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Effets des antagonistes du récepteur de la progestérone
dans des modèles de cancer mammaire humain
N .ESBER1,2, F. LE BILLAN1, C.CHERBONNIER3a, H .LOOSFELT1 ,M. RESCHE-RIGON2,
M.LOMBES1 et N.CHABBERT-BUFFET3b
1 INSERM U693 Faculté de Médecine Paris Sud , le Kremlin Bicêtre ; 2 HRA PHARMA, Paris, 3aAssistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital Tenon,
3aService d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, 3bUnité Obstétrique et Gynécologie, 4 Rue de la Chine, 75020 Paris, France
Résumé
Le rôle des progestatifs et du récepteur de la progestérone (PR) dans la carcinogénèse
mammaire a été maintenant établi. Le PR est exprimé sous deux isoformes PRA et PRB dont
leur expression est équimolaire et leur activité transcriptionnelle des gènes cibles diffère. La
surexpression de PRA est associée à un pronostic défavorable du cancer mammaire et
observée chez les femmes à haut risque génétique de cancer du sein (Hagan, BMC Med,
2014). L’objectif est d’évaluer les effets de l’anti-progestatif l’ulipristal acétate (UPA) sur la
tumorigenèse mammaire dans deux modèles d’études complémentaires. In vitro, dans la
lignée cancéreuse mammaire bi-inductible (MDA-iPRAB) (Khan, PLoS One, 2012), nous
avons démontré que l’UPA inhibe la prolifération cellulaire induite par la progestérone en
présence de PRA. Nous avons étudié l’expression de certains gènes clés de la tumorigenèse
mammaire, cibles de PRA et corrélé la prolifération à l’expression au niveau messager et
protéique du facteur anti-apoptotique BCL2L1. L’activation transcriptionnelle, dépendante de
la progestérone et inhibée par l’UPA, s’accompagne d’un recrutement spécifique et sélectif
de PRA sur des séquences régulatrices du gène BCL2L1, comme le démontrent les
expériences de ChIP. In vivo, dans un modèle murin de xénogreffe de tumeur mammaire
humaine, nous avons évalué les effets de l’UPA en quantifiant la croissance tumorale, les
index mitotiques et nécrotiques, et l’expression de gènes de la tumorigenèse. L’ensemble de
nos résultats démontrent une action anti-proliférative et apoptotique de l’UPA ce qui suggère
un rôle potentiel dans la prise en charge du cancer du sein
Introduction
oLa progestérone (P4) agit via son récepteur (PR). Il existe deux isoformes PRA et PRB
qui sont ont une expression équimolaire dans le tissu mammaire.
oUne surexpression de PRA est souvent observée dans le cancer du sein, associée à un
mauvais pronostic et une résistance au tamoxifène.
oCes deux isoformes régulent, de façon différentielle et tissu-spécifique, l’expression de
nombreux gènes clés impliqués dans la tumorigenèse (BRCA1/2, WNTs, .…).
oLes progestatifs pourraient favoriser sur la carcinogénèse mammaire (études WHI,
MWS).
oL’UPA (ulipristal acétate, VA2914): SPRM (modulateur sélectif de PR): contraception
d’urgence, traitement des fibromes utérins), antagoniste puissant de PR mais faible
activité anti-glucocorticoïde.
o Une nouvelle classe d’antagonistes hautement sélectifs de PR (APRn) a été synthétisé
et sont potentiellement utilisables en thérapeutique (Khan et coll., Mol. Endocrinol.,
2013). Ils sont qualifiés d’antagonistes passifs.
UPA, VA2914
Brevet-Européen INSERM-CNRS-UPS, EP
N°10305484.7 7 mai 2010, international May 9 2011
F
F M e
3
17
11
Objectifs
oEvaluer le pouvoir antiprolifératif de deux antagonistes de PR: UPA et APR19
oCaractériser leur mécanisme d’action dans deux modèles expérimentaux
complémentaires
1. Modèle in vitro: lignée mammaire humaine bi-inductible (MDA-iPRAB)
(Khan et al., PloS One, 2012)
2. Modèle préclinique: xénogreffes de tumeurs humaines mammaires dans des souris
nude (Marangonni et al., Current Opinion in Oncology, 2014).
