Utilisation des SNP pour l`identification humaine

TECHNOLOGIE APPLIQUÉE
24 SPECTRA ANALYSE n° 249 • Avril - mai 2006
Utilisation des SNP pour
l’identifi cation humaine
Christine KEYSER, Elizabet PETKOVSKI*
*Institut de Médecine Légale - 11, rue Humann - 67085 Strasbourg cedex - Tél : [phone] – Fax : [phone]
Génétique
qu
qu
I - Introduction
Les SNP (pour Single Nucleotide Polymorphisms)
constituent les polymorphismes les plus répan-
dus du génome humain. Il s’agit de variations de
la séquence d’ADN portant sur un seul nucléotide
(fi gure 1). Ces marqueurs sont répartis sur l’en-
semble du génome, toutes les 500 paires de bases
en moyenne, aussi bien au niveau des régions co-
dantes (gènes) que des régions non codantes. Ils
sont le plus souvent phénotypiquement neutres
c’est à dire qu’ils ne modifi ent pas le phénotype de
celui qui les porte. A l’heure actuelle, plus de 5 mil-
lions de SNP ont été caractérisés. Cette abondance
explique l’énorme intérêt qu’ils suscitent dans les
domaines de la médecine et de la pharmacogéné-
tique où ils sont notamment utilisés pour détecter
des prédispositions individuelles à certaines ma-
ladies ou pour identifi er les gènes impliqués dans
des maladies multifactorielles.
RÉSUMÉ
Les polymorphismes d’un seul nucléotide ou SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) suscitent depuis
peu un engouement grandissant dans le domaine de l’identifi cation génétique humaine. Ces marqueurs
se révèlent intéressants pour l’analyse de prélèvements biologiques dégradés, mais également dans les
tests de paternité. Outre leur utilisation à des fi ns médico-légales, les SNP constituent également des
marqueurs de choix en anthropologie moléculaire pour distinguer diff érents groupes (ou haplogroupes)
au niveau des lignées paternelles et maternelles et estimer ainsi l’origine ethnique des individus étudiés.
Les méthodologies de typage des SNP étant en continuel développement, le choix d’une technique
ad hoc peut paraître diffi cile. Notre équipe, impliquée dans des investigations génétiques, a fait celui
d’une discrimination allélique par extension d’amorces (formation de produits ayant une masse spécifi que
pour chaque allèle) suivi d’une détection par spectrométrie de masse MALDI-TOF. L’objectif de cet article
est d’argumenter ce choix mais également de développer l’approche méthodologique utilisée, ainsi que
les avantages et les inconvénients de cette technique.
MOTS-CLÉS
SNP, spectrométrie de masse, PCR, identifi cation génétique, contrôle de fi liation
Use of SNP in human identifi cation
SUMMARY
Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs arouse a growing interest in the fi eld of human genetic identifi cation.
These markers are interesting for the analysis of degraded biological samples, as well as for paternity testing.
Beside their use in forensic science, SNPs are also of great interest in molecular anthropology. They distinguish
groups (called haplogroups) of paternal and maternal lineage and allow the estimation of the studied individuals’
ethnic affi liation.
The SNP typing methodologies being in continual development, the choice of an appropriate technology
seems diffi cult. Working in the fi elds of forensic identifi cation we chose a method based on MALDI-TOF mass
spectrometry detection of allele specifi c primer extension products. The aim of this paper is to explain this choice
as well as the used methodological approach and to discuss advantages and limits of this technique.
KEYWORDS
SNP, mass spectrometry, PCR, forensic genetic, paternity testing

Technologie appliquée
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Utilisation des SNP pour l’identifi cation humaine
II – SNP et identifi cation génétique,
atouts et diffi cultés
Dans le domaine de l’identifi cation génétique,
l’engouement pour les SNP ne cesse de croître car
ceux-ci possèdent plusieurs caractéristiques inté-
ressantes pour des applications médico-légales :
1) Les régions d’ADN ciblées pour l’analyse de
SNP sont de petites tailles, ce qui permet l’étude
de molécules d’acides nucléiques fragmentées.
Ceci est particulièrement important en crimina-
listique, domaine dans lequel les preuves biologi-
ques laissées sur les scènes de crimes sont souvent
présentes à l’état de traces et/ou sont dégradées
par des facteurs environnementaux tels que la lu-
mière, la chaleur ou l’humidité. Avec les techni-
ques classiquement utilisées dans les laboratoires
d’identifi cation génétique, l’ADN extrait de ces
traces peut ne fournir qu’une empreinte (ou profi l)
génétique partielle, diffi cilement exploitable ; il en
est de même pour les catastrophes de masses (e.g.
attentat du World Trade Center, Tsunami du Sud
Est Asiatique…) où les restes humains à identifi er
sont souvent fortement altérés.
