FT-ICR - Spectrométrie de masse
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FT-ICR 1. Introduction La spectrométrie de masse à transformée de Fourier (FT-ICR/MS) est un instrument de très grande performance offrant une très haute précision de mesure de masse et un très haut pouvoir résolutif.1,2,3 D’un point de vue analytique, cet instrument est un outil puissant pour des études très variées, il joue un rôle déterminant non seulement dans la Chimie et ses produits naturels, mais aussi dans les Sciences de la vie ainsi que la pharmacie. Le principe de la résonance cyclotronique a été développé par Lawrence et al. en 1930.4 Lawrence a construit le premier accélérateur cyclotronique pour étudier les propriétés fondamentales des atomes en recherche nucléaire. Dans cet instrument, la fréquence angulaire du mouvement de rotation des particules chargées dans un champ magnétique est indépendante du rayon et inversement proportionnelle au rapport masse sur charge (m/z) multiplié par la valeur du champ magnétique. Quelques années plus tard, Penning a conçu le premier piège pour les particules chargées en employant une combinaison d’un champ électrique statique et d’un champ magnétique pour confiner des électrons.5 En 1949, le principe de la résonance cyclotronique des ions est incorporé, pour la première fois, dans un spectromètre de masse par Hipple et al..6,7 Avec ce premier instrument ICR/MS, nommé Omegatron, les ions sont accélérés radialement à leur fréquence cyclotronique et la détection d’ions se réalisait sur un collecteur fixe. A cause des restrictions instrumentales dans les années 1950, cet appareil est très limité au niveau de la résolution et la gamme de masse, ainsi que de son utilité analytique. Plus tard, Wobschall a 1 Marshall A.G., Hendrickson C.L., Jackson G.S.. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: a primer. Mass Spectrom. Rev. 1998, 17, 1. 2 Amster I.J.. Fourier transform mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 1996, 31, 1325. 3 Vartanian V.H., Anderson J.S., Laude D.A.. Advances in trapped ion cells for fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 1995, 14, 1. 4 Lawrence E.O. and Edlefsen N.E.. On the production of high speed proton. Science. 1930, 72, 376. 5 Penning F.M.. Glow discharge at low pressure between coaxial cylinders in an axial magnetic field. Physica. 1936, 3, 873. 6 Hipple J.A., Sommer H., Thomas H.A.. A precise method of determining the faraday by magnetic resonance. Phys. Rev. 1949, 76, 1877 7 Sommer H., Thomas H.A., Hipple J.A.. The measurement of e/M by cyclotron resonance. Phys. Rev. 1951, 82, 697 collaboré avec la société Varian pour l’amélioration de l’ICR/MS.8 Les développements, apportés au nouvel instrument Syrotron, consistent en une cellule “drift”, qui a été divisée en source d’ions, analyseur et régions de collection et une détection par oscillateur marginal. La version commercialisée de cet instrument a été beaucoup utilisée pour l’étude des réactions ionmolécule en phase gazeuse. La grande difficulté à cette époque résidait dans la mesure de tous les rapports m/z des ions présents dans la cellule ICR. L’introduction du piège ionique ICR9 a ouvert un nouveau chapitre de l’évolution de l’instrumentation ICR/MS. Les ions sont piégés par des électrodes de piégeage où des faibles tensions sont appliquées. Le temps de piégeage étant 100 fois plus long que pour la cellule “drift” (1-2 ms pour le piège ionique), la sensibilité, la gamme dynamique et la résolution ont été largement améliorées. Sur cette base, en 1974, la spectrométrie de masse FT-ICR (résonance cyclotronique des ions à transformée de Fourier) a été inventée par Comisarow et Marshall10 grâce au progrès de l’informatique et en particulier des convertisseurs analogique/numérique (ADC) permettant la digitalisation en temps réel du signal électrique induits par les ions en mouvement dans la cellule ICR. Depuis, la spectrométrie de masse FT-ICR n’a cessé de se développer - en 1989, McLafferty et al.11 ont couplé une source ESI au FT-ICR au travers d’une injection d’ions quadripolaire et des domaines de pompages différentiels. Ce couplage est très utile pour des systèmes non-volatiles, notamment les macromolécules. A partir de cette combinaison, les modes d’ionisation externe11,12,13,14 (ESI, MALDI, LD, autoionisation, EI, CI, APCI, APPI etc.) ont remplacé les sources internes (EI, CI, PI, LD etc.).1,15 8 Wobschall D. Ion cyclotron resonance spectrometer. Rev. Sci. Instrum. 1965, 36, 466. McIver R.T. Jr.. Trapped ion analyzer cell for ion cyclotron resonance spectroscopy. Rev. Sci. Instrum. 1970, 41, 555. 10 Comisarow M.B., Marshall A.G. Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 1974, 25, 282. 9 11 Henry K.D., Williams E.R., Wang B.H., McLafferty F.W., Shabanowitz J., Hunt D.F. Fourier-transform mass spectrometry of large molecules by electrospray ionization. Proc. Natl. Acad . Sci. USA. 1989, 86, 9075. 