PDF - Université Paul Sabatier

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Immunologie
Présentée et soutenue par Thibault SANTOLARIA
Le 26 janvier 2009
Titre : INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D'ORGANES SOLIDES PAR LES
LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+ CD25+ FOXP3+
JURY
Président
Pr Roland LIBLAU
Dr Maria Cristina CUTURI
Rapporteur
Pr Jean DAVOUST
Rapporteur
Pr Joost van MEERWIJK Directeur de Thèse
Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies
Unité de recherche : U563 Inserm
Directeur(s) de Thèse : Joost van Meerwijk
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REMERCIEMENTS
Aujourd’hui se tourne une page importante de ma vie, quatre années passées
à l’Inserm U563 et pourtant, quand je regarde en arrière, j’ai l’impression d’être
seulement arrivé hier. Cette page est émminamment importante puisque c’est elle
qui m’a vu, pour rester dans l’immunologique, me différencier de cellule immature
(étudiante) en cellule effectrice, apte à la dure loi de la sélection du travail… Même si
une telle transformation demande une intégration personnelle du message (« La
chimère hématopoïétique est à la réponse à toutes les questions » et autre « Les
Tregs vont sauver le monde »), elle ne saurait s’opérer sans une éducation et un
signal de survie de la part d’autres cellules spécialisées (la grande famille des Chefs,
et la famille tout court).
Dans mon cas, ma cellule présentatrice d’antigènes est certainement mon
directeur de thèse : Joost van Meerwijk. Merci à vous de m’avoir accepté au sein du
DEA d’immunologie, puisque c’est ainsi que cela s’appelait encore, et de m’avoir
associé à l’un des plus passionnants sujets qui soit : la tolérance aux autres. Merci
également de m’avoir tout au long de ces quatre années enseigné l’art délicat de la
chimère hématopoïétique, la passion des Tregs et le goût de former la génération
suivante. Je garderai en mémoire, de nos « interactions », les longues semaines,
pleines de doutes et de craintes, à patienter pour savoir si oui ou non, nos greffes de
coeur allaient survivre jusqu’à terme ; les mois à attendre que nos coupes
histologiques soient enfin prêtes ; les jours précédents l’envoi du papier à faire et
refaire, encore et encore, des photos avec Talal ; et votre détermination sans faille
pour défendre le papier devant l’Editorial Board de Nature Medicine. Peu y aurait cru,
vous oui ! Encore moins aurait réussit un tel pari, vous si ! Le jeu en valait la
chandelle… Merci encore pour ses intences émotions.
Si dans cette métaphore immunologique, Joost devait être la CPA, alors Paola
serait certainement la mTEC. Parfait complément dans cette étape de sélection, vous
avez su m’apporter la rigueur nécessaire à la réalisation d’un projet scientifique.
Merci pour votre disponibilité, les nombreux rapports de congrès que vous nous avez
fait (et les discussions qui s’ensuivaient) et votre enthousiasme au quotidien. Mon
seul regret sera que vous ne m’ayez que partiellement communiqué votre passion
pour la sélection thymique. Il faut dire que je partais avec un a priori assez fort vis-àvis de cette partie de l’immunologie.
Merci à Geneviève pour sa gentillesse et son aide précieuse dans le
phénotypage des nombreuses souris transgéniques utilisées au laboratoire.
Bien sûr, le thymocyte n’est pas seul dans l’immensité du thymus. De très
nombreux autres lymphocytes en devenir l’accompagnent dans cette longue
transformation. Sans eux, le pauvre thymocyte ne serait plus le même. Parmi eux, il y
a d’abord mes collègues de l’équipe Tolérance et Auto-immunité, à commencer par
2
REMERCIEMENTS
les anciens, qui par leur sagesse ont contribué à ma formation. Un grand merci donc
à toi, Olive, pour m’avoir appris les bases techniques du sujet et donné tous les
conseils dont j’avais besoin : de l’étude comparative entre les pansements Carrefour
et Hansaplast pour les greffes de peau, à la technique secrète de l’ACK ou les
chemins détournés pour traverser Toulouse en pleine heure de pointe pour rentrer
chez mes parents. Merci enfin, pour ta patience, devant mon style parfois si
particulièrement particulier (« Lors du dysfonctionnement d’un organe, celui-ci
n’assure plus sa fonction »). Ingrid, pendant les trois ans que je t’ai cottoyée, tu as
été un tel soleil, de par ta fougue, ta gentillesse, et ton caractère si trempé, qu’il est
difficile de t’oublier. Tantôt souriante, tantôt attendrissante quand tu parlais de Tristan
et parfois si effrayante quand tu t’enflammais contre quelqu’un, tes rires resonneront
encore longtemps contre les murs du labo. Mille mercis pour ce que tu es ! Surtout
ne change pas… Julie, tu es la seule à m’avoir accompagné tout au long de ces
quatre ans. D’abord intimidé par tes « Allo » si engageant, j’ai rapidement découvert
derrière le masque, une fille extrêmement attachante et toujours prête à aider. Nos
discussions, tant sur le Stade Toulousain que sur les derniers exploits d’un Ministre
appelé à devenir Président à la place du Président, me manqueront. Merci
également pour tes idées débordantes pour fêter le départ d’un des notres… idées
qui m’ont tour à tour, mis dans la peau de Mitch, Travolta ou Charlie et ses drôles de
dames. Enfin, comment oublier la petite Julie Ribot, mascotte de l’équipe et
ambassadrice des pauses cafés-clopes. Même dans les moments difficiles, tu m’as
toujours soutenu, écouté et je t’en remercie.
Place maintenant aux jeunes, à la relève du labo. Honneur à la première
arrivée : Céline ! C’est maintenant toi la doyenne du labo, le pillier sur lequel
compteront les futurs étudiants. Merci pour ton écoute, tes discussions souvent
enflammées et ton entrain quotidien. A Lise, je t’ai refilé le bébé et espère qu’il t’e
donnera autant de bonheur et de réussite qu’il m’en a apporté. Bon courage pour la
suite et profite bien de ces quelques années de thèse : elles ont une saveur toute
particulière. Clémence, nos chemins ne se sont malheureusement pas croisés très
longtemps mais cela m’a suffit pour comprendre qu’un peu à l’image d’Ingrid, tu allais
rapidement devenir la coqueluche de l’U563, grâce à ta sympathie et à ta bonne
humeur quotidienne. Mais, j’ai également découvert que, comme elle, tu n’étais pas
genre à te faire marcher sur les pieds. Entre toi, Lise et Céline, Joost a donc du souci
à se faire. Peut-être en fait, devrais-je lui souhaiter à lui « Bon Courage ». Enfin, il est
temps de boucler la boucle, celle-là même qui avait commencé quand Olive m’avait
cédé sa place comme seul coq de la basse-cour et qui se termine aujourd’hui
puisque je laisse Svet au milieu de ces filles. Cela peut faire peur de prime abord,
mais tu verras : on y prend goût très vite. En tout cas, courage pour la suite de ton
M2R !
3
REMERCIEMENTS
Je remercie également tous les membres de l’unité, les anciens comme les
nouveaux, pour avoir partagé avec moi tant de bons moments pendant ces 4
longues années : Florie, Camille, Sabina, Loïc, Nico, Yovan, Delphine, Lucile, Audrey
et Patrick de l’animalerie, Fatima, Dominique, notre super secrétaire, et Aline, notre
deuxième mère. Une mention spéciale à Nicolas, mon talentueux partenaire de
dance, à Sophie, la gentillesse incarnée, à Aurelie, la « people » de l’U563, à Julie
Tabiasco, la pile électrique toujours prête à aider, et Michaël, l’animateur de nos
repas de midi, qui, chacun dans son style, m’a beaucoup apporté.
Pour terminer, je remercie mes parents sans qui, je ne serais pas celui que je
suis aujourd’hui et qui m’ont toujours soutenu ; mes amis qui depuis déjà 13 ans pour
certains, me supportent et me permettent d’oublier les petits tracas de la vie. Enfin, si
je devais une dernière fois utilisée la comparaison avec l’immunologie, je dirais
qu’une cellule effectrice ne saurait exister sans sa contrepartie régulatrice, chacune
étant le versant opposé de l’autre, unies en un tout... N’est-ce pas la définition de
l’âme sœur ? Merci à toi Karine d’être ma cellule régulatrice, celle qui fait mon
bonheur et mes peines et qui, comme moi, a subit la parfois difficile sélection
thymique.
4
SOMMAIRE
Résumé……………………………………………………………………………………… 8
Liste des illustrations…………………………………………………………………… 10
Liste des abréviations…………………………………………………………………... 11
Introduction………………………………………………………………………………...12
1ère Partie : Transplantation…………………………………………………… 13
A. Historique
B. Limites non immunologiques
1) Le manque de donneur
2) La mort cérébrale
3) Ischémie et reperfusion
C. Limites immunologiques
1) Les alloantigènes
• Les antigènes majeurs d’histocompatibilité
• Les antigènes mineurs d’histocompatibilité
• Le système ABO
2) Les voies d’alloreconnaissance
• Voie d’alloreconnaissance directe
• Voie d’alloreconnaissance indirecte
• Voie d’alloreconnaissance semi-directe
3) Les mécanismes de rejet
• Le rejet hyperaigu
• Le rejet aigu
• Le rejet chronique
D. Protocole d’inhibition du rejet
1) Drogues immunosuppressives
• Inhibition de la prolifération
• Glucocorticoïdes
• Déplétion/modulation des lymphocytes
• Inhibition de la synthèse des cytokines
• Blocage de la migration des cellules activées
2) Nouvelles stratégies thérapeutiques
• Induction de chimérisme hématopoïétique
• Cellules dendritiques tolérogènes
• Blocage des co-récepteurs
5
SOMMAIRE
•
Blocage des molécules de co-stimulation
2ème Partie : Tolérance……………………………………………………………53
A. Tolérance centrale
1) La sélection positive
2) La sélection négative
B. Tolérance périphérique
1) La tolérance passive
• L’ignorance
• L’anergie
• La délétion
• La déviation phénotypique
2) La tolérance active
• Les cellules dendritiques tolérogènes
• Les lymphocytes NKT
• Les lymphocytes T CD8 régulateurs
• Les lymphocytes Tr1
3ème Partie : Les lymphocytes T régulateurs……………………………….67
A. Mise en évidence et caractérisation des Tregs
1) Mise en évidence des Tregs
2) Les premiers marqueurs
3) La découverte de Foxp3
4) Les nouveaux marqueurs
B. Origine, développement et homeostasie des Tregs
1) Origine thymique
2) Développement des Tregs
3) Homéostasie des Tregs
C. Mécanismes de suppression
1) Déprivation cytokines
2) CTLA-4
3) Cytotoxicité directe
4) Cytokines immunsuppressives
D. Fonctions physiologiques et pathologiques
1) Prévention de l’auto-immunité
6
SOMMAIRE
2) Modulation des réponses anti-infectieuses
3) Inhibition de la réponse anti-tumorale
4) Tolérance foeto-maternelle
E. Potentiel clinique des Tregs
1) Pathologies auto-immunes et immuno-inflammatoires
2) Maladie du greffon contre l’hôte
3) Aide à la thérapie génique
Résultats……………………………………………………………………………………91
1) Article
2) Resultats préliminaires
Discussions et perspectives…………………………………………………………..106
Annexes…………………………………………………………………………………...122
Références
bibliographiques…………………………………………………………………………126
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RESUME
Thibault Santolaria
INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D’ORGANES SOLIDES PAR LES
LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+FOXP3+
Directeur de Thèse : Joost van Meerwijk
Thèse soutenue à Toulouse, le 26 janvier 2009
La principale limite à la transplantation d’organe réside dans l’initiation d’une
forte réponse immune dirigée contre le greffon. Si l’utilisation de drogues
immunosuppressives a largement permis de contrôler l’apparition du rejet aigu, de
nombreux patients souffrent d’un rejet chronique qui conduit inévitablement à la
destruction de l’organe transplanté. L’induction d’une tolérance immunologique vis-àvis des antigènes du greffon pourrait permettre de s’affranchir du rejet ainsi que de la
nécessité d’un traitement à vie avec des drogues immunosuppressives. Une
tolérance similaire existe déjà à l’état physiologique vis-à-vis des antigènes du soi.
Elle est médiée en périphérie par une sous population lymphocytaire douée de
propriétés immunosuppressives : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+.
Lors de ce travail de thèse, j’ai pu montrer que, chez des souris irradiées à
des doses cliniquement applicables, l’injection de cellules régulatrices
CD4+CD25+Foxp3+ stimulées in vitro avec des alloantigens, induit une tolérance
durable et spécifique vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et, par la suite, de
cœur ou de peau. Les Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par la voie
directe d’alloreconnaissance inhibent uniquement le développement du rejet aigu, en
dépit de l’état de chimérisme induit. En revanche, des Tregs spécifiques pour les
antigènes présentés par les voies directe et indirecte de reconnaissance préviennent
l’apparition des phases de rejet aigu et chronique. Nos résultats démontrent ainsi le
fort potentiel des Tregs, activés de manière appropriée, pour de futures approches
de thérapie cellulaire, dans le but d’induire une tolérance durable aux greffes
allogéniques.
Mots clés : lymphocytes T régulateurs, transplantation, mécanismes d’action
Discipline : Immunologie
Equipe Tolerance et Autoimmunité
INSERM U563, Hôpital Purpan
31024 Toulouse cedex 3
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ABSTRACT
Thibault Santolaria
INDUCTION OF TOLERANCE TO SOLID ALLOGRAFTS BY REGULATORY T CELLS
CD4+CD25+FOXP3+
Thesis supervisor : Joost van Meerwijk
Toulouse, Purpan Hospital, January 26th 2009
A major challenge in transplantation medicine is controlling the very strong
immune responses to foreign antigens that are responsible for graft rejection.
Although immunosuppressive drugs efficiently inhibit acute graft rejection, a
substantial proportion of patients suffer chronic rejection that ultimately leads to
functional loss of the graft. Induction of immunological tolerance to transplants would
avoid rejection and the need for lifelong treatment with immunosuppressive drugs.
Tolerance to self-antigens is ensured naturally by several mechanisms ; one major
mechanism depends on the activity of regulatory T lymphocytes.
We showed that in mice treated with clinically acceptable levels of irradiation,
regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells stimulated in vitro with alloantigens induced
long-term tolerance to bone marrow and subsequent skin and cardiac allografts.
Regulatory T cells specific for directly presented donor antigens prevented only acute
rejection, despite hematopoietic chimerism. By contrast, regulatory T cells specific for
both directly and indirectly presented alloantigens prevented both acute and chronic
rejection. Our findings demonstrate the potential of appropriately stimulated
regulatory T cells for future cell-based therapeutic approaches to induce lifelong
mmunological tolerance to allogeneic transplants.
Keywords : regulatory T cells, transplantation, mechanisms
Discipline : Immunology
Tolerance and Autoimmunity team
INSERM U563, Hôpital Purpan
31024 Toulouse cedex 3
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LISTE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1 : Deux modèles permettent d’expliquer la forte fréquence de cellules
alloréactives
Figure 2 : Les trois voies d’alloreconnaissance dans la transplantation
Figure 3 : La découverte des agents immunosuppresseurs en transplantation
Figure 4 : Les cibles moléculaires des différentes drogues immunosuppressives
Figure 5 : Démonstration par Billingham en 1953 de « l’acquisition active de
tolérance » vis-à-vis d’alloantigènes
Figure 6 : Génération de cellules dendritiques tolérogènes in vitro
Figure 7 : Les mécanismes de tolérance centrale
Figure 8 : Les mécanismes passifs de tolérance périphériques
Figure 9 : Les différents marqueurs des Tregs et leur découverte
Figure 10 : Les mécanismes effecteurs des Tregs
Figure 11 : Les fonctions physiologiques et pathologiques des Tregs
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LISTE DES ABREVIATIONS
AIRE : autoimmune regulator
APECED : autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy
B6 : C57BL/6
CD : cellule dendritique
CMH : complexe majeur d’Histocompatibilité
CPA : cellule présentatrice d’antigène
cTEC : cortical thymic epithelial cell
CTLA-4 : cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
DN : double négatif
DP : double positif
EAE : encéphalite autoimmune expérimentale
Foxp3 : forkhead box p3
GITR : glucocorticoid-induced TNF receptor family-related gene
IDO : indoléamine 2,3-dioxygénése
IFN : interferon
Ig : immunoglobuline
IL : interleukine
iNKT : invariant natural killer T cell
IPEX : immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy and X-linked
syndrome
LT : lymphocyte T
mTEC : medullary thymic epithelial cell
mTOR : mammalian target of rapamycin
NFκ
κB : nuclear factor-kappa B
NK : natural killer
NOD : non-obese diabetic
PD-L1 : program death ligand 1
RAG : recombination activation gene
Scid : severe combined immunodeficiency
SP : simple positif
STAT : signal transducer and activator of transcription
TCR : T cell receptor
TGF : transforming growth factor
Th : T helper
TNF : tumor necrosis factor
Treg : lymphocyte T régulateur
11
INTRODUCTION
12
TRANSPLANTATION
A. HISTORIQUE
« Simple curiosité opératoire aujourd'hui, la transplantation d'un organe pourra peutêtre un jour avoir un certain intérêt pratique » Alexis Carrel, Prix Nobel de Médecine
1912.
•
Les premières expériences
L’Histoire de la Transplantation est particulièrement riche en témoignages
écrits, remontants pour certains aussi loin que l’Empire Romain et rapportant
diverses tentatives de greffe de tissu. La Bible en est ainsi largement pourvoyeuse :
le Christ remet en place l'oreille du soldat mutilé par Saint Pierre, Saint Antoine de
Padoue procède à la réimplantation d'un pied, Saint Pierre fait de même avec les
Seins de Sainte Agathe, tranchés par un romain. Quoique sans aucun fondement
scientifique, ces récits illustrent parfaitement la fascination de l’Homme pour la
transplantation.
Au fil des âges, cette fascination va s’affirmer et, profitant des premières
dissections aux XVème et XVIème siècles, connaît un nouvel essor. Gaspare
Tagliacozzi, un des pères de la chirurgie plastique, utilise ainsi la peau du bras d’un
homme pour réparer son nez arraché par un chien, réalisant ainsi la première
autogreffe avérée. Un siècle plus tard, en 1668, Job van Meeneren décrit
minutieusement comment il a consolidé le crâne d’un soldat blessé en utilisant les os
d’un chien. Malheureusement, ces différentes tentatives n’ont pour fonction que de
soigner un cas isolé et ne font en rien progresser la discipline. Ce n’est qu’en 1744
avec les débuts des expériences de greffes chez l’animal, réalisées par Abraham
Trembley que la transplantation, jusqu’alors simple curiosité chirurgicale, passe par
une démarche scientifique. Grâce à elles, de nouvelles techniques sont découvertes
et permettent à Berger de les appliquer en retour chez l’Homme lors d’autogreffes de
peau. Enfin, en 1869, Jacques-Louis Reverdin s’illustre à son tour en réalisant la
première allogreffe de peau et donne ainsi son nom à une procédure chirurgicale.
•
Amélioration des techniques
Néanmoins, si les tentatives de greffes d’organes, autres que la peau, sur des
animaux se multiplient, leurs résultats ne permettent toujours pas d’envisager de les
étendre à l’homme. Une des difficultés majeures concerne en effet l’incapacité des
chirurgiens de l’époque à suturer de façon durable les vaisseaux sanguins des
13
organes transplantés à ceux des receveurs. Il faut attendre 1906 pour que Mathieu
Jaloubay, un médecin lyonnais spécialisé en chirurgie vasculaire, mette au point une
telle technique. Il l'applique dès lors à la transplantation, en greffant un rein de porc
au pli du coude d’une femme atteinte d'insuffisance. Pourtant, cela ne suffit pas à
empêcher le rejet rapide de l’organe. Ce n’est finalement qu’après la mise au point
des techniques de suture vasculaire (1), qui vaudront le Prix Nobel de Médecine en
1912 à Alexis Carrel, que la transplantation d’organe entre enfin dans l’ère moderne.
•
Découvertes des antigènes HLA
Pourtant, si de part le monde, de nombreux investigateurs parviennent à
reproduire et à simplifier l’allotransplantation des deux reins réussie par le Docteur
Carrel, aucune avancée majeure ne parvient à prolonger la survie des organes
greffés. Il devient donc rapidement évident que d’autres phénomènes entrent en jeu
et sont responsables des échecs systématiques des différentes tentatives de
transplantation. En 1933, le Russe Serguey Voronoy est le premier à proposer une
autre cause que l’imperfection des techniques chirurgicales : le rejet est un
événement immunologique. Pour le prouver, il décide de réaliser la première
homotransplantation, en greffant un rein provenant d’un homme de 60 ans décédé
chez une jeune femme de 26 ans : il espère ainsi s’affranchir du rejet de greffe.
Quatre jours après l’intervention, la patiente décède mais l’idée de Voronoy va
révolutionner l’approche de la communauté scientifique.
S'ensuit une longue période de latence ; le contexte mondial n'est guère
propice aux recherches. Il faut attendre l'après-guerre pour que les travaux
reprennent. En 1952, l’équipe de Jean Hamburger réalise une avancée sans
précédent : un jeune patient, Marius Renard, reçoit dans l’urgence le rein de sa
mère. Contre toute attente, le patient survit 21 jours (2). Deux ans plus tard, la totale
réussite d’une transplantation rénale entre deux jumeaux identiques, sous la
direction de Merrill et Murray à Boston (3), vient corroborer ces résultats. Le rôle de
certains facteurs génétiques est alors supposé. En 1958, les travaux de Jean
Dausset et de son équipe mettent à jour l’existence d’une « empreinte génétique »
sous formes de marqueurs cellulaires, qui, à l’image des empreintes digitales, sont
propres à chaque individu. Il s’agit des groupes d’antigènes HLA (« Human
Leucocyte Antigen »). Quelques années plus tôt, leurs homologues murins (système
H-2) avaient déjà été mis en évidence par Peter Gorer et George Snell. Toutefois, si
ces découvertes majeures jettent les bases de l’histocompatibilité, elles confirment
que l’application en clinique humaine de la transplantation ne sera possible que si la
composante immunologique est contournée.
14
•
L’immunosuppression
Les recherches se concentrent donc sur l'immunosuppression. Plusieurs
méthodes sont expérimentées, à commencer par l'irradiation totale. En 1959, des
équipes à Boston et Paris réussissent les premières greffes rénales entre faux
jumeaux. Des séances d'irradiation totale et un traitement par corticoïdes ont permis
d'affaiblir suffisamment le système immunitaire du patient pour qu'il n'y ait pas de
rejet. Parallèlement, à Richmond, l'Américain David Hume réalise la première greffe
avec immunosuppression à partir d'un rein de donneur décédé.
Les réussites s'enchaînent alors, principalement sur la greffe rénale. Après
avoir mis au point les premières techniques d’immunosuppression, ils cherchent
désormais à élargir la greffe à d’autres organes que le rein. Mais si ce dernier,
organe pair, permet la greffe à partir d’un donneur vivant et a une durée de vie plus
longue hors du corps, ce n’est pas le cas des autres organes. De plus, après
quelques expérimentations, les équipes médicales constatent rapidement qu’un
organe prélevé chez un donneur décédé après arrêt circulatoire, s’altère très
rapidement, limitant grandement son intérêt en transplantation.
•
La mort cérébrale
En 1959, l'école neurologique parisienne décrit l'état de mort cérébrale ouvrant
ainsi de nouveaux horizons en termes de prélèvement à cœur battant. Les travaux
de Mollaret et Goulon (4) sont publiés. C’est à eux que l’on doit l’expression de
« coma dépassé » qui sera remplacé plus tard par la notion plus juste de mort
cérébrale. Cependant la question se pose : « A quel moment, ces patients en mort
encéphalique peuvent-ils être considérés comme décédés? » La lecture du tracé des
encéphalogrammes apporte une réponse claire et ouvre désormais la voie au
prélèvement d’organes sur un cadavre : le rein en 1963 par les équipes de Guy
Alexandre en Belgique et Jean Hamburger en 1964 ; le foie en 1963 puis 1967 à
Denver par Thomas Starzl ; les poumons en 1963 sous la direction de James Hardy ;
le pancréas dès 1966. Si aucune de ces « premières » n’a été médiatisée à l’époque,
il en va différemment de la première greffe cardiaque. Bénéficiant des travaux de
Norman Shumway à San Francisco, le 3 décembre 1967, le professeur Christian
Barnard, au Cap, en Afrique du Sud, étonne le monde par la première greffe de
l'organe le plus symbolique : le cœur (5). Son second opéré, un blanc, survivra grâce
au cœur d’un métis. Dans l’Afrique du Sud des années 60, le symbole est fort.
15
•
La découverte de la Cyclosporine
Pourtant, malgré toutes ses « premières », la transplantation humaine connait
une période de transition durant les années 70 : les nombreuses contraintes
techniques, la lourdeur des traitements immunosuppresseurs et les échecs fréquents
ont eu raison de l’enthousiasme des précédentes décennies. Il faut attendre le 9
mars 1980 pour que l’utilisation d’une nouvelle molécule révolutionnaire, la
Cyclosporine, utilisée comme immunosuppresseur lors d’une greffe de foie par le Dr
Starzl, éveille de nouveaux espoirs (6). En quelques années, le taux de survie des
greffons à cinq ans passe de 40 à 75%. L’avenir de la transplantation est dès lors
assuré.
Depuis, d’autres traitements immunosuppresseurs, plus efficaces encore, ont
été découverts, permettant l’amélioration constante des chances de survie des
patients. Cependant, la transplantation souffre encore de nombreuses limites.
B. LIMITES NON IMMUNOLOGIQUES
Pendant plusieurs siècles, la recherche s’est donc focalisée sur l’amélioration
des techniques chirurgicales puis sur la compréhension de la physiopathologie des
mécanismes de rejet et sur les moyens à mettre en œuvre afin de les contrôler. Les
différentes avancées majeures ont ainsi occulté l’existence de nombreuses
restrictions, non immunologiques, qui limitent encore aujourd’hui le recours et/ou le
succès de cette solution thérapeutique. Elles sont notamment liées à l’appréhension
du don d’organe dans nos sociétés, à l’origine des greffons et aux altérations subies
par les organes avant même leur implantation chez le receveur.
1. LE MANQUE DE DONNEUR
En 2007, 13081 patients nécessitaient une greffe en France. Parmi eux, seuls
4666 organes étaient greffés. 360 d’entre eux trouvèrent la mort cette année-là
(Source EFG). Ainsi, le nombre de receveurs potentiels et de donneur n’ont cessé de
progressivement diverger, provoquant un allongement constant des listes d’attentes
(6348 patients en attente au 1er janvier 2002 ; 7307 en 2007). La raison en est le
sentiment ambivalent qui nait du don d’organe : plaisir d’assurer la vie d’autrui et
crainte pour le non-respect de sa propre mort. Au début des années 90, cette
dernière perception a pris le pas sur la générosité. Entre 1991 et 1996, le nombre de
greffes réalisées a chuté de 23% ! Ceci a conduit la communauté scientifique à
développer des méthodes adéquates de prélèvement afin d’optimaliser et
d’augmenter le nombre d’organes mis à disposition pour la transplantation. Depuis,
de nombreuses campagnes de sensibilisation ainsi qu’un cadre légal favorable ont
permis d’inverser cette tendance.
16
En effet, quand en 1952, Jean Hamburger réalise la première transplantation
rénale française à partir d’un donneur vivant, aucune législation ne prévoyait les
prélèvements in vivo. Les chirurgiens se trouvaient alors menacés par une autre loi
qui les faisait tomber sous le coup de « l’atteinte au corps de la personne ». De
même quand, en 1959, la mort cérébrale est décrite, elle n’a aucune valeur légale,
obligeant les médecins et scientifiques de l’époque à opérer dans l’illégalité jusqu’à
sa reconnaissance officielle en 1968 par une circulaire parue au journal officiel. Dès
lors, la « tradition » veut que l’avis de la famille soit consulté avant tout prélèvement
mais ceci entraine de très nombreux refus, en particulier quand il s’agit du cœur.
Pour remédier à cela, la Loi Caillavet est promulguée le 2 décembre 1976.
Elle y autorise le prélèvement d’organe à partir d’un donneur vivant ou en mort
cérébrale « confirmée » et instaure pour la première fois, le concept de
consentement présumé. Elle sera ensuite reprise par la loi n°94-654 du 29 juillet
1994 relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du corps humain, ellemême complétée par les Lois de Bioéthique du 6 aout 2004. Quatre principes
éthiques sont ainsi établis : le consentement, la gratuité du don, l’anonymat entre le
donneur et le receveur et l’interdiction de publicité en faveur d’une personne ou d’un
organisme déterminé. La notion de consentement présumé prévoit que « des
prélèvements peuvent être effectués à des fins thérapeutiques ou scientifiques sur le
cadavre d’une personne n’ayant pas fait connaître de son vivant son refus d’un tel
prélèvement ». Pour recueillir les éventuels désaccords, un Registre National des
Refus est créé en 1997 et est placé sous la responsabilité de l’Etablissement
Français des Greffes. Toutefois, la consultation de la famille est fortement
encouragée dans les cas où le défunt n’aurait pas clairement exprimé son opinion de
son vivant. La loi de 1994 interdit toute rémunération du don d’organes ou de tissus
qu’elle définit comme « un acte de générosité entièrement gratuit ». Elle affirme
également le principe de l’anonymat : l’identité du donneur ne peut être révélée à la
famille du défunt, et inversement afin d’éviter une relation délicate entre la famille du
donneur et celle du receveur, de faciliter le deuil de la famille du donneur ainsi que la
convalescence du malade vivant avec l’organe ou le tissus d’un autre. La famille du
donneur peut toutefois être informée des résultats des greffes par les équipes
médicales. Enfin, la publicité en faveur d’un don d’éléments ou de produits du corps
humain est interdite tandis que l’information du public est encouragée. La
sensibilisation de la population par des campagnes d’information a ainsi permis une
augmentation du nombre de donneurs pendant les années 2000. Pourtant, si
aujourd’hui 82% des français se disent favorables au don de leurs propres organes,
seuls 40% ont fait part de leur position à leurs proches…
2. LA MORT CEREBRALE
La mort fut traditionnellement définie par l'arrêt de toutes les fonctions
organiques et plus particulièrement de la respiration et de l'automatisme cardiaque.
17
Depuis l'avènement des méthodes médicales de réanimation permettant de faire
reprendre ces activités après leur suspension, ainsi que le maintien artificiel de la
ventilation et de la circulation sanguine par l'appareillage médical, une définition,
médicale et juridique, plus précise devint nécessaire.
Décrit dès 1959, le concept de « mort cérébrale » implique une destruction
totale du tronc cérébral et donc, à court terme, de l’organisme entier. Extrêmement
rare (2.000 décès sur 500.000 chaque année en France), cet état ne doit pas être
confondu avec certains comas profonds n’entrainant pas la mort et au cours duquel
le cerveau n’est que partiellement endommagé. Selon la Loi, le diagnostic ne peut
être réalisé que par deux médecins qualifiés, non impliqués dans une activité de
transplantation et indépendant du donneur et/ou du receveur. Il requiert un examen
clinique complet mettant en évidence trois critères indispensables à la déclaration de
mort cérébrale : l’absence de conscience, de reflexes du tronc cérébral et de
ventilation spontanée. En complément, la destruction totale et définitive du cerveau
doit être confirmée par deux encéphalogrammes nuls et aréactifs effectués à un
intervalle minimal de quatre heures ou par artériographie objectivant l'arrêt complet
de la circulation encéphalique.
Les activités cardiaque et respiratoire pouvant être maintenues artificiellement,
la mort encéphalique a permis aux médecins et scientifiques d’obtenir des greffons
d’excellente qualité. Cependant, malgré un cadre juridique favorable et de
nombreuses campagnes d’informations, la moitié des cas en France n’est pas
prélevée (dont 2/3 sont liés à un refus). De plus, il a été suggéré, dès les années 90,
que l’état de mort cérébrale pouvait avoir un impact sur la qualité des organes
périphériques. Ainsi, diverses données expérimentales et cliniques ont montré que la
fonctionnalité et la survie des organes prélevés chez des individus vivants sont
supérieures à celles observées avec des donneurs cadavériques (7, 8).
Une des explications vient de l’origine même du décès. En effet, la mort
cérébrale est généralement provoquée par un violent traumatisme, une hémorragie
ou une tumeur, provoquant ainsi une hypoxie et/ou une augmentation sévère de la
pression intracrânienne. En réponse, l’organisme diminue le débit et la fréquence
cardiaque. Le cerveau, sous-alimenté et sous-oxygéné, active alors des mécanismes
compensatoires. Cette réaction, appelée « reflexe de Cushing », se traduit par une
libération massive et systématique de catécholamines par la médullosurrénale (9) et
une sécrétion locale de noradrénaline et neuropeptide Y, par les terminaisons
nerveuses sympathiques intramyocardiques (10). Sous l’effet de ces médiateurs, la
fréquence et le débit cardiaque augmentent fortement. Cet emballement, conjugué
aux propriétés vasoconstrictrices de la noradrénaline et du Neuropeptide Y, aboutit à
une dérégulation de la balance entre apport et consommation en oxygène du cœur.
Celui-ci entre alors en situation d’ischémie et modifie en conséquence son
métabolisme en passant en anaérobie (11). La pression artérielle s’élève
inexorablement avant d’atteindre un plateau et de se stabiliser. La déplétion des
catécholamines et des substances vasoactives ainsi que la production d’espèces
actives d’oxygène (ROS) par les cellules tuées ou stressées (12, 13), entraine alors
la diminution de la résistance vasculaire systémique et l’hypotension. Le cœur
diminue sa force et sa fréquence de contraction à des valeurs proches de la normale.
18
L’effet délétère de cet emballement sur la qualité du tissu cardiaque a été
établi par différents groupes. Dans des cœurs de babouins, prélevés 12 heures
après la mort, ils ont observé des lésions au niveau des tissus conducteurs, des
cellules musculaires lisses des artères coronaires et des cardiomyocytes. Il a été
suggéré que les catécholamines pourraient jouer un rôle majeur dans cette
dégradation, notamment en induisant des spasmes microvasculaires (13, 14).
Le tissu cardiaque n’est cependant pas le seul à être altéré lors d’une mort
encéphalique. Les reins ou les poumons sont également affectés par la
vasoconstriction, l’ischémie et par une dérégulation de la balance hormonale. De
plus, l’équipe de Tilney a montré dans le cœur, les reins et le sang périphérique de
donneurs cadavériques, des niveaux anormalement élevés de médiateurs proinflammatoires (8, 15).
3. L’ISCHEMIE ET LA REPERFUSION
Une fois l’organe prélevé, il est maintenu stérile dans un environnement à
basse température, en présence d’un milieu isotonique, puis est transporté jusqu’au
receveur. Tout au long de cette étape pouvant durer jusqu’à plusieurs heures, les
tissus sont privés d’oxygène et de nutriment tandis que les déchets cellulaires ne
sont plus éliminés : c’est l’ischémie. Cette situation particulièrement stressante
provoque au niveau de l’organe une accumulation de métabolites toxiques (16) ainsi
que des altérations biochimiques au niveau cellulaire.
L’absence d’oxygène limite le métabolisme oxydatif et accentue la glycolyse
anaérobie. Ceci conduit à la production de ROS et d’acide urique, à l’accumulation
rapide d’acide lactique, qui diminue le pH intracellulaire, et donc à l’activation
d’enzymes lytiques. De plus, cette voie métabolique n’est que peu productrice
d’énergie, entraînant à court terme une diminution des stocks d’ATP et l’arrêt de
nombreuses fonctions cellulaires. Le dysfonctionnement de la pompe Na/K ATPase,
notamment, perturbe l’homéostasie des électrolytes (K, Ca, Fe) et ainsi exacerbe
l’activité des phospholipases et des protéases. Enfin, la fixation des métaux sur leur
protéine de transport (transferrine, ferritine) est également inhibée. L’augmentation
de la concentration intracellulaire en fer libre qui en résulte catalyse la génération de
radicaux oxygénés (17) qui permettront à leur tour la production d’autres espèces
actives d’oxygène telles que l’oxyde nitrique. L’équipe de Nori a ainsi mis en
évidence l’implication de cette molécule dans l’altération des organes greffés, en
montrant que l’inhibition in vivo de l’enzyme responsable de sa production (NO
synthase) protège les reins des effets néfastes de l’ischémie (18).
Une fois l’organe réimplanté, l’étape de reperfusion va permettre son
réchauffement, sa réoxygénation, un retour à un métabolisme aérobie et donc à la
production massive d’ATP. Cependant, des quantités importantes de ROS vont aussi
être produites (17, 19). La réaction entre l’anion superoxyde et le peroxyde
d’hydrogène va permettre la génération du radical hydroxyle. Cette molécule,
hautement réactive et cytotoxique, va induire la peroxydation des membranes
19
lipidiques (17). L’intensité du stress oxydatif va largement dépasser les mécanismes
de régulation et permettre une accumulation de ROS qui induiront la mort par
apoptose des cellules présentes dans l’environnement (20).
L’ischémie et la reperfusion de l’organe entrainent donc une destruction
tissulaire plus ou moins importante. Celle-ci, même limitée, permet le relargage de
nombreuses molécules toxiques et de facteurs de stress, à même d’entrainer un état
inflammatoire important.
Ainsi, des études réalisées sur le foie, le cerveau, le myocarde ou les reins ont
montré que l’expression d’ICAM1 et VCAM est augmentée à la surface des cellules
endothéliales. Ces deux molécules jouent un rôle crucial dans le recrutement des
leucocytes dans les tissus. Au moment de la transplantation, l’entrée des cellules du
système immunitaire du receveur au sein du greffon n’en sera que favorisée. De
plus, l’altération tissulaire liée à la production de ROS conduit à la production de
molécules chimioattractantes, telles l’IL-8 ou ELR-CXC, qui favorisent le recrutement
rapide et massif des neutrophiles qui entretiendront à leur tour le processus
inflammatoire. Enfin, les protéines de choc thermique, telles HSP60, libérées dans le
tissu lésé, pourraient aussi avoir un rôle majeur sur les fibroblastes et les cellules
musculaires lisses contenus dans la paroi des vaisseaux. En induisant leur
prolifération et leur sécrétion de matrice extracellulaire, ces molécules pourraient
notamment participer au développement de vasculopathies caractéristiques des
épisodes de rejet chronique.
Toutefois, grâce à la mise en lumière de ces mécanismes, de nombreuses
cibles thérapeutiques ont ainsi pu être identifiées et la recherche a permis
d’améliorer la qualité des liquides de conservation. Ainsi, de nombreux composés
actifs sont ajoutés afin d’inhiber l’hypertrophie cellulaire, de contrôler l’homéostasie
du calcium, de diminuer la génération des ROS et de fournir à l’organe des substrats
hautement énergétiques. Il a également été montré que le conditionnement du
receveur pouvait prévenir certaines complications. L’ajout de mannitol ou d’autres
molécules anti-oxydantes, permet ainsi de prévenir au maximum la destruction
cellulaire liée à la production des ROS. D’autres molécules visant à augmenter la
vasodilatation ou à réduire la peroxydation lipidique (inhibiteurs des canaux
calciques) sont aussi utilisées, notamment dans le cas d’allogreffes rénales. Enfin,
l’utilisation de traitements anti-inflammatoires puissants a été associée à une
augmentation de la survie et de la fonctionnalité des organes greffés.
