Réaction Ac-Ag Et ses appllications pratiques

Réaction Ac-Ag
Et ses appllications pratiques
Caractéristiques générales de la réaction AcAg.
La liaison AgAc
Pour qu’il y ait une liaison, il faut une « complémentarité stérique » entre le paratope de l’Ac et l’épitope
de l’Ag.
Complémentarité stérique : complémentarité conformationnelle, représentation dans l’espace.
Complémentarité entre l’épitope et le paratope :
La cristallographie aux rayons x permet de définir une structure 3D d’une molécule. A partir de cette
technique on a pu définir la structure d’un Ac. Aux régions hypervariables, les AA vont se lier aux Ac
(comme une mâchoire). Cela concerne que quelques AA, tout le reste est plus ou moins une
« charpente ».
Il y a bcp de forces de répulsions, les liaisons intermoléculaires sont faibles => énergie de liaison faible.
Si l’épitope correspond bien à l’épitope alors il n’y a que des forces d’attraction et pas de forces de
répulsions. Alors les forces d’attractions sont optimales et l’énergie de liaison est bcp plus importante.
La bonne complémentarité entre paratope et épitope entraîne la formation du Complexe Immun.
Paratope et Epitope peuvent se déformer légèrement pour permettre la formation du CI.
Forces impliquées :
Ici, il s’agit de liaisons de faibles énergies (et non de liaisons covalentes !). Ces liaisons sont dues à
plusieurs forces, établies entre AA hypervariables et épitope.
Force électrostatiques : qui s’établies entre groupement chimiques ionisées de charges opposées.
Forces issues des liaisons hydrogènes : issues de liaisons entre atomes de charges +, comme H,
et des atomes de charges -, comme O ou N. l’interaction avec H est d’autant plus forte qu’il y a
exclusion des molécules d’eau.
Forces issues des interactions hydrophobes : liées à des groupements apolaires (de nombreux AA
sont hydrophobes ex : AA aromatiques, tyrosine, phénylalanine, …). Se sont ces interactions qui
représentent les forces les plus importantes dans le CI. => composante majeure de l’énergie de
liaison entre épotipe et paratope.
Forces de VanDerWaals : crées par les interactions des nuages électroniques des atomes.
Ces 4 types de forces sont attractives ce qui entraînent et maintiennent la formation du CI.
Affinité :
Elle caractérise la force de cette liaison.
Affinité = forces attractives + forces répulsives
Comment se mesure-t-elle ?
Elle se définit par réaction chimique : Ac+AgAc-Ag
Cette réaction est réversible, le complexe peut se dissocier.
Cette réaction peut aussi se définir par des constantes cinétiques avec :
k = constante cinétique d’association
k’ = ‘’
‘’
de dissociation
A l’équilibre, la vitesse d’association = vitesse de dissociation. On établit alors une constante
d’association de l’équilibre KA :
KA = [Ac-Ag]eq / [Ac]eq x [Ag]eq
Vitesse d’association:
Va = k[Ac][Ag]
Vitesse de dissociation :
Vd = k’ [Ac-Ag]
A l’équilibre, Va = Vd
k[Ac][Ag] = k’ [Ac-Ag]
KA = [Ac-Ag]eq / [Ac]eq x [Ag]eq => k/k’
On peut aussi établir une constante de dissociation à l’équilibre KD:
KD = 1/KA
L’unité de KA est L/mol, et pour KD c’est le mol/L.
Quand il y a une bonne affinité alors KA est élevé. On dispose d’Ac dont KA=1010 L/mol.
Bonne affinité : 103 < KA <1010 L/mol.
Avidité :
Pour avoir une bonne affinité :utilisation d’Ac monoclonaux. C’est-à-dire un seul type d’Ac donc un seul
paratope.
Quand on utilise du sérum polyclonal avec des Ag multivalents (cad plusieurs épitopes) : on parle
d’avidité car on mélange plusieurs Ac différents capables de reconnaître plusieurs épitopes différents.
nAc + mAg  nAc-mAg appelé “complexe multimoléculaire”.