Résultats
114 KDa
94 KDa
55 KDa
PRB
PRA
a-Tubulin
RSL1
Dox - + - +
0.5
1
1.5
Foldinduction at day 5
**
ns
- +
RSL1
Dox
P4
Clone 250 iPR- iPRA iPRB iPRAB
--++
ns
**
ns
- + - + - + - + - +
- - - -
- - - -
+ + + +
+ +
- - + +
114 KDa
94 KDa
55 KDa
PRB
PRA
a-Tubulin
RSL1
Dox - + - +
0.5
1
1.5
Fold induction at day 5
**
ns
- +
RSL1
Dox
P4
Clone 250 iPR- iPRA iPRB iPRAB
--++
ns
**
ns
- + - + - + - + - +
- - - -
- - - -
+ + + +
+ +
- - + +
Fig. S1
Fig. S2
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3 4 5 6
V
P4
UPA
UPA+P4
**
** **
**
**
Foldinduction
Days
Days
(a)
(b)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6
V
P4
UPA
UPA+P4
(MDA-iPRB)
(MDA-iPRA)
*
*
*
*
**
Absorbance (490 nm)
Days
Days
Fig. S1
Fig. S2
0.5
1
1.5
2
2.5
0 1 2 3 4 5 6
V
P4
UPA
UPA+P4
**
** **
**
**
Foldinduction
Days
Days
(a)
(b)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 1 2 3 4 5 6
V
P4
UPA
UPA+P4
(MDA-iPRB)
(MDA-iPRA)
*
*
*
*
**
Absorbance (490 nm)
Days
Days
0.0
0.5
1.0
1.5
Fold Change
(mRNABCL2-L1/18s RNA)
(a)
**
** ***
xxxxxx
xxxxxx
xxx
BCL2-L1
0
10
20
30
40
50
PRA recruitment (Fold induction above vehicle)
***
*** ***
xxxxxx
IgG Anti-PR
RSL1
P4
UPA
+ + + + +
-
- -
-+ --
++ +
1/3 2/3 3/3
5’3’
Exon
Intron
HH
SRC1
BCL2-L1
PRE
Pol II
PR
(a)
(b)
PR
x
+58kb
+1
94 KDa
114 KDa PRA
PRB
3 19 21 22 34 iPRAB
HBCx
55 KDa Tubulin
3 19 21 22 34
1. Modèles in vitro: lignée MDA-iPRAB
2. Modèle in vivo de xénogreffe de tumeurs
mammaires dérivées d’une patiente
o MDA-MB-231 (ER-, PR-), métastase d’un cancer mammaire humain
Lignée bi-inductible exprimant les isoformes de
PRA et / ou PRB (Systèmes Rheoswitch et T-Rex)
(RSL1 et / ou Doxycycline)
(Khan et al., PLoS One, 2012)
0.0
0.5
1.0
1.5
*
BCL2-L1expression (to GAPDH)
BCL2-L1
Control
P4
UP
A
APR19
a. La lignée MDA-iPRAB
a. Effets isoforme-spécifique de la progestérone sur la prolifération cellulaire de la lignée
MDA-iPRA/B
b. Action inhibitrice de l’UPA sur la prolifération cellulaire de la lignée MDA-iPRA/B
oP4 stimule la prolifération cellulaire dans la
lignée MDA-iPRA
et l’inhibe dans la lignée MDA-iPRB
oUPA inhibe la prolifération
cellulaire de la lignée MDA-iPRA/B:
- Inhibition de l’effet de P4 lors de
l’induction de PRA
- Synergie avec P4 dans la lignée
MDA-iPRB
c. Régulation de l’expression du facteur anti-apoptotique BCL2-L1
par P4 et UPA dans la lignée MDA-iPRA
PRA
GAPDH
BCL2-L1
V P4 U PA UPA+P4
BCL2-L1expression
(to GAPDH)
**
** **
(a)
(b)
36 KDa
26 KDa
94 KDa
0.0
0.5
1.0
1.5 xx
xxx
PRA
GAPDH
BCL2-L1
V P4 U PA UPA+P4
BCL2-L1expression
(to GAPDH)