C. LIMITES IMMUNOLOGIQUES
Les siècles précédents ont ainsi permis à la transplantation de progresser tant
du point de vue des techniques chirurgicales que de la compréhension des
mécanismes responsables de l’altération des organes avant la greffe. Pourtant,
malgré des progrès évidents, il a fallut attendre la fin des années 50 et l’utilisation de
20
protocoles immunosuppresseurs expérimentaux pour que les premières greffes entre
deux individus génétiquement différents fonctionnent. Par la suite, l’amélioration de
ces traitements n’a toutefois pas réussi à vaincre la dernière limite à cette stratégie
thérapeutique ambitieuse : l’activation du système immunitaire du receveur,
conduisant à l’élimination plus ou moins rapide des tissus greffés.
1. LES ALLOANTIGENES
De nombreuses molécules, exprimées par les cellules du greffon, sont
susceptibles de conduire à l’activation du système immunitaire du receveur : les
alloantigènes. Ceux-ci peuvent varier par leur distribution tissulaire, leur structure ou
leurs fonctions physiologiques. Toutefois, trois types d’antigènes sont
particulièrement impliqués : les antigènes majeurs d’histocompatibilité, les antigènes
mineurs d’histocompatibilité et le système antigénique ABO
•
Les antigènes majeurs d’Histocompatibilité
Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) constituent la
principale cible du système immunitaire lors du rejet de greffe. Mises en évidence
dès 1936 à la suite de nombreuses études à partir de souris congéniques, elles sont
codées par un ensemble de gênes situés sur le chromosome 6 chez l’homme et 17
chez la souris. Cette région comprend ainsi différents loci, classés en gènes de
classe I (HLA- A, B et C chez l’Homme ; H-2K, D et L chez la souris) et de classe II
(HLA-DP, DQ et DR chez l’Homme ; I-A et I-E chez la souris).
Les molécules de CMH de classe I sont exprimées de manière constitutive à la
surface de toutes les cellules nucléées. Ces glycoprotéines sont composées d’une
chaîne α polymorphe à trois domaines, associée de façon non covalente à la β2microglobuline. Leur fonction consiste à présenter à la surface des cellules des
fragments peptidiques dérivés de protéines endogènes. Ainsi en reflétant en
permanence une image du contenu intracellulaire, elles permettent au système
immunitaire de détecter des situations pathologiques, telles une infection virale ou les
processus de cancérisation. Une exception à cette définition est apportée par les
cellules dendritiques qui possèdent la capacité de présenter des peptides exogènes
dans le contexte du CMH de classe I, ceci afin de permettre l’activation des
lymphocytes T CD8+ vis-à-vis d’antigènes viraux non portés par la CPA : c’est la
présentation croisée (21).
21
22
Ces molécules associées à leur peptide peuvent être reconnues et permettre
l’activation des lymphocytes T CD8+ via leur TCR. Mais elles peuvent également
réguler l’activation des cellules NK. Ainsi, une expression anormale des molécules de
CMH de classe I, due par exemple à une infection virale ou à un stress important,
conduira à l’activation des cellules NK et in fine à la destruction de la cible.
Les molécules de CMH de classe II sont, elles, formées par l’assemblage de
deux chaines polymorphes α et β. Elles sont impliquées dans la présentation des
antigènes exogènes ou membranaires et permettent l’activation des lymphocytes T
CD4+. Leur expression est, contrairement aux molécules de CMH de classe I, bien
plus restreinte, limitée principalement aux cellules présentatrices d’antigènes
(cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B) et aux cellules épithéliales
thymiques. Toutefois, sous l’influence de certaines cytokines comme l’IFN-γ, elles
peuvent également être retrouvées à la surface des cellules endothéliales
vasculaires.
Ainsi, si les molécules de CMH de classe I et II diffèrent par leur profil
d’expression et leur structure, elles partagent une origine polygénique complexe,
sont hautement polymorphes et répondent à une expression co-dominante de leurs
gènes. Ceci leur permet ainsi d’augmenter les chances de survie de chaque individu
face aux agressions extérieures mais posent à contrario un problème majeur en
transplantation puisqu’elles réduisent fortement les probabilités d’histocompatibilité
entre donneur et receveur.
•
Les antigènes mineurs d’Histocompatibilité
Les antigènes mineurs d’histocompatibilité regroupent l’ensemble des
molécules, différentes des antigènes du CMH de classe I et II, susceptibles d’induire
l’activation de lymphocytes T allospécifiques et ainsi, d’amener au rejet d’une greffe.
Le plus souvent de nature peptidique, il a été montré qu’ils pouvaient provenir non
seulement de glycoprotéines membranaires, comme cela avait été initialement
suggéré, mais également de protéines intracellulaires, telles que des facteurs de
transcription ou la myosine. Ils trouvent leur origine dans les nombreuses variations
géniques propres à chaque espèce et se traduisent par des peptides différents
présentés aux cellules T par le biais des molécules de CMH (22, 23).
Ils peuvent être codés par des chromosomes autosomaux comme c’est le cas
pour la myosine ou la β2-microglobuline, par le chromosome Y ou l’ADN
mitochondrial (24). Les antigènes mâles HY constituent ainsi l’un des exemples
d’antigènes mineurs les mieux caractérisés. Ils n’ont une relevance que lorsqu’un
tissu mâle est greffé chez une femelle histocompatible. Les femelles ne possédant
pas le chromosome Y, leur système immunitaire voit les peptides, dérivés de gènes
codés par l’Y (Hya, Sry, Uty, Smcy, Ube1y) et présentés naturellement par le CMH,
comme étrangers (25). Néanmoins, cette immunogénicité des antigènes de mâles
23
n’est pas due à une simple présence/absence. En effet, tous les gènes, présents sur
le chromosome Y et susceptibles de coder pour un antigène mineur, possèdent leur
paralogue sur le chromosome X. Cependant, il a souvent des divergences
importantes dans les séquences des paralogues et ce sont ces nombreuses
différences qui sont vues par le système immunitaire femelle comme étranger (26).
Ces antigènes sont donc capable d’induire l’activation des lymphocytes T CD4 et
CD8 alloréactifs et ainsi d’entrainer le rejet d’un tissu greffé entre individu mâle et
femelle histocompatible (27). En revanche, ils ne déclenchent pas de réponse
humorale détectable. Ces différences mâle/femelle sont d’autant plus importantes
chez la souris, où les lignées consanguines ont permis d’en étudier longuement les
implications.
Chez la souris, environ 720 loci codent ainsi pour des antigènes mineurs
potentiels (28). Cependant, lorsque des greffes sont réalisées entre souris
partageant les mêmes haplotypes du CMH mais génétiquement différentes, par
exemple entre des souris de même haplotype, la réponse semble se limiter à un petit
nombre de peptides dits immunodominants, en dépit d’une multitude de différence
d’antigènes mineurs (29, 30). Des évidences suggèrent que ces peptides sont
associés aux molécules de CMH avec une affinité supérieure et que ces complexes
CMH/peptide sont exprimés à des niveaux élevés à la surface cellulaire. L’interaction
CMH-peptide-TCR n’en est qu’optimisée et les réponses à leur encontre sont alors
plus fortes.
•
Le système ABO
Ce système d’antigènes, découvert en 1900 par Karl Landsteiner, n’entre pas
dans la définition des antigènes mineurs, étant incapable d’activer les lymphocytes T.
Son importance ne doit toutefois pas être sous-estimée.
Les déterminants antigéniques du système ABO sont des oligosaccharides
présents à la surface de différents types cellulaires et notamment par les
érythrocytes et par l’endothélium vasculaire, interface importante entre le greffon et
l’hôte. Le gène « ABO », situé sur le chromosome 9 chez l’Homme, code pour une
glycotransférase de type A ou B, ces deux formes ne différant que par quatre
substitutions d’acides aminés. Dans le cas de l’allèle O, une délétion d’un acide
aminé dans l’exon 6 est à l’origine d’un codon stop et conduit à la synthèse d’une
protéine tronquée inactive (31, 32). Ces glycosylations différentielles modifient la
substance H et définissent ainsi les quatre groupes sanguins connus (A, B, AB, O).
Durant les premières années de leur vie, les individus immunocompétents du
groupe O produisent des anticorps contre les antigènes des groupes sanguins
manquants : anti-A et anti-B (33). Il a été supposé que ces anticorps préformés, en
majorité des IgM, sont produits par sensibilisation à des substances
environnementales comme la nourriture, des bactéries ou des virus. Ces anticorps
24
constituent une barrière immunologique très efficace contre la transfusion et la
transplantation d’organe entre individus de groupes sanguins différents. Ainsi, lors
d’une greffe d’organe solide d’un donneur de type A et/ou B chez un receveur de
type O, l’endothélium du greffon sera le premier, la cible des anticorps préformés
(34) et nouvellement synthétisés, entrainant un rejet hyperaigu. Cependant, depuis
de nombreuses années, afin de faire face à la raréfaction des organes disponibles,
de nombreuses équipes ont, avec succès, réalisé des transplantations rénales de
donneur ABO-incompatible en utilisant des protocoles visant à diminuer les anticorps
anti-donneur A/B chez le receveur (plasmaphérèse, élimination des cellules B, ex
vivo immunoadsorption) (35). Chez ces patients, la survie du greffon est alors
comparable à celle obtenue lors d’une greffe entre personne de même groupe
sanguin (36).
2. LES VOIES D’ALLORECONNAISSANCE
L’activation du système immunitaire du receveur à lieu au niveau des nœuds
lymphatiques drainants la greffe. Là, les lymphocytes T alloréactifs naïfs pourront
être activés selon deux voies principales d’activation.
•
Voie de reconnaissance directe
La voie de reconnaissance directe implique une interaction entre le TCR des
lymphocytes T et les molécules de CMH allogéniques intactes à la surface des CPAs
(Cellules dendritiques, cellules endothéliales, etc.) du donneur.
La mise en évidence de cette voie s’appuie sur différentes observations. Ainsi,
in vitro, une prolifération intense des lymphocytes T peut être observée lorsqu’ils sont
mis en contact avec des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs) irradiées. Cette
réponse rapide et forte correspond à celle observée in vivo lors du rejet aigu d’un
organe.
Diverses stratégies de déplétion des CPAs de l’organe greffé sont venues
conforter cette observation. Lafferty a ainsi montré que la survie d’une greffe
allogénique de thyroïde, dont les CPAs ont été éliminées avant transplantation, est
prolongée de façon significative par rapport à celle d’un greffon non manipulé (37).
De même, lors d’une greffe de moelle osseuse, la maladie du greffon contre l’hôte
(Graft versus Host Disease, GvHD) peut être prévenue par l’inactivation des CPAs
de l’hôte (38). Lechler, pour sa part, a observé, dans un modèle de rat, qu’en prétransplantant un rein semi-allogénique dans un hôte intermédiaire, sous traitement
immunosuppresseur, avant de le greffer à son hôte final quatre semaines plus tard,
le greffon était durablement accepté (>100 jours). Dans ces conditions, l’injection de
quelques milliers de cellules dendritiques du donneur chez le receveur final suffit à
25
restaurer l’immunogénicité de l’allogreffe, provoquant ainsi un rejet aigu (39).
Cependant, si dans ces mêmes expériences, les combinaisons sont changées et que
le greffon utilisé provient cette fois d’un hôte totalement allogénique, la greffe
« retransplantée » est inévitablement rejetée, avec cependant une cinétique plus
lente que si elle n’a pas été pré-transplantée chez un hôte intermédiaire. Ceci laissait
à penser qu’une autre voie de présentation des alloantigènes pouvait prendre le
relais.
Enfin, dans de nombreux modèles expérimentaux, ainsi qu’en clinique
humaine, il a été montré que plus l’histocompatibilité entre le receveur et le donneur
était importante, meilleures étaient les chances de survie du greffon. Dans le cas
d’une parfaite identité pour les molécules de CMH de classe II, une allogreffe de rein
peut même être acceptée à long terme (40).
La démonstration formelle que des cellules T, ne reconnaissant les
alloantigènes que directement, pouvaient induire à elles seules le rejet de greffe, n’a
été apportée que récemment par l’équipe de Gill. Ainsi, le transfert de lymphocytes T
CD4+ syngéniques B6 chez un hôte Rag1-/- entraine le rejet d’un cœur allogénique
BLAB/c exprimant les molécules de CMH de classe II mais pas le rejet d’un cœur
provenant de souris déficientes pour ces mêmes molécules. En outre, dans ces
mêmes combinaisons, l’expression des molécules de CMH II par l’hôte n’est pas
nécessaire au rejet. La voie de reconnaissance directe médiée par les lymphocytes T
CD4+ est ainsi nécessaire et suffisante pour induire le rejet de greffe (41).
L’existence d’un tel mécanisme direct de stimulation des lymphocytes T par
une molécule de CMH autre semble transgresser le dogme de la restriction du TCR
au CMH du soi. L’analyse structurale d’un TCR allogénique a indiqué que ce mode
de reconnaissance trouvait son origine dans la cross-réactivité de lymphocytes
spécifiques de complexe peptide/CMH du soi pour les molécules de CMH
allogéniques (42). Cette hypothèse est en accord avec des travaux plus anciens qui
avaient montré qu’une large proportion des lymphocytes T participant à l’alloréactivité
ont un phénotype mémoire (43).
La réponse immunitaire dépendante d’une activation par la voie directe a été décrite
comme particulièrement rapide et de grande amplitude. Ceci s’explique par la
fréquence élevée (environ 7%) des cellules T susceptibles de reconnaître des
molécules de CMH allogéniques, une fréquence 100 à 1000 fois plus grande que
celle estimée des précurseurs T spécifiques d’un antigène exogène (44). Diverses
hypothèses ont été proposées afin d’expliquer ce constat.
26
27
La première repose sur les travaux de Jerne dans les années 70. Il a ainsi été
suggéré que le répertoire de gènes qui codent pour le TCR a évolué en fonction de
sa capacité à conférer une réactivité avec les antigènes du CMH de l’espèce (45).
Cette hypothèse a été par la suite confirmée et démontrée par Zerrahn et al. en
1997. Lors d’expérience de maturation de thymocytes en absence de molécule de
CMH, ils ont en effet observé une alloréactivité similaire à des populations de
thymocytes ayant subis les différentes étapes de sélection thymique (46).
La deuxième propose que le ligand du TCR alloréactif est la molécule du CMH
elle-même, indépendamment du peptide présenté. Ainsi, à la surface des CPAs du
donneur, toutes les molécules de CMH allogéniques peuvent agir comme un ligand
pour le TCR, augmentant ainsi fortement l’avidité de l’interaction. La forte fréquence
de lymphocytes mobilisés lors d’une allogreffe serait donc liée au fait que même les
cellules qui expriment un TCR de faible affinité sont susceptibles de s’activer.
Enfin, la dernière hypothèse, à l’inverse de la précédente, propose que
chaque TCR est spécifique d’un complexe CMH/peptide bien défini. Ainsi, en
supposant qu’un peptide dérivé d’une protéine non polymorphe, mais présenté dans
le contexte du CMH allogénique, soit reconnu comme du non-soi, le fort pourcentage
de cellules T allospécifiques serait lié à l’existence d’un nombre immense de
complexes immunogènes à la surface des CPAs. Ce modèle, proposée par Polly
Matzinger, est appelée « modèle du complexe binaire simplifié » (47).
En réalité, il est supposé que ces deux derniers modèles représentent deux
cas extrêmes qui encadrent un large spectre de situations dans lesquelles le peptide
contribue, à différents degrés, à l’interaction entre le TCR et le ligand. Obst et al. ont
en effet pu montrer que le peptide a d’autan plus d’importance que les molécules de
CMH du donneur et du receveur sont proches. A l’inverse, plus les molécules du
CMH sont structurellement éloignées, plus l’interaction entre le TCR et son ligand
est à dominance CMH (48).
Enfin, la voie d’alloreconnaissance directe a essentiellement été associée aux
épisodes de rejet aigus. En effet, les cellules dendritiques allogéniques sont
présentes en nombre limité dans l’organe transplanté et sont incapables de se
renouveler. Ainsi, leur capacité à soutenir une activation continue du compartiment T
du receveur va décroitre avec le temps post-greffe. Ceci est en adéquation avec des
études cliniques qui ont montré que le nombre de cellules T activées par cette voie
diminue inexorablement, même en l’absence de rejet total du greffon (49, 50).
•
Voie de reconnaissance indirecte
Suite à l’inflammation crée par l’acte chirurgical, les cellules dendritiques du
receveur et leurs précurseurs hématopoïétiques sont attirés vers le greffon où ils vont
pouvoir acquérir des alloantigènes par l’internalisation de molécules de CMH
28
solubles, par la phagocytose de corps apoptotiques/nécrotiques ou par échange de
vésicules. Cette acquisition peut également avoir lieu directement au niveau des
nœuds lymphatiques drainant grâce notamment à la présence de nombreuses CPAs
du donneur à leur niveau.
Ces alloantigènes sont alors présentés par les molécules du CMH de classe II
endogènes présentés à la surface des CPAs du receveur. Les peptides présentés
dérivent de l’action protéolytique de différentes enzymes lysosomales à l’égard des
molécules du CMH allogéniques ou des antigènes mineurs d’histocompatibilité. La
fréquence des lymphocytes T alloréactifs s’activant par la voie indirecte de
présentation est extrêmement faible comparée à celle de la voie directe,
puisqu’équivalente à la fréquence des cellules T reconnaissant des antigènes
exogènes.
L’existence de cette voie d’alloreconnaissance a été démontrée au cours de
différentes études. Ainsi, Lechler, dans les mêmes expériences qui ont mises en
évidence la voie directe, a observé que la déplétion des cellules dendritiques
contenues dans le greffon permet de retarder, mais pas de totalement inhiber, le rejet
(39). De même, dans un modèle murin, une greffe allogénique de peau provenant
d’un donneur déficient pour les molécules de CMH de classe II peut être rejetée par
le système immunitaire d’un animal receveur CMH I-/- (51). Dans ce système, la
souris hôte n’a pas de cellules T CD8+ et ses cellules T CD4+ ne peuvent pas être
directement activées par les CPAs contenues dans le greffon puisqu’elles
n’expriment pas les antigènes de classe II. Enfin, Dalchau et al ont montré que des
rats préalablement injectés avec des molécules solubles et allogéniques de CMH I
ou II rejettent plus rapidement une allogreffe de peau que des animaux non
manipulés (52).
Si la portée de cette voie n’est que faible lors du rejet aigu, il semble qu’elle
soit la voie prédominante lors du rejet chronique. En effet, l’influence de la voie
directe diminue avec le temps, alors que la voie indirecte se maintient à des niveaux
élevés chez des patients présentant un rejet cardiaque chronique en comparaison à
des patients ayant acceptés le cœur transplanté (53).
•
Voie de reconnaissance semi-directe
Pendant très longtemps, les voies directes et indirectes ont été considérées
comme les seuls mécanismes de stimulation des cellules T allospécifiques du
receveur. Pourtant, de nombreuses observations laissaient à penser que d’autres
mécanismes étaient impliqués. Ainsi, il avait été décrit que des cellules T CD4+
activées par la voie indirecte étaient capables de délivrer une aide efficace aux
lymphocytes T CD8+ stimulés directement par les molécules allognéiques de CMH
de classe I (54).
29
Une nouvelle voie intermédiaire, qualifiée de « semi-directe » a récemment
été décrite par l’équipe de Robert Lechler (55, 56). Elle a pu mettre en évidence in
vitro que des cellules dendritiques pouvaient acquérir et présenter, par un
mécanisme actif, des molécules intactes de CMH de classe I et de classe II
présentes à la surface de cellules dendritiques ou endothéliales allogéniques. De
plus, elle a montré que ce transfert d’antigène se déroule également in vivo et que
les molécules de CMH ainsi captées sont capables d’activer par une voie directe, et
spécifique de l’antigène, des cellules T syngéniques. Cette voie permettrait ainsi
d’assurer, une fois les CPAs du donneur disparues, une activation continue des
lymphocytes T CD8+, obligé de reconnaître le CMH de classe I du donneur pour
présenter leurs fonctions cytotoxiques, et de recevoir une aide efficace des CD4+,
activés eux par la voix d’alloreconnaissance indirecte. Toutefois, l’importance relative
de ces mécanismes dans l’activation du répertoire alloréactif et son implication dans
le rejet de greffe ne sont pas actuellement connues.
3. LES MECANISMES DE REJET
Trois formes de rejet ont été initialement décrites. Elles se caractérisent par
leur cinétique plus ou moins précoce après la greffe, par les mécanismes
moléculaires et cellulaires mis en jeu et par les types de lésions constituées au
niveau du greffon.
•
Le rejet hyperaigu
Le rejet hyperaigu survient dans les heures qui suivent la reperfusion de
l’organe. Il est l’exemple le plus classique et le plus spectaculaire d’un rejet
dépendant des anticorps. Macroscopiquement, l’organe présente des signes
évidents de thrombose vasculaire, d’hémorragies et une infiltration légère de cellules
mononucléées.
Il est la conséquence de la présence d’alloanticorps préformés dans le sang
du patient suite à une transfusion, une greffe ou une grossesse. Ces anticorps sont
majoritairement dirigés contre les antigènes ABO ou les molécules du CMH présents
à la surface des cellules endothéliales du greffon. Leur fixation va entrainer
l’activation intense de la cascade du complément qui aboutit à la destruction des
cellules cibles par le complexe d’attaque membranaire ainsi qu’à la libération de
médiateurs inflammatoires comme l’IL-8, MCP-1 ou le facteur de Von Willebrand
(57). Les cellules de l’endothélium vont alors se rétracter, ce qui va augmenter la
perméabilité des vaisseaux et provoquer des hémorragies, et perdre l’expression de
molécules anticoagulantes ce qui conduira à une thrombose, à l’ischémie et à la mort
rapide de l’organe (58).
30
De nos jours, la recherche systématique d’alloanticorps présents chez le
receveur fait de ce type de rejet un évènement rare en transplantation clinique.
Cependant, le rejet hyperaigu constitue encore à l’heure actuelle une barrière
majeure en xénotransplantation (59).
•
Le Rejet Aigu
Le rejet aigu se développe chez l’homme durant le premier trimestre suivant la
transplantation. Jusqu’à la découverte des traitements immunosuppresseurs, il était
la principale cause du rejet de greffe. L’analyse histologique révèle une infiltration
interstitielle diffuse et massive composée de lymphocytes T, de macrophages et de
granulocytes (60). L’organisation anatomique de l’organe est perdue. Les tissus
nobles détruits sont progressivement remplacés par des tissus « de remplissage ».
Les mécanismes impliqués dans la destruction rapide de l’organe sont
nombreux et font intervenir un grand nombre de cellules immunitaires spécialisées.
La réponse humorale semble ainsi jouer un rôle non négligeable dans la mise en
place du rejet aigu (61, 62). Les lymphocytes T et les différents mécanismes
effecteurs qu’ils activent restent toutefois les principaux acteurs de cette forme de
rejet, aujourd’hui maitrisée.
Véritables chef d’orchestre du système immunitaire, les lymphocytes T CD4+
vont coordonner toute la réponse immunitaire contre le greffon. Leur rôle majeur a
été souligné par de nombreuses études. Lors d’une greffe allogénique de moelle
osseuse, leur élimination de la population cellulaire injectée suffit en effet à inhiber le
développement de la maladie du greffon contre l’hôte (63). De même, la déplétion de
ces cellules par traitement anticorps, ou par l’utilisation de receveurs CMH II-/-,
conduit à l’acceptation à long terme d’une allogreffe cardiaque (64). Cependant, il a
également été montré dans un modèle murin d’allogreffe de peau, qu’en leur
absence, une réponse efficace peut se développer et conduire à la destruction du
greffon (65).
Après leur activation, les lymphocytes T auxiliaires alloréactifs vont
préférentiellement se différencier en cellule Th1. Ce biais dans la polarisation de
l’alloréponse, lors du rejet aigu, a été rapporté à de nombreuses reprises (66, 67).
Toutefois, une minorité de travaux a observé une différenciation plutôt en faveur de
Th2. Il est à noter qu’à l’heure actuelle, le rôle des cellules Th17 reste obscur : seule
l’IL-17 a été reliée à la transplantation (68). Le déséquilibre Th1/Th2 pourrait être lié
au fait que l’avidité d’interaction entre les cellules T CD4+ et les cellules dendritiques
allogéniques est élevée, puisque le ligand du TCR est exprimé à une forte densité à
la surface des CPAs. Il a en effet été montré que des interactions de moyenne et de
forte intensité favorisent la différenciation en Th1 (69). De plus, le type de CPA
influence aussi fortement la balance Th1/Th2. Or les cellules dendritiques qui migrent
31
du greffon ont la capacité de produire de l’IL-12 qui est la cytokine clef de la
différenciation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices de type 1.
Une fois activé, les lymphocytes T CD4+ vont notamment fournir aux cellules B
l’aide nécessaire pour leur division et pour leur production d’anticorps. Chez la
souris, les Th1, via la sécrétion d’IFN-γ vont favoriser la production d’IgG2a,
immunoglobulines fixatrices du complément. Après fixation à la surface de la cellule
cible, notamment les cellules endothéliales du greffon, les anticorps peuvent
entraîner directement la mort de la cible par l’activation de la cascade du
complément. Parallèlement, après s’être associées à leurs récepteurs Fcγ présents,
entre autres, à la surface des cellules NK, les immunoglobulines peuvent tuer
indirectement leur cible via l’ADCC (Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity) en
activant les mécanismes cytolytiques de la cellule NK.
•
Les mécanismes cytotoxiques des cellules T
Les lymphocytes T CD4+ vont également favoriser la différenciation des
lymphocytes T CD8+ en cellules T cytotoxiques. Ces dernières vont s’accumuler, une
fois activées, dans le greffon (66) où elles vont pouvoir exercer leur activité
cytotoxique à l’encontre de leurs cellules cibles selon deux voies essentielles : la voie
perforine/granzyme de façon prédominante et la voie Fas/FasL.
L’utilisation de souris déficientes pour la perforine a permis de mieux définir
l’importance de cette voie dans le rejet aigu. Une étude a pu montrer que des souris
receveuses sauvages contrôles et des souris déficientes en perforine rejetaient un
cœur allogénique avec des cinétiques identiques. Cependant, le rejet de greffe était
retardé de façon significative quand la souris receveuse déficiente en perforine était
greffée avec un cœur ayant une disparité isolée au niveau des antigènes de CMH de
classe I (70). Cette observation peut être expliquée par le fait que les lymphocytes T
CD8 jouent un rôle dominant dans le rejet d’organe possédant une disparité isolée
au niveau des molécules de CMH de classe I, situation dans laquelle les
lymphocytes T CD4 ne peuvent pas être activés par la voie directe, alors que
d’autres mécanismes effecteurs sont mis en place dans des combinaisons
d’histocompatibilité classe I et classe II (71).
En effet, les lymphocytes T CD4 de type Th1 possèdent aussi une activité
cytotoxique et utilisent préférentiellement pour ce faire la voie Fas/FasL. Le rôle de
cette voie dans le rejet aigu a été observé dans des modèles où le rejet de greffe
solide est uniquement dépendant de l’activation des lymphocytes T CD4. Ceci
s’explique par le fait que, dans des combinaisons complètement allogéniques où les
cellules T CD4 et CD8 seront activées, l’absence de la voie Fas/FasL attribuable en
majorité aux cellules CD4, sera compensée par les mécanismes de lyse
perforine/granzymes dépendant des lymphocytes T CD8.
32
Tout d’abord, il a été montré que dans des modèles de greffe de peau H-2bm12
sur des receveuses H-2b, situation dans laquelle le donneur possède une disparité
isolée au niveau des molécules CMH II, le greffon de peau est rejeté par deux
mécanismes distincts, le premier impliquant les éosinophiles et le second mettant en
jeu des mécanismes dépendant d’interactions Fas/FasL. Chez la souris receveuse
déficiente en IL-5, cytokine cruciale au développement et à l’activation des
éosinophiles, il est en effet nécessaire et suffisant de neutraliser ces interactions
Fas/FasL, en greffant par exemple une peau provenant d’un animal Fas-/- pour que le
greffon soit durablement accepté (72).
•
Réaction d’hypersensibilité retardée
La réaction d’hypersensibilité retardée (Delayed-type hypersensibility ou DTH)
ont été associées, dans des modèles d’allogreffes de peau ou de cœur chez les
rongeurs, aux épisodes de rejet aigu (73-75). Elle est généralement caractérisée par
un œdème consécutif à l’augmentation de la perméabilité vasculaire ainsi qu’à
l’infiltration massive du tissu par des cellules T, des macrophages et des neutrophiles
(71). Elle est due au recrutement de lymphocytes Th1 et de CTLs au sein du greffon
qui, après activation, sécrètent des cytokines telles que l’IFN-γ et le TNF-α qui vont
participer à l’activation de macrophages. Ceux-ci vont dès lors libérer des molécules
toxiques telles que le TNF-α, des radicaux libres et le monoxyde d’azote. Le
monoxyde d’azote est toxique à haute concentration, il est aussi responsable de la
vasodilatation et des œdèmes caractéristiques des DTH). Le TNFα en s’associant à
son récepteur induit l’apoptose de la cellule cible par l’activation de la voie des
caspases.
De plus, la production par les lymphocytes T d’IFN-γ, de RANTES et de MCP1 (« Monocyte Chemotactic Protein-1 ») va avoir un effet sur les cellules
endothéliales et favoriser la migration de nouvelles cellules infiltrantes qui
entretiendront la DTH. Les neutrophiles, notamment, produiront une enzyme, la
myéloperoxidase, qui va être à l’origine de la synthèse de métabolites toxiques
comme des radicaux libres et du peroxyde d’hydrogène (71).
•
Rejet Chronique
Dès lors qu’une immunosuppression est mise en œuvre, que ce soit au niveau
des systèmes expérimentaux visant à étudier les mécanismes de rejet ou en clinique
humaine, le rejet aigu est plus ou moins muselé avec succès. La découverte des
drogues immunosuppressives a de ce point de vue, permit des progrès importants en
transplantation. La survie à un an des greffons a ainsi considérablement augmenté.
Toutefois, malgré ces avancées, 3 à 5% des patients perdent encore leur transplant
chaque année. Ce constat est lié au développement inexorable d’un processus
33
indolent mais progressif : le rejet chronique. Contrairement au rejet aigu qui est la
conséquence d’une réponse immunitaire exacerbée à l’encontre de l’organe étranger
transplanté, celui-ci est une maladie dominée par le remodelage pathologique du
tissu greffé (76). En effet, le rejet chronique ne conduit pas à la destruction de
l’organe mais à l’obstruction progressive de la lumière des vaisseaux sanguins,
consécutive à la prolifération des cellules musculaires lisses (77). Cette occlusion
entraîne une mauvaise perfusion de l’organe, en altère ses fonctions et conduit à
l’ischémie et, à terme, à la mort du greffon. Actuellement, cette artériosclérose de
transplantation reste l’obstacle majeur à la survie à long terme d’organes
vascularisés (78).
Le développement du rejet chronique est un processus comportant plusieurs
étapes clefs qui peuvent être distinguées en fonction des types de cellules
infiltrantes, de cytokines et de facteurs de croissance impliqués dans les lésions
tissulaires.
Les étapes initiales du rejet chronique sont associées à une réponse
inflammatoire, proche d’une DTH et dominée par une infiltration massive de
monocytes/macrophages dans l’intima. Dans des modèles de greffe chez le rat, il a
pu être montré que ces étapes précoces étaient aussi caractérisées par
l’attachement de nombreuses cellules T et la production in situ d’IL-1, d’IFN-γ et de
TNF-α. Il a de plus été rapporté que la production de la chimiokine MCP-1 par les
macrophages résidents amplifiaient le recrutement de cellules inflammatoires (79).
Dans les phases plus tardives, l’infiltration cellulaire est dominée par les
macrophages, le nombre de cellules T diminuant peu à peu. Ces étapes sont
caractérisées par la prolifération des cellules musculaires lisses, l’épaississement
secondaire de l’intima et l’apparition des premières zones infarctiées. Avec le temps,
ces phénomènes s’amplifient et des cytokines de type 2, telles que l’IL-4, l’IL-10 et le
TGF-β, cytokine impliquée dans le remodelage et la fibrose tissulaire, apparaissent
dans le greffon. Ces cytokines vont conduire au dérèglement de la balance
synthèse/dégradation de la matrice extracellulaire et ainsi, à l’apparition d’une fibrose
concentrique (80, 81). Parallèlement, les cellules musculaires lisses expriment à des
niveaux élevés les récepteurs aux facteurs de croissance Platelet-Derived Growth
Factor (PDGF-α, -β) et Epidermial Growth Factor (EGF), critiques pour leur
prolifération et leur migration vers l’intima. Ces deux évènements aboutissent à la
formation d’un épaississement diffus : la néointima. Dans les situations les plus
extrêmes, la lumière vasculaire va complètement se boucher ce qui va conduire à
l’ischémie de l’organe, à la fibrose de son parenchyme et à sa mort.
L’étiologie du rejet chronique est multiple. L’hypercholestérolémie,
l’hypertension, le tabagisme, l’âge, l’alcoolisme sont, comme pour l’athérosclérose,
autant de facteurs aggravants. Les évènements consécutifs à la mort cérébrale,
l’ischémie froide et à la reperfusion ont également des effets délétères. Cependant,
même si des expériences de greffes secondaires ont permis de montrer qu’une fois
34
initiée, l’artériosclérose de transplantation peut s’autoentretenir en l’absence
d’alloréponse, l’implication du système immunitaire dans cette forme de rejet reste
indispensable, du moins pour son initiation. En effet, chez le rat, la greffe d’un cœur
allogénique est associée au développement de rejet chronique contrairement à la
greffe d’un cœur syngénique ayant subit les mêmes procédures chirurgicales (82).
Les CPAs contenues dans le greffon ne s’autorenouvellant pas, l’activation
des cellules T de l’hôte va essentiellement être réalisée par la voie indirecte et semidirecte (80). Une fréquence importante de lymphocytes T spécifique de complexes
CMH du soi/peptide allogénique a été identifiée chez des patients développant un
rejet chronique suite à une greffe de cœur, de rein (49) ou de poumon (83). Ces
cellules vont essentiellement se différencier vers un phénotype Th2. Différentes
hypothèses ont permis d’expliquer ce « shift » de la réponse immune constaté dans
la plupart des modèles expérimentaux et en clinique humaine (77). Ainsi, l’action
inhibitrice des traitements immunosuppresseurs sur l’état inflammatoire contribue à la
diminution de l’intensité de la réponse Th1. De plus, l’activation des cellules T par la
voie d’alloreconnaissance indirecte implique des interactions de plus faibles avidités,
favorisant ainsi une différentiation Th2. De même, le changement dans la nature des
CPAs impliquées dans l’activation du répertoire T et dans la composition cytokinique
du milieu pourrait aussi y participer.
Cette déviation de la réponse immune pourrait ainsi, en grande partie, être
responsable du développement du rejet chronique vasculaire. Les cytokines de type
2, qui sont retrouvées en quantité importante dans les lésions d’artériosclérose,
jouent en effet un rôle majeur dans la sécrétion d’alloanticorps, capables en
l’absence de cellules T d’induire des lésions importantes, dans le contrôle de la
balance synthèse/dégradation de matrice extracellulaire et dans la prolifération et la
migration des cellules musculaires lisses dans l’intima. Elles participent également,
via l’IL-4 et l’IL-5, au recrutement et à l’activation des éosinophiles qui, en sécrétant
du TGF-β et des protéines cationiques telles la MBP (Major Basic Protein),
favoriserait le développement de la fibrose (84).
D. PROTOCOLES DE CONTROLE DU REJET
Depuis les années 60, date à laquelle la transplantation d’organe a réellement
été envisagé comme une solution thérapeutique, différentes stratégies ont été mises
au point afin de contrôler la réponse immune du receveur, principal obstacle à sa
réussite. Après la découverte en 1970 et l’utilisation dans les années 80 de la
Cyclosporine, de nombreuses générations de molécules actives ont été développées
avec le souci permanent d’un ciblage toujours plus précis des cellules responsables
du rejet et d’une réduction des effets iatrogènes. Pourtant, si les efforts consentis en
termes de recherche ont permis une augmentation de la survie des greffons, de
nombreuses limites persistent encore. Elles ont conduit la communauté scientifique à
mettre au point de nouvelles approches.
35
1. Les drogues immunosuppressives
Les traitements anti-rejet utilisés couramment en clinique humaine ont pour
objectif d’inhiber de façon plus ou moins directe l’activation et, plus récemment, la
migration des lymphocytes T, principaux acteurs du rejet. Ainsi cinq grands types de
drogues ou de traitements immunosuppresseurs ont été développés. Ils différent
notamment par leurs cibles et leurs modes d’action (85).
•
Inhibition de la prolifération
Les premières approches utilisées afin de contrôler l’alloréponse reposaient
essentiellement sur un effet anti-prolifératif. En 1915, Murphy et Morton montraient
ainsi que l’irradiation d’animaux conduisait à l’élimination du compartiment
lymphoïde, et de façon concomitante, à la prise durable d’une tumeur allogénique.
Cette destruction non sélective des cellules en cycle sera par la suite utilisée en
clinique humaine par Jean Hamburger. En 1959, il décrira que le conditionnement de
patients par irradiation totale du corps permet la survie à deux ans d’une allogreffe
rénale. Malgré ce résultat encourageant, obtenu chez 9 patients transplantés sur 25,
et le développement de techniques permettant de restreindre l’irradiation à certaines
parties du corps, la toxicité sévère du traitement et le caractère transitoire des effets
observés ont conduit à la recherche de nouvelles approches.
C’est dans ce cadre qu’ont été mises en évidence les premières drogues antiprolifératives. Après différents travaux reposant sur l’utilisation du benzène, les
traitements à l’azathioprine, toujours utilisés de nos jours, furent les premiers à
donner des résultats probants, en permettant notamment de prolonger de façon
significative la survie d’allogreffes rénales chez l’Homme (86). Une fois administrée,
cette molécule est rapidement hydrolysée en 6-mercaptopurine, inhibiteur compétitif
des bases puriques (adénine et guanine). Cependant, plus de 80% des patients
traités par l’azathioprine développent des épisodes de rejet aigu. Cette limite majeure
a permis le développement de produits analogues, mais plus efficaces. Le
mycophenolate mofetil (MMF), qui inhibe de manière non compétitive et réversible
la déshydrogénase inosine monophosphate, une enzyme indispensable à la
synthèse des nucléosides guanosiques, a alors été mis au point. Néanmoins, des
différences pharmacocinétiques interdividuelles importantes au niveau de son
absorption intestinale lui confèrent une efficacité aléatoire. Ce frein, associé à la
toxicité générale des traitements anti-prolifératifs vis-à-vis des tissus présentant un
fort taux de renouvellement (tractus digestif, tissu hématopoïétique…) a aujourd’hui
fortement restreint son utilisation.
36
37
•
Les Glucocorticoïdes
La seconde étape majeure dans le développement des drogues
immunosuppressives a été la découverte des stéroïdes. Les glucocorticoïdes,
stéroïdes dérivés de la synthèse chimique, forment un représentant majeur de cette
famille de molécules. Ils possèdent des récepteurs de type nucléaire, qui, une fois
associés à leur ligand, se libèrent des protéines chaperonnes de choc thermique
hsp90 qui les retiennent dans le cytoplasme et transloquent aussitôt dans le noyau
où ils s’associent à leurs éléments de réponse au niveau de l’ADN. Ces récepteurs
vont dès lors réguler l’activité transcriptionnelle de nombreux gènes, notamment en
inhibant la translocation de NF-κB. Ce facteur de transcription est à l’origine de
l’activation et de la maturation de cellules du système immunitaire telles les cellules
dendritiques (87). Les stéroïdes vont aussi inhiber, de façon directe ou non, la
synthèse de nombreuses enzymes de l’inflammation telles que la cyclo-oxygénase 2,
impliquée dans la synthèse de Prostaglandine E2, ou la phospholipase 2.