2) Les SNP sont considérés comme des marqueurs
génétiques stables : ils présentent un taux de mu-
tation bien inférieur à celui des microsatellites ou
STR (Short Tandem Repeats), marqueurs actuelle-
ment utilisés pour établir le profi l génétique d’un
individu. Ce taux moindre de mutations (de l’ordre
de 10-8 contre 10-3) peut constituer un réel avan-
tage dans les tests de parenté où des mutations qui
surviennent sur quelques générations peuvent être
sources de confusions.
3) A la diff érence des STR, l’analyse des SNP n’est
pas fondée sur l’étude du polymorphisme de lon-
gueur de régions de répétitions ce qui la préserve
d’artéfacts liés à des problèmes de « bégaiement »
rencontrés par l’ADN polymérase, l’enzyme impli-
qué dans le processus d’amplifi cation de l’ADN.
4) Les SNP peuvent être étudiés par des techni-
ques d’analyse à haut-débit, ce qui facilite la cons-
titution rapide de base de données intéressant un
très grand nombre d’individus (d’où une grande
fi abilité dans le calcul des fréquences alléliques par
exemple).
5) Lorsque étudiés au niveau du chromosome Y ou
de l’ADN mitochondrial, les SNP permettent d’es-
timer l’origine ethnique de l’individu à la source du
prélèvement ou de l’échantillon étudié.
Toutefois, ces marqueurs présentent également
des inconvénients qui complexifi ent leur utilisa-
tion à des fi ns judiciaires :
1) Pour chaque SNP, il y a logiquement 4 allèles
(ou variants nucléotidiques) possibles, mais le plus
souvent seuls 2 des ces 4 allèles existent réelle-
ment. Leur polymorphisme limité constitue donc
le principal défaut des SNP ; par exemple si l’on ap-
pelle A et B les deux allèles possibles à un site poly-
morphe donné, les individus peuvent être de type
AA, AB ou BB. Ces 3 types ou génotypes peuvent
paraître faibles en comparaison des 20 à 50 géno-
types possibles avec la plupart des STR. Ce poly-
morphisme réduit peut néanmoins être compensé
par l’analyse de nombreux SNP. Il a été démontré
que l’analyse combinée d’une cinquantaine de SNP
doit permettre d’atteindre un pouvoir informatif
équivalent à celui obtenu à l’heure actuelle grâce
aux STR (1).
2) Du fait de la nature biallélique de la majorité des
SNP, il est diffi cile de détecter la présence de deux
ou plusieurs ADN dans un échantillon ; l’analyse
de mélanges d’ADN est donc diffi cile, or ces der-
niers sont très nombreux dans les aff aires crimi-
nelles (e.g. viol : mélange de cellules de l’agresseur
et de la victime ; trace de contact : mélange de plu-
sieurs individus…).
Au cours des dernières années un grand nombre
de techniques de typage des SNP ont été dévelop-
pées, chacune possédant ses propres caractéristi-
ques (pour des revues voir : 2 et 3). Certaines per-
mettent l’analyse d’un petit nombre de marqueurs
sur un grand nombre d’échantillons, d’autres auto-
risent l’analyse d’un grand nombre de marqueurs
sur un petit nombre d’échantillons, un dernier en-
semble s’applique à l’analyse d’un grand nombre de
SNP sur un grand nombre d’échantillons. L’expert
judiciaire travaillant le plus souvent à partir d’un
nombre restreint de prélèvements, l’étude d’un
nombre élevé de marqueurs avec un débit d’ana-
lyse moyen est suffi sante (excepté dans le cadre de
la constitution de bases de données ou de catastro-
phe de masse).
Autre facteur important à considérer : la quantité
d’ADN nécessaire pour établir un génotype. Cer-
taines techniques s’appliquent directement sur
l’ADN génomique, sans réaction d’amplifi cation
préalable, ce qui nécessite une quantité minimum
d’ADN matrice relativement importante. Compte
tenu des faibles quantités d’ADN extraites à par-
tir d’un nombre non négligeable de prélèvements
médico-légaux, le choix d’une technique faisant
intervenir une étape préalable d’amplifi cation par
PCR (Polymerase Chain Reaction) est indispensa-
ble. La possibilité de développer des réactions PCR
multiplexes (permettant l’amplifi cation simulta-
née de plusieurs sites polymorphes) est également
primordiale, non seulement pour des questions de
quantité d’ADN mais également pour augmenter
le pouvoir discriminant de l’analyse.
Figure 1
Les SNP sont des
substitutions,
insertions ou
délétions de
nucléotides qui
surviennent à des
positions uniques
dans le génome.