L’avidité se caractérise par une constante
d’association KA qui donne toujours KA>>KA1 ;KA2.
Le complexe est plus stable du fait des différents
Ac qui se lient à l’Ag.
Remarque KA : Cette constante dépend du nombre d’Ac capables de reconnaître des déterminant
antigéniques différents. Elle dépend également des conditions physico-chimiques du milieu cad pH,
Temp°C et force ionique du milieu. En faisant varier ces conditions, on stabilise ou on fragilise le CI.
Spécificité des Ac
Représente la capacité d’un Ac à discriminer 2 déterminants antigéniques semblables en se liant à eux
avec une affinité différente.
Ici on considère que l’Ac est bien spécifique de c
déterminant antigénique car grande différence
d’affinité entre les deux déterminants antigéniques.
Les Ac monoclonaux sont dit bcp plus spécifiques pour un Ag donné que pour les sérums polyclonaux.
Il peut y avoir des réactivités croisées car les Ac produits pour un Ag1 peuvent reconnaître des
déterminants antigéniques de d’autres Ag. Ces problèmes de réactivités croisées se posent quand un
Ag possède des déterminants antigéniques similaires ou semblables. Donc avec le même sérum
polyclonal on peut avoir une affinité élevée KA1 avec Ag1 et une autre affinité KA2 pour l’Ag Ag2. Il faut
alors vérifier et contrôler si le sérum est bien spécifique des Ag.
Pour les Ac monoclonaux la spécificité est meilleure car il y a un seul type d’Ac donc le problème des
réactivité croisée est moindre.
Détection des réactions AgAc
Présentation générale
Ac : outil de reconnaissance spécifique ; il faut être capable de détecter le CI.
Détection visible à l’œil nu :
Agglutination : Elle concerne les Ag insolubles ou particulaires.
Précipitation : L’Ag est solubles mais le CI formé précipite.
Complexe Immun non visible à l’œil nu :
On utilse des révélateurs pour mettre en évidence le CI.
Marquage : marquage soit de l’Ag soit de l’Ac. Il existe trois types de marquages : fluorescent
« immunofluorescence », radioactif « radioimmunologie », enzymatique « immunoenzymologie ».
Utilisation du complément
Neutralisaiton de l’activité enzymatique : Bloquer l’activité enzymatique d’un Ac notamment du type
toxique (quand il y formation du CI, il y a perte de l’activité toxique).
Les réactions d’Agglutination
Principe :
Les réactions d’agglutinations sont la conséquences d’Ac agglutinant sur un Ag particulaire permettant
ainsi la formation de ponts spécifiques entre les particules ce qui constitue un réseau visible sous forme
d’amas.
Conditions nécessaires à l’agglutination :
Les particules généralement utilisées sont chargées + ce qui entraîne une répulsion. Or pour former un
réseau il faut former des liaisons afin de rapprocher les particules. Ces liaisons > forces de répulsions.
Ces forces de répulsions sont reliées à un potentiel (zêta) :
ζ = σ / D x racine carrée de μ
avec σ = charge électrique des particules
avec D = constante d’électricité
avec μ = force ionique du milieu
Ce potentiel traduit les force de répulsions entre les particules.
Il existe de sAc qui agglutinent facilement à des particules et d’autres qui ont plus de difficultés, ce sont
les Ac non-agglutinants. Les Ac agglutinants sont souvent des immunoglobulines du types IgM, et les
non-agglutinants sous souvent du type IgG. Ce qui permet de dire que si les Ac sont, ou non, agglutinant
et la valence (IgM = 10 ; IgG = 2).
Les Ig masquent les chargent électriques à la surface des particules (surtout IgM car elles sont plus
grosses).
On peut également agir sur la force ionique du milieu en augmentant la concentration en ions (plus la
force ionique augmente plus zêta diminue).
La température joue une rôle important. L’augmentation de la Temp°C = agitation moléculaire. Cette
agitation favorise la rencontre Ac/Ag.