Les corticostéroïdes sont donc
de puissants
anti-inflammatoires
et
immunosuppresseurs dont la première utilisation en tant que traitement anti-rejet
date de la fin des années 60 (85). Ainsi de 1964 à 1978, de la prednisone a
notamment été administrée, de façon chronique, en combinaison avec
l’azathioprine. Ce traitement permettait la survie à un an de 50% des patients ayant
reçu une allogreffe de rein. Cependant, leur administration provoqua de nombreuses
altérations du compartiment hématopoïétique, des désordres métaboliques
(hypertension et ostéoporose), des diabètes ainsi que l’aggravation d’états infectieux
(réveil du virus de la varicelle ou du cytomégalovirus) et une sensibilité accrue aux
infections. Du fait des nombreux effets indésirables liés à l’administration des
stéroïdes, il est envisagé d’interrompre leur administration après les premiers mois
suivant la greffe. Toutefois, les premiers résultats suggéraient que l’arrêt des
corticostéroïdes trois mois après la greffe augmentait le risque de rejet.
•
Déplétion/modulation des lymphocytes
Une autre stratégie consiste à détruire sélectivement les lymphocytes, étant
donné leur rôle central dans l’alloréponse. La première approche, mise au point par
Woodruff en 1963, consistait à placer un cathéter dans le canal thoracique des
patients avant greffe, afin de drainer les lymphocytes qui retournent à la circulation
sanguine (88). La lymphe récoltée, déplétée en cellules mononuclées par
sédimentation ex vivo, était ensuite réinjectée au patient. En dépit de son originalité,
cette approche n’a connu que très peu d’applications en clinique humaine, en raison
notamment de la difficulté à la mettre en œuvre.
38
39
Une autre méthode, plus simple, fut envisagée : l’utilisation d’anticorps.
Malheureusement, les premières expériences furent des échecs : les anticorps antilymphocytaires utilisés, polyclonaux, reconnaissaient une grande variété de cibles et
s’accompagnaient donc d’une forte toxicité pour l’organisme. L’anti-thymocyte
globulin a toutefois été utilisé durant de longues années, principalement aux EtatsUnis. Il est aujourd’hui de plus en plus délaissé en faveur des anticorps
monoclonaux. Leur mise au point permit rapidement de résoudre ces problèmes.
Ainsi, l’un des plus anciens, et cependant toujours utilisé, est l’anticorps OKT3 dont
les premiers essais cliniques datent du début des années 1980 (89). Cette
immunoglobuline de souris reconnait CD3ε, une molécule clef du complexe TCR qui
joue un rôle prépondérant dans les évènements proximaux de la transduction du
signal, inactivant ainsi les fonctions des cellules T naïves et activées. Un autre
exemple d’anticorps, déplétant celui-ci, est le CAMPATH-1H ou Alemtuzumab. Il a
été montré que l’injection de cet anticorps humanisé anti-CD52 à J0 et J1 post-greffe
permet, en l’absence de stéroïdes, la survie à moyen terme d’une allogreffe rénale
par un traitement léger à la cyclosporine (90). CD52 est une molécule de surface
exprimée notamment par les cellules NK, les lymphocytes B et T, la plupart des
populations de monocytes/macrophages et les cellules dendritiques. Il est
actuellement en cours d’évaluation dans les greffes d’organes mais il est
régulièrement utilisé dans les greffes de moelle osseuse pour prévenir le rejet et la
GVHD ainsi que dans le traitement de leucémies (91). L’un des effets indésirables
majeurs imputables à ces anticorps est l’importante immunosuppression qu’ils
engendrent du fait de leur non-spécificité vis-à-vis des cellules T naïves ou activées.
Leur utilisation est donc restreinte à de faibles doses et à des périodes de temps
relativement courtes afin de réduire au maximum le risque d’infections opportunistes
ou le développement de novo de tumeurs malignes. Afin de remédier à cela, deux
autres anticorps monoclonaux, le Daclizumab (92) et le Basiliximab (93), visant
spécifiquement les lymphocytes T activés, ont été développés. Ces anticorps sont
dirigés contre la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25), exprimée à la surface des
cellules T et NK activées. Cependant, même s’ils permettent de réduire la fréquence
des épisodes de rejet aigu lors de greffes rénales, ces anticorps ont une efficacité
limitée du fait de leur faible compétition avec l’IL-2 endogène et du fait qu’ils inhibent
l’AICD (« Activation Induced Cell Death ») induite par cette cytokine. Ils entrainent de
plus le syndrome du relargage de cytokines (Cytokine Storm). Toutefois, étant
donnée leur spécificité vis-à-vis des cellules activées, leur administration ne semble
pas associées à une susceptibilité accrue aux infections opportunistes.
•
Inhibition de la synthèse des cytokines
Pour parachever leur activation et leur différenciation Th1/Th2, les
lymphocytes T nécessitent un signal dépendant des cytokines. En court-circuitant ce
signal, les médecins pensaient ainsi pouvoir réduire la réponse allogénique. La
découverte de la cyclosporine en 1970 à l’occasion de recherche sur de nouveaux
40
antifongiques a ouvert la voie à l’immunosuppression chimique. Ce polypeptide, isolé
à partir d’un champignon, fut testé dès 1978 et permis effectivement de fortement
réduire la fréquence et l’intensité des épisodes de rejet aigu (94). Depuis le
Tacrolimus (FK506), agent plus puissant, a été isolé à partir d’une bactérie. Ces
deux molécules, en s’associant avec la calcineurine, inhibent son activité, laquelle
sert de relais entre le TCR et différents facteurs de transcription, tels que JNK, NFAT
ou NFκB. La transcription de certains gènes cibles comme l’IL-2 est alors fortement
réduite. Cependant, même si l’effet de ces drogues est relativement restreint aux
cellules lymphoïdes, elles ne peuvent pas être administrées seules à des doses
suffisament élevées pour inhiber le rejet de greffe. En effet, la calcineurine étant
largement distribuée, son inhibition va avoir de nombreux effets indésirables tels que
des dommages neurologiques ou rénaux ainsi que l’apparition de diabète.
Le Sirolimus ou Rapamycine, molécule apparentée structuralement au
Tacrolimus, inhibe la kinase mTOR (mammalian Target of Rapamycin) impliquée
dans la transduction des signaux en aval des molécules de co-stimulation ou en
réponse à des cytokines telles que l’IL-2 ou l’IL-15 (95). L’activation de mTOR est à
l’origine de la progression de la cellule T de la phase G1 à la phase S (96).
L’administration de Sirolimus va avoir donc pour effets adverses principaux une
hyperlipidémie et une thrombocytopénie.
La stratégie actuelle consiste à combiner ces drogues qui possèdent différents
mécanismes d’action pour minimiser les doses utilisées et par là même la toxicité
intrinsèque à chacun de ces traitements.
•
Blocage de la migration des cellules effectrices
En 1992, une nouvelle classe de drogues anti-rejet est découverte, suite à la
modification chimique d’une molécule immunosuppressive naturelle retrouvée chez
les champignons, la myriocine. Nommé FTY720, cette nouvelle drogue est un
agoniste de haute affinité du récepteur 1 à la sphingosine-1 phosphate (S1P1).
Contrairement aux drogues classiques, il n’inhibe pas l’activation ou la différenciation
des cellules effectrices, mais en induisant l’internalisation de S1P1, il empêche
l’émigration des cellules T des organes lymphoïdes vers la périphérie (97, 98). Ainsi,
il a été montré, chez le rat, que son administration est associée à une importante
diminution des infiltrations des cellules CD3 positives dans le greffon de peau
allogénique. Et si son administration seule n’a que peu d’effet sur la survie du
greffon, en combinaison avec la cyclosporine, il en permet une augmentation très
significative (99).
Un de ses avantages est qu’en ne faisant que séquestrer les lymphocytes T et
B, il n’empêche ni leur activation dans les ganglions, ni les réponses humorales
périphériques ou la génération de CTLs spécifiques d’un virus (97). Ainsi peut-on
supposer que son administration, en comparaison aux drogues bloquant la
41
prolifération des cellules T ou leur activation, interfère moins avec le développement
de réponses immunitaires à la suite d’une infection du patient (la réponse restera
toutefois cantonnée aux organes lymphoïdes)
Cette molécule est actuellement testée en essai clinique de phase III chez
des patients ayant bénéficiés de greffe de rein. Récemment, les résultats d’une
étude, qui comparait l’effet du remplacement du mycophénolate mofétil par le
FTY720, tous deux en association avec la cyclosporine, ont été publiés. Ces
données montrent que le FTY720 est aussi efficace que le mycophénolate mofétil
dans la prévention du rejet de greffe, l’administration de FTY720 étant toutefois
associée à une diminution du risque des infections par le CMV (100).
1. Nouvelles stratégies thérapeutiques
Les drogues immunosuppressives ont beaucoup apporté à la transplantation.
Grâce à elles, ce qui n’était encore qu’un rêve à la sortie de la seconde guerre
mondiale est devenu une solution thérapeutique couramment utilisée en clinique
humaine. Pourtant, elles restent soumises à de nombreux effets secondaires, liés
notamment à une expression de leur molécule cible, non restreinte au compartiment
lymphoïde. De plus, les traitements n’affectant pas uniquement la réponse
alloréactive, l’état d’immunosuppression induit est global. Ainsi, en comparaison avec
des individus sains, les patients ayant bénéficiés d’une greffe d’organe présentent
une fréquence accrue de cancers et d’infections diverses. Ceci se caractérise
également par une mortalité amplifiée. Enfin, l’effet des drogues
immunosuppressives actuelles sur l’apparition des épisodes de rejet chronique reste
particulièrement faible. Ces différentes limites ont poussé la communauté scientifique
à élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
En 1953, Billingham et fait une découverte sans précédent. En injectant in
utero une suspension de cellules allogéniques à des souris gestantes, son équipe a
montré qu’à leur naissance, les souriceaux acceptaient durablement une greffe de
peau provenant d’un donneur génétiquement identique aux cellules administrées
(101). Mais la prouesse tenait surtout au spectaculaire rejet par ces mêmes
souriceaux d’une peau provenant d’un autre donneur allogénique. Ainsi, pour la
première fois, il avait été montré que l’on pouvait manipuler le système immunitaire
de manière spécifique afin de le forcer à accepter ce qui lui est étranger. La notion
d’induction de tolérance au non-soi était née. Depuis, elle est devenue le Saint Graal
que tout médecin en transplantation recherche. A l’inverse, ces expériences ont
permis de mieux connaitre la tolérance au soi. Il est ainsi rapidement apparu que la
tolérance observée était due à un microchimérisme qui se mettait en place chez les
souriceaux à partir des cellules injectées.
42
43
Les études et les modèles pour reproduire les résultats de Billingham se sont
donc multipliés mais seuls certains d’entre eux peuvent aujourd’hui prétendre à une
application future chez l’homme.
•
L’induction de chimérisme hématopoiétique
Dès 1945, Owen observa, chez des veaux ayant partagés la même circulation
placentaire (102), l’existence d’un mélange d’erythrocytes de deux origines
différentes. Chacun de ces veaux possédaient ainsi ses propres cellules et des
cellules de son frère. De plus, ce chimérisme perdurait à très long terme. Peu après,
Medawar montrait que chacun des faux-jumeaux étaient tolérants vis-à-vis d’une
greffe de peau provenant de leur frère. Par la suite, les travaux de Billingham et
Medawar mirent en évidence le fort potentiel thérapeutique d’un chimérisme dans le
cadre de la transplantation (101). La pertinence d’une telle approche chez l’Homme,
fut confortée quand des patients, ayant reçus au préalable une greffe de moelle
osseuse pour raison thérapeutique, s’avérèrent tolérants à une greffe de rein
provenant du même donneur, au point de pouvoir se passer de traitements
immunosuppresseurs.
Dès lors, la communauté scientifique s’intéressa de près à ces mécanismes et
tenta de repoduire au travers de divers modèles, l’induction d’une telle tolérance. Les
premières expériences chez la souris, réalisées par Ildstad et Sachs, montrèrent que
l’élimination totale du système hématopoïétique par irradiation létale et sa
reconstitution par un mélange de moelle osseuse syngénique et allogénique permet
d’obtenir une tolérance durable et spécifique du donneur vis-à-vis d’une greffe de
peau de même fond génétique que la moelle (103). L’approche fut plus tard rendu
moins toxique par l’utilisation d’une irradiation non-létale combiné à un traitement
d’anticorps déplétants anti-CD4 et anti-CD8 (104). Lors de la reconstitution du
système immunitaire de l’hôte, la tolérance est induite et maintenue par des
mécanismes de sélection des cellules T neogénérées au niveau du Thymus, médiés
principalement par la présence au niveau de la medulla de cellules dendritiques du
donneur. L’établissement de cette tolérance permet par la suite l’acceptation d’une
greffe d’organe provenant de la même origine, sans l’utilisation de traitements
immunosuppresseurs.
Par la suite, des études chez le porc miniature et chez les primates nonhumains ont clairement établis le principe selon lequel l’induction d’un chimerisme
mixe dans des conditions non-myéloablatives est un moyen particulièrement efficace
de promouvoir la tolérance. L’approche a également été étendue à l’Homme, lors de
tests cliniques dans lesquels la tolérance a été induite chez certains patients sans
induire de maladie contre le greffon ou de toxicité (105, 106). Ce point s’est révélé
particulièrement prometteur, l’établissement d’un chimérisme ayant longtemps été
freiné par la forte morbidité de la GVHD.
44
Pourtant, de nombreuses interrogations subsistent sur le chimérisme et sa
capacité à induire une tolérance. Ainsi, l’établissement d’un chimérisme mixte
persistant, s’il est relativement aisé chez les rongeurs, s’avèrent particulièrement
difficile chez les primates et l’Homme. Le conditionnement des receveurs reste
encore aujourd’hui très contraignant pour permettre la prise de la moelle osseuse. De
plus, il est rapidement apparu que l’induction d’un chimerisme n’était pas
systématiquement synonyme d’une tolérance. Ce phénomène, appelé « Split
Tolerance », a d’abord été observé dans des cas de chimérime total, où toutes les
cellules hématopoïétiques proviennent du donneur. Depuis, il a été clairement décrit
dans différents modèles de chimérisme mixte (104, 107-110). Enfin, il est à noter
que, même dans le cas où une tolérance a été induite, celle-ci peut brusquement
disparaître, parfois plusieurs mois après son induction, impliquant le rejet de l’organe
solide greffé.
Cette solution thérapeutique, quoique prometteuse, nécessite donc encore de
nombreuses études afin de comprendre les mécanismes sous-jacents et pouvoir, à
terme, induire une tolérance à chaque fois.
•
Les Cellules Dendritiques Tolérogènes
Les cellules dendritiques jouent un rôle clef dans le contrôle de la réactivité du
système immunitaire puisque ce sont elles qui vont présenter les alloantigènes aux
cellules T effectrices. Cependant, si une fois matures, elles sont à l’initiation des
mécanismes conduisant au rejet de greffe, elles participent à l’état immature aux
mécanismes d’induction de tolérance. Cette dualité fonctionnelle a donc amené
différents groupes à moduler l’état d’activation de ces cellules afin d’inhiber
sélectivement le compartiment immun alloréactif et, ainsi, induire la survie à long
terme de greffes allogéniques.
De nombreux travaux reposent sur l’utilisation de cellules dendritiques
allogéniques immatures. Ces cellules sont notamment caractérisées par une faible
expression des molécules du CMH II et de co-stimulation. Aussi, en l’absence de
signaux activateurs, leur capacité à stimuler les lymphocytes T est extrêmement
faible. Dans différents systèmes, il a même été montré qu’elles ont un potentiel
tolérogène important. La première démonstration d’un tel potentiel des cellules
dendritiques fut apportée par Lu et al. en 1995. Ils ont dérivé, en présence de GMCSF et en l’absence d’IL-4, des cellules dendritiques à partir de précurseurs
contenus dans la moelle osseuse. Après 8 à 10 jours de culture, ils ont montré que
ces cellules induisent, de façon antigène spécifique, l’anergie réversible de
lymphocytes T alloréactifs (111). Dans ce modèle, l’hyporéponse est associée à
l’absence d’expression des molécules de co-stimulation par les CPAs puisque l’ajout
d’un anticorps anti-CD28 in vitro permet de réverser le phénomène.
45
En 2000, la même équipe obtient des données analogues avec des cellules
dendritiques dérivées en présence de faible quantité de GM-CSF et d’IL-4. Ces
cellules sont résistantes à la maturation induite par différents stimuli tels que du LPS,
du TNFα ou des anticorps anti-CD40. De phénotype immature, elles expriment que
faiblement les molécules de co-stimulation CD80 et CD86 et sont incapables
d’activer des lymphocytes T allogéniques in vitro. De façon spectaculaire, les auteurs
ont pu démontrer l’efficacité de ces cellules dans un modèle de greffe cardiaque
allogénique chez la souris. L’administration par voie systémique d’un faible nombre
de cellules dendritiques immatures d’origine du donneur 7 jours avant la greffe,
permet d’induire l’acceptation à long terme de façon spécifique (112).
Différents traitements pharmacologiques peuvent être employés pour générer,
in vitro, des cellules dendritiques immatures possédant des capacités tolérogènes.
Ainsi, un grand nombre de traitements immunosuppresseurs classiquement utilisés
en clinique, en plus de leur action sur les cellules T, ciblent également les cellules
dendritiques. Les Corticostéroïdes, la Rapamycine et la Cyclosporine peuvent
notamment inhiber la maturation des cellules dendritiques (113).
Parallèlement, d’autres agents permettent l’induction de cellules dendritiques
tolérogènes. La 1, 25 dihydroxy vitamine D3, par exemple, le métabolite actif de la
vitamine D3, inhibe la différenciation et la maturation des cellules dendritiques
humaines et murines in vitro. De plus, elle inhibe leur sécrétion d’IL-12 en réponse au
LPS, alors que dans le même temps, leur sécrétion d’IL-10 est fortement augmentée.
Tous ces effets ont pour conséquence d’inhiber la capacité des cellules dendritiques
à activer les lymphocytes T alloréactifs, rendant les cellules T anergiques (114).
L’utilisation in vivo de la 1, 25 dihydroxy vitamine D3 dans des modèles de
greffe a permis de montrer son efficacité. Ainsi, l’inocculation de cellules dendritiques
de mâles prétraitées à la vitamine D3 chez une femelle syngénique quelques jours
avant qu’elle ne reçoive une peau de mâle, est associée à l’acceptation durable de la
peau greffée. A l’opposé, l’administration de cellules dendritiques mâles non
prétraitées n’est pas associée à une augmentation de survie du greffon en
comparaison aux souris contrôles n’ayant pas reçu de cellules dendritiques (115).
De plus, il a été montré que l’administration directe de vitamine D3 en
association avec du mycophénolate mofétil induit l’acceptation durable de greffes
cardiaques et d’îlots pancréatiques chez des souris. Les auteurs ont mis en évidence
que chez les souris traitées, les cellules dendritiques autour de la greffe présentent
un phénotype immature, attesté par une expression de CD40, CD80 et CD86
46
47
diminuée en comparaison avec des cellules dendritiques de souris non traitées. De
même, lorsque ces cellules dendritiques purifiées sont mises en contact avec des
lymphocytes T CD4 du donneur, elles sécrètent 10 fois moins d’IL-12 que leurs
homologues provenant d’animaux non traités. Enfin la réponse T CD4 qui se
développe est caractérisée par une faible production d’IFN-γ. Les auteurs on pu
montrer que cette tolérance était transférable. En effet, des lymphocytes T CD4+
CD25+ purifiés à partir de la rate des souris tolérantes, cellules dont le pourcentage
est augmenté par rapport aux souris contrôles, protègent des souris naïves du rejet
de greffe d’îlots (116) : la tolérance induite serait donc dominante.
Parallèlement à la génération de cellules dendritiques tolérogènes ex vivo,
une étude récente indique que l’administration de dérivés apoptotiques provenant
des splénocytes du donneur, 7 jours avant la greffe cardiaque, permet d’augmenter
de façon significative la survie du greffon (117). En effet les cellules dendritiques du
donneur qui ont capturé les cellules apoptotiques restent immatures, et la
présentation des peptides allogéniques aux lymphocytes T CD4, activés ici de
manière directe, entraine leur anergie. Ces cellules CD4, une fois « activées »,
s’avèrent incapable de sécréter de l’IL-2 et de l’IFN-γ.
Cependant, ces différentes stratégies présentent de nombreuses limites.
Ainsi, il a été montré que ces cellules peuvent maturer in vivo et conduire à
l’accélération du rejet de l’organe. Ceci peut toutefois être contrôlé par l’injection
d’anticorps bloquant l’interaction CD40/CD40L (118). Enfin, d’un point de vue
logistique, il apparaît difficile d’injecter une semaine avant la greffe des cellules
dendritiques dérivées de tissus prélevés chez un donneur cadavérique.
Pour pallier cela, des stratégies reposant sur des cellules dendritiques
syngéniques ont été proposées. La pertinence de cette approche est suggérée par le
fait que l’induction de tolérance à des alloantigènes a été décrite, dans différents
systèmes, comme nécessitant une voie d’alloreconnaissance indirecte fonctionnelle
(119, 120). Ainsi, il a été montré dans des modèles de greffe cardiaque allogénique
chez le rat par l’équipe du Dr Cuturi que l’injection de cellules dendritiques
syngéniques immatures permet d’augmenter significativement la survie de l’organe
transplanté (121). Mieux, lorsque l’injection des cellules dendritiques est suivie d’un
traitement suboptimal de LF15-095, un état de tolérance durable et spécifique de
l’antigène est induit (122). Cet analogue de la deoxyspergualine pourrait potentialiser
l’action des cellules dendritiques en inhibant leur maturation in vivo.
De façon intéressante, le même groupe a montré que l’administration
d’exosomes provenant du donneur après la transplantation, en association avec du
LF15-095, est capable d’induire une tolérance spécifique des alloantigènes du
donneur, caractérisée par une profonde inhibition des réponses prolifératives « antidonneurs ». De plus, ce traitement permet de retarder significativement le rejet
chronique. Ces données montrent que la présentation des molécules du CMH du
donneur à la surface des exosomes peut induire le développement de réponses
48
« régulatrices » capables d’induire une tolérance vis-à-vis du donneur, même si ces
exosomes sont administrés après la greffe (123).
Enfin, une dernière approche concernant l’utilisation de cellules dendritiques
tolérogènes, consiste à manipuler ces cellules in vivo afin d’optimiser leurs capacités
tolérogènes (124). En ce sens, l’expression de différentes molécules aux propriétés
immunosuppressives a été induite dans ces cellules par génie génétique. Afin de
bloquer l’expansion clonale des lymphocytes T allospécifiques, et/ou d’induire leur
apoptose, des stratégies ont consisté à transfecter les cellules dendritiques avec le
gène codant pour l’indoléamine-2,3 dioxygénase (IDO). De même, afin de
promouvoir l’anergie ou la délétion des cellules effectrices, l’expression de molécules
telles que PDL-1 ou FasL a été forcée à la surface des CPAs. L’inhibition de
l’expression des molécules de co-stimulation, indispensable à une bonne activation
des lymphocytes T, a été envisagée via un effet autocrine, après transfection des
cellules dendritiques avec les gènes codant pour l’IL-10 ou le TGF-β.
•
Blocage des co-récepteurs
Dans les années 90, l’équipe de Herman Waldmann a développé des
protocoles d’induction de tolérance basés sur l’administration, d’anticorps anti-CD4
non déplétants. Ces traitements permettent l’acceptation de greffes cardiaques
allogéniques (125). L’addition d’anticorps anti-CD8 ou anti-CD40L, entraine une
tolérance durable et spécifique du donneur, à savoir que l’animal ainsi « tolérisé »
accepte une seconde greffe de même origine que la première alors qu’il rejette une
greffe d’origine différente (126). Les auteurs ont mis en évidence que cette tolérance
peut être transférée chez un hôte naïf : c’est la tolérance dominante (127). Celle-ci
serait dépendante d’une population de lymphocytes T CD4+ possédant des
propriétés immunorégulatrices. En effet, ces cellules, quand elles sont transférées,
ont la capacité d’empêcher le rejet d’une greffe de même origine que celle de la
greffe qu’a reçue l’animal tolérisé.
Ces protocoles d’induction de tolérance utilisant des anticorps dirigés contre
les co-récepteurs ont connu peu de succès, en dehors du groupe de H. Waldmann.
Ceci est probablement dû à l’engouement général envers les anticorps bloquant les
signaux de co-stimulation. De plus, l’état de tolérance qui se développe suite à
l’administration de ces anticorps s’acquiert seulement après plusieurs semaines de
traitement (128).
•
Blocage des molécules de co-stimulation
Les succès rencontrés par les protocoles d’induction de tolérance à l’aide
d’anticorps développés par Waldmann, ont conduit de nombreuses équipes à élargir
49
l’éventail de molécules cibles. Etant donnée leur importance pour une activation
efficace du système immunitaire, les molécules de co-stimulation sont rapidement
apparues comme d’excellents candidats.
Il existe une grande variété de voies de co-stimulation ; cependant
B7/CD28/CTLA-4 et CD40/CD40L est probablement la plus importante et
certainement la mieux caractérisée à ce jour. De même, CD40/CD40L, malgré le fait
qu’elle ne fasse pas intervenir à proprement parler des molécules de co-stimulation,
a été bien décrite. Ces deux voies ont ainsi concentré toute l’attention de la
communauté scientifique. Toutefois, si de nombreux modèles ont été mis au point
chez les rongeurs, seul le blocage de la voie B7/CD28 a fait l’objet d’essais cliniques
et d’études approfondies chez les primates non humains.
L’interaction entre CD28 à la surface de la cellule T et les molécules B7 à
la surface des APCs peut être bloquée par des anticorps anti-B7 et par CTL4-Ig, une
protéine recombinante constituée du domaine extracellulaire de CTLA-4 fusionné à
la chaîne lourde d’une immunoglobuline. L’utilisation de ces anticorps prévient le
rejet aigu d’allogreffe et induit parallèlement une tolérance spécifique vis-à-vis des
antigènes du donneur. Cependant, il est à noter que le blocage n’est pas efficace
dans toutes les souches de souris, ni dans toutes les combinaisons.
Une seule dose de CTLA4-Ig permet d’augmenter de façon significative la
survie du rein greffé chez la majorité des rats traités (129). Néanmoins, il semble que
l’administration d’antigènes du donneur sous la forme de transfusion de splénocytes
du donneur (DST) soit nécessaire pour obtenir une acceptation durable et pour
prévenir le rejet chronique des cœurs greffés (130). La DST potentialiserait l’action
de l’administration de CTLA4-Ig en fournissant aux lymphocytes T alloréactifs un
important stimulus pour leur TCR. Dans le même temps, le blocage des molécules
de co-stimulation ne permettrait pas aux lymphocytes T d’obtenir une activation
optimale. Il en résulterait une anergie ou l’apoptose des cellules T.
CTLA4-Ig permettrait l’acceptation durable via plusieurs mécanismes. Tout
d’abord, il réduirait la fréquence des cellules T alloréactives qui prolifèrent en
augmentant parallèlement leur sensibilité à l’apoptose. En accord avec cela, des
agents pharmacologiques comme la Rapamycine qui augmente l’AICD potentialise
l’apoptose induite par l’administration de CTLA4-Ig, alors que la cyclosporine la
diminue (131).
Un deuxième mécanisme a récemment été découvert. Grohmann et al. ont
pu montrer que la liaison de CTLA4-Ig aux molécules B7 induit l’expression de
l’enzyme IDO par les cellules dendritiques in vitro. Celle-ci va métaboliser le
tryptophane en kynurénine, métabolite entraînant l’apoptose des lymphocytes T. De
façon intéressante, les auteurs ont mis en évidence que l’état de tolérance induit par
l’administration de CTLA4-Ig était dépendant du catabolisme du tryptophane in vivo.
Si des îlots pancréatiques allogéniques étaient durablement acceptés chez des
souris recevant du CTLA4-Ig, ils étaient rapidement rejetés lorsque était coadministré
50
du 1-methyltryptophane, un inhibiteur d’IDO (132). Ces résultats sont en accord avec
des études qui montraient l’importance d’une interaction B7/CTLA4-Ig intacte dans
l’induction de tolérance. Ainsi, la tolérance induite par un traitement associant
CTLA4-Ig et une DST était prévenue lorsque des anticorps Anti-CTLA4 étaient
administrés de façon concomitante (133).
Des résultats similaires à ceux obtenus avec blocage de la voie CD28/B7
ont été observés avec l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CD40L (anti-CD154).
In vivo, le blocage de cette voie va avoir, entre autres, pour conséquence d’altérer la
maturation des cellules dendritiques, leur présentation d’antigène ainsi que leur
capacité à activer les lymphocytes T (134). Chez des souris ayant reçu des anticorps
anti-CD40L et une DST, on observe l’augmentation significative d’une population de
lymphocytes T CD4+ CD25+, nécessaires pour induire un état de tolérance durable
chez le receveur. Chez ces animaux, une forte expression des ARNm codant pour
Foxp3, un marqueur des populations régulatrices, est observée dans les greffons
cardiaques des souris tolérisées (135).
Il semble que comme pour l’administration de CTLA4-Ig, le traitement des
souris receveuses avec des anticorps anti-CD40L pendant les premiers jours suivant
la greffe ne soit pas suffisant pour induire l’acceptation durable des greffes
cardiaques (136) ou d’îlots pancréatiques allogéniques (137). En effet, il apparait que
les lymphocytes T CD8 qui sont plus résistants au blocage de CD40, sont à l’origine,
chez les souris ne possédant pas une voie de signalisation CD40/CD40L
fonctionnelle, du développement du rejet chronique (138, 139). Comme pour le
blocage de CD28, une DST est dans les deux cas nécessaire pour atteindre une
tolérance à long terme sans survenue de rejet chronique (136, 137).
Des stratégies visant à combiner le blocage des deux voies ont provué leur
efficacité. Chez les souris, des anticorps anti-CD154 en association avec CTLA4-Ig
permettent d’induire la survie à long terme d’allogreffes cardiaques BALB/c sans
dommages vasculaires chroniques chez un hôte C3H (140). Ce protocole de
tolérance autorise aussi l’acceptation de peau allogénique BALB/c par l’hôte C3H.
Il faut toutefois préciser que l’efficacité de ces protocoles d’induction de
tolérance est fortement dépendante des souches utilisées dans les combinaisons
donneur/receveur, et ce particulièrement lorsque des greffes de peau, hautement
immunogènes, sont réalisées. Ainsi, si dans la combinaison citée plus haut BALB/c
dans C3H, la co-administration anti-CD40L et CTLA4-Ig permet l’acceptation de la
peau greffée, dans une autre combinaison BALB/c dans B6, ce protocole n’est pas
efficace et ne permet que de retarder de quelques jours le rejet de la peau greffée.
Ces résultats pourraient s’expliquer par le fait que des lymphocytes T CD8 de
certaines souches seraient plus résistants que d’autres aux blocages des voies de
co-stimulation (141).
Malheureusement, si l’administration d’anticorps anti-CD40L est efficace
chez les primates non humains (142), certains groupes ont rapporté la survenue
51
d’épisodes thromboemboliques (143) suite à ce traitement chez l’Homme. Ces
complications reflètent l’importance de l’expression des molécules de co-stimulation
par les cellules non lymphoïdes. CD40L est en effet constitutivement exprimé à la
surface de l’endothélium et son expression est induite à la surface des plaquettes
activées. Ainsi, à ce jour, les stratégies de blocage de co-stimulation basées sur
l’administration d’anticorps anti-CD40L ne font pas l’objet d’essais cliniques.
A l’inverse, les protocoles basés sur l’utilisation de CTLA4-Ig font l’objet
d’investigations cliniques. Belatacept est un dérivé de l’abacept, une protéine de
fusion humaine constituée du domaine de CTLA4 fusionné à une IgG1 humaine. La
différence entre les deux protéines est une substitution de deux acides aminés qui
augmente l’affinité du belatacept. Un essai clinique de phase 2, incluant des adultes
ayant subi une allogreffe de rein, a comparé son effet à celui de la cyclosporine, en
addition d’une thérapie d’induction composée de basiliximab, de mycophénolate
mofétil et de cortisone. Les résultats de l’étude publiée en 2005 concluent que le
belatacept et la cyclosporine sont aussi efficaces dans la prévention des rejets aigus.
Toutefois, il semble que la prise des belatacept soit associée à des effets
indésirables moindres. Chez les patients ayant reçu la protéine CTLA4-Ig plutôt que
la cyclosporine, on note un meilleur fonctionnement du rein greffé associé à une
diminution d’un facteur 2 des néphropathies chroniques (144). De nouvelles études
prospectives randomisées devraient à l’avenir permettre de tester l’efficacité de ce
traitement pour d’autres greffes d’organes.
Ces stratégies thérapeutiques parviennent donc, avec plus ou moins de
succès, à induire une tolérance aux alloantigènes chez le receveur en manipulant
son système immunitaire. Cette tolérance est, dans la plupart des modèles décrits ici,
induite soit par l’anergie et la délétion des cellules alloréactives, soit par
l’amplification ou la génération de sous-population de lymphocytes T doués de
propriétés immunosuppressives. Ce faisant, ces différents protocoles ne font que
détourner de leur but initial des mécanismes déjà existants à l’état naturel chez tout
individu et lui permettant d’assurer l’intégrité de son organisme, en évitant que son
propre système immunitaire ne se retourne contre lui : c’est la tolérance au soi.
52
TOLERANCE AU SOI
Pour répondre à l’infini diversité des antigènes, les régions variables des
récepteurs des lymphocytes B et T sont générées par recombinaisons géniques. Ce
processus étant aléatoire, il permet la production d’un très vaste répertoire de
spécificités, à même de couvrir en théorie l’intégralité des antigènes rencontrés. Le
revers de la médaille toutefois, réside dans la génération de cellules présentant une
forte affinité pour les antigènes du soi. Ces lymphocytes autospécifiques pourraient,
une fois en périphérie, s’activer et représenter une menace pour l’organisme. Il est
donc indispensable soit de neutraliser directement ces cellules lors de leur
génération, c’est la « tolérance centrale » ; soit d’empêcher coute que coute leur
activation au niveau des organes lymphoïdes secondaires, c’est la « tolérance
périphérique ».
A. TOLERANCE CENTRALE
Le développement thymique des lymphocytes T passe par différentes étapes
clefs, le passage à l’étape suivante étant tributaire de la réussite de la précédente.
Tout au long de cette maturation, le thymocyte sera identifié par l’expression,
temporellement et spatialement ordonnée, de différentes molécules de surface
incluant les co-récepteurs CD4 et CD8. Ainsi, c’est au stade « double négatif » (DN),
alors qu’il n’exprime aucun de ces deux marqueurs, que le thymocyte va exprimer la
machinerie moléculaire nécessaire au réarrangement somatique des segments V, D
et J codant pour la chaine β du TCR. Il s’agit notamment des enzymes de
recombinaison RAG1 (145) et RAG2 (146, 147). Si un réarrangement fonctionnel a
lieu, la chaine β va s’apparier à une pré-chaine α (pTα) pour former un complexe
exprimé à la surface : le pré-TCR (148, 149). Pour passer à l’étape suivante, le
thymocyte a dès lors besoin d’un signal de survie via son pré-TCR : c’est la sélection
β. Cependant, les chaines β, dont la région intracellulaire est réduite, et pTα, en dépit
d’une queue intracytoplasmique longue, ne peuvent initier la transduction du signal
(150). Le pré-TCR va donc être exprimé à la membrane, associé à des molécules,
telles CD3, impliquées dans les évènements de signalisation proximale (150, 151).
Les voies de signalisation activées vont conduire à la répression de l’expression des
enzymes RAG1 et RAG2 afin d’empêcher l’expression d’un second TCR : c’est
l’exclusion allélique. Après une étape d’intense prolifération, les thymocytes
acquièrent les co-récepteurs CD4 et CD8, devenant ainsi des cellules double
positives (DP). La recombinaison somatiques des segments V, D et J codant pour la
chaine α va alors débuter. Si un réarrangement fonctionnel a lieu et si les chaines α
et β s’apparient correctement, le récepteur à l’antigène est exprimé.
53
54
Les prochaines étapes de maturation consisteront à s’assurer que ce nouveau
TCR correspond bien à un cahier des charges très strict : il doit être capable de
reconnaître les molécules de CMH du soi, puisque ce sont elles qui présenteront les
antigènes exogènes, sans pour autant présenter une affinité trop forte pour les
complexes CMH-peptide du soi. C’est le rôle des sélections positive et négative.
1. Sélection positive
Pour permettre au lymphocyte T d’assurer sa fonction, le TCR ainsi généré
doit être capable de reconnaître le CMH du soi. Malheureusement, en raison du
caractère stochastique du réarrangement somatique, seuls 5% des TCR générés
vont être réellement capables d’interagir avec les complexes peptide-CMH du soi.
Une sélection des lymphocytes T dits « utiles » est donc indispensable. Cette étape
de « sélection positive » s’effectue par défaut. Près de 90% des thymocytes meurent
donc par négligence, car ils ne peuvent intégrer les signaux, dépendants de
l’engagement du TCR, nécessaires à leur survie.
Cette étape a été mise en évidence dès les années 70 : Bevan et al.
montraient, à l’aide de chimères, que la spécificité des lymphocytes T d’un animal
était restreinte aux molécules de CMH exprimées par ses cellules non
hématopoïétiques (152). Peu après, l’équipe de Zinkernagel observait que la
transplantation d’un thymus allogénique chez des chimères thymectomisées induit
chez les cellules T du receveur une spécificité vis-à-vis des molécules de CMH
allogénique (153). Elle montrait ainsi l’importance du thymus, et notamment de
l’épithélium thymique, dans ce phénomène.
Toutefois, il restait encore à déterminer qui du cortex et de la medulla était
responsable de la sélection positive. La présence exclusive des DP (154) et
l’expression des molécules de CMH de classe I et II au niveau du cortex apportèrent
un début de réponse. La confirmation vint avec l’utilisation de souris transgéniques
n’exprimant les molécules de CMH que sur les cellules épithéliales thymiques
corticales (cTEC) ou, à l’inverse, uniquement sur les cellules épithéliales thymiques
médullaires (mTEC) (155). En effet, chez ces souris, seule une expression dans le
cortex permet la sélection positive des lymphocytes T.
2. Sélection négative
L’interaction du TCR avec un complexe CMH/peptide du soi, exprimé à la
surface des cTEC permet d’induire la survie du thymocyte DP. Cependant, le
compartiment lymphocytaire T ainsi sélectionné est fortement enrichi en cellules
ayant une forte affinité pour les antigènes du soi et donc dangereuses pour
l’organisme. Dans des modèles expérimentaux dans lesquels l’expression des
55
molécules du CMH sont restreintes aux cellules épithéliales du cortex, il a en effet
été montré que le répertoire de lymphocytes T qui se développe est en partie
autospécifique (155, 156). Ces cellules sont fonctionnelles et potentiellement auto
réactives puisque, ex vivo, elles sont capables de répondre à une stimulation délivrée
par des CPAs syngéniques. Une étape de sélection, visant à éliminer ses cellules
dangereuses, est donc nécessaire : c’est la sélection négative.