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Autre considération importante dans le contexte
médico-légal : l’analyse de mélanges d’ADN. La
possibilité de quantifi er chaque allèle dans un
échantillon peut aider à l’analyse de ces mélanges.
Enfi n, derniers impératifs : la sensibilité, la repro-
ductibilité, et la précision de la technique doivent
être élevées tandis que la durée ainsi que le coût de
l’analyse doivent être au plus bas.
III - Méthodes d’analyse des SNP
Les méthodes de typage des SNP font intervenir
deux étapes : une étape de discrimination allé-
lique, correspondant à la formation de produits
réactionnels spécifi ques à chaque allèle, suivie
d’une étape de détection des produits issus de la
discrimination allélique.
La plupart des techniques de discrimination allé-
lique comprennent une étape de pré-amplifi cation
par PCR de la région contenant le SNP. Une analy-
se post-PCR est ensuite eff ectuée pour déterminer
le variant allélique au site polymorphe considéré.
Les analyses post-PCR sont fondées soit sur l’hy-
bridation d’une sonde sur le produit amplifi é, soit
sur une ligation des amorces, soit sur un clivage
de sonde, soit encore sur une extension des amor-
ces. Il existe également diff érents systèmes de dé-
tection des produits de la discrimination allélique
parmi lesquels les puces à ADN, l’électrophorèse,
la PCR en temps réel, le pyroséquençage, la spec-
trométrie de masse. Au vu des impératifs exigés
par des analyses à visée judiciaire, la combinaison
technologique employée à l’Institut de Médecine
Légale de Strasbourg correspond à une extension
d’amorce, qui répond aux besoins qualitatifs d’une
analyse d’identifi cation génétique, suivie d’une
analyse pas spectrométrie de masse MALDI-TOF
(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
Time-Of-Flight) qui répond notamment aux critè-
res de sensibilité, précision et rapidité.
1. Discrimination allélique
par extension d’amorce
Cette étape, également appelée miniséquençage,
est précédée par une étape d’amplifi cation de la ré-
gion d’ADN contenant le SNP d’intérêt au moyen
d’un couple d’amorces. Les produits PCR obtenus
sont purifi és au moyen de billes magnétiques puis
soumis à la réaction d’extension d’amorce ou PEX
(pour Primer EXtension). Cette réaction repose
sur l’extension d’une amorce de 1 ou 2 nucléotides,
en fonction de la séquence du fragment d’ADN ci-
ble. Cette extension se fait grâce à une ADN poly-
mérase qui incorpore de manière indiff érente les
désoxyNucléotides TriPhosphates (dNTPs) et les
didéoxyNucléotide TriPhosphate (ddNTPs, voir
Note 1). Dans l’exemple de la Figure 2, une amorce
a été conçue pour se fi xer à l’extrémité 3’ du SNP
d’intérêt, un polymorphisme de type T/A. L’un des
quatre dNTP du milieu réactionnel (le dATP) est
remplacé par un ddNTP (le ddATP) qui bloque la
réaction d’élongation lorsqu’elle rencontre un T.
Figure 2
Principe de la réaction
d’extension d’amorce.
L’utilisation combinée de
ddNTP avec des dNTP
permet d’augmenter
les diff érences de masse
entre les allèles d’un SNP.
NOTE 1
Les ddNTP
bloquent la
synthèse de
l’ADN par les
ADN polymé-
rases après
leur incor-
poration. Ce
blocage est dû
à l’impossibi-
lité qu’ont ces
nucléotides
de former une
liaison phos-
phodiester
avec un autre
nucléotide
en raison de
l’absence du
groupement
hydroxyle sur
le carbone 3’.

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Utilisation des SNP pour l’identifi cation humaine
Dans le cas du premier allèle, le ddATP est incor-
poré immédiatement, ce qui génère un amplicon
de 24 nucléotides. Dans le cas du second allèle, le
premier nucléotide (dTTP) est incorporé et l’ex-
tension se poursuit jusqu’au T ou un ddATP est in-
corporé, conduisant à l’obtention d’un produit de
25 nucléotides. Ces deux produits d’amplifi cation
ou amplicons présentent des masses diff érentes et
peuvent, après une étape de purifi cation, être dis-
tingués notamment par leur masse.
2. Détection allélique par spectrométrie
de masse MALDI-TOF
La spectrométrie de masse (SM) est devenue une
technique de choix pour l’étude des biopolymères,
notamment depuis le développement de nouvelles
méthodes d’ionisation, qui permettent aujourd’hui
de vaporiser des molécules aussi grosses que des
protéines ou des acides nucléiques. L’une de ces
méthodes est la technique d’ionisation par dé-
sorption laser assistée par matrice ou MALDI,
méthode d’ionisation couramment associée à un
analyseur en temps de vol (TOF).
