L`activité antibactérienne et immunomodulatrice d`un extrait d`algue

L’activitéantibactérienneetimmunomodulatrice
d’unextraitd’alguevertericheenpolysaccharidessulfatés
MustaphaBERRI(1),CindySLUGOCKI(2),MichelOLIVIER(1),SébastienHOLBERT(3)EmmanuelleHELLOIN(2),
IsabelleJACQUES(2),HenriSALMON(1),PiNYVALLCOLLEN(4),MatthieuLEGOFF(4),HervéDEMAIS(4)
(1)EquipeVIRIM,(2)CIRM‐BP,(3)EquipeIMA,UMRISP1282,CentrederechercheINRAValdeLoire,37380Nouzilly,France
(4)AmadéiteSAS,"Pôlebiotechnologique"duHautduBois,56580Bréhan,France
[email protected]
AveclacollaborationtechniquedeMarieGALLISSOT(4)
Antibacterialandimmunomodulatoryactivitiesofsulfatedpolysaccharide‐richextractofgreenalgae
Antibioticshavebeenusedforalongtimeinpigproductiontoprotectanimalsagainstpathogens.However,EUpolicyhasbeen
adoptedtoimplementasustainableproductionwithoutaddingantibioticsasgrowthpromoters.Marinealgaecontainintheircell
wallwater‐solublesulfatedpolysaccharideswithpotentialbiologicalactivitiessuchasanticoagulant,antiviral,antibacterialand
immunomodulatingactivitiesthatarebeingexploredtobeusedasaneffectivealternativetoantibiotics.Acrudeextract
containingsulfatedpolysaccharideswaspreparedfromthegreenalgaeUlvaarmoricanaharvestedinBrittanyregion(France)and
testedforitsantibacterialactivityagainstfivestrainsofbacterialpathogens:SalmonellaTyphimurium,Staphylococcusaureus,
Listeriamonocytogenes,E.coliO78andE.coliK88.Theobtainedresultsshowedthatthisextractwasmoreeffectiveininhibiting
thegrowthofS.aureusthanthoseofL.monocytogenes,E.coliK88andE.coliO78.Furthermore,theabilityoftheextractto
stimulatetheexpressionoftheimmuneresponsemediatorswasevaluatedusinganinvitrosystemofporcinedifferentiated
intestinalepithelialcellsIPEC‐1.AnalysisbyRT‐qPCRshowedincreasedexpressionofseveralcytokinesincludingTNFα,IL‐1α,IL‐6,
IL‐8andCCL20.ThisstimulationofimmuneresponsefactorexpressioninvolvedtheactivationofTLR4receptor.Theseresults
suggestthatthisextractcouldbeusedasanewprophylacticstrategytostimulatetheimmuneresponseofanimalsandtoprotect
mucosaltissuesagainstpathogens.
INTRODUCTION
Lesantibiotiquesontétélongtempsutilisésdanslesélevages
commefacteursdecroissancepourprotégerlesanimaux
contrelesagentspathogènes.Cependant,desdirectives
européennesontétéadoptéesenvuedemettreenplacedes
productionsdurablessansadjonctiond’antibiotiques
(Regulation(EC)No1831/2003).Ilestdoncimportantde
mettreaupointdesstratégiesprophylactiquesalternatives
efficacespouraméliorerlarésistancedesanimauxaux
infections.Lafilière"Alguesmarines"susciteunintérêt
croissantgrâceàlaqualiténutritionnelledesalguesetleur
richesseenmoléculesbioactives.Laparoicellulairedesalgues
marinesestricheenpolysaccharidessulfatésayantdes
propriétésphysicochimiquesetdesactivitésbiologiquesqui
pourraientavoirdesapplicationspotentiellesdansl’industrie
pharmaceutique,enagricultureoucommeadditifspour
l’alimentationhumaineetanimale(O’Sullivanetal.,2010;
Chojnackaetal.,2012).Unextraitbrutricheen
polysaccharidessulfatésaétépréparéàpartirdel’algueverte,
UlvaarmoricanarécoltéeenBretagne(France).Cetextraita
ététesté,invitro,pourévaluersonactivitéantimicrobienne
vis‐à‐visdebactériespathogènesetsacapacitéàstimuler
l’expressiondemédiateursdel’immunitéenactivantun
récepteurmembranairedetypeTLR(TollLikeReceptor).