En 1984, l’existence d’une tolérance restreinte par le CMH a été décelée par
Polly Matzinger (157). Ainsi, si les lymphocytes T sont capables de s’activer au
contact d’un antigène du non-soi présenté par le CMH du soi ou d’un antigène du soi
complexé à un CMH allogénique, leur interaction avec un complexe CMH du
soi/peptide du soi reste non immunogène. Depuis, deux mécanismes de sélection
ont été décrits. Le premier aboutit à la délétion clonale des précurseurs autoréactifs
(158, 159). Une étude quantitative et cinétique du développement des thymocytes a
permis de montrer que la moitié à deux tiers des cellules sélectionnées positivement
sont ainsi éliminées (160). Le second ne conduit pas à l’élimination physique des
thymocytes dangereux, mais à leur inactivation fonctionnelle (161).
Grâce à des expériences de chimères hématopoïétiques et à la différence de
sensibilité aux radiations des différentes composantes cellulaires du stroma
thymique, des auteurs ont suggéré que ces deux mécanismes de sélection soient
induits par des populations cellulaires distinctes. La délétion serait essentiellement
dirigée par les cellules dendritiques médullaires alors que l’induction d’anergie serait
sous la dépendance d’une population radiorésistante : les cellules épithéliales de la
medulla (162). Ce dogme a cependant été remis en cause par différentes
publications. Il a notamment été montré que l’épithélium médullaire est susceptible
d’induire la délétion partielle de thymocytes spécifiques de superantigènes (163) ou
d’antigènes tissulaires (164).
L’implication des cellules épithéliales thymiques de la medulla a été renforcé
avec l’identification de AIRE (Autoimmune regulator) (165), une protéine présentant
des similitudes importantes avec des facteurs de transcription, et dont l’expression,
restreinte aux tissus lymphoïdes, est particulièrement élevée dans les mTEC. Le
groupe de Christophe Benoist et Diane Mathis a ainsi montré que AIRE régule
l’expression de 200 à 1200 gènes chez la souris (166). De plus, la greffe chez une
souris nude, d’un thymus déplété de ses cellules hématopoïétiques et provenant
d’une souris AIRE-/-, entraine, tout comme chez les souris AIRE-/-, le développement
d’un syndrome auto-immun polyendocrinien. Chez l’Homme également, sa
déficience provoque une pathologie semblable, autosomique récessive monogénique
(167), baptisée APECED (« Autoimmune PolyEndocrinopathy
Candidiasis
Ectodermal Dystrophy »). L’activité de la protéine AIRE permettrait donc, via
l’induction ectopique d’antigènes présentant une spécificité tissulaire, de prévenir
l’auto-immunité.
Un lien direct entre AIRE et la sélection négative a depuis été établi. Des
auteurs ont généré des souris sauvages ou AIRE-/-, doubles transgéniques pour les
56
chaînes α et β d’un TCR spécifique d’un peptide dérivé du HEL (Hen Egg Lysozyme)
et pour la protéine HEL sous le contrôle du promoteur à l’insuline (168). Dans les
souris « sauvages », les thymocytes exprimant le TCR transgénique sont éliminés
par des mécanismes de sélection négative nécessitant l’expression d’AIRE par le
compartiment thymique non hématopoïétique. Dans les souris déficientes pour le
facteur de transcription, des cellules T matures exprimant le TCR transgénique,
sortent du thymus. Les mTEC, en présentant à leur surface les antigènes spécifiques
d’organes, sous forme de peptides associés aux molécules du CMH, permettraient
donc l’élimination des cellules autospécifiques.
Il est à noter que AIRE semble ne pas être le seul mécanisme permettant
l’expression d’antigènes ectopique (166, 169). En effet, il a été montré que
l’expression par les mTEC de Chrna1 était régulé, en plus de l’action d’AIRE, par
IRF8 (interferon regulatory factor 8) (170).
B. TOLERANCE PERIPHERIQUE
Les différentes étapes de sélection que connait un lymphocyte T permettent
ainsi d’éliminer les cellules T « inutiles », car incapables de reconnaitre les molécules
de CMH du soi, et les cellules dangereuses car présentant une trop forte affinité pour
les antigènes du soi.
Pourtant, malgré l’activité d’AIRE, tous les antigènes tissulaires ne sont pas
exprimés dans le thymus (171), ou sont exprimés à des niveaux insuffisants pour
induire la délétion de l’ensemble des cellules autospécifiques. Il en résulte la sortie
du thymus de lymphocyte T matures autospécifiques et donc potentiellement
autoréactifs (172-174).
La présence des cellules chez un individu sain implique que d’autres
mécanismes sont mis en place par l’organisme pour les neutraliser en périphérie.
Ces mécanismes se subdivisent en deux ensembles : les mécanismes dits
« passifs » qui font appel aux caractéristiques intrinsèques des cellules T et les
mécanismes « actifs » qui sont assurés par des populations immunitaires
régulatrices.
57
58
1. Tolérance passive
•
L’ignorance
Durant la période périnatale, l’ignorance tient une grande importance. En effet,
lors des deux semaines suivant la naissance, des lymphocytes T fonctionnels et
spécifiques d’antigènes tissulaires peuvent s’accumuler dans la périphérie (175).
Leur inaptitude à déclencher une réponse auto-immune est associée à l’incapacité
des cellules dendritiques à présenter ces antigènes chez le jeune animal (175, 176).
Ce constat permet notamment d’expliquer le délai de 4 à 6 semaines, observé dans
le développement du diabète auto-immun chez les souris BDC2.5, en dépit d’un
répertoire T enrichi en cellules spécifiques d’antigènes pancréatiques (176, 177).
Chez l’adulte, l’ignorance réside principalement dans la séquestration des
antigènes pour que les cellules immunitaires ne puissent atteindre certains tissus et
dans la prévention de leur présentation. Ainsi, certains sites, présentent un statut
immunoprivilégié, tels les yeux, le cerveau ou l’endomètre (178), grâce notamment à
un accès limité (barrière hémato-encéphalique). Par ailleurs, les molécules de CMH
de classe I sont absentes ou faiblement exprimées à la surface des neurones, des
cellules oculaires (179, 180) ou trophoblastiques. Ceci permet une protection de ces
cellules vis-à-vis des fonctions cytotoxiques des lymphocytes T CD8 (181), tout en
les exposant à la lyse par les cellules NK. L’absence d’activation des lymphocytes T
autospécifiques a aussi été associée à une trop faible expression de l’antigène, en
dépit de cellules dendritiques pleinement fonctionnelles (182). Enfin, des cellules T
autospécifiques demeurent ignorantes car elles expriment un TCR de trop faible
affinité pour son ligand (183, 184). Ceci est lié au fait que le seuil d’affinité de
l’interaction TCR/CMH/peptide conduisant à la délétion clonale des thymocytes est
plus faible que le seuil requis pour l’activation des cellules T en périphérie (185).
Toutefois, même si elle aboutit à l’absence de déclenchement des pathologies
auto-immunes, l’ignorance ne peut être considérée comme un mécanisme
d’induction de tolérance à part entière. En effet, les cellules T autospécifiques, ni
éliminées, ni anergisées, demeurent physiquement et fonctionnellement présentes
au sein du répertoire T périphérique.
•
L’anergie
Les cellules dendritiques immatures présentes dans les organes lymphoïdes
secondaires et les tissus périphériques induisent l’anergie des LT qu’elles
rencontrent par l’absence des molécules de co-stimulation CD80 et 86 à leur surface
(186, 187). En effet, l’interaction avec CD28 induit l’hétérodimère AP-1 (activator
protein 1), qui se complexe avec le facteur de transcription NFAT (nuclear factor of
activated T cell), activé par la signalisation calcique soutenue qui suit l’engagement
du TCR. Un programme transcriptionnel alternatif est accompli par NFAT en absence
59
d’AP-1, conduisant à l’incapacité du LT d’engager une réponse proliférative, de
produire de l’IL-2 ou de se différencier, et à la synthèse d’IL-10 (188). Les cellules
dendritiques immatures expriment par ailleurs PD-L1 (program death ligand 1), une
molécule de co-stimulation inhibitrice dont le récepteur est exprimé par les LT et LB
activés (189). PD-L1 est également présent sur des cellules non lymphoïdes, comme
les cellules β des îlots de Langherans, les cellules gliales ou placentaires.
L’interaction PD-1/PD-L1 inhiberait la prolifération et la sécrétion de cytokines. Un
autre rétrocontrôle négatif est l’induction de CTLA-4 à la surface des LT après
stimulation (190). Son affinité supérieure à celle de CD28 pour CD80/86 permet de
passer d’une signalisation activatrice à inhibitrice et de limiter l’expansion et l’activité
des clones T engagés dans la réponse.
•
La délétion
La manière la plus évidente pour neutraliser les clones autoréactifs, restent
leur élimination physique. Un tel mécanisme, déjà utilisé lors de la tolérance centrale
au niveau du thymus, a été démontré en périphérie par l’équipe de Heath (182).
Ainsi, ils ont développé un modèle expérimental dans lequel des lymphocytes T OT1, exprimant un TCR transgénique spécifique de l’ovalbumine, se développent chez
un hôte transgénique exprimant de façon constitutive dans le pancréas et le rein, une
forme membranaire de la protéine. Afin d’éviter une délétion au niveau centrale, le
thymus de ces souris est remplacé par celui d’une souris syngénique et non
transgénique. Dans ce modèle, les cellules T arborant le TCR transgénique sont
sélectionnées positivement dans le thymus et émigrent, de façon continue dans la
périphérie. Dans les ganglions drainant les reins et le pancréas, elles vont alors
interagir avec les cellules dendritiques qui cross-présentent l’autoantigène. Pourtant,
malgré leur activation, ces souris ne développent aucune pathologie auto-immune.
La raison en est qu’après quelques cycles de prolifération, ces cellules autoréactives
entrent en apoptose. La cross-présentation d’antigène tissulaire par les cellules
dendritiques peut donc permettre la tolérisation, par induction d’apoptose, des
lymphocytes T autospécifiques.
L’une des voies principales impliquée dans cette apoptose dépend de
l’interaction du récepteur de mort Fas (CD95), exprimé à la surface du lymphocyte,
avec son ligand (FasL). L’importance de cette voie est suggérée par l’analyse des
animaux déficients pour l’une ou l’autre des molécules. En effet, les souris CD95-/(lpr/lpr) et CD95L-/- (gld) développent une pathologie auto-immune proche du lupus
érythémateux (191, 192). De même, un défaut dans la voie Fas est associée chez
l’Homme à un syndrome auto-immun lymphoprolifératif (193, 194).
60
•
La déviation phénotypique
En détournant la réponse immune vers une réponse peu agressive ou
inadaptée, la déviation phénotypique permet à certains tissus de se préserver d’une
inflammation dangereuse.
Ainsi, dans le modèle de l’EAE (« Encéphalomyélite Autoimmune
Expérimentale »), représentatif de la sclérose en plaque chez l’Homme, des cellules
Th1, spécifiques d’autoantigènes constituant la gaine de myéline (dont MBP, pour
« Myelin Basic Protein »), sont responsables de la pathologie. A l’inverse, des
lymphocytes de la même spécificité, mais polarisés Th2, sont incapable d’initier la
maladie et peuvent même inhiber l’action des cellules Th1. De plus, dans des
modèles de souris transgéniques, la présence de cellules T spécifiques d’un peptide
dérivé de MBP ne suffit pas à induire une EAE si l’enzyme RAG n’est pas inactivée,
et donc si des cellules T endogènes non transgéniques sont générées. Ces résultats
suggèrent fortement que le potentiel autodestructeur de lymphocytes T peut être
contrôlé par des cellules de spécificité et/ou de polarisation différente. Ainsi, dans un
modèle d’EAE, une réponse immune dirigée contre un antigène bactérien peut
inhiber les conséquences morbides d’une réponse auto-immune, en induisant la
déviation de la polarisation de Th1 vers Th2 (195). Sous l’influence de la réponse
antibactérienne, l’environnement cytokinique dans lequel sont activées les cellules T
autospécifiques est modifié. Aussi, malgré la pleine activation de ces cellules, leur
mauvaise polarisation aboutit à une réponse abortive. Cette déviation de la réponse
est couramment utilisée comme mécanisme d’échappement par les cellules
tumorales et les agents infectieux qui favorisent une réponse inadaptée à leur
élimination (196, 197).
Les cytokines présentes dans le milieu, en influençant directement
l’expression des molécules d’adhésion et des récepteurs aux chimiokines à la
surface des lymphocytes T, peuvent également moduler le trafic des lymphocytes T
et ainsi contrôler les cellules accessoires avec lesquelles ils vont interagir. En
réponse à une stimulation tolérogène, les cellules T CD4 autospécifiques qui sont
activées et prolifèrent, sont en revanche incapables de migrer dans les zones
folliculaires des organes lymphoïdes secondaires pour y délivrer une aide efficace
aux cellules B (195). L’entrée dans cette zone est en effet dépendante de CXCR5
dont l’expression optimale est associée à l’engagement de CD28 (198).
D’autres travaux ont suggéré l’importance, dans la tolérance au soi, d’une
distribution anatomique précise des lymphocytes. Ainsi, dans un modèle murin, il a
été montré qu’une expression aberrante de CXCL13 (la chimiokine reconnue par
CXCR5) par les cellules dendritiques peut aboutir au développement d’un lupus
auto-immun (199).
61
2. Tolérance active
La tolérance active implique de nombreuses sous-populations de cellules du
système immunitaire qui vont, de par leurs propriétés immunosuppressives, inhiber
l’activation et/ou les fonctions effectrices des lymphocytes autospécifiques.
1. Les cellules dendritiques tolérogènes
S’il est possible de rendre tolérogènes des cellules dendritiques comme nous
l’avons vu dans le chapitre sur les nouvelles thérapies en transplantation, certaines
sont naturellement capables de concourir à la tolérisation des lymphocytes T. Ainsi,
les cellules dendritiques immatures peuvent produire du TGB-β (200), une cytokine
immunosuppressive qui inhibe la prolifération des cellules T et qui maintient les
cellules dendritiques dans leur état immature. A l’état mature, elles peuvent
également participer à la tolérance. Ainsi, le maintien de l’homéostasie des
muqueuses passe par l’induction de cellules dendritiques tolérogènes, souvent
productrices d’IL-10. La génération de ces cellules peut par exemple être obtenue
par l’administration intra-nasale d’un antigène (201).
Les cellules dendritiques peuvent également conduire à l’induction de
lymphocytes régulateurs. Les cellules dendritiques, caractérisées par l’expression du
marqueur CD103, y contribuent par le biais de l’acide rétinoïque (202, 203) tandis
qu’il a été montré que les cellules dendritiques plasmacytoïdes matures, à la suite de
la stimulation du TLR9 (Toll-Like Receptor) induisent en culture des lymphocytes T
régulateurs CD4+ Foxp3+ fonctionnels (Tregs) (204). De façon intéressante, le
groupe de Blomberg a observé que lors d’une allogreffe cardiaque, les cellules
dendritiques plasmacytoïdes capturent les alloantigènes, migrent vers les nœuds
lymphatiques drainants et y génèrent des Tregs (205). Dans les animaux rejetant la
greffe, ces cellules sont retrouvées uniquement dans la rate, et l’inhibition de la
migration des cellules dendritiques plasmacytoïdes vers les ganglions inhibent la
tolérance mise en place par le conditionnement du donneur (DST et anti-CD40). Le
fait que ces cellules dendritiques tolérogènes ne soient retrouvées que dans la rate
reste inexpliqué : s’agit-il d’un sous-type cellulaire ou les nœuds lymphatiques
constituent-ils un environnement conditionneur ?
Une population proche des cellules dendritiques plasmacytoïdes, caractérisée
par l’expression de CD19, présente la capacité de produire, suite à la stimulation
avec TLR9 (206) ou à l’interaction avec CTLA-4 porté par les Tregs (207), l’IDO. Ceci
conduit à l’arrêt de la prolifération des lymphocytes T, voire leur mort.
62
2. Les lymphocytes NKT
Les cellules NKT constituent une population distincte des lymphocytes T et ont
été définie sur l’expression de récepteurs habituellement exprimés par les cellules
NK. Ces cellules se divisent en trois groupes, le plus représenté étant celui de iNKT
(invariant NKT), qui arborent un répertoire très restreint, la majorité exprimant le TCR
Vα14Jα18 pour la souris et Vα24/Jα18 pour l’Homme. Ce TCR est spécifique des
glycolipides présentés par la molécule de CMH non classique, CD1d. Les deux
autres groupes minoritaires comprennent les NKT de type II, qui sont restreintes à
CD1d mais montrent un panel de TCR plus varié, et les NKT de type III qui ne sont
pas restreintes à CD1d.
Bien que leur contribution à l’auto-immunité et à l’inflammation soit fermement
établie, plusieurs études ont montré qu’elles pouvaient participer à la régulation de la
réponse. La souris NOD (Non Obese Diabetic) présente en effet un défaut en
cellules iNKT. Le transfert adoptif de ces cellules (208), ou l’expression forcée de
Vα14/Jα18 (209), ont un effet bénéfique sur le diabète. Chez l’Homme, une
corrélation a été établie entre une diminution des iNKT dans le sang périphérique et
l’auto-immunité (210). De plus, un biais Th2 a été observé dans les cytokines
produites par des iNKT isolées du sang de patients en rémission de leur sclérose en
plaques par comparaison aux patients en rechute ou aux sujets sains (211). L’effet
protecteur des cellules NKT passe par la production d’IL-10 et d’IL-4 et pourrait en
outre participer à l’homéostasie et à la génération périphérique des Tregs (212).
3. Les lymphocytes T CD8
L’existence de LT CD8+ suppresseurs (Ts) fut longtemps controversée. Malgré
l’observation en 1978 par Cantor et al. de l’existence de cellules induites par contact
avec des lymphocytes T CD4+, par le biais de la molécule de CMH de classe I non
classique Qa-1 218 (213), il fallut attendre l’identification des Tregs pour que les
investigations sur les Ts reprennent.
La découverte que des souris invalidées pour le gène de CD8 présentaient
une tendance significative à développer une pathologie chronique dans le modèle de
l’EAE par le groupe de Mak fut la première à relancer l’intérêt pour ces cellules,
jusque là oubliées (214). Par la suite, il a été montré dans un modèle murin d’EAE,
que les LT CD8+ CD28-, contrairement à leur contrepartie CD28+, inhibent, sans
préstimulation, l’activation et l’expansion clonale de lymphocytes T CD4 Th1
encephalitogènes. De plus, leur transfert protègent de l’induction de l’EAE (215).
Ménager-Marcq et al. ont obtenu des résultats similaires dans le modèle de la colite
avec des cellules CD8+CD28- naturelles (216). Les mécanismes d’action de ces
cellules sont multiples puisqu’elles sont efficaces in vitro en absence de CPAs, ce qui
implique un contact direct, et que leur fonction in vivo dépend de leur aptitude à
sécréter des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et TGF-β. Chez l’Homme, un défaut
spécifique d’activité régulatrice des LT CD8+ a été mis à jour chez les patients
63
souffrant de maladies inflammatoires chroniques des intestins (217), suggérant ainsi
l’implication des Ts dans l’homéostasie intestinale.
D’autres sous-populations de Ts ont depuis été caractérisées. Ainsi, les
cellules T CD8αα+ représentent la moitié des lymphocytes T intraépithéliaux chez la
souris (218). Ces cellules présentent un développement particulier qui, s’il
commence bien au niveau du thymus comme les autres populations T, se termine en
dehors, probablement au niveau intestinal. Leur fonction régulatrice a été rapportée
dans le contrôle des infections et de l’inflammation de l’intestin par la
reconnaissance, via le TCR ou les récepteurs NK co-exprimés à leur surface, de
molécules du soi modifiées ou inductibles par le stress ou l’inflammation. De plus,
une étude réalisée dans le modèle expérimental de la colite chez des souris immunodéficientes, montre que ces cellules protègent les souris contre le développement de
la colite. Cependant, pour se faire, les auteurs utilisent des ratios de cellules
transférées très nettement en faveur des cellules régulatrices ce qui laisse à penser
que la véritable population régulatrice n’a toujours pas été identifiée parmi les
lymphocytes T CD8αα+. À l’inverse des modèles murins, chez l’Homme, seuls des
LT CD8αα+ γδ ont pu être mis en évidence au sein de l’épithélium intestinal (219). En
revanche, des lymphocytes T CD8αβ+ exprimant des récepteurs NK ont été
retrouvés et semblent jouer un rôle identique aux cellules CD8αα+. Dans certaines
conditions, ils acquièrent des capacités lytiques pour éliminer des cellules
épithéliales exprimant des stimuli de stress, ce qui participerait à la limitation du
développement de cellules tumorales.
Chez la souris, une nouvelle sous-population régulatrice, les lymphocytes T
CD8+ CD122+, a été récemment identifiée. Ces cellules possèdent des propriétés
suppressives en culture et leur absence in vivo entraîne un désordre hyperprolifératif
(220).
Enfin, une dernière population de Ts naturelles a été décrite chez le Rat et
chez l’Homme, et est caractérisée par une faible expression de CD45RC et une
fonction suppressive passant par le contact (221). Ces cellules ont démontré leurs
capacités régulatrices dans le cadre de l’alloréactivité.
4. Les lymphocytes Tr1
Les lymphocytes Tr1 sont caractérisés par leur capacité à sécréter de grandes
quantités d’IL-10. Générés en présence de cette même cytokine, ils ne possèdent
aucun marqueur de surface propre. Leur identification se fait donc grâce à leur profil
cytokinique particulier, à savoir la production d’IL-10 et de TGF-β mais pas d’IL-4, à
l’absence d’expression constitutive de Foxp3, bien qu’elle puisse être induite après
stimulation comme chez les lymphocytes T CD4+CD25- humains (222), et à la
présence sélective de ROG (repressor of GATA-3), par ailleurs retrouvé chez les LT
64
CD4+ activés (223). Il a également été mis en évidence des LT CD8+ Tr1 aux
propriétés similaires à la population CD4+.
Les Tr1 peuvent être induits in vitro et in vivo à partir de LT naïfs ; mais parce
qu’ils peuvent parfois produire de l’IFN-γ ou de l’IL-5, il a été proposé que les Tr1
puissent également dériver de LT Th1 ou Th2 par stimulation chronique (224). La
génération en culture des Tr1 nécessite une stimulation antigénique et de l’IL-10,
toutefois ces deux signaux ne semblent pas suffisants pour obtenir une
différenciation complète (225). L’apport d’IFN-α (225) ou l’engagement de CD2
(222), CD46 (226) ou CD45RO/RB (227) amplifieraient considérablement la
conversion. In vivo, ces cellules peuvent être générées chez des sujets sains par le
biais d’une injection de cellules dendritiques immatures chargées d’un peptide du
virus influenza (228). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes ont aussi l’aptitude de
polariser des cellules T CD4+ et CD8+ en Tr1 (229, 230). Cependant, les CPAs les
plus efficaces dans la génération de Tr1 restent les cellules dendritiques myeloïdes
tolérogènes, elles-mêmes induites en présence d’IL-10 (231), de TGF-β (232), de
TNFα (233), du peptide immunosupresseur VIP (234), de vitamine D3 et/ou
dexaméthasone (114).
Les lymphocytes Tr1 présentent ainsi des capacités suppressives dont le rôle
dans le contrôle de l’inflammation et de l’auto-immunité a été décrit in vivo. Ainsi, des
Tr1 ont été isolés du liquide synovial de patients atteints d’arthrite rhumatoïde, leur
fréquence basse étant inversement corrélée à celle des cellules Th1 (235). Les Tr1
sont par ailleurs capables d’inhiber le développement de la colite induite par le
transfert de LT CD4+CD45RBhi (236). En outre, des clones de Tr1 spécifiques de la
gliadine, l’élément immunogénique du gluten, ont été isolés de la muqueuse
intestinale de patients cœliaques en rémission (237). Les Tr1 semblent de surcroît
revêtir une importance particulière dans l’allergie : il a été mis en évidence qu’ils
représentent la sous-population dominante parmi les cellules spécifiques pour les
allergènes environnementaux les plus communs chez les individus sains (238). Le
groupe de Hawrylowicz a de plus montré que l’effet bénéfique des glucocorticoïdes
dans l’asthme était partiellement dû à la conversion de Tr1, et que l’administration de
vitamine D3 restaurait cette génération chez des patients résistants aux stéroïdes
(239).
Enfin, les capacités régulatrices de Tr1, ainsi que leur facilité de génération, a
conduit au développement de thérapies. Dans le domaine de la transplantation, leur
utilisation a paru tout indiqué en raison de nombreuses données corrélant la
tolérance du greffon avec la présence de cellules productrices d’IL-10 (223). Un
premier essai clinique de transfert de Tr1 est mené en Italie par Maria Grazia
Roncarolo dans le cadre de la prévention de la maladie du greffon contre l’hôte
(240). Une génération in vivo par une combinaison de rapamycine et d’IL-10 serait
également possible chez la souris et permettrait d’établir une tolérance à long terme
à une allogreffe d’îlots pancréatiques (241).
65
Les cellules immunitaires, présentant des propriétés régulatrices et chargées
d’assurer en périphérie la tolérance, sont nombreuses et diverses. Régulièrement, de
nouvelles populations sont découvertes. Pour autant, la plus décrite à l’heure
actuelle reste sans conteste les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+.
66
LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+Foxp3+ (TREGS)
A. MISE EN EVIDENCE ET CARACTERISATION DES TREGS
1. Mise en évidence des Tregs
En 1969, alors qu’ils tentent de statuer sur le rôle du thymus dans le système
immunitaire, Nishizuka et Sakahura réalisent des thymectomies néonatales de
souriceaux (242, 243). Ils se rendent alors compte que chez des femelles dont
l’ablation a été réalisée 3 jours après la naissance, les ovaires s’atrophient puis
dégénèrent dans les mois qui suivent l’opération. Dans ce modèle, l’analyse
histologique montre clairement que les signes cliniques observés ne sont pas
imputables à un simple défaut hormonal, comme cela avait été suggéré dans des
travaux antérieurs. Contrairement à ce qui est observé chez des animaux ayant subi
une ablation de l'hypophyse, les ovaires ne présentent pas simplement un blocage
ou un retard dans leur développement. Ils subissent une attaque, une agression qui
aboutit à la destruction des follicules. Un phénotype analogue est observé quatre ans
plus tard chez des rats Wistars thymectomisés à l’âge adulte et irradiés souslétalement à plusieurs reprises (244). Dans les semaines suivant le conditionnement,
une destruction de la thyroïde consécutive à une infiltration de cellules mononuclées
est observée. Dans les deux cas, la greffe d’un thymus syngénique ou le transfert de
lymphocytes T, en particulier de cellules CD4+, permet de protéger les animaux de
ces pathologies (245, 246). Ces résultats suggèrent pour la première fois, l’existence
d’une sous-population de cellules T suppressives qui aurait pour rôle de contrôler en
périphérie le compartiment lymphocytaire T autospécifique.
Pendant de longues années, de nombreuses équipes ont essayé dans
différents modèles de mieux caractériser, phénotyper et isoler cette sous-population
lymphocytaire suppressive. Elles ont rencontré de nombreuses difficultés ainsi qu’un
scepticisme d’une partie de la communauté scientifique allant jusqu’à remettre en
cause l’existence même d’une telle sous-population de cellules ayant des propriétés
régulatrices, du fait du manque de marqueurs réellement spécifiques et du flou
autour de leurs mécanismes d’action.
67
68
2. Les premiers marqueurs
Depuis les expériences de 1969, aucune avancée majeure n’est faite au sujet
des Tregs. A tel point que certains commencent à douter de l’existence d’une
population régulatrice. Ce n’est qu’en 1981 que Sakaguchi et al. ont amené de
nouvelles évidences dans la caractérisation de cette population lymphocytaire
suppressive. Toujours en utilisant le modèle murin de thymectomie néonatale, ils ont
montré que le transfert de splénocytes pouvait prévenir le développement d’une
ovarite auto-immune chez la souris en montrant que la population cellulaire
responsable de la protection pouvait être restreinte par le phénotype suivant : T CD4+
CD5high (ou Lyt-1high) (246). CD5 est une glycoprotéine transmembranaire,
exprimée fortement par les lymphocytes T activés, qui antagonise la signalisation en
aval du récepteur à l’antigène chez les cellules T et B. De façon intéressante, cette
molécule permet aussi de définir une sous-population de lymphocytes B, appelée
cellules B1, jouant un rôle « immunomodulateur » (247).
Pour tester l’hypothétique fonction suppressive des différentes souspopulations de cellules T CD4+, la stratégie gagnante fut dès lors d’essayer de créer
une brèche dans la tolérance en déplétant les sous-populations soupçonnées d’être
régulatrices puis de vérifier que la reconstitution du compartiment éliminé permettait
d’inhiber l’apparition et le développement d’un syndrome auto-immun. En utilisant
cette démarche, l’équipe de Shimon Sakaguchi a confirmé en 1985 les résultats
obtenus 3 ans plus tôt (248). Ces auteurs ont montré que l’élimination ex vivo des
cellules T CD4+CD5+ permet l’induction, par la population CD4+CD5- résiduelle, d’une
pathologie auto-immune multi-organes après transfert dans des souris nude
congéniques. L’injection de cellules T CD4+CD5high suffit à prévenir le développement
de la pathologie.
Suivant cette logique, l’effort de recherche s’est concentré sur la capacité à
pouvoir mieux disséquer cette population régulatrice du compartiment effecteur
autologue, de nombreux marqueurs ont donc été proposés afin de mieux l’identifier.
CD45RB (protéine tyrosine phosphatase exprimée par la quasi-totalité des cellules
d’origines hématopoïétiques) a été proposé par Powrie et al. en 1990. Ils ont montré
que l’injection de la sous-population T CD4+CD45RBhigh à des rats congéniques
athymiques induit une pathologie sévère s’accompagnant d’une perte de poids et
d’une infiltration massive de cellules dans de nombreux organes. A l’inverse, le
transfert adoptif de la fraction cellulaire T CD4+ CD45RBlow n’est pas pathogéne, les
animaux continuant à gagner du poids normalement. De façon encore plus
surprenante, le transfert de lymphocytes T CD4+ totaux n’est associé qu’à une
morbidité mineure (249, 250). Même quantitativement minoritaire, la population T
CD4+ CD45RBlow est donc capable de contrôler la population effectrice T CD4+
CD45RBhigh. En 1993, Powrie et al. et Morrissey et al. ont montré simultanément que
le transfert de lymphocytes T CD4+ CD45RBhigh à des souris SCID (severe combined
immunodeficiency) induit le développement d’une pathologie inflammatoire et autoimmune au niveau des muqueuses intestinales, l’IBD (Inflammatory Bowel Disease).
L’injection de la fraction autologue T CD4+ CD45RBlow ou bien la co-injection des
fractions T CD4+ CD45RBhigh et T CD4+ CD45RBlow n’induit pas l’IBD (251, 252).
69
L’inconvénient principal de ces marqueurs est qu’ils englobent encore des
populations cellulaires trop importantes pour permettre vraiment de distinguer
précisément les populations T régulatrice et effectrices. Les lymphocytes T CD4+
CD45RBlow représentent en effet entre 25 et 30% des lymphocytes T CD4+ totaux
chez une souris naïve (253).
C’est en 1995 que Sakaguchi et son équipe identifient une population douée
de propriétés immunoregulatrices, caractérisée par l’expression constitutive de
CD25. Un grand pas est alors franchi puisque ce marqueur permet réellement de
différencier, au moins fonctionnellement, la population de lymphocytes T CD4+
régulateurs des autres populations T. En effet, le compartiment T CD4+ CD25+
régulateur (Tregs) qui constitue entre 5 et 10% des lymphocytes T CD4+ totaux chez
une souris naïve ainsi que chez l’homme constitue une population cellulaire
prévenant le développement de pathologies auto-immunes dans des modèles de
transferts adoptifs comme ceux décrits précédemment (254). De plus, l’élimination
des cellules CD4+ CD25+ permet d’exacerber des réponses allogéniques ou
xenogéniques. Ce travail a conforté des résultats publiés en 1990 qui suggéraient
l’existence d’une population « suppressive » au sein du compartiment CD4+ CD25+
dans un modèle d’allogreffe cardiaque chez le rat (255). Ces auteurs avaient en effet
mis en évidence, qu’après traitement des animaux receveurs avec de la
cyclosporine, le système immunitaire des rats qui toléraient à long terme l’organe
allogénique contenait une population CD4+ CD25+ incapable de rejeter le greffon
après transfert dans un hôte lymphopénique. Mieux, ces cellules avaient la capacité
d’inhiber le rejet induit par des lymphocytes T effecteurs naïfs, ou présensibilisés par
des alloantigènes.
La caractérisation de ces cellules régulatrices a aussi permis d’expliquer les
mécanismes sous-jacents dans le modèle de thymectomie néonatale. Une étude
cinétique a en effet mis en évidence que la population CD4+ CD25+ n’apparaît dans
les organes lymphoïdes périphériques que 4 à 5 jours après la naissance (256).
Dans ce travail, les auteurs ont également montré que la reconstitution de ce
compartiment suppresseur permet de prévenir la pathologie. Ainsi, la thymectomie à
J+3 a pu être étroitement associée à l’absence de génération des lymphocytes T
CD4+CD25+ et l’absence de développement de ces cellules régulatrices à l’apparition
d’auto-immunité.
Toutefois, le marqueur CD25, étant exprimé par les lymphocytes T activés,
n’est, tout comme les précédents, pas spécifique du compartiment régulateur. La
quête pour un marqueur unique a donc continué et a permis de mettre en évidence
l’expression d’autres marqueurs, tels CTLA-4 (257, 258) et GITR (GlucocorticoidInduced Tumor necrosis factor Receptor family-related gene) (259). Cependant, ces
derniers sont eux-aussi exprimés par les lymphocytes T conventionnels après
activation.
70
3. La découverte de Foxp3
En 1982, une étude de cas clinique portant sur un patient dont dix-sept
enfants de sexe masculin dans la famille sont morts durant la première année de vie,
permet de mettre en évidence un syndrome jusque là inconnu. Les analyses et les
informations recueillies auprès de huit patients ont permis de décrire un nouveau
syndrome, l’IPEX (Immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy-X-linked
syndrom), dépendant d’une mutation récessive située sur le chromosome X. Un
tableau clinique complet a été dressé. Il associe des diarrhées, un diabète de type 1,
une anémie hémolytique, des poussées d’eczéma, une réponse antivirale
exagérées, le tout combiné avec des évidences de manifestations auto-immunes
conduisant à la destruction des glandes endocrines, comme la thyroïde. L’évaluation
fonctionnelle du système immunitaire chez ces patients a révélé des anomalies dans
le fonctionnement du compartiment T (260). De plus, chez ces patients, le niveau des
IgE circulantes peut-être très élevé et associé à une augmentation des éosinophiles,
évidences indiquant une déviation du répertoire T CD4+ vers un lignage Th2 (261).
Il faudra attendre 2001 pour qu’une mutation dans le gène codant pour le
facteur de transcription Foxp3 soit identifiée comme cause du développement de
l’IPEX (262, 263). En parallèle de ces données obtenues chez l’homme, un modèle
de souris Scurfy présentant des mutations perte de fonctions situées sur le
chromosome X dans le gène codant pour le facteur de transcription Foxp3 et
développant un syndrome auto-immun lymphoprolifératif apparenté à l’IPEX sur le
plan clinique a permis de mieux comprendre l’importance de Foxp3 pour le système
immunitaire. Les souris scurfy mâles meurent aux environs de trois à quatre
semaines de vie suite à l’apparition de pathologies auto-immunes multi-organes avec
présence de forts infiltrats lymphocytaires (263-266). Cependant, ce n’est qu’en 2003
que le lien entre le défaut génétique et le comportement anormal du répertoire T a
été établi. Trois groupes ont alors montré simultanément que Foxp3 était
spécifiquement exprimé par les Tregs (267-269). De plus, en utilisant un modèle de
KO conditionnel, l’équipe de Rudensky a établi que l’expression de ce facteur de
transcription par les cellules régulatrices est indispensable à leur développement
intrathymique (269, 270). En accord avec ce travail, un nombre accru de cellules T
CD4+ CD25+ a été mis en évidence chez des souris surexprimant Foxp3 (267). Ces
résultats suggèrent donc que chez les patients atteints d’IPEX, comme chez les
souris Scurfy, le phénotype observé n’est pas associé à une défaillance intrinsèque
aux cellules effectrices mais plutôt à un défaut de génération du compartiment
régulateur. Confirmant cette hypothèse, le transfert néonatal de cellules T CD4+
CD25+ dans les souris Scurfy prévient l’apparition et le développement du syndrome
auto-immun.
Des travaux récents du groupe de Roncarolo ont permis de préciser un peu
l’impact de cette mutation pour la population de Tregs chez des patients IPEX (271,
272). Ainsi l’analyse du sang périphérique chez les patients IPEX a mis en évidence
que le nombre de cellules T CD4+ CD25high en périphérie est identique à celui obtenu
à partir de prélèvements de donneurs sains. Des tests fonctionnels in vitro montrent
que les lymphocytes T CD4+ CD25high de ces patients IPEX (Foxp3- ou Foxp3+) ont
71
une altération importante de leur potentiel suppresseur sur des effecteurs T
autologues. Il en est de même chez les souris Scurfy où les rares cellules CD4+
CD25+ retrouvées en périphérie sont incapables, in vitro, d’inhiber la prolifération de
cellules CD4+ suite à une stimulation polyclonale (267). De plus, des cellules CD4+
naïves, chez lesquelles l’expression constitutive de Foxp3 a été induite par infection
rétrovirale, sont susceptibles, in vitro d’inhiber la prolifération de cellules effectrices
et, in vivo, d’inhiber la colite ou la gastrite auto-immune induite chez des souris SCID
par injection de cellules T CD45RBhigh (269, 273).
Récemment, le groupe de Rudensky a généré, par Knock-In, une souris
transgénique exprimant une protéine de fusion GFP-Foxp3 (270). Outre la possibilité
d’identifier et de suivre facilement le développement des cellules Foxp3+, cette
approche a également permis de montrer qu’il n’y a pas de corrélation stricte entre
son expression et celle de CD25. En réalité, seuls 80% des cellules Foxp3+ sont
CD25+. Ainsi l’induction d’un syndrome auto-immun mineur suite à la déplétion des
cellules T CD25+ chez des animaux non manipulés peut sans doute s’expliquer par la
capacité des lymphocytes T Foxp3+ CD25- et/ou Foxp3+ CD8- à compenser le déficit.
A l’inverse, Lahl et al. ont montré de manière élégante en 2007, que la déplétion des
Tregs in vivo dans une souris nouveau-née est suffisante pour conduire au
développement de symptômes équivalents à ceux observés chez une souris Scurfy
(splénomégalie, lymphoadénopathie, diabète de type 1 et une sévère inflammation
cutanée) (274). Pour cela, ils ont généré une souche de souris DEREG (Depletion of
regulatory T cell) exprimant un récepteur à la toxine diphtérique (DTR) couplé à la
GFP (Green Fluorescent Protein), le tout sous le contrôle du locus génique de
Foxp3. Cela permet de visualiser de manière précise à la fois la présence de Tregs
par un double marquage en cytométrie en flux (Foxp3/GFP) ainsi que leur déplétion
après injection aux animaux, de toxine diphtérique (absence de cellules Foxp3+
GFP+).
Le facteur de transcription Foxp3 est donc le marqueur qui a permis
d’identifier de manière précise les Tregs et reste aujourd’hui, un des marqueurs les
plus fiables, même si chez l’Homme, son expression peut être induite chez des
lymphocytes T activés. Cependant, au vu du très large potentiel que ces cellules
pourraient avoir en clinique humaine, il est important de pouvoir trouver d’autres
marqueurs de surface afin de pouvoir les isoler sans avoir une population effectrice
contaminante trop importante au sein de la fraction cellulaire triée. La recherche
« du » marqueur se poursuit donc.