L’agglutination est plus rapide à températures élevées qu’à températures froides. Dans de cas on parle
« d’Ac chauds ». Il existe des Ac froids qui agglutinent davantage à 4°C qu’à 37°C. En effet l’agitaiton
moléculaire peut rompre les liaisons entre les particules.
Les différents types d’agglutination :
Il faut que l’Ag soit particulaire. Cet Ag peut-être naturellement particulaire (comme les Ag A,B,O porté
sur les hématies). Dans ce cas, il y a « Agglutination Active ».
Il existe aussi des Ag que l’on a rendu particulaire = Ag que l’on fixé volontairement sur une particule (ex
billes de latex). Dans ce cas il s’agit d’une « Agglutination Passive ».
Exemple d’agglutination directe :
Détermination des groupes A,B,O = on veut mettre en évidence une particularité sur les hématies =>
technique qualitative.
Détermination de la quantité d’Ac contenu dans un sérum => technique quantitative. Travail effectué en
microplaques.
Application : Ac antiSalomnelles et antiBrucella.
Titre du Sérum = quantité d’Ac présent dans le sérum qui correspond à l’inverse de la plus grande
dilution du sérum pour laquelle on observe encore une réaction d’agglutination.
Exemple d’agglutination active indirecte :
Ac non- agglutinant : ne provoque pas d’agglutination spontanée =>souvent des IgG. On utilise des
« artifices » afin d’obtenir des réactions d’agglutination. => Ajouter au milieu réactionnel des
macromolécules qui vont réaliser des ponts fixés à des molécules voisines.
On crées des ponts artificiels entre les Ig. On utilise souvent du sérum d’Albumine provenant de Bœuf
(SAB). Il existe aussi du Dextran et du Ficoll qui ont la même fonction que la SAB.
Remarque : Hydrolyse partielle de l’Ag
Parfois avec des IgM il n’y a pas d’agglutination. L’utilisation d’enzymes protéolytiques qui vont couper
certaines parties de l’Ag sont responsables de la non agglutination.
Exemple d’agglutination Passive :
Au départ l’Ag est soluble puis on le rend particulaire en le fixant sur un support spécial (ex bille de latex
ou hématies). Or les hématies ne sont pas antigéniquement neutres. Il faut alors vérifier que les
hématies n’agglutinent pas spontanément avec les Ac utilisées. De plus les hématies sont fragiles ; elles
s’hémolysent très facilement : on utilise du formol pour les rendre plus stables (en plus de les garder à
+4°C).
L’Ag choisit peut se fixer très facilement sur les hématies, par simple contact ou réaction chimique.
Les billes de latex présentent un autre avantage : antigéniquement neutre et très peu fragiles.
L’agglutination sera pourtant plus sensible et plus simple avec les hématies plutôt qu’avec les billes de
latex.
Exemple : Recherche du facteur rhumatoïde :
Polyarthrite rhumatoïde = maladie auto-immune ( IgM anti Fc IgG).
Les réactions d’agglutination sont donc très faciles à mettre en œuvre et peu coûteuses, en générale.
Elles sont appliquées dans de nombreux domaines (notamment microbiologie, sérologie, alimentair et
biotechnologie).
Réactions de précipitation
Principe :
Réactions qui mettent en jeu des Ac spécifiques et des Ag solubles. Il se forme un réseau
multimoléculaires entre les Ac et les Ag et qui, dans certaines conditions, peut devenir insoluble et
précipite. Contrairement à la réaction d’agglutination, ce n’est pas des particules mais des protéines ou
des polyosides.
C’est donc le CI qui devient insoluble. C’est peut-être sa taille qui en est à l’origine.
Remarque : Il existe des Ac qui précipite et d’autres qui ne précipitent pas. C’est-à-dire que tous les cI
ne sont pas précipitables.
Conditions nécessaires à la précipitation :
Il y a différents milieux possibles pour la précipitation : liquide ou « solides » (= gélifié). Les
concentrations en Ag et en Ac sont déterminantes.