1. MATERIELSETMETHODES
1.1. Compositiondel’extrait
L'extraitestconstituéde11,6%desucresneutres,7,3%de
protéines,12,2d’acidesuroniqueset26,4%depolysaccharide
sulfaté.
1.2. Analysedel’activitéantimicrobienne
L’évaluationexpérimentaledel’activitéantibactérienneaété
effectuéesurcinqbactériespathogènesprésentesdansles
élevagesdesanimauxderenteàsavoirSalmonella
typhimurium,Staphylococcusaureus,Listeriamonocytogenes,
E.coliO78etE.coliK88.
L’analyseaétéeffectuéeenévaluantlacroissancebactérienne
enprésencedel’extraitmarin,d’unepartsurunmilieunutritif
géloséetd’autrepartenmesurantcettecroissanceen
cinétiquecontinueenmilieuliquide(BioscreenC.,Thermo
FisherScientific,France).
Cesdeuxméthodesontpermisdedéterminerles
ConcentrationsMinimalesd’Inhibition(CMI)del’extraitvis‐à‐
visdecescinqsouches.
2015. Journées Recherche Porcine, 47, 309-310.
309

1.3. AnalysedelaréponseimmunitaireparRT‐qPCR
Lacapacitédecetextraitàstimulerl’expressionde
médiateursdel’immunitéaétéévaluée,parRT‐qPCR,en
utilisantunsystèmedecultureinvitrodecellulesépithéliales
intestinalesporcinesdifférenciéesIPEC‐1.Troisdoses(1,01et
0.01mg/ml)ontététestéesencomparaisonavecduLPSd’E
coli0111:B4commecontrôlepositifetdescellulesincubées
enmilieudecultureseulcommecontrôlenégatif.Cetextraita
étéaussitestévis‐à‐visdelalignéedecellulesrénales
embryonnaireshumainesHEK293exprimantTLR4/MD2/CD14,
TLR2,TLR5,TLR9,NOD1etNOD2afindedéterminerle
récepteurTLRouNLRimpliquéensuivant,parELISA,
l’expressiond’IL8commemarqueurdestimulation.Des
analysesstatistiquesontétéeffectuéesparletestKruskal‐
WallisetBonferroni‐Dunnpourunecomparaisondegroupes.
2. RESULTATS
L’analysedel’activitéantibactérienneparlesdeuxtechniques
amontrédessensibilitésdifférentesdesbactériesvis‐à‐visde
l’extraitdepolysaccharide.S.aureus(1,9<CMI<3,9mg/mL)
etL.monocytogenes(31,3<CMI<62,2mg/mL)appartenant
augroupedesbactériesGram+étaientplussensiblesàl'effet
despolysaccharidessulfatésquelesbactériesGram‐testées,à
savoirS.typhimurium(CMI=63mg/mL),E.coliK88(CMI=63
mg/mL)etE.coliO78(CMI=62,4mg/mL).
