmentation du titre de ANCA permettent de prévenir les rechutes (322). De plus, le
traitement au rituximab, qui cible les lymphocytes B est très efficace dans la déplétion des
ANCA et dans l’induction de la rémission (323). La rémission est observée chez tous les
patients et est maintenue tant que les lymphocytes B sont absents. Ces résultats et le fait que
les ANCA doivent être produits par les lymphocytes B suggèrent un rôle fondamental de ces
cellules dans la pathologie des AAV.
Des études in vitro ont permis de montrer que les neutrophiles expriment PR3 et MPO
à leur surface lorsqu’ils sont activés avec de faibles doses de cytokines pro-inflammatoires
comme le TNF-α (Figure 19) (324). Lorsque ces neutrophiles sont incubés avec des ANCA
anti-PR3 ou anti-MPO, ils s’activent, produisent des radicaux oxygénés et relarguent des
enzymes lytiques comme l’élastase et PR3 (324, 325). Il a aussi été montré que les
neutrophiles adhèrent et migrent vers et à travers des couches de cellules endothéliales
lorsqu’elles sont perfusées avec des ANCA dans des conditions physiologiques (326). De
plus, la présence des ANCA stabilise l’adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales
(327) et conduit au détachement et à la lyse de ces dernières (328). La plupart des individus
possèdent une population de neutrophiles hétérogènes : certains expriment PR3 à leur
membrane (mPR3) alors que d’autres non (329). La proportion de chaque sous-population est
stable chez un individu et est génétiquement prédéterminée (330). Les patients atteints de la
maladie de VGI ont une proportion plus élevée de neutrophiles exprimant mPR3 (329). Une
proportion plus élevée de mPR3 chez les patients atteints de VGI a été associée à une
augmentation des rechutes (331). De plus, une association, entre la maladie de VGI et un
polymorphisme dans la région du promoteur de PR3, a pu être démontrée (332). Cependant,
une étude plus récente montre qu’il n’y aurait pas d’association entre ce polymorphisme et
l’augmentation de l’activité du promoteur de PR3 (333) suggérant un autre rôle de ce
polymorphisme. En outre, le traitement des DC avec PR3 induit leur maturation via PAR-2
(Protease-Activated-Receptor-2) qui sont alors capables d’activer les lymphocytes T CD4
spécifiques de PR3 (334). Il a aussi été montré que les neutrophiles provenant d’individus
déficients pour MPO ne répondent pas aux ANCA anti-MPO (335). Ces études suggèrent que
67
Organes impliqués
Articulation
Tractus respiratoire supérieur
Asthme
Tractus respiratoire inférieur
Rein
Cœur
Peau
Système nerveux central
Système nerveux périphérique
Tractus gastro-intestinal
ANCA positif
VGI (%)
25
93
Non spec.
54
54
13
23
Non spec.
20
Non spec.
84
MPA (%)
51
Non spec.
Non spec.
35
79
20
73
12
58
31
75
CSS (%)
37
83
100
73
16
35
52
9
72
32
38
Figure 18. Organes impliqués dans les vascularites à ANCA (AAV).
Ce tableau représente les différents organes touchés par la maladie selon le type d’AAV et est
basé sur trois cohortes : la cohorte VGI (vascularite granulomateuse idiopathique) comprend
155 patients, la cohorte MPA (polyangite microscopique) comprend 85 patients et celle des
CSS (syndrome de Churg–Strauss) en comprend 112. Non spec. = non spécifié.
D’aprèse Holle JU et al. (318).
68
l’augmentation de l’auto-antigène PR3 peut-être reliée au développement de cette réponse
auto-immune.
D’autres facteurs comme des infections pourraient contribuer à l’augmentation de
l’expression de PR3 et MPO (Figure 19) (336). Des infections telles que Staphylococcus
aureus ont été associées à une augmentation des rechutes de la maladie de VGI (316).
Xiao et al. ont pu mettre en évidence, à l’aide de modèles murins, la capacité des
ANCA anti-MPO à induire des vascularites nécrosantes (337). En effet, l’immunisation de
souris déficientes pour la MPO, avec de la MPO murine conduit à la formation des ANCA
anti-MPO. L’injection de ces ANCA à des souris immunodéficientes ou sauvages induit des
vascularites nécrosantes. De plus, lorsque des splénocytes provenant de souris injectées avec
la MPO sont transférés à des souris Rag2-/-, ces souris développent des glomérulonéphrites
nécrosantes et des vascularites systémiques. En revanche, même si l’injection de PR3 à des
souris PR3 déficientes induit des ANCA anti-PR3, le transfert passif de ces ANCA n’induit
pas de vascularite (338). Des ANCA anti-LAMP-2 (Lysosomal Membrane Proteine-2) ont pu
être détectés chez la majorité des patients atteints de glomérulonéphrite nécrosante (339). De
façon intéressante, LAMP-2 possède une homologie de 100% avec l’adhesine bactérienne
FimH et les anticorps anti-LAMP-2 cross-réagissent avec cette protéine bactérienne.
Récemment, il a été montré chez le rat, que l’injection de ANCA anti-LAMP-2 ou anti-FimH
induit une glomérulonéphrite suggérant que les bactéries Gram négative sont impliquées dans
la pathogenèse des AAV (340).
2.2. Rôle de l’immunité cellulaire dans les vascularites à ANCA
De nombreuses cytokines pro-inflammatoires sont sécrétées par les neutrophiles après
liaison aux ANCA comme l’IL-1β, le TNF-α, l’IL-6, l’IL-8 et l’IL-17 (Figure 19) (341-344).
La sécrétion de cytokines médiée par les ANCA pourrait activer et recruter de nombreuses
autres cellules du système immunitaire, comme les monocytes et les lymphocytes T,
amplifiant et perpétuant la réponse inflammatoire.
Les monocytes et macrophages sont présents dans les biopsies rénales et participent à
la formation des granulomes en synthétisant et sécrétant des chimioattractants, des facteurs de
croissance et de cytokines pro-inflammatoires (345, 346). Ces cellules peuvent aussi être
activées par les ANCA (347, 348). L’opsonisation des neutrophiles apoptotiques via les
69
Figure 19. Modèle schématique des mécanismes, innés et adaptatifs supposés, impliqués
dans la pathogénèse des vascularites à ANCA.
Des superantigènes et des peptidoglycanes de Staphylococcus aureus stimulent les CPA dans
le tractus respiratoire à produire de l’IL-23 qui induit à son tour la prolifération des cellules
Th17 et le relargage d’IL-17. L’IL-17 agit ensuite sur l’épithélium respiratoire et les
macrophages. En réponse à l’IL-17, les cellules épithéliales bronchiques sécrètent des
chimiokines qui attire les neutrophiles vers les tissus infectés alors que les macrophages
sécrètent des cytokines proinflammatoires telles que l’IL-1ß et le TNF-α. Ces cytokines
entraînent l’activation des neutrophiles (expression membranaire de la PR3) ainsi que
l’augmentation de molécules d’adhésion à leur surface ainsi qu’à la surface de l’endothélium
vasculaire (sélectines, ICAM-1, VCAM-1). Les neutrophiles vont alors adhérer aux cellules
endothéliales. La liaison des ANCA à leur antigène à la surface des cellules et l’interaction
des fragments Fc des ANCA avec les récepteurs Fc activent les neutrophiles et augmentent la
transmigration et l’adhérence des neutrophiles aux parois des vaisseaux. L’activation des
neutrophiles médiée par les ANCA entraîne aussi la production de radicaux libres oxygénés
(ROS) et le relargage d’enzyme protéolytique qui vont endommager les cellules endothéliales
vasculaires. PR3 sécrétée peu être aussi présentée par les CPA aux cellules T CD4. Comme
les cellules Treg ne réussissent pas à inhiber cette réponse autoimmune, les lymphocytes T
autoréactifs sont stimulés de façon répétée par les CPA présentant PR3 et constituent un
réservoir de cellules mémoires effectrices (TEM). Les T CD4 stimulés par PR3 peuvent agir
sur les lymphocytes B et augmenter la production de ANCA. De plus, les lymphocytes CD4
TEM augmentent l’expression de NKG2D à leur surface et se lient alors à MIC-A exprimés
par les cellules endothéliales vasculaires entraînant alors la lyse alors des cellules cibles de
façon perforine/granzyme dépendante. D’abdulahad WHet al. (349).
70
ANCA augmente à la fois l’activité phagocytaire des macrophages et leur production de
cytokines pro-inflammatoires (342). De plus, les ANCA stimulent les monocytes à produire
MCP-1 in vitro (350). Des études ont aussi suggéré que les ANCA pourraient recruter les
neutrophiles en induisant la production d’IL-8 par les monocytes (351). Une augmentation de
l’expression de CD14 et CD18 sur les monocytes par les ANCA in vitro a été reportée (352).
Les lymphocytes T semblent aussi jouer un rôle dans les AAV (Figure 19). De
nombreuses observations suggèrent qu’il s’agit d’une réponse immunitaire T dépendante : a)
les ANCA sont des anticorps de haute affinité, avec une prédominance d’IgG1 et d’IgG4 dans
la maladie de VGI (353), b) les lymphocytes T s’accumulent dans le rein et leur nombre est
corrélé à la déficience de la fonction rénale (345, 354, 355), c) les marqueurs de cellules T
activées sont augmentés chez ces patients (356), d) les lymphocytes T de patients d’AAV
réagissent à la PR3 et MPO dans des test de prolifération (357-359), e) une rémission de la
maladie peut-être induite après traitement avec des molécules dirigées contre les lymphocytes
T (360-362).
Dans les reins de patients atteints d’AAV, les cellules infiltrant les glomérules sont
essentiellement des monocytes et des granulocytes alors que les cellules infiltrant le tissu
interstitiel rénal sont majoritairement des lymphocytes T (345). Ces lymphocytes T sont
surtout retrouvés autour des glomérules sclérosés. Les infiltrats sont composés à la fois de
lymphocytes T CD4 et CD8. De plus, dans un modèle animal de vascularite associée aux
ANCA anti-MPO, il a été montré que les lymphocytes T jouaient un rôle essentiel (363). En
effet, la déplétion de lymphocytes T CD4 dans ce modèle atténue la maladie.
Tout d’abord, il avait été constaté que les patients atteints d’AAV présentaient une
augmentation des marqueurs d’activation T dans le sérum et que cette augmentation était
associée aux risques de rechutes (364, 365). Puis des lymphocytes T CD4 et CD8 activés ont
été retrouvés dans le sang périphérique des patients d’AAV, à la fois pendant la maladie
active et lors des rémissions (366). De nombreux marqueurs d’activation comme CD25,
HLA-DR, CD69 sont augmentés pendant la maladie (367, 368). Ces données suggèrent une
exposition répétée à l’antigène ainsi qu’une réponse T incontrôlée. Ceci pourrait être expliqué
par l’observation d’un défaut de fonctionnement des Treg chez les patients atteints de maladie
de VGI (369). Ce défaut observé est toutefois à discuter puisque les cellules Treg étudiées
sont caractérisées par l’expression de CD25 et de Foxp3, marqueurs exprimés aussi par les
cellules T humaines activées. Cette observation pourrait donc être attribuable à une activation
des lymphocytes T. Des polymorphismes dans les gènes codant pour des molécules
inhibitrices de l’activation des T (CTLA-4 et PD-1) ont été décrits comme facteur de risque
71
des AAV (370). Ce réservoir de lymphocytes T activés persistant pourrait avoir le potentiel de
réactiver la maladie dans les tissus et d’initier les rechutes. D’autres études ont montré une
diminution des cellules naïves en périphérie (CD45RO-CCR7+) chez des patients atteints
d’AAV ainsi qu’une augmentation des cellules effectrices mémoires CD4 (TEM) caractérisées
par l’expression de CD45RO et l’absence de CCR7 (371, 372). De plus, les patients en
rémission ont plus de TEM que les patients avec une maladie active.
Des variations quantitatives et qualitatives dans la sécrétion de cytokine ont aussi été
décrites chez les patients atteints d’AAV. L’analyse de sérums et de granulomes de patients
révèle une déviation vers un phénotype Th2 chez les patients avec une maladie de VGI
généralisée active et ceux atteints du CCS alors qu’une réponse Th1 domine chez les patients
avec une maladie de VGI localisée et avec une maladie de MPA (373-376). Cependant,
aucune différence de cytokines n’est observée lorsque les lymphocytes T sont stimulés avec
PR3 ou MPO entre les cellules de patients atteints d’AAV et les cellules d’individus contrôles
(358). Plus récemment, l’implication des Th17 dans les AAV a aussi été étudiée. Chez les
patients atteints de la maladie de VGI, un pourcentage plus élevé de Th17 et Th2 est observé
lorsque les cellules mononuclées du sang sont stimulées avec l’antigène PR3 alors qu’aucune
augmentation des Th1 n’est observée suggérant que les Th17 seraient les effecteurs majeurs
dans les AAV (377). De plus, l’IL-17 joue un rôle important dans le recrutement et
l’activation des neutrophiles, cellules clés des AAV. Les neutrophiles activés in vitro par des
ANCA anti-MPO sécrètent de l’IL-17 et de l’IL-23 (344). Dans un modèle de vascularite
induite par l’injection de ANCA anti-MPO chez la souris, une augmentation sérique des
cytokines responsables du développement des Th17 : l’IL-6, de l’IL-23 et de l’IL-17A a été
observée (344). Récemment, Ivanov et al. ont montré que la stimulation intra-nasale avec des
peptidoglycanes provenant de S.aureus induit une augmentation de l’IL-23 dans le liquide de
lavage broncho-alvéolaire générant des Th17 (378). Il a aussi été montré que l’IL-17 induit le
relargage de chimiokines par les cellules épithéliales ce qui attire spécifiquement les
neutrophiles sur le site de l’inflammation en association avec une activité de l’élastase et de la
MPO (379, 380). De plus, l’IL-17 promeut la sécrétion d’IL-1β et de TNF-α par les
macrophages (381). Ces cytokines pro-inflammatoires activent les neutrophiles résultant en la
translocation de PR3 à la membrane plasmique (382). La présence de PR3 et la rupture de la
tolérance médiée par les Treg devraient conduire à une réponse T autoréactive contre PR3
conduisant à la production d’ANCA anti-PR3 (Figure 19).
72
III.
REPONSE IMMUNE PATHOLOGIQUE : REJET DE GREFFE
1. Transplantation d’organe solide
A l’heure actuelle, la transplantation d’organes allogéniques chez l’Homme permet de
traiter de nombreuses pathologies liées à des déficiences de fonctions vitales. Mais la
principale complication de la greffe d'organe est le phénomène de rejet. Ce rejet va dépendre
essentiellement de la réaction immunologique du receveur contre l'organe greffé. Plusieurs
formes de rejets existent. Elles se caractérisent par le moment de leur survenue, par les
mécanismes immunologiques mis en jeu et par les types de lésions constituées au niveau du
greffon. L’expression clinique du rejet d’allogreffe est étroitement liée à la nature de l’organe
greffé, à l’intensité du rejet (suraigu, aigu ou chronique) et aux traitements
immunosuppresseurs utilisés pour limiter les phénomènes de rejet.
1.1. Rejet Hyper-aigu (ou rejet aigu médié par les anticorps)
Le rejet hyper-aigu se caractérise par une thrombose immédiate des vaisseaux irrigant
le greffon survenant dans les minutes ou les heures qui suivent la reperfusion de l’organe. Il
est la conséquence de la présence, dans le sérum du receveur, d’alloanticorps préformés
dirigés contre le système ABO ou les molécules HLA (Human Leucocytes Antigen) du
donneur apparus suite à une grossesse, à une greffe antérieure ou à des transfusions répétées.
La fixation de ces anticorps à leur cible entraîne l’activation de la cascade du complément
conduisant à une thrombose vasculaire, à une ischémie et à une nécrose des tissus. Etant
donné qu’il n’existe aucun traitement efficace, le rejet hyper-aigu conduit invariablement au
rejet du greffon. Aujourd’hui, il est exceptionnellement observé car les transplantations sont
toujours faites entre sujet ABO compatibles et les anticorps anti-HLA sont recherchés chez
tout receveur avant transplantation. Leur présence est une contre indication à la
transplantation. Cependant, ce type de rejet constitue encore une barrière majeure à la
xénotransplantation (383).
1.2. Rejet cellulaire aigu
En l’absence d’anticorps préformés, les greffes d’organes peuvent tout de même être
rejetées après quelques jours : c’est le rejet aigu. En clinique, sous traitements
73
immunosuppresseurs, cette forme de rejet a lieu 5 jours à 3 mois après la transplantation.
Dans le cas de greffe rénale, sous traitement immunosuppresseurs, l’incidence du rejet aigu
est approximativement de 5 à 10% la première année. L’analyse histologique montre
généralement des infiltrats cellulaires interstitiels diffus composés à la fois de lymphocytes T
CD4 et CD8 avec un phénotype activé, de macrophages et de granulocytes (384, 385). Les
tissus nobles sont progressivement détruits et remplacés par des tissus de remplissage.
1.3. Rejet chronique
Malgré l’utilisation de traitements immunosuppresseurs qui ont permis de prolonger
significativement la survie des greffons à un an, la survie à long terme du greffon reste faible :
chaque année, 3 à 5% des patients perdent leur greffon. Le rejet chronique constitue un
obstacle majeur à la survie à long terme d’organes vascularisés (386). Le rejet chronique,
d’étiologie multiple mais avant tout immunologique, est responsable d’une altération
progressive et irréversible de la fonction du greffon. Il est caractérisé par une fibrose
interstitielle chronique et une occlusion des vaisseaux. Il ne conduit pas directement à la
destruction de l’organe mais à l’obstruction progressive de la lumière des vaisseaux sanguins,
aboutissant ainsi graduellement à la fibrose totale du greffon. L’occlusion de la lumière des
vaisseaux est précédée par une infiltration massive et périvasculaire de macrophages et par la
présence d’un nombre important de lymphocytes T CD4 et CD8 dans l’intima. Une
production importante de MCP-1, d’IL-1 d’IFN-γ et de TNF-α a aussi été rapportée (387).
Dans les phases plus tardives, l’infiltration de cellules mononuclées est toujours dominée par
les macrophages et la quantité de cellules T diminue fortement. Des cytokines de type Th2
commencent à s’accumuler dans les tissus transplantés. L’intima s’épaissit suite à une
prolifération intense des cellules musculaires lisses et endothéliales. Les cellules endothéliales
et les macrophages sécrètent des quantités importantes de facteurs fibrosant tels que le TGF-ß,
l’IL-6 et l’IL-1 (388). Dans les cas les plus extrêmes, la lumière vasculaire va complètement
se boucher ce qui conduit à l’ischémie de l’organe, la fibrose de son parenchyme et sa mort.
2. Les mécanismes du rejet de greffe
2.1. Les alloantigènes
74
La phase initiale du rejet d’allogreffe est provoquée par la capacité des lymphocytes T
du receveur à reconnaître une grande variété de protéines polymorphes du donneur appelées
dans ce contexte alloantigènes. En 1931, Karl Landsteiner apporta une contribution
importante à la biologie de la transplantation avec la découverte des groupes érythrocytaires
ABO (389). Très vite cependant, il s’avéra que la seule compatibilité ABO n’était pas
suffisante pour éviter le rejet de greffe. En effet, d’autres alloantigènes étaient mis en cause.
En fonction de l’intensité de la réaction de rejet induite, ces antigènes furent qualifiés
d’antigènes d’histocompatibilité « mineurs » ou « majeurs » (390).
a. Les molécules du CMH
Les alloantigènes les plus importants sont de loin, ceux codés par les gènes du
complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Les molécules du CMH sont les principales
cibles de la réponse immunitaire allogénique et par conséquent sont responsables du rejet de
greffe. Le CMH est un complexe multigénique situé sur le chromosome 6 chez l’Homme et
17 chez la souris. Parmi tous les gènes présents dans cette région, deux groupes de gènes
jouent un rôle central dans l’alloreconnaisssance : les antigènes du CMH de classe I (CMH-I)
connus comme HLA-A(Human Leucocytes Antigen), B et C chez l’Homme et H-2K, D et L
chez la souris, et les antigènes du CMH de classe II HLA-DP, DQ et DR chez l’Homme et IA et I-E chez la souris. Les gènes codés par le CMH font partie des gènes les plus
polymorphes connus, avec une centaine d’allèles différents sur les 5 loci majeurs du CMH
humain.
Les molécules du CMH-I sont des hétérodimères constitués d’une chaîne α
polymorphe associée de façon non covalente à la ß2-microglobuline. Les molécules de CMHI sont exprimées de manière constitutive à la surface de l'ensemble des cellules nuclées de
l'organisme. Leur principale fonction est de présenter aux lymphocytes T CD8, des peptides
endogènes, c'est-à-dire issus de protéines exprimées normalement par la cellule, ou
anormalement après une dérégulation (tumeur) ou une infection (virus, bactérie, parasite
intracellulaire). Il existe une alternative qui permet l'apprêtement et la présentation d'antigènes
exogènes par les molécules du CMH-I: c’est la présentation croisée (391).
Les molécules de CMH de classe II sont également des hétérodimères d'une chaîne α
et ß polymorphes associées de manière non covalente. Elles ont une distribution tissulaire plus
restreinte que les molécules de CMH-I. Leur expression est restreinte aux cellules
présentatrices d'antigènes professionnelles, comme les monocytes, les macrophages, les
75
cellules dendritiques, les cellules de Langerhans, les lymphocytes B ou encore les cellules
épithéliales du thymus. Chez l'homme, le rat et la souris, les molécules du CMH de classe II
sont aussi exprimées par les lymphocytes T activés (392-394). Leur principale fonction est de
présenter, par la voie exogène, des fragments de peptides endocytés provenant de protéines
d'origine extracellulaire, aux lymphocytes T CD4.