4. Les nouveaux marqueurs
En 2006, deux groupes ont parallèlement mis en évidence que les Tregs CD4+
CD25+ Foxp3+ n’exprimaient que faiblement CD127, la chaîne α du récepteur à l’IL7, alors que les lymphocytes T effecteurs activés (CD25+) ou non activés (CD25-)
étaient CD127high (275, 276). Des analyses moléculaires par CHiP (puces à ADN)
suggèrent que le promoteur du gène codant pour CD127 est une cible pour le facteur
de transcription Foxp3. De plus la surexpression de Foxp3 dans une souris
72
transgénique conduit à une population de cellules exprimant de manière homogène
CD127low et possédant des propriétés suppressives (275). Les cellules T
effectrices/mémoires et naïves CD4+ CD25+ CD127low présentent toutes deux des
propriétés suppressives lors de tests fonctionnels in vitro au contraire des cellules T
CD4+ CD25+ CD127high qui ne possèdent aucune activité suppressive. CD127
semble donc au final un très bon marqueur de surface permettant d’identifier et
d’isoler en combinaison avec CD25 des populations pures de Tregs chez des
individus sains ou bien chez des patients atteints de diabète de type 1 (275) pour des
études in vitro ou pour d’éventuelles stratégies de thérapies cellulaires.
Enfin, en 2007, le groupe de Sakaguchi a identifié chez la souris un nouveau
marqueur de surface FR4 (Folate Receptor 4), un sous-type de récepteur à l’acide
folique, exprimé fortement et constitutivement sur les Tregs CD4+ CD25+ CD127low
Foxp3+. Ce marqueur permet aussi de distinguer entre Tregs (CD4+ CD25+ FR4high)
et T conventionnels activés (CD4+ CD25+ FR4low). L’élimination in vivo chez la souris
des lymphocytes T CD4+ FR4high avec des anticorps déplétants conduit, suivant la
dose administrée soit, à forte dose, au développement de pathologies auto-immunes
soit, à faible dose et si la souris porte une tumeur, à une régression de la masse
tumorale. De plus, la surexpression rétrovirale de Foxp3 dans des lymphocytes T
CD4+ conduit à un phénotype FR4high suggérant ainsi que Foxp3 contrôle le niveau
d’expression de FR4 (277).
B. ORIGINE, DEVELOPPEMENT ET HOMEOSTASIE DES TREGS
1. Origine thymique
L’origine thymique des lymphocytes T CD4+ CD25+ fut soupçonnée dès les
expériences de thymectomie néonatale (243). La découverte de cellules CD4+ CD8CD25+ dans le thymus, présentant les mêmes caractéristiques phénotypiques et
fonctionnelles que leur contrepartie périphérique (278), confirma les premières
hypothèses, suggérant même que la population CD4- CD8- formait un précurseur
commun aux cellules conventionnelles et régulatrices. Il fut démontré par la suite que
les thymocytes régulateurs exprimaient en outre Foxp3 (268).
2. Développement des Tregs
Le thymus contribue donc à l’induction de tolérance du soi en inactivant ou en
éliminant les cellules autospécifiques du compartiment T effecteur et en générant,
naturellement, les cellules T régulatrices. Pourtant, cette origine thymique des Tregs
soulève la question de leur développement. Comment un même organe parvient-il à
assurer la génération et la sélection de deux populations de lymphocytes T aux
73
fonctions totalement opposées ? Existe-t-il des signaux spécifiques, non
conventionnels, qui dirigent le comportement de la cellule en cours de maturation ?
5. Les Tregs subissent la sélection thymique
La nécessité d’une interaction entre le TCR exprimé à la surface des Tregs et
les complexes CMH/peptide a été mise en évidence à de multiples reprises. En
2001, Bensinger a montré que l’expression des molécules du CMH de classe II
uniquement par les cTEC est nécessaire et suffisante au développement de cellules
T régulatrices pleinement fonctionnelles (279). Par ailleurs, la mesure en absence de
délétion clonale de la proportion de cellules spécifiques pour les superantigènes
endogènes exprimés par l’épithélium thymique, fait apparaitre que la sélection
positive des Tregs est augmentée (280). En outre, quand un seul couple CHM
II/peptide est exprimé uniquement dans le cortex, les Tregs spécifics pour le ligand
sont préférentiellement sélectionnés parmi le large répertoire des précurseurs
immatures (281). Comme sa contrepartie CD25-, le compartiment CD25+ est donc
sélectionné positivement et cette sélection vis-à-vis d’autoantigènes serait accrue par
rapport aux cellules conventionnelles.
Après leur sélection positive au niveau du cortex, les Tregs semblent subir
également une sélection négative efficace. Ainsi, Paola Romagnoli a analysé et
comparé le répertoire Vβ chez des thymocytes CD25+ et CD25- isolés à partir
d’animaux exprimant ou non Mtv 1, 6, 7, 8, 11, 13, 14 et 17. Elle a ainsi pu montrer
que le compartiment régulateur présente la même sensibilité à la délétion médiée par
des superantigènes endogènes à surface des cellules dendritiques (279, 282, 283).
L’implication des mTEC dans le développement des Tregs reste plus incertaine.
Anderson et al. ont démenti l’hypothèse que l’expression d’AIRE fût la source d’une
sélection positive des Tregs, son absence ne modifiant pas leur développement ni
leur fonctionnalité (284). Toutefois, l’équipe de Aschenbrenner a montré qu’une
absence de molécules du CMH II à la surface des mTECs induit une réduction de
Tregs polyclonaux. De plus, l’expression de l’antigène HA uniquement à la surface
des mTECs AIRE+, mimant ainsi l’expression ectopique d’antigènes par AIRE,
conduit à la génération importante de Tregs spécifiques (285).
6. Le choix de lignage
Au cours des différentes études cherchant à découvrir l’origine des cellules
régulatrices, deux modèles se sont peu à peu imposés et s’opposent aujourd’hui : les
modèles « instructif » et « sélectif ». Le point de départ des deux repose sur
l’interprétation de différents travaux portant sur les interactions de forte affinité du
TCR des cellules régulatrices avec un complexe CMH/ligand agoniste.
74
Ainsi, en 1999, l’équipe de Sakaguchi a montré, dans des souris DO11.10
dont le TCR transgénique est spécifique de l’ovalbumine, qu’en l’absence
d’expression du ligand du TCR par le stroma thymique, environ 3% des cellules T
CD4+ qui se développent sont CD25+ (278). Contrairement aux cellules CD25-, ces
cellules expriment en majorité une chaine TCRα endogène. De plus, lorsque des
souris DO11.10 sont générées sur fond génétique RAG2-/-, un développement
normal du compartiment effecteur est observé alors qu’aucune cellule CD4 simple
positive (SP) CD25+ mature n’est produite. En l’absence d’expression du ligand
agoniste dans le thymus, des lymphocytes T régulateurs exprimant le TCR
transgénique ne peuvent donc pas se différencier.
En 2001, cette hypothèse était confirmée par Jordan et al. Ces auteurs
montraient que, contrairement à la sélection thymique des autres types de cellules T
αβ, le développement des lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+, requiert des
interactions agonistes de haute avidité avec des complexes CMH/peptide du soi
exprimés par les cellules épithéliales (286). Des approches complémentaires sont
venues enrichir l’argumentation en faveur de la nécessité d’un signal antigènique fort
(287-289). Le renforcement de la signalisation en aval du TCR par l’inhibition de la
phosphatase SHP-1 (Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1)
permet de doubler la taille du compartiment régulateur (290), tandis que l’interruption
de la voie aboutissant à l’activation de NF-κB limite dramatiquement le
développement des Tregs (291). Il a donc été proposé que l’engagement des
précurseurs T vers le lignage régulateurs se fasse lorsque l’intensité d’interaction
TCR/ligand dépasse un certain seuil d’avidité.
Les travaux de l’équipe de Diane Mathis ont amené à reconsidérer
l’interprétation de ces résultats. Ils ont analysé le développement intrathymique des
compartiments effecteurs et régulateurs dans une souris exprimant un TCR
transgénique (292). Dans ce modèle, l’expression du ligand du récepteur à l’antigène
peut être modulée, de façon dépendante de la dose, par ajout de tétracycline dans
l’eau de boisson des animaux. Ils ont ainsi pu mettre en évidence que l’augmentation
de l’expression du ligand permet un enrichissement du compartiment CD4 en cellules
CD25+ exprimant le TCR transgénique dans le thymus et les organes lymphoïdes
secondaires. Surtout, ils ont observé que cet enrichissement, s’il est lié à une baisse
significative du nombre de thymocytes CD25-, n’est pas associé à une augmentation
du nombre absolu de thymocytes CD25+. Lorsque l’avidité d’interaction augmente,
les cellules CD25- ne sont donc pas converties en cellules CD25+ mais elles sont
éliminées. Ainsi, dans ce modèle, comme dans celui de Jordan, l’augmentation de la
proportion de Tregs parmi les thymocytes dans le cadre d’interactions de haute
avidité est le fait d’une résistance à la délétion. Toutefois, les résultats obtenus par
notre équipe dans un modèle de superantigènes, permettant de s’affranchir des
limites des TCR transgéniques, s’avèrent incompatibles avec un modèle
d’instruction.
75
7. Le rôle des molécules de co-stimulation
En plus d’une interaction TCR/ligand forte, il semble que le développement
des Tregs soit dépendant des molécules de co-stimulation exprimée à la surface des
cellules de l’environnement thymique. En effet, les souris invalidées pour CD28 ne
présentent qu’une population très réduite de Tregs dans le thymus et la périphérie
(293, 294). Le groupe de Singer a identifié le domaine de liaison de Lck comme la
clef de la fonction de CD28 dans la différenciation qui permet aux thymocytes DP de
devenir des lymphocytes T CD4+ Foxp3+ (295). De plus, il a été très récemment
montré que l’expression de CD40 par les cellules épithéliales thymiques et les
cellules dendritiques influencerait quantitativement la génération des Tregs (296).
3. Homéostasie des Tregs
Une fois en périphérie, les Tregs migrent, via la circulation sanguine, dans les
organes lymphoïdes secondaires. A l’équilibre, il a été montré que la taille du
compartiment régulateur est stable. Un tel constat pourrait s’expliquer par l’état
d’anergie qui caractérise les Tregs. Pourtant, il en est rien. En effet, l’équipe de
Salomon a montré que ce même compartiment se divise en deux sous-populations
(297). La première, qui exprime de hauts niveaux de CD62L, est dans un état
quiescent. La deuxième correspond à des cellules en cycle qui ont diminué
l’expression de CD62L et augmenté celle de marqueur de surface, tels CD69 ou
CD44, caractéristiques de lymphocytes activés. Une étude plus approfondie a permis
à cette équipe de suggérer que ces cellules correspondent à la fraction
autospécifique du compartiment T régulateur.
Cette prolifération des Tregs n’est possible qu’en présence d’IL-2 exocrine
sécrétée par les populations T effectrices. L’IL-2 est une cytokine produite
rapidement après activation des cellules T au niveau des ganglions lymphatiques
drainant le site de l’infection ou de l’inflammation. En induisant la prolifération des
Tregs dès l’initiation de la réponse immunitaire, l’IL-2 favorise la mise en place d’une
réponse suppressive effective dans les plus brefs délais, ayant pour but de contrôler
la réponse effectrice et d’éviter l’apparition de lésions immunopathologiques. Il a
récemment été montré in vivo que lors de l’immunisation d’une souris par un
antigène donné il y a expansion des Tregs (FR4high Foxp3+) de façon antigène
spécifique (277). L’expression importante de CD25 donne un avantage prolifératif
aux Tregs par rapport aux lymphocytes T effecteurs.
Une approche utilisant des souris Foxp3-GFP possédant une déficience soit
en IL-2, soit en CD25 (IL-2Rα-/-) a permis de montrer que l’IL-2 n’est pas impliquée à
proprement dit dans le développement intra-thymique des Tregs (298). mais que
cette cytokine est cruciale in vivo pour le maintien et l’homéostasie périphérique des
Tregs. Une étude complémentaire réalisée chez l’homme a montré que l’IL-2 régule
positivement et spécifiquement dans les Tregs l’expression de Foxp3 et que cette
régulation implique la liaison des protéines STAT3 et STAT5 sur le premier intron du
gène codant pour Foxp3 (299).
76
L’homéostasie des Tregs n’est pas uniquement dépendante de l’IL-2. D’autres
cytokines participent à la modulation du compartiment régulateur. C’est le cas de l’
l’IFN-γ dont l’action sur la réponse immunitaire semble dépendre du contexte. L’IFN-γ
a en effet des fonctions paradoxales, en favorisant d’une part le développement
d’une réponse pro-inflammatoire de type Th1 et d’autres part en permettant aux
Tregs de contrôler le déroulement des réponses immunes (300). L’équipe de Kathryn
Wood a proposé en 2005 un modèle où les Tregs produisaient rapidement et
seulement de manière transitoire de l’IFN-γ, crucial pour leur fonction in vivo (301).
Cette production d’IFN-γ par les Tregs peut de plus créer un microenvironnement
suppressif induisant une inhibition de l’activation et de la prolifération des cellules T
effectrices et ce, en influençant la fonction des APCs en induisant l’enzyme iNOS
(inducible nitric oxide synthase), l’enzyme HO-1 (heme oxygenase-1) ou bien
l’enzyme IDO induisant le catabolisme du tryptophane (302).
La cytokine clef impliquée dans le maintien en périphérie et la mise en place
des fonctions effectrices des Tregs est le TGF-β. Il existe plusieurs isoformes du
TGF-β : le TGF-β1, le TGF-β2 et le TGF-β3. Le TGF-β1 est l’isoforme ayant une
activité immunologique, les autres jouant plutôt un rôle au cours de l’embryogenèse
ou bien lors des processus de myogenèse. Le TGF-β est une cytokine pléïotropique
(la plupart des cellules possèdent un récepteur au TGF-β) très conservée au cours
de l’évolution possédant un effet immunosuppresseur prononcé. En effet, une souris
exprimant un dominant négatif du récepteur de type II au TGF-β (dnTGF-β RII)
exprimé sous le contrôle d’un promoteur T spécifique et donc possédant des cellules
T incapables de répondre à cette cytokine va développer des pathologies autoimmunes. Cela démontre, l’importance cruciale du TGF-β dans l’homéostasie du
compartiment T (303).
En 2005, Marie et al. ont montré que le TGF-β1 était critique pour
l’homéostasie et l’activité régulatrice du pool de Tregs périphérique mais non requis
pour le développement intrathymique de ces cellules. En effet, des souris TGF-β1-/âgées de 8 à 10 jours (phénotype létal à 3 semaines de vie) présentent une
réduction significative du nombre de Tregs en périphérie mais un nombre inchangé
de thymocytes Foxp3+ au sein du thymus. Ils ont de plus montré en utilisant un
modèle murin dnTGF-β RII que l’abrogation de la signalisation TGF-β dépendante
dans les Tregs induit une diminution à la fois du niveau d’expression de Foxp3 mais
également de l’activité suppressive (304). Ces résultats sont toutefois à modérer. En
effet, Liu et al ont récemment montré qu’un retard dans le développement des Tregs
était observable chez des souris déficientes pour le recepteur au TGF-b1 au niveau
des cellules T, 3 à 5 jours après la naissance (305). Ce retard est ensuite compensé
par une expansion accélérée des Tregs thymiques, attribuable à une surproduction
d’IL-2.
Durant ces dernières années il a été largement documenté que le TGF-β1
associé à une stimulation du TCR permettait in vitro chez l’homme et la souris la
conversion de lymphocytes naïfs T CD4+ CD25- Foxp3- en lymphocytes T CD4+
CD25+ Foxp3+ régulateurs (306). Cette conversion de T effecteurs en Tregs ou TiTregs (TGF- β induced Tregs) permet d’obtenir des cellules présentant une activité
77
suppressive in vitro mais également in vivo après transferts adoptifs dans des
modèles murins (307-310). Ces Ti-Tregs transférés in vivo chez la souris persistent
dans l’organisme assurant ainsi une fonction régulatrice à long terme chez l’animal
(311). Le groupe de Schevach a récemment montré que la présence d’IL-2 semble
être un paramètre important pour réaliser cette conversion en Ti-Tregs induite par le
TGF-β (312). Cependant, ces Ti-Tregs, une fois générés, s’avèrent instables (313).
L’absence d’expression de CD127 est une des caractéristiques phénotypiques
permettant d’identifier les Tregs. La répression de CD127 serait d’ailleurs
subordonnée à l’expression de Foxp3. Le groupe de Bandeira a montré que la
génération et l’homéostasie des Tregs sont maintenues en absence de l’IL-7,
contrairement à leur contrepartie effectrice (314). Le développement thymique,
bloqué à la transition DN2-DN3, est sévèrement réduit pour les deux populations.
Cependant, des cellules régulatrices sont toujours présentes et fonctionnelles, même
après l’involution du thymus. Les souris déficientes pour l’IL-7, qui développent la
colite après déplétion des lymphocytes T CD25+, entrent en rémission spontanément
alors que le compartiment régulateur se reforme. La génération périphérique des
Tregs expliquerait donc que la lymphopénie des souris invalidées pour cette cytokine
ne soit pas corrélée au développement d’une pathologie auto-immune.
Enfin, il a été mis en évidence dès 1999 que les Tregs ont besoin de la
présence de leur antigène en périphérie pour se maintenir (315). Dans un modèle de
rats thymectomisés et irradiés, une thyroïdite et un diabète auto-immun curables par
le transfert de Tregs apparaissent. Lorsque ces cellules proviennent d’animaux dont
la thyroïde a été détruite in utero par administration d’iode 131, elles ne parviennent
à contrôler que le diabète de type I. Par contre, les thymocytes sont capables de
prévenir la survenue des deux pathologies. Garza et al. ont utilisé une approche
similaire pour étudier la tolérance à un antigène ovarien, ZP3 (316). Une oophorite
auto-immune peut être induite expérimentalement, chez des souris mâles ou
femelles simultanément ovariectomisées, par la greffe d’un ovaire accompagnée
d’une immunisation contre ZP3. La sévérité de la pathologie était nettement plus
marquée chez le mâle que chez la femelle. En revanche, si l’ovariectomie a eu lieu
plus d’une semaine avant l’induction de l’oophorite, la protection chez la femelle est
perdue, ce qui montre que cette tolérance nécessite la persistance des antigènes
ovariens.
C. MECANISMES DE SUPPRESSION
Une fois le marqueur CD25 associé aux lymphocytes T régulateurs, l’objectif
de nombreuses équipes a été de découvrir par quel mécanisme passe leurs
propriétés immunosuppressives. Cependant, ce n’est pas un mais plusieurs
mécanismes qui ont rapidement été mis à jour. Aujourd’hui encore, de nouveaux
mécanismes sont découverts.
De nombreuses études montrent que les Tregs CD4+ CD25+ Foxp3+ naturels
inhibent l’activation et/ou l’expansion de différentes cellules immunitaires, à
78
commencer par les lymphocytes T CD4+ effecteurs. En effet, l’équipe de Sakaguchi a
montré que la déplétion en Tregs conduit au développement de pathologies autoimmunes T CD4+ dépendantes pouvant être corrigées par transfert adoptif de Tregs
(254). Depuis cette approche expérimentale a été étendue à de nombreux modèles
de pathologies auto-immunes chez la souris (253). Des études in vitro ont montré
que les Tregs suppriment efficacement l’activation, la prolifération et/ou la production
de cytokines de lymphocytes T CD4+ ou T CD8+ aussi bien dans des systèmes avec
des CPAs que dans des systèmes sans CPAs avec des stimulations polyclonales de
type anti-CD3/CD28 (317-320). In vivo, il a été récemment observé par des
approches de microscopie biphotonique intravitale que les Tregs peuvent bloquer
l’exocytose des granules lytiques des CTLs (321).
Les lymphocytes T ne sont pas les seuls à subir la loi des Tregs : les cellules
B également. Leur prolifération, leur production d’immunoglobuline ainsi que leur
commutation isotypique peuvent ainsi être inhibées (322, 323). L’aptitude des Tregs
à inhiber les cellules NK (Natural Killer) et les cellules NKT (Natural Killer T) a été
également documentée (324, 325). Enfin, les Tregs peuvent également moduler la
maturation des cellules dendritiques (326). Il est important de noter que la
suppression induite par les Tregs peut se faire sur des cellules T naïves, effectrices
ou bien mémoires. Cependant leur potentiel régulateur sur l’activation ou bien la
réponse proliférative est plus efficace sur des populations lymphocytaires T naïves
(327, 328).
Les Tregs ne sont cependant efficaces qu’après avoir été stimulées par leur
antigène spécifique (329) et en absence de fortes doses de cytokines signalant par
la chaîne commune γ (330, 331), en particulier l’IL-2 (329), et de costimulation par
CD28 (329). En effet, ces deux signaux réversent l’état d’anergie des Tregs et leur
ôtent leurs propriétés régulatrices.
1. Déprivation des cytokines de survie
On a longtemps cru que l’inhibition de la prolifération s’expliquait par une
inhibition de la transcription d’IL-2 par les lymphocytes effecteurs (320). Les travaux
de Pandiyan et al ont élégamment proposé une autre hypothèse, déjà proposée en
2004 (330) : le concept de déprivation du micro-environnement. Ils ont réussit à
montrer que la présence de Tregs dans les co-cultures induit une diminution de la
concentration en IL-2, mais contrairement à ce qui était auparavant avancé, ils n’ont
pas observé de diminution de la transcription (331). Ils ont donc proposé que la
déprivation en IL-2, mais aussi en IL-7, induirait l’apoptose des cellules effectrices
par une voie dépendante du facteur pro-apoptotique Bim. En effet, les Tregs sont
impuissants à contrôler une colite induite par des lymphocytes T colitogènes
déficients pour Bim.
79
80
2. CTLA-4
Différentes expériences utilisant des « transwel »l ont clairement établi que le
contact cellulaire était indispensable entre les Tregs et les cellules effectrices pour
que l’inhibition de la prolifération puisse avoir lieu (320, 332). L’expression
constitutive par les Tregs d’une molécule inhibitrice de l’activation T comme CTLA-4
ne pouvait dès lors qu’attirer l’attention des chercheurs, d’autant que ses ligands,
CD80 et CD86, sont exprimés par les CPAs et les lymphocytes T CD4+ activés.
En étudiant séparément la fonction biologique de CTLA-4, il apparaît alors
évident de l’importance de cette molécule dans la fonction suppressive in vitro et in
vivo des Tregs. En effet le blocage de CTLA-4 chez la souris conduit au
développement de pathologies auto-immunes multi-organes (253). De plus, des
études génomiques chez l’homme ont montré que l’altération quantitative de la forme
transmembranaire ou bien soluble de CTLA-4 conduisait à une destruction autoimmune des tissus (333). Le blocage de CTLA-4 lors de tests de suppression in vitro
par des anticorps monoclonaux anti-CTLA-4 ou bien en utilisant des CTLA-4 Fab
(Fragment antigen binding) inhibe l’activité suppressive des Tregs quand les Tregs
sont isolés à partir de souris WT et les T effecteurs à partir de souris CTLA-4-/- (332).
Il a également été montré que l’expression forcée de Foxp3 dans des cellules T
naïves augmentait l’expression de CTLA-4, suggérant ainsi que l’expression de
CTLA-4 est régulée positivement par ce facteur de transcription (268). CTLA-4
présent sur les Tregs va pouvoir agir de plusieurs manières dans l’induction de
mécanismes régulateurs. Tout d’abord, CTLA-4 peut interagir avec les molécules
accessoires CD80 et CD86 à la surface des lymphocytes T effecteurs. Il en résulte
un signal « outside-in » suppresseur pour les lymphocytes T. Enfin, l’engagement de
CTLA-4 avec ses ligands à la surface des cellules dendritiques induit l’expression
d’IDO (207).
3. Cytotoxicité directe
L’expression par les lymphocytes T régulateurs humains après activation de la
granzyme A avait soulevé l’hypothèse d’une cytotoxicité directe des Tregs vis-à-vis
des cellules effectrices (334). Une lyse dépendante de la perforine a pu être
démontrée vis-à-vis de lymphocytes T CD4 et CD8 humains (334). Chez la Souris,
l’équipe de Ley a pu éclaircir l’apparent paradoxe d’une immunité tumorale plus
efficace chez les animaux déficients en granzyme B, en montrant que les Tregs du
micro-environnement tumoral sont capables de lyser des cellules CD8+ et NK (335).
En outre, plusieurs études ont établi une cytoxicité des Tregs envers les lymphocytes
B, avec lesquels ils interagissent en tant que CPAs, soit par la voie
perforine/granzyme (336), soit par l’interaction Fas/FasL (337).
81
4. Les cytokines immunosuppressives
La nécessité d’un contact cellulaire pourrait faire penser que la sécrétion de
cytokines par les lymphocytes T régulateurs n’intervient pas dans leurs propriétés
immunosuppressives. Il est vrai qu’in vitro, l’utilisation d’anticorps bloquant anti-IL-10
et/ou anti-TFG-β n’altère nullement leurs fonctions (253, 332, 338).
Pourtant, in vivo, de nombreuses données ont clairement démontré le
contraire. Ainsi l’IL-10 est requise dans le contrôle de la colite par les Tregs CD4+
CD25+ CD45RBlow. En effet, des Tregs isolés à partir de souris IL10-/- ne peuvent pas
prévenir cette pathologie (339). De plus, Kingsley et al. ont montré que l’IL-10 était
impliquée dans l’inhibition par les Tregs du rejet de greffes de peau, l’administration
d’anticorps anti-IL-10 bloquants accélérant le rejet (340). Il a récemment été observé
que les Tregs infiltrant la lamina propria intestinale ou le système nerveux central
peuvent respectivement inhiber le développement de la colite et de l’EAE par une
sécrétion locale d’IL-10. De plus, après analyse des différents pools de Tregs, il
apparaît que les Tregs infiltrant l’intestin produisent de l’IL-10 au contraire des Tregs
spléniques, ces données suggérant peut-être que l’environnement influence le profil
de sécrétion des Tregs et les fonctions effectrices suppressives mises en place (341,
342).
Les premières cibles de l’IL-10 sont les cellules myéloïdes dont elle restreint
l’expression des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines, des molécules de
CMH de classe II et de co-stimulation (343). Une partie de l’effet de l’IL-10 pourrait
également découler de l’induction de lymphocytes Tr1 ou de cellules dendritiques
tolérogènes, cellules qui amplifieraient la suppression en produisant elles-mêmes
cette cytokine (223, 344). Il faut toutefois remarquer que par opposition à ses
propriétés immunosuppressives, l’IL-10 a un effet stimulateur sur la prolifération et la
cytotoxicité des LT CD8+ (345).
L’autre cytokine immunosuppressive majeure est le TGF-β, et une part
importante de l’action des Tregs lui est attribuée. Le TGF-β intervient entre autres sur
la maturation des cellules dendritiques (346), la prolifération et la différenciation des
lymphocytes T CD4+ (347, 348) et des lymphocytes B (349, 350), ou les fonctions
cytotoxiques des lymphocytes T CD8+ (351) et des NK (325). Une propriété non
négligeable est de participer à la génération de novo de Tregs à partir de LT CD4+
Foxp3- (307, 352). A la sécrétion de TGF-β par les Tregs pourrait venir s’ajouter celle
induite par ces dernières chez les cellules dendritiques de manière à créer un
microenvironnement tolérogène. Ainsi, dans le modèle de la colite, l’expression d’un
dominant négatif du récepteur TGF-βRII par les lymphocytes T CD4+ colitogènes a
montré que ceux-ci doivent être sensibles au TGF-β pour être inhibé. L’origine du
TGF-β est encore aujourd’hui controversée. Ainsi, dans le même modèle de colite,
l’équipe de Powrie à montré que cette cytokine n’était pas produite par les cellules
régulatrices (353) alors qu’à l’inverse, le groupe de Flavell a montré qu’elles étaient à
l’origine de cette production (354). En s’appuyant sur des marquages en cytométrie,
Nakamura et al. ont émis l’hypothèse que le TGF-β produit se retrouverait adsorbé à
la surface et serait délivré à la cellule cible par contact (355). Ce concept est étayé
par le fait que le TGF-β soit sécrété sous une forme inactive qui doit être clivée pour
acquérir son activité biologique. Il a été récemment découvert que l’intégrine αvβ8
82
joue ce rôle chez les cellules dendritiques (356). Chez les Tregs, la molécule
équivalente a été identifiée comme la furine.
Une nouvelle cytokine immuno-suppressive est venue, il y a peu, rejoindre l’IL10 et le TGF-β : l’IL-35 (357). Composée de deux chaînes, IL-12α et IL-27β, son
expression semble spécifique aux Tregs, car IL-27β est régulée par Foxp3. En son
absence, les Tregs sont inefficaces à endiguer la prolifération homéostatique de
lymphocytes T transférés dans un animal immunodéficient, comme ils échouent à
protéger du développement de la colite. Par ailleurs, elle est la seule cytokine dont le
défaut a une influence sur leur capacité à inhiber la prolifération des cellules CD4+ in
vitro.
D. FONCTIONS PHYSIOLOGIQUES ET PATHOLOGIQUES
Le potentiel immunosuppresseur des Tregs joue un rôle majeur dans la
régulation des réponses immunes. Toutefois, selon le processus pathologique
impliqué, leur rôle pourra être bénéfique, comme lors de la prévention de l’autoimmunité ou la tolérance fœto-maternelle, ou au contraire fortement délétère lors
d’une réponse anti-tumorale
.
1. Prévention de l’auto-immunité
Depuis les premiers travaux visant à identifier un marqueur fiable, l’implication
des Tregs dans la prévention de l’auto-immunité ne fait aucun doute. De façon
systématique, il a été montré que l’altération, au profit des mécanismes effecteurs,
de l’équilibre établi entre l’activité des cellules autoréactives et celle des régulatrices,
aboutit au développement d’une réponse immune dirigée contre les antigènes du
soi : la thymectomie néonatale mène à une oophorite (243), la thymectomie et
l’irradiation de rats adultes entraînent une thyroïdite et un diabète (245), et le
transfert à un animal immunodéficient de lymphocytes T CD4+ CD25- aboutit à une
auto-immunité systémique mortelle (254). Moins artificiellement, les conséquences
graves d’une absence des Tregs sont illustrées par le syndrome de l’IPEX (260, 262,
263) ou par l’infection néonatale par le MTLV (mouse T lymphotropic virus) qui, en
détruisant le compartiment CD4, cause entre autres une gastrite (358).
D’une façon moins drastique, la diminution des fonctions effectrices des Tregs
peut être à l’origine de désordres dans la tolérance au soi. Ainsi des cellules
régulatrices avec des capacités amoindries ont été isolées du sang de patients
souffrant d’une forme relativement peu sévère de l’IPEX (271), de diabète de type I
(359), de sclérose en plaque (360), de polyarthrite rhumatoïde (361) ou du syndrome
de Wiskott-Aldrich (362). La perturbation de l’homéostasie des Tregs pourrait
également conduire à la survenue de pathologies : la déficience en IL-2 ou
l’incapacité à y répondre handicapent lourdement les Tregs, ce qui provoque chez
les animaux invalidés des atteintes auto-immunes (298). De nouveau, des défauts
moins marqués peuvent suffire à déséquilibrer le système immunitaire. Une
83
insuffisance dans la production d’IL-2 a été ainsi suggérée comme un des facteurs
de susceptibilité au diabète de la souris NOD et à l’encéphalite auto-immune
expérimentale (363, 364). Par ailleurs, l’accumulation de Tregs dans le système
nerveux central a été associée à la rémission observée chez la souris C57BL/6 dans
le modèle de l’EAE (341). Chez cette souche, l’induction de la maladie se traduit par
l’apparition d’une inflammation aïgue du tissu nerveux qui se résorbe spontanément.
Une fois guéris, les animaux deviennent réfractaires à la ré-induction de la
pathologie. La déplétion des Tregs avant la première immunisation retarde la
rémission spontanée, tandis qu’une élimination postérieure au rétablissement
empêche l’acquisition de la résistance. Les Tregs s’avèrent donc capables de
contrôler la réponse auto-immune, mais leur enrichissement suite à une première
réponse pourrait établir une tolérance durable.
2. Modulation des réponses anti-infectieuses
Lors d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, le système immunitaire met
en place différents mécanismes effecteurs : la production de cytokines proinflammatoires, la production de chimiokines permettant le recrutement de cellules
immunitaires sur le lieu de l’infection et finalement l’activation de cellules
cytotoxiques comme les CTLs et les NK qui vont pouvoir lyser les cellules infectées.
Bien que ces mécanismes soient cruciaux pour limiter la propagation de l’agent
pathogène dans l’organisme ainsi que pour éliminer le pathogène de l’organisme, ils
doivent être drastiquement contrôlés afin d’éviter tout risque d’hyper-inflammation et
de dommages tissulaires collatéraux. En effet, il est possible que lors de la réponse
immunitaire adaptative contre les antigènes du pathogène il y ait génération d’une
réaction immunitaire dite croisée ou « cross-réactive » contre des antigènes du soi
aboutissant alors au développement de pathologies auto-immunes. C’est pour palier
à cela que le système immunitaire a développé des mécanismes suppresseurs afin
de préserver l’homéostasie de l’organisme.
Il a tout d’abord été décrit des mécanismes de régulation consistant en la
production de cytokines anti-inflammatoires par les cellules de l’immunité innée. Plus
récemment, l’implication de l’immunité adaptative a été largement documentée dans
différents modèles infectieux avec le rôle capital que jouent les Tregs Foxp3+ (365).
La plupart des infections où les Tregs ont un rôle protecteur important sont des cas
d’infections chroniques (366). L’isolement de Tregs à partir de patients atteints d’une
infection chronique par Helicobacter pylori, montre que ces cellules régulatrices sont
capables d’inhiber des réponses cellulaires T spécifiques des antigènes bactériens
mais pas des réponses cellulaires T spécifiques d’autres antigènes (367). Un
exemple bien documenté à ce jour est le cas de l’infection gastro-intestinale
bactérienne par Helicobacter hepaticus qui va causer une inflammation intestinale.
Le transfert de cellules T CD4+ isolées à partir d’une souris IL-10-/- infectée par
Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- infectée par cette même bactérie va
permettre un excellent contrôle de l’infection, mais cela va également augmenter
l’inflammation intestinale et induire l’apparition d’une colite inflammatoire. Le transfert
de lymphocytes T CD4+ totaux isolés à partir d’une souris sauvage infectée par
84
Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- également infectée par la même
bactérie va permettre d’induire une réponse immunitaire contre le pathogène moins
importante, mais en évitant le développement de la colite. Les auteurs de ce travail
ont donc montré l’importance de la génération d’un pool de Tregs antigène
spécifique qui va moduler la réponse immunitaire anti-bactérienne via un mécanisme
dépendant de l’IL-10 (368).
Toutefois, le revers de la médaille à cette intervention des Tregs est que
certains pathogènes utilisent en leur faveur cette immunorégulation afin de
restreindre la réponse immune. C’est le cas des infections par Pneumocystis carinii,
par Candida albicans, par Leishmania major, par le virus de l’hépatite C, par le virus
de l’herpès (366). Cette persistance à long terme va créer un nouvel état
d’homéostasie pour l’organisme, ce qui est illustré par le modèle murin d’infection par
Leishmania major. En 2002, Yasmina Belkaid et al. ont montré que la persistance de
Leishmania major au niveau de la peau de souris C57BL/6 après résolution de la
phase « aigüe » de l’infection était due à l’action endogène des lymphocytes T CD4+
CD25+ régulateurs (369). Au cours du processus infectieux, les Tregs s’accumulent
au niveau du derme des souris infectées et inhibent via des mécanismes à la fois
dépendants et indépendants de l’IL-10 les réponses effectrices des lymphocytes T
CD4+ CD25- conventionnels visant à éliminer le parasite.
Cependant, l’activité suppressive des Tregs ne se fait pas que pour assurer la survie
du pathogène, cela permet également au système immunitaire (du fait de la
persistance des antigènes parasitaires en périphérie) de mettre en place une
mémoire immunitaire efficace en cas de réinfection par le même pathogène. En effet,
des souris IL-10-/- infectées par Leishmania major développent une réponse
immunitaire permettant l’élimination de la totalité de la charge parasitaire mais ne
permettant pas la mise en place d’une mémoire immunitaire capable de protéger
l’animal en cas de réinfection (369). Le groupe de Yasmina Belkaid a depuis montré
en 2006, dans ce modèle d’infection parasitaire que la chimiokine CCR5 était
responsable du recrutement des Tregs au niveau du derme infectieux (370). Ils ont
de plus montré, après avoir réalisé des tests fonctionnels ex vivo, que la majorité des
Tregs recrutés au niveau du derme de souris infectées par Leishmania major étaient
spécifiques des antigènes du parasite (371).
3. Inhibition des réponses anti-tumorales
Les pathologies infectieuses et inflammatoires sont induites par des
organismes exogènes (virus, bactéries, parasites…). Les cancers au contraire sont
des pathologies inflammatoires qui vont être induites suite à des divisions
anarchiques et non contrôlées de cellules du soi. Du fait de l’origine endogène des
tumeurs, générer une immunité anti-tumorale efficace est un processus délicat car
85
86
cela pourrait conduire à la mise en place d’une réponse auto-immune.
Heureusement, les antigènes tumoraux ne sont pas tous des antigènes du soi mais
possèdent des caractéristiques propres (antigènes EBV dans certains lymphomes,
des formes mutées de p53 dans certains carcinomes épithéliaux, etc), le terme de
« soi modifié » est alors employé afin de les désigner.
Malgré les efforts du système immunitaire à mettre en place une réponse
immunitaire anti-tumorale, la régression spontanée d’une tumeur établie est un
évènement très rare. En effet, les tumeurs ont développé de nombreux mécanismes
d’évasion au système immunitaire notamment en générant un microenvironnement
suppresseur grâce à la production de cytokines aux propriétés immunosuppressives :
l’IL-10 (372, 373) et le TGF-β (200, 374). Les tumeurs sont également capables de
sécréter des facteurs de croissance endothéliaux comme le VEGF (Vascular
endothelial growth factor) qui permet d’induire des processus de néoangiogenèse
favorisant ainsi la croissance tumorale. D’autre part, le VEGF sécrété localement par
les cellules tumorales inhibe la maturation des cellules dendritiques affectant ainsi
l’activation des lymphocytes T (375). Toutefois, des travaux récents semblent
montrer qu’un obstacle majeur à l’immunosurveillance anti-tumorale et à la mise en
place de stratégies d’immunothérapies anti-tumorale efficaces est du à
l’immunosuppression réalisée par les Tregs (376).
De nombreux travaux ont à ce jour démontré in vivo dans des modèles murins
le rôle délétère des Tregs dans l’immunité anti-tumorale (376). L’élimination sélective
des Tregs par l’injection d’anticorps déplétants anti-CD25, anti-FR4 favorise une
diminution de la croissance tumorale et le rejet de la tumeur (277, 376). Les Tregs
infiltrent massivement les tumeurs solides et leur nombre est considérablement
augmenté au niveau des ganglions lymphatiques drainant ces sites tumoraux.
L’expansion périphérique du pool de Tregs se fait indépendamment du thymus au
niveau des organes lymphoïdes secondaires et ne requiert pas de prolifération
cellulaire. Il s’agirait majoritairement d’une conversion de lymphocytes T CD4+ CD25Foxp3- en Tregs CD4+ CD25- Foxp3+ induite de manière active par la tumeur (377).