Tableau1–Activitéantibactériennedel’extraitde
polysaccharidessulfatésvis‐à‐visdecinqbactériespathogènes
BactériestestéesValeursdeCMI
enmg/ml
E.coliO78(Fècesdepoulet,CIRMBP‐096)
E.coliK88(ColibacillosePorcine,CIRMBP‐945)
S.Typhimurium(SepticémieBovineCIRMBP‐
940)
L.monocytogenes(Tissuedelapin,CIRMBP‐
711)
S.aureus(Mammitebovine,CIRMBP‐476)
62,4
63
63
31,3<MIC<62,6
1,9<MIC<3,9
L’analyseparRT‐qPCRamontréquel’extraitde
polysaccharidessulfatésinduit,àuneconcentrationde
1mg/ml,uneaugmentationdel’expressiondeplusieurs
cytokinesparlescellulesintestinalesIPEC‐1encomparaison
aveclescellulesnontraitées(Tableau2).LachimiokineCCL20
estlacytokinelaplusstimulée,sonexpressionétant
augmentéede38foiscomparativementaucontrôle.Cet
extraitinduitaussiuneaugmentationdel’expressiondeTNFα
(8,3fois),IL‐8(10,8fois)ainsiquedeIL‐1α(7,1fois)etIL‐6
(4fois).Parailleurs,ilinduitd’unefaçonsignificativemais
faible(1,7à2,4fois)l’expressiondescytokinesIL‐1β,IL‐12p40,
TGF‐βetlefacteurdetranscriptionPPARγ.
Enrevanche,cetextraitnesemblepasinduirel’expression
d’IL‐10,CCL25,CCL28TLR2etTLR4(Tableau2).LeLPSn’induit
pasdestimulationdel’expressiondecesmédiateursen
comparaisonavecl’extraitd’algue.Cetextraitaététestévis‐à‐
visdescellulesHEK293exprimantdifférentsrécepteurs
membranaires(TLR4/MD2/CD14,TLR2,TLR5,TLR9,NOD1et
NOD2).Lesrésultatsobtenusmontrentquelastimulationde
l’expressiondesfacteursimmunitairespasseraitpar
l’activationdurécepteurcellulaireTLR4.
Tableau2–Influencedel’extraitdepolysaccharidessulfatés
(1mg/ml)surl’expressiondescytokines
dansdescellulesintestinalesIPEC‐1(**:P<0,01)
CONCLUSION
L’ensembledesrésultatsamontréquel’extraitd’algueverte
richeenpolysaccharidessulfatésavaituneactivité
antibactériennecontredesagentspathogènesrencontrés
danslesélevages.Ilaaussilacapacitédestimuler,invitro,
l’expressiondescytokinesimpliquéesdansl’activation,le
recrutementetlamigrationdeslymphocytesainsiqueles
cellulesdendritiquespourmodulerlaréponseimmunitaire.
Cettestimulationpasseraitparl’activationdurécepteurTLR4.
Cetextraitpourraitdoncêtreutilisédansl'alimentationdes
animauxd’élevagepourinhiberlacroissancedecertaines
bactériesetstimulerlaréponseimmunitairepouraugmenter
larésistancedesanimauxauxinfectionsetréduirel'utilisation
desantibiotiques.Ilpourraitaussiêtreutilisécommeadjuvant
potentieldansdesapprochesdevaccinationmucosalepour
améliorerlaréponseimmunitairedel’organismehôte.
REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES
• Regulation(EC)No1831/2003:EuropeanUnion:Regulation(EC)No.1831/2003oftheEuropeanParliamentandtheCouncilof22
September2003onadditivesforuseinanimalnutrition.
• O’SullivanL.,MurphyB.,McLoughlinP.,DugganP.,LawlorP.G.,HughesH.,GardinerG.E.,2010.PrebioticsfromMarineMacroalgaefor
HumanandAnimalHealthApplications.MarineDrugs,8,2038‐2064.
• ChojnackaK.,SaeidA.,WitkowskaZ.,TuhyL.,2012.BiologicallyActiveCompoundsinSeaweedExtracts‐theProspectsforthe
Application.TheOpenConferenceProceedingsJournal,3,(Suppl1‐M4),20‐28.
Gènesdesmédiateursde
l’immunitétestés
Degrédestimulation
d’expression/Contrôle
TNFα
IL‐1α
IL‐8
CCL20
IL‐6
IL‐1β
IL‐12p40
TGFβ
PPARγ
TLR2
IL‐12p35
IL‐10
CCL25
CCL28
TLR4
8,3**
7,1**
10,8**
38,4**
4**
2,1**
2,0**
1,7**
2,4**
2,4
1,8
1,1
2,2
1,5
1,6
2015. Journées Recherche Porcine, 47.
310