Il existe différentes techniques pour déterminée la quantité du précipité : en milieu liquide on peut
analyser le résultat via un dosage de Kjeldahl pour mesurer l’azote qui est directement proportionnelle
au précipité (cf . Biochimie) ; par néphélométrie ; par turbidimétrie ; …
Il y a augmentation de la quantité de précipité en fonction de la quantité
d’Ag. Puis un plateau quand la quantité de précipité est maximal. Puis la
quantité de précipité diminue.
Quand il y a un excédant d’Ac, il n’y a en fait quasiment pas de réseau
moléculaire. Puis à l’équivalence, tout les Ac sont reliés aux Ag =
réseau macromoléculaire. On parle ici de « concentration optimale ».
Puis il y a un excédant de précipité = bcp d’Ag vont rester insolubles
mais quelques rares CI ne vont pas former de réseau.
Avant tout réaction de précipitation il faut définir les concentrations optimales entre Ac et Ag pour avoir le
maximum de précipité (ordre de grandeur de la concentration : entre 1 à 10µg/mL).
Il existe d’autres techniques plus sensibles.
Supports de réactions de précipitations :
Milieu Liquide : « Ring test ». Apparition d’un anneau blanchâtre
si présence d’Ag spécifique aux Ac utilisés. Techniques qualitative,
on voit à l’œil nu. Peut-être quantitative si on utilise un
spectrophotomètre.
Milieu « Solide » : Gel d’agar ou d’agarose. Agar = mélange de 2
polysaccharides : agaropeptine + agrose. L’agaropeptine a bcp de
groupement polaires par rapport à l’agarose. Avantage : ils sont
chimiquement neutres ; ils sont visqueux à partir de 50°C, se
gélifient à une température < 50°C. Or à 50°C, on peut incorporer
des protéines, sans qu’elles soient dénaturés ; ils sont
transparents. Ces gels sont maintenus à 7<pH<8,6. La
concentration en agarose est d’environ 0,5 à 2%. Un gel, une fois
solidifier peut-être comparer à une éponge. Ce qui est soldie c’est
l’agarose avec l’eau. On peut alors faire diffuser les réactifs au
travers des mailles de l’éponge. On établit alors un gradient de
concentration.
Une diffusion se caractérise par une « vitesse de diffusion ». Elle dépende de la taille et de la masse de
la molécule.
Conséquences : Dans le gel, à l’intérieur des mailles, si l’ac et l’Ag forment le CI et le réseau
macromoléculaire alors il y a formation d’un précipité. Cette précipitation va stopper la diffusion et il sera
visible à l’œil nu.
Remarque : ces réactions sont très spécifiques mais peu sensibles car il faut des concentrations
optimales.
Principales techniques de d’immunoprécipitation en milieu gélifié :
Ouchternoly :diffusion double.
Diffusion Simple : technique d’immunoprécipitation en milieu gélifié pour laquelle un des
constituant est incluse dans le gal à concentration constante.
Technique de Mancini : technique de diffusion radiale. C’est une méthode quantitative pour faire un
dosage.
Plus la quantité d’Ag est importante, plus le diamètre du cercle de précipitation sera grand.
D² = α [Ag] + β
C’est la surface qui est proportionnelle à la concentration.
Il s’agit d’une technique bidimensionnelle.
Immunodiffusion après accélération dans un champs électrique :cf principe de l’électrophorèse.
Les deux diffusions précédentes se font suivant un gradient de concentration. Ici la diffusion va se fire
sui te à l’établissement d’un champ électrique dans le gel. Le gel va être relié à un générateur de
tension.
Diffusion Simple, ou la technique de Laurel : Des Ac
sont introduits dans le gel. Méthode de dosage. On fait
des trous dans le gel du côté + ou – en fonction de la
charge de l’Ag. La charge de l’Ag varie en fonction du
milieu, cad du pH, cf Biochimie.
Ici on sait que pHi(Ac)~8,6, il faut donc que le pH du gel
soit à 8,6 pour que les Ac ne migrent pas. C’est une
diffusion unidimensionnelle, le cercle (= le puit) s’étend
en forme de « fusée ». Onconsidère que la hateur de la
fusée et proportionnelle à la concentration :
h = α [Ag] + β
Diffusion double: ici les Ac et les Ag migrent.