Toujours chez la souris, en 2007, Liu et al. ont montré que c’était le TGF-β produit
par les cellules tumorales qui induisait cette conversion de lymphocytes T CD4+
CD25- Foxp3- effecteurs en Tregs CD4+ CD25+ Foxp3+. Ils ont de plus montré que le
traitement des souris avec un anticorps bloquant anti-TGF-β permettait d’inhiber ce
processus de conversion et d’induire une immunité anti-tumorale efficace (374). En
plus de la fonction jouée par le TGF-β dans l’induction de Tregs, le groupe de
Zitvogel a montré que lors d’une réponse immunitaire anti-tumorale (après transferts
adoptifs des différents types cellulaires dans une souris nude), le TGF-β produit par
les Tregs et fixé à leur surface permettait d’inhiber les fonctions effectrices et
cytotoxiques des NK sur la lyse des cellules tumorales (325).
Parallèlement, le groupe de Von Boehmer a montré dans un modèle tumoral
murin que les Tregs inhibent in vivo la cytotoxicité des CTLs via la production de
TGF-β. En effet, le transfert de CTLs exprimant un dnTGF-βRII et donc étant
insensibles à la signalisation induite par le TGF-β résiste à la suppression réalisée
par les Tregs. Le rétablissement de la cytotoxicité est associé dans ce modèle à un
rejet de la tumeur (351).
87
Supportant ces travaux réalisés avec des modèles tumoraux murins, l’impact
des Tregs sur l’immunité anti-tumorale chez des patients atteints de cancer est
maintenant bien documenté (373, 376). En 2001, Woo et al. ont observé pour la
première fois que des patients atteints de cancers des poumons et de cancers
ovariens présentaient un nombre supérieur de Tregs par rapport à celui observé
chez des individus sains (378). Depuis, de nombreux types de cancers où la
fréquence des Tregs dans le sang périphérique est supérieure à celle observée chez
un donneur sain ont été référencés : cancer du sein, cancer pancréatique,
leucémies. Cette liste continue de s’agrandir au fil des différentes investigations
cliniques qui semblent toutes indiquer que ces Tregs possédant des propriétés
suppressives in vitro sont un obstacle majeur à une réponse immunitaire antitumorale efficace chez ces patients (376).
Arriver à mieux comprendre les mécanismes d’actions employés par les Tregs
dans l’inhibition des réponses immunitaires anti-tumorales apparaît donc comme un
enjeu crucial dans la mise en place de stratégies thérapeutiques anticancéreuses
(373). L’IL-2 est une cytokine assurant la prolifération des lymphocytes T, elle est
utilisée en thérapeutique humaine notamment chez des patients atteints de tumeurs
rénales ou de mélanomes afin de favoriser les réponses immunitaires anti-tumorales.
La dose d’IL-2 administrée est un paramètre très important à prendre en compte. A
hautes doses, l’IL-2 va favoriser l’expansion des Tregs chez ces patients et de ce fait
la progression de la tumeur (379). L’expression constitutive et forte de CD25 à la
surface des Tregs par rapport aux lymphocytes T conventionnels va leur donner un
avantage prolifératif. L’établissement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber de
manière sélective les Tregs spécifiques d’antigènes tumoraux permettrait donc
d’induire une réponse immunitaire contre les tumeurs efficace sans pour autant
risquer le développement de pathologies auto-immunes dues à une rupture de
tolérance (373).
4. Tolérance fœto-maternelle
La grossesse pourrait sur un plan immunologique se décrire comme une
greffe semi-allogénique naturelle. En effet, durant la phase de gestation du fœtus, le
système immunitaire maternel doit s’adapter et relever un challenge important pour
pouvoir tolérer la présence de non-soi dans l’organisme, ce non-soi correspondant
aux alloantigènes paternels (380). Les agressions du système immunitaire maternel
dirigées contre le fœtus sont inhibées par différents mécanismes visant à neutraliser
localement les cellules immunitaires réactives contre les alloantigènes du fœtus. Tout
d’abord, il y a établissement d’une barrière physique : la barrière placentaire
constituant une interface sélective entre la mère et le fœtus. Au niveau de cette
interface, il y a expression de la molécule de CMH de classe I non classique HLA-G
qui inhibe l’activation des cellules NK et induit l’apoptose des CTLs (381). De plus,
les cellules trophoblastiques expriment la molécule FasL ce qui leur confère le
potentiel d’induire l’apoptose des lymphocytes T allospécifiques maternels (382).
Malgré leur efficacité, tous ces mécanismes ont toutefois une action restreinte à un
88
niveau local. Leur seule présence n’explique donc pas la capacité à assurer de
manière prolongée une tolérance systémique aux alloantigènes paternels.
En 2004, Aluvihare et al. ont montré, dans un modèle murin, que durant la
période de gestation, il y avait de manière alloantigène indépendante une expansion
systémique du pool périphérique de Tregs maternels. Leur fonction, en plus de
supprimer les réponses auto-immunes, consiste à inhiber les réponses allogéniques
dirigées contre le fœtus. Leur absence conduit à un avortement chez la souris,
avortement correspondant à un rejet immunologique du fœtus (383). Une autre
équipe a montré parallèlement chez la souris que lors de l’administration d’un
traitement à base d’E2 (17-beta œstradiol) ou bien durant la période physiologique
de gestation (période au cours de laquelle le niveau systémique des œstrogènes est
élevé), il y a augmentation du niveau d’expression de Foxp3 et expansion du pool
périphérique de Tregs. Ces données expliquent donc l’augmentation du nombre de
Tregs circulants durant la grossesse et de plus, permettent de mieux comprendre le
rôle protecteur de l’E2 sur le développement de pathologies auto-immunes (384).
Enfin, des travaux plus anciens ont montré que le traitement de souris
gestantes avec un inhibiteur pharmacologique d’IDO conduit à un avortement dû à
un rejet immunologique du fœtus (385). A l’époque, l’action d’IDO n’a pas été reliée à
l’activité régulatrice des Tregs, mais il est envisageable que la fonction protectrice
des Tregs durant la grossesse soit due au moins en partie à l’induction d’IDO par les
Tregs au niveau des cellules trophoblastiques et des CPAs.
E. POTENTIEL CLINIQUE DES TREGS
Les différentes fonctions imputées aux Tregs ont conduit de nombreuses
équipes à développer des modèles expérimentaux de thérapie cellulaire reposant sur
l’utilisation de leurs capacités immunosupressives.
1. Pathologie auto-immune et immuno-inflammatoire
De nombreuses études précliniques réalisées dans des modèles
animaux ont montré que le transfert adoptif de Tregs est capable de prévenir le
développement de pathologies auto-immunes ou immuno-inflammatoires telles que :
le diabète de type 1, l’EAE, l’arthrite rhumatoïde, etc. (240). Les travaux montrant
que le transfert adoptif de Tregs peut corriger une pathologie auto-immune active et
déjà établie sont plus rares (386-388). Le groupe de Powrie a montré en 2003 que
l’injection de Tregs polyclonaux dans le traitement d’une pathologie inflammatoire
intestinale déjà établie (modèle murin de l’IBD) permettait d’éliminer les infiltrats
lymphocytaires pathogéniques au niveau de la lamina propria intestinale et de
rétablir une architecture intestinale physiologique (386). Après expansion ex vivo de
89
Tregs transgéniques stimulés par des cellules dendritiques autologues présentant
des antigènes des îlots pancréatiques, Tarbell et al. ont montré que l’injection de ces
Tregs antigène-spécifiques permettait de corriger un diabète auto-immun déjà établi
dans une souris NOD de treize semaines. Les souris traitées avec succès possèdent
toujours des cellules T diabétogéniques mais elles présentent parallèlement un
nombre accru de cellules Foxp3+ au niveau des ganglions lymphatiques drainant le
pancréas (387). Un travail très récent du groupe de Kuchroo a montré que le
traitement de pathologies auto-immunes à l’aide de Tregs générés ex vivo devait être
associé à un contrôle de l’inflammation tissulaire locale. En effet, en utilisant un
modèle murin d’EAE, ils ont montré qu’au pic de la pathologie, les Tregs spécifiques
du peptide MOG35-55 étaient capables d’inhiber des lymphocytes T effecteurs de
même spécificité isolés à partir de la rate mais incapables d’inhiber ces mêmes
effecteurs lymphocytaires isolés à partir du système nerveux central. L’importante
production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF) par ces lymphocytes T
effecteurs recrutés au niveau du système nerveux central des animaux malades
inhibe l’activité suppressive des Tregs (389).
L’ensemble de ces éléments semble indiquer que le traitement de
pathologies auto-immunes chez l’homme par la mise en place de thérapies
cellulaires utilisant des Tregs pourrait être possible. L’utilisation de Tregs polyclonaux
semble fonctionner dans des animaux lymphopéniques où l’expansion de ces
cellules est possible et où un pool suffisant de Tregs ayant une spécificité pour les
auto-antigènes d’intérêt sera constitué. Cependant dans un hôte immunocompétent,
les travaux actuels semblent indiquer la nécessité d’injecter des Tregs ayant une
spécificité antigénique pour les auto-antigènes d’intérêt. Cela rend donc plus
complexe la mise en place de protocoles cliniques de thérapie cellulaire chez des
patients atteints de pathologies auto-immunes ou immuno-inflammatoires.
2. La maladie du greffon contre l’hôte
Que ce soit pour contrer une maladie génétique touchant le compartiment
hématopoïétique ou pour soigner une leucémie, la greffe de moelle osseuse s’est
aujourd’hui imposée comme une des meilleures (voire parfois la seule) solution
thérapeutique. Elle implique cependant un protocole lourd et éprouvant, imposant
l’isolement du malade en unité aseptique. La préparation à la greffe associant une
chimiothérapie à haute dose et éventuellement l’irradiation corporelle totale, vise
surtout à traiter la maladie mais, dans le cas de greffes allogéniques, démantelent
également les défenses immunitaires du patient. Le patient, une fois la greffe
acceptée, s’expose à de nombreuses complications, telles qu’une pneumonie
interstitielle, des lésions plus ou moins graves, des infections liées à
l’immunosuppression voire, à plus long terme, une altération importante du cristallin,
de la rétine ou de la thyroïde.
Dans le cas des greffes allogéniques, la complication la plus crainte par les
médecins reste la maladie du greffon contre l’hôte, où les lymphocytes T contenus
90
dans la moelle osseuse allogénique vont pouvoir s’activer vis-à-vis des cellules du
receveur et ainsi provoquer des lésions graves pouvant entrainer la mort du patient.
A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement capable de l’inhiber sans compromettre
la capacité du patient à combattre les infections. Afin de prévenir le développement
de cette pathologie, il a été proposé d’éliminer, avant injection, les cellules T
contenus dans le greffon. Cependant, cette démarche n’est pas réellement
envisageable car, si elles ont un effet délétère vis-à-vis de l’hôte, ces cellules
favorisent la prise des cellules souches hématopoïétiques (390), accélèrent la
reconstitution du système immunitaire et réduisent le risque de syndromes
lymphoprolifératifs associés à une infection par EBV (391). Enfin, elles sont les
principales responsables de l’effet thérapeutique des greffes de moelles osseuse
chez les patients atteints de leucémie, l’effet GVL ou GVT (Graft versus Leukemia ou
Tumor) (392). Ainsi, plutôt que de les éliminer, il apparait plus opportun d’essayer de
finement contrôler les précurseurs alloréactifs responsables de la pathologie.
Jusqu’en 2002, très peu de travaux s’étaient intéressés à la capacité des
Tregs à contrôler une alloréponse. Sakaguchi avait montré, dans des souris nude,
que le rejet d’une allogreffe de peau est accéléré lorsque les lymphocytes T
transférés sont déplétés en cellules CD25+ (254). In vivo, Taylor et al. avaient mis en
évidence que ces cellules sont impliquées dans la tolérance induite à des
alloantigènes par blocage des « voies de co-stimulation » CD40/CD40L ou CD28/B7
(393). Enfin, deux autres groupes avaient réussit à induire la survie d’îlots
pancréatiques ou de greffe de peau allogénique par transfert de cellules régulatrices
CD4+ CD25+ isolées à partir d’un animal préalablement rendu tolérant (116, 394).
Ces données, suggérant que les Tregs sont capables de moduler des réponses
dirigées contre des alloantigènes, ont incité plusieurs équipes à tester leur capacité à
inhiber le développement d’une GvHD (393, 395, 396).
Le modèle qu’ils ont développé est assez similaire. Il consiste à irradier
létalement des souris puis de les reconstituer avec une greffe de moelle osseuse
allogénique. En l’absence de toute autre manipulation, les animaux survivent à long
terme. Par contre, lorsque des cellules T allogéniques ou des splénocytes totaux
sont administrés, une GvHD sévère se développe. De façon intéressante, la coinjection de cellules T CD4+ CD25+, isolées à partr d’un donneur non manipulé,
permet de retarder significativement l’apparition de la pathologie.
Chez l’Homme comme chez l’animal, la fraction CD25+ ne représente que 5 à
10% du repertoire TT CD4+ périphérique. L’utilisation de ces cellules en clinique,
dans des protocoles de thérapies cellulaires, nécessite donc une étape préalable
d’expansion. Aussi ses auteurs ont-ils développé des méthodes de culture ex vivo en
présence d’antigènes du receveur, pour induire spécifiquement la prolifération des
cellules allospécifiques, et d’IL-2, afin de réverser l’état d’anergie des Tregs. Lorsque
les cellules ainsi cultivées sont injectées avec la moelle osseuse et les cellules
effectrices, le développement de la pathologie est retardé (393, 395). Mieux, elle est
totalement inhibée lorsque les Tregs ont été préactivés ex vivo en présence de TGF91
β. Les Tregs pourraient donc être utilisés en thérapie pour inhiber l’apparition de la
GvHD. D’autant plus que (392)les Tregs parviennent dans le même modèle, chez
des souris ayant reçu des cellules leucémiques, à inhiber le développement de la
GvHD tout en permettant l’élimination des cellules cancéreuses (397, 398).
Cependant, ces résultats semblent dépendre du type de cellules cancéreurses
utilisé.
La différence de comportement des cellules régulatrices vis-à-vis des deux
types de réponses immunes pourrait s’expliquer par une différence, en termes
d’intensité et/ou de mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu, entre la GvHD
et la réponse anti-tumorale (GvT pour Graft versus Tumor). En effet, la maladie du
greffon est principalement médiée par les cellules T CD4+ tandis que la GvT est, elle,
caractérisée par une cytotoxicité dépendante des cellules T CD8+. Aussi, on peut
émettre l’hypothèse que le fait que la réponse du greffon contre la tumeur puisse se
dérouler est lié, dans ces modèles, à une inhibition plus efficace du compartiment
CD4 que CD8 par les lymphocytes T régulateurs.
3. L’aide à la thérapie génique
Comme la transplantation, les protocoles de thérapie génique peuvent être
limités par des mécanismes de rejet. L’expression du transgène va ainsi déclencher
une réponse visant à détruire les cellules qui expriment le « néo-auto-antigène ».
L’utilisation de Tregs en clinique humaine, pour empêcher cette réponse, s’est donc
rapidement imposée.
L’équipe de Jean Davoust a ainsi montré que l’injection de Tregs isolés à
partir de souris exprimant un TCR transgénique spécifique de HA permet de
contrôler totalement la réponse immune. Ces cellules, contrairement à des Tregs non
relevants, sont capables d’inhiber la production de cytokines pro-inflammatoire,
l’activité cytotoxique des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène et la production
d’anticorps par les cellules B. L’analyse histologique montre clairement une réduction
de l’infiltration de cellules mononuclées et une prise à long terme du transgène (399).
Plus récemment, ces auteurs ont réussit à faire accepter, sans aucun préconditionnement des receveurs, une greffe de moelle osseuse de mâle chez des
femelles syngéniques, en utilisant des Tregs spécifiques des antigènes de mâles
(DBY). De façon spectaculaire, les souris ainsi greffées conservent une
immunocompétence intacte et peuvent ainsi développer une réponse immune contre
un antigène exogène, tel l’ovalbumine (400).
92
RESULTATS
93
OBJECTIFS
Depuis leur découverte, les lymphocytes T régulateurs présentent un
formidable potentiel thérapeutique. Ce potentiel a depuis été confirmé à de
nombreuses reprises dans divers modèles animaux et permettraient de soigner un
vaste éventail de maladies. Dans le cas de la transplantation, la capacité de ces
cellules à inhiber le développement de la GvHD a conduit de nombreuses équipes à
s’intéresser à leur utilisation afin d’induire une tolérance aux alloantigènes. Toutefois,
à l’état naturel, la balance entre les cellules regulatrices et leur contrepartie effectrice
est très nettement en faveur de cette dernière. L’objectif communément admis par la
communauté consiste donc à inverser cette balance afin de permettre aux Tregs de
prendre le pas. Dans ce but, certaines équipes ont dévelopé des approches reposant
sur l’injection d’anticorps non déplétants aux animaux receveurs. Ces traitements
permettent en effet l’émergence d’une population de cellules T régulatrices. Pour
notre part, nous avons choisi une approche alternative consistant à isoler sur la base
des marqueurs de surface CD4 et CD25, expandre puis ré-injecter ces cellules.
Nos premiers travaux ont permis de montrer que ces cellules, une fois
expandues, pouvaient inhiber le rejet d’une moelle osseuse semi-allogénique dans
un modèle d’irradiation létale. La tolérance induite était alors durable et spécifique
des alloantigènes.
Cependant, le modèle utilisé était particulièrement éloigné de la clinique
humaine, de part la forte intensité du conditionnement des receveurs et la nature
semi-allogénique de la moelle utilisée. L’objectif de mon travail de thèse a donc été
multiple. Il s’agissait dans un premier temps d’induire une tolérance aux
alloantigènes dans un modèle plus relevant en terme clinique. Pour ce faire, nous
avons choisi d’irradier sous létalement les receveurs et de réaliser chez ces animaux
une greffe de moelle osseuse, cette fois, totalement allogénique (major and minor
antigen mismatches). Dans un second temps, nous voulions étendre notre modèle à
l’induction de tolérance vis-à-vis de greffes d’organes solides. Nous avons donc
choisi les modèles bien décrits de la greffe de peau, intéressante pour la forte
immunogénicité qui y est associée, et de la greffe de cœur, organe fortement irrigué
et dont le rejet est facilement monitorable par simple palpation abdominale. Enfin,
nous avons voulu étudier si la tolérance induite était spécifique des antigènes utilisés
lors de l’activation in vitro des cellules régulatrices, ainsi que les mécanismes
impliqués dans cette protection. Dans ce but, nous nous sommes notamment
intéressés à l’implication des cytokines anti-inflammatoires IL-10 et TGF-β, dont le
rôle potentiel comme mécanisme d’action des Tregs a été démontré dans divers
modèles.
94
© 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine
LETTERS
Prevention of acute and chronic allograft rejection with
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes
Olivier Joffre1,2,6,7, Thibault Santolaria1,2,6, Denis Calise3, Talal Al Saati4, Denis Hudrisier1,2,7,
Paola Romagnoli1,2 & Joost P M van Meerwijk1,2,5
A major challenge in transplantation medicine is controlling the
very strong immune responses to foreign antigens that are
responsible for graft rejection. Although immunosuppressive
drugs efficiently inhibit acute graft rejection, a substantial
proportion of patients suffer chronic rejection that ultimately
leads to functional loss of the graft1. Induction of
immunological tolerance to transplants would avoid rejection
and the need for lifelong treatment with immunosuppressive
drugs1,2. Tolerance to self-antigens is ensured naturally by
several mechanisms3; one major mechanism depends on the
activity of regulatory T lymphocytes4,5. Here we show that in
mice treated with clinically acceptable levels of irradiation,
regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells stimulated in vitro with
alloantigens induced long-term tolerance to bone marrow and
subsequent skin and cardiac allografts. Regulatory T cells
specific for directly presented donor antigens prevented only
acute rejection, despite hematopoietic chimerism. By contrast,
regulatory T cells specific for both directly and indirectly
presented alloantigens prevented both acute and chronic
rejection. Our findings demonstrate the potential of
appropriately stimulated regulatory T cells for future cell-based
therapeutic approaches to induce lifelong immunological
tolerance to allogeneic transplants.
CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) have a crucial role in
the prevention of autoimmune4,5 and immunoinflammatory6 diseases, in the regulation of immunity to viral and parasite infections7,8,
in the maintenance of maternal tolerance to the fetus9 and in the
inhibition of antitumor immunity10. Given their proven physiological
role in immune regulation, it is appealing to try to use Tregs to induce
immunological tolerance to allografts. We and others have opted to
use a strategy in which Tregs are isolated from unmanipulated hosts,
cultured in vitro to expand cells with appropriate specificity, and then
used to protect allografts in mice. In this fashion, tolerance to bone
marrow11 but not skin allografts12,13 has been successfully induced.
Here we evaluated whether immunological tolerance to solid tissue
allografts could be induced with a protocol in which mice preconditioned with clinically acceptable levels of irradiation were grafted with
allogeneic bone marrow, injected with Tregs and then transplanted
with donor skin or heart.
We grafted sublethally irradiated BALB/c (H-2d) mice with allogeneic T cell–depleted C57BL/6 (B6, H-2b) bone marrow. Three weeks
later, the grafted cells had been rejected (Fig. 1a), demonstrating the
non-lymphoablative nature of the preconditioning. To prevent rejection of bone marrow allografts, we next injected the preconditioned
BALB/c mice with B6 bone marrow and host-type Tregs stimulated
in vitro with donor strain–derived antigen-presenting cells (APCs;
Supplementary Note 1 online). The in vitro culture protocol we used
allowed for the expansion of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs (Fig. 1b).
When co-injected with donor bone marrow, these Tregs efficiently
protected the allograft from rejection (Fig. 1a). Thus, we also induced
tolerance to fully allogeneic bone marrow grafts in other donor-host
combinations, independently of interleukin-10 (IL-10) production by
Tregs (Fig. 1c and Supplementary Fig. 1a,b online). Using a modified
experimental setup, we showed that allograft protection required that
effector T cells responded to TGF-b (Supplementary Fig. 1b). Finally,
we observed no rejection up to 120 d after transplantation (Fig. 1d),
and after engraftment, allogeneic precursors reconstituted all hematopoietic lineages (data not shown).
To be activated, Tregs require antigen-specific stimulation with
major histocompatibility complex (MHC) molecule–peptide complexes. However, once activated, these cells exert their suppressor
effector function in a non–antigen specific manner in vitro14. It was
therefore important to evaluate whether Tregs induced generalized
immunosuppression in our system. We stimulated B6 Tregs with
BALB/c APCs and then injected them into sublethally irradiated B6
recipient with BALB/c and SJL (H-2s) bone marrow. Three weeks later,
the target bone marrow had reconstituted the hosts’ hematopoietic
systems, but the third-party SJL bone marrow had been fully rejected
(Fig. 1e). Similarly, Tregs specific for SJL antigens protected SJL but
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U563, Tolerance and Autoimmunity section, Toulouse, F-31300 France. 2Université Toulouse III Paul
Sabatier, Toulouse, F-31400 France. 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Louis Bugnard, Institut Fédératif de Recherche 31, Plateau
technique de Microchirurgie Expérimentale, Toulouse, F-31403 France. 4Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Claude de Preval, Institut
Fédératif de Recherche 30, Plateau technique d’Histopathologie Expérimentale (Toulouse Midi-Pyrénées Genopole), Toulouse, F-31300 France. 5Institut Universitaire
de France, Paris, F-75000 France. 6These authors contributed equally to this study. 7Present addresses: Cancer Research UK London Research Institute,
Immunobiology Laboratory, London WC2A 3PX, UK (O.J.); Centre National de la Recherche Scientifique, UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie
Structurale, Toulouse, F-31400 France (D.H.). Correspondence should be addressed to J.P.M.v.M. ([email protected]).
Received 30 May; accepted 25 October; published online 9 December 2007; doi:10.1038/nm1688
88
VOLUME 14
[
NUMBER 1
[
JANUARY 2008
NATURE MEDICINE
LETTERS
Figure 1 In vitro–preactivated Foxp3+ Tregs
Number of Tregs
induce long-lasting tolerance to fully allogeneic
injected (× 106)
250
bone marrow grafts. (a) Hematopoietic
200
0
0.5
1
2
100
150
95%
chimerism, assessed by FACS analysis of PBMCs,
100
**
**
in BALB/c mice grafted with B6 bone marrow
50
log H-2Kb
0
and injected with BALB/c Tregs preactivated
50
in vitro with B6 APCs. FACS analysis was carried
100
out 3 weeks after bone marrow transplantation.
***
2,000
0
b
d
Above, typical FACS plots of H-2K versus H-2K
1,500
– +
Treg: – +
93%
50
1,000
staining; below, the percentage of donor (H-2Kb+)
CBA
BALB/c
500
cells among PBMCs from individual mice.
0
Bone marrow graft
0
(b) Phenotype of Tregs before (above) and after
log CD4
0
0.5
1
2
in vitro culture with donor-type APCs (below).
Number of Tregs
log Foxp3
injected (× 106)
Right, black lines indicate staining with antibody
to Foxp3, and gray curves staining with isotypematched control antibodies. (c,d) Hematopoietic
100
log Foxp3
reconstitution assessed at 3 weeks (c) or at the
100
10
indicated time points (d) after B6 mice were
grafted with allogeneic donor bone marrow from
50
+ Treg
DBA/2 BM
50
indicated or BALB/c donors with or without Tregs.
BALB/c
5
B6 BM
SJL
w/o Treg
Values for individual mice are shown; bars
indicate means. (e) Hematopoietic reconstitution
0
0
0
–
+
–
+
0
40
80
120
by cells of BALB/c (’) and SJL (&) origin in B6
0
3
6
9
αBALB/c
αSJL
Time
(d)
after
graft
mice grafted with a mixture of BALB/c and SJL
Time (weeks) after graft
Treg specificity
bone marrow cells with or without Tregs of
indicated specificity, as assessed 3 weeks after
grafting. (f) Percentage of Thy1.1 Tregs, as analyzed by FACS at the indicated time points, among CD4+ splenocytes from B6 mice grafted with B6 (&) or
(’) DBA/2 bone marrow and injected with B6.Thy1.1 Tregs cultured in vitro in presence of DBA/2 APCs. The FACS plots above indicate Foxp3-staining on
Thy1.1+CD4+ splenocytes. Horizontal bars indicate mean values. ***P o 0.001, **P o 0.01 (Student’s t-test).
b
c
Donor cells in
PBMC (%)
1
10
10
1, 0
00
0
NATURE MEDICINE
VOLUME 14
[
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JANUARY 2008
Thy1.1+ Treg
among CD4+ (%)
Donor cells in
PBMCs (%)
f
Cell
counts
1
10
1
1, 00
00
0
Cell counts
log CD25
Donor cells in
PBMCs (%)
not BALB/c bone marrow from rejection (Fig. 1e). These results
showed that the APCs used in the in vitro cultures determined the
specificity of the Tregs in vivo. Moreover, despite the fact that in these
mice Tregs had clearly been activated (as they prevented rejection of
target bone marrow), they did not protect third-party grafts. Their
suppressor effector function was therefore donor specific; they had not
induced generalized immunosuppression.
Our data showed that Tregs allow for the establishment of hematopoietic chimerism. We next analyzed whether this chimeric state, in
its turn, created a favorable environment for the persistence of injected
Tregs. We sublethally irradiated B6 mice, grafted them with allogeneic
DBA/2 (H-2d) or syngeneic bone marrow, injected them with Tregs
previously stimulated with DBA/2 APCs in vitro, and monitored the
persistence of the injected Tregs in the mice (Fig. 1f). We found that
substantially more injected Tregs persisted in spleens (but not in blood
or lymph nodes; data not shown) of mice that had been injected with
donor-type bone marrow. Moreover, these cells had maintained their
expression of Foxp3 (Fig. 1f). These results show that donor hematopoietic cells and donor-specific Tregs mutually favor each other’s
persistence in vivo.
We wanted to know whether Tregs could also induce tolerance to
solid allografts (Fig. 2). Three weeks after irradiation—the time it took
the mice to recover from the preconditioning regimen—B6 animals
received allogeneic DBA/2 skin transplants. We injected Tregs, cultured
in vitro with donor-type APCs, immediately after irradiation (D0) or
just before grafting the skin (D21). In contrast to the results for
bone-marrow transplantation, in this setting skin grafts were rapidly
rejected (Fig. 2a). Combined with previously published data12,13, these
data suggested that alloantigen-specific Tregs alone do not induce
immunological tolerance to allogeneic skin grafts, at least not at the
cell doses tested. We therefore next tried to induce tolerance to skin
allografts by combining Treg transfer with bone marrow transplantation to prolong Treg persistence. In addition, we expected that
the induced chimeric state would contribute to induction of
e
***
Donor cells in
PBMCs (%)
d
***
© 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine
log H-2Kd
a
allograft-tolerance. We reconstituted B6 hosts with DBA/2 bone
marrow, injected them with in vitro cultured Tregs, and 3 weeks
later grafted them with DBA/2 skin. Allogeneic skins did not show any
macroscopic signs of rejection during the 100-d observation period,
but third-party SJL skins were rapidly rejected (Fig. 2a). We obtained
similar results with five other host-donor combinations and when
using mice with substantially lower levels of hematopoietic chimerism
(Supplementary Figs. 2 and 3a,b online). We also assessed whether
mice in which Tregs protected a skin allograft from rejection were
generally immunosuppressed. SJL mice received B6 bone marrow
grafts, B6-specific Tregs and B6 and third-party DBA/2 skins on
opposing flanks. Whereas in these mice B6 skins survived, DBA/2
skins were rapidly rejected (Fig. 2b). Treg-mediated allograft protection was therefore specific, and these cells did not induce generalized
immunosuppression.
At 100 d after transplantation, we submitted the skin grafts to
histological analysis. The allografts showed only minor signs of
rejection (that is, tissue damage), but we observed substantial infiltration by eosinophils and macrophages (Fig. 2d,g), which were previously observed in chronically rejected skin allografts15. Although this
observation indicated that the combined Treg–bone marrow chimerism approach had not induced full immunological tolerance to
allogeneic skins, 250 d after transplantation, allogeneic grafts still
survived (Supplementary Fig. 3c). These results demonstrated that
the combined Treg–hematopoietic chimerism approach protected
allogeneic skin grafts from rejection but did not induce full immunological tolerance to the graft, despite persistent hematopoietic
chimerism (Supplementary Fig. 3d). It therefore seems unlikely
that this protocol will induce long-term protection of tissue allografts
in clinical settings.
Graft rejection is initiated when APCs present donor antigens from
the transplanted tissue to host lymphocytes, which are then activated
to attack the grafted organ via direct cytotoxicity, B cell help and
induction of an inflammatory response16. Donor antigens from a
89
LETTERS
100
75
+ BM
+ Treg αDBA/2
75
50
+ Treg D0
+ Treg D21
25
+ BM
+ BM + Treg αDBA/2
(SJL skin)
50
25
0
0
0
10 20 30 40 50 100
Time (d) after skin graft
c 100
Treg SJL αB6
B6 skin
DBA/2 skin
75
50
0
0
10 20 30 40 50 100
d 100
+ BM + Treg αF1
75
50
+ BM
+ BM + Treg αF1
(SJL skin)
25
25
10 20 30 40 50 100
0
g
25
Infiltrates:
None
Weak
Moderate
Severe
DBA/2 F1
Treg specificity
DBA/2 → B6 (ctrl)
f
F4/80
HE
Luna
DBA/2 skin → B6, Treg αDBA/2
50
10 20 30 40 50 100
F4/80
HE
75
0
0
0
B6 → B6 (ctrl)
e
© 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine
b 100
100
(ctrl B6 skin)
Mice (%)
Graft survival (%)
a
Luna
h
DBA/2 skin → B6, Treg αF1
F4/80
F4/80
Luna
HE
Luna
HE
Figure 2 Tregs prevent acute and chronic skin allograft rejection. (a) Skin allograft survival, as monitored daily by assessment of macroscopic signs of
rejection, in mice grafted under different conditions. Left, data for B6 recipient mice preconditioned with sublethal irradiation only (J, n ¼ 4) or combined
with injection of Tregs preactivated in vitro with donor-type (DBA/2) APCs immediately after irradiation (‘‘D 0’’, , n ¼ 8) or 3 weeks later, just before DBA/2
(or control B6) skin transplantation (‘‘D 21’’, m, n ¼ 10). Control mice were irradiated and received a syngeneic skin graft (&, n ¼ 4). Right, data for B6
mice irradiated and injected with donor DBA/2 bone marrow with (, n ¼ 12, ’, n ¼ 8) or without (n, n ¼ 6) Tregs. Three weeks later, DBA/2 (or control
SJL) skins were transplanted and their survival monitored. (b) Survival of ‘target’ B6 () and third-party DBA/2 (J) skins in SJL mice that were irradiated,
injected with B6 bone marrow and Tregs cultured with B6 APCs, and grafted 3 weeks later with B6 and SJL skins on opposing flanks (n ¼ 4). (c) As in a
(right), except that Tregs were precultured with (B6 DBA/2)F1 APCs (n, n ¼ 3; , n ¼ 8, ’, n ¼ 8). (d) Scoring of infiltrates of DBA/2 skins transplanted
on mice that had received DBA/2 bone marrow and Tregs cultured with DBA/2 (n ¼ 12) or (B6 DBA/2)F1 (n ¼ 8) APCs. (e–h) Representative features
of skin histopathology 100 d after transplantation (HE, H&E; F4/80, immunohistochemistry with an antibody to F4/80; Luna, Luna’s eosinophil stain).
Scale bars represent 200 mm (HE), 400 mm (F4/80) or 40 mm (Luna).
transplant are presented to T cells in two distinct ways, depending on
the origin of the APCs1. First, donor APCs migrate from the graft to
secondary lymphoid organs where they activate host T cells, which
therefore recognize donor antigens presented by donor MHC molecules. In contrast to this ‘direct’ pathway, donor antigens can also be
picked up in the transplanted tissue by host APCs, processed and then
presented to T cells on self-MHC molecules (‘indirect allorecognition’). Whereas acute organ graft rejection has been attributed mainly
to direct antigen presentation, chronic rejection is thought to be
mediated mostly by T cells specific for indirectly presented donor
antigens1. In our in vitro culture protocol, we activated host Tregs with
donor-type APCs. The injected Treg population was therefore
enriched in cells specific for directly presented alloantigens17. This
may explain why acute skin allograft rejection was efficiently inhibited
while chronic rejection still occurred. Tregs specific for indirectly
presented alloantigens might, therefore, be able to prevent the chronic
immune response to the graft (Supplementary Note 2 online).
To test this hypothesis, we expanded Tregs with (host donor)F1
APCs. B6 hosts were transplanted with DBA/2 bone marrow and
90
simultaneously injected with Tregs that had previously been expanded
in vitro with (B6 DBA/2)F1 APCs. Three weeks later, mice were
grafted with DBA/2 (or third-party SJL) skin and allograft survival was
monitored. Whereas third-party skins were rejected, ‘target’ skin grafts
survived the whole 100-d monitoring period (Fig. 2c). We obtained
similar results with the reciprocal host-donor combination (Supplementary Fig. 3e). When, at 100 d after grafting, we subjected the
DBA/2 skins to histological analysis, we observed healthy skin without
eosinophil or macrophage infiltration (Fig. 2d,h). The fundamental
difference between our results with Tregs specific for directly versus
both directly and indirectly presented alloantigens occurred despite
similar hematopoietic chimerism in the two experimental conditions
(Supplementary Fig. 3d). These results show that, in combination
with hematopoietic chimerism, Tregs specific for directly and indirectly presented alloantigens protected skin allografts from acute and
chronic rejection.
We next wanted to know whether Tregs cultured appropriately
in vitro would also induce tolerance to cardiac allografts (Fig. 3).
Irradiated host mice received allogeneic bone marrow grafts,
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NATURE MEDICINE
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+ Treg D0
+ Treg D21
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10 20 30 40 50 100
Time (d) after
transplantation
50
+ BM
25
0
0
10 20 30 40 50 100
Time (d) after
transplantation
e
B6 heart → B6 (ctrl)
4
***
3
f
2
1
DBA/2 heart → B6 (Treg αF1)
0
DBA/2
F1
Treg specificity
DBA/2 heart → B6 (Treg αDBA/2)
Masson
HE
0
75
Masson
0
+ BM + Treg αDBA/2
+ BM + Treg αF1
HE
50
c
100
Rejection score at
day 100
75
Graft survival (%)
(ctrl B6 heart)
HE
d
b
100
Masson
© 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine
Graft survival (%)
a
Figure 3 Tregs prevent acute and chronic cardiac allograft rejection. (a) Cardiac allograft survival, monitored daily (for 100 d) by abdominal palpation, in B6
mice that were preconditioned with sublethal irradiation only (J, n ¼ 2) or with irradiation and injection of Tregs preactivated in vitro with donor-type (DBA/
2) APCs immediately after irradiation (‘‘D 0’’, m, n ¼ 5) or 3 weeks later (‘‘D 21’’, ’, n ¼ 5) and then transplated 3–8 weeks later with donor DBA/2 hearts.
Control mice were irradiated and received a syngeneic B6 heart graft (&, n ¼ 4). (b) Data as in a for B6 mice that were irradiated and injected with donor
DBA/2 bone marrow with (, n ¼ 12, &, n ¼ 9) or without (n, n ¼ 2) Tregs cultured in vitro with DBA/2 () or (B6 DBA/2)F1 (&) APCs and then
transplanted 3–8 weeks later with donor DBA/2 hearts. (c) Clinical score of DBA/2 cardiac allograft rejection 100 d after transplantation into sublethally
irradiated hosts grafted with DBA/2 bone marrow and injected with Tregs preactivated in vitro with DBA/2 (n ¼ 12) or (B6 DBA/2)F1 (n ¼ 9) APCs, as
indicated. *** P o 0.001 (Student’s t-test). (d–f) Representative features of cardiac histopathology 100 d after transplantation of B6 (d) or DBA/2 (e,f)
hearts in B6 hosts. Specificity of injected Tregs is indicated in the figure. Scale bar represents 200 mm in left panels and 50 mm in right panels.
in vitro–cultured Tregs and, 3–8 weeks later, allogeneic heart transplants. Whereas in the control groups the hearts were rejected, in
treated mice the grafted hearts continued beating for more than 100 d
after transplantation (Fig. 3a,b and Supplementary Fig. 4a online).
Prevention of rejection was partially dependent on IL-10 (Supplementary Fig. 1c). At 100 d after transplantation, the beating hearts
were removed for histological analysis. In hearts grafted into mice that
had received Tregs specific for directly presented alloantigens only, we
observed large, diffuse infiltrates of mononuclear cells and eosinophils,
destruction of cardiac muscle fibers, thickening of the intima, arteriosclerosis and extended areas of fibrosis replacing contractile tissue
(Fig. 3e and Supplementary Fig. 4b), all typical signs of chronic
cardiac allograft rejection. All the hearts thus analyzed showed
moderate to severe chronic rejection (Fig. 3c and Supplementary
Fig. 4c). In contrast, hearts grafted into mice that had received Tregs
specific both for directly and indirectly presented alloantigens showed
little or no signs of rejection (Fig. 3b,c,f). This difference occurred
despite similar hematopoietic chimerism in both cases (Supplementary Fig. 4d). These data show that Tregs specific for both directly and
indirectly presented donor antigens, in combination with mixed
hematopoietic chimerism, prevented both acute and chronic rejection
of heart allografts.
Our findings show that host CD4+CD25+Foxp3+ Tregs, when
appropriately stimulated in vitro, can be used to induce immunological tolerance to bone marrow and subsequent skin or cardiac
allografts in hosts submitted to non-lymphoablative g-irradiation,
preventing both acute and chronic rejection (Supplementary
Note 3 online). Suppression of rejection is most likely due to two
interdependent mechanisms. First, Tregs suppress host lymphocytes
and thus directly contribute to acceptance of the allograft. Second,
NATURE MEDICINE
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immunosuppression by Tregs also helps in establishing a chimeric
hematopoietic state, allowing the persistence of injected Tregs and
contributing to the induction of central and peripheral immunological
tolerance of the allografts18.