12 Castro J.A., Koster C., Wilkins C.. Matrix-assisted laser desorption/ionization of high-mass molecules by Fourier-transform mass spectrometry. Rapid comm. mass spectrom. 1992, 6, 239. 13 Riegner D.E., Laude D.A., Jr.. Collision-mediated axial ejection of radially excited ions as a mass-dependent ion loss mechanism in Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1992, 120, 103. 14 Brown S.C., Kruppa G., Dasseux J.L.. Metabolomics applications of FT-ICR mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 223. 15 Ghaderi S., Kulkarni P.S., Ledford E. B., Jr., Wilkins C.L., Gross M.L.. Chemical ionization in Fourier transform mass spectrometry. Anal. Chem. 1981, 53, 428. - l’évolution de l’électronique et de l’informatique a donné l’accès à différentes méthodes de l’excitation1,2 (“Chirp”, “SWIFT ”, etc.), de la détection1,2 (“broad-band”, “narrow-band”), et du traitement du signal Transformée de Fourier (“Zero-filling”,16 “Apodisation”17). - des nombreuses modifications de géométrie du piège ionique18 ont été mises en œuvre pour réduire au maximum l’influence des potentiels de piégeage des ions afin que les fréquences mesurées soient les plus proche possible des fréquences cyclotronique théoriques. Les grands développements du FT-ICR ont commencé dans les années 1990 avec l’introduction de champs magnétiques plus élevés,19 de l’accumulation d’ions externe,20 et d’un quadripôle externe pour la sélection d’ions,21 En même temps, les techniques de dissociation comme la dissociation induite par collisions (CID,22 SORI-CID23), par multiphoton infrarouge (IRMPD),24,25 par la capture d’électron (ECD)26 et par détachement d’électron (EDD),27 ont été développées et appliquées à la caractérisation de substances macromoléculaires. 16 Comisarow M.B., Melka J.D. Error estimates for finite zero-filling in Fourier transform spectrometry. Anal. Chem. 1979, 51, 2198. 17 Aarstol M., Comisarow M.B.. Apodization of FT-ICR spectra. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987, 76, 287. 18 Guan S., Marshall A.G.. Ion traps for Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: principles and design of geometric and electric configurations. Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1995, 146/147, 261. 19 Marshall A.G., Guan S.H.. Advantages of high magnetic field for fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1996, 10, 1819. 20 Senko M.W., Hendrickson C.L., Emmett M.R., Shi S.D.H., Marshall A.G.. External accumulation of ions for enhanced electrospray ionization fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1997, 8, 970. 21 Belov M.E., Nikolaev E.N., Anderson G.A., Auberry K.J., Harkewicz R., Smith R.D.. Electrospray ionization-Fourier transform ion cyclotron mass spectrometry using ion preselection and external accumulation for ultrahigh sensitivity. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2001, 12, 38. 22 Senko M.W., Speir J.P., Mclafferty F.W.. Collisional activation of large multiply-charged ions using Fourier-transform massspectrometry. Anal. Chem. 1994, 66, 2801. 23 Kellersberger K.A., Yu E., Kruppa G.H., Young M.M., Fabris D.. Top-Down characterization of nucleic acids modified by structural probes using high-resolution tandem mass spectrometry and automated data interpretation. Anal. Chem. 2004, 76, 2438. 24 Little D.P., Speir J.P., Senko M.W., O’Connor P.B., McLafferty F.W.. Infrared multiphoton dissociation of large multiply charged ions for biomolecules sequencing. Anal. Chem. 1994, 66, 2809. 25 Little D.P., Aaserud D.J., Valaskovic G.A., McLafferty F.W.. Sequence information from 42–108-mer DNAs (complete for a 50 mer) by tandem mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 9352. 26 Cooper H.J., Hakansson K., Marshall A.G.. The role of electron capture dissociation in biomolecular analysis. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 201. 27 Yang J., Hakansson K.. Fragmentation of oligoribonucleotides from gas-phase ion-electron reactions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006, 17, 1369. Aujourd’hui, la spectrométrie de masse FT-ICR est devenu un instrument mûrement développé, et largement utilisé dans les différents domaines de recherche grâce à ses nombreux avantages : - haut pouvoir résolutif (105 à 106 FWHM). - haute précision de mesure de masse (de l’ordre du sub-ppm). - grande sensibilité et haute gamme dynamique. - une flexibilité suffisante permettant la combinaison avec différentes sources d’ions externes11,12,13,14 (auto-ionisation, EI, CI, LD, MALDI, ESI, APCI, APPI etc.). - l’accès aux différents modes d’activation avec les plus récents, dont certains sont des techniques propres aux technique de piégeage tout comme le SORI-CID,23 l’IRMPD,24 l’ECD26 et l’EDD.27 2. Principe de base 2.1 Mouvement cyclotronique des ions dans la cellule ICR Le principe de la cellule