Le CMH est multigénique, multiallélique et d'expression codominante contribuant ainsi
à la diversité entre individus. La grande hétérogénéité des molécules du CMH lui permet de
lier un large éventail de peptide et de générer des réponses immunes spécifiques. Cependant,
si cette diversité du CMH est bénéfique pour la protection de l'organisme contre des agents
pathogènes, elle limite considérablement la probabilité d'histocompatibilité entre un donneur
et un receveur, lors de la transplantation d'organes. En effet, la disparité d'un seul locus du
CMH suffit pour déclencher une réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) dans le cas de
greffe de moelle osseuse. L’histocompatibilité du CMH est très importante pour la survie à
long terme de la greffe (395). Cependant l’immunosuppression est tout de même requise
lorsque donneur et receveur sont entièrement identique pour leur molécule du CMH. Ceci est
dû aux antigènes mineurs d’histocompatibilité.
b. Les antigènes mineurs d'histocompatibilité
Même si le rôle des antigènes du complexe majeur d’histocompatibilité est primordial,
le rejet peut néanmoins survenir après une transplantation entre deux individus
histocompatibles. Un ensemble de protéines d’une même espèce présentant un
polymorphisme génétique et n’appartenant pas au CMH, a été identifié comme important
dans l’induction du rejet. Ce sont les antigènes mineurs d’histocompatibilité (miHA) (396,
397). Les peptides provenant de ces protéines sont présentés aux lymphocytes T par les
molécules du CMH (398, 399). L’importance de la disparité de ces miHA entre individus
HLA identiques dans l’induction de la maladie du greffon contre l’hôte a été démontrée chez
l’Homme dans la greffe de moelle osseuse (400). Le nombre de miHA possible dans les
greffes réalisées sur des donneurs non apparentés, histocompatibles est très grand. Cependant,
la réponse T semble retreinte à un petit nombre de peptides dits immunodominants (401). Ces
protéines peuvent être codées par des gènes situés sur les chromosomes autosomaux comme
la myosine, par le chromosome Y ou par l’ADN mitochondrial (396, 397). Les antigènes
mâles HY constituent les exemples d’antigènes mineurs les mieux caractérisés. Ils n’ont une
relevance que lorsqu’un tissu mâle est greffé chez une femelle. Le système
76
A
Matériel provenant de
cellules nécrotiques et
apoptotique
B
Aide des LT
C
Matériel provenant de
cellules nécrotiques et
apoptotique
Aide des LT
exosomes
Figure 20. Voies de reconnaissance des alloantigènes.
A. Voie de présentation directe. La reconnaissance du complexe CMH/peptide présenté par
les CPA du donneur active les lymphocytes T CD4 et CD8 du receveur. B. La voie de
reconnaissance indirecte implique la présentation de peptides du donneur par les CPA du
receveur qui vont alors présenter ces peptides aux lymphocytes T CD4. C. Voie de
reconnaissance semi-directe. Le contact cellulaire entre les APC du donneur et celles du
receveur peut entraîner le transfert de composants intacts de la membrane comme des
molécules de CMH allogéniques. dAPC: CPA provenant du greffon ; rAPC : CPA provenant
du receveur.
D’après Afzali B et al. (402).
77
immunitaire de la femelle reconnaît les peptides codés par des gènes du chromosome Y
comme étranger et entraîne le rejet de greffe ou une GvHD.
2.2. Les voies de présentation des alloantigènes
Les lymphocytes T jouent un rôle central dans la réponse aux alloantigènes. Leur
déplétion ou la suppression de leur fonction permet de prolonger la survie du greffon. Les
lymphocytes T alloréactifs présents dans les ganglions drainant la greffe peuvent reconnaître
les alloantigènes présentés par les CPA selon deux voies principales (Figure 20). Ils peuvent
reconnaître directement les complexes allogéniques CMH/peptide présents à la surface des
cellules allogéniques du greffon (présentation directe), mais aussi les peptides allogéniques
présentés par le CMH des CPA du receveur (présentation indirecte). Un troisième type de
présentation a récemment été décrit et correspond à la présentation de complexe CMH/peptide
du donneur par les CPA du receveur (présentation semi-directe), (Figure 20). Ces voies de
présentations ne sont pas mutuellement exclusives. Elles peuvent être toutes trois impliquées
simultanément ou à des temps différents.
a. La présentation directe des alloantigènes
Dans la semaine suivant la greffe, les CPA contenues dans le greffon migrent au
niveau des ganglions lymphatiques drainant où elles activent les cellules T allogéniques du
receveur selon un mode de présentation qualifié d'alloreconnaissance directe. Cette
alloreconnaissance implique une interaction directe entre le TCR et la molécule de CMH
intacte exprimée par la CPA du donneur. De nombreuses observations ont mis en évidence
l’importance de cette voie de reconnaissance. In vitro, les lymphocytes T prolifèrent
intensément face à des CPA allogéniques irradiées et la prolifération des lymphocytes T n’est
pas affectée par la déplétion des CPA syngéniques. En revanche, l’élimination des CPA
allogéniques altère profondément cette réponse (403). De plus, différentes équipes ont montré
que la déplétion des CPA de l’organe greffé conduisait à une meilleure survie du greffon et le
rejet est restauré par injection de CPA provenant du donneur (403-405). De même, lors d'une
greffe de moelle osseuse, la GvHD peut être prévenue par l'inactivation des CPA de l'hôte
(406). Enfin, l’importance de la présentation directe a clairement été mise en évidence dans
un modèle d’allogreffe cardiaque chez la souris, où le transfert de lymphocytes T CD4
78
syngéniques chez des receveurs RAG-/- et n’exprimant pas les molécules du CMH-II conduit
au rejet de cœur allogénique seulement si ce cœur provient de souris qui expriment le CMH-II
(407).
Il apparaît que la voie directe de l'alloreconnaissance génère une réponse
lymphocytaire T intense chez le receveur, associée à un rejet aigu du greffon. Cependant, ces
réponses alloréactives directes diminuent avec le temps. Les cellules dendritiques du greffon
ne se renouvellent pas et sont donc peu à peu éliminées après la transplantation. Ainsi, en
l'absence de stimulation, la fréquence des cellules T ayant des spécificités de réponse directe
contre le donneur décline avec le temps (408). Ce déclin est observé aussi bien chez des
patients montrant des signes de rejet chronique, que chez des patients ayant accepté la greffe.
Ces résultats suggèrent donc que la voie directe de l'alloreconnaissance n'est pas essentielle au
rejet chronique (409).
L'alloreconnaissance par la voie directe se heurte aux lois de restriction du TCR aux
molécules du CMH du soi. De plus, une des caractéristiques de l’alloréactivité est la
fréquence élevée de précurseurs de lymphocytes T capables de reconnaître des molécules du
CMH allogéniques. Cette fréquence est de 1 à 10% soit 100 à 1000 fois plus élevée que la
fréquence des précurseurs spécifiques d'un antigène conventionnel (410). Cette différence de
fréquence de précurseurs suggère une dégénérescence du TCR. Plusieurs modèles ont ainsi
été proposés (411) :
•
Le TCR pourrait directement interagir avec les résidus polymorphes des molécules du
CMH allogéniques indépendamment du peptide présenté. La taille du répertoire alloréactif
pourrait alors être la conséquence de la forte densité de complexes immunogènes exprimés
sur la CPA allogénique (412). Cette forte densité antigénique permettrait de recruter un plus
grand nombre de lymphocytes T ayant des TCR d'affinités variables. En accord avec cette
hypothèse, il a été montré qu’un même clone alloréactif pouvait reconnaître différents
peptides présentés par la même molécule de CMH (413).
•
D’autres modèles proposent que le peptide jouerait une rôle central dans la
reconnaissance des CMH allogéniques par le TCR (414). Une seule molécule de CMH
pourrait alors fixer un grand nombre de peptides différents de ceux présentés par le CMH du
soi ou bien des peptides du soi dans une conformation différente. Par conséquent, de
nombreux clones T différents seraient recrutés en réponse à un CMH allogénique. L'analyse
structurale par cristallographie d’un TCR alloréactif a permis de montrer que les lymphocytes
T pouvaient interagir avec le complexe peptide/CMH du soi ou le complexe CMH/peptide
79
allogénique par réaction croisée (415). Ces résultats sont plutôt en faveur d’une
reconnaissance du peptide. Récemment, Felix et al. ont montré qu’un seul TCR pouvait
interagir avec plusieurs complexe CMH/peptide avec des orientations différentes selon le
peptide lié, mais toujours avec une spécificité à la fois pour le peptide et le CMH suggérant
une polyspécificité du TCR plutôt qu’une dégénérescence (411, 416).
Obst et al. ont réconcilié ces 2 modèles en montrant que la reconnaissance allogénique
dépend des similarités et/ou des différences de séquences entre les molécules du CMH du
donneur et celles du receveur au niveau du site de liaison avec le TCR (417). Lorsque les
molécules du CMH du donneur et du receveur sont proches, le lymphocyte T reconnaît et
réagit surtout avec le peptide endogène présenté. En revanche, plus les molécules de CMH
sont structurellement éloignées plus l’interaction entre lymphocytes T alloréactifs et la CPA
sera à dominance CMH.
b. La présentation indirecte des alloantigènes
La voie indirecte de l'alloreconnaissance implique la présentation de peptides dérivés
des molécules du CMH ou des antigènes mineurs d'histocompatibilité du donneur, par les
molécules du CMH-II (selon la voie exogène), ou par les molécules du CMH-I (selon la
présentation croisée), exprimées à la surface des CPA du receveur (418, 419). Ce mécanisme
de rejet de greffe a été proposé, il y a plus de 20 ans, lorsque Lechler et al. ont observé qu’un
rein complètement allogénique de rats de souche AUG était lentement rejeté chez un receveur
de souche AS même après déplétion des CPA (404). Une démonstration plus formelle a été
apportée dans un modèle murin où une greffe allogénique de peau issue d'un donneur CMH-II
invalidé, est réalisée chez une souris receveuse dépourvue de lymphocytes T CD8 (CMH-I
invalidé) (420). Les lymphocytes T CD4 qui induisent le rejet de la greffe, sont alors
uniquement activés par les CPA du receveur, car les CPA contenues dans le greffon
n'expriment pas les molécules de CMH-II. En dépit de l’absence de réponse directe, toutes les
greffes de peau sont rejetées. Différents processus peuvent être impliqués dans la
reconnaissance indirecte. Les DC du receveur qui circulent en permanence dans l'organe
transplanté, peuvent endocyter les alloantigènes localement dans le greffon, puis migrer vers
les organes lymphoïdes. Il a été également suggéré que les alloantigènes peuvent être captés et
apprêtés sur les molécules du CMH-I, selon la présentation croisée, par les cellules
endothéliales vasculaires du receveur, adjacentes au greffon (421, 422). Les lymphocytes T
CD8 effecteurs activés, reconnaissent ce complexe CMH-I receveur/allopeptide, et détruisent
80
l'endothélium vascularisant le greffon
Si cette voie ne paraît pas essentielle au rejet aiguë, elle semble en revanche
importante pour le rejet chronique (409). Valujskikh et al. ont démontré dans un modèle
d’allogreffe de peau chez la souris que la reconnaissance d’un seul peptide allogénique
présenté dans le contexte du CMH du soi est suffisante pour induire le rejet dont les lésions
sont caractéristiques des lésions observées lors d'un rejet chronique (423). D’autre part, une
étude a démontré que des patients ayant dans leur sang des cellules T activées par présentation
indirecte développent de nombreux signes de rejet chronique (424).
c. La présentation semi directe
Herrera et al. ont identifié une nouvelle voie de présentation : la présentation semidirecte. Ce groupe a pu montrer que les DC ont la capacité d’acquérir des molécules intactes
de CMH de classe I et II provenant d’autres cellules dendritiques ou de cellules endothéliales
et d’activer efficacement des lymphocytes T (425). Cette voie permet la présentation à la fois
du complexe intact CMH/peptide du donneur et du CMH du soi présentant un peptide du
donneur, par une même cellule. Ceci permet aux lymphocytes T CD8 avec une allospécificité
directe de recevoir l’aide de lymphocyte T CD4 qui ont une allospécificité indirecte.
L’acquisition de telles molécules semble se faire par contact cellulaire (426) ou via le
relargage puis la capture d’exosomes (427, 428). Récemment, Peche et al. ont montré que
l’administration de tels exosomes (possédant le CMH/peptide du donneur) induit la tolérance
d’une allogreffe cardiaque chez le rat (429). Cependant, le rôle exact de la présentation semidirecte dans le processus de rejet reste encore à éclaircir.
2.3. Mécanismes effecteurs du rejet de greffe allogénique
a. initiation du rejet
Les étapes d’ischémie et de préservation de l’organe en condition hypothermique qui
ont lieu lors du prélèvement de l’organe jusqu’au moment de la greffe, privent les tissus
d’oxygène et de nutriments et provoquent l’accumulation de métabolites toxiques (430). Ce
phénomène est amplifié lorsque les organes proviennent de donneurs cadavériques. Wihelm et
81
al. ont détecté une augmentation de médiateurs pro-inflammatoires (cytokines, chimiokines
ou molécules d’adhésion) lors de greffes cardiaques provenant de donneurs cadavériques
conduisant à une accélération du rejet (431). La reperfusion de l’organe déjà endommagé
augmente ce phénomène d’inflammation. Ces étapes génèrent en effet des quantités
importantes de radicaux oxygénés et de métabolites cytotoxiques (430). Ceci conduit à une
altération sévère des tissus et à l’initiation de l’alloréponse. Cette inflammation créée par ces
phénomènes d’ischémie/reperfusion semble suffisante pour entraîner la maturation des
cellules dendritiques qui sont les principales CPA impliquées dans l’initiation du rejet de
greffe (432). De plus, il a été montré que les lésions tissulaires liées à l’ischémie et à la
reperfusion sont dépendantes de cellules exprimant le TLR4 et à l’induction locale de
cytokines proinflammatoires et de chimiokines (433). Immédiatement après la greffe, les DC
du donneur vont migrer vers les ganglions lymphatiques et la rate du receveur (434). Les
ARN messagers (ARNm) des cytokines promouvant la maturation des DC et leur migration
comme l’IL-1ß et le TNF-α sont augmentés lors d’allogreffe de cornés dès les premiers jours
suivant la greffe et cette augmentation est aussi observée lors de greffe syngénique (435).
Ceci indique que les dommages observés sont apparus avant la greffe. Les DC du receveur,
elles, migrent vers le greffon. En effet, ces étapes d’inflammation vont augmenter
l’immunogénicité du greffon. Des études réalisées sur le foie, le cerveau, le myocarde et les
reins ont montré que l’expression d’ICAM1 et VCAM1 est augmentée à la surface des
cellules endothéliales lors des étapes d’ischémie/reperfusion (436, 437). Ces deux molécules
jouent un rôle crucial dans le recrutement des leucocytes dans les tissus. Les DC du donneurs
capturent alors les alloantigènes et recirculent vers les organes lymphoïdes secondaires. Une
fois dans les organes lymphoïdes secondaires, les DC du donneur et/ou du receveur vont
présenter les alloantigènes aux lymphocytes T CD4+ du receveur et les activer (Figure 21).
L’importance des organes lymphoïdes secondaires dans le rejet de greffe a été mise en
évidence par Lakkis et al. qui ont montré qu’un receveur dépourvu d’organes lymphoïdes
secondaires accepte spontanément une allogreffe (438). Les cellules endothéliales d’un
greffon vascularisé peuvent ainsi jouer un rôle important dans le rejet de greffe en activant
directement les lymphocytes T (439).
b. Les lymphocytes T alloréactifs
Après avoir été activés dans les organes lymphoïdes secondaires, les lymphocytes T
alloréactifs migrent vers le greffon. L’inflammation créée par l’ischémie/reperfusion
82
Figure 21. Mécanismes cellulaires de la réponse alloréactive.
a. Les CPA du receveur infiltrant le greffon ainsi que les CPA du donneur vont migrer vers
les ganglions lymphatiques où elles vont activer les lymphocytes T par les différentes voies
reconnaissances. b. Les lymphocytes T CD4 activés vont aider les lymphocytes T CD8
cytotoxiques et peuvent aussi provoquer une réaction d’hypersensibilité retardée (DTH)
médiée par les macrophages activés par la sécrétion d’IFN-γ. Les lymphocytes T CD4
peuvent aussi entraîner la lyse directe via FasL. L’inflammation induite par les éosinophiles,
conséquence d’une réponse de type Th2, va aussi endommager le greffon. Les lymphocytes
Th17 vont recruter les neutrophiles qui vont sécréter des radicaux libres oxygénés et des
enzymes lytiques. Adapté de Lechler RI et al. (440).
83
augmente la sécrétion de chimiokines par les cellules du greffon. Ceci va attirer des
neutrophiles, des macrophages et des cellules NK au niveau de la greffe, qui vont à leur tour
sécréter des chimiokines. Toutes ces chimiokines attirent alors les lymphocytes T activés
(Figure 21).
Les lymphocytes T CD4
Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle essentiel dans le rejet de greffe. En effet, des greffes
cardiaques ou des greffes de peaux allogéniques sont acceptées de façon permanente chez un
receveur déficient en lymphocytes T CD4 (441). De plus, le seul transfert de lymphocytes T
CD4, un jour avant la greffe, est suffisant pour induire le rejet du greffon. Une fois activés les
lymphocytes T CD4 peuvent se différencier en cellules Th1, Th2 ou Th17.
Dans le cadre du rejet de greffe, la différenciation des lymphocytes T CD4 en Th1
entraîne la différenciation des T CD8 en CTL ainsi qu’une réaction d’hypersensibilité retardée
(DTH) avec activation des macrophages et production d’anticorps IgG2a, immunoglobulines
capable de fixer le complément (Figure 21). La DTH est caractérisée par un œdème consécutif
à l’augmentation de la perméabilité membranaire ainsi qu’à l’infiltration massive du tissu par
des lymphocytes T, des macrophages et des neutrophiles (442). Ces cellules sécrétent des
cytokines telles que l’IFN-γ et le TNF-α qui vont participer à l’activation des macrophages
qui à leur tour produisent du monoxyde d’azote, des radicaux oxygénés et du TNF-α. Le NO,
métabolite d’azote très réactif, est toxique à haute concentration et entraîne une vasodilatation
et un œdème caractéristiques de la DTH. Il a été montré que l’inhibition de la synthèse du NO
prolongeait significativement la survie du greffon (443). Le TNF-α s’associe à son récepteur
et entraîner l’apoptose ou la nécrose des cellules cibles via l’activation de la voie des
caspases. Les neutrophiles vont sécréter l’enzyme MPO qui convertit le H202 produit suite au
burst oxydatif en produits très toxiques pour les cellules (444). Les études cliniques mettent
en évidence l’importance de la DTH dans le rejet de greffe allogénique (445, 446). Différents
groupes ont appuyé cette idée à l’aide de modèles expérimentaux. Tout d’abord les
macrophages sont souvent présents dans les infiltrats leucocytaires des greffes rejetées (423,
447). De plus, l’implication directe des Th1 dans le rejet a été montrée par différents groupes,
par l’injection de lymphocytes Th1 chez des souris immunodéprimées (444, 448, 449). Le
transfert de cellules est suffisant pour induire le rejet de greffe caractérisé par une infiltration
cellulaire de macrophages et de lymphocytes T. Ceci est associé à une forte proportion
d’ARNm du TNF-α. Chez l’Homme, une augmentation des ARNm de T-bet, facteur de
84
transcription spécifique des lymphocytes Th1 est observée lors de rejet aigu de rein (450). De
plus, les Th1 peuvent également exercer une activité cytotoxique par les systèmes
perforine/granzyme ou Fas/Fas-L (451, 452). Ces mécanismes ont aussi été montré dans le
cadre d’alloréactivité, in vitro face à des cibles allogéniques (151, 453). Lors de greffe peau,
les greffons provenant de donneurs déficients pour Fas sont moins vite rejetés (454).
Quant à l’IFN-γ, cytokine Th1, il joue un rôle paradoxal dans le rejet de greffe. D’une
part, il favorise l’inflammation du greffon en favorisant la réponse Th1 et d’autre part il
semble aussi jouer un rôle régulateur du rejet. En effet, plusieurs groupes ont montré que
l’IFN-γ est indispensable à la tolérance du greffon, réduisant l’hémorragie et la nécrose (455),
(456). L’IFN-γ semble prévenir la destruction du greffon médiée par la voie
perforine/granzyme et l’expression des molécules de CMH-I par le greffon est indispensable
dans cette protection (457). Sawitzki et al. ont montré que chez des souris déficientes pour
l’IFN-γ les capacités régulatrices des lymphocytes Treg alloréactifs étaient fortement altérées
et ces derniers ne sont plus capables de contrôler le rejet de greffe de peau (456). De plus,
l’IFN-γ induit une augmentation de l’expression de Foxp3 par les lymphocytes T CD4 naïfs
cultivés en présence de CPA allogéniques et lorsque ces cellules prétraitées à l’IFN-γ sont
injectées à des souris, elles sont capables d’inhiber le rejet de greffe de peau allogénique
(458).
Initialement, les lymphocytes Th1 étaient considérés comme les principales cellules
effectrices du rejet d’allogreffe alors que les lymphocytes Th2 étaient décrits comme cellules
régulatrices du rejet (459). Cependant, différents groupes ont montré, dans des modèles
murins de greffe allogénique de peau, cardiaque ou de vaisseaux, que les cytokines Th2 telles
que l’IL-4 et l’IL-5 sont responsables à la fois du rejet de greffe aigu et chronique (448, 460462). Les premières expériences suggérant un rôle pour les Th2 dans l’induction du rejet
d’allogreffe proviennent de modèles murins où la polarisation Th2 est entraînée par la
déplétion des lymphocytes T CD8 ou par des antagonistes de l’IL-12. En effet, chez des
souris dont les lymphocytes T CD8 ont été éliminés, le rejet aigu a été associé à une
augmentation de la production locale d’IL-4 et d’IL-5 avec une infiltration d’éosinophiles
(463). Ces résultats ont aussi été obtenus lors d’allogreffe chez un receveur CMH-I
compatible ou déficient en lymphocytes T CD8 (448, 461). De même, le blocage de la voie
Th1 avec un antagoniste de l’IL-12 n’est pas capable de prévenir le rejet, et une infiltration
massive d’éosinophiles ainsi que des ARNm de l’IL-4, l’IL-5 dans le greffon rejeté ont pu
être observés (464). Wang et al. ont montré que chez différentes souches de souris, une
85
déviation de la réponse immune vers un phénotype Th1 ou Th2 est associée à un rejet de
greffe mais avec des caractéristiques différentes (465). Les souches génétiquement
prédisposées à développer une réponse Th2 font un rejet aigu avec un fort dépôt d’ IgG antidonneur avec une prédominance d’IgG1.
La preuve directe de l’implication des Th2 dans le rejet de greffe a été apportée par
différents groupes qui ont montré que le transfert de lymphocytes T CD4 polarisés en Th2 ou
de clones Th2 différenciés in vitro ou encore de clones Th2, chez des souris
immunodéficientes induit le rejet de greffe cardiaque, de peau ou d’îlots de pancréas (448,
460, 462) et ce aussi efficacement que les Th1 (449). Des souris doublement invalidées pour
l’IL-2 et IFN-γ rejettent rapidement une greffe de cœur allogénique et ce rejet est caractérisé
par une augmentation des IgG1 par rapport aux IgG2a et la présence de cytokines de type 2 à
l’intérieur de la greffe (466).