La technique MALDI utilise un faisceau laser pour
désorber et ioniser un mélange matrice/échan-
tillon co-cristallisé sur une plaque métallique. L’ir-
radiation laser provoque l’ionisation des molécules
d’échantillon et de matrice en phase gazeuse. La
matrice (un mélange d’acide 3-hydroxypicolinique
et de citrate hydrogenodiammonium) permet de
minimiser la dégradation de l’échantillon (pro-
duits de la réaction PEX) provoquée par l’absorp-
tion de l’énergie du faisceau laser incident. Une
fois les ions formés, ils sont accélérés par applica-
tion d’un champ électrostatique et envoyés dans
un tube sous vide dans lequel ils sont séparés en
fonction de leur vitesse ou temps de vol. Les ions
ayant une masse élevée volent plus lentement que
les ions ayant une masse plus faible. Leur arrivée
au bout du tube est détectée par un multiplicateur
et visualisée sous forme d’un spectre (fi gure 3). Le
Figure 3
Les produits de l’extension d’amorce, mélangés à une matrice, sont co-cristallisés sur une plaque métallique. Le mélange
ADN/matrice est frappé par le faisceau d’un laser. Cette énergie est transférée à la matrice qui est vaporisée ce qui permet
à une petite partie de l’ADN d’être expulsée dans un analyseur en temps de vol. Le produit ADN chargé est ensuite accéléré
avant de pénétrer dans le tube de vol libre de champ où il va voler vers le détecteur. Les molécules chargées volent d’autant
plus vite qu’elles sont plus légères. Le temps écoulé, entre l’entrée dans le tube de vol et la collision avec le détecteur, constitue
le temps de vol (Time Of Flight).

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temps de vol est proportionnel à la masse.
Cette technique nous a permis de sélectionner,
dans un premier temps, une quarantaine de SNP
susceptibles d’être utilisés dans le cadre d’identi-
fi cations génétiques d’individus et de contrôles de
fi liation (4). La Figure 4 illustre le type de résultats
obtenus dans le cadre d’une recherche en paterni-
té. Les allèles se distinguent par leur diff érence de
masse, mesurée sur la base de leur temps de vol et
interprétée automatiquement par ordinateur. Cet-
te technique permet, selon l’individu étudié, de dé-
terminer s’il est homozygote ou hétérozygote pour
un SNP donné. Bien entendu, l’analyse d’un seul
SNP est insuffi sante et seule l’analyse simultanée
de plusieurs d’entre eux présente un intérêt pour
des investigations d’identifi cations génétiques.
Des réactions PEX incluant plusieurs amorces
susceptibles de s’hybrider au niveau de diff érents
SNP (réactions multiPEX) ont donc été mises en
œuvre dans un second temps. Les résultats de ces
travaux, qui intéressent une cinquantaine de SNP
devraient être prochainement publiés (5). Ils dé-
montrent clairement l’intérêt d’une approche de
typage des SNP fondée sur une discrimination al-
lélique par extension d’amorce suivie d’une détec-
tion par SM MALDI-TOF.
IV - Avantages de la SM MALDI-TOF
pour des investigations médico-
légales
L’analyse de polymorphismes ponctuels de l’ADN
par extension d’amorces et spectrométrie de
masse MALDI-TOF s’avère précise, fi able, sensi-
ble, spécifi que, rapide, et peu coûteuse. En eff et,
contrairement à d’autres méthodes de typage des
SNP, qui identifi ent les produits de la discrimina-
tion allélique en mesurant la fl uorescence émise
par des molécules marquées, la spectrométrie de
masse MALDI-TOF mesure la masse moléculaire
des produits de la réaction d’extension d’amorces.
Il s’agit donc d’une méthode de détection directe
d’une propriété intrinsèque des molécules ana-
lysées : le rapport de leur masse sur leur charge.
Figure 4
Spectres obtenus dans le cadre d’une analyse de paternité. La mère est homozygote, elle possède deux allèles portant une
guanine à la position polymorphe et n’a pu transmettre qu’un allèle G à l’enfant. Ce dernier n’a pu hériter de l’allèle A que
de son père. Le père présumé étant homozygote A/A, il a pu transmettre l’allèle A et peut être le père biologique dans le cas
présent. Bien entendu, ce résultat, obtenu pour un seul locus, n’est pas signifi catif et il faut tester une cinquantaine d’autres
loci pour pouvoir affi rmer que le père présumé est bien le père biologique. Le pic non coloré correspond à l’amorce non
étendue utilisée dans la réaction PEX.
Mère Enfant Père présumé