Cette technique s’applique plutôt dans le milieu médical
(ex Candidose).
Il s’agit d’une technique plus rapide qu’Ouchternoly.
Utilisation des Réactifs marqués
Dans ce cas là, la réaction Ac-Ag ne peut-être mis en évidence à lo’eil nu. On utilise alors des réactifs
marqués :
-radioactifs (isotopes)
-fluorescence
-enzymatiques
Immunofluorescence
Un des réactifs est marqué par un fluorochorme = molécule capable d’émettre de la fluorescence après
excitation. Pour observer cette réaction, il faut utiliser un miscrosope à fluorescence = capable d’exciter
le fluorochrome et de détecter la fluorescence émise.
Le plus souvent c’est l’Ac qui est marqué par le fluorochrome.
Fluorochorme = isothicyanate de fluorescence FITC ; dérivés de la rhodamine.
Il existe divers techniques de fluorescences :
Immunofluorescence directe : étape de marquage + étape
de lavage + étape de révélation, cad observation au
microscope à fluorescence.
Inconvénient : la préparation de l’Ac est délicate car les Ac
primaires sont coûteux et davantage encore l’ajout de FITC !
Avantage : technique très simple car un seul Ac à rajouter et un
seul lavage.
Immunofluorescence indirecte : L’Ac primaire n’est pas
marqué, on rajoute un Ac secondaire (anti Ac primaire ou
anti Isotype) marqué.
Avantage : moins coûteux car il est plus facile de faire des Ac
secondaires marqués que des Ac primaires. Méthode plus
sensible car il y a amplification du signal entre Ac primaire et Ac
secondaire.
Inconvénient : méthode plus longue car plusieurs étapes
d’incubation et risque de marquage non-spécifique.
Technique du « Sandwich » : Mise en évidence des Ac. Elle consiste dans un premier temps, à
fixer des Ac sur un support. Ensuite on fixe l’Ag. Puis « on prend en sandwich » l’Ag avec un second
Ac qui lui est fluorescent.
Remarque : Ces techniques d’immunofluorescences sont utilisées soit de manières qualitatives pour
mette en évidences des Ac ou des Ag. Mais maintenant de plus en plus quantitatives pour des dosages.
Radioimmunologie
Principe : utiliser des Ac radiomarqués pour mettre en évidence le complexe Ac-Ag. La molécule la plus
souvent utilisées est le Tritium, H3.
Immunuenzymologie
Principe : utilisation d’Ac sur lesquels n a fixé une enzyme ce qui va permettre la détection du CI.
Techniques « non-compétitives » : Elle repose sur le même principe que l’immunofluorescence
donc elle peut-être directe/indirecte/sandwich.
Exemple directe : le produit P de la réaction enzyme E / substrat S a des propriétés d’absorption donc
mise en évidence par spectrophotométrie. On établit ainsi une gamme étalon : on fait varier la quantité
d’Ag marqués et on ajoute la même quantité d’Ac secondaires avec l’enzyme E. On détermine la zone
de linéarité pour faire le dosage.
 Techniques « compétitives » : Faire un compétition vis-à-vis d’Ac fixés sur un support entre l’Ag à
doser et un Ag marqué de même spécificité ajouté en quantité commune et en même temps.
La variable ici est le nombre d’Ag marqués. L’absorbance est inversement proportionnelle à la quantité
d’Ag. Limite de détection environ 10 ng/L. Les enzymes les plus utilisées sont Phosphatase alcaline,
Peroxydase, Beta-galactosidase.
Obtention des Ac
Rappels sur la physiologie de la réponse immunitaire
Médiation humorale
Médiation cellulaire
Ac spécifiques (sang, sécrétion des muqueuses) = Pas de production d’Ac mais production de cellules
réponse cellulaire
qui agissent sur l’Ag => cytoxicité cellulaire. Pas de
-> LB, LT helpers cd4+
cellules phagocytaires
-> cellules phagiques (macrophages,
- LT cytotoxiques et LT cd8+
polynucléïdes)
AcAg = CI qui active le complément et les cellules
phagiques.