We showed here that mixed hematopoietic chimerism did not
induce immunological tolerance to skin and cardiac allografts.
This important conclusion is consistent with data on transplantation
in mixed hematopoietic chimeras19–22. Transplantation protocols
based exclusively on the induction of hematopoietic chimerism will
therefore most probably not yield permanent tolerance to, and
survival of, allografts.
In conclusion, we have demonstrated that adequately prestimulated
Tregs can be used to protect skin and cardiac allografts from acute and
chronic rejection. The preconditioning regimen used in our study has
a level of toxicity that may be acceptable in clinical settings23.
However, other protocols aimed at the induction of hematopoietic
chimerism are currently being tested in clinical trials24–26 and could be
used, in combination with injection of in vitro activated Tregs, to
replace the one we used. Moreover, human Tregs with indirect
specificity can be expanded in vitro27. Induction of tolerance to organs
or tissues to be taken from live donors should therefore be feasible
using our protocol or a modified version thereof. We can also predict
that it could, after adaptation, be used to induce tolerance to
transplants taken from cadaveric donors.
METHODS
Mice. Sex-matched mice between 6 and 10 weeks of age were used. Mice were
purchased from the Centre de Recherche et d’Elevage Janvier. Thy1.1 B6 mice
and IL-10–deficient B6 mice were purchased from Charles River. dnTbRIItransgenic B6 mice28 were bred in our specific pathogen–free animal facility. All
91
LETTERS
© 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine
experiments involving animals were performed in compliance with relevant
laws (authorization no. 31-13) and institutional guidelines (Institut National de
Santé et de la Recherche Médicale, Inserm) and were approved by the local
ethics committee (Midi-Pyrénées, France; ref. MP/01/31/10/03).
Antibodies. Antibodies with the following specificities were used for analyses
and purification of Tregs: H-2Kb (AF6-88.5), H-2Kd (SF1-1.1), H-2Ks (5KH49),
H-2Kk (36-7-5) (BD PharMingen); CD4 (GK1.5), CD8 (53.6.7), Thy1.1, CD25
(PC61), Foxp3 (FJK-16s, eBioscience); F4/80 (CI:A3-1, Serotec). Hybridoma
supernatants of antibodies recognizing FcgRII/III (2.4G2), CD8 (53.6.7), MHC
class II (M5/114.15.2) and Thy1.2 (AT83) were produced in our laboratory.
Purification and in vitro culture of CD4+CD25+ T cells. CD4+CD25+ splenic
T cells were purified and cocultured with g-irradiated splenocytes as
previously described17.
Bone marrow allografts. Bone marrow cells from femurs and tibias were
prepared as previously described17. 107 cells were injected intravenously into
g-irradiated mice (5 Gy, 137Cs source).
Flow cytometry. Hematopoietic reconstitution and Treg persistence were
determined by analyzing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or
splenocytes at indicated time points. Erythrocyte-depleted cells were resuspended in 2.4G2 hybridoma supernatant and saturating concentrations of
indicated antibodies (Fig. 1) were added. Acquisition was performed on a
FACSCalibur or an LSR II cytometer and data were analyzed using CellQuest
(BD Biosciences) or FlowJo (Tree Star) software. Foxp3 analysis was performed
according to the manufacturer’s instructions (eBioscience).
Skin and cardiac transplantation. Skin graft was performed as previously
described29. Skins were considered rejected if Z70% of the surface was necrotic.
Heterotopic heart transplantation was performed in the surgery section of the
Institut Fédératif de Recherche 31 animal facility according to a published
method30 with some modifications. Functionality of the transplanted heart was
monitored daily by abdominal palpation. Clinical rejection was defined by
cessation of palpable heartbeats and confirmed by autopsy. Loss of graft
function within 48 h of transplantation was considered as a technical failure
(o5%), and animals in which this occurred were omitted from the analysis.
Histological analysis. Skin biopsies and hearts were fixed in 10% buffered
formalin and embedded in paraffin. Sections were stained with H&E, Masson’s
trichrome or Luna’s eosinophil stain or using antibodies specific for F4/80.
Heart rejection was graded from 0 (none) to 4 (severe): 0, no rejection; 1, slight
perivascular mononuclear cell infiltration; 2, intense and/or interstitial mononuclear cell infiltration; 3, intense interstitial mononuclear cell infiltration
associated with myocyte loss and slight fibrosis; 4, interstitial mononuclear
cell infiltration associated with myocardial necrosis and massive fibrosis.
Statistics. Statistical significance was determined using Student’s t-test.
Note: Supplementary information is available on the Nature Medicine website.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank M.-C. Cuturi, J. Cohen and C. Reis e Sousa
for valuable advice and critical comments on the manuscript, J.-C. Guéry for
stimulating discussions, F. Powrie (University of Oxford, UK) and R. Flavell
(Yale University) for transgenic mice, the personnel of the Institut Fédératif de
Recherche 30, Institut Fédératif de Recherche 31 and Institut de Pharmacologie
et de Biologie Structurale animal facilities for expert animal husbandry, F. Capilla
for preparation of histological specimens, the personnel of the Institut Fédératif
de Recherche 30 flow cytometry facility for technical assistance, and C. Joffre
for her permanent support. This work was supported in part by grants from
the Région Midi Pyrénées (nos. 01008776 and 03011999), the Etablissement
Français des Greffes (2003), the Roche Organ Transplantation Research
Foundation (ROTRF no. 133456773) and the Ligue Nationale contre le
Cancer (no. GL/VP-4825 to O.J.).
AUTHOR CONTRIBUTIONS
O.J. and T.S. performed, and contributed to the design of, the in vitro and in vivo
experiments and interpreted results; D.C. designed and performed cardiac
transplantations; T.A.S. helped in the design and interpretation of histological
92
analysis; D.H. and P.R. contributed to the design of experiments and
interpretation of results; J.P.M.v.M. directed the study and wrote the paper; and
all authors contributed to writing and critically reviewing the manuscript.
Published online at http://www.nature.com/naturemedicine
Reprints and permissions information is available online at http://npg.nature.com/
reprintsandpermissions
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JANUARY 2008
NATURE MEDICINE
SUPPLEMENTARY DATA : DISCUSSION
En supplementay Data de cette publication, nous présentons diverses
expériences complémentaires, venant renforcer le message principal du papier mais
également apporter de précieuses informations sur le rôle des Tregs en
transplantation.
Ainsi, nous avons étudié l’implication des cytokines anti-inflammatoires TGF-β
et IL-10 et avons pu montrer, dans notre modèle d’irradiation létale, que la sensibilité
au TGF-β des lymphocytes T effecteurs était une condition sine qua none pour que
l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse, par les Tregs, puisse se
dérouler. Cette cytokine est donc un mécanisme important mis en jeu par les Tregs.
Toutefois, il reste à déterminer l’origine de sa production : les Tregs en sont-ils la
source ? Ou induisent-ils d’autres populations (Lymphocytes T, Cellules dendritiques,
etc.) capables de la produire ? Concernant l’IL-10, nous avons observé que si cette
cytokine n’était pas impliquée dans la mise en place d’une tolérance lors de la greffe
de moelle osseuse, sa production par les Tregs est, elle, indispensable à la survie à
long terme d’un cœur. Cette différence dans l’implication de l’IL-10, selon la nature
de l’organe à protéger, sera discutée dans le Chapître « Discussion et
Perspectives ».
Dans la figure supplémentaire n°2, nous avons reproduit l’état de tolérance,
induit par les Tregs, dans différentes combinaisons. Il est donc important de noter
que, contrairement à l’induction de tolérance par traitement à base d’anticorps ou par
chimérisme, la protection n’est pas dépendante du fond génétique utilisé. D’autant
plus que, dans nos expériences, les receveurs et les donneurs différent totalement,
tant au niveau des antigènes majeures (CMH) que des mineurs. Ceci laisse à penser
qu’un tel protocole, en plus de palier efficacement aux drogues immunosuppressives,
pourrait considérablement élargir le nombre de donneurs potentiels en clinique
humaine, en éliminant la nécessité d’une compatibilité, même partielle, entre le
donneur et le receveur. Une perspective intéressante, toujours dans le cadre d’une
application chez l’Homme, sera de tester notre protocole dans des modèles de xénotransplantation, particulièrement difficile à inhiber, notamment en raison du rejet
hyperaigu auxquels ils sont associés.
Par la suite, nous avons mis à jour des résultats particulièrement intéressants.
En effet, nous avons montré que la tolérance induite, dans le cas de la peau, pouvait
être maintenue, malgré un faible chimérisme (inférieur ou égale à 10%). Cela est
d’autant plus important qu’il a été montré qu’un chimérisme pouvait altérer la réponse
immune vis-à-vis de certaines infections chroniques, le virus profitant alors d’une
faille dans la sélection des lymphocytes T pour se cacher à l’intérieur des cellules de
la moelle. Plus le chimérisme est faible, moins cette altération est importante. Enfin,
cela confirme de nombreux résultats, montrant que l’induction d’un micro-chimérisme
peut suffire à induire une tolérance.
95
De façon importante, nous avons également pu montrer que, dans le cas de la
greffe de peau, l’induction de tolérance en présence de Tregs spécifiques
uniquement pour la voie directe, si elle montre bien des évidences histologiques
d’une activation immunitaire dès 100 jours post-greffe, ne s’accompagne pas d’un
rejet efficient de la peau, celle-ci survivant jusqu’à plus de 250 jours après la greffe.
Ces données vont à l’encontre de celles observées pour le cœur où les dégats
observés à 100 jours sont parfois très importants et altèrent la fonction même de
l’organe. On pourrait en conclure que l’impact du rejet chronique varie selon l’organe
observé, notamment selon l’intensité de son irriguation et de l’inflammation de la
greffe provoque. Une autre explication de cette différence pourrait provenir
d’anciennes études montrant que, selon l’endroit où elle est prélevée chez le
donneur, la peau n’est susceptible de la même façon d’activer une réponse
immunitaire contre les antigènes mineurs, en partie responsables du rejet chronique.
Enfin, toujours dans la figure supplémentaire 3, nous montrons que malgré
l’apparition d’un rejet chronique, le chimérisme n’est pas affecté chez les receveuses.
Ce contrôle nous permet d’affirmer que le rejet n’est pas du à un défaut du niveau de
chimérisme mais bien à son incapacité à induire une tolérance totale du greffon.
Enfin, dans la dernière figure, nous avons voulu vérifier si la tolérance partielle
induite par notre protocole n’était pas simplement du à un « artefact », du à la
combinaison choisie. Pour cela, nous avons utilisé une moelle osseuse puis un cœur
Balb/c, présentant les mêmes molécules de CMH que les souris DBA/2 (H-2d) mais
un génome totalement différent. Là encore, le rejet chronique est évident et il n’est
pas associé à une altération du niveau de chimerisme chez les receveuses.
96
Supplementary Figure 1 The roles of TGF-β and IL-10 in protection of bone marrow and
heart allografts by Treg. (a) Sublethally irradiated B6 mice were grafted with BALB/c bone
marrow cells and injected or not with Treg from wt or IL-10 deficient B6 mice, pre-activated
in vitro with BALB/c APC. Hematopoietic chimerism was assessed by FACS analysis three
weeks after bone marrow transplantation. Squares indicate percentage of donor (H-2Kd+) cells
among PBMC from individual mice. Horizontal bars indicate mean values. (b) B6 mice were
lethally irradiated and grafted with a 1:1 mixture of B6 and (B6 x DBA/2)F1 (H-2bd) bone
marrow. The host’s immune system was reconstituted by injection of wt or dnTβRIItransgenic B6 splenocytes and injected or not with wt Treg, pre-activated in vitro with (B6 x
DBA/2)F1 (donor-type) APC. PBMC were analyzed as in (a). ***P<0.001, n.s., not
significant (Student’s t test). (c) B6 mice were sublethally irradiated and injected with
BALB/c bone marrow cells and Treg from wt (, n=5) or IL-10 deficient (, n=11) B6 mice,
in vitro cultured in presence of BALB/c APC. Three to eight weeks later, mice were
transplanted with a BALB/c cardiac allograft. Graft survival was monitored daily by
abdominal palpation. Kaplan-Meyer curves indicate allograft survival during the 100-day
observation period.
Supplementary Figure 2 Treg, in combination with hematopoietic chimerism, prevent
rejection of fully allogeneic skin grafts. B6 (a), SJL (b,c), and DBA/2 (d,e) hosts were
sublethally irradiated, injected with donor SJL (a, d), DBA/2 (b), or B6 (c, e) bone-marrow
with or without Treg cultured in vitro with APC of indicated mouse-strain. Three weeks later,
donor skins were transplanted and their survival monitored. (a) , n=6, , n=10, , n=8, (b)
, n=3, , n=8, , n=8; (c) , n=4, , n=8, , n=8; (d) , n=4, , n=8, , n=8; (e) ,
n=3, , n=8, , n=8.
Supplementary Figure 3 Treg and hematopoietic chimerism prevent skin-allograft rejection.
(a,b) B6 hosts were sublethally irradiated, grafted with a mixture of B6 and DBA/2 bonemarrow cells (1:1 ratio), and injected or not (as indicated) with B6 Treg beforehand cultured
in presence of DBA/2 APC. (a) Induced hematopoietic chimerism, as assessed at three weeks
post-transplantation, by FACS analysis of PBMC. Indicated are the percentages of donor cells
(H-2Kd+) among PBMC. (b) Three weeks post grafting, DBA/2 skins were transplanted on
the chimeras and their survival monitored macroscopically. , n=3, , n=9. (c) B6 hosts
were irradiated, injected with DBA/2 bone-marrow with (, n=6) or without (, n=3) Treg
cultured in vitro with DBA/2 APC. Three weeks later, indicated skins were transplanted and
their survival monitored for 250 days. (d) PBMC from mice treated as described in the legend
of Fig. 2 were analyzed by FACS at 100 days post skin transplantation, the day mice were
euthanized and biopsies taken for histological analysis. Indicated are the percentages of donor
cells (H-2Kd+) among PBMC. (e) DBA/2 mice were irradiated, grafted with B6 bone marrow,
injected or not (as indicated) with Treg in vitro cultured with (B6 x DBA/2)F1 APC, and
grafted, three weeks later, with indicated skins. Skin graft survival was monitored
macroscopically.
Supplementary Figure 4 Treg specific for directly presented alloantigens prevent acute but
not chronic cardiac allograft rejection. (a) B6 recipient mice were preconditioned i) with
sublethal irradiation only (, n=6), ii) with irradiation and injection of BALB/c (H-2d) bone
marrow (▲, n=5), or iii) with irradiation and injection of donor bone marrow and Treg preactivated in vitro (, n=5). Three to eight weeks later, mice were transplanted with BALB/c
hearts. Allograft survival was monitored. (b) Representative features of cardiac
histopathology 100 days after transplantation (HE, hematoxylin and eosin; Masson, Masson’s
trichrome stains). Scale bar represents 200 µm in left panels, 100 µm in upper right panels,
and 40 µm in lower right panels. (c) Clinical score of BALB/c heart graft rejection 100 days
post-transplantation. Clinical scores of B6 hearts transplanted into sublethally irradiated B6
hosts are shown as comparison (n=5). **P<0.01 (Student’s t test). (d) PBMC from mice
treated as described in the legend of Fig. 3 were analyzed by FACS at 100 days post cardiac
transplantation, the day mice were euthanized and hearts taken for histological analysis.
Indicated are the percentages of donor cells (H-2Kd+) among PBMC.
Supplementary Note 1
Rational for the use of in vitro cultured Treg
In this report we used Treg prestimulated in vitro with donor-type APC. Freshly isolated Treg
did not induce tolerance to bone marrow allografts in our previous study, probably for
quantitative reasons1. Moreover, very large numbers of non-specifically expanded Treg were
required to inhibit bone-marrow allograft rejection in another report2. Also in reports on Tregmediated prevention of GvHD it was shown that Treg in vitro cultured with specific APC are
more potent than cells expanded in vitro with third-party APC3,4. In vitro culture therefore has
two advantages: it increases the available numbers of Treg and improves their in vivo
reactivity. Moreover, the use of in vitro cultured cells allows for evaluation of their in vivo
antigen-specificity during the suppressor-effector phase (Fig. 1e).
1.
Joffre, O., Gorsse, N., Romagnoli, P., Hudrisier, D. & van Meerwijk, J.P.M. Induction
of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T
lymphocytes. Blood 103, 4216-4221 (2004).
2.
Taylor, P.A. et al. L-Selectin(hi) but not the L-selectin(lo) CD4+25+ T-regulatory
cells are potent inhibitors of GVHD and BM graft rejection. Blood 104, 3804-3812
(2004).
3.
Cohen, J.L., Trenado, A., Vasey, D., Klatzmann, D. & Salomon, B.L.
CD4(+)CD25(+) Immunoregulatory T Cells: New Therapeutics for Graft-Versus-Host
Disease. J. Exp. Med. 196, 401-406. (2002).
4.
Trenado, A. et al. Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor
immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graftversus-leukemia. J. Clin. Invest. 112, 1688-1696 (2003).
Supplementary Note 2
Evidence that Treg with indirect specificity may prevent allograft rejection
The hypothesis we postulated in this report stating that Treg specific for indirectly presented
alloantigens could prevent chronic allograft-rejection is consistent with previously published
data showing that tolerance to allografts induced by blockade of costimulatory molecules,
which is known to be mediated by Treg1, requires host MHC class II2. Also other evidence
supports the notion that Treg specific for indirectly presented alloantigens may be involved in
prevention of allograft-rejection3-6, e.g. by inhibiting production of alloantibodies7.
1.
Taylor, P.A., Noelle, R.J. & Blazar, B.R. CD4+CD25+ Immune Regulatory Cells Are
Required for Induction of Tolerance to Alloantigen via Costimulatory Blockade. J.
Exp. Med. 193, 1311-1318 (2001).
2.
Yamada, A. et al. Cutting Edge: Recipient MHC Class II Expression Is Required to
Achieve Long-Term Survival of Murine Cardiac Allografts After Costimulatory
Blockade. J. Immunol. 167, 5522-5526 (2001).
3.
Hara, M. et al. IL-10 Is Required for Regulatory T Cells to Mediate Tolerance to
Alloantigens In Vivo. J. Immunol. 166, 3789-3796 (2001).
4.
Wood, K.J. & Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat. Rev.
Immunol. 3, 199-210 (2003).
5.
Lechler, R.I., Sykes, M., Thomson, A.W. & Turka, L.A. Organ transplantation--how
much of the promise has been realized? Nat. Med. 11, 605-613 (2005).
6.
Golshayan, D. et al. In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+
regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance. Blood 109, 827-835
(2007).
7.
Callaghan, C.J. et al. Abrogation of antibody-mediated allograft rejection by
regulatory CD4 T cells with indirect allospecificity. J. Immunol. 178, 2221-2228
(2007).
Supplementary Note 3
Different transplanted tissues are differentially affected by Treg-specificity
Interestingly, whereas Treg specific for directly and indirectly presented alloantigens fully
protected all three tested tissues (bone marrow, skin, and heart), cells specific for directly
presented alloantigens differentially affected their rejection. When the latter cells were
administered, bone-marrow allografts showed indefinite survival; skin grafts showed signs of
chronic rejection (eosinophil and macrophage infiltration), but without widespread tissue
destruction; and cardiac allografts were heavily infiltrated and extensive tissue-destruction
associated with fibrosis was observed. This observation suggests that rejection of the three
tested tissues is mediated by distinct mechanisms, differentially affected by Treg specific for
directly presented alloantigens but all inhibited by cells activated by the direct and indirect
pathways. More work will need to be done to assess the rejection mechanisms involved and to
understand the differential Treg-specificity requirements to control them.
CONCLUSION
En réalisant ce travail, notre objectif premier était de réussir à induire une
tolérance aux alloantigènes, grâce aux lymphocytes T régulateurs, dans un modèle
proche des conditions de clinique humaine. Sur ce point, les résultats obtenus sont
particulièrement encourageants mais ne sauraient cacher la longue route semée
d’obstacles qu’il reste encore à parcourir avant qu’un tel protocole soit applicable
chez l’Homme. Les conditions de sélection des Tregs, leur amplification in vitro, les
problèmes logistiques et de pré-conditionnement des receveurs, sont autant de freins
qu’il nous faudra résoudre, en passant notamment chez le primate.
Notre deuxième objectif était, toujours dans le cadre d’une application chez
l’Homme, d’étendre la tolérance acquise à la greffe d’organes solides comme le
cœur ou la peau. Malheureusement, nos premiers résultats indiquaient des traces
évidentes de rejet lors des coupes histologiques : infiltrats massifs, destructuration du
tissu musculaire et fibrose dans le cas du cœur. Mais des analyses plus poussées
ont rapidement révélées que ces altérations relevaient en réalité du développement
progressif d’un rejet chronique. Ces résultats étaient donc la preuve que
l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique ne suffit pas à engendrer une
tolérance totale vis-à-vis d’une allogreffe. Plus important, nous avons par la suite
montré que des Tregs, pré-activés par les deux voies d’alloreconnaissance,
inhibaient le développement des rejets aigu et chronique.
Enfin, ces travaux nous ont permis d’étudier les mécanismes impliqués dans
l’établissement d’une tolérance aux alloantigènes par les lymphocytes T régulateurs.
Nous avons ainsi pu montrer l’implication du TGF-β et de l’IL-10, respectivement lors
de la greffe de moelle osseuse et de cœur. Toutefois, cet obectif est loin d’être
accomplit puisque ces deux cytokines peuvent difficilement à elles seules expliquer
l’incroyable potentiel suppresseur des Tregs. De nombreux autres mécanismes ont
été associés aux Tregs et il nous reste à déterminer lesquels sont impliqués dans
notre modèle d’induction de tolérance.
97
RESULTATS PRELIMINAIRES
98
OBJECTIFS
Nos travaux ont ainsi pu montrer que les lymphocytes T régulateurs peuvent
induire une tolérance durable et spécifique vis-à-vis d’alloantigènes, non seulement
dans le cadre d’une greffe de moelle osseuse mais également lors de la
transplantation d’organes solides, tels le cœur et la peau. Dans ce dernier cas, nous
avons également pu montrer que les Tregs protégeaient non seulement du rejet aigu
mais, de façon plus importante, du rejet chronique.
Une des perspectives évidentes de ce travail consiste à étudier les
mécanismes mis en place par les cellules régulatrices afin d’établir cette tolérance.
Nous nous sommes donc tout naturellement intéressés aux cytokines antiinflammatoires, IL-10 et TGF-b, connues pour être dans certains modèles, produites
par les Tregs et indispensables à leurs fonctions immunosuppressives. Nous avons
ainsi pu montrer dans le précédent article que les lymphocytes T effecteurs,
responsables du rejet, doivent absolument être sensibles au TGF-β, sans quoi
l’induction de tolérance ne peut plus avoir lieu. A l’inverse, l’IL-10, produite par les
Tregs, ne semble jouer aucun rôle dans notre modèle de greffe de moelle osseuse.
En revanche, son rôle s’avère majeur pour la survie à long terme du cœur.
Toutefois, hormis ces cytokines, il existe de nombreux autres mécanismes
utilisés par les lymphocytes T régulateurs pour inhiber l’activation, la prolifération, la
différenciation et/ou l’action des cellules effectrices. L’objectif de ce nouveau travail a
donc été de faire un état de lieux des différents mécanismes impliqués. Etant donné
son rôle majeur dans l’induction de la tolérance aux alloantigènes dans le cadre
foeto-maternel, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’indoléamine
2,3 dioxygénase (IDO) et aux diverses molécules susceptibles d’induire sa
production in vivo (IFN-γ, CD80/86).
99
RESULTATS PRELIMINAIRES
Introduction
Les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+ (Tregs) jouent un rôle
crucial dans de nombreuses physiopathologies. Ainsi, il a été montré qu’ils
participaient à la prévention de l’autoimmunité (401, 402) et des maladies
immunoinflammatoires (403), dans la régulation de l’immunité anti-virale et antiparasitaire (404, 405) et dans l’inhibition des réponses anti-tumorales (406). Plus
récemment, il a également été montré que les Tregs étaient indispensables à la
maintenance de la tolérance foeto-maternelle (383), c'est-à-dire à l’induction d’une
tolérance vis-à-vis d’alloantigènes. Cette découverte, couplée à la capacité de ces
cellules à inhiber l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) (398), a
conduit de nombreuses équipes à envisager leur utilisation en transplantation, lors
de protocole de thérapie cellulaire.
Notre équipe a ainsi pu montrer que des Tregs purifiés à partir d’animaux non
manipulés et expandus in vitro de manière adéquate, induisent une tolérance vis-àvis d’une greffe de moelle osseuse totalement allogénique chez des animaux
faiblement irradiés. Plus important, consécutivement à ce conditionnement, les
receveurs acceptent une greffe de cœur ou de peau sans présenter d’épisodes de
rejet aigu ou chronique. Lors de ces travaux, nous avons également démontré que le
TGF-β était indispensable à la prise de la greffe de moelle osseuse tandis que l’IL-10
participait à la survie à long terme du cœur.
D’autres mécanismes, dont l’implication varie d’un modèle à un autre, ont été
associés aux lymphocytes T régulateurs. Ainsi, il a été montré par l’équipe de
Kathrine Woods que la production transitoire d’IFN-γ par les Tregs est indispensable
à l’induction de tolérance vis-à-vis d’alloantigène, suite à un traitement à base
d’anticorps bloquant (301). Un autre mécanisme impliqué est l’intéraction entre la
molécule CTLA-4 à la surface des cellules regulatrices et les molécules de costimulation CD80/86 à la surface des cellules effectrices (355). Enfin, de façon
intéressante, il a été montré que les Tregs peuvent induire la synthèse de
l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO) par les cellules dendritiques (307, 401). Cette
induction peut se faire soit par l’intéraction entre la molécule CTLA-4, à la surface de
la cellule régulatrice, et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface de la
cellule dendritique soit par la production d’IFN-γ par la Treg. Une fois produite, cette
enzyme permet le catabolisme du tryptophane. Ce faisant, l’IDO appauvrit le milieu
en cet acide aminé essentiel et induit l’apparition de la kinurenine, un catabolite proapoptotique.
A la vue de ces données, et sachant que l’IDO a également été impliquée
dans l’établissement de la tolérance foeto-maternelle, nous nous sommes intéressés
au rôle de cette enzyme dans notre modèle d’induction de tolérance à une allogreffe
100
de moelle osseuse. Nous avons ainsi pu montrer que les productions d’IFN-g par les
Tregs et d’IDO par les CPA ne sont pas nécessaires à la protection de la moelle
osseuse. De même, les molécules CD80/86 à la surface des cellules effectrices n’est
pas, dans notre modèle, nécessaire à l’établissement de la tolérance.
Matériel et Méthodes
Souris : toutes les souris utilisées sont des femelles agées de 6 à 8 semaines
au début des expériences. Les lignées de souris IFN-γ-/-, CD80/86-/- et IDO-/- ont été
entretenues au sein de notre animalerie, en respect des lois d’éthique en vigueur.
Anticorps : les anticorps avec les spécificités suivantes ont été utilisés pour
analyser le chimérisme des animaux receveurs et la purification des Tregs : H-2Kb
(AF6-88.5), H-2Kd (SF1-1.1), H-2Ks (5KH49) (BD PharMingen) ; CD4 (GK1.5), CD25
(PC61). Les surnageants d’hybridomes, reconnaissant le FcgRII/III (2.4G2), CD8
(53.6.7) le CMH de classe II (M5/114.15.2) et Thy1.2 (AT83) ont été produits dans
notre laboratoire.
Tri des Tregs : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ ont été purifiés
comme décrit précédement (407). Brièvement, le tri consiste dans un premier temps
à éliminer les erythrocytes et les cellules mortes grâce à un gradient de Lympholyte
M. Les cellules sont ensuite enrichies en CD4 par élimination des autres populations
grâce à des anticorps dirigés contre CD8, CMH II et FcgRII/III et des billes de tri
(DYNALBEADS). La population enrichie est ensuite sélectionnée positivement pour
le marqueur CD25 à l’aide d’un anticorps dirigé contre CD25 et de billes de tri
(MYLTENYI). La pureté obtenue en routine est supérieure ou égale à 95%.
Greffe de Moelle Osseuse : les greffes de moelle osseuse sont réalisées
comme précédemment décrit (407). Brièvement, les souris receveuses sont irradiées
à 500 Rad , 24 heures avant la greffe. Les cellules hématopoïétiques du donneur
sont obtenues à partir des os longs des pattes postérieures (Fémurs et Tibias). Afin
d’éviter tout risque de GvHD, les lymphocytes T contenus dans la moelle osseuse
sont éliminés par déplétion au complément, à l’aide d’un anticorps dirigé contre
Thy1.1 (AT83).
Analyse du chimerisme : 3 semaines après la greffe, le sang des receveurs
est prélevé au niveau du sinus retro-orbital. Après élimination des erythrocytes, le
sang est incubé avec des anticorps dirigés contre l’haplotype du CMH du donneur et
du receveur.
101
Résultats
Lors de ses travaux, nous avons ainsi pu montrer l’implication des cytokines
immunosuppressives TGF-β et IL-10 à diverses étapes du protocole d’induction de
tolérance à une greffe de moelle osseuse puis d’organe solide. Nous nous sommes
par la suite intéréssés aux autres mécanismes des Tregs intervenant dans l’induction
de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse.
Rôle de l’IFN-γγ dans l’induction de tolérance
Les récents travaux de Kathrine Woods et de son équipe ont mis en évidence
une production transitoire d’IFN-γ par les lymphocytes T régulateurs. Dans leur
modèle, reposant sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les molécules de costimulation, ils ont put montrer que cette production était indispensable à
l’établissement d’une tolérance vis-à-vis des alloantigènes (301) . Dans ce cas, l’IFNγ pourrait agir sur les cellules dendritiques et induire la synthèse de l’IDO, enzyme
responsable du catabolisme du tryptophane et donc de la mise en place d’un milieu
appauvrie.
Nous avons donc voulu étudier si la production d’IFN-γ par les cellules
régulatrices jouait un rôle similaire dans notre propre modèle d’allogreffe. Pour cela,
des souris B6 ont été irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange 1 :1
de moelles osseuses allogénique DBA/2 et syngénique. L’analyse à trois semaines
du chimérisme au niveau du sang a montré que le greffon médulaire était accepté. A
l’inverse, la « reconstitution » du système immunitaire des souris receveuses par
l’injection de splénocytes B6 entraine un rejet rapide et total de la moelle osseuse
allogénique. Dans ce modèle, déjà utilisé lors de nos premiers travaux (408) et des
expériences sur le TGF-β, nous avons ensuite tenté d’inhiber le rejet médié par les
splénocytes grâce à la co-injection de lymphocytes T régulateurs purifiés à partir de
souris sauvage ou déficientes pour l’IFN-γ. Nous avons ainsi observé que les deux
populations de Tregs étaient capables d’induire une tolérance comparable vis-à-vis
des alloantigènes. La production de cette cytokine par les Tregs ne semble donc pas
impliquée dans notre modèle.
Rôle de l’interaction CTLA-4 / CD80-86 dans l’induction de tolérance
Un autre mécanisme impliquant les Tregs et pouvant conduire à la synthèse
d’IDO nécessite l’intéraction de la molécule CTLA-4, exprimée par les cellules
régulatrices, avec les molécules de co-stimulation CD80/86 exprimées par les CPAs.
Afin de tester ce mécanisme d’action dans notre modèle, nous avons eu recours,
chez des souris irradiées létalement, à une greffe de moelle osseuse allogénique
provenant de souris B6 déficientes pour CD80/86 : ainsi les CPAs qui permettront
l’activation du système immunitaire ne pourront pas intéragir avec le CTLA-4 des
102
Tregs. Toutefois, ce système présente une faille : sans molécules de co-stimulation,
les CPAs allogéniques se sont révélées, sans surprise, incapables d’activer
efficacement les splénocytes injectés. La moelle osseuse n’a donc pas été rejetée,
même en l’absence des cellules régulatrices. Au contraire, sa prise en est même
facilitée. Ces résultats ne permettent donc pas de statuer sur l’implication de cette
intéraction entre CPAs et Tregs.
CD80/86 n’est cependant pas exprimé exclusivement à la surface des CPAs.
Ainsi, les lymphocytes T effecteurs, une fois activé, expriment ces molécules et
peuvent devenir par là-même des cibles pour les Tregs. Afin de tester cette
hypothèse, nous avons cette fois utilisé, toujours dans le même modèle d’irradiation
létale, des splénocytes provenant de souris CD80/86-/-. Des souris B6 ont donc été
irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange équivalent de moelles
osseuses syngénique et allogéniques DBA/2. L’injection des splénocytes KO permet
un rejet du greffon équivalent à celui entrainé par des splénocytes sauvages. A
l’inverse, la co-injection de Tregs, cultivé in vitro en présence d’APC DBA/2, permet
dans les deux cas, une protection du greffon médulaire. Nos résultats montrent donc
que l’interaction entre le CTLA-4 des Tregs et les molécules CD80/86 des cellules
effectrices n’est pas impliquée dans l’induction de tolérance vis-à-vis des
alloantigènes.
Rôle d’IDO dans l’induction de tolérance
Enfin, nous nous sommes directement intéressés au rôle de l’indoléamine 2,3
dioxygénase dans la mise en place d’une tolérance durable. Pour cela, nous avons
utilisé une moelle osseuse allogénique provenant de souris B6 défientes pour cette
enzyme et avons comparé sa « prise » avec celle provenant de souris B6 sauvages,
en présence de lymphocytes T régulateurs. Nos résultats montrent que les deux
moelles ont été acceptées de manière identique, rejetant ainsi une implication de
cette enzyme dans l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Ces
expériences ont par la suite été reproduites dans le modèle d’irradiation sous-létale,
utilisé dans le Nature Medicine.
Discussion
Notre équipe a montré que les lymphocytes T régulateurs sont capables
d’induire la protection d’une greffe de moelle osseuse. Plus important, cette
protection passe par une tolérance durable et spécifique qui, si les Tregs sont
convenablement activés, permet d’inhiber les phases de rejet aigu et chronique.
Si de nombreux mécanismes d’action ont été décrits pour les Tregs, ceux
impliqués dans cette tolérance aux alloantigènes n’avaient pas encore été identifiés.
Dans un premier temps, nous avons ainsi pu montrer que le TGF-β et l’IL-10 jouait
103
un rôle important dans l’établissement de cette tolérance, respectivement, vis-à-vis
d’une greffe de moelle osseuse et de cœur.
Lors de ce travail, nous avons donc tenté de mettre à jour d’autres
mécanismes. De par son implication dans la tolérance foeto-maternelle, l’IDO nous a
semblé un candidat de choix. Toutefois, nos résultats n’ont pu mettre en évidence
son implication dans la mise en place de la protection de la moelle osseuse. De
même, nous avons testé, sans succès, les molécules communément décrites comme
pouvant induire in vivo sa synthèse, à savoir la cytokine IFN-γ et les molécules de costimulation CD80/86, via l’intéraction avec CTLA-4. Ces résultats préliminaires
tendent à nous faire penser que la voix de l’IDO n’est pas impliquée dans la
tolérance établie par les Tregs et rejoignent ainsi ceux observés notamment par
l’équipe de Sykes dans un modèle d’induction de tolérance par CTLA-4Ig (409).
Toutefois, ces résultats sont à modérer. En effet, dans le cas d’IDO, s’il
semble que l’enzyme n’intervient pas dans les mécanismes conduisant à
l’acceptation d’une moelle osseuse, nous devons encore réaliser les mêmes
expériences lors de la greffe de peau ou de cœur, afin d’exclure qu’elle puisse jouer
un rôle lors de la greffe d’organe solide, comme cela a été le cas de l’IL-10. Un tel
comportement pourrait s’expliquer, là encore, par l’état d’inflammation, provoqué par
l’acte chirurgical lui-même ou l’état d’ischémie de l’organe et associé à une
production d’IFN-γ, plus important lors de greffe d’organes solides que lors d’une
greffe de moelle osseuse, moins invasive. Ainsi, chez l’Homme, et contrairement à
certains modèles animaux, si de nombreux rapports font état d’une expression d’IDO
au sein de transplants indemnes de rejet, preuve d’un proccessus de tolérisation
médié par l’enzyme (410, 411), tous font, pour le moment, référence à des
transplantations d’organes solides.
Concernant l’IFN-γ, les résultats que nous avons obtenus montrent que sa
production par les Tregs n’est pas nécessaire à l’établissement d’une tolérance à une
allogreffe de moelle osseuse. Ces données sont en contradiction avec celles
obtenues par Kathrine Woods où, dans son modèle, une production éphémère de
cette cytokine est indispensable à l’inhibition des réponses allogéniques. La
différence entre ces résultats peut s’expliquer par la différence des modèles utilisés.
En effet, dans le cas de Woods, les lymphocytes T régulateurs sont induits in vivo
par le traitement des receveurs à l’aide d’anticorps neutralisants tandis que dans
notre cas, les Tregs sont naturellement présents chez le receveur. Nous pouvons
donc imaginer que malgré des marqueurs phénotypiques similaires, nos deux
populations régulatrices diffèrent. Parallèlement à cela, il est tout à fait possible
qu’une production d’IFN soit bien, dans notre modèle, impliquée dans les processus
de tolérisation mais que cette production ne soit pas le fruit des Tregs injectés. Cette
production pourrait être assurée par différentes populations cellulaire : les
lymphocytes T activés, les CPAs suite à l’intéraction avec les Tregs, mais, également
des populations régulatrices induites par les Tregs injectés. Il s’agira donc en
perspective de ce travail de reproduire nos expériences en utilisant des splénocytes
104
(T effecteurs ou T régulatrices induites) et/ou des moelles osseuses (CPAs) IFN-γ-/chez des souris irradiées létalement.
Enfin, dans le cas des molécules de co-stimulation CD80/86, elles aussi
capables d’induire la production d’IDO par les CPAs lorsqu’elles intéragissent avec le
CTLA-4 des cellules régulatrices, nos résultats ne nous ont pas permis de conclure
quant au rôle de cette voie. En effet, nous avons observé, comme attendu, qu’une
greffe de moelle osseuse déficiente pour ces molécules ne s’accompagne pas d’un
rejet, les cellules effectrices n’étant pas totalement activées. Il nous est donc
impossible dans ces conditions de déterminer si les Tregs sont capables ou non
d’induire une tolérance et par conséquent, si ces molécules sont impliquées. Pour ce
faire, vu que, dans cette voie, les molécules CD80/86 intéragissent avec CTLA-4, il
nous faudra tester la capacité de Tregs CTLA-4 déficientes à induire une tolérance
vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse, dans notre modèle d’irradiation létale.
Parallèlement à cela, nous avons pu écarter l’implication de l’intéraction entre le
CTLA-4 des Tregs et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface des
cellules T activées.
Néanmoins, si ces résultats venaient à être confirmés, ils poseraient la
question de savoir pourquoi une enzyme comme l’IDO, déjà montrée comme
facilitant la mise en place d’une tolérance vis-à-vis d’alloantigènes, dans le cas de
l’intéraction foeto-maternelle, et impliquées dans de nombreux modèles
expérimentaux de transplantation, n’est pas induite ici. Là encore, l’origine des
cellules régulatrices versus des cellules régulatrices induites in vivo (dans le cas des
traitements aux anticorps neutralisants), ainsi que l’étape de pré-activation in vitro,
susceptible de modifier le comportement de nos Tregs ou d’amplifier une souspopulation particulière, pourrait en partie l’expliquer.