Les lymphocytes Th2 peuvent aussi entraîner le rejet de greffe via l’activation des
éosinophiles (Figure 21). De nombreux modèles ont mis en évidence le rôle des éosinophiles
dans le rejet de greffe médié par les Th2 (467). En effet, au niveau histologique, le rejet médié
par les Th2 est caractérisé par une infiltration d’éosinophiles au niveau du greffon (460, 461,
468). De telles observations ont été relevées aussi chez l’Homme où des infiltrats
d’éosinophiles sont constatés dans les biopsies de transplants en cours de rejet, lors de greffes
hépatique, rénale, ou cardiaque (469-471). De plus, il a été montré, chez la souris, que la
neutralisation de l’IL-4 ou de l’IL-5 ou la déplétion des neutrophiles prévient cette infiltration
d’éosinophile et le rejet (454, 461, 472, 473). Les éosinophiles sont recrutés dans la greffe par
l’IL-4, l’IL-5 et l’IL-13 produites par les Th2. En effet, l’IL-4 et l’IL-13 vont faire augmenter
l’expression de VCAM-1 sur les cellules endothéliales. VCAM-1 interagit avec VLA-4
exprimés par les neutrophiles et permet l’adhésion de ces cellules (474, 475). Ces cytokines
augmentent aussi le recrutement tissulaire des éosinophiles en accroissant la production
d’éotaxine notamment par les cellules endothéliales (476, 477). L’IL-5 et l’éotaxine vont
ensuite recruter et activer les éosinophiles dans le tissu enflammé (478). Les éosinophiles
activés relarguent alors des substances nocives qui créent des pores membranaires sur les
cellules cibles ainsi que des dommages oxydatifs sur les protéines tissulaires (479).
Les Th17 semblent aussi jouer un rôle dans le rejet de greffe allogénique. Des études
ont montré que des antagonistes de l’IL-17 retardent significativement le rejet de greffe (480,
481). Cependant, ces antagonistes de l’IL-17 semblent protéger du rejet aigu mais pas du rejet
chronique (482). Chez l’Homme, quelques études reportent une association entre l’IL-17 et le
rejet. En effet, de l’IL-17 est détectée chez des patients présentant un rejet aigu (483-485). De
86
plus, il a été montré que les souris Tbet-/- rejettent leur greffon plus rapidement dans un
modèle de vasculopathie chronique d’allogreffe et on observe chez ces souris un « switch »
vers une réponse Th2 et Th17 (486). La neutralisation de l’IL-17 dans ce modèle inhibe cette
accélération du rejet. Ces résultats montrent qu’en l’absence de réponse allogénique Th1, les
Th17 médient une réponse proinflammatoire agressive dans le cadre du rejet de greffe et des
vasculopathies chroniques de greffe. Des cellules différenciées in vitro en Th17 sont capables
d’induire une GvHD létale caractérisée par des lésions cutanées et pulmonaires (487). Cet
effet semble médié par le TNF-α. De façon surprenante, l’ajout d’anticorps anti-IL-17
n’améliore pas la GvHD dans ce modèle. Le rôle pathogène de l’IL-17 pourrait s’expliquer
par sa capacité à recruter les neutrophiles au site du greffon (Figure 21). En effet, les
neutrophiles, qui sont rapidement recrutés par la voie IL-17/IL-23, ont largement été décrits
dans le rejet d’allogreffe chez l’homme et dans des modèles expérimentaux. Chez l’Homme,
l’infiltration de neutrophiles est fréquemment observée dans les biopsies de greffe rejetées et
une corrélation a été établie entre le degré d’infiltration des neutrophiles et la sévérité du rejet
(488). Chez la souris, la déplétion des neutrophiles retarde l’apparition du rejet lors de greffe
de peau (472) ou de greffe cardiaque (489).
Cependant, des données récentes suggèrent que le rôle des Th17 dans l’alloréactivité
est un peu plus complexe. En effet, l’injection de lymphocytes T CD4 IL-17-/- dans un
modèle de greffe de moelle osseuse chez des receveurs sauvages retarde légèrement
l’apparition de la GvHD , mais la mortalité générale n’est pas affectée. Ces souris présentent
une diminution des macrophages et de granulocytes sécréteurs d’IFN-γ ainsi qu’une
diminution des cytokines proinflammatoire IL-4 et IL-6. Il semblerait donc que les Th17 ne
soit pas importants dans le développement de la GvHD mais contribuent a son développement
précoce en promouvant la production de cytokine proinflammatoire.(490). Dans un modèle de
GvHD murins, il a été montré que des cellules T CD4 IL-17-/- du donneur se différencient en
Th1 avec une augmentation de la production d’IFN-γ et induisent une GvHD aiguë exacerbée.
Lorsque l’IFN-γ est neutralisé chez ces souris, la GvHD est retardée. Ces résultats indiquent
que les Th17 du donneur peuvent inhiber la différenciation Th1 et améliorer la GvHD aiguë
chez des receveurs allogéniques (152).
Les lymphocytes T CD8
La génération de CTL est un mécanisme effecteur majeur dans le rejet de greffe. Le
rôle des CTL a longtemps été un thème populaire en recherche sur la transplantation. Par
87
exemple, Rosemberg et al. ont montré que le transfert adoptif de lymphocytes T CD8
effecteurs est suffisant pour induire le rejet de peau incompatible pour le CMH-I chez la
souris (491). Une autre étude, dans un modèle de greffe de peau, montre un retard dans le
rejet lorsque les lymphocytes T CD8 sont absents (444). De plus, d’autres modèles murins
d’allogreffes de peaux ont montré que la déplétion de lymphocytes T CD4 ne suffisait pas à
empêcher le rejet (492, 493). Un rôle important a donc été attribué aux lymphocytes T CD8.
Par contre, Krieger et al. ont montré que des greffes de peau chez des souris CD8-/- sont
rejetées avec la même cinétique que chez des souris sauvages (441) montrant ainsi que les
lymphocytes T CD8 ne sont pas nécessaires pour initier le rejet du greffon. Aujourd’hui, il
semble clair que les lymphocytes T CD8 cytotoxiques jouent un rôle clé dans le rejet d’organe
(Figure 21).
Les CTL sont activés par la reconnaissance du CMH-I du donneur mais ces molécules
de CMH sont aussi la cible des effecteurs cytotoxiques matures. L’hypothèse dominante serait
que les lymphocytes T CD8 seraient activés par la présentation directe d’antigènes du
donneur par les CPA provenant du greffon (494). Bien que les CPA du donneur soient les
principales cellules impliquées dans l’induction des CTL, Kreiser et al. ont reporté un
nouveau mécanisme de présentation directe des alloantigènes par les cellules endothéliales
vasculaires activées du donneur (439, 495). Cette voie peut induire un phénotype effecteur
suffisant pour causer le rejet de greffe.
Bien que des études aient montré, à l’aide de souris déficientes pour la perforine ou
Fas ou les deux, l’importance de la voie perforine/granzyme et Fas/Fas-L dans la cytotoxicité,
des études suggèrent un rôle dominant de la voie perforine/granzyme dans l’induction de
l’apoptose dans le rejet de greffe (496). De plus, l’expression de Fas et Fas-L peut-être
détectée chez l’Homme dans les greffes rejetées mais leur présence n’est pas spécifique du
rejet (497, 498). Krupnick et al. ont montré in vitro que la mort cellulaire de cellules
endothéliales vasculaires déficientes pour Fas et FasL induite par les CTL n’est pas affectée
(496). De même, lorsque des lymphocytes T infiltrant la greffe rénale humaine subissant un
rejet sont incubés en présence de concanamycine A, un inhibiteur de la voie
perforine/granzyme, la lyse et l’apoptose des cellules épithéliales tubulaires proximales sont
fortement réduites. En revanche, l’incubation avec un inhibiteur de Fas ne diminue pas la
mort cellulaire (499). A l’inverse, des études montrent que le rejet peut arriver en absence de
perforine (500). Dimaond et Gill ont montré à l’aide de transfert adoptif de lymphocytes T
CD8 chez des souris immunodéprimées que le rejet de greffe d’îlots pancréatiques ne
dépendait pas de la perforine ni de FasL. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les
granzymes peuvent entrer dans la cellule cible par un mécanisme indépendant de la perforine
88
tel que le récepteur au mannose-6-phosphate cation indépendant. En effet, le blocage de la
capture de granzyme B par ce récepteur prévient l’apoptose. Lorsqu’il est injecté à des souris
sous la capsule rénale, il prévient le rejet (501).
Ces molécules qui confèrent des propriétés cytotoxiques sont généralement
considérées comme inductrices du rejet mais il a été montré que dans certaines conditions
elles peuvent jouer un rôle protecteur. Par exemple, il a été suggéré que la perforine provenant
des cellules du donneur peut réguler la réponse alloréactive en induisant l’apoptose des
cellules du receveur (502). De même, il a été montré que l’expression de Fas-L confère une
protection du greffon en induisant l’apoptose via Fas des cellules effectrices du receveur (503,
504).
89
OBJECTIFS
Chez le rat, l’intensité d’expression membranaire de la tyrosine phosphatase CD45RC,
permet de définir deux sous-populations lymphocytaires T CD4 et T CD8 fonctionnellement
distinctes. Les lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RChigh sont responsables du
développement de pathologies auto-immunes (wasting disease et thyroïdite) et de réponse
alloréactive pathogène (GvHD aiguë et chronique). Par contre, les lymphocytes T CD4 et
CD8 CD45RClow possèdent des propriétés différentes puisqu’ils sont capables de réguler ces
pathologies.
L’objectif de ma thèse a été d’étudier si, chez l’Homme, le niveau d’expression de
CD45RC permettait aussi de définir des sous-populations fonctionnellement distinctes au sein
des lymphocytes T CD4 et CD8; et d’analyser l’implication de ses sous-populations dans les
pathologies humaines.
Dans un premier temps, nous avons analysé le profil d’expression de la molécule
CD45RC au sein de la population T CD4 et CD8 d’individus sains. Afin de déterminer les
propriétés fonctionnelles de ces sous-populations, nous avons étudié, la prolifération de ces
sous-populations et la sécrétion de cytokines induite en réponse à une stimulation polyclonale.
Une analyse de l’expression de marqueurs de différenciation et de cellules régulatrices a
permis de mieux caractériser ces sous-populations. Les différences fonctionnelles observées
nous ont poussé à étudier l’implication de ces sous-populations dans le développement de
maladies auto-immunes. Du fait des cytokines impliquées, nous nous sommes intéressés plus
particulièrement aux vascularites à ANCA. Nous avons pour cela analysé le profil
d’expression de CD45RC sur une cohorte de patients atteints de cette pathologie.
Par la suite, nous avons étudié les propriétés alloréactives de ces cellules en analysant
leur prolifération et leur profil de production de cytokines après stimulation allogénique. Étant
donné la grande hétérogénéité inter-individuelle d’expression de CD45RC observé et les
différences d’alloréactivité de ces sous-populations nous nous sommes interrogés sur la
capacité de CD45RC à servir de marqueur pour prédire le développement d’une pathologie
alloréactive qu’est le rejet de greffe allogénique. Dans cet objectif, nous avons analysé le
profil d’expression de CD45RC chez des patients avant transplantation rénale et le suivi de
ces patients sur une période de 2 à 8 ans après la greffe nous a permis d’étudier les capacités
prédictives de ce marqueur.
90
RESULTATS
I.
LE NIVEAU D’EXPRESSION DE CD45RC PERMET D’IDENTIFIER
DES SOUS-POPULATIONS T FONCTIONNELLEMENT DISTINCTES
DONT LA DISTRIBUTION VARIE ENTRE DES INDIVIDUS SAINS
ET DES PATIENTS ATTEINTS DE VASCULARITES À ANCA.
Le niveau d'expression de CD45RC permet de définir des sous-populations différentes
au sein des lymphocytes T humains : les sous-populations CD45RChigh et CD45RClow, parmi
les lymphocytes T CD4 et les sous-populations CD45RChigh, CD45RClow et CD45RCint parmi
les lymphocytes T CD8. L’analyse en cytométrie en flux, montre que la proportion des ces
sous-populations au sein des lymphocytes T CD4 et T CD8 humains, est variable entre les
individus et reste stable au cours du temps. Cette variabilité est indépendante de l'âge ou du
sexe de l'individu.
La caractérisation phénotypique montrent que ces sous-populations sont hétérogènes.
Les lymphocytes T CD4 et CD8 CD45RChigh contiennent en majorité des cellules naïves
(CD45RA+CD45RO-CCR7+) et quelques cellules de phénotype TEMRA (CD45RA+
CD45R0+). Les lymphocytes T CD4 et CD8 CD45RClow contiennent des cellules mémoires
centrales, mémoires effectrices et des TEMRA. Quant à la sous-population CD8 CD45RCint, elle
est composée essentiellement des cellules TEMRA. De plus, les cellules exprimant le marqueur
des cellules régulatrices Foxp3 sont contenues dans les sous-populations T CD4 et CD8
CD45RClow.
In vitro, la stimulation polyclonale avec des anticorps anti-CD3ε et anti-CD28, révèle
que les sous-populations CD45RC prolifèrent de façon équivalente mais possèdent des profils
de sécrétion de cytokines différents. Les cellules T CD4 et CD8 CD45RChigh produisent
préférentiellement des cytokines de type-1 (IFN-γ et TNF-α), alors que les cytokines de type2 (IL-4 et IL-5), régulatrice (IL-10) ainsi que la cytokine proinflammatoire IL-17 sont
essentiellement sécrétées par la sous-population T CD4 CD45RClow. La sous-population T
CD8 CD45RCint produit de grande quantité de cytokines de type 1 et de faible quantité d’IL-4,
d’IL-5, d’IL-10 et d’IL-17.
Lorsque nous avons étudié la proportion de ces sous-populations chez des patients
atteints de vascularites à ANCA, nous avons pu observer que ces patients possédaient une
plus grande proportion de lymphocytes T CD4 CD45RClow que des individus sains ou atteints
de lupus érythémateux. Étant donné que cette augmentation est stable dans le temps,
91
indépendante du type d’AAV, de la spécificité des ANCA (anti-MPO ou anti-PR3), de la
durée de la maladie ainsi que du nombre de rechutes, nous pouvons supposer que ce
déséquilibre entre les sous-populations T CD4 CD45RChigh et CD45RClow est un phénomène
précédant la maladie et pourrait donc être impliqué dans l’étiologie des AAV.
92
CD45RC T Cell Subsets in AAV
CD45RClow T cell subset [25]. Importantly, this difference in the
proportion of CD45RChigh and CD45RClow T cell subsets is
genetically controlled by the same chromosomal regions that have
been shown to influence the susceptibility to immune mediated
disorders [22,23,25,30]. Based on these experimental findings,
suggesting that the imbalance between CD45RChigh and
CD45RClow T cell populations contributes to the susceptibility
to vasculitis, we examined the distribution and function of the
CD45RC subsets in healthy individuals and AAV patients.
In the present study, we show that CD45RC subsets within the
CD4 and CD8 T cell compartments exhibit different cytokine
profiles, and that their relative proportion is variable from one
individual to another. Interestingly, the proportion of CD45RClow
CD4 T cells is strongly increased in AAV patients as compared to
healthy controls and patients with systemic lupus erythematosus
(SLE). Since this increase is not associated with disease subtype,
disease duration or number of relapses, we hypothesize that the
observed imbalance between CD45RChigh and CD45RClow T cell
subsets is a pre-existing phenomenon that may be involved in the
etiology of AAV.
Antibodies
FITC-, PE-, PE-Cyan5, PE-Cyan7,Alexa 700, Pacific Blue,
APC or biotin-conjugated anti-CD4 (RPA-T4), anti-CD8 (RPAT8), anti-TCRab (BW242/412), anti-HLA-DR (LN3), anti-CD25
(4E3), anti-CD28 (CD28.2), anti-CD69 (FN50), anti-CD45RA
(HI100), anti-CD45RB (MT4), anti-CD45RC (MT2), antiCD45R0 (UCHL1), anti-CCR7 (3D12), anti-Foxp3 (PCH101),
anti-IL-4 (4D9), anti-IL-10 (JES3-9D7) and anti-IFN-c (25723.11)
mAbs as well APC or PC7-streptavidin and biotinylated MARG2a were purchased from BD Biosciences (San José, CA), R&D
Systems (Minneapolis, MN), IQ Product (Groningen, The
Netherlands), Miltenyi (Bergisch Gladbach, Germany), Beckman
Coulter (Fulletron, CA) or eBioscience (San Diego, CA).
Flow cytometry analysis
For immunofluorescence staining, 106 cells were incubated with
mAbs for 20 min at 4uC. After washing with phosphate buffered
saline (PBS) containing 5% fetal calf serum (FCS) the biotinlabeled cells were incubated with streptavidin-coupled PC7 for 20
min at 4uC, washed twice with PBS/5% FCS. Foxp3 intracellular
expression was detected using APC anti-human Foxp3 Staining
Set from eBioscience, according to their standard protocol. Data
were collected either on a FACS-Calibur (BD Biosciences)
cytometer using the CELLQuestTM software (BD Biosciences)
for analysis or on a LSR-II (BD Biosciences) cytometer using the
DIVA software (BD Biosciences) for analysis.
Materials and Methods
Study population
For analysis of the distribution of CD45RC T cell subsets in
peripheral blood, patients were recruited via the outpatient clinic
of the Maastricht University Medical Centre (Maastricht, The
Netherlands). All AAV patients (n = 38; 21 men and 17 women;
median age 57 [range 32–75]) fulfilled the disease definitions as
proposed by the Chapel Hill Consensus Conference [31]. Only
patients with inactive disease, as evaluated by the Birmingham
Vasculitis Activity Score [32], were included. Characteristics of
AAV patients are presented in table 1. The SLE patients (n = 20; 4
men and 16 women; median age 40 years [range 22–64 years])
fulfilled the revised criteria of the American College of
Rheumatology [33] and had inactive disease at the time of
sampling. Patient’s spouses were recruited as control subjects
(n = 39; 17 men and 22 women; median age 55 years [25–70]).
Written informed consent was obtained from all subjects. They
were informed about the study and were enabled to ask further
information. All subjects had sufficient time to consider participation. This study was approved by the Medical Ethics Committee
of the University Hospital of Maastricht. For cytokine analysis on
CD45RC T cell subsets, PBMC were obtained from buffy coat
preparations from anonymous healthy donors, from the Purpan
university hospital blood bank (Toulouse, France).
T cell subsets purification
PBMCs were prepared by gradient centrifugation (MLS-Ficoll,
Eurobio, Les Ulis, France) of buffy coat. Monocytes were removed
by plastic adherence and CD4 and CD8 T cells were purified by
negative selection using CD4 or CD8 negative isolation kit (Dynal;
Oslo, Norway). The percentage of residual CD8 or CD4 T cells after
depletion was always less than 0.5 % and the remaining population
consisted of 95–98% CD4 or CD8 T cells and 2–5% CD4 CD8
double negative non T cells. The isolation of CD45RChigh and
CD45RClow CD4 T cell subsets was performed as follows: CD4 T
cells were stained with limiting amounts of FITC-conjugated antiCD45RC mAb and separated into CD45RChigh and CD45RClow
cells by positive selection after addition of anti-FITC MACS
microbeads (Miltenyi). The resulting purity was always more than
92% for CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cells. For cell sorting
experiments, purified CD4 T cells were stained with anti-CD4, antiCD45RC and anti-TCR mAbs and separated on a Coulter cell
sorter (Epics Altra; Beckman-Coulter, Fullerton, CA). The purity of
sorted CD45RChigh or CD45RClow CD4 T cell subsets was more
Table 1. Clinical characteristics of AAV* patients
Total AAV (n = 38)
WG (n = 24)
MPA (n = 6)
CSS (n = 4)
RLV (n = 4)
SLE (n = 20)
Gender (M/F)
21/17
12/12
5/1
2/2
2/2
16/4
Age, median (range) yrs
57 (32–75)
55 (32–75)
61 (56–75)
54 (45–60)
65 (58–75)
40 (22–64)
ANCA (PR3/MPO/none)
24/9/5
20/2/2
3/3/0
0/1/3
1/3/0
-
Disease duration, Median
(range) yrs
2.6 (0.6–16.3)
3.5 (0.9–16.3)
1.0 (0.6–4.0)
4.2 (0.9–9.4)
0.8 (0.6–1.7)
6 (0.7–28.1)
Renal involvement (+/2)
18/20
11/13
2/4
1/3
4/0
9/11
Relapses, median (range)
1.3 (0–5)
1.9 (0–5)
0 (0–0)
0.8 (0–2)
0 (0–0)
-
*
Abbreviations: AAV, ANCA-associated vasculitis; ANCA, anti-neutrophil cytoplasmic antibody; CSS, Churg-Strauss syndrome; MPA, microscopic polyangiitis; MPO,
myeloperoxidase; PR3, proteinase 3; RLV, renal-limited vasculitis; WG, Wegener’s granulomatosis.
doi:10.1371/journal.pone.0005287.t001
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April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
than 99 %. To purify CD45RAhigh and CD45RAlow CD4 T cell
subsets, the CD45RClow CD4 subpopulation, purified by magnetic
beads, were labeled with anti-CD45RA mAb and separated on a
Coulter cell sorter according to CD45RA expression. The purity of
sorted CD45RAhigh or CD45RAlow CD4 T cell subsets was more
than 99 %. Similar procedures were used for purification of CD4
CD45RB subpopulations within the CD45RClow subset. CD8
CD45RC T cell subsets were purified by cell sorting after labeling
purified CD8 T cells with anti-CD8, anti-CD45RC and anti-TCR
mAbs. The purity of sorted CD45RChigh , CD45RCint or
CD45RClow CD8 T cell subsets was more than 97 % .
CD45RCint: 51% and 17–71%; CD45RChigh: 25% and 9–77%).
These differences in the relative proportion of CD45RC subsets
within the CD4 (Fig. 1B, left panel) and CD8 (Fig. 1B, right panels)
T cells were not explained by differences in age. To assess intraindividual variation over time, the proportion of CD45RC T cell
subsets were reanalyzed after a period of 4 years in 11 individuals.
No significant changes in the proportion of CD45RC T cell subsets
were observed during this period except for the CD8 CD45RCint
subset (Fig. 1C). Finally, we showed that the observed heterogeneity
in the CD45RC subsets was not the result of different numbers of
activated T cells, since we found no correlation between the
proportion of CD45RC T cell subsets and the percentage of HLADR+ cells for CD4 T cells and CD8 T cells (data not shown). Also,
the absolute numbers of T cells and the CD4/CD8 T cell ratio were
not correlated with the proportion of CD45RC T cell subsets (data
not shown). Altogether, these data demonstrate that CD45RC
expression identifies different subsets of CD4 and CD8 T cells that
are differentially distributed between healthy individuals independently of age or size and activation state of the T cell compartment.
