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Effets des antagonistes du récepteur de la progestérone
dans des modèles de cancer mammaire humain
N .ESBER1,2, F. LE BILLAN1, C.CHERBONNIER3a, H .LOOSFELT1 ,M. RESCHE-RIGON2,
M.LOMBES1 et N.CHABBERT-BUFFET3b
1
INSERM U693 Faculté de Médecine Paris Sud , le Kremlin Bicêtre ; 2 HRA PHARMA, Paris, 3aAssistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital Tenon,
3aService d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, 3bUnité Obstétrique et Gynécologie, 4 Rue de la Chine, 75020 Paris, France
Résumé
Introduction
o La progestérone (P4) agit via son récepteur (PR). Il existe deux isoformes PRA et PRB
qui sont ont une expression équimolaire dans le tissu mammaire.
Le rôle des progestatifs et du récepteur de la progestérone (PR) dans la carcinogénèse
mammaire a été maintenant établi. Le PR est exprimé sous deux isoformes PRA et PRB dont
leur expression est équimolaire et leur activité transcriptionnelle des gènes cibles diffère. La
surexpression de PRA est associée à un pronostic défavorable du cancer mammaire et
observée chez les femmes à haut risque génétique de cancer du sein (Hagan, BMC Med,
2014). L’objectif est d’évaluer les effets de l’anti-progestatif l’ulipristal acétate (UPA) sur la
tumorigenèse mammaire dans deux modèles d’études complémentaires. In vitro, dans la
lignée cancéreuse mammaire bi-inductible (MDA-iPRAB) (Khan, PLoS One, 2012), nous
avons démontré que l’UPA inhibe la prolifération cellulaire induite par la progestérone en
présence de PRA. Nous avons étudié l’expression de certains gènes clés de la tumorigenèse
mammaire, cibles de PRA et corrélé la prolifération à l’expression au niveau messager et
protéique du facteur anti-apoptotique BCL2L1. L’activation transcriptionnelle, dépendante de
la progestérone et inhibée par l’UPA, s’accompagne d’un recrutement spécifique et sélectif
de PRA sur des séquences régulatrices du gène BCL2L1, comme le démontrent les
expériences de ChIP. In vivo, dans un modèle murin de xénogreffe de tumeur mammaire
humaine, nous avons évalué les effets de l’UPA en quantifiant la croissance tumorale, les
index mitotiques et nécrotiques, et l’expression de gènes de la tumorigenèse. L’ensemble de
nos résultats démontrent une action anti-proliférative et apoptotique de l’UPA ce qui suggère
un rôle potentiel dans la prise en charge du cancer du sein
o Une surexpression de PRA est souvent observée dans le cancer du sein, associée à un
mauvais pronostic et une résistance au tamoxifène.
o Ces deux isoformes régulent, de façon différentielle et tissu-spécifique, l’expression de
nombreux gènes clés impliqués dans la tumorigenèse (BRCA1/2, WNTs, .…).
o Les progestatifs pourraient favoriser sur la carcinogénèse mammaire (études WHI,
MWS).
UPA, VA2914
F 17
F
3
Brevet-Européen INSERM-CNRS-UPS, EP
N°10305484.7 7 mai 2010, international May 9 2011
o L’UPA (ulipristal acétate, VA2914): SPRM (modulateur sélectif de PR): contraception
d’urgence, traitement des fibromes utérins), antagoniste puissant de PR mais faible
activité anti-glucocorticoïde.
o Evaluer le pouvoir antiprolifératif de deux antagonistes de PR: UPA et APR19
d’action
mécanisme
Me
11
Objectifs
o Caractériser leur
complémentaires
APR19
dans
deux
modèles
o Une nouvelle classe d’antagonistes hautement sélectifs de PR (APRn) a été synthétisé
et sont potentiellement utilisables en thérapeutique (Khan et coll., Mol. Endocrinol.,
2013). Ils sont qualifiés d’antagonistes passifs.
expérimentaux
1. Modèle in vitro: lignée mammaire humaine bi-inductible (MDA-iPRAB)
(Khan et al., PloS One, 2012)
2. Modèle in vivo de xénogreffe de tumeurs
mammaires dérivées d’une patiente
2. Modèle préclinique: xénogreffes de tumeurs humaines mammaires dans des souris
nude (Marangonni et al., Current Opinion in Oncology, 2014).
Résultats
a. Xénogreffes de carcinome canalaire invasif humain chez des souris nude
1. Modèles in vitro: lignée MDA-iPRAB
Traitement (42 jours)
Greffe
Caractérisation des
tumeurs
Antagonistes de PR
a. La lignée MDA-iPRAB
HBCx
b. Prolifération tumorale
œstrogéno-dépendante
(a)
0.5
RSL1 Dox P4 -
+
+
-
Clone 250
+
-
+
iPR-
+
+
+
-
iPR A
+
+
(MDA-iPRA)
2
+
+
-
iPRB
P4
+
+
+
**
**
**
**
iPRAB
1
**
UPA
Control
E2
1500
1000
100
*
-
+
+ +
- - +
- + +
- +
+ +
+ +
- +
1.0
60
0.5
40
0.0
0
10 Control
0
P4
20
UPA 40
30
iPR-
iPR A
iPRB
iPRAB
80
APR19
0
10
Days
Fig. 2
d. Analyse du marqueur de la prolifération cellulaire Ki67
UPA+P4
Clone 250
*
1.5
Days
+
+
120
2.0
500
(a)
Tumor volume
(b)
2.5
T/C (%)
ns
0.5
RSL1 Dox P4 -
V
1.5
1
o P4 stimule la prolifération cellulaire dans la
lignée MDA-iPRA
**
et l’inhibe
dans la lignée MDA-iPRB
**
2.5
ns
Tumor weight
(a)
l
ns
c. Les antagonistes de PR réduisent
la croissance tumorale
tr
o
Fig. S1
Tubulin
55 KDa
2000
ns
o Evaluation de l’expression
de gènes clés du cancer mammaire
on
1
ns
PRA
94 KDa
19
+
+
Tumor Volume (mm3)
Fold induction at day 5
ns
Fold induction
Fold induction at day 5
**
PRB
3
19
21
22 34
Expression
de PR
a. Effets
isoforme-spécifique
de la progestérone sur la prolifération
cellulaire de la lignée
1.5
RSL1
+
+
Dox
+
+
**
MDA-iPRA/B
1.5
morphologiques et histologiques
PR
+
iPRAB
A
+
-
34
PA
-
22
U
RSL1
Dox
21
114 KDa
a-Tubulin
55 KDa
a-Tubulin
55 KDa
PRA
19
C
PRA
PRB
3
Tumor weight (g)
(at sacrifice)
(Khan
et al., PLoS One, 2012)
94 KDa
La tumeur HBCx-34
Carcinome canalaire
invasif: (RE+, RP+:
PRA<PRB)
P4
o MDA-MB-231 (ER-, PR-), métastase d’un cancer mammaire humain
Lignée bi-inductible exprimant les isoformes de
114 KDa
PRA et / ou PRB (Systèmes Rheoswitch et T-Rex)
94 KDa
(RSL1 et / ou Doxycycline)
PRB
114 KDa
(b)
Ki67 marker
60
b. Action inhibitrice de l’UPA sur la prolifération cellulaire de la lignée MDA-iPRA/B
Control
UPA
0.5
**
6
Days
Days
+58kb
0.0Intron
-
+
2/3
1/3
P4 (1 nM)
Exon
-
-
-
UPA (1 µM)
+
+
+
3/3
+
x
- PRE
-
+
+
3’
+
1.0
0.5
xxx
+
+
+
+
P4 (1 nM)
-
+
-
+
UPA (1 µM)
-
-
+
+
**
o L’expression protéique du facteur anti-apoptotique
APR19
BCL2-L1 est diminuée dans le groupe traité par UPA
0
UPA
19
U
A
19
A
PR
PA
C
20
0.0
PA
l
tr
o
f. Variation de l’expression de BCL2-L1
RSL1
PR
19
PR
A
19
PR
A
40
1.0
*
0.5
0.0
C
0.0
19
1.5
0.5
PR
o P4(b) stimule l’expression de
**
BCL2-L1 (transcrit
et protéine)
o UPA inhibe son expression
** avec
seul ou en association
**
P4
xx
**
A
0.5
**
BCL2-L1
PA
***
1.5
U
BCL2-L1
x
o UPA: Augmentation de
l’expression de PR
o APR19:60Diminution de l’expression de PR
P4
**
xx
80
l
36 KDa
26 KDa
P4
tr
o
GAPDH
Days
Control
1.0
on
94 KDa
19
PRA
(b)
PR
6
APR19
A
5
PA
4
U
Days
1.0
3
P4
2
UPA
**
PA
UPA+P4
l
1
RSL1
5’
U PA
C
Fold Change
(mRNA BCL2-L1/18s RNA)
+1
P4
(to GAPDH)
(a)
V
**
0
Fig. S2
(a)
**
0
0
xxx
0.0
***
l
xxx
20
1
tr
o
xxx
1.5
xxx
xxx
(to GAPDH)
BCL2-L1
xx
1.5
(b)
UPA+P4
xxx
BCL2-L1expression
(a)
0.2
Fig. 3
UPA
0.4
40
P4
P4
x
60
0
2
U
*
**
1
xx
80
10
***
3
P4
Control
20
l
36 KDa
26 KDa
V
BCL2-L1expression
Absorbance
(490 nm)
0.6
xxx
xxx
0.8
2
xxx
(b)
U
4
GAPDH BCL2-L1
c. Régulation de l’expression du facteur anti-apoptotique
BCL -L
par P4 et UPA dans la lignée MDA-iPRA
*
*
*
PR
tr
o
Days
(a)
94 KDa
PRA
PR (%)
6
0
on
5
l
Days
4
tr
o
3
PR (%)
(b)
2
Fig. S2
(MDA-iPRB)
1.0
1
on
0
Days
Days
***
C
0.0
6
1
30
C
5
APR19
tr
o
4
Control
on
3
e. Effets de UPA et APR19 sur l’expression de PR
*
on
2
Necrosis
40
C
1
(c)
Fold Change
(mRNA PR/18s RNA)
UPA+P4
2
19
0.4
0.2
0
PA
UPA
1
0.5
l
P4
***
3
PR
UPA+P4
*
**
P4
**
**
UPA
V
A
**
**
*
*
*
o Diminution de l’expression de
Ki67 chez le groupe de traitement
PR
par UPA xxx xxx
xxx
0
U
P4
1.5
0.6
4
Necrotic area (%)
Absorbance
(490 nm)
V
(a)
20
nt
ro
0.8
2
o UPA inhibe la prolifération
cellulaire de la lignée MDA-iPRA/B:
- Inhibition de l’effet de P4 lors de
l’induction de PRA
- Synergie avec P4 dans la lignée
(a)
V
P4
U PA
UPA+P4
MDA-iPRB
Co
(b)
**
Fold induction
(MDA-iPRB)
1.0
Fold Change
(mRNA PR/18s RNA)
(a)
Ki67 (%)
(MDA-iPRA)
2.5
40
on
5
BCL2-L1 expression
(to GAPDH)
4
P4
3
PA
2
U
1
P4
0
P4
Fig. S1
SRC1
d. Recrutement de PR
PRA
surBCLle-L gène BCL2-L1 par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
PR
H H Pol II
2
1
xxx
(b)
PRA recruitment
(Fold induction above vehicle)
xxx
50
o P4 stimule le recrutement de PRA sur
le gène BCL2-L1
***
40
30
20
***
10
***
o Recrutement associé de l’ARN
polymérase II et du coactivateur SRC1
0
RSL1
P4
UPA
+
IgG
+
-
+
+
-
+
+
Anti-PR
+
+
+
o UPA inhibe le recrutement de PRA
Conclusions
o La prolifération de la lignée cellulaire MDA-iPRAB est P4-dépendante et PRA-spécifique.
o UPA exerce une action antiproliferative et pro-apoptotique.
o UPA réduit la croissance tumorale, diminue Ki67, inhibe BCL2-L1.
o UPA Thérapie adjuvante potentielle du cancer du sein ciblant les progestatifs et PR.
o APRn investigation future.