Ci peut aussi « neutraliser » l’Ag (l’Ac se fixe sur la
toxine bactéreinne par exemple, et inhibe la
toxicité).
Deux phénomènes spécifiques
Caractéristiques générale de la réponse immunitaire à médiation humorale
On immunise un animal avec un Ag
étranger.
Cette réaction immunitaire présente
toujours un délai temporel. Elle est
transitoire : elle dure peu dans le temps,
il arrive un moment où les Ac spécifiques
ne sont plus détectables. C’est une
production
majoritaire
d’IgM
(et
minoritairement d’IgG). L’Ag possède
plusieurs épitope différents alrs réponse
immunitaire avec plusieurs types d’IgM
pouvant reconnaître plusieurs épitopes
différents. La production d’Ac se fait un
faible quantité.
La seconde réaction est immédiate. La
production d’Ac est 10 fois plus
importante. Ce sont des IgG qui sont
produits majoritairement. Cette seconde
réponse est maintenue dans le temps.
Généralement les Ac produits ici ont une
meilleure affinité avec l’Ag.
On montre ici que l’organisme développe une « mémoire immunitaire » entre la première et la seconde
immunisation.
Le principe de la vaccination repose sur cette « mémoire immunitaire ».
Facteurs de variation de la réponse immunitaire
Cette réponse immunitaire dépend de la voie d’administration.
-jamais sous voie orale,
-voie sous-cutanée,
-intra-péritonéale (dans l’abdomen),
-rarement en intra-veineux.
Cette réaction dépend aussi de sa dose.
Utilisation d’un adjuvant : c’est une substance qui est incorporée / injectée en même temps que les Ag et
qui va stimuler la réponse immunitaire. Très souvent ce sont des sels inorganiques (hydroxyde
d’alumine, phosphate de calcium). Ils ont tendance à piéger les Ag et à les accumuler sur les sites de
l’injection. Ceci favorise les réponse immunitaire car il y a une forte concentration à cet endroit. Ce sont
aussi des composant bactériens, par exemple les protéines de la paroi des mycobactéries. Ces Ag
stimulent fortement les lymphocytes.
Exemple : « adjuvant de Freud » = solution antigénique (soluble) + Ag BK (protéine de la paroi des
mycobactéreies) + huile de paraffine. L’huile forme une émulsion => l’Ag devient alors particulaire ce qui
stimule fortement la réponse immunitaire ( réaction inflammatoire très importante).
Remarque : les adjuvants sont totalement interdits en vaccination humaine.
Récupération de sérums polyclonaux
On récupère d’abord le sang que l’on centrifuge pour obtenir le plasma. Puis lors de la coagulaitondu
plasma il y a formationd ‘un caillau de fibrine (sans anticoagulant). On récolte alors le sérum (avec
toutes les protéines du sérum, cad envrion une centaine). Dans ce sérum ne nous intéresse que les Ac.
Purification des Ac : On utilise une colonne de chromatographie.
Chromatographie d’affinité :
Liaisons d’affinité = liaisons faibles. La protéine A a une
affinité avec Fc des Ig donc la partie Fab pourra nous
servir a récupérer les autres protéines. Une élution
permet de décrocher les protéines. Variation de la force
ioniques ou variation du pH. On récupère tous les Ig que
l’on va faire passer sur une seconde colonne. Dans une
seconde colonne on fixe des Ag spécifiques qui vont
retenir que les Ac spécifiques. Les autres seront
évacués. DE même on effectue une élution pour
récupérer les Ac spécifiques. On obtient alors notre
sérum polyclonal.
Chromatographie sur colonne échangeuse d’ions :
Production d’Ac monoclonaux
Principe : préparation et obtention de « cellules hybrides » dites « hybridomes » qui sont le résultats de
la fusion (forcée) de deux cellules :
-cellule tumorale (myélome)
-plasmocyte (LB activé sécrétant des Ac)
Du fait de cette fusion, les hybridomes ont des doubles propriétés :
-capables de synthétiser et de sécréter des Ac spécifiques
-capables de se multiplier indéfiniment en culture cellulaire in vitro.