To identify the relation between the CD45RC phenotype and
naive T cells (CD45RA+RO2CCR7+), effector memory T cells
(CD45RA2RO+CCR72), central memory T cells (CD45RA2RO+CCR7+) and natural Treg (Foxp3+), we performed 6-color
staining flow cytometry. As shown in Fig. 2, the CD4 and CD8
CD45RC T cell subsets are heterogeneous. The majority of CD4
CD45RChigh cells are naive cells (87%; range 72–93) whereas the
CD4 CD45RClow subset contains central memory cells (median
36%; range 21–46), effector memory cells (median 19%; range 14–
26%) (Fig. 2A). Concerning the CD8 T cell compartment, the
CD45RChigh and CD45RCint subsets contain the majority of naive
cells (High: 66%; range 44–90; Int: 8% range 2–20) whereas the
CD45RClow subset contains the majority of memory cells (central
memory T cells: 10%; range 7–24, effector memory T cells: 22%;
range 17–34) (Fig. 2B). A significant proportion of CD4 and CD8
CD45RC T cell subsets contains two subpopulations with ill defined
functions i.e; CD45RA+CD45RO2CCR72 and CD45RA+CD45RO+. In addition, we found that the majority of Foxp3+ CD4
and CD8 T cells are contained in the CD45RClow subset (Fig. 2).
T cell stimulation and analysis of T cell proliferation and
cytokine production
The culture medium was RPMI 1640 (Gibco Life Technologies
Ltd, Cergy Pontoise, France) containing 5 % of human SAB (Biowest,
France), 1% sodium pyruvate, 1% non essential amino acids, 1% Lglutamine, 1% penicillin-streptomycin and 261025 M 2-mercaptoethanol. Highly purified CD45RC CD4 or CD8 T cell subsets (105 T
cells / well) were polyclonally stimulated in 96 well plates (Falcon,
Becton Dickinson) using bound anti-CD3e (TR66; kindly provided
by Dr Valitutti, Toulouse, France) and soluble anti-CD28 mAbs
(CD28.2, BD Biosciences). Proliferation was measured by 3Hthymidine uptake during the last 18 h of a 24, 48, 72 or 96 h culture
period. At various times throughout the culture, supernatants were
analyzed for cytokine production using CBA kit (BD Biosciences) or
ELISA for IL-17 (eBiosciences). Cytokine production was also
assessed by intracellular staining as described [34]. Briefly, CD4 or
CD8 T cell subsets were stimulated for 72 h with anti-CD3e plus antiCD28 mAbs, then activated with phorbol 12-myristate 13-acetate
(PMA) (20 ng/ml, Sigma) plus ionomycin (0.8 mg/ml, Sigma,) in the
presence of Monensin (2 mM, Sigma) for 4 h. Cells were harvested,
fixed with 2% paraformaldehyde (Fluka Chemie AG, Buchs,
Switzerland) and permeabilized with 0.5% saponin (Fluka). Cells
were incubated with FITC-labeled antibody to IFN-c (Beckman
Coulter), PE-labeled antibody to IL-4 or IL-10 (BD Biosciences
washed, and analyzed by flow cytometry on FACSCalibur or LSRII.
Statistical analysis
The proportion of CD45RC CD4 and CD8 T cell subsets is
differentially distributed between healthy individuals and
AAV patients
Data are presented as box plot. The Wilcoxon matched-pairs
test was used for intra-individual comparison. Linear regression
analysis was performed to assess associations between the age and
the proportion of CD45RC T cell subsets and to assess the
association between the relapse and the proportion of CD45RC T
cells subsets. The non-parametric Mann–Whitney U-test was used
to compare data from AAV patients, SLE patients and HCs. *,
p,0.05; **, p,0.02; p,0.002.
The analysis of CD45RC T cell subsets in the peripheral blood
of patients with AAV, all in clinical remission, revealed a strong
predominance of the CD45RClow subset within the CD4, but not
the CD8 T cell compartment (Fig. 3A). Interestingly, we did not
observe this increased proportion of CD45RClow CD4 T cells in
patients with SLE, another chronic systemic autoimmune disease
(Fig. 3A). The percentage of CD45RC CD4 T cells was not
different between patients with the distinct disease entities of AAV
(WG, MPA, CSS, and renal limited vasculitis), MPO2 or PR3ANCA, or number of relapses (Fig. 3B). Interestingly, the
proportion of CD4 CD45RClow subset was significantly higher
in AAV patients with renal involvement (Fig. 3B, right panel).
Finally, the observed increased proportion of the CD45RClow
CD4 T cells in AAV patients was not influenced by the duration of
the disease and was stable during 4 year follow-up (Fig. 3C).
Results
The proportion of CD45RC CD4 and CD8 T cell subsets is
highly variable in the human population
The analysis of CD45RC expression on human peripheral blood
CD4 T cells by flow cytometry revealed an heterogeneous
expression, allowing the definition of two subsets: CD45RChigh
and CD45RClow (Fig. 1A, left panel). In contrast, the CD45RC
expression level on human CD8 T cells revealed a more complex
pattern with usually three subsets: CD45RChigh, CD45RCint and
CD45RClow (Fig. 1A, right panel). We analyzed the relative
proportion of CD4 and CD8 CD45RC subsets in 39 healthy
individuals (22 women and 17 men, median age 56, range 26–71).
As shown in Figure 1, this proportion was very heterogeneous for
CD4 (median and range for CD45RClow: 57% and 37–77%) and
for CD8 (median and range for CD45RClow: 22% and 7–39%;
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The level of CD45RC expression identifies two subsets
within human CD4 T cells with differential cytokine
production
In order to characterize the function of CD45RChigh and
CD45RClow CD4 T cell subsets, we determined their cytokine
3
April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Figure 1. CD4 and CD8 CD45RC T cell subsets distribution in healthy individuals. Peripheral blood leukocytes from 39 healthy individuals
(median age 55, range 25–70) were stained with mAbs against CD3, CD4, CD8, CD45RC. (A) The histograms represent the CD45RC expression on CD4
T cells (left panel) and CD8 T cells (right panel) from two healthy individuals showing the inter-individual variability in CD45RC expression. (B) The
proportion of CD45RClow CD4 T cells (left panel) and the proportion of CD45RChigh-CD45RCint-CD45RClow CD8 T cells (right panels) are presented
according to age of the donors. Each dot represents a separate individual. The r- and p-values were calculated using linear regression. (C) Represent
the percentage of CD45RClow CD4 T cells (left panel) or the proportion of CD8 CD45RC T cell subsets (right panel) of 11 individuals at 4 years interval.
The p-values were calculated using the Wilcoxon matched-pairs test; *, p,0.05.
doi:10.1371/journal.pone.0005287.g001
contains both CD45RAhigh and CD45RAlow subsets (Fig. S1A,
S1B). After stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs, we
showed that purified CD45RClowCD45RAhigh CD4 T cells and
CD45RClowCD45RAlow CD4 T cells exhibited a similar pattern
of cytokine production as total CD45RClow CD4 T cell subsets
(Fig. S1C and S1D). Similar phenotypic and functional studies
were obtained when CD45RB was used instead of CD45RA (data
not shown). Since the CD45RAhigh (and CD45RBhigh) cells within
the CD45RClow subset produced IL-4, IL-5 IL-10 and IL-17, we
conclude that CD45RC expression is more reliable than CD45RA
(and CD45RB) expression to identify human CD4 T cells that are
responsible for type-2, IL-17 and regulatory cytokine production.
Altogether, these data demonstrate that CD45RC expression
identifies two human CD4 T cell subsets with different cytokine
profiles. The CD45RChigh subset produce mainly type-1 cytokines
while T cells responsible for IL-17, IL-10 and type-2 cytokine
production are mainly contained within the CD45RClow subset.
profile. For this purpose, we purified these sub-populations from
peripheral blood of 20 healthy individuals using magnetic beads.
The purity was always higher than 92% (Fig. 4A). Purified
CD45RC CD4 T cell subsets were then stimulated in vitro in an
antigen-presenting cell independent system using plate bound antiCD3 mAb in the presence of soluble anti-CD28 mAb. Initial
experiments showed that the peak of cytokine production was
reached after 3 days of stimulation (data not shown). Upon this in
vitro stimulation, both T cell subpopulations proliferated equally
well, but produced different cytokines (Fig. 4B). The type-1
cytokines, IL-2, TNF-a and IFN-c, were produced by both
subsets, but the CD45RChigh population produced more IL-2
(Fig. 4B). In contrast, IL-17, IL-10 and the type-2 cytokines (IL-4,
IL-5) were mainly produced by the CD45RClow CD4 T cells
(Fig. 4B). Similar results were also obtained when CD45RC
subsets were highly purified by flow cytometry (.99%), thus
excluding a possible contribution of contaminating cells in these
differences (data not shown). Intracellular staining confirmed the
above results and showed that IFN-c was produced by both the
CD45RChigh and CD45RClow subsets, while IL-4 and IL-10
producing cells were mainly contained within the CD45RClow
subset (Fig. 4C). In addition, these experiments showed that the
majority of IL-4 or IL-10 producing cells did not produce IFN-c
(Fig. 4C). We also analysed CD4 T cells according to the
expression of CD45RA isoform. We showed that the majority of
CD45RChigh subset expresses also high levels of CD45RA isoform.
In contrast, the CD45RClow population is heterogeneous and
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The level of CD45RC expression identifies three subsets
within human CD8 T cells with differential cytokine
production
We also studied the cytokine repertoire of CD45RChigh,
CD45RCint and CD45RClow CD8 T cell subsets. These three
sub-populations were purified from peripheral blood of 12 healthy
individuals using flow cytometry and stimulated in vitro using plate
bound anti-CD3 mAb in the presence of soluble anti-CD28 mAb.
The purity was always higher than 97% (Fig. 5A). Initial
4
April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Figure 2. Phenotypic characterization of CD45RC T cell subsets. Peripheral blood leukocytes from healthy individuals were stained with
mAbs against TCR, CD4 or CD8, CD45RC, CD45RA, CD45RO and CCR7 (n = 6) or TCR, CD45RC, CD4 or CD8 and Foxp3 (n = 27). Gates were set on CD4 T
cells (upper panels) or CD8 T cells (lower panels). Box plot diagrams represent the proportion of naive (CD45RA+CD45RO2CCR7+), central memory
(CD45RA2CD45RO+CCR7+), effector memory (CD45RA2CD45RO+CCR72) and natural regulatory T cells (Foxp3+) within the CD45RC subsets. The
group ‘‘others’’ contains both CD45RA+CD45RO2CCR72 and CD45RA+CD45RO+ subsets, subpopulations with ill defined functions. The p-values
were calculated using the Wilcoxon matched-pairs test; *, p,0.05; **, p,0.02; p,0.002.
doi:10.1371/journal.pone.0005287.g002
increased in patients with AAV, but not in SLE, as compared to
healthy controls. This increase concerned only the CD4 T cell
compartment and appeared independent of AAV subtype, ANCA
specificity, number of previous relapses, and duration of disease.
The observation that remission can be induced in AAV patients
by drugs specifically targeting T cells strongly suggests a pivotal
role of T cells in the pathogenesis of this disorder [3,35,36]. In
addition, involvement of T cells is suggested by granuloma
formation in the lesions and by the presence of isotype-switched
autoantibodies, which is compatible with an antigen-driven and T
helper cell-dependent autoimmune response. Furthermore, in an
animal model of MPO-ANCA associated vasculitis, it was
demonstrated that T cells play a pivotal role in the pathophysiology of the disease [37]. Our present study shows that AAV
patients in remission harbor an increased proportion of
CD45RClow CD4 T cells that is stable over time and independent
of disease duration and subtype of AAV. In animal models, T cell
activation induces a persistent down-modulation of CD45RC
expression, only when the antigen is continuously presented to the
immune system [38,39]. Therefore, the increased proportion of
CD45RClow CD4 T cells in AAV patients may be indicative of an
ongoing strong antigenic stimulus. In line with this hypothesis, it
has been shown that WG patients exhibit a low frequency of naive
CD4 T cells [9] and high number of CD4 effector memory cells
[13]. Moreover, patients with vasculitis often have increased serum
markers of T cell activation [40,41], and increased percentages of
activated T cells [7], both during active disease and in remission.
This could be explained by a failure of effectively control T cell
activation since a defective suppressive function of circulating Treg
experiments showed that the peak of cytokine production was
reached after 4 days of stimulation (data not shown). All three
CD45RC CD8 T cell subsets produced the type-1 cytokines, IL-2,
TNF-a and IFN-c, but the CD45RCint population produced more
TNF-a and IFN-c (Fig. 5B). In contrast, IL-4, IL-5, and IL-10
were mainly produced by the CD45RClow and CD45RCint CD8
subsets, with the CD45RClow population producing higher
amounts (Fig. 5B). IL-10 was produced only by 4 individuals
among 12 tested and IL-17 was undetectable (data not shown).
Intracytoplasmic staining confirmed the above results and showed
that IFN-c was produced by all three CD8 T cell subsets, while IL4 producing cells were mainly contained within the CD45RClow
subset (Fig. 5C). Here again, the majority of IL-4 producing cells
did not produce IFN-c (Fig. 5C). Altogether, these data
demonstrate that CD45RC expression divides human CD8 T
cells into three subsets with differential cytokine production and
that the CD8 T cells responsible for type-2 cytokine production
and IL-10 production are mainly contained within the
CD45RClow and CD45RCint subsets.
Discussion
In the present study, we show that the level of CD45RC
expression on human CD4 and CD8 T cells identifies functionally
distinct subsets that differ by their cytokine profile and stage of
differentiation. In addition, the proportion of these subsets is
diverse within the human population and this diversity is not
related with age or the state of T cell activation. Finally, we show
that the proportion of CD45RClow CD4 T cells is significantly
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April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Figure 3. CD45RC T cell subsets distribution in healthy individuals and ANCA patients. Peripheral blood leukocytes from 39 healthy
individuals (HC), 38 patients with ANCA-associated vasculitis (AAV), and 20 patients with systemic lupus erythematosus (SLE), were stained with mAbs
against CD3, CD4, CD8, CD45RC. (A) The proportion of CD45RClow CD4 T cells (left panel) and the proportion of CD45RChigh-CD45RCint-CD45RClow
CD8 T cells (right three panels) are presented as box plot diagrams for each study population. The p-values were calculated using the Wilcoxon
matched-pairs test; p,0.05; **, p,0.02; ***, p,0.002. (B) The proportion of CD45RClow CD4 T cells are presented according to disease subtype (WG,
Wegener’s granulomatosis; MPA, microscopic polyangiitis; CSS, Churg-Strauss Syndrome; RLV, renal limited vasculitis), type of ANCA specificity (MPO,
myeloperoxidase; PR3, proteinase 3), renal involvement (no: no kidney disease; yes: kidney disease), and relapses (no: no relapse; yes: relapses). Data
are presented as box plot diagrams for each study population. The p-values were calculated using Mann Witney U test; *p,0.05. The proportion of
CD45RClow CD4 T cells are presented according to duration of disease (C, left panel). The proportion of CD45RClow CD4 T cells of 18 AAV patients (13
WG, 3 MPA, and 2 RLV patients) at 4 years interval (C, right panel).
doi:10.1371/journal.pone.0005287.g003
The next question is how the high frequency of CD45RClow
CD4 T cells could influence the development of AAV. It is clear
from our study that the CD45RClow CD4 T cell compartment is
composed of distinct T cell subsets, including both effector and
central memory T cells. Interestingly, a persistent expansion of
effector memory CD4 T cells has been described in WG [13],
suggesting that the increased proportion of CD45RClow CD4 T
cells preferentially affects the effector memory compartment. With
respect to the type of effector cells involved, it is of great interest to
note that in animal model of type-2 cytokine dependent heavy
metal-induced immune disorders, the depletion of CD45RChigh T
cells exacerbates disease, while adoptive transfer of this subset has
a protective effect [44,45]. This could be due to the differential
cytokine production by these T cell subsets. In the current study,
we show that IL-17 and type-2 cytokines are exclusively produced
by CD45RClow T cells, while type-1 cytokines are produced by
both subsets, in agreement with our previous findings in rats
[22,23,25]. Interestingly, our study also shows that the proportion
of CD45RClow CD4 T cell subset is higher in patients with renal
involvement, in agreement with the pathogenic potential of this
subset. This is in strong concordance with studies showing that
Th17 cells are identified in the vasculitic lesions [46] and a skewed
distribution of Th2 and Th17 cells in WG patients after either
antigen-specific stimulation or polyclonal activation [11,47,48]. In
addition, IL-17 plays an important role in recruitment and
has been shown in WG patients [12]. In addition, genetic
polymorphisms in genes encoding the inhibitory molecules for T
cell activation (CTLA-4, PD1, and PTPN22) have been defined as
a risk factor for AAV [42,43].
It remains to be established whether the increased proportion of
CD45RClow CD4 T cells, as observed in AAV patients, is
secondary to the disease process, or is a pre-existing phenomenon
that contributes to the susceptibility to develop AAV. Since this
increase is independent of the treatment (by comparing AAV to
SLE patients), the duration of disease or number of previous
relapses, we would rather favor the second hypothesis. This is
further supported by evidence obtained in animal models. LEW
rats, which have a preponderance of CD45RChigh T cells, develop
preferentially type-1 mediated disorders. In contrast, BN rats, that
harbor high amounts of CD45RClow T cells, preferentially develop
heavy metal-induced type-2 immune-mediated disorders and
MPO-ANCA associated vasculitis [25–28]. In addition, the
differential distribution of CD45RC subsets between LEW and
BN rats is genetically controlled by a locus on chromosome 9 that
co-localizes with a 120 kb interval controlling susceptibility of BN
rats to develop heavy metal-induced immune-mediated disorders
[22,23,25,30] (our unpublished data). Based on these animal
model’s data, we would like to propose the hypothesis that the
imbalance in CD45RC T cell subsets, as observed in AAV
patients, may be a risk factor for developing disease.
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April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Figure 4. Cytokine profile of human CD45RC CD4 T cell subsets. (A) Representative example of the purification of CD4 CD45RC T cell subsets.
Results are shown as histograms for CD45RC expression on CD4 T cells before (left histogram) and after CD45RC subsets purification (right
histograms). The values within the histograms represent the percentage of CD45RC T cell subsets. (B) Purified CD45RChigh (High) and CD45RClow
(Low) CD4 T cell subsets, were stimulated in vitro with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 mAbs. The supernatants were collected at 72 h of culture
and analyzed for the presence of cytokines using the CBA kit and Elisa. The results obtained in 20 healthy individuals are presented as box plot
diagrams. The p-values were calculated using the Wilcoxon matched-pairs test; *, p,0.05; **, p,0.02; ***, p,0.002. (C) For intracellular measurement
of cytokines, purified CD4 CD45RChigh and CD45RClow T cells were stimulated and stained using FITC-labeled anti-IFN-c mAb and PE-labeled anti-IL-4
or anti-IL-10 mAbs. The results are expressed as dot plot representing IFN-c/IL-4 or IFN-c/IL-10 production by CD4 T cell subsets. The values within the
plots represent the fraction of CD4 T cells producing the indicated cytokine. The results are representative of three independent experiments.
doi:10.1371/journal.pone.0005287.g004
tious agents, medication, and genetic predisposition, all creating
the environment for the development of disease [2]. Our current
data suggest that the increased proportion of CD45RClow CD4 T
cells may also contribute to the susceptibility to AAV. From
animal studies, the relative proportion of CD45RC subsets is
genetically controlled by the same genetic interval that also
controls several immune-mediated disorders [22,23,25,30]. Although it remains to be determined whether the balance between
activation of neutrophils, a characteristic feature of AAV disease.
How expression of the CD45 isoform could influence cytokine
profiles of CD4 T cells is not clear. However, it has been
documented that CD45 modulates signalling through diverse
receptors affecting cytokine production and response to cytokines
[49,50].
The induction of AAV is multifactorial, with an interplay of
environmental factors including silica, bacterial and viral infecPLoS ONE | www.plosone.org
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April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Figure 5. Cytokine profile of human CD45RC CD8 T cell subsets. (A) Representative example of the purification of CD45RChigh, CD45RCint and
CD45RClow CD8 T cell subsets. Results are shown as histograms for CD45RC expression on CD8 T cells before (left histogram) and after CD45RC
subsets purification (right histograms). The values within the histograms represent the percentage of CD45RC T cell subsets. (B) These subpopulations were stimulated in vitro with anti-CD3 and anti-CD28 mAbs. The supernatants were collected at 96 h of culture and analyzed for the
presence of cytokines using the CBA kit and Elisa. The results obtained in 12 healthy individuals are presented as box plot diagrams. The p-values
were calculated using the Wilcoxon matched-pairs test; **, p,0.02. (C) For intracellular measurement of cytokines, purified CD8 CD45RC T cell
subsets were stimulated and analyzed for intracytoplasmic cytokines as indicated in the legend of figure 4. The results are representative of three
independent experiments.
doi:10.1371/journal.pone.0005287.g005
CD45RC subsets in humans is also genetically controlled, the
identification of the gene(s) involved will give new insight in the
etiology and pathogenesis of AAV.
p,0.001). (B) Dot plot showing CD45RC and CD45RA
expression by CD4 T cells from 2 different donors with different
profiles. (C) CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cell subsets
were purified by flow cytometry. CD45RClow CD4 T cells were
stained with anti-CD45RA mAb and separated by flow cytometry
into CD45RAhigh and CD45RAlow subsets. (D) These subpopulations as well as total CD45RClow CD4 T cells (white bars)
and CD45RChigh CD4 T cells (black bars) were stimulated in
vitro with plate-bound anti-CD3 and soluble anti-CD28 mAbs.
The supernatants were collected after 72 h of culture and analyzed
for the presence of cytokines using the CBA kit. These results are
Supporting Information
Figure S1 Differential cytokine production by human CD45RA
CD45RClow CD4 T cell subsets (A) CD4 T cells from 18 healthy
controls were stained for the expression for CD45RA and
CD45RC isoforms. The results are presented as correlation
between CD45RAlow and CD45RClow T cells subsets (r = 0.8;
PLoS ONE | www.plosone.org
8
April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
CD45RC T Cell Subsets in AAV
Drs Roland Liblau and Daniel Gonzalez-Dunia for critically reading the
manuscript.
representative of 2 experiments from two different healthy
individuals.
Found at: doi:10.1371/journal.pone.0005287.s001 (9.73 MB TIF)
Author Contributions
Acknowledgments
Conceived and designed the experiments: LO IB JWCT JD AS. Performed
the experiments: LO IB FLO. Analyzed the data: LO IB JWCT JD AS.
Wrote the paper: JD AS.
The authors wish to thank Dr Marjan Slot for recruiting patients and
controls for the phenotypic studies, Kim Savelkouls for flow cytometry, and
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10
April 2009 | Volume 4 | Issue 4 | e5287
80
B
60
4
10
CD45RA
CD45RAlow
A
40
20
20
0.3%
103
102
1
10
0
40
60
CD45RClow
10
80
100
101
102
103
104
CD45RC
4
47%
58%
31%
49%
CD45RA
10
103
16%
102
1
10
0
10
100
CD45RA
CD45RC
C
101
CD45RC
CD45RA
102
103
104
CD45RC
CD4 T cells
44%
56%
40%
CD45RC
cell sorting
CD45RClow
CD45RChigh
60%
CD45RA
CD45RC
CD45RA
cell sorting
CD45RC
CD45RClow CD45RAlow
CD45RClow CD45RAhigh
CD45RA
IFN-g
30
20
10
10
0
RChigh RClow RAlow RAhigh
IL-5
ng/ml
ng/ml
6
4
2
0
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
Figure S1
10
8
6
4
2
0
60
30
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
RClow
IL-10
ng/ml
IL-4
8
90
0
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
IL-2
120
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
50
40
30
20
10
0
IL-17
3
ng/ml
0
TNF-a
20
ng/ml
ng/ml
40
ng/ml
D
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
2
1
0
RChigh RClow RAlow RAhigh
RClow
II.
