Les plasmocytes et leur niche - Collection mémoires et thèses

Les plasmocytes et leur niche : Étude de la génération
de plasmocytes humains in vitro
Thèse
Guillaume Bonnaure
Doctorat en biochimie
Philosophiae doctor (Ph.D.)
Québec, Canada
© Guillaume Bonnaure, 2016

Les plasmocytes et leur niche : Étude de la génération
de plasmocytes humains in vitro
Thèse
Guillaume Bonnaure
Sous la direction de :
André Darveau, directeur de recherche
Sonia Néron, codirectrice de recherche

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Résumé
Chez l’humain, les lymphocytes B mémoires IgG+ et IgA+ sont des cellules clés de
l’immunité humorale. Ces cellules mémoires sont maintenues à long-terme dans
notre organisme. Elles représentent une défense rapide et efficace contre toutes
les infections que nous avons déjà vaincues pendant notre vie. Ces cellules
mémoires qui rencontrent à nouveau leur antigène se différencient rapidement en
plasmocytes à courte vie, et permettent la sécrétion massive d’immunoglobuline
(Ig). La contrepartie mémoire de ces cellules sont les plasmocytes à longue vie qui
sont présents dans les niches de la moelle osseuse et y sécrètent en permanence
des anticorps protecteurs qui circulent dans le sang. Ces cellules sécrétrices
peuvent avoir une durée de vie allant de dizaines d’années à la vie entière de
l’individu. Les patients qui reçoivent des traitements de chimiothérapie ou de
radiothérapie sont privés de ces cellules mémoires détruites par ces traitements au
même titre que les cellules cancéreuses. Ces patients deviennent vulnérables aux
infections et leur survie dépend de la régénération rapide de leur système
hématopoïétique. Notre équipe a déjà mis au point une méthode pour préparer de
grandes quantités des cellules mémoires capables de sécréter des IgG et des IgA.
Les présents travaux visent à générer des plasmocytes fonctionnels et capables
de survivre à long terme in vitro.
La stratégie expérimentale visait à établir des conditions permettant de se
rapprocher de l’environnement de la moelle osseuse. Dans un premier temps,
nous avons étudié les paramètres permettant la différenciation des lymphocytes B
mémoires en plasmocytes. Étant donné l’importance du potentiel redox dans
l’environnement de la moelle osseuse, nous avons d’abord tenté d’en contrôler
l’impact avec un antioxydant, le N-acétyle cystéine (NAC). Nos résultats ont
démontré que le NAC avait un effet significatif et diminuait la phosphorylation de la
protéine STAT3 en raison d’une inhibition des kinases JAK2 et JAK3.
Étonnamment, cet antioxydant retardait la différenciation de nos lymphocytes B qui

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étaient stimulés avec une forte interaction CD40-CD154. Par la suite, la
comparaison des interactions CD40-CD154 et CD27-CD70 a permis de conclure
qu’il était essentiel de réduire à son minimum l’interaction CD40-CD154 et qu’il
fallait ajouter les cytokines IL-6 et IL-10. Les cellules CD31+CD38+CD138+
générées présentaient un phénotype similaire à celui des plasmocytes de la moelle
osseuse. Malheureusement la fréquence de ces cellules était faible et leur viabilité
insuffisante. Afin d’augmenter la survie de ces cellules le dernier volet de nos
travaux visait à se rapprocher des niches de la moelle osseuse. Notre but a été
atteint en ajoutant des cellules mésenchymateuses issues de la moelle osseuse en
présence de 8% de dioxygène (O2). Les cellules CD31+CD38+CD138+ générées
ont une excellente viabilité et représentent plus de 50% des cellules totales en
culture. De plus, le modèle de culture est maintenant établi dans un milieu exempt
de sérum et de protéines animales. Dans l’ensemble, nos résultats permettent de
proposer la production ex vivo de plasmocytes autologues avec une perspective
thérapeutique pour réduire les risques d’infections des patients devenues
immunodéficients, suite à un traitement de radiothérapie ou de chimiothérapie.

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Abstract
In Humans, IgG+- and IgA+ memory B lymphocytes are key cells for the
maintenance of humoral immunity. Memory B lymphocytes are long-lived cells
maintained as a memory repertoire throughout our lives. Memory B lymphocytes
can establish an efficient and rapid defense against previously encountered
infections. These cells rapidly differentiate into short-lived plasma cells secreting
high levels of antibodies. Their counterpart, the long-lived plasma cells are the
memory populations present in the bone marrow microenvironment. The long-lived
plasma cells release protective antibodies into the peripheral blood, maintaining a
permanent immune protection. Plasma cells can remain active for years or even for
the entire life of an individual. Conversely, patients treated for cancer receive
massive doses of chemotherapy or radiotherapy, which are detrimental for immune
memory cells as well as cancerous cells. Those patients become highly vulnerable
to infectious diseases and their survival depends on the regeneration of their
hematopoietic system. Our research group has established an in vitro model
enabling to prepare large quantities of IgG and IgA-secreting memory B
lymphocytes. The present study aims to further investigate in vitro conditions to
generate plasma cells with high survival capacity and able to secrete antibodies.
Our experimental strategy intends to establish culture conditions similar to the
bone marrow environment. The first step was to study parameters involved into
differentiation of memory B lymphocytes into plasma cells. The importance of the
redox balance in the bone marrow environment led us to measure the impact of N-
acetyl cysteine (NAC), an antioxidant. Our results showed that NAC decreased
STAT3 activation by inhibiting the phosphorylation of two kinases namely JAK2
and JAK3. Surprisingly, the addition of NAC had a negative effect on the
differentiation of memory B lymphocytes in our culture conditions using a high level
of CD40 stimulation. By comparing the levels of CD40-CD154 and CD27-CD70
interactions, we then confirmed that a low level of CD40-CD154 interaction was