ICR est basé sur le piégeage des ions par un champ magnétique. Un ion de vitesse dans un champ magnétique uniforme B subit une force de Lorentz F (Équation 1) qui induit un mouvement circulaire de l’ion, perpendiculaire à la direction du champ magnétique (Figure 77). x B z y v - + zev x B v zev x B r Figure 7. Mouvement cyclotronique des ions positifs et négatifs dans un champ magnétique (modifié à partir de schéma publié par Marshall28). F ze B Équation 1 z : nombre de charge e = 1,6.10-19 C Lors qu’un ion exécute un mouvement uniforme avec un rayon r de la trajectoire circulaire, la force de Lorentz (Flor) est en équilibre avec la force centripète (Fcen), avec Flor zeB , Fcen or 2rc et m 2 r m 2 zeB r → r 2 c : vitesse des ions (m), r : rayon du mouvement cyclotronique (m) : vitesse angulaire (rad/s); c : fréquence cyclotronique (Hz) donc c zeB 1.535611 107 B 2 2m m/ z Équation 2 Ce mouvement de rotation est appelé mouvement cyclotronique c et sa fréquence ne dépend que du champ magnétique et du rapport masse sur charge, mais est indépendante de la vitesse initiale. A partir de cette équation (Équation 2), la mesure de la fréquence cyclotronique permet une détermination du rapport m/z d’ions dans la cellule ICR. Il faut noter que cette fréquence est inversement proportionnelle au rapport m/z ; un ion de haut rapport m/z aura donc une fréquence cyclotronique c faible. 28 Marshall A.G., Grosshans P.B.. Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: The teenage years. Anal. Chem. 1991, 63, 215A. Bien que la fréquence cyclotronique soit identique pour les ions de même rapport m/z, le rayon initial de la trajectoire circulaire de ces ions est variable car il est dépendant de la vitesse initiale dans le plan xy (Équation 3). r m xy Équation 3 zeB 2.2 Piège de Penning La cellule ICR est un piège dit de Penning5 où les ions sont piégés par la combinaison d’un champ magnétique et un champ électrique. Le mouvement cyclotronique des ions induit par le champ magnétique implique un mouvement hélicoïdal infini suivant l’axe z (anti-parallèle au champ magnétique B ) et sa vitesse reste constante (Figure 88). Afin de piéger les ions suivant l’axe z , deux plaques de piégeage sont disposées perpendiculairement au champ magnétique de façon à créer un puits de potentiel électrique permettant le piégeage des ions. Généralement un faible potentiel de l’ordre de 1 V est appliqué sur chacun des deux plaques de piégeage. Les ions décrivent alors un mouvement d’oscillation entre ces deux plaques, dite mouvement de piégeage (Figure 99). Figure 8. Mouvement cyclotronique d’un ion Figure 9. Mouvement macroscopique d’un dans un champ magnétique ion dans un champ magnétique, piégé entre deux plaque. 29 (Figures adaptés par A. Delvolvé à partir de documentation Bruker ). Si le champ électrique appliqué était homogène et parallèle au champ magnétique avec des plaques de longueur infinies, ce qui est le cas idéal, le mouvement d’un ion serait hélicoïdal avec des oscillations périodiques suivant l’axe z dans le puits de potentiel électrique. La fréquence de piégeage T peut donc être définie par l’Équation 4: T 1 2 2 zeVtrap ma 2 Équation 4 a : distance entre les plaques de piégeage; Vtrap : potentiel de piégeage (en V); : facteur géométrique. En réalité, le champ électrique ne pouvant pas être parallèle au champ magnétique, un troisième mouvement est induit par la composante radiale du champ électrique. Ce mouvement, nommé mouvement magnétron, donne une tendance à entraîner les ions sur d’autres trajectoires (Figure 10) et se traduit par un abaissement de la fréquence cyclotronique. Les définitions de la fréquence cyclotronique réduite et la fréquence magnétron sont données comme l’Équation 5 et l’Équation 6. 1 29 Delvolvé A.. Etude en phase gazeuse de complexes non-covalents APN/ADN: exploration de l’origine de leur stabilité. Thèse de l’Université Pierre et Marie Curie, 2006. Mouvement Magnétron Décélération B + Accélération Er chemin d‘ion Figure 10. Mouvement magnétron dans la cellule ICR (documentation Bruker). c c T 2 2 2 2 c 2 c T 2 2 2 2 (Fréquence cyclotronique réduite) Équation 5 (Fréquence magnétron) Équation 6 2 Malgré cette affaiblissement de la fréquence cyclotronique, nous appliquons expérimentalement une approximation : c . En effet, pour un ion de faible rapport m/z, la fréquence cyclotronique réduite est très proche de la fréquence cyclotronique c . Cependant, pour un ion de valeur m/z élevée, la fréquence cyclotronique étant plus basse, l’influence de la fréquence de piégeage devient plus importante, ainsi que la différence entre et c peut être non négligeable. Afin de réduire cette différence de fréquence réelle et théorique, il est préférentiel d’appliquer un potentiel de piégeage faible (de l’ordre de 1 V). La combinaison des trois mouvements d’un ion dans la cellule ICR (mouvement cyclotronique, mouvement de piégeage et mouvement magnétron) est présentée dans la Figure 1111. Parmi ces trois mouvements, le mouvement magnétron ainsi que le mouvement de piégeage possèdent une fréquence beaucoup moins importantes par rapport à celle du mouvement cyclotronique. En général, la fréquence de piégeage et la fréquence magnétron sont négligeables sauf si l’ion n’est pas dans l’axe du piège et/ou l’amplitude du mouvement de l’ion est proche de la distance entre les parois de piège.1 Mouvement cyclotronique Axe de cellule B Mouvement de piégeage Mouvement magnétron Figure 11. Trajectoire d’ion dans la cellule ICR1. Depuis l’introduction de la cellule cubique à un instrument ICR-MS des premières générations par McIver en 19709, différents types de cellules ICR ont été développés (Figure). L’objectif de ces modifications géométrique est de tenter d’avoir i) un potentiel de piégeage avec un champ électrique radial le plus faible possible, ii) un plus grand diamètre de piège et, iii) une meilleure linéarité de l’excitation dipolaire. Figure 12. Différents types de cellule FT-ICR (modifié à partir de schéma publié par Marshall18), avec ses différents plaques : E = excitation, D = détection; T = piégeage. (a) cellule cubique initiale, (b) cellule cylindrique, (c) cellule cylindrique dite “Infinie”, (d) et (e) cellule cylindrique ouverte sans ou avec un couplage capacitif, (f) double cellule cubique, (g) cellule hyperboloïdale et, (h) cellule “ matrix-shimmed”. 3. Principe de fonctionnement L’enregistrement d’un spectre de masse implique la détection des courants induits du mouvement cyclotronique par les plaques dites de détections. Or le signal cyclotronique est dans un premier temps non détectable. En effet, dans les instruments à source externe, les ions ont été introduits avec des énergies cinétiques variables et selon des temps différents dus aux temps de vol des ions, ils sont donc déphasés et sont en orbite selon un faible rayon. Ainsi, il est nécessaire de faire passer la population d’ions (de même rapport m/z) d’un mouvement d’ensemble incohérent (ions déphasés) à un mouvement d’ensemble cohérent (en phase) avec une même orbite. Pour atteindre ce but, une procédure d’excitation – détection est utilisée (Figure13). x z y Figure 13. Processus de fonctionnement de la cellule FT-ICR cubique pour l’obtention de spectre de masse (modifié à partir de schéma publié par Marshall1) : après excitation, les ions prennent un mouvement cohérent ainsi qu’une orbite de rayon plus important permettant d’obtenir un signal mesurable sur les deux plaques de détection. 3.1 Excitation résonante des ions Les méthodes d’excitation résonante classiques consistent : i) l’excitation par impulsion rectangulaire (Figure 1414a), où on applique une seule fréquence d’excitation correspondant à un ensemble d’ions de même rapport m/z ; ii) l’excitation “broadband”, peut être effectuée suivant deux approches : - par la méthode dite “R.F. chirp” (Figure 1414b),30,31 impliquant l’utilisation d’une seule impulsion d’excitation qui balaye la gamme de fréquence d’intérêt. - par la méthode “SWIFT”32,33(Stored-Waveform Inverse Fourier Transform) comme montré dans la Figure 14c, où le domaine de fréquence d’excitation est défini a priori et l’onde d’excitation calculée en conséquence par transformée de Fourier inverse. Figure 14. Différentes méthodes d’excitation avec le domaine de temps à gauche et le domaine de fréquence à droite (modifié à partir de schéma publié par Marshall1): (a) impulsion rectangulaire (monofréquence), (b) R.F. chirp et, (c) SWIFT. Dans le cas de l’excitation par impulsion rectangulaire (Figure 14a), un champ électrique sinusoïdal dipolaire est appliqué de façon homogène dans la cellule FT-ICR. Ce champ électrique, produit par un courant électrique alternatif disposé sur les plaques d’excitation, oscillant à la fréquence cyclotronique d’ions d’une valeur m/z conduit à obtenir un mouvement cohérent avec une orbite plus importante (Figureb). Les ions d’autres rapports m/z, ayant des fréquences cyclotronique différentes, ne sont pas en résonance avec la radio-fréquence du champ 30 Comisarow M.B., Marshall, A.G.. Frequency-sweep Fourier transform ion cyclotron resonance spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 1974, 26, 489. 31 Marshall A.G., Roe D.C.. Theory of Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectroscopy: Response to frequencysweep excitation. J. Chem. Phys. 1980, 73, 1581. 32 Marshall A.G., Wang T.-C.L., Ricca T.L.. Tailored excitation for Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Amer. Chem. Soc. 1985, 107, 7893. 33 Marshall A.G., Ricca T.L., Wang T.C.L.. Tailored excitation for trapped ion mass spectrometry. USA Patent #4,761,545, issued 2 August 1988. électrique, ils n’absorbent pas d’énergie et donc restent au centre du piège. Pour connaître l’orbite d’un ensemble d’ions, il est possible de calculer son rayon lors qu’il est excité à sa fréquence cyclotronique, à partir de l’Équation 7. r V p p texcit 2dB Équation 7 V p p : tension d’excitation (en V); texcit : durée de l’irradiation ; d : distance entre les plaques d’excitation. Il faut noter que selon cette équation, le rayon cyclotronique post-excitation d’ion, est indépendamment de la valeur m/z, tous les ions dans la gamme de m/z définie peuvent être excités à un même rayon. En théorique, plus le rayon de l’orbite est grand, plus grande sera l’intensité du signal obtenu. Néanmoins, cette orbite ne peut pas être trop grande, car l’inhomogénéité du champ électrique peut conduire à l’éjection des ions. En pratique, le rayon de l’orbite r doit être inférieur à 0.4 fois la distance entre les deux plaques d’excitation. En général, la méthode d’excitation par impulsion rectangulaire est peu utile pour enregistrer un spectre de masse de tous les ions piégés dans la cellule FT-ICR. Ainsi, l’excitation “broadband” est souvent procédée par “R.F. chirp” (Figure 14b).30,31 Cette méthode implique l’utilisation d’une seule impulsion d’excitation qui balaye la gamme de fréquence d’intérêt. Les limites de ce mode d’excitation sont mises en lumière par le manque d’uniformité de l’amplitude d’excitation (traduit par une variation de l’abondance relative d’ion apparent), ainsi que de la sélectivité limitée aux limites du spectre. La méthode “SWIFT”32,33 (Figure 14c) est ensuite introduit, grâce à la bonne cohérence entre l’excitation et la réponse dans la cellule FT-ICR, permettant une excitation plus homogène des ions. Dans ce cas, une forme d'onde d'excitation dans le domaine des temps est générée par la transformée de Fourier inverse d’un domaine prédéfini de fréquences dans lequel les fréquences de résonance des ions à exciter sont incluses. 3.2 Détection Le mouvement cohérent d’un paquet d’ions de même m/z entre les deux plaques de détection crée un courant induit (Équation 8).34 Le signal ICR est en fait proportionnel à ce courant induit Q . Q 2 ze y d Équation 8 Q : courant induit ; y : la vitesse dans l’axe y ; d : distance entre les plaques d’excitation. Selon cette équation, le courant induit apparaît comme étant indépendant de la fréquence cyclotronique des ions et de l’intensité du champ magnétique. Cependant, il est fonction du rayon cyclotronique post-excitation d’ion (Équation 7), car la vitesse dans l’axe y ( y ) est proportionnelle au rayon cyclotronique des ions (Équation 3). D’ailleurs, le courant induit augmente linéairement avec la charge des ions, donc le signal ICR est plus intense pour un ion multichargé. Pendant la durée d’acquisition du signal, certains phénomènes peuvent influencer le résultat et en particulier, la présence d’un gaz résiduel provoquant des collisions ion/neutre. Il en résulte une diminution du rayon cyclotronique de façon aléatoire et une perte de la cohérence (création de déphasage) des ions d’un même rapport m/z qui finissent par induire des courants en opposition de phase dont la résultante du courant devient nulle. Les collisions sont responsables de l’atténuation du signal suivant une exponentielle décroissante caractéristique du signal (Free Induction Decay, ou FID). Ceci conduit à la limitation de la durée du signal transitoire et donc à une diminution du pouvoir résolutif de l’instrument (Figure15). Il est donc primordial de 34 Comisarow M.B.. Signal modeling for ion cyclotron resonance. J. Chem. Phys. 1978, 69, 4097. travailler avec un nombre faible d’ions et sous un très bon vide dans la cellule ICR (10-9-10-10 mBar). Figure 15. Signal transitoire de 0.32 s (512k) correspondent à l’enregistrement de l’ion m/z 531 de la bradykinine (a) sans et (b) avec introduction d’argon dans la cellule suivi d’un temps de pompage de 1 s. Il est intéressant de remarquer que lors de l’analyse d’espèces de haut rapport m/z dans un FT-ICR, le signal transitoire obtenu présente un motif de répétition périodique appelé “Isotope Beating”35 pour le signal du domaine de temps (Figure16). Comme son nom l’indique ce phénomène est lié aux interférences constructives et destructives liées au faite que les isotopes ont une fréquence très proches. Cet effet est plus important pour les ions multichargés à cause du rapprochement de la fréquence des ions isotopiques (Figure17). Ainsi, il nécessite aussi un signal transitoire suffisamment long afin de ne pas interrompre un massif isotopique, provoquant une erreur de mesure. 35 Easterling M.L., Amster I.J., van Rooij G.J., Heeren R.M.A.. Isotope beating effects in the analysis of polymer distributions by Fourier transform mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1999, 10, 1074. Figure 16. Spectres de masse d’isolement de l’ion m/z 531 avec une fenêtre (a) de 5 Th, et (b) de 0.5 Th conduisant à la sélection de l’ion monoisotopique uniquement. Figure 17. Signal transitoire du domaine de temps (a) bovine insuline avec un état de charge +5 (Mw=5729), (b) cytochrome c avec un état de charge +8 (Mw=12360), et (c) myoglobine avec un état de charge +10 (Mw=17554), collecté avec un aimant de 7 Tesla. Comme nous l’avons vu, pour augmenter le pouvoir résolutif, il est nécessaire d’augmenter la longueur du signal transitoire enregistré. Pour un taux d’échantillonnage donné, cela va dépendre de la mémoire du convertisseur analogique /numérique (ADC). Ainsi pour enregistrer en mode dit « large bande » un ion de m/z 500 avec un aimant de 7 T (νc=215kHz) il faut au minimum un taux d’échantillonnage de 430 kHz (critère de Nyquist36). Dans ce cas si l’on utilise un taux d’échantillonnage de 500 kHz, la longueur du signal transitoire sera de 2s avec l’enregistrement de 1 million de points. Afin d’enregistrer un signal transitoire plus long, il est donc nécessaire d’utiliser le mode de détection “hétérodyne”.2,37 Ce mode de détection, aussi nommé détection à bande étroite (“narrow-band”), permet d’utiliser un plus faible taux d’échantillonnage. Avec la détection “hétérodyne”, le signal produit par le courant induit (f1) est multiplié par une fréquence de référence (f2) qui est proche de celle du signal intérêt. La combinaison de ces deux signaux sinusoïdaux donne un signal composite comprenant deux composantes correspondantes à la somme et à la différence des fréquences de deux signaux originaux, i.e. (f1+f2) et (f1-f2). La composante de fréquence élevée peut être éliminée avec un filtre passe-bas permettant de garder seule la fréquence basse. Ainsi le taux d’échantillonnage nécessaire est fortement diminuée permettant l’enregistrement d’un signal transitoire beaucoup plus long. Cependant, il est bien de noter que la gamme de masse qu’on peut observer devient aussi plus étroite. Le principe de détection “hétérodyne” est présenté dans la Figure18. 36 Nyquist H.. Thermal agitation of electric charge in conductors. Phys. Rev. 1928, 32, 110. Drader J.J., Shi S.D.-H., Blakney G.T., Hendrickson C.L., Laude D.A. Marshall A.G.. Digital quadrature heterodyne detection for high-resolution fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 1999, 71, 4758. 37 Figure 18. Illustration du principe de détection “hétérodyne”.2 Il faut noter que le phénomène de charge d’espace apparaît lorsqu’un nombre important d’ions est présent dans la cellule du FT-ICR. Lorsque trop d’ions sont présents dans la cellule, il devient nécessaire de prendre en compte les effets des interactions de répulsion entre les ions. Ceci peut conduire à un décalage de la fréquence des ions dans la cellule. Il a été montré que ce décalage dépend du rayon cyclotronique. Ainsi, pour avoir une précision de masse optimale, il est nécessaire d’effectuer un étalonnage de l’instrument dans les mêmes conditions et avec un nombre d’ions proche que pendant l’analyse.2 Par ailleurs, lorsque la charge d’espace est très élevée, des phénomènes dit de coalescence peuvent apparaître où des ions de rapport m/z proche se confondent conduisant à un signal unique. Néanmoins, le nombre d’ions a une influence sur la durée du signal transitoire. Il a été montré que lorsque le nombre d’ions est plus important, l’atténuation du signal est plus lente. Ceci a des conséquences sur les mesures de rapports isotopiques. En effet, dans certains cas, en particulier lors de l’enregistrement d’un signal transitoire relativement long, il apparaît une discrimination en faveur des isotopes de plus grande abondance.38,39 Ainsi en Figure19, le signal transitoire correspondant aux ions de plus faibles abondances présente une atténuation plus rapide que dans le cas des ions de plus haute abondance. 38 Bresson J.A., Anderson G.A., Bruce J.E., Smith R.D.. Improved Isotopic Abundance Measurements for High Resolution Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectra via Time-Domain Data Extraction. J Am Soc Mass Spectrom 1998, 9, 799. 39 Gordon E.F., Muddiman D.C.. Impact of ion cloud densities on the measurement of relative ion abundances in Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry: experimental observations of coulombically induced cyclotron radius perturbations and ion cloud dephasing rates. J. Mass Spectrom. 2001; 36: 195. Figure 19. Extracted time-domain signals for individual isotopic peaks from the 51 charge state of bovine insulin. The differences in signal damping vary with the abundances of the isotopic species.38 3.3 Traitement de signal - Transformée de Fourier Le signal ICR sinusoïdale produit par le mouvement cyclotronique périodique des ions est amplifié et digitalisé avec un taux d’échantillonnage adapté. Selon le critère de Nyquist,36 la fréquence d'échantillonnage d'un signal doit être égale ou supérieure à 2 fois la fréquence maximale (correspond au plus petit ion que l’on veut détecter) contenue dans ce signal, afin de convertir ce signal d'une forme analogique (continue) à une forme numérique (discrète). La durée de détections des ions, dont dépendra le pouvoir résolutif, sera ainsi liée au plus petit rapport m/z détecté ainsi qu’au nombre de points de donnés utilisées. Le nombre de points maximum est défini par l’informatique et est de l’ordre de 1 à 2 millions au maximum dans les instruments actuels. Le signal transitoire dans le domaine temporel est transformé en domaine de fréquence par la transformée de Fourier. A la fin, ce domaine de fréquence est converti en un spectre de masse (Figure 2020). Figure 20. Obtention et traitement du signal produit par des ions en mouvement cohérent au sein d’une cellule ICR : obtention d’un spectre de masse.29 De façon à améliorer la qualité du spectre de masse obtenu après transformée de Fourrier, différents traitements peuvent être utilisés au niveau du signal transitoire digitalisé : “l’Apodisation”17,40 et “le Zero-filling”.16 L'apodisation implique la multiplication du signal transitoire par une fonction qui permet réduire au minimum les pics présents aux pieds des signaux des spectres de masses. Ces pics résultent de la troncation brusque du signal transitoire en début et fin d'acquisition de données dans le domaine de temps. Les fonctions d'apodisation (sinusoïdales) utilisées permettent de réduire au minimum ce problème en forçant le début et la fin du signal transitoire à tendre vers zéro de façon monotone (Figure21). Dans le cas du traitement par zero-filling (Figure 22), on double (triple, etc…) le nombre de points permettant de diminuer l’intervalle de fréquence. Ce traitement permet en particulier réduire les erreurs sur la hauteur et la largeur du pic. Par ailleurs, avant la transformée de Fourier il est possible d’accumuler un grand nombre de FID conduisant à un renforçant du rapport signal sur bruit (le signal croit de façon linéaire avec le nombre d’accumulations alors que le bruit croit en racine carrée de ce nombre). 40 Goodner K.L., Milgram K.E., Williams K.R., Watson C.H., Eyler J.R. Quantitation of ion abundances in Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1998, 9, 1204. Figure 21. Schéma du traitement par Apodisation, en haut signal avant le traitement, et en bas après le traitement. Figure 22. Schéma du traitement par Zero-filling, à gauche signal avant traitement et à droite après doublement du nombre de point. 4. Intérêt de FTICR 4.1 Haut pouvoir résolutif et précision de masse L’obtention d’un haut pouvoir résolutif nécessite la mesure du signal pendant une durée relativement longue. Avec la cellule FT-ICR, cette durée peut être très longue (de l’ordre de plusieurs dizaines de secondes). Cependant, le facteur qui limite la durée du signal transitoire est la pression au sein de la cellule ICR. Comme décrit précédemment, le gaz résiduel peut créer des interactions ion/neutre avec les ions stockés. Les ions restent donc moins longtemps cohérents avec l’augmentation de pression. Lorsque la pression est suffisamment faible, la largeur des pics du spectre de fréquence ne dépend pas de la fréquence des ions, donc des rapports m/z. Mais comme la fréquence est inversement proportionnelle au rapport m/z, les pics se rapprochent lorsque le rapport m/z augmente. Donc, le pouvoir résolutif 1( m / m50% ) diminue pour un rapport m/z plus grand. m zeB m50% m50% Équation 9 m50% : largeur du pic à mi-hauteur d’un spectre de masse ; 50% : largeur du pic à mi-hauteur d’un spectre de fréquence. Une haute résolution est un point important pour obtenir la précision de masse. Or elle ne peut pas garantir la précision de mesure.41 Il est nécessaire d’effectuer un étalonnage en rapport m/z. La qualité de l’étalonnage est fortement influencée par la charge d’espace dans la cellule ICR. Un effet de répulsion est produit lorsque la distance entre les espèces chargées est très faible, la trajectoire des ions est donc légèrement modifiée. Ainsi, les pics observés sont déplacés. Normalement l’étalonnage interne permet d’obtenir une précision de rapport m/z inférieure à 1 ppm, car l’étalon interne est détecté dans les mêmes conditions d’analyse que les ions à détecter. Cette méthode permet de s’affranchir partiellement de l’effet de la charge 41 Zhang L.K., Rempel D., Pramanik B.N., Gross M.L.. Accurate mass. measurements by Fourier transform mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 286. d’espace même si elle existe. Néanmoins, dans certain cas il est difficile d’effectuer l’étalonnage interne, par exemple dans le cas de l’expérience MS/MS. Il faut dans ce cas effectuer un étalonnage externe. Alors, la qualité des mesures dépend du nombre d’ions piégés dans la cellule, il est préférable de piéger le moins d’ions possible afin d’assurer une meilleure précision de masse. En général, l’étalonnage externe donne une précision en m/z de quelques ppm pour un spectre de masse enregistré dans des conditions constantes de la cellule ICR. Il faut souligner que certains instruments hybrides : piège à ion linéaire / FT-ICR permettent une mesure préalable du courant ionique (avec le piège à ions) pour introduire un nombre d’ions constant dans la cellule ICR conduisant ainsi à améliorer la précision de mesure de masse par étalonnage externe. 4.2 Gamme de rapports masse sur charge La limite de la m/z maximum dépend de la dimension de la cellule ICR. Il est clair que le plus grand rapport m/z qu’on peut observé doit avoir un mouvement cyclotron inférieur au rayon rmax de la cellule après l’excitation et la détection. Cette limite est donnée par l’Équation 10 : mmax 2 ( ze) 2 B02 rmax 2kT Équation 10 Par contre, le champ électrique dans la cellule ICR ne peut pas être parfaitement homogène et spatial. A cause de cette inhomogénéité du champ électrique, due au potentiel de piégeage appliqué ou la répulsion Coulomb des ions, le rayon d’orbite doit être beaucoup plus petit que le rayon de la cellule afin de détecter un signal cohérent. Il existe une valeur de m/z pour laquelle le fréquence magnétron ( ) et la fréquence cyclotronique réduite ( ) sont égales (Équation 11). mcritique 1.20607 107 zB02 a 2 Vtrap Équation 11 Pour un ion de m/z supérieur à cette valeur critique, la trajectoire d’ion n’est plus stable et a tendance de conduire l’ion vers extérieur de la cellule et donc à sa perte. Avec notre système de cellule cylindrique infinie, pour un potentiel de piégeage de 1V, le rapport m/z maximum est environ 134 000 Th (valeurs de a et α sont données par le Tableau 1). Tableau 1. Paramètres géométriques de différents types de cellule ICR.1 4.3 Flexibilité : couplage avec divers sources d’ionisation Comme la plupart des échantillons sont des espèces non-volatiles (sels, métaux, métabolites, peptides, protéines, oligonucleotides, lipides, oligosaccharides, etc.), il est nécessaire d’utiliser des modes de désorption/ionisation comme l’ESI, le MALDI, l’APPI, l’APCI, le DESI, etc… Aujourd’hui, le FTICR peut être couplé avec diverses sources d’ionisation en utilisant une source externe installée hors du champ magnétique. Les espèces ionisées sont transférées à la cellule ICR par un système de guide d’ions. Plusieurs étapes de pompages différentiels au long de ce guide d’ions sont appliquées pour assurer un transfert efficace d’ions. Un tel système où la source est située à l’extérieur de l’aimant beaucoup plus flexible et permet donc d’utiliser différents modes d’ionisation.11,12,13,14 Les ions formés dans la source sont introduits et piégés dans la cellule ICR. Néanmoins, ces ions possèdent une énergie cinétique qui leur permet de franchir la barrière de potentiel de la plaque de piégeage pour entrer dans la cellule mais leur donne aussi la possibilité d’en sortir. Il faut donc trouver des solutions pour piéger les ions par l’introduction d’un gaz inerte ou par l’application de voltage sur le potentiel de piégeage. Les modes de piégeage les plus couramment utilisés sont : le piégeage “Static Gated”, le piégeage “Sidekick” et le piégeage dynamique : i) Piégeage “Static Gated” Il s’agit d’introduire un gaz inerte dans la cellule ICR afin de piéger les ions. En effet, le principe de ce mode est similaire à une cellule de piégeage conventionnelle (piège de Paul). Les collisions du gaz inerte avec les ions permettent la relaxation de ces derniers en énergie cinétique, ce qui va empêcher leur sortie du piège. De plus, à l’aide du gaz inerte, on peut obtenir une meilleure focalisation des ions. Cependant, la résolution se dégrade de part l’augmentation de la pression dans la cellule ICR. Il est donc nécessaire de prévoir un délai de pompage avant l’étape de détection. ii) Piégeage “Sidekick” Ce mode consiste en l’application d’une faible différence de potentiel, orthogonale à l’axe z, juste avant l’entrée des ions dans la cellule ICR. L’énergie cinétique des ions est donc une partie convertie en énergie radiale, ce qui se traduit par une augmentation du rayon magnétron. L’énergie restant du côté axial n’est plus suffisante pour franchir la barrière de potentiel, les ions sont ainsi piégés. iii) Piégeage dynamique Ce mode utilise des variations de tensions impliquées sur les deux plaques de piégeage. Une synchronisation des tensions sur les plaques de la cellule ICR est effectuée suivant le mouvement des ions (Figure23). La procédure de piégeage dynamique peut être effectuée en boucle “N” fois pour obtenir un nombre d’ions suffisant. Par contre, il est possible de créer une discrimination d’ions en raison de la différence de temps de vol des espèces ionisées. Back Trap Plate Front Trap Plate 4.0V + + + + 4.0V 0V 0V “N” fois Back Trap Plate Front Trap Plate 4.0V 0V Back Trap Plate + + ++ 4.0V 0V Front Trap Plate 4.0V + + + + 4.0V 0V 0V Figure 23. Schéma du principe du piégeage dynamique des ions (adapté à partir de documentation Bruker).