LE NIVEAU D’EXPRESSION DE CD45RC SUR LES LYMPHOCYTES
T HUMAINS EST UN BIOMARQUEUR DU RISQUE DE REJET
D’ALLOGREFFE RÉNALE.
Les allogreffes permettent de traiter de nombreuses pathologies liées à des déficiences
de fonction vitale ou des cancers. L’utilisation de traitements, immunosuppresseurs a permis
d’améliorer considérablement le taux de réussite des greffes. Mais, en déprimant l’ensemble
du système immunitaire, ils entraînent des effets secondaires importants. Actuellement, tous
les receveurs sont soumis à de tels traitements, indépendamment du risque de rejet du greffon.
Il est donc essentiel de posséder un outil diagnostique permettant d’identifier les lymphocytes
T alloréactifs, cellules responsables de ces pathologies, et ainsi de prédire le rejet ou la GvHD
afin de pouvoir limiter l’utilisation de ces immunosuppresseurs. Chez le rat, l’intensité
d’expression membranaire de CD45RC définit 2 populations de lymphocytes T CD4 et CD8.
Les lymphocytes T CD4 et CD8 CD45RChigh sont alloréactifs et induisent la GvHD, alors que
les lymphocytes T CD8 CD45RClow préviennent cette pathologie. De plus, la proportion de
ces populations varie en fonction des souches de rats et cette variabilité est contrôlée
génétiquement par deux régions situées sur les chromosomes 9 et 20. Ceci souligne la
possibilité d’utiliser le rapport CD45RChigh/CD45RClow au sein des lymphocytes T pour
prédire les manifestations alloréactives comme la GvHD et le rejet de greffe.
Nous avons donc évalué les propriétés alloréactives des sous-populations T CD4 et
CD8 CD45RC humaines. Nous avons tout d’abord montré que les sous-populations T CD4 et
CD8 CD45RC possèdent des propriétés alloréactives différentes face à des cellules
présentatrices d’antigènes allogéniques, in vitro. Les lymphocytes T CD4 CD45RChigh
contiennent une majorité de cellules alloréactives qui prolifèrent et produisent des cytokines
de type 1 et de type 2. Les lymphocytes T CD4 CD45RClow prolifèrent peu, mais produisent
de grande quantité d’IL-17. Par contre, les sous-populations T CD8 CD45RC prolifèrent de
façon équivalente, mais possèdent des profils de sécrétion de cytokines différents. Les CD8
CD45RChigh produisent essentiellement de l’IFN-γ alors que les CD8 CD45RClow produisent
essentiellement de cytokines de type 2, la cytokine immunorégulatrice (IL-10) et l’IL-17. La
sous-population T CD8 CD45RCint produit des quantités intermédiaires de la majorité des
cytokines étudiées.
Nous avons montré sur une cohorte de 608 individus sains, que la proportion des souspopulations CD45RC parmi les lymphocytes T CD4 et T CD8 est très variable et suit une
distribution gaussienne. Étant donné cette variabilité et les différentes propriétés alloréactives
de ces sous-populations, nous avons étudié la capacité de CD45RC à servir de marqueur dans
104
la prédiction du rejet de greffe rénale allogénique. Nous avons analysé chez l’homme, le
profil CD45RC de 89 échantillons sanguins provenant de receveurs de greffe rénale avant la
transplantation, et les résultats se sont révélés particulièrement intéressants puisque nous
avons montré que l’incidence de rejet se révèle plus importante chez les receveurs possédant
une forte proportion de CD8 CD45RChigh. Cette étude montre que CD45RC permet
d’identifier de nouvelles sous-populations lymphocytaires T CD4 et T CD8 humaines qui
diffèrent par leurs propriétés alloréactives. De plus, ce travail suggère que CD45RC pourrait
être utilisé comme un outil diagnostique prédictif du risque de rejet dans le cas de
transplantation d’organes ou de GvHD lors de greffe de cellules souches hématopoïétiques.
105
Expression of the CD45RC isoform on human T cells is a biomarker for the risk of
kidney allograft rejection
Short Title: CD45RC T cell subsets in transplantation
By Laurence Ordonez, Isabelle Bernard, Marianne Chabod, Jean-François Augusto*, Valérie
Lauwers-Cances≠, Christelle Cristini≠, Jean-François Subra* and Abdelhadi Saoudi.
From the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U563, Institut
Fédératif de Recherche (IFR) 150, Hôpital Purpan and Université Paul Sabatier, Toulouse,
France; *INSERM U892, Service de Nephrologie-Dialyse Transplantation CHU Angers and
université d’Angers, France and
≠
the Epidemiology unit, CHU Toulouse, France.
Keywords:
Renal transplantation, GvHD, Human, alloreactivity, T cells, CD45RC,
Correspondence: Dr Abdelhadi Saoudi, INSERM U563, CPTP Bat B, CHU Purpan, BP
3028, 31024 Toulouse Cedex 3, France. Phone : 33-5-62744512, Fax: 33-5-62744558, Email: [email protected].
Submitted on the 6th of October 2009
106
Transplantation is the classic standard of care for end-stage organ failure. However, allograft
rejection represents a common complication, affecting the long-term outcome of the
transplanted organ. Many immune cells participate in this process but alloreactive CD4+
and/or CD8+ T lymphocytes play a key role 1,2. The introduction of immunosuppressive drugs
has revolutionized the field of transplantation by substantially reducing the frequency of acute
rejection
3,4
. However, the marked morbidity resulting from the empiric and life-long use of
immunosuppressive drugs remains an important limitation. Therefore, a major challenge is to
identify easy, reliable and noninvasive surrogate markers for the deleterious alloreactive
immune responses. This would constitute a crucial step towards the development of
therapeutic strategies aimed at improving the care of allograft recipients. Here, we show that
expression of the CD45RC isoform on T cells identifies functionally distinct alloreactive T
cell subsets. Importantly, we demonstrate that this expression may serve as a predictive
biomarker for the risk of allograft rejection. These findings have potentially major clinical
implications for tailoring immunosuppressive treatments according to the patients' needs.
Furthermore, altering the relative balance between CD45RC subsets could provide a new
avenue for immunotherapy in allogeneic transplantation.
107
CD45, a transmembrane protein tyrosine phosphatase, operates as a regulator of kinases
belonging to the Src-family kinases. This protein is essential for efficient signal transduction
after T cell receptor engagement 5 ,6,7. Multiple CD45 isoforms differing in size and charge are
generated by alternative splicing of exons 4(A), 5(B) and 6(C), leading to changes in the
extracellular domain of the molecule
8,9
. Although CD45 alternative splicing is highly
regulated and conserved among vertebrates, the function of the different CD45 isoforms is not
clear. However, differential expression of CD45 isoforms has been associated with different
stages of T cell development and function. Several groups have shown that T cells expressing
high levels of CD45RB (in mice) or CD45RC (in rats) are effector T cells capable of
promoting transplant rejection and organ inflammation
10 ,11 ,12 ,13
. In contrast, T cells
expressing low levels of CD45RB or CD45RC exert a regulatory activity and inhibit allograft
rejection
14,15 ,16
and autoimmune diseases
10 ,11 ,12,17 ,18
. In addition, it has been shown that
treatment using anti-CD45RB antibodies reliably induces donor-specific tolerance
19 ,20
.
Together, these experimental findings have clearly demonstrated that the genetically
predetermined CD45 isoform expression on T cells
21-23
may modulate their rejection
potential, thereby impacting on allograft outcome. However, the alloreactive properties of
these T cell subsets in humans are still unknown. In the present study, we analyzed
alloreactive functions of human CD45RC T cell subsets in healthy individuals and analyzed
whether their frequency was associated with the outcome of kidney transplantation.
Flow cytometry analysis of CD45RC expression on human peripheral blood CD4 T cells
revealed an heterogeneous expression, allowing the definition of the CD45RChigh and
CD45RClow subsets (Fig. 1a). In order to characterize their alloreactive potential, these two
sub-populations were purified and stimulated in vitro with irradiated allogeneic APC. We
observed that CD45RChigh CD4 T cells proliferated significantly more than CD45RClow T
cells and produced higher amounts of IFN-g, TNF-a, IL-2, IL-5, IL-4 and IL-10 (Fig. 1a).
These data demonstrate that CD45RC expression identifies two human CD4 T cell subsets
and that the CD4 CD45RChigh subset proliferates vigorously to allostimulation and produces
the majority of cytokines tested (Fig. 1a).
Likewise, analysis of CD45RC expression on human peripheral blood CD8 T cells allowed
the definition of the CD45RChigh, CD45RCint and CD45RClow subsets (Fig. 1b). To study their
proliferation and their cytokine repertoire, these three sub-populations were purified and
stimulated using mixed-lymphocyte cultures. Although CD8 CD45RChigh T cells proliferated
108
slightly less than the CD8 CD45RCint and CD8 CD45RClow subsets, they produced higher
amounts of IFN-g (Fig. 1b). Conversely, the CD45RClow subset produced higher amounts of
IL-4, IL-5 and IL-10. The CD45RCint subpopulation had an intermediate production of IFN-g,
IL-4, IL-5 and IL-10. Thus, the level of CD45RC expression divides human CD8 T cells into
three subsets with differential alloreactive properties; the alloreactive CD8 T cells responsible
for production of type 2 and regulatory cytokines are mainly contained within the CD45RClow
and CD45RCint subsets.
To assess the inter individual variation of CD4 and CD8 CD45RC T cell subsets in humans,
we analyzed their relative proportion in a cohort of 608 healthy individuals (259 women and
349 men, median age 45, range 18-67). This proportion was very variable within CD4 (Fig.
2a; median and range for CD45RChigh: 49% and 10-85%) and CD8 T cells (Fig. 2b; median
and range for CD45RChigh: 48% and 7-89%; CD45RCint: 31% and 5-78%; CD45RClow: 18%
and 2-67%). Age of patients accounted for only 4% of the variation within the CD4
compartment (Fig. 2a) and at best for 18% of the variation within the CD8 compartment (Fig.
2b). Importantly however, the proportion of CD45RC subsets for a given individual was
stable over time 24. In agreement with these finding, it has also been shown in the rat that the
relative proportion of CD45RC subsets is highly variable between strains. It has also been
demonstrated that this variability is intrinsic to hematopoietic cells and is genetically
controlled
21-23
. These observations, combined with the different alloreactive properties of
CD45RC subsets in vitro, led us to hypothesize that the outcome of a graft could be different
in transplanted patients with different CD45RC profiles. To test this hypothesis, we analyzed
whether the distribution of CD45RC T cell subsets before transplantation would predict the
graft rejection in a cohort of 89 patients which had undergone a first kidney transplantation
and with PRA HLA antibodies < 20%. As shown in Figure 3, the distribution of CD4 (Fig.
3a) and CD8 (Fig. 3b) CD45RC subsets in these patients was similar to that observed in the
608 healthy controls, indicating that kidney failure and dialysis had no impact on CD45RC
expression by T cells. The transplanted recipients (69 men, 20 women, median age 51, range
16-77 years) were followed for an average of 4.1 (± 2.3) years (Supplementary Table 1).
During this follow-up, 17 subjects exhibited biopsy-proven graft rejection: acute rejection for
11 patients, chronic rejection for 3 patients and both for 3 patients. However, we showed that
graft rejection was not predicted by the initial anti-rejection therapy (type of induction:
antithymocyte globulin vs. basiliximab, HR 1.6 [0.58-4.50]; p=0.364), type of treatment
(monotherapy Tacrolimus vs. mycophenolate mofetil/Tacrolimus, HR 0.73 [0.3-2.0];
109
p=0.551), the HLA mismatches (higher than 4, HR 1.68 [0.64-4.46]; p=0.293) or the cold
ischemia time (higher than 18 hours, HR 1.33 [0.51-3.45] ; p=0.557) (Supplementary Table
2). To test whether the proportion of the different CD45RC subsets before transplantation
could discriminate patients with or without rejection, we performed a Receiver Operating
Characteristic (ROC)-curve analysis. This analysis showed that the proportion of CD45RC
CD4 T cells was not predictive for rejection (Table 1, Fig. 3c). In contrast, results were highly
predictive when analyzing the CD8 T cell compartment. Indeed, patients with more than 54.7
% of CD8 CD45RChigh T cells before transplantation have 5.36 fold more risk to reject their
kidney transplant (HR 5.36; [1.75-16.48]; p=0.003) (Table 1). The Kaplan Meier curves
showed that patients with more than 54.7% of CD45RChigh CD8 T cells (or less than 24.1% of
CD45RCint CD8 T cells) had higher kidney rejection rates (Fig. 3d). Together, our results
demonstrate that the level of CD45RC expression on CD8 T cells could be used to define
patients at high risk of kidney graft rejection. This is in agreement with experimental studies
showing that the CD8 CD45RChigh are very efficient at inducing graft-versus host disease 15.
There are several explanations for why CD45RC T cell subsets differ in their ability to predict
graft rejection. First, it could be related to their cytokine repertoire since it has been shown
that CD45 isoforms differentially regulate the activation signals resulting from TCR ligation
and the subsequent secretion of effector cytokines 25-27. In this regard, it is important to note
that the CD8 CD45RChigh T cell subset, which was shown to predict graft rejection in our
study, responds well to alloantigen stimulation in vitro and produces mainly type 1 cytokines,
which are key mediators for graft rejection
28-30
. In contrast, the CD4 CD45RChigh subset,
which did not predict graft rejection, responds also well to alloantigen stimulation but
produces mainly anti-inflammatory cytokines, in particular IL-10, a key cytokine for the
control of graft rejection and graft versus host disease (GvHD) 30-33. Second, the differences in
alloreactivity between the CD45RC subsets could also be explained by their activation status.
Indeed, peripheral T cells can be broadly divided into naive and antigen-experienced T cells,
which include effector, central memory, and effector memory cells. Studies using several
animal models have shown that T cells with naïve phenotype induce GvHD, in contrast to
total memory T cells or purified central memory T cells, which are unable to promote this
disease 13,34-37. In accordance with these findings, we previously showed that the CD45RClow
subset contains mainly central (CD45RA-RO+CCR7+) and effector memory (CD45RARO+CCR7-) cells while the CD45RChigh subset contains mainly naive cells (CD45RA+RO-
110
CCR7+) 24. However, among all these markers, our data show that CD45RC is clearly the best
biomarker for the risk of kidney allograft rejection (Table 1).
Despite extensive studies, there are still no adequate markers allowing to predict graft
rejection in order to adapt the immunosuppressor treatments and to identify patients that
would ultimately accept a transplanted organ. Our study establishes that the level of CD45RC
expression on recipient CD8 T cells before transplantation could represent a useful predictive
factor for kidney graft rejection. This may have important clinical implications such as
shifting from the usual empiric use of immunosuppression towards an individualized and
minimized therapy, according to CD45RC expression profile. This marker has several
advantages since a) it requires a minimally invasive procedure (blood testing), b) it can be
easily implemented in routine immunology laboratories, c) it is a pregraft evaluation and
therefore can have an impact rapidly after grafting for tapering off the immunosuppressive
treatment. This marker now requires to be tested in other organ transplantation, in particular
liver, before it becomes routinely used in transplant centers to improve the quality of life of
the transplanted patients.
111
METHODS
Patients and sample collection.
For this prospective study, we selected a cohort of 89 patients who received a first cadaveric
kidney transplant at University Hospital Center of Angers, France, between 1999 and 2005.
Exclusion criteria were multiple organ transplantations and peak panel reactive (PRA) HLA
antibodies ≥ 20%. At the time of study, all patients gave their written consent (approved by
the Medical Ethics Committee of the University Hospital of Angers, France). Before
transplantation, peripheral blood mononuclear cells from patients were obtained by gradient
density Ficoll separation and were stored in liquid nitrogen (in human albumin/20%DMSO) at
the University Hospital Center of Angers. The transplanted recipients (69 men, 20 women,
median age 51, range 16-77 years) were followed for an average of 4.1(± 2.3) years. Patient
characteristics are described in supplementary Table 1. Diagnosis of rejection episodes was
based on conventional clinical and laboratory criteria (i.e., transient 20% elevation of
creatinine level and/or proteinuria, with normal ultrasound examination) and on data obtained
after graft biopsy (scored according to the Banff classification). During this follow-up, 17
subjects exhibited biopsy-confirmed graft rejection: acute rejection for 11 patients, chronic
rejection for 3 patients and both for 3 patients. Acute rejection was observed after a median
time of 6.9 months [0.3–72 months], and chronic rejection after 19.1 months [7 –49 months].
Among the 89 patients, 6 patients deceased and 8 had terminal renal graft failure. Induction
treatment consisted in one bolus of 500 mg methylprednisolone (Solu-Medrol®, Pfizer,
France) alone (n=8), or in association with two injections of basiliximab (Simulect®,
Novartis, Basel, Switzerland; 20 mg on days 0 and 4 post-transplantation; n=26), or with
rabbit antithymocyte globulins (Thymoglobuline®, Genzyme Cambridge, MA, USA; 1.5
mg/kg/day for 3 to 7 days post-transplantation; n=55). In addition, all patients received
mycophenolate mofetil (Cellcept®, Roche; France; 1g/d) with tacrolimus (Prograf®,
Fujisawa, Japan) initiated between the 1st and the 7th day post-transplantation and
administered twice daily. Prednisone (Cortancyl®, Sanofi Aventis, France) dose was tapered
off by 10 mg/week until it reached 20 mg/day, and gradually afterwards until it reached 5
mg/day on the 12th week post-transplantation. Prednisone was completely withdrawn 6
months post-transplantation. In a group of 55 transplant recipients, mycophenolate mofetil
was tapered off to 500 mg/day at the end of the second month post-transplantation and
stopped at the end of the 4th month, i.e., this group had tacrolimus monotherapy on the 6th
month post-transplantation. Mycophenolate mofetil was continued in the other patients.
112
Afterwards, immunosuppression regimen was adapted in accordance to rejection episodes,
relapsing primary disease or drug tolerance. For the healthy individuals, peripheral blood
mononuclear leucocytes were obtained from Buffy coat preparations drawn from anonymous
blood donors, at the Purpan University Hospital blood bank (Toulouse, France).
Antibodies.
FITC-, PE-, PE-Cyan5, PE-Cyan7, Alexa 700, Pacific Blue, APC or biotin-conjugated antiCD4 (RPA-T4), anti-CD8 (RPA-T8), anti-TCRαβ (BW242/412), anti-CD25 (4E3), antiCD69 (FN50), anti-CD45RA (HI100), anti-CD45RC (MT2), anti-CD45R0 (UCHL1), antiCCR7 (3D12), anti-Foxp3 (PCH101) mAbs as well APC-streptavidin and biotinylated
MARG-2a were purchased from BD Biosciences (San Jose, CA), R&D Systems
(Minneapolis, MN), IQ Product (Groningen, The Netherlands), Miltenyi (Bergisch Gladbach,
Germany), Beckman Coulter (Fulletron, CA) or eBioscience (San Diego, CA).
Flow cytometry analysis.
For immunofluorescence staining, 106 cells were incubated with mAbs for 20 min at 4°C.
After washing with phosphate buffered saline (PBS) containing 5% fetal calf serum (FCS),
the biotin-labeled cells were incubated with streptavidin-coupled PC7 for 20 min at 4°C,
washed twice with PBS/5% FCS. Foxp3 intracellular expression was detected using APC
anti-human Foxp3 Staining Set from eBioscience, according to their standard protocol. Data
were collected either on a FACS-Calibur (BD Biosciences) cytometer using the
CELLQuestTM software (BD Biosciences) for analysis, or on a LSR-II (BD Biosciences)
cytometer using the DIVA software (BD Biosciences) for analysis.
Purification of CD45RC T cell subsets.
PBMCs were prepared by gradient centrifugation (MLS-Ficoll, Eurobio, Les Ulis, France) of
buffy coats. Monocytes were removed by plastic adherence and CD4 and CD8 T cells were
purified by negative selection using CD4 or CD8 negative isolation kits (Dynal; Oslo,
Norway). The percentage of residual CD8 or CD4 T cells after depletion was always less than
0.5 % and the remaining population consisted of 95-98% CD4 or CD8 T cells and 2-5% CD4
CD8 double negative non T cells. The isolation of CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cell
subsets was performed as follows: CD4 T cells were stained with limiting amounts of FITCconjugated anti-CD45RC mAb and separated into CD45RChigh and CD45RClow cells by
113
positive selection after addition of anti-FITC MACS microbeads (Miltenyi). The resulting
purity was always more than 92% for CD45RChigh and CD45RClow CD4 T cells. CD8
CD45RC T cell subsets were purified by cell sorting after labeling purified CD8 T cells with
anti-CD8 and anti-CD45RC mAbs and separated on a Coulter cell sorter (Epics Altra;
Beckman-Coulter, Fullerton, CA). The purity of sorted CD45RChigh, CD45RCint or
CD45RClow CD8 T cell subsets was higher than 97 % .
T cell stimulation and analysis of T cell proliferation and cytokine production.
The culture medium was RPMI 1640 (Gibco Life Technologies Ltd, Cergy Pontoise, France)
containing 5 % of human SAB (Biowest, France), 1% sodium pyruvate, 1% non essential
amino acids, 1% L-glutamine, 1% penicillin-streptomycin and 2 x 10-5 M 2-mercaptoethanol.
For mixed alloreactive reactions (MLR), 105 highly purified CD45RC T cell subsets were
stimulated with 2.105 mixed irradiated APC prepared from 4 healthy donors. For the CD8 T
cell subsets, 50 U/ml of recombinant human IL-2 was added to the culture (AbCys, France).
Proliferation was measured by 3H-thymidine uptake during the last 18 h of a 4 or 5 days
culture period. At various times throughout the culture, supernatants were removed and stored
at -20°C for cytokine determination using CBA Human Th1/Th2 cytokine kit (BD
Biosciences).
Statistical analysis.