105
Cellules du donneur dans le
sang (%)
100
80
N.S
60
40
20
0
MO :
+
+
+
+
Splénocytes :
-
+
+
+
Tregs :
-
-
WT
IFN-
-/-
Figure 1 : La production d’IFN- par les Tregs n’est pas impliquée dans
l’induction de tolérance vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse. Des
souris B6 sont irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange de moelle
osseuse syngénique et allogénique (MO), en présence ou non de splénocytes
syngéniques (Splénocytes) et de lymphocytes T régulateurs purifiés à partir de
souris WT ou IFN- -/- (Tregs). Le chimérisme est ensuite analysé 3 semaines après
greffes par FACS à partir du sang.
A
***
Cellules du donneur
dans le sang (%)
100
80
60
40
20
0
MO :
WT
WT
CD80/86-/-
WT
CD80/86-/-
Splénocytes :
-
+
+
+
+
Tregs :
-
-
-
+
+
B
Cellules du donneur
dans le sang (%)
100
80
N.S
60
40
20
0
MO :
+
+
+
+
+
Splénocytes :
-
WT
CD80/86-/-
WT
CD80/86-/-
Tregs :
-
-
-
+
+
Figure 2 : les molécules CD80/86 à la surface des lymphocytes T
effecteurs ne sont pas impliquées dans l’induction de tolérance vis-à-vis
d’une allogreffe de moelle osseuse par les Tregs. (a) Des souris DBA/2
sont irradiées létalement puis reconstituées avec une moelle osseuse DBA/2
et une moelle allogénique B6 soit WT, soit issue de donneurs CD80/86 -/(MO). Les souris sont co-injectées ou non avec des splénocytes syngéniques
WT (Splénocytes) et des lymphocytes T régulateurs. (b) Des souris B6 sont
irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange de moelle osseuse
syngénique (B6) et allogénique (DBA/2), en présence ou non de splénocytes
B6 WT ou CD80/86-/- et de Tregs. Le chimérisme est ensuite analysé 3
semaines après greffes par FACS à partir du sang.
Cellules du donneur dans le
sang (%)
100
N.S
80
60
40
20
0
WT
IDO-/-
WT
IDO-/-
WT
IDO-/-
Splénocytes :
-
-
+
+
+
+
Tregs :
-
-
-
-
+
+
MO :
Figure 3 : l’IDO n’est pas impliqué dans l’induction de tolérance vis-àvis d’une allogreffe de moelle osseuse par les Tregs. Des souris DBA/2
sont irradiées létalement puis reconstituées avec une moelle osseuse DBA/2
et une moelle allogénique B6 soit WT, soit issue de donneurs IDO-/- (MO). Les
souris sont co-injectées ou non avec des splénocytes syngéniques WT
(Splénocytes) et des lymphocytes T régulateurs. Le chimérisme est ensuite
analysé 3 semaines après greffes par FACS à partir du sang.
DISCUSSION ET
PERSPECTIVES
109
Depuis l’antiquité, la transplantation est apparue aux yeux des médecins et
des scientifiques comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Cependant, il a
fallut attendre le dernier siècle pour qu’enfin le rêve commence à prendre forme. La
découverte de techniques chirurgicales, l’établissement d’un cadre juridique
favorable et les progrès exponentiels réalisés en Immunologie fondamentale ont
permis de sans cesse améliorer les techniques et les traitements utilisés en clinique
humaine. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent
au rejet de greffe ont notamment permis le developpement d’outils prédictifs ou
diagnostiques qui ont considérablement amélioré les chances de succès. Cela a
également mis à jour des cibles potentielles pour les drogues immunosuppressives
développées par l’industrie pharmaceutique. Les chances de survie des malades
ainsi que leur confort s’en sont trouvés grandement améliorées. Mais ces nombreux
progrès ont également mis en lumière les limites des traitements actuels : les effets
iatrogènes, l’immunosuppression globale et le faible effet sur le rejet chronique.
En parallèle, la découverte des mécanismes de tolérance au soi, centraux et
périphériques, et surtout la démonstration par Billingham de la capacité de les
manipuler dans le cadre de la transplantation, ont ouvert la voie à de nouvelles
approches thérapeutiques. De nombreuses stratégies ont alors été proposées telle
l’utilisation de cellules dendritiques tolérogènes ou d’anticorps bloquant les
molécules de co-stimulation. Rapidement, ces protocoles prometteurs ont mis en
evidence que la tolérance induite était dépendante d’une sous-population de cellules
douées de propriétés régulatrices : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+.
Caractérisés par Sakaguchi en 1995, les Tregs ont rapidement montré un
potentiel immunosuppresseur sans précédent. De nombreux modèles ont été
développés afin de découvrir toute l’étendue de ce potentiel, son implication dans les
processus physiologoqiques et pathologiques ainsi que leur possible utilisation lors
de thérapies cellulaires. Les données obtenues par différents groupes ont
notamment établi que la déplétion avant greffe de la fraction CD25 permet
d’exacerber les réponses immunes allogéniques de l’hôte, mais aussi du greffon
dans des modèles de GvHD. Ces résultats nous ont amené à penser que l’utilisation
de la fraction allospécifique contenue dans le compartiment régulateur pourrait
permettre d’induire un état de tolérance aux allogreffes.
1) L’expansion des Tregs
A l’état physiologique, la balance cellules effectrices/cellules régulatrices est
très nettement en défaveur de ces dernières. Une des solutions pour induire une
tolérance vis-à-vis des antigènes du greffon est d’inverser cette tendance en isolant
le compartiment régulateur à partir des animaux receveurs, en l’expandant in vitro
puis en le réinjectant. C’est la solution pour laquelle nous avons opté.
110
La première difficulté a consisté à mettre au point les conditions de culture des
cellules régulatrices. Leur nombre au sein d’un organisme étant relativement faible
(les CD25+ ne représentent que 5 à 10% du compartiment CD4), l’objectif premier de
la mise en culture était de les expandre afin d’obtenir des quantités suffisantes de
cellules. Pour cela, les lymphocytes T régulateurs, fraichement isolés à partir
d’animaux syngéniques au receveur, ont été stimulés pendant 15 jours avec des
splénocytes totaux irradiés du donneur, et de l’IL-2 afin de réverser leur état
d’anergie. Le second avantage de cette méthode est qu’elle induit l’enrichissement
des Tregs en cellules allospécifiques. Ceci peut expliquer pourquoi, lors de nos
premiers essais, l’injection des cellules régulatrices fraichement isolées ne suffisait
pas, à quantité égale, à induire une tolérance (408). De la même manière, des
études similaires pour inhiber le rejet de moelle osseuse (412) ou l’apparition de la
GvHD (395, 398), ont montré qu’un grand nombre de cellules non-spécifiques devait
être utilisé pour égaler les résultats observés avec des Tregs spcifiques. Ces
données, combinées aux nôtres, montrent que cette méthode de culture permet
effectivement de fortement enrichir la population isolée en cellules allospécifiques. La
culture in vitro, avant la ré-injection, présenterait donc le double avantage
d’augmenter quantitativement et qualitativement le nombre de cellules transférables.
Cependant, des études récentes suggèrent qu’un tel protocole peut encore
être amélioré. Il a en effet été montré que la présence d’IL-2 induit une prolifération
en partie non-spécifique (413). Pour palier à ce probleme, l’utilisation de cellules
dendritiques purifiées ou derivées à partir de précurseurs pluripotents comme source
d’alloantigène pourraient être envisagée. De tels systèmes permettent en effet, en
l’absence d’IL-2, d’induire uniquement une expension antigène-spécifique des
lymphocytes T régulateurs. Toutefois, si la spécificité des cellules obtenues sera
meilleure, il risque d’en être autrement concernant leur nombre, la capacité
d’expansion d’un tel système étant plus faible. Une autre stratégie consisterait à
améliorer l’efficacité d’action de la population CD4+ CD25+. L’ajout d’adjuvant dans la
culture, tels que le TGF-β, la forme active de la vitamine D3 ou le mycophenolate
mofétil a en effet été décrit comme permettant d’augmenter leurs capacités
immunosuppressives (414). Enfin, l’équipe de Roncarolo a montré que l’addition in
vitro de rapamycine favorise la prolifération des Tregs CD4+ CD25+ (415). Il semble
toutefois que cet effet soit du à une différence de sensibilité à la rapamycine, les
Tregs possédant des voies d’activation alternes à mTOR (416). Ainsi, au sein de la
culture, les cellules effectrices seraient inhibées par la drogue tandis que les cellules
régulatrices n’en seraient pas affectées. Cet effet a également été observé in vivo
(417).
111
2) La spécificité des Tregs
Nous avons ensuite utilisé ces cellules dans un modèle expérimental
d’allogreffe de moelle osseuse. Pour cela, les souris sont irradiées à une dose souslétale comparable aux niveaux de conditionnement utilisés par les praticiens. Dans
ce modèle, le système immunitaire du receveur reste fonctionnel malgré l’irradiation.
Ainsi, en l’absence de lymphocytes T régulateurs, la moelle allogénique est
rapidement rejetée. A l’inverse, l’utilisation de nos cellules permet une protection
durable du greffon. De manière intéressante, nous avons pu reproduire ces résultats
dans différentes combinaisons de donneur/receveur avec à chaque fois le même
succès, là où les traitements à base d’anticorps, par exemple, ont clairement montré
que leur tolérance ne fonctionne que chez certaines souches de souris (141).
Forts de ces résultats, nous avons ensuite cherché à savoir si la tolérance
induite par les lymphocytes T régulateurs n’affecte pas l’immunocompétence des
animaux receveurs. En d’autres termes, si les lymphocytes T régulateurs, à l’instar
des drogues immunosuppressives, inhibent de façon globale le système immunitaire
et donc la réponse allogénique ou si, au contraire, ils permettent la mise en place de
réponses immunitaires tierces. La question était d’autant plus pertinente que la
spécificité d’action des Tregs in vivo n’avait été que peu documentée. En effet, s’il
était connu que pour s’activer et exercer leurs propriétés immunosuppressives, les
lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ nécessitent en périphérie une interaction
avec l’antigène pour lequel ils sont spécifiques, l’éventuelle interférence de leurs
fonctions inhibitrices avec d’autres réponses immunitaires, dirigées contre des
antigènes différents du leur, restait inconnue. De précédentes expériences in vitro
avaient montré qu’une fois activées, les Tregs inhibent sans restriction (418).
Pendant longtemps, ceci est restée un dogme aussi bien in vitro qu’in vivo. Plusieurs
équipes, dont la nôtre, ont finalement démontré en juin 2004 que l’activité
immunosuppressive des cellules régulatrices peut être spécifique d’un antigène, tant
lors de la phase d’activation des cellules que pendant sa phase effectrice (408, 419,
420).
Notre première demonstration de la spécificité d’action des Tregs était dans
un modèle de greffe de moelle osseuse semi-allogénique chez des animaux dont le
système immunitaire était totalement détruit suite à une irradiation létale. Il nous est
donc apparu pertinent de confirmer nos premiers résulats dans notre nouveau
modèle, plus proche de la clinique humaine. Nous avons ainsi montré qu’une souris
recevant une greffe de moelle en présence de Tregs n’accepte le greffon que si les
cellules régulatrices sont spécifiques des alloantigènes de la moelle injectée. De
façon plus spectaculaire, l’injection de deux moelles, l’une pour laquelle les Tregs
sont spécifiques et l’autre non, est systématiquement suivie d’un rejet rapide de la
moelle tierce. Des résultats identiques ont été obtenus lors des greffes de peau.
Toutefois, le développement d’une réponse allogénique tierce malgré la
présence de nos Tregs est certes encourageant quant à la spécificité d’action de ces
cellules, mais reste insuffisant dans l’optique d’une application chez l’Homme. En
112
effet, la réponse allogénique tierce qui se développe dans notre modèle, malgré la
présence des Tregs, est une réponse forte. Elle pourrait donc s’affranchir d’une nonspécificité résiduelle des cellules injectées. Surtout, notre modèle a seulement mis en
évidence que les Tregs étaient capables d’une spécificité dépendante de la CPA,
ayant servie à sa pré-activation in vitro et non d’une réelle spécificité antigènique.
Ainsi, dans nos expériences, les antigènes « à protéger » se trouvent sur une CPA
différente de celle présentant les antigènes « à éliminer ». La question encore en
suspens est donc de déterminer si, dans le cas où les deux types d’antigènes, « à
protéger » et « à éliminer », sont présentés par la même CPA, la réponse immune
tierce peut se développer, sans pour autant nuire à l’état de tolérance vis-à-vis des
antigènes « à protéger ». Pour répondre à ces différentes questions, il s’agira de
montrer si l’organisme des souris receveuses est toujours capable soit de développer
une réponse immunitaire efficace contre un antigène exogène, tel l’ovalbumine ou
HY, soit d’éliminer un agent pathogène tel le virus de l’influenza ou du LCMV murin.
Ces analyses se feront quand se sont les CPA du receveur (alloantigène et antigène
exogène sont sur deux CPAs différentes) ou du donneur (l’alloantigène et l’antigène
exogène se retrouvent alors sur la même CPA), qui présentent l’antigène exogène.
3) Le rôle du TGF-β
Nous nous sommes par la suite interessés aux mécanismes qui pouvaient
rendre compte de cette spécificité d’action. Les études que nous avons réalisées
semblent indiquer qu’une sécrétion d’IL-10 par les cellules T régulatrices n’est pas
nécessaire, dans notre système, à leur activité immunosuppressive. En revanche, le
TGF-β semble être indispensable. Une publication récente de l’équipe de Fiona
Powrie a montré dans le système de la colite, que si cette cytokine est nécessaire à
l’immunosuppression induite par les lymphocytes T CD4+ CD25+, les Tregs ne sont
pas à l’origine de cette production (353). Ces resultats ont cependant été remis en
question par l’équipe de Flavell qui a montré l’importance de la production du TGF-β
par les Tregs dans le même modèle de colite (354). Une des sources potentielles de
cette cytokine est représentée par les cellules dendritiques allogéniques, puisque ces
cellules sont susceptibles d’être rendues tolérogènes par les Tregs (421). Ainsi, on
peut suspecter un système dans lequel les lymphocytes T régulateurs induiraient la
production de TGF-β par les cellules dendritiques exprimant les alloantigènes dont ils
sont spécifiques et que cette cytokine créerait un microenvironnement local peu
propice pour l’activation des cellules effectrices, voire leur conversion en cellules
régulatrices. Seules les cellules effectrices reconnaissant les alloantigènes présentés
par ces cellules dendritiques devenues tolérogènes seraient affectés par cette
inhibition indirecte de la part des Tregs. De plus, le fait que la production de
médiateurs solubles par les cellules dendritiques puisse être « adressée » vers des
partenaires lymphocytaires précis a été suggéré par différents modèles (422). Une
autre explication voudrait que l’inhibition puisse dépendre de l’engagement de la
forme membranaire du TGF-β, exprimée à la surface des cellules régulatrices, avec
113
le récepteur à cette cytokine immunosuppressive exprimé à la surface des T
effecteurs.
4) Autres mécanismes d’action
Enfin, pour expliquer cette spécificité d’action, nous pouvons imaginer que les
différents mécanismes de suppression à disposition des Tregs et nécéssitant un
contact cellulaire étroit, soit avec les cellules dendritiques allogénique susceptibles
d’activer la réponse immunitaire soit avec les cellules effectrices, participent à
l’induction de cette tolérance. Les Tregs peuvent ainsi via CTLA-4 (207) ou par le
biais d’une production momentanée d’IFN-γ (301), induire chez les CPAs la
production d’IDO. Cette enzyme, en catabolisant le tryptophane, va limiter la
prolifération des lymphocytes environnants, voire même, par le biais de la kinurenine,
induire leur apoptose. Ils peuvent également, comme cela a été montré in vitro,
diminuer l’expression des molécules de co-stimulation à leur surface. Cependant,
nos résutats préliminaires tendent à montrer que la production d’IFN-γ par les Tregs,
ainsi que celle d’IDO par les CPAs ne seraient pas nécessaires à l’induction de
tolérance lors de la greffe de la moelle osseuse. Leur rôle lors de la greffe d’organes
solides reste toutefois à déterminer.
Une autre cytokine immuno-suppressive pourrait elle-aussi être impliquée :
l’IL-35 (357). Composée de deux chaînes, IL-12α et IL-27β, son expression a été
montrée spécifique aux Treg, IL-27β étant régulée par Foxp3. En son absence, les
Treg sont inefficaces à endiguer la prolifération homéostatique de LT transférés dans
un animal immunodéficient, comme elles échouent à protéger du développement de
la colite. Par ailleurs, elle est la seule cytokine dont le défaut a une influence sur leur
capacité à inhiber la prolifération des LT CD4+ in vitro.
Il a été également rapporté un pouvoir cytotoxique des Tregs vis-à-vis des
lymphocytes T CD4+, CD8+ (334) et B (336). L’ensemble de ces mécanismes reste
encore à étudier dans notre modèle.
5) La survie des Tregs
Un des objectifs de ce travail était de réussir à induire une tolérance vis-à-vis
d’organes autres que la moelle osseuse. Malheureusement, l’adaptation stricte du
protocole précédent, à savoir une greffe chez un animal affaibli soutenue par
l’injection de Tregs pré-activés ex vivo, s’est avérée un echec. Les greffons
cardiaques étaient rapidement rejettés. Néanmoins, nos résultats montraient un léger
retard dans le rejet, certes non significatif mais un retard tout de même. Nous avons
dès lors émis l’hypothèse, s’appuyant sur les travaux de Seddan et Mason (315), que
le rejet était dû, non pas à une impuissance de la part des cellules régulatrices
injectées, mais plutôt à leur incapacité à survivre au-delà de quelques jours en
114
l’absence, en périphérie, des alloantigènes pour lesquelles elles sont spécifiques.
Nos résultats sur la survie des cellules régulatrices en présence des alloantigènes
corrèlent cette hypothèse. Ainsi, chez des souris ayant reçues une moelle de même
fond génétique que les CPAs ayant servi à l’activation in vitro des Tregs, le
pourcentage de cellules injectées retrouvé au niveau de la rate des souris est bien
supérieur à ce même pourcentage chez des souris ayant reçues une moelle
syngénique. Il est à supposer que cette différence de pourcentage serait due à une
prolifération en périphérie plus importante des Tregs en présence de leurs
alloantigènes, comme le suggère les travaux de Salomon sur l’homéostasie des
cellules régulatrices CD62L- (297). Toutefois, dans cette expérience, l’irradiation et la
greffe ont eu lieu avec vingt quatre heures de décalage, contrairement aux
expériences sur les greffes de peau, en absence de moelle osseuse, où l’irradiation
a eu lieu trois semaines avant la greffe de la peau. Pour confirmer notre hypothèse, il
conviendra donc de reproduire les expériences de greffe de peau, en absence de
moelle osseuse, en utilisant des Tregs Thy1.1, afin de pouvoir les suivre. Une
diminution drastique de leur pourcentage en périphérie, correlée à l’apparition des
signes cliniques du rejet des greffons, appuierait notre hypothèse. Enfin, afin de
déterminer si les forts pourcentages observés sont bien le fruit d’une intense division
des cellules régulatrices, l’injection dans le même modèle de Tregs marqués au
CFSE nous permettra d’établir avec précision la capacité d’expansion in vivo de ces
cellules, chez un receveur lymphopénique.
6) Implication des Tregs spécifiques de la voie indirecte dans le
contrôle du rejet chronique
Dès lors, des souris ayant reçues au préalable une greffe de moelle osseuse
sous couvert de Tregs pré-activés ex vivo par les deux voies d’alloreconnaissance,
acceptent à long terme une greffe de cœur ou de peau. Dans un tel système,
l’induction de tolérance à l’allogreffe est dépendante de deux mécanismes distincts
et complémentaires. Ainsi les cellules dérivées de la moelle osseuse qui
reconstituent le système hématopoïétique, vont participer, dans les organes
lymphoïdes secondaires, à la sélection négative des populations lymphocytaires
néosynthétisées. Par contre, le compartiment immun périphérique présent avant
traitement, et persistant après irradiation sous-létale, va être controlé par les cellules
régulatrices injectées. La nécessité de ce mécanisme périphérique d’induction de
tolérance aux alloantigènes dans la survie du greffon cardiaque est soulignée par
différentes observations. La première est qu’il semble nécessaire, afin de contrôler
totalement le rejet de l’organe solide, de modifier les conditions de culture des
cellules T régulatrices. Leur préactivation ex vivo via les deux voies
d’alloreconnaissance, contrairement à une stimulation par des CPAs allogéniques,
est en effet associée à un contrôle total de l’alloréponse. Ceci avait déjà été suggéré
par des données montrant que la tolérance induite aux allogreffes par les anticorps
bloquants les voies de co-stimulation, connue pour être médiée par les Tregs,
115
nécessite l’expression des molécules du CMH de classe II de l’hôte (120). A défaut
un rejet chronique se développe. De plus, l’utilisation de lymphocytes T régulateurs
CD4+ CD25+ isolés à partir de souris IL-10-/- nous a permis de montrer que la
sécrétion de cette cytokine par les cellules régulatrices est impliquée, voire
indispensable, à la protection de l’allogreffe cardiaque sur le long terme. Pris
ensemble, ces résultats suggèrent fortement que, contrairement au dogme établit
communément, un contrôle périphérique actif est nécessaire pour que l’allogreffe de
cœur ou de peau soit acceptée.
7) Chimérisme et tolérance
L’induction d’un chimérisme n’est donc pas synonyme de tolérance (104, 108110). Ceci peut notamment s’expliquer par le fait que si une sélection négative a bien
lieu au niveau du thymus des chimères vis-à-vis des alloantigènes (423), elle s’avère
imparfaite et laisse s’échapper des cellules alloréactives en périphérie. Chez un
individu normal, un tel phénomène est observé pour les cellules autoréactives.
Toutefois, celles-ci, une fois en périphérie, doivent être contrôlées par les Tregs,
sélectionnées eux aussi au niveau du thymus. Hors, aujourd’hui encore, il n’a pas été
clairement défini si la génération de Tregs capables d’inhiber en périphérie
l’alloréponse était efficiente chez des chimères. En effet, il a été montré que les
antigènes présentés par les cellules dendritiques de la medulla thymique, seules
cellules d’origines hématopoïétiques impliquées dans la sélection, ne semblaient pas
intervenir dans la sélection des Tregs, ceux-ci se développant normalement lors
d’une greffe de moelle n’exprimant pas le CMH chez une souris sauvage (282, 285).
Ceci pourrait expliquer pourquoi la tolérance induite par le chimérisme n’est pas
toujours durable. Ainsi, même dans le cas historique des agneaux jumaux décrit par
l’équipe de Medawar, 70% des greffes de peau réalisées étaient rejettés à long
terme (424, 425). Ces résultats montrent que l’établissement d’un chimérisme
parvient à contrôler le rejet aigu mais pas le rejet chronique. Chez l’adulte, une étude
approfondie des différents résultats d’induction de tolérance à l’aide d’un chimérisme
révèle que lorsque les donneurs ne différent des receveurs que par leurs molécules
du CMH, les greffes de peau sont acceptées. A l’inverse, lorsque cette différence
génétique s’étend également aux antigènes mineurs, les peaux sont à long terme
rejettées. Il semble donc que le chimérisme hématopoïétique est capable d’inhiber
l’activation des cellules T effectrices contre les molécules de CMH allogéniques
(reconnaissance directe) mais qu’il échoue à contrôler les cellules reconnaissants les
antigènes mineurs (reconnaissance indirecte), rôle qui revient aux Tregs dans notre
modèle.
Ces données posent dès lors la question de pourquoi, alors que leur
génération thymique est en théorie possible, l’injection de Tregs spécifiques de la
voie indirecte est indispensable au contrôle du rejet chronique. La première réponse
qui vient à l’esprit est que ces cellules ne sont tout simplement pas générées au
niveau du thymus et ne sont donc pas présentes en périphérie. Une autre explication
116
veut que leur nombre, à la suite de cette génération, soit trop faible en périphérie
pour assurer une parfaite protection. Ceci est corroboré par le fait que nous injectons
de grandes quantités de cellules régulatrices : 2.106, soit le double des cellules
régulatrices retrouvées au niveau de la rate d’une souris saine.
8) Différence de l’impact du rejet chronique sur la moelle, la peau et le
cœur
Nos résultats montrent clairement une disparité dans la façon dont les trois
organes que nous avons testés sont affectés par la présence ou non de Tregs
spécifiques de la voie indirecte. Ainsi, en leur absence, la moelle osseuse montre
une survie à très long terme sans la moindre altération du chimérisme ; la peau
présente des infiltrats massifs mais qui n’altèrent pas sa survie ; tandis que le cœur
est lentement dégradé avec une altération importante de sa structure et de sa
fonction. Ces observations suggèrent que les mécanismes impliqués sont différents
selon les organes impliqués. De plus, dans le cas de la peau, sa relative sensibilité
au rejet chronique pourrait s’expliquer par le fait que la peau de queue, que nous
avons utilisée dans notre modèle, est connue pour être moins sensible aux
différences d’antigènes mineurs (426, 427), cela même qui sont impliqués dans le
rejet chronique chez des chimères.
9) Le rôle de l’IL-10
Une observation surprenante dans notre modèle est liée au fait que la
production d’IL-10 par les cellules régulatrices n’est pas impliquée dans l’induction
de tolérance aux allogreffes de moelle osseuse. De plus, et même si une production
de cette cytokine par les cellules allogéniques greffées ne peut être exclue,
l’utilisation de receveur IL-10-/- montre que cette cytokine n’est pas produite par une
autre source cellulaire. Ce résultat parait être en opposition avec de nombreuses
données de la littérature qui suggéraient, notamment dans les systèmes reposant sur
l’injection d’anticorps non déplétants, que cette cytokine joue un rôle important dans
le contrôle de l’alloréponse (339, 340, 428). Cette apparente contradiction de nos
données avec celles de l’équipe de Wood pourrait être liée aux différences entre nos
deux systèmes. Les populations de lymphocytes T régulateurs que nous utilisons
pourraient notamment être fonctionnellement différentes, au moins partiellement, en
dépit d’un phénotype apparemment identique (CD4+ CD25+ Foxp3+). En effet,
l’utilisation d’anticorps bloquant pourrait induire l’émergence de sous-populations
régulatrices, productrices d’IL-10. De même, dans notre système, les cellules sont
expandues pendant deux semaines avant d’être injectées, ce qui pourrait induire
préférentiellement l’expansion de certaines sous-populations régulatrices. Une autre
hypothèse, repose sur les travaux de O’Gara (428). Elle soutient que dans les
systèmes dans lesquels l’état inflammatoire est faible, cette cytokine, même produite
117
par les cellules suppressives, n’aurait pas un rôle central ou du moins, ne serait pas
indispensable à l’immunosuppression dépendante des cellules régulatrices. Ceci est
le cas dans le modèle de la gastrite et pourrait aussi expliquer nos résultats dans les
greffes de moelle osseuse. A l’inverse, dans le cas de processus inflammatoires
chroniques, comme dans le modèle de la colite, l’IL-10 jouerait un rôle clef pour
éviter un emballement des mécanismes effecteurs qui les rendraient incontrôlables
par les cellules régulatrices. Cette hypothèse semble confirmer par nos propres
résultats. En effet, dans le cas de la greffe de cœur, l’IL-10 semble tenir une place
importante dans la stratégie mise en œuvre par les Tregs pour maintenir la tolérance.
Là aussi, l’état inflammatoire résultant de l’activation du système immunitaire est plus
important.
10) Vers un protocole clinique
Notre protocole permet donc d’établir une tolérance durable et spécifique visà-vis d’une greffe de moelle osseuse, de cœur ou de peau. Pour autant, aussi
prometteur qu’il soit, de nombreux obstacles doivent encore être franchi pour
envisager une application à l’Homme. La première limite consiste dans la purification
et l’expansion des lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+. En effet, si chez la souris
cette population renferme en très grande majorité des cellules régulatrices, en raison
de l’absence de cellules activées chez ces animaux naïfs, il n’en est pas de même
chez l’Homme. L’expression de CD25 ne permet pas de différencier les effectrices
des régulatrices. Ainsi, purifier sur ce seul marqueur pourrait conduire à isoler puis
amplifier des lymphocytes T effecteurs qui pourraient altérer l’efficacité du protocole
voire pire. La découverte récente du marqueur de surface CD127 permettant de bien
séparer les populations effectrices (CD127high) et régulatrices (CD127low) devrait
permettre d’améliorer la spécificité des procédures de tri cellulaire. De plus, la culture
des fractions triées avec de la rapamycine pourra assurer l’obtention post-culture
d’une population cellulaire encore plus pure. L’expansion in vitro des Treg humains
pourrait elle-aussi constituer un obstacle car si des progrès ont été réalisé sur ce
point (318), la maitrise de leur expansion reste encore délicate. D’autant que, dans
notre protocole, afin de permettre l’activation des Tregs durant la phase d’expansion
via les deux voies d’alloreconnaissance, nous utilisons des CPAs semi-allogéniques
ce qui s’avèrent extrêmement restrictif, et donc inapplicable, chez l’Homme. Une
alternative à ceci pourrait être d’utiliser, comme suggéré par les travaux de Lechler,
des lysats cellulaires de cellules allogéniques et d’en « charger » des CPAs du
receveur afin de permettre une protection efficace contre les phases de rejet aigu et
chronique. De tels travaux sont actuellement en cours, au sein du laboratoire.
Autre limite de taille : l’irradiation totale des receveurs. Celle-ci présente
l’avantage de libérer de la place pour la moelle injectée au niveau des niches
hématopoïétiques mais affaiblit en contrepartie le système immunitaire. De plus,
quoiqu’utilisée en clinique, celle-ci est de plus en plus délaissée au profit des
traitements myéloablatifs et/ou d’irradiation d’une petite partie du corps. Afin de
118
remplacer cette étape,
il serait intéressant de tester différentes drogues
myéloablatives, telles le BuSulfan. Ceci nous permettrait également d’établir la
capacité des Tregs à inhiber le rejet chez un individu dont le système immunitaire n’a
pas été affecté. De même, pour des raisons « cinétiques », il conviendra de tester
des stratégies à base de drogues immunosuppressives qui permettront de contenir
les mécanismes de rejet du temps de la culture in vitro des Tregs. En effet, dans le
cas de greffons prélevés sur un donneur cadavérique, les lymphocytes T régulateurs
CD4+ CD25+ ne pourront être précultivés avant l’implantation de l’organe ou de la
moelle osseuse. Aussi, notre stratégie thérapeutique n’est envisageable que si des
drogues immunosuppressives sont capables de suppléer les lymphocytes
régulateurs pendant l’étape d’expansion in vitro et que ces cellules par la suite,
parviennent à prendre le relais des traitements médicamenteux sans que ceux-ci
n’aient d’effets indésirables sur elles. Ainsi, si la Cyclosporine ne pourrait être utilisée
en raison de ces effets similaires sur les Tregs comme sur les effectrices, la
Rapamycine ou le FTY720 pourraient parfaitement correspondre. La rapamycine, en
effet, favorise le développement in vivo des cellules régulatrices, celles-ci ne
répondant pas à l’inhibition de mTOR, et pourrait donc être utilisée. Toutefois, elle ne
semble pas à même d’inhiber seule le rejet. Le FTY720, pour sa part, est une
nouvelle molécule pleines de promesse qui, en séquestrant au niveau des organes
lymphoïdes secondaires les lymphocytes T, pourrait être fortemente intéressante. En
effet, si elle était utilisée pendant l’étape d’expansion des Tregs, elle permettrait de
contenir la pathogénicité des cellules alloréactives tut en les regroupant dans des
sites anatomiques précis, hors de l’organe transplanté. Ceci pourrait permettre d’une
part de potentialiser l’action des Tregs injectés qui n’aurait plus alors qu’à inhiber les
cellules effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires et d’autre part, de
réduire les dommages subis par le greffon.
Notre travail a ainsi permis de mettre en lumière l’immense potentiel
thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans la transplantation de moelle
osseuse, mais également d’organes solides. La tolérance induite est alors durable et
surtout spécifique des antigènes ayant servis à l’activation des cellules régulatrices.
Nous avons montré que l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique ne suffit
pas à induire une tolérance vis-à-vis des alloantigènes. Plus important encore, les
Tregs nécessitent une activation par la voie d’alloreconnaissance indirecte afin d’être
capable d’inhiber l’apparition du rejet chronique. Nous nous sommes enfin intéressés
aux mécanismes impliqués dans l’induction de cette tolérance. Nous avons pu
montrer que le TGF-b est impliqué dans l’induction de tolérance tandis que l’IL-10 ne
semble intervenir que lors de la greffe d’organes solides. La production d’IFN-γ par
les Tregs de même que l’intéraction entre CTLA-4 à leur surface et CD80/86 sur les
effectrices ne sont pas impliqués dans la protection de la moelle osseuse.
119
ANNEXES
120
Supprimer l’immunosuppression
Olivier Joffre, Thibault Santolaria, Joost P.M. van Meerwijk
M/S n° 8-9, vol. 24, août-septembre 2008
Nouvelles.indd 689
surveillance, augmentant
ainsi la fréquence de néoplasmes et d’infections et
la morbidité qui leur est
associée. Enfin, si elles
sont efficaces pour lutter contre les à-vis des antigènes du donneur. Dès
épisodes de rejet aigu, ces drogues n’ont 1953, les travaux de Billingham, Brent et
que peu d’effet sur le rejet chronique Medawar ont confirmé cette hypothèse
(Figure 1). Face à ces limitations majeu- [1]. Si leur approche basée sur l’inducres, la communauté scientifique tente tion d’un chimérisme hématopoïétique
de développer des stratégies visant à durant la vie fœtale apparaît inexploiinduire une tolérance au greffon, c’est- table en clinique humaine, des études
à-dire un état d’hyporéponse immuno- récentes suggèrent que des protocoles
logique spécifique des alloantigènes. similaires sont envisageables chez des
La majorité des approches envisagées individus adultes [2].
repose sur un concept
commun : détourner les
100
mécanismes de tolérance
80
au soi de leur fonction
première.
60
La tolérance « au soi » est
un processus nécessaire
40
afin d’éviter que le sys20
tème immunitaire ne s’attaque aux tissus de l’or0
ganisme. Elle est assurée
0 1
5
10
par différents mécanismes
Années post-transplantation
complémentaires. Dans
2000-2005
1985-1989
les organes lymphoïdes
primaires, les précurseurs Figures 1. Survie des patients après transplantation cardiaque
lymphocytaires autospéci- selon la période de greffe. L’augmentation significative de la
fiques sont éliminés après médiane de survie des receveurs entre les périodes 1985-1989
interaction avec des cellu- et 1995-1999 (72,3 mois contre 131,9) est essentiellement
les d’origine hématopoïé- associée au développement de stratégies thérapeutiques qui
tique. Cette observation ont permis de contrôler efficacement les épisodes de rejet aigu
a conduit de nombreuses et ainsi, d’augmenter la survie du greffon à court terme. Après
équipes à postuler qu’une la première année, entre 2 et 3% des patients perdent encore
greffe de moelle osseuse chaque année le greffon en raison du développement d’une
allogénique puisse induire forme de rejet qualifiée de chronique (source : Agence de la
un état de tolérance vis- biomédecine, www.agence-biomedecine.fr).
Survie (%)
L’obstacle du rejet immunitaire
en transplantation
La transplantation est une stratégie
thérapeutique attractive confrontée à
de nombreux obstacles. Le don d’organe
est notamment limité par le sentiment
ambivalent qu’il provoque, mêlé du désir
de voir repoussées les limites de la vie
et d’une profonde aversion à l’égard de
la manipulation de la mort. D’un point
de vue médical, la principale barrière
est représentée par le système immunitaire du receveur qui met en place et
coordonne un ensemble de mécanismes
visant à détruire le greffon allogénique,
considéré à juste titre comme du nonsoi. Pour contrôler les différentes formes
de rejet, un large panel d’immunosuppresseurs a été développé depuis 40 ans.
Conjugués à l’optimisation des techniques chirurgicales et des méthodes de
conservation, ils ont permis de considérablement augmenter la survie des greffons (Figure 1). Ces molécules présentent
cependant de nombreux inconvénients.
Comme tout traitement médicamenteux,
leur efficacité est influencée par des
différences pharmacocinétiques interindividuelles. La large distribution tissulaire et la nature moléculaire de leurs
cibles sont à l’origine d’effets iatrogènes majeurs, notamment au niveau des
tissus chargés de l’épuration de l’organisme et/ou présentant un fort taux
de renouvellement cellulaire. De plus,
ces molécules inhibent globalement le
système immunitaire et non spécifiquement le compartiment responsable du
rejet. Cette immunosuppression générale altère les mécanismes d’immuno-
O. Joffre : Inserm U563, Section Tolérance et Auto-immunité,
31300 Toulouse, France.
Adresse actuelle : CRUK, LRI, Immunobiology Lab,
London WC2A 3PX, Royaume-Uni.
T. Santolaria : Inserm U563,
Section Tolérance et Auto-immunité,
31300 Toulouse, France.
J.P.M. van Meerwijk : Inserm U563,
Section Tolérance et Auto-immunité,
31300 Toulouse, France.
Université Paul Sabatier Toulouse III,
31400 Toulouse, France.
Institut Universitaire de France, Toulouse, France.
[email protected]
[email protected]
NOUVELLES
Utilisation des lymphocytes T
régulateurs en transplantation
MAGAZINE
NOUVELLE
689
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Un autre mécanisme impliqué dans
l’induction et la maintenance de la
tolérance « au soi » est dépendant de
l’action de lymphocytes T régulateurs
dont l’existence, suspectée depuis
les travaux de Le Douarin [3], a été
définitivement établie par l’équipe de
Sakaguchi [4]. L’observation que leur
déplétion entraîne le développement
d’une pathologie auto-immune létale
[5] démontre que ces cellules, de phénotype CD4+CD25+Foxp3+ et naturellement produites dans le thymus, ont un
rôle non-redondant dans le contrôle
des lymphocytes autospécifiques [11].
Différents groupes ont développé des
approches visant à évaluer leur utilisation potentielle dans le cadre de la
transplantation.
A Voie d’alloreconnaissance
directe
Une nouvelle stratégie de contrôle
du rejet de greffe de moelle osseuse
par des T régulateurs amplifiés
La capacité des lymphocytes T régulateurs à contrôler les mécanismes de rejet
dépend du rapport de force entre les
compartiments suppresseurs et effecteurs allospécifiques. Les cellules T
régulatrices n’étant présentes dans l’organisme qu’en quantités limitées, les
protocoles d’immunothérapie ont longtemps été bloqués par le faible nombre
de cellules obtenues après purification.
De plus, contrairement au compartiment
des lymphocytes effecteurs, le répertoire
des lymphocytes T régulateurs est pauvre
en précurseurs allospécifiques [6]. Dans
le laboratoire, nous avons levé ces deux
barrières en développant une approche
B Voie d’alloreconnaissance
indirecte
CD8+
CD8+
CD4+
CMH I
CD4+
TCR
CMH I
TCR
TCR
CMH II
TCR
CMH II
3
Matériel allogénique
(molécules du CMH solubles,
cellules mortes,
débris cellulaires…)
DC allogénique
2
1
DC syngénique
Figures 2. Deux voies d’alloreconnaissance conduisent à l’activation des lymphocytes T allospécifiques. A. Dans les semaines suivant l’opération, les cellules dendritiques (DC) allogéniques
présentes dans le tissu greffé migrent dans les ganglions lymphatiