Pharmacologie Maury Semestre 4 Pharmacologie Maury Introduction (Page 1 et 2) Avancée majeure dans le traitement dans le cancer en utilisant une molécule intacte. La deuxième possibilité est d’utiliser un dérivé de produit naturel, des dérivés semi synthétiques, modifiés à partir d’extraits de produits trop actifs et donc toxiques. La 3ème solution consiste à utiliser une molécule végétale comme base, comme squelette à des molécules beaucoup plus complexes. On les utilise beaucoup pour les stérols végétaux, modifiés pour correspondre aux stéroïdes humains. I. Les métabolites issus de végétaux On dit souvent que la cellule végétale est une usine chimique. Face à la cellule animale, le nombre de composés fabriqués est très supérieur. Chaque famille de plantes va fabriquer un sous ensemble de molécules végétales. Chaque plante fabrique un petit nombre de molécules communes, et chacune fabrique ensuite des molécules spécifiques. Par exemple, Nicotiana tabacum fabrique la nicotine. Le caféier est la source de caféine la plus importante. On est capable de recenser 100 000 molécules, et on pense ne pas avoir dépassé 10% des molécules totales. On n’en connaît que si peu car un grand nombre de familles végétales ne sont pas recensées, et beaucoup de connues n’ont pas été testées pour la pharmacologie. Les plantes sont autotrophes aux carbones, et peuvent donc fabriquer des métabolites primaires carbonés. Les métabolites primaires sont les protéines, les acides nucléiques, les lipides et les glucides. Elles peuvent alors à partir des métabolites primaires fabriquer des métabolites secondaires (page 3). Le β carotène appartient aux terpènes, c’est un précurseur de la vitamine A. Chez l’homme, elle permet de fabriquer quelques composés comme le rétinol, le rétinal et l’acide rétinoïque, qui sont indispensable pour le développement de l’enfant et pour la vision. La vitaminose A est une maladie grave, des enfants meurent à cause de manque de β carotène. Chez les plantes, il y a des composés qui sont nécessaires au développement normal de l’homme, comme les vitamines, les antioxydants… Le taxol est un anticancéreux (=un antinéoplasique), très souvent administré. Il n’est fabriqué que par des cellules végétales. La plante qui le fabrique est taxus, on n’est pas capable de le fabriquer chimiquement de façon économique, il coute très cher et on ne peut l’avoir que grâce à la nature. Chaque famille végétale fabrique ses propres composés. Problématique : Les quantités disponibles de certaines molécules sont insuffisantes de nos jours pour répondre aux besoins en pharmacologie. On n’a par exemple pas assez de taxol ou de vinblastine. Il n’y a pas assez de ces molécules car les plantes fabriquent souvent de très petites quantités de ces molécules actives. Elles leurs servent seulement pour se défendre contre les animaux ou contre les microbes qui les agresse. Elles n’ont donc pas besoin de grandes quantités. Certaines de ces plantes sont de plus difficiles voire impossibles à cultiver à grande échelle, car certaines de ces plantes sont d’origine tropicale, et ne poussent bien que dans leur milieu naturel. Les méthodes d’extraction sont de plus parfois très limitantes, renforçant le problème. 1 Pharmacologie Maury II. Semestre 4 Les approches expérimentales pour améliorer la production Il y a 3 axes de recherche pour améliorer la production. Le premier axe est un axe de la chimie. Le deuxième est l’axe des généticiens et des améliorateurs. Le 3ème est celui des bio-technologistes. A. Extraction, purification et synthèse artificielle L’essentiel de leur travail se passe sur l’extraction et la purification. Pour l’extraction on change le solvant, et pour la purification on utilise des techniques comme la chromatographie, et notamment la HPLC. C’est une science empirique. On peut aussi faire des molécules artificielles, en fabriquant les molécules in vitro, par un enchainement de réaction. Par exemple l’aspirine est fabriquée à partir d’acide salicilique, extrait du saule. Maintenant, on ne l’extrait plus du saule. Savoir le fabriquer chimiquement permet de faire baisser les couts de production et de les fabriquer à grande échelle. Dans le cas de molécules très complexes, la synthèse artificielle est soit trop difficile soit trop couteuse. B. Sélection et amélioration des plantes Interviennent des généticiens et des améliorateurs. Au sein d’une espèce végétale qui fabrique les composés intéressants, il y a plusieurs cultivars. On sélectionne déjà le meilleur cultivar, le plus productif. La stratégie va se faire en 2 phases. La première est l’évaluation de la diversité naturelle. Par exemple chez la pervenche de Madagascar il existe 7 cultivars, dans lesquels on va mesurer la quantité de vinblastine, pour trouver le plus productif. Des fois cette phase va suffire. D’autres fois, ce n’est pas aussi simple, chaque cultivar aura ses avantages et ses inconvénients, par exemple, le plus productif pour la vinblastine est celui qui est le plus sensible aux maladies chez cette espèce. La deuxième phase consiste à faire des croisements et la sélection des meilleurs descendants. Dans la première descendance, on les teste tous et on regarde lesquels sont les plus intéressants, par exemple résistant à la maladie et fabriquant beaucoup de vinblastine. L’objectif est alors de faire 7 back cross, en croisant un descendant avec un parent, et les descendants auront alors une majorité de gènes fabriquant beaucoup de vinblastine, et une toute petite partie de gène de résistance à la maladie. Ca ne marche pas à tous les coups, et ça prend beaucoup de temps. Il faut de plus sélectionner beaucoup d’individus. C’est donc long et couteux, et il peut être difficile de piloter le génome, certaines combinaisons de gènes sont trop difficiles à obtenir. C. Les biotechnologies On ne les utilise qu’en dernier recours, ça coute très cher, et on ne le fera que si la molécule en vaut le coup et rapporte. Cette dernière phase n’a de sens que pour des molécules anticancéreuses. 