**
** **
(a)
(b)
36 KDa
26 KDa
94 KDa
0.0
0.5
1.0
1.5 xx
xxx
o P4 stimule l’expression de
BCL2-L1 (transcrit et protéine)
o UPA inhibe son expression
seul ou en association avec
P4
RSL1
-
+
+
+
+
P4 (1 nM)
-
-
+
-
+
UPA (1 µM)
-
-
-
+
+
RSL1
+
+
+
+
P4 (1 nM)
-
+
-
+
UPA (1 µM)
-
-
+
+
d. Recrutement de PRA sur le gène BCL2-L1 par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
o P4 stimule le recrutement de PRA sur
le gène BCL2-L1
o Recrutement associé de l’ARN
polymérase II et du coactivateur SRC1
o UPA inhibe le recrutement de PRA
a. Xénogreffes de carcinome canalaire invasif humain chez des souris nude
Caractérisation des
tumeurs
Traitement (42 jours)
La tumeur HBCx-34
Carcinome canalaire
invasif: (RE+, RP+:
PRA<PRB)
morphologiques et histologiques
o Evaluation de l’expression
de gènes clés du cancer mammaire
Antagonistes de PR
Greffe
Tumor Volume (mm3)
Days
0 10 20 30 40
0
500
1000
1500
2000Control
E2
Expression de PR
Control
UPA
APR19
Fig. 3
Control
Control
UPA
APR19
(a)
(b)
0
20
40
60
Ki67 (%)
P4
**
(c)
0
10
20
30
40 *
Necrotic area (%)
Control
P4
UP
A
APR19
Ki67 marker
Necrosis
Control
P4
U
P
A
APR19
o Diminution de l’expression de
Ki67 chez le groupe de traitement
par UPA
c. Les antagonistes de PR réduisent
la croissance tumorale
b. Prolifération tumorale
œstrogéno-dépendante
d. Analyse du marqueur de la prolifération cellulaire Ki67
e. Effets de UPA et APR19 sur l’expression de PR
0
1
2
3
4
Fold Change
(mRNA PR/18s RNA)
PR
***
***
xxx
xxx xxx
0
20
40
60
80
PR (%)
Control
P4
U
P
A
APR19
**
x
xx
Control P4
U
P
AAPR19
Control
P4
UPA
APR19
(a)
(b)
0
1
2
3
4
Fold Change
(mRNA PR/18s RNA)
PR
***
***
xxx
xxx xxx
0
20
40
60
80
PR (%)
Control
P4
U
P
A
APR19
**
x
xx
Control P4
U
P
AAPR19
Control
P4
UPA
APR19
(a)
(b)
oUPA: Augmentation de l’expression de PR
oAPR19: Diminution de l’expression de PR
f. Variation de l’expression de BCL2-L1
oL’expression protéique du facteur anti-apoptotique
BCL2-L1 est diminuée dans le groupe traité par UPA
Conclusions
oLa prolifération de la lignée cellulaire MDA-iPRAB est P4-dépendante et PRA-spécifique.
oUPA exerce une action antiproliferative et pro-apoptotique.
oUPA réduit la croissance tumorale, diminue Ki67, inhibe BCL2-L1.
oUPA Thérapie adjuvante potentielle du cancer du sein ciblant les progestatifs et PR.
oAPRn investigation future.
APR19
(a)
Tumor weight (g) (at sacrifice)
Control
P4
UPA
APR19
Fig. 2
0 10 20 30
40
60
80
100
120
T/C (%)
(b)
*
Control
P4
U
P
A
APR19
Tumor weight Tumor volume
Days
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*