Quantitative variables were expressed as mean ± standard deviation (SD) or median [
interquartile range (IQR)]. Data are presented as box-plots. The Wilcoxon matched-pairs test
was used for comparisons of the proliferation and cytokine production. Mean comparisons
were performed using Student’s t test or Mann-Whitney, depending on the normality of the
distribution. To test if the variability observed for the different subsets could be explained by
age, we used the coefficient of determination R2. The discriminant capacity of different
subsets of peripheral T cell were investigated using non parametric estimation of the area
under the receiver operating characteristic (ROC) curves (AUC). The different AUC were
compared using a Wilcoxon non parametric test. For survival analysis, cumulative survival
rates were estimated using the Kaplan Meier method. Because of a non linear relationship, the
different subsets were dichotomized using the threshold obtained by the ROC curve or using
the median of the distribution. The relationship between risk of transplant rejection and T cell
subset measures was examined using log rank tests and a Cox proportional hazard analysis
model, in which the time scale was the time of study with a time origin defined as the
114
transplant date. A multivariate model was built to take into account potential confounding
factors. Proportionality in Cox analysis was tested using Schoenfeld residuals and log-log
plot. A p value lower than 0.05 was considered as significant. Data analysis was performed
using stata software (Stata Statistical Software: Release 9. College Station, TX: StataCorp
LP).
115
ACKNOWLEDGEMENTS
This work was supported by Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale,
Association Française Contre les Myopathies, Association de la Recherche Contre le Cancer,
Région Midi-Pyrénées. AS is supported by Centre National de la Recherche Scientifique, IB
by INSERM, LO by grants from Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la
Technologie and Fondation pour la Recherche Médicale. The funders had no role in study
design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
We would like to thank Daniel Dunia, Roland Liblau and Lennart Mars for their critical
comments on the manuscript. Veronique Monzat and Jean-Pierre Calot (“Etablissement
Français du Sang”) are acknowledged for their collaboration in establishing the healthy
individuals peripheral blood mononuclear leucocytes cohort. Florence Villemain and Anne
Croué (CHU Angers, France) are acknowledged for the care of the clinical and histological
resource of the transplantation cohort. We would like also to thank Fatima-Ezzahra L’FaqihiOlive and Valérie Duplan (cytometry unit, Institut Fédératif de Recherche 150) for their
technical assistance. The authors have no conflicting financial interest.
AUTHOR CONTRIBUTIONS
L.O. contributed to the design of the project and performed the in vitro and in vivo
experiments, interpreted results and wrote the manuscript; M.C. and I.B. provided help for the
in vitro experiments and for patient samples stainings ; C.C. and V.L. performed the clinical
statistic analysis ; J.F.S. and J.F.A. performed the clinical studies and ; A.S. supervised the
overall project and wrote the manuscript.
116
Figure 1 : CD45RC expression identify distinct human CD4 and CD8 T cell subsets with
different alloreactive properties in vitro.
(a) CD45RC expression on CD4 T cells identifies two CD45RC subsets. Purified CD45RChigh
(High) and CD45RClow (Low) CD4 T cells were stimulated in vitro using T-depleted
irradiated allogeneic PBMC from 4 different donors. The proliferation was measured by
thymidine incorporation during the last 18h of the 4 days of culture. The supernatants were
collected at 96h of culture and analyzed for the presence of cytokines using the CBA. The
results from 24 healthy individuals are presented as box-plot diagrams. Statistical results
comparing the CD45RChigh and CD45RClow subsets: proliferation (p=0.0004), IFN-g
(p=0.0005), TNF-a (p=0.0002), IL-2 (p<0.0001), IL-4 (p=0.022), IL-5 (p=0.0017) and IL-10
(p=0.016). (b) CD45RC expression on CD8 T cells identifies three CD45RC subsets. Purified
CD45RChigh (High), CD45RCint (Int) and CD45RClow (Low) CD8 T cells were stimulated by
MLR as described above for CD4 T cells and the proliferation and cytokine analysis were
performed at day 5. The results obtained in 7 healthy individuals are presented as box-plot
diagrams. Statistical results comparing the CD45RChigh, CD45RCint and CD45RClow subsets:
proliferation (p{high/low}=0.043; p{high/int}=0.043), IFN-g (p{high/low}=0.018 ;
p { h i g h / i n t } =0.043),
TNF-a
{ h i g h / i n(pt } =0.028), IL-4 (p{ h i g h / l o w}=0.018 ;
p{high/int}=0.018; p{int/low}=0.018), IL-5 (p{high/low}=0.018 ; p{high/int}=0.018;
p{int/low}=0.018) and IL-10 (p{high/low}=0.018 ; p{high/int}=0.027; p{int/low}=0.028).
The p-values were calculated using the Wilcoxon matched-pairs test; *, p<0.05; **, p<0.02;
***, p<0.002.
Figure 2: Distribution of CD4 and CD8 CD45RC T cell subsets in healthy individuals.
Peripheral blood leukocytes from 608 healthy individuals were stained with mAbs against
TCR, CD4, CD8, CD45RC. The histograms represent CD45RC expression on CD4 T cells (a,
top panels) and CD8 T cells (b, top panels) from three healthy individuals, to illustrate the
inter-individual variability. The distribution of the proportion of CD45RChigh CD4 T cells (a)
and of CD45RChigh, CD45RCInt and CD45RClow CD8 T cells (b) in the cohort of 608 healthy
individuals is presented as histograms. The proportion of CD45RC subsets in CD4 (a) and
CD8 (b) T cells is presented according to age and each dot represents a separate individual.
The R2 values were calculated using linear regression.
117
Figure 3 : The proportion of CD8 CD45RC T cells before transplantation serves as a
biomarker for the risk of kidney allograft rejection.
Peripheral blood leucocytes from 89 patients were frozen in liquid nitrogen before renal
transplantation. Thereafter, these cells were thawed and stained with mAbs against TCR,
CD4, CD8 and CD45RC. (a, b) the proportion of CD45RC subsets within CD4 (a) and CD8
T cells (b) in the 89 recipient before the graft were compared to those of 608 healthy
individuals. The p-values were calculated using the Mann-Whitney test. (c, d) Kaplan-Meier
curve estimates the survival without rejection based on CD45RC expression. The AUC for
CD45RChigh CD4 T cell subset (0.61) did not allow to define a threshold. The patients were
therefore separated into two groups based on the median value for CD4 CD45RChigh (c).
However, the AUC for CD45RChigh and CD45RCint CD8 T cell subset (0.71 and 0.73
respectively) permitted to define a threshold of 54.7 % for CD45RChigh and 24.1 % for
CD45RCint. The patients were therefore separated into two groups based on these cut-off
values obtained from ROC analyses for CD45RChigh (d, upper panel) and CD45RCint (d,
medium panel) within CD8 T cells.
118
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120
Table 1: Crude hazard ratio (HR), 95% confidence interval (CI) and p-value (p) of
different human T-cell subsets according on transplant rejection.
n
Number
of
rejection
HR (CI95%)
% CD45RChigh ≤ 48.2
45
6
1
> 48.2
44
11
1.85 (0.68 – 5.00)
%RA+RO-CCR7+ ≤ 36.5
45
6
1
> 36.5
44
11
1.78 (0.66 – 4.82)
%RA-RO+CCR7+ ≤ 29.8
45
10
1
> 29.8
44
7
0.73 (0.28 – 1.92)
%RA-RO+CCR7- ≤ 14.3
45
12
1
44
5
0.45 (0.16 – 1.28)
p
CD4 T CELLS
> 14.3
0.225
0.256
0.525
0.134
CD8 T CELLS
% CD45RChigh < 54.7 a
54
4
1
≥ 54.7
35
13
5.36 (1.75 – 16.46)
a
64
7
1
< 24.1
25
10
3.82 (1.45 – 10.06)
% CD45RClow ≤ 16.9
45
12
1
> 16.9
44
5
0.43 (0.15 – 1.22)
%RA+RO-CCR7+ < 36.1a
50
4
1
≥ 36.1
39
13
4.21 (1.37 – 12.92)
%RA-RO+CCR7+ ≤ 6
46
10
1
>6
43
7
0.82 (0.31 – 2.15)
%RA-RO+CCR7- ≤ 10.6
45
9
1
> 10.6
44
8
1.00 (0.38 – 2.59)
% CD45RCint ≥ 24.1
0.003
0.007
0.113
0.012
0.688
0.995
a
For these variables, the subsets were dichotomized using the threshold obtained by the ROC curve rather than
the median.
Abbreviation: HR, Hazard Ratio; CI, confidence interval
121
Supplementary Table 1. Characteristics of transplanted patients
Total cohort
(n=89)
69/20
Rejection
(n=17)
13/4
No rejection
(n=72)
56/16
51 (37-59)
37 (28-56)
51 (41-60)
18 (15-21)
20 (14-22)
18 (16-21)
1 (1-2)
1 (1-2)
1 (1-2)
2 (1-2)
2 (1-2)
2 (1-2)
HLA-DR
1 (1-2)
1 (1-2)
1 (1-2)
Total
4 (3-5)
4 (3-5)
4 (3-5)
Panel reactive antibodies (%)
0 (0-0)
0 (0-0)
0 (0-0)
Induction
(No/basiliximab/ATG)
Monotherapy (No/Yes)
8/26/55
0/6/11
8/20/44
32/57
6/11
26/46
Gender (Men/Women)
Age at transplantation in years,
median (IQR)
Cold ischaemia time (h)
median (IQR)
HLA mismatches,
median (IQR)
HLA-A
HLA-B
Abbreviation: IQR means interquantile range; No induction means that patients received only
methylprednisolone; ATG, antithymocyte globulins; Monotherapy means that patients
received only Tacrolimus 6 months post-transplantation.
122
Supplementary Table 2 : Crude hazard ratio (HR), 95% confidence interval (CI) and pvalue (p) of recipient parameters on transplant rejection.
n
Number of
rejection
HR (IC95%)
p
Women
Men
20
69
4
13
1
0.97 (0.31 – 2.96)
0.951
Age≤51a
Age >51
45
44
12
5
1
0.42 (0.15 – 1.19)
0.104
≤18a
>18
47
42
8
9
1
1.33 (0.51 – 3.45)
0.557
Total ≤4a
Total >4
60
29
10
7
1
1.68 (0.64 – 4.46)
0.293
No
basiliximab
ATG
8
26
55
0
6
11
1b
1.61 (0.58 – 4.50)
0.364
Gender
Age at transplantation
in years
Cold ischaemia time (h)
HLA mismatches
Induction
Monotherapy
No
32
6
1
Yes
57
11
0.73 (0.27 – 2.03)
a
Subgroups of patients were defined using the median values of the cohort.
b
patients with no induction are excluded from this bivariate analysis.
0.551
Abbreviation: HR, Hazard Ratio; CI, confidence interval; No induction means that
patients received only methylprednisolone; ATG, antithymocyte globulins;
Monotherapy means that patients received only Tacrolimus 6 months posttransplantation.
123
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
I.
SOUS-POPULATIONS T CD45RC HUMAINES DANS L’AUTOIMMUNITÉ
La tyrosine phosphatase CD45 constitue un composant essentiel dans la voie de signalisation
des lymphocytes T (24). Les animaux et individus n’exprimant pas cette protéine souffrent
d’une immunodéficience sévère. Différents isoformes de cette protéine CD45 (A, B, C, O) ont
été utilisés pour définir des populations de lymphocytes T distinctes. L’expression cellulaire
de ces isoformes varie selon le stade de développement ou l’état d’activation des lymphocytes
T. Un dysfonctionnement dans l’expression de ces isoforme a été corrélé à de nombreuses
pathologies auto-immunes. Par exemple, chez la souris, une expression aberrante de CD45RA
sur les lymphocytes T CD4 est responsable du développement du diabète (505). De même,
lorsque des lymphocytes T CD4 exprimant fortement CD45RB (CD45RBhigh) sont injectés à
des souris immunodéficientes, ils entraînent des pathologies auto-immunes comme la colite
ou une maladie auto-immune multi-organes (242, 243). A l’inverse, les lymphocytes T
CD45RBlow sont capables de contrôler ces pathologies induites par les lymphocytes T CD4
CD45RBhigh. De telles populations ont aussi été identifiées chez le rat. Le transfert de
lymphocytes T CD4 CD45RChigh , chez des animaux histocompatibles athymiques, provoque
des manifestations auto-immunes (syndrome de dépérissement, thyroïdite, diabète), alors que
le co-transfert de cette sous-population avec des lymphocytes T CD4 CD45RClow prévient le
développement de ces maladies (59-61).
Chez l’Homme, les isoformes les plus étudiés sont CD45RA et CD45RO qui
permettent de définir les lymphocytes T naïfs et mémoires (24). L'expression aberrante de ces
isoformes a été associée à plusieurs maladies auto-immunes comme le lupus systémique
érythémateux, l'arthrite rhumatoïde et la maladie d'Alzheimer (70-74). Il a été montré que les
patients exprimant très fortement l’isoforme CD45RA ont un risque accru de développer une
sclérose en plaques, une hépatite auto-immune, un diabète ou un lupus systémique
érythémateux (75). L’augmentation de l'expression de CD45R0 sur les lymphocytes T est
associée à une protection contre ces maladies auto-immunes (180). Par contre, aucune étude
n’a été menée sur l’isoforme CD45RC chez l’Homme. Dans ce travail, nous avons montré
que le niveau d’expression de l’isoforme CD45RC permet aussi de séparer les lymphocytes T
humains en sous-populations fonctionnellement distinctes. Un déséquilibre de ces populations
127
est associé aux maladies auto-immunes que sont les vascularites à ANCA. En effet, nous
avons observé chez des patients atteints d’AAV, que le rapport entre les cellules T CD4
CD45RChigh et T CD4 CD45RClow est déséquilibré, et que les lymphocytes T CD4 de ces
personnes contiennent en moyenne 75 % de cellules T CD4 CD45RClow.
L’auto-immunité induite par les différentes sous-populations T CD45 est associée à
des profils de sécrétion cytokinique spécifique à ces sous-populations. Chez le rat ou la souris,
les sous-populations CD45RC ou CD45RB de lymphocytes au sein des T CD4 et des T CD8
sont caractérisées par des profils cytokiniques différents (47, 48, 53). En effet, il a été montré
que les lymphocytes T CD45RBhigh ou CD45RChigh face à une stimulation polyclonale
produisaient des cytokines de type 1 alors que les sous-populations T CD45RBlow (chez la
souris) ou CD45RClow (chez le rat) sont productrices de cytokines de type 2 et de cytokines
régulatrices. Les capacités des sous-populations T CD45RBhigh et T CD45RChigh à produire des
cytokines telles que l’IFN-γ et le TNF-α (47, 48, 53) semblent être la cause du développement
des pathologies auto-immunes comme la colite qui est une maladies caractérisée par une forte
production d’IFN-γ (243). En effet, la neutralisation de l’IFN-γ prévient la colite chez les
animaux injectés avec des lymphocytes T CD4 CD45RBhigh alors que la neutralisation de l’IL4 n’influence pas la maladie (53). Chez l’Homme, nous avons montré que les cellules T CD4
CD45RChigh produisent des cytokines de type 1 alors que les cytokines de type 2 et l’IL-17
sont produites exclusivement par la sous-population T CD4 CD45RClow. Ces résultats
montrent que la sous-population T CD4 CD45RClow contient les cellules Th2 et Th17. Or chez
les patients atteints d’AAV, des variations quantitatives et qualitatives dans la sécrétion de
cytokines ont été décrites. L’analyse de sérums et de granulomes révèle une déviation vers un
phénotype Th2 chez les patients avec une maladie de VGI généralisée active et ceux atteints
du CCS, alors qu’une réponse Th1 domine chez les patients avec une maladie de VGI
localisée (373-376). De plus, chez les patients atteints de la maladie de VGI ou du CSS, un
pourcentage plus élevé de Th17 et Th2 est observé dans les lésions ainsi qu’in vitro (373-377)
suggérant que les Th2 et les Th17 soient les effecteurs majeurs dans les AAV. De plus, l’IL17 joue un rôle important dans le recrutement et l’activation des neutrophiles, cellules clés des
AAV. Or ce profil de sécrétion de cytokines est caractéristique de la sous-population T CD4
CD45RClow majoritairement représentées chez les patients atteints de vascularites à ANCA. Il
est possible que les traitements immunomodulateurs contre ces vascularites soient à l’origine
de la modification du rapport entre les sous-populations T CD4 CD45RC observée chez ces
patients. Cependant, nous avons montré que ce rapport n’est pas modifié chez des patients
atteints de lupus systémique érythémateux ayant reçu les mêmes traitements. Nous avons
128
aussi montré que la proportion des T CD45RClow est indépendante de la durée de la maladie
ainsi que du nombre de rechutes. Ces résultats suggèrent que le déséquilibre observé entre les
sous-populations T CD4 CD45RC chez ces patients pourrait être à l’origine de ces
pathologies.
L’étiologie des AAV n’est pas encore bien définie. Cependant l’importance des
lymphocytes T est aujourd’hui bien établie (349). De plus, en accord avec nos résultats une
étude a montré une diminution des cellules naïves en périphérie chez des patients atteints
d’AAV ainsi qu’une augmentation des cellules effectrices mémoires CD4 (TEM) (371, 372).
La forte proportion de CD45RClow pourrait s’expliquer par le fait que ces cellules soient
stimulées en continu à cause de la présence permanente de l’antigène. Il a été montré que,
chez l’animal, l’activation des lymphocytes T induit une diminution persistante de
l’expression de CD45RC seulement quand l’antigène est présent (506, 507). Cette activation
constante pourrait s’expliquer par un défaut qualitatif des lymphocytes T régulateurs comme
il a été montré chez les patients atteints de vascularite granulomateuse idiopathique (369). Les
lymphocytes T CD4 CD45RClow fortement représentés chez les patients atteints de
vascularites à ANCA semblent responsables du développement de ces pathologies. L’analyse
en cytométrie en flux montre que les sous-populations T CD45RC humaines sont
hétérogènes. Les cellules naïves sont majoritairement contenues dans les sous-populations T
CD4 et CD8 CD45RChigh alors que les cellules mémoires (TCM et TEM) sont majoritairement
contenues dans les populations CD45RClow. Quant aux cellules T CD8 CD45RCint, elles sont
majoritairement composées de cellules TEMRA. Nous avons cependant montré que le marqueur
CD45RC n’était pas l’homologue de CD45RA car il existe des cellules qui n’expriment pas
CD45RC mais expriment CD45RA. De plus, nous avons pu montrer que lorsque les cellules
CD45RClow sont séparées selon l’expression de CD45RA, ces deux sous-populations
(CD45RClow/CD45RA- et CD45RClow/CD45RA+) possèdent un profil de sécrétion de
cytokines identique à celui observé avec les CD45RClow totales. Ceci montre que l’expression
de CD45RC permet d’identifier de nouvelles sous-populations de lymphocytes T humains,
différentes des sous-populations T CD45RA. L’analyse de l’expression de CD45RC sur les
lymphocytes T pourrait permettre de disposer d’un marqueur phénotypique qui aurait
plusieurs intérêts à savoir : i) la possibilité de suivre l’évolution de ces sous-populations lors
du développement de réponses immunes pathologiques, ii) étudier l’implication d’un
déséquilibre entre ces sous-populations dans le développement des réponses auto-immunes,
iii) manipuler l’équilibre entre ces sous-populations à des fins thérapeutiques.
129
II.
SOUS-POPULATIONS
T
CD45RC
HUMAINES
ET
ALLOTRANSPLANTATION
1. Le niveau d’expression de CD45RC permet de prédire le rejet de greffe rénale
chez l’Homme
La transplantation d’organes dans le but de remplacer des organes vitaux défaillants ou
atteints de cancer est actuellement un traitement de choix dans de nombreuses pathologies
humaines. L’essentiel des échecs attribués à la survenue du rejet du greffon par le système
immunitaire de l’hôte ont pu être fortement réduits à l’aide des traitements
immunosuppresseurs. Mais l’inhibition non spécifique de l’ensemble du système immunitaire
par l’intermédiaire de ces drogues se heurte pourtant à de graves problèmes. Outre leur
toxicité propre, les drogues provoquent des effets secondaires tels que des infections
opportunistes virales, bactériennes, ou fongiques, et surtout des cancers viro-induits, dont
l’incidence est significativement augmentée après transplantation d’organe (508). De plus, le
patient doit le plus souvent garder une administration à vie de ces drogues puisqu’un arrêt ou
une diminution pourrait conduire le système immunitaire à recouvrer ses capacités
d’induction du rejet. Par ailleurs, même si ces traitements immunosuppresseurs ont permis de
maîtriser le rejet aigu des greffons, ils ne préviennent pas le développement du rejet chronique
dont l’incidence ne diminue pas (509). Enfin, la pénurie d’organes qui fait suite au succès
grandissant de la transplantation réduit de façon drastique le choix et la disponibilité des
greffons. Dès lors, chaque organe devenant très précieux, leur fonctionnalité et leur
acceptation par le receveur doivent être maintenues le plus longtemps possible. Afin de
trouver une alternative à ces traitements immunosuppresseurs, l’étude des mécanismes
d’induction d’une tolérance en allo-transplantation reste un axe de recherche majeur en
transplantation d’organes. La tolérance immunologique se définit comme une absence de
réaction vis-à-vis de certains antigènes (les allo-antigènes dans le cas d’une greffe), en
l’absence d’immunosuppression, alors que la réponse immunitaire est maintenue contre les
autres antigènes. Cet état idéal d’immunosuppression spécifique du donneur a été atteint dans
de nombreux modèles animaux d’allogreffe. Mais cet état de tolérance du greffon n’a été
atteint que très rarement chez l’homme et les raisons en sont inconnues. En effet, certains
patients après arrêt du traitement immunosuppresseur, souvent à cause d’intolérance trop
forte, voient leur greffon accepté définitivement alors que d’autres subissent un rejet aigu
(510). À l’heure actuelle, aucun moyen n’a été mis en évidence pour différencier les
130
personnes qui vont tolérer leur greffe de celles qui vont la rejeter et les patients subissent donc
tous de la même façon les lourds traitements immunosuppresseurs. Il apparaît donc important
de pouvoir identifier un marqueur biologique permettant de distinguer les populations
cellulaires alloréactives pathogènes de celles permettant une tolérance du greffon (511).
La recherche d’un test pronostic remonte aux années 60 lorsque le typage HLA, les
tests de réaction croisée du sérum et la réaction lymphocytaire mixte (MLR) ont été inventés
(512-515). Les premiers bio-marqueurs du rejet identifiés ont été le système ABO et les
molécules HLA. Étant donnée l’importance des molécules HLA en transplantation, la
recherche de donneurs HLA identiques permet de prévenir une allo-réponse sévère. Mais,
étant donné le peu d’organes disponibles, la majorité des patients sont transplantés avec un
organe dont le HLA n’est pas complètement compatible (516). Des études montrent que
l’immunogénicité des incompatibilités HLA est variable. Certaines incompatibilités, appelées
« incompatibilités acceptables » seraient moins reconnues par le système immunitaire du
receveur. En effet, des analyses rétrospectives de survie de greffe ont montré que le
phénotype HLA du receveur et particulièrement les antigènes HLA-DR pourrait prédire la
force de la réponse allo-immune. Par exemple, les receveurs HLA-DR6 positifs rejettent plus
facilement des greffes rénales (517) incompatibles alors que les receveurs HLA-DR1 positifs
sont moins répondeurs (518). De même, certaines incompatibilités du donneur, comme HLADR6 est moins immunigène que d’autres (519). Cependant, ces études d’associations ciblant
seulement le donneur ou le receveur sont un peu réductrices. Il est important de considérer
l’immunogénicité HLA dans un contexte donneur/receveur. Basé sur ce principe, Maruya et
al. ont pu définir des incompatibilités HLA acceptables/permissives (520). Les combinaisons
donneur/receveur avec des incompatibilités permissives ont un taux de survie de greffe
similaire aux greffes HLA identiques. D’un autre coté, Doxiadis et al. ont pu démontrer que
certaines incompatibilités HLA étaient fortement immunogènes chez certains patients (521).
De nos jours, la survie de greffe rénale avec une seule incompatibilité HLA est
significativement plus faible chez des patients HLA-A1 positifs (45% à 5 ans) que chez des
patients HLA-A1 négatifs (75% à 5 ans). Ces études ont conduit à la définition
d’incompatibilités « taboo » conduisant à un faible taux de survie du greffon et qui doivent
donc être évitées.
Les lymphocytes T jouant un rôle crucial dans le rejet aigu, une des options
alternatives est d’étudier leur réponse à l’aide de tests fonctionnels in vitro. De nombreuses
études ont montré une corrélation entre la faible réponse des cellules dans de tels tests et la
131
survie du greffon (522, 523). Mais d’autres études ont montré que les cellules répondeuses
n’avaient qu’une valeur prédictive limitée voire aucun effet (524). Le problème de ces tests
provient du fait qu’ils n’apportent pas d’informations quantitatives. La quantification de
précurseurs alloréactifs au sein des lymphocytes T CD4 et T CD8 est devenu possible avec
l’introduction de test d’analyse en dilution limite (DLA) (525). Une corrélation entre une
augmentation de la fréquence des CTL alloréactifs et le rejet aigu de greffe rénale a alors été
décrit (526). Van Besouw et al. ont montré que la diminution des traitements
immunosuppresseurs lors de greffe rénale est possible lorsque la fréquence de CTL est faible
alors que lorsqu’elle est élevée, la fréquence de rejet est augmentée (527). D’autres équipes
n’ont cependant pu observer aucune différence de fréquence de CTL (528, 529), mais ont mis
en évidence une différence de fréquence de lymphocytes T CD4 alloréactifs (529).
L’analyse des cytokines a aussi fait l’objet d’études. Le microenvironnement
cytokinique dans les tissus lymphoïdes détermine la différenciation des lymphocytes T et
ainsi le rejet. Si les cytokines pro-inflammatoires (ex :TNF-α) dominent, le risque de rejet
pourrait être plus élevé alors que si les cytokines anti-inflammatoires (ex : IL-10) dominent le
risque pourrait être réduit. Il a été montré qu’un polymorphisme d’un seul nucléotide (SNP) à
la position 308 du promoteur du TNF-α prédit une augmentation significative du rejet (530,
531). Le rejet de greffe hépatique et pulmonaire a aussi été relié à des polymorphismes du
gène de l’IL-10 (532). Le niveau de cytokines sériques pourrait être un facteur prédictif du
rejet. Dans une étude prospective de greffe rénale, une augmentation d’IFN-γ a été observée
chez les patients ayant rejeté leur greffon (533). Cependant la très grande variabilité
interindividuelle ne permet pas de conclure.
Par contre, des équipes de plus en plus nombreuses ont montré que l’augmentation
plasmatiques de la forme soluble de CD30 (sCD30) est un très bon indicateur pronostic du
rejet aigu chez les receveurs lors de greffe rénale (534, 535). sCD30 appartient à la
superfamille des récepteurs au TNF. En présence de DC allogéniques sCD30 est sécrété par
une sous-population de lymphocytes T ayant de fortes capacités prolifératives et synthétisant
de l’IFN-γ et de l’IL-5 (536). L’augmentation de sCD30 semble accroître la vulnérabilité du
greffon aux anticorps anti-HLA ainsi que les effets de l’incompatibilité HLA (537).
Nos travaux ont permis de montrer que le niveau d’expression de CD45RC pourrait
faire partie de ces biomarquers prédictifs du rejet. Chez l'Homme, nous avons montré que les
sous-populations CD45RC T CD4 et T CD8 ont des propriétés alloréactives différentes in
132
vitro. De plus, nous avons montré que les patients ayant plus de 54,7% de lymphocytes T
CD8 CD45RChigh avant la greffe voient leur risque de rejet augmenté de cinq fois par rapport
aux autres patients. Étant donné la forte valeur prédictive négative (93%), nous pouvons dire
que si un patient à moins de 54,7% de T CD8 CD45RChigh avant la greffe, il ne rejettera pas
son rein dans 93% des cas. Ces résultats impliquent que le niveau d’expression de CD45RC à
la surface des lymphocytes T CD8 pourrait être utilisé comme marqueur prédictif du rejet. Il
faut souligner que de tels résultats ont été obtenus avec une cohorte de seulement 89 patients.
L’étude pourra donc être élargie à plusieurs centres de transplantation afin de voir si on
augmente les capacités prédictives de CD45RC. Il serait aussi intéressant d’étudier si
l’analyse combinée du HLA, de sCD30 et de CD45RC peut augmenter la fiabilité du
pronostic de rejet. L’analyse en routine de CD45RC sur les PBMC avant la greffe par
cytométrie de flux serait une méthode très rapide et peu coûteuse qui permettrait d’améliorer
les conditions de vie des patients.
Cette étude pourrait aussi permettre le développement de nouvelles stratégies
thérapeutiques. En effet, il serait possible de cibler spécifiquement les cellules CD45RChigh
comme cela a été montré lors du traitement par des anticorps dirigés contre l’isoforme
CD45RB. Ces anticorps affectent spécifiquement les CD45RBhigh et préviennent le rejet de
greffe dans les modèles animaux (538, 539).
Nous avons aussi montré que la proportion de cellules naïves (CD45RA+CD45ROCCR7+) parmi les lymphocytes T CD8 était aussi associée au rejet de greffe montrant pour la
première fois chez l’homme, que les receveurs possédant une plus forte proportion de cellules
naïves ont plus de risque de rejeter leur greffon. Cette observation est en accord avec des
données obtenues dans des modèles animaux où il a été montré que seuls les lymphocytes T
naïfs sont capables d’induire une GvHD (540-543). L’incapacité des T mémoires à induire
une réponse alloréactive pathogènes pourrait s’expliquer par la différence de répertoire. En
effet, le répertoire des lymphocytes T mémoires, moins large que celui des T naïfs, diminue
leur capacité à répondre à des alloantigènes. Cependant les sous-populations T CD8
CD45RCint et CD45RClow répondent aux alloantigènes puisqu’elles prolifèrent de façon
équivalentes aux CD45RChigh.
Cette observation pourrait alors s’expliquer par une plus forte pathogénicité des
lymphocytes T CD8 CD45RChigh par rapport aux CD45RCint et les CD45RClow dans le rejet de
greffe. Les CD45RCint et les CD45RClow ont la capacité de reconnaître les alloantigènes, mais
ne possèdent pas les fonctions effectrices requises pour médier le rejet de greffe. Le rejet aigu
133
lors de greffe rénale se manifeste par l’accumulation de cellules mononuclées dans
l’interstitium accompagné par une inflammation des tubules et parfois des artères (544). Les
cellules mononuclées perméabilisent l’espace interstitiel autour des tubules. Ces cellules sont
majoritairement des lymphocytes T CD4 et CD8. Une augmentation de l’IFN-γ et de
l’expression de T-bet est observée lors de rejet aigu de rein (450, 545). Or nous avons montré
que la sous-population T CD45RChigh est exclusivement constituée de cellules Tc1 et sécrète
de grande quantité d’IFN-γ. Les cellules T présentes dans le greffon lors du rejet contiennent
des granules cytotoxiques (perforine, granzyme A et B) ou la molécule FasL (546).
L’expression génique des ARNm du greffon montre une augmentation de ces molécules
cytotoxiques (450, 545). De plus, Fowler et al. ont montré que les lymphocytes T CD8 Tc1 et
Tc2 ont des capacités cytotoxiques différentes (547). Les lymphocytes Tc1, qui sécrètent des
cytokines pro-inflammatoires, sont capables de lyser leurs cibles via la voie Fas/FasL et
perforine/granzyme alors que les lymphocytes Tc2, qui sécrètent des cytokines antiinflammatoires, n’utilisent que la voie perforine/granzyme (548). Ainsi, les lymphocytes Tc1
ont des propriétés cytotoxiques supérieures aux lymphocytes Tc2 (547) ce qui pourrait
expliquer que les T CD8 CD45RCint et CD45RClow aient des capacités différentes dans
l’induction du rejet. L’analyse des fonctions cytotoxiques des sous-populations T CD8
CD45RC chez le rat montre que seuls les T CD8 CD45RChigh sont cytotoxiques face à des
CPA allogéniques (312). Ce défaut de cytotoxicité serait associé à un défaut d’expression de
la perforine par cette population. Il serait donc intéressant d’étudier les propriétés
cytotoxiques des trois sous-populations T CD8 CD45RC humaines en effectuant des tests de
cytolyse ou en analysant l’expression d’effecteurs cytotoxiques tels que la perforine, les
granzymes et FAS/FAS-L lors de cultures de ces sous-populations avec des CPA
allogéniques.
Les lymphocytes T CD45RCint et CD45RClow sont caractérisés par une grande
production d’IL-17. Or dans des modèles animaux et chez l’Homme, l’IL-17 semble associée
au rejet. Cependant des données tendent à montrer que le rôle de l’IL-17 dans l’alloréactivité
n’est pas si simple. La neutralisation de l’IL-17, dans un modèle de greffe de moelle osseuse
chez des receveurs sauvages, entraîne une GvHD aiguë exacerbée médiée par les lymphocytes
Th1 (152). Ces résultats indiquent que les Th17 du donneur peuvent inhiber la différenciation
Th1 et améliorer la GvHD aiguë. Une telle observation a été retrouvée dans des modèles de
colite et d’asthme allergique qui montrent un rôle protecteur de l’IL-17. Dans ces modèles,
l’IL-17 semble contrôler respectivement la réponse de type 1 et de type 2 responsables de ces
pathologies (104, 549). Ce rôle protecteur de l’IL-17 pourrait aussi s’expliquer par le fait que
134
les Treg sont aussi des cellules productrices d’IL-17. En effet, très récemment, il a été montré,
chez l’Homme, que des cellules T CD4 Foxp3+ productrices d’IL-17 sont présentes dans les
amygdales d’individus sains et que ces cellules possèdent des capacités régulatrices (550).
Mais le rôle de l’IL-17 dans les capacités régulatrices des Treg n’est pas encore connu. Dans
notre étude, les cellules Foxp3+ et les cellules productrices d’IL-17 sont retrouvées dans les
mêmes sous-populations T CD45RC. Il est donc possible que ces cellules productrices d’IL17 contiennent de telles cellules régulatrices. Il serait intéressant d’étudier, en marquage
intracytoplasmique, si les cellules productrices d’IL-17 sont aussi productrices d’IL-10.
Plusieurs travaux ont attribué un rôle important des lymphocytes T CD8 dans la
régulation de la différenciation des lymphocytes T CD4. Par exemple, les lymphocytes T CD8
peuvent contrôler négativement la réponse Th2 et favoriser la réponse Th1, par leur capacité à
produire de l'IFN-γ (551, 552). Chez le rat, la déplétion des lymphocytes T CD8 favorise
l'émergence d'une réponse Th2 et la production d'immunoglobulines de type 2 (161, 553,
554). Chez la souris, lors d'une infection virale, l'absence de lymphocytes T CD8 est associée
à une diminution de la réponse Th1 et à une augmentation de celle de type Th2 (551, 552).
Chez le rat BN, le développement préférentiel d'une réponse immune de type 2 est associé,
d'une part à une faible fréquence de lymphocytes T CD8 (555), et d'autre part à la polarisation
de la réponse T CD8 vers le type 2. Les lymphocytes T CD8 de rat BN produisent 20 fois
moins d'IFN-γ, mais 30 fois plus d'IL-4 que les lymphocytes T CD8 de rat Lewis (556).
D'autres travaux réalisés chez la souris et chez l'homme ont mis en évidence que des
lymphocytes T CD8 sont capables d'induire la maturation des DC (557). Les T CD8 peuvent
aussi entraîner les DC à produire de l’IL-12 et ainsi favoriser une réponse Th1 (558). Les
travaux chez le rat montrent également que les sous-populations T CD8 CD45RC influencent
la réponse T CD4 alloréactive (312). Les lymphocytes T CD8 CD45RChigh potentialisent la
réponse T CD4 en termes de prolifération et amplifient la différenciation des lymphocytes
CD4 en lymphocytes Th1. Au contraire, les lymphocytes T CD8 CD45RClow inhibent la
prolifération et la différenciation des lymphocytes T CD4 alloréactifs en lymphocytes Th1
sans pour autant favoriser leur différenciation en lymphocytes Th2.
2. Le niveau d’expression de CD45RC permet de prédire la GvHD dans un modèle
de souris humanisées
135
Les lymphocytes T alloréactifs peuvent, en plus du rejet, être responsables d’une autre
pathologie lors d’un type particulier de greffe qu’est la greffe de CSH. La greffe de CSH
allogéniques a été conçue pour obtenir la reconstitution complète et durable du système
hématopoïétique d'un individu, et permettre le traitement de différentes pathologies
médullaires comme des leucémies (559). Or, les lymphocytes T contenus dans le greffon sont
aussi susceptibles de reconnaître l'hôte comme étranger. Cette alloréactivité contribue à une
complication sévère et fréquente de la greffe de CSH : la maladie du greffon contre l'hôte
(GvHD).
La GvHD reste l'obstacle majeur dans la réalisation de la greffe allogénique
hématopoïétique (560, 561). Sa sévérité est variable et peut aller jusqu'à la mort du receveur.
Son contrôle, voire sa prévention, constitue un objectif majeur dans la recherche sur la greffe
de CSH. Cette réaction se déclenche lorsque les lymphocytes T présents dans le greffon
s'activent et prolifèrent en reconnaissant les antigènes histoincompatibles exprimés sur les
cellules et les tissus du receveur. La GvHD conduit à une maladie multi-organes et s'exprime
de façon aiguë ou chronique. Plusieurs facteurs peuvent influencer le devenir de la GvHD : la
composition cellulaire du greffon médullaire, c'est à dire le nombre et le phénotype des
cellules T du donneur, ou l'intensité du traitement myéloablatif du receveur avant la greffe.
Chez le rat, il a été montré que les lymphocytes T CD4 CD45RChigh sont capables
d’induire une GvHD aiguë ou chronique chez un receveur semi-allogénique (LEW x BN)
alors que les T CD4 CD45RClow en sont incapables (540). Dans ce modèle de GvHD aiguë
induite par injection des lymphocytes T CD4 de rat LEW chez des receveurs F1 (LEW x BN),
l’ injection des lymphocytes T CD4 associés aux lymphocytes T CD8 CD45RChigh induit une
GvHD plus sévère en termes de lésions histopathologiques et de mortalité que la GvHD
observée chez les animaux injectés avec les lymphocytes T CD4 seuls. Par contre
l’administration des lymphocytes T CD4 en association avec des lymphocytes T CD8
CD45RClow prévient complètement les signes cliniques et histologiques de la GvHD chez la
majorité des receveurs (312).
Ces résultats sont en accord avec les résultats que nous avons obtenus sur la cohorte de
transplantés rénaux et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la greffe de
CSH. Nous avons donc établi une collaboration avec les Docteurs Van Tol à Leiden et
Damoiseaux à Maastricht (Pays-Bas) afin d’étudier rétrospectivement si la proportion des
sous-populations T CD4 et CD8 CD45RC du donneur de CSH avant la greffe permet de
prédire l’apparition de la GvHD chez le receveur (en cours d’étude). Nous analyserons chez
les donneurs le rapport CD45RChigh/CD45RClow et chez les receveurs le devenir de l’allogreffe
136
2 Gy
A
i.p
Suivi clinique et anayse
histologique
hPBMC
foie
Souris Scid/bg
poumons
peau
foie
hPBMC
B
74%
1000 26%
or
500
0
101 102 103 104 105
CD45RC
Survie (%)
500
400
300
200
100
0
2 Gy
45%
55%
i.p
101 102 103 104 105
Souris Scid/bg
CD45RC
2 .106 ( ) or 5.106 ( )
hPBMC donneur 1
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
peau
PBS
# Cells
# Cells
1500
poumons
2 .106 ( ) or 5.106 ( )
hPBMC donneur 2
Suivi survie
0
20
40
60
80
100
jours
Figure 22. Les PBMC humains contenant une forte proportion de CD45RChigh sont
responsables du développement de la xéno-GvH chez les souris SCID/bg.
A. 30 ou 15.106 de PBMC humains (hPBMC) provenant d’individus sains sont injectés
(intrapéritonéale) à des souris receveuses SCID/bg irradiées (2 Gy). Les souris sont sacrifiées
dès l’apparition des signes cliniques de GvH. L’analyse histologique des souris injectées avec
des PBMC humains (à gauche) ou du PBS (à droite) est représentée. Le foie, les poumons et
la peau ont été fixés puis marqués avec de l’hématoxyline/éosine (en haut) ou avec un
anticorps ant-CD45 humain (en bas) (n=14). Échelle: x 200. B. 2 ou 5.106 de PBMC humains
provenant du sang de deux individus (donneur 1 ou donneur 2) possédant un profil CD45RC
opposé au sein des lymphocytes T ont été injectés comme en A. La survie des souris d’une
expérience représentative est montrée ici (n=9 souris par groupe). L’expérience a été
renouvelée trois fois avec trois paires de donneurs différentes.
137
en étudiant les paramètres suivants : GvHD aiguë ou chronique, données hématologiques et
immunologiques, toxicité viscérale et chimérisme hématopoïétique. Si comme chez l’animal,
les lymphocytes T responsables de la GvHD sont contenus dans les CD45RChigh, on s’attend à
ce que l’intensité de la GvHD soit faible chez les donneurs de moelle osseuse ayant moins de
lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RChigh. Ceci pourrait avoir des retombées importantes en
clinique humaine puisqu’il deviendrait possible d’adapter les traitements immunosuppresseurs
(dose, début, durée) en fonction des donneurs de moelle osseuse et d’améliorer l’efficacité de
cette thérapeutique afin de généraliser son utilisation à des hémopathies héréditaires.
En accord avec cette hypothèse, nous avons étudié l’implication de ces souspopulations T CD45RC dans la GvHD à l’aide d’un modèle de souris humanisées. Ces études
sont effectuées chez la souris SCID/beige, déficiente en lymphocytes T, B et en cellules NK
(562). Nous avons montré que les souris SCID/beige injectées avec différentes doses de
leucocytes humains du sang périphérique développent les signes cliniques et
histopathologiques d’une GvHD aiguë (infiltrats inflammatoires dans la peau, le foie et les
poumons), et cela de façon dépendante de la dose de cellules injectées (Figure 22). Afin
d’analyser si la proportion de CD45RC au sein des lymphocytes T CD4 et T CD8 des
donneurs de CSH permet de prédire l’apparition et la sévérité de la GvHD, nous avons injecté
des leucocytes du sang humain provenant de donneurs différents et contenant des proportions
différentes de lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RChigh. Nous avons évalué chez ces souris
receveuses à la fois les signes cliniques de GvHD ainsi que la présence d’infiltrats
inflammatoires par histologie. Des résultats préliminaires montrent que les souris injectées
avec des leucocytes contenant une forte proportion de CD45RChigh (70 %) sont plus
susceptibles de développer une GvHD (incidence : 8/9) que celles ayant reçu des leucocytes
contenant une faible proportion de CD45RChigh (30% de CD45RChigh, incidence : 1/9) (Figure
22). Ces résultats sont à confirmer en réalisant des expériences supplémentaires. Nous
utiliserons également ce modèle pour analyser le pouvoir inducteur et/ou régulateur de la
GvHD des différentes sous-populations humaines purifiées : T CD4 CD45RChigh, T CD8
CD45RChigh, T CD4 CD45RClow ou T CD8 CD45RClow. Ce système nous permettra d’étudier,
in vivo, les propriétés allo-(xéno)-réactives des sous-populations T CD45RC (CD4 et CD8)
humaines afin de déterminer si l’expression de CD45RC pourrait être utilisée comme un outil
diagnostique prédictif de développment de GvHD.
Des études cliniques et des travaux chez la souris, suggèrent que le développement de
la GvHD aiguë est classiquement une réaction de type 1, associée à une production d'IL-2 et
138
d'INF-γ et à l’activation des lymphocytes T CD8 cytotoxiques (563, 564). Chez les souris
injectées avec des PBMC ayant une plus forte proportion de CD45RClow la fréquence
d’apparition de la xéno-GvHD est plus faible. Ceci pourrait s’expliquer par la différence de
profil de production de cytokines de ces deux sous-populations. Les lymphocytes T CD8
CD45RChigh sécrètent seulement des cytokines de type 1 pro-inflammatoires qui pourraient
accentuer la différenciation des lymphocytes T CD4 alloréactifs en lymphocytes Th1
responsables des lésions tissulaires.
Les cellules matures immunocompétentes contenues dans le greffon hématopoïétique
possèdent aussi des effets bénéfiques majeurs lors de la greffe de CSH qui sont un effet antiinfectieux et un effet anti-tumoral (565, 566). Le conditionnement avant la greffe et la période
de reconstitution du système hématopoïétique, font que le receveur subit une
immunodépression sévère de longue durée, qui le rend vulnérable aux infections bactériennes,
virales ou fongiques. Cependant, les infections opportunistes sont relativement bien
contrôlées en plaçant le patient sous une antibiothérapie massive et multiple, et en l'isolant
dans un milieu protégé : chambre et environnement stériles sous flux laminaire, alimentation
stérile. Le principal risque infectieux vient des infections latentes d'un individu, telles que les
infections EBV et CMV (567), (568). Ainsi, il a été observé des syndromes
lymphoprolifératifs B induits par l'EBV ou des maladies à CMV (de type pulmonaire), chez
des individus transplantés avec un greffon dont les lymphocytes T ont été éliminés. Ces
manifestations pathologiques ont pu être contrôlées par le transfert de cellules T. Les
lymphocytes T CD45RCint et CD45RClow étant majoritairement composés de cellules
mémoires, on peut s’attendre à ce que ces populations permettent aussi le contrôle de ces
infections. Il serait tout de même intéressant de tester leur capacité à répondre in vitro à des
antigènes de rappel comme la toxine tétanique ou la tuberculine ainsi que leur réponse face à
des cellules infectées par EBV.
Bien que les conditionnements par chimio et/ou radiothérapie permettent d'éliminer au
maximum les cellules cancéreuses, ils ne permettent pas de les éradiquer totalement. Les
quelques cellules résiduelles persistant chez le malade sont suffisantes pour recoloniser tout
l'organisme et conduire à des rechutes leucémiques. La plupart des études chez la souris et
l'homme, ont montré que les cellules T allogéniques sont particulièrement efficaces pour
exercer une activité anti-tumorale chez un receveur (réaction du greffon contre la tumeur ou
GvT). Ces lymphocytes T allogéniques reconnaissent soit des antigènes spécifiques de la
139
tumeur, soit des alloantigènes du CMH et des alloantigènes mineurs exprimés sur les cellules
normales et malignes (396, 569). Le développement de méthodes visant à mieux exploiter
l'effet bénéfique anti-tumoral, a transformé la greffe des CSH en une véritable
immunothérapie cellulaire plutôt qu'un simple traitement pour les complications apportées par
les hautes doses de chimio-radiothérapie. Différents travaux ont montré qu’il est possible
d’inhiber la réaction du greffon contre l’hôte sans pour autant affecter l’effet anti-tumoral
(570, 571). En effet, Trenado et al. ont montré que le transfert de cellules régulatrices T CD4
CD25+ spécifiques de l’allo-antigène peut inhiber le développement de la GvHD lorsqu’elles
sont co-injectées avec la moelle osseuse et les cellules T effectrices du donneur. Afin
d’étudier l’effet bénéfique réel dans la transplantation de CSH, il serait nécessaire d’étudier
les capacités des cellules CD45RCint et CD45RClow à éliminer des cellules tumorales. Pour
cela, il sera possible d’utiliser ce modèle de xéno-GvHD. Les souris SCID/beige pourront être
injectées avec les différentes sous-populations T CD45RC ainsi qu’avec des lignées
leucémiques humaines afin d’évaluer les capacités anti-tumorales de ces sous-populations.
L'infusion différée dans le temps des lymphocytes du donneur (delayed lymphocyte
infusion ou DLI) a permis de réduire la sévérité de la GvHD (572, 573). Le but de la DLI est
de diminuer l'intensité du conditionnement, en espérant une réduction des lésions tissulaires,
puis de transférer tardivement les lymphocytes matures du donneur afin qu’ils éliminent les
cellules tumorales résiduelles. De cette façon, il est possible d'obtenir un équilibre entre les
deux effets majeurs de l'alloréaction : une alloréactivité trop faible pour induire une GvHD
délétère, et une réaction suffisamment protectrice pour obtenir un bon effet GvT. En
diminuant l'inflammation systémique du conditionnement, la libération de cytokines proinflammatoires est réduite, et les lymphocytes matures du donneur ont un accès limité vers les
tissus sains. Cependant, les résultats du traitement des leucémies aiguës, par la DLI sont
décevants, et la GvHD reste une complication même si elle est mieux contrôlée (574). Trois
facteurs favorisent l'apparition de la GvHD après la DLI : la période entre la greffe de moelle
osseuse et le début de la DLI (inférieure à 45 jours), le nombre de cellules et la composition
des cellules matures transférées. Il a été montré, par exemple, que la présence d'un grand
nombre de lymphocytes T CD8 dans le mélange cellulaire, favorise l'apparition de la GvHD
après une DLI (575, 576). Ceci suggère la nécessité de sélectionner des lymphocytes capables
d'améliorer l'efficacité de ce traitement, en réduisant l'intensité de la GvHD tout en préservant
l'effet anti-tumoral. Notre étude clinique sur les rejets de greffe ainsi que les résultats
préliminaires chez les souris SCID/bg suggèrent que les sous-populations T CD45RC
pourraient constituer une solution. En effet, il pourrait être envisageable de dépléter le greffon
140
des cellules T CD45RChigh. Les cellules injectées contiendraient alors des cellules mémoires
matures permettant de lutter contre les infections opportunistes et potentiellement des cellules
capables d’effectuer cette activité anti-tumorale. Les cellules alloréactives pathogènes par
contre seraient alors éliminées.
III.
PROPRIÉTÉS RÉGULATRICES DES SOUS-POPULATIONS T
CD45RC HUMAINES
Le contrôle de l’intensité de la réponse immunitaire, qu’elle soit dirigée contre les
antigènes exogènes (388), ou des antigènes du soi (577), est assuré par des lymphocytes T
régulateurs. Les cellules régulatrices jouent un rôle essentiel pour le maintien de
l’homéostasie du système immunitaire et un dysfonctionnement de ces cellules peut être
responsable de pathologies graves telles que l’auto-immunité, le rejet de greffe et la GvHD
(236, 578, 579).
Les molécules CD45RC (chez le rat) ou CD45RB (chez la souris) font parties des
marqueurs cellulaires utilisés pour distinguer les cellules régulatrices des cellules pathogènes
T. Les cellules T CD4 CD45RChigh provenant de rat donneur non manipulé, sont capables de
provoquer des signes de maladies multi-organes lorsqu’elles sont transférées chez des
animaux athymiques (59). Le transfert des cellules T CD4 CD45RClow en association avec les
CD45RChigh inhibe le développement de ces pathologies, montrant que les cellules T CD4
CD45RClow contiennent des cellules régulatrices capables de prévenir des réponses autoimmunes induites par les cellules T CD4 CD45RChigh. Il existe également une inter-régulation
entre les sous-populations T CD8 CD45RC. La population T CD8 CD45RClow contient des
cellules régulatrices qui inhibent la prolifération des lymphocytes T CD8 CD45RChigh stimulés
en réaction lymphocytaire mixte et inhibent également leur différenciation en lymphocytes T
producteurs de cytokines de type 1 (312). En outre, Foxp3, le facteur de transcription
nécessaire pour le développement de lymphocytes T CD4 régulateurs (580), est sélectivement
exprimé par la population T CD8 CD45RClow de rat identifié récemment comme une nouvelle
population de lymphocytes T CD8 régulateurs naturels.
Dans ce travail, nous avons montré que l’expression de Foxp3 est restreinte aux
lymphocytes T CD4 et T CD8 CD45RClow. Il est donc également important de réaliser des
141
+
Lymphocytes
T CD4 CFSE+
CD8 High
20%
CFSE
CD8 Int
30%
CFSE
41%
IFN-γ
Sous-populations
T CD8 CD45RC
CPA
allogéniques
-
Marquages ICS
Analyse FACS
+/-
CD8 Low
34%
CFSE
49%
IFN- γ
31%
CFSE
44%
IFN- γ
42%
IFN- γ
Figure 23. Les sous-populations T CD8 CD45RC ne contrôlent ni prolifération ni la
sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T CD4.
Les sous-populations T CD8 CD45RC sont purifiées par cytométrie de flux puis incubées
avec des lymphocytes T CD4 du même donneur marqués au CFSE ainsi qu’avec des CPA
allogéniques. Après 3 jours de culture, les lymphocytes T CD4 sont marqués avec des
anticorps ant-CD4, anti-TCR et anti-IFN-γ. La prolifération (dilution du CFSE ;
histogrammes en haut) et la production d’IFN-γ (marquage intracytoplasmique ou ICS ;
histogrammes en bas) des lymphocytes T CD4 sont analysées en cytométrie de flux (FACS).
142
études fonctionnelles afin d’analyser, la capacité de ces cellules régulatrices à contrôler les
lymphocytes T effecteurs CD4 et CD8 et d’analyser les mécanismes de régulation. Les
capacités des sous-populations T CD8 CD45RC humaines à prédire le rejet pourrait aussi
s’expliquer par des capacités régulatrices des lymphocytes T CD8 CD45RCint et CD45RClow.
Des expériences de co-culture nous permettront d’étudier la capacité des lymphocytes
T CD4 et T CD8 de type CD45RClow à inhiber la réponse proliférative et la production d’IFNγ des lymphocytes T CD8 et T CD4 de type CD45RChigh dans une réaction lymphocytaire
mixte. Cependant, des études préliminaires ont montré que les lymphocytes T CD4 et T CD8
CD45RClow humains étaient incapables de contrôler des lymphocytes T CD4 effecteurs in
vitro en stimulation polyclonale ou en MLR (Figure 23) contrairement à des cellules T CD4
CD25high (non montré). Les lymphocytes T CD4 et T CD8 de type CD45RChigh ont été
marqués au CFSE avant mise en culture avec des nombres croissants de cellules T CD4
CD45RClow ou T CD8 CD45RClow provenant du même donneur et des CPA allogéniques
irradiées. L’analyse de la dilution du CFSE a permis d’étudier la prolifération des souspopulations T CD8 et T CD4 CD45RChigh. L’analyse de production d’IFN-γ a été testée par
ELISA et par marquage intracytoplasmique. Dans ces conditions nous n’avons pas pu mettre
en évidence une inhibition de la prolifération ni de la production d’IFN-γ par les lymphocytes
T CD8 CD45RCint et CD45RClow. Mais ces résultats n’excluent pas une régulation dans
d’autres conditions expérimentales ainsi qu’in vivo.
Différents mécanismes de suppression sont mis en jeu par les cellules régulatrices T.
Elles peuvent agir soit directement sur la cellule effectrice soit agir sur la CPA et les rendre
tolérogènes (581). In vitro, les capacités inhibitrices des lymphocytes T CD8 CD45RClow de
rats sont dépendantes de la présence de CPA. En effet, les T CD8 CD45RClow ne peuvent pas
moduler la prolifération ou la différenciation des lymphocytes T CD4 ou des lymphocytes T
CD8 stimulés en absence de CPA (anti-TCR et anti-CD28). Différents travaux ont montré que
les cellules régulatrices pouvaient rendre les CPA tolérogènes. Par exemple, les cellules T
CD8 CD28- régulatrices agissent directement sur les CPA (301). Elles inhibent la
surexpression des molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86), et augmentent
l'expression de récepteurs inhibiteurs ILT-3 et ILT-4 qui contrôlent négativement la fonction
co-stimulatrice de la CPA. Ces CPA ILT3high et ILT4high deviennent tolérogènes (298). La
143
24h
Analyse de l’expression
d’ICAM-1, CD80, CD86
et HLA-DR sur les CPA
+
Sous-populations
T CD8 CD45RC
CPA allogénique
+ IL-2
CD86
% d’expression
cellulaire
sur les CPA
ICAM-1
45
40
35
30
25
20
Low
HLA-DR
45
80
50
40
70
35
60
30
50
40
High Int
CD80
60
30
High
Int
Low
25
High Int
Low
40
High
Int
Low
Individu 1
Individu 2
Figure 24. Les sous-populations T CD8 CD45RC inhibent l’activation des CPA
allogéniques.
Les sous-populations T CD8 CD45RC sont purifiées par cytométrie de flux puis
cultivés avec des CPA allogéniques. Après 24h de culture, les cellules sont marquées avec des
anticorps anti-TCR, ant-CD80, anti-CD86, anti-HLA-DR et anti-ICAM-1. L’expression des
marqueurs d’activation des CPA est alors analysée en cytométrie de flux. Les carrés blancs et
noirs représentent deux expériences indépendantes ou les sous-populations de lymphocytes T
CD8 proviennent de deux individus différents.
144
stimulation des lymphocytes T CD4 naïfs ou effecteurs en présence de ces cellules
dendritiques tolérogènes va rendre les lymphocytes T CD4 silencieux ou anergiques.
Dans notre étude, nous avons analysé la capacité des sous-populations T CD45RC
humaines à moduler l’activation des CPA. Lorsque les T CD8 CD45RCint et CD45RClow sont
incubés avec des CPA allogéniques, nous avons pu observer une diminution de l’expression
de marqueurs d’activation des CPA tels que ICAM-1, CD80 et CD86 en cytométrie de flux
qui n’est pas observé avec les CD45RChigh (Figure 24). Ceci suggère que les CD8 CD45RCint
et CD45RClow possèdent la capacité d’inactiver les CPA. L’absence de régulation, in vitro,
pourrait s’expliquer par le système expérimental où l’activation des lymphocytes T
CD45RChigh a lieu avant que les T CD45RClow aient pu inactiver les CPA. Il serait intéressant
de pré-incuber les CPA avec les lymphocytes T CD8 CD45RCint et CD45RClow pendant 24 h
puis d’ajouter les T CD4 marqués au CFSE. Nous pourrons ainsi analyser la prolifération de
ces dernières et étudier si des CPA pré-incubées avec les T CD8 CD45RCint et CD45RClow
deviennent tolérogènes. Ces résultats pourraient expliquer pourquoi les lymphocytes T CD8
CD45RCint et CD45RClow ont un rôle protecteur dans le rejet et dans la GvHD. En effet, il a
été montré que les cellules tubulaires rénales augmentent leur expression d’ICAM-1, CD80 et
CD86 lors du rejet (582). L’inhibition de l’augmentation de ces molécules d’activation
pourrait alors empêcher l’activation des lymphocytes T alloréactifs pathogènes et protéger du
rejet.
Étant donné que les lymphocytes T CD8 CD45RCint et CD45RClow humains sont les
seuls à produire de l’IL-10, le rôle des cytokines immunosuppressives dans l'inhibition de
l’activation des CPA n'est pas exclu. L’IL-10 pourrait avoir un effet indirect via les CPA du
receveur. En effet, L’IL-10 in vitro est capable d’inhiber l’expression de diverses molécules à
la surface des cellules dendritiques telles que B7.1 et B7.2 (583) ou l’expression des
molécules de classe II par les monocytes (584). Il a été montré que le contrôle du
développement de la GvHD ou du rejet de greffe par les cellules T régulateurs passe par la
production d'IL-10 (579, 585). Les cellules T CD8 CD122, comme les Tr1, mises en évidence
pour leur rôle dans le contrôle de pathologies auto-immunes, possèdent des fonctions
suppressives qui requièrent la sécrétion d’IL-10 (309, 586).
145
L’expression de CTLA-4 par les sous-populations T CD45RC pourra aussi être
analysée. Le rôle de CTLA-4 dans l'induction de tolérance a été également montré dans des
modèles d'allogreffes chez la souris et le rat (62), (313). Les T CD4 CD25+ peuvent moduler
les fonctions des CPA et les rendre inaptes à activer un lymphocyte T effecteur par un
mécanisme dépendant de CTLA-4. L’expression de CTLA-4 par les T CD4 CD25+ induit
l’expression de l’enzyme IDO par les CPA (290). La privation en tryptophane et la présence
de kinurenines pro-apoptotiques (produit de dégradation du tryptophane), entraînées par IDO,
inhibent l’expansion clonale et augmentent la délétion des lymphocytes T (291). Mais étant
donné que l’expression de CTLA-4 est augmentée après activation des lymphocytes T,
l’analyse de l’expression membranaire de CTLA-4 ne serait pas forcément informative. Il
serait plus important d’analyser l’expression des différents marqueurs des CPA tolérogènes
après culture avec les différentes sous-populations T CD45RC humaines. ILT-3/ILT-4
pourront être analysés en cytométrie de flux à différents temps de culture. L’expression
d’IDO par les CPA pourra être analysée par PCR quantitative et le relargage de kinurenines
ainsi que la quantité de tryptophane dans le milieu pourront être analysés par chromatographie
en phase liquide (587).
Par ailleurs, l’équipe d’Ignacio Anegon a identifié une sous-population T CD8
CD45RClow chez le rat dont les mécanismes suppresseurs sont dépendants de la synthèse
d’IFN-γ et d’IDO (313). Dans un modèle de greffe de cœur allogénique, le traitement des rats
receveurs avec un anticorps CD40Ig induit l’acceptation indéfinie de la greffe. Les
lymphocytes T CD8 sont responsables de l’induction de tolérance. Lorsque les lymphocytes T
CD8 sont séparés en fonction de l’intensité d’expression du marqueur CD45RC, seule la
population T CD8 CD45RClow est capable de transférer la tolérance. L’analyse des transcrits
au sein de la greffe par RT-PCR a révélé une surexpression de Foxp3, IDO, PIR-B
(l’homologue d’ILT4 chez le rat), CTLA-4 et de l’IFN-γ chez les rats traités par CD40Ig par
rapport aux rats témoins. Le traitement des rats receveurs par un anticorps neutralisant l’IFN-γ
ou par du 1-méthyl tryptophane (inhibiteur pharmacologique d’IDO) se traduit par un rejet
rapide de la greffe. In vitro, ces lymphocytes T CD8 CD45RClow peuvent agir directement sur
les cellules endothéliales et induire l’expression d’IDO par un mécanisme dépendant de la
sécrétion d’IFN-γ. L’analyse phénotypique ainsi que le profil cytokinique de la population T
CD8 CD45RClow induite suite au traitement par CD40Ig suggère que cette population est peu
différente des T CD8 CD45RClow naïfs de rat ainsi que des T CD8 CD45RClow humains.
146
IV.
ÉTUDE DU CONTRÔLE GÉNÉTIQUE DES SOUS-POPULATIONS T
CD45RC HUMAINES ET DE FOXP3
Une expression altérée de CD45 n’est pas forcément la conséquence de polymorphismes
dans le locus de CD45 mais peu être influencée par des molécules codées par d’autres gènes
impliqués dans l’épissage ou la transcription par exemple. Notre équipe a montré que la
proportion des sous-populations CD45RChigh et CD45RClow, aussi bien au niveau des
lymphocytes T CD4 que des lymphocytes T CD8, varie en fonction des souches de rats. Il a
été montré que cette variabilité est intrinsèque aux cellules hématopoïétiques et qu’elle est
contrôlée génétiquement par deux locci, cec1 et cec2, situés sur les chromosomes 9 et 20
respectivement (47, 48). De façon intéressante, le locus cec1 co-localise avec différents loci
associés au développement de l'EAE, de l’arthrite et aux désordres immunopathologiques de
type 2 induits par les sels d’or (47, 48, 588-590). Ces études démontrent que l’intervalle du
locus cec1 contient un ou plusieurs gènes impliqués dans les voies de développement de
maladies auto-immunes et inflammatoires. L’identification de ce ou ces gènes ouvrirait la
perspective des nouveaux traitements pour les patients atteints de ces maladies. Si nos
résultats chez l’homme sont compatibles avec les travaux chez le rat, et en particulier le
contrôle génétique du rapport des sous-populations T CD45RC, ceci suggère que ce rapport
pourrait être relié à des formes cliniques distinctes de pathologies auto-immunes et au
développement du rejet ou de la GvHD.
De plus, il a été montré que le locus cec1 contrôle aussi la proportion des lymphocytes
régulateurs Foxp3+ du rat (Colacios C et al. en préparation). La carte physique de cette région
a permis de mettre en évidence quatre gènes. Après séquençage, un polymorphisme majeur
dans le gène Vav1 a été trouvé (Colacios C et al. en préparation). Cette mutation entraîne la
substitution d’une arginine en tryptophane dans le domaine CH de la protéine VAV1
(mutation VAV1 R63W), ce qui conduit à une diminution de 75% du taux protéique de
VAV1 et à une diminution du flux calcique dans les lymphocytes T chez le rat BN qui
possède le variant VAV1 W63 (Casemayou et al. en préparation). À l’aide de lignées
congéniques LEW.BN pour ce locus, la mutation VAV1 W63 a été associée à la résistance à
l’EAE et à une augmentation du nombre de Treg Foxp3+ (Colacios C et al. en préparation).
La déplétion des Treg avant l’induction de la maladie, abolit cette résistance à l’EAE.
147
Chez l’Homme, nous avons montré chez plus de 608 individus que la proportion des
sous-populations lymphocytaires T CD45RC dans le sang périphérique est très variable d’un
individu à un autre. Nous avons montré que la distribution des proportions de CD45RC dans
la population étudiée suit une loi normale avec une faible représentation des individus
possédant de très forte proportion de CD45RChigh ou CD45RClow. Nous avons également
montré que ces proportions sont stables au cours du temps et que même si l’âge semble
légèrement influencer ces sous-populations, il n’explique pas cette grande hétérogénéité. Afin
d’effectuer une étude d’association entre la proportion de ces populations lymphocytaires et
les polymorphismes de la région orthologue humaine, nous avons collectionné 480
échantillons de sang humains d’individus sains pour lesquels la proportion de lymphocytes T
CD45RChigh et de lymphocytes Treg Foxp3+ a été préalablement déterminé. Nous avons donc
conçu des amorces de 86 SNP situés dans la région orthologue au locus cec1 que nous
étudierons à l’aide de la technique ILLUMINA. Cette région contient 7 gènes : Vav1, C3,
Tnfs9, Tnfs14, CD70, TRIP10, GPR108. Nous nous sommes aussi intéressés aux
polymorphismes de CD45 et de Foxp3. Afin de voir si notre population est de même origine
nous avons inclus 67 AIMs (ancestry-informative markers). Par la suite, nous avons prévu de
collecter des cellules de patients atteints de pathologies auto-immunes ainsi que de patients
transplantés rénaux afin de déterminer si un polymorphisme dans cette région permet de
prédire le développement de l’auto-immunité et le risque de rejet de greffe.
L’ensemble de ce travail de thèse montre que l'expression de la molécule CD45RC sur les
lymphocytes T humains est un bon candidat pour distinguer des sous-populations ayant des
propriétés auto-immunes et allogéniques différentes. CD45RC permet d’une part de définir
une sous-population de lymphocytes T qui semblent impliqués dans la pathologie des
vascularites à ANCA et d’autre part de prédire le rejet de greffe rénale chez l’homme et la
xéno-GvHD chez la souris. L’étude plus approfondie de ces sous-populations dans les AAV
pourrait permettre une meilleure compréhension de la physiopathologie de ces maladies. De
plus, ces résultats ouvrent des perspectives non négligeables en transplantation. En effet, la
prédiction du rejet lors de greffe d’organes solides ou de la réaction du greffon contre l’hôte
lors de greffe de CSH est d’une grande importance pour pouvoir adapter les traitements
immunosuppresseurs au cas par cas. Lors de greffe de CSH, la manipulation de l'équilibre de
ces sous-populations T CD45RC en fonction du phénotype du donneur, pourrait aboutir à la
composition d'un greffon idéal, améliorant l'efficacité de la greffe de CSH.
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Laurence Ordonez
Phenotypic and functional studies of CD45RC CD4 and CD8 T cell subsets:
implication in graft rejection and autoimmunity
__________________________________________________________________________________
During my PhD, I have shown that CD45RC expression allows the segregation of
human CD4 and CD8 T cells in functionally different subsets. In the context of autoimmune
diseases, we have shown that patients affected by ANCA vasculitis have a higher proportion
of T cells expressing low amount of CD45RC (CD45RClow). Interestingly, this population
produce cytokines involved in this pathology, in particular IL-17. However, in the context of
kidney transplantation, we have shown that the rejection incidence is higher in recipients with
a high proportion of CD45RChigh CD8 T cells before transplantation. These results suggest
that CD45RChigh T cells contain cells responsible for graft rejection. Therefore, the expression
level of CD45RC can be used as a diagnostic tool to predict graft rejection in order to
decrease the immunosuppressive treatments.