1. Culture in vitro La culture in vitro correspond à cultiver des plantes, des organes de la plante, des tissus ou des cellules isolées en conditions stériles et contrôlées (température, humidité, pH, salinité, concentration des hormones, concentration des métabolites…). Certaines des plantes sont difficiles à cultiver à grande échelle, mais là, on contrôle tous les paramètres, ce qui aide pour les plantes difficiles. Les molécules intéressantes chez certaines plantes ne sont fabriquées que par un organe ou par un tissu donné. On va donc ne cultiver que ce qui produit la molécule. (voir page 4, figure 6) La culture de tissus est appelé un cal. Dans l’erlenmeyer de la photo, on cultive en milieu liquide, contrairement au milieu solide du cal. Dans un milieu liquide, les cellules vont sécréter la molécule, et donc on va retrouver la molécule dans le milieu, et on pourra facilement la récupérer, puisqu’on connaît les compositions des milieux de culture. 2 Pharmacologie Maury Semestre 4 2. Elicitation et rôle des métabolites secondaires dans la molécule Le stress permet la sécrétion de la molécule par la plante. On peut contrôler ce stress, et on appelle cela l’élicitation, qui correspond à l’ajout d’une molécule qui va stresser le végétal, et permet la sécrétion du métabolite secondaire (voir page 5 figure 8). On met un éliciteur, le récepteur va activer la sécrétion secondaire et des cascades de phosphorylation-déphosphorylation. Elle arrive au noyau où elle active des facteurs de transcription qui vont permettre d’induire l’expression de gènes de défense, qui aboutira à des métabolites secondaires. (page 6 figure 9) La stratégie d’élicitation a été très utilisée pour augmenter la production des composés pharmacologiques chez les plantes. On va même aboutir à la stratégie publiée. (Page 5 figure 7) : A savoir. Cette technique n’est rentable que pour le taxol et pour l’Ajmalicine. 3. Transgénèse a) Technologies La transformation par bombardement est la première technique pour transformer des molécules. C’est une méthode très brutale, mais qui marche. (Page 7, figure 10) Les billes sont enrobées d’ADN, si une bille arrive dans les noyaux, les fragments d’ADN sont insérés dans le génome. Une cellule végétale perforée va mourir. Il faut donc un bombardement modéré, mais suffisant pour qu’une bille arrive, et il faut de plus que l’ADN s’insère, chose à petit rendement. A partir de là on a une cellule transgénique, pas plus. Il faut alors régénérer une plante entière. C’est du clonage somatique. Acrobacterium tumefaciens est une bactérie capable dans la nature de former une tumeur (pathogène). C’est une prolifération de cellules végétales. Il y a quelques dizaines d’années on s’est aperçu que les cellules infectées sont modifiées génétiquement, elles ont des gènes de la bactérie. Cette découverte prouve que l’on est capable de modifier le génome d’une plante grâce à une bactérie. (Page 8, figures 11 et 12). Une partie du plasmide de la bactérie est transféré dans le génome de la cellule végétale. Cette séquence provoque la fabrication entre autres de facteurs de croissance, ce qui produit la tumeur (page 9 et 10). Les opines fournies à la bactérie lui donnent de l’énergie. Zone Vir : zone qui permet le transfert. L’ADNt est limité par 2 petites zones, que l’on garde, et on change l’ARNt par ce qui nous intéresse, et on enlève la zone verte, qui permettait de nourrir la bactérie. On garde par contre l’origine de réplication. (Page 11) On prend une feuille de la plante et on lui met en contact la bactérie porteuse du vecteur. On va faire alors un cal, et on va alors régénérer des plantes entières à partir des cals. La bactérie n’est capable de reconnaître que les dicotylédones. Le bombardement permet de faire n'importe quelle espèce végétale (notamment les monocotylédones), comme les céréales, par exemple. b) Application : alicaments et planticorps On peut faire fabriquer aux plantes des protéines vaccin ou des anticorps. Les anticorps des plantes sont les planticorps. On a fait fabriquer un vaccin au maïs. Ceci permet d’éviter les vaccinations par seringues dans des pays en voie de développement, et autres pays ou l’utilisation de seringue est difficile. On peut alors faire ingérer le produit qui en petites quantités permet de vacciner (page 14). (Page 13) Schéma du cout en fonction de la quantité de cellules transgéniques, suivant les animaux ou les végétaux. Il est plus cher de faire des cellules animales que des cellules végétales. (Page 12, figure 17) On peut faire des vaccins à partir de cellules transgéniques végétales comme de bactéries, d’animaux et autres. Les plus rapides à faire sont les bactéries. Les couts sont les moindres pour les 3 Pharmacologie Maury Semestre 4 végétaux. Glycosylation, assemblage multimérique et repliement sont les meilleurs sur les mammifères, puisque les plus proches de l’homme. Cependant, les virus ou bactéries végétales ne sont pas toxiques pour l’homme. Et les meilleurs pour l’échelle sont les végétaux. Ce sont donc les végétaux qui gagnent. III. L’exemple du Millepertuis : de la plante au médicament Figure 7 page 5 Le Millepertuis est cultivé en extérieur, on le récolte. Les quantités sont alors très variables, suivant les conditions environnementales. Les quantités d’hypéricine varient alors d’un facteur 20. Il faudrait alors les cultiver en conditions in vitro, car les préparations sont homogènes. 4