Culture in vitro : milieu de culture liquide, 37°c, 5%de CO2, pour les cellules animales et eucaryotes.
Les étapes principales de production d’Ac monoclonaux
Pour faire un hybridome ont a besoin de cellules tumorales et de plasmocytes. Il faut cependant des
plasmocytes spécifiques, par exemples sécrétant des Ac antiActine. Il faut donc immuniser un animal
avec des Ag spécifiques, il va produire un sérum polyclonal composé d’Ac antiActine. Ce qui nous
intéresse ce sont les plasmocytes produisant ces Ac. Chez l’animal, ces plasmocytes abondants sont
situés dans la rate. Les cellules de la rate s’appellent les splénocytes, donc certains splénocytes sont
des plasmocytes.
Lorsque l’on a récupéré ces splénocytes on les mélanges avec le myélomes.
Le PEG (PolyEthylèneGlyol) a un effet sur les membranes plasmiques, il favorise les contacts cellulaires
entre plasmocytes et myélomes. Puis on cultive les cellules in vitro.
Lors du mélange il n’y a pas que les hybridomes sérétant les Ac antiActine, il y a aussi ceux produisant
les autres Ac.
Lors du mélange en tubes toutes les cellules ne s’hybrident pas ! Il reste donc dans chaque puit des
hybridomes, des splénocytes et des myélomes.
Sachant que les plasmocytes ont une durée de vie de 3-4 jours, au bout d’une semaine il n’y aura plus
de plasmocytes non hybridés. Par contre il faut une contrainte, lors de la culture pour empêcher la
culture des mylomes non hybridés = sélection négative.
Lors de la duplication de l’ADN il faut des précurseurs dans le milieu du type :
-Thymine qui permet de synthétiser la Thymine et la Cytosine (bases Pyrimidiques).
-Hypoxanthine qui permet de synthétiser l’Adénosine et la Guanine (bases Puiriques).
On ajoute dans le milieu ces deux précurseurs. L’aport d’Hypoxanthine nécessite une enzyme : la
HGPRT (Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase).
Le mode de sélection des hybridome repose sur cette enzyme. Si il n’y a pas d’enzyme dans le milieu il
n’y a pas d’Adénine ni de Guanine.
On peut aussi synthétiser les nucléotides à partir des bases Azotés déjà existantes dans la cellules
(synthèses des « novo »).
Or les hybridomes utilisés sont des HGPRT -.
Dans le milieu de sélection on met les deux précurseurs : Hypoxanthine + Thymidine +Aminotpérine qui
inhibe la synthèse des « novo ».
Donc la synthèse des novo des hybridome va être inhibée, la synthèse via H et T aussi. Donc seuls les
hybridomes HGPRT+ grâce aux plasmocytes pourront survivre.
On note qu’au bout de 10 jours environ on obtiens que des hybridomes dans les puits de culture.
Identification des clones produisant les Ac spécifiques.
On recherche quels sont les puits qui possèdent les Ac qui nous intéressent. On prélève le surnagent
cad les protéines libérées par les hybridomes.
Clonage
Objectif : isoler une unique cellule dans un puit pour que cette cellule se multiplie pour donner une
population cellulaire. La méthode utilisée et celle de la dilution limite.
Dilution Limite : dilutions choisies de telle sorte qu’après ces dilutions il n’y ait soit 1 soit 0 cellule dans
les puits. On laisse incuber 15j pour que les cellules se développent Puis on recherche les clones qui
possèdent les Ac mococlonaux voulus.
Production d’Ac monoclonaux en masse. Cf. poly
Avantage Ac m / Ac p:
1 seul type de reconnaissance bcp plus importante pour les mococloanaux que les polyclonaux. Bcp
moins de risques d’activités croisées. De plus la sélection des Ac est faite avec une meilleure affinité,
pour être la plus spécifique = >outils de reconnaissance très spécifique !!
Par contre coût et fabrication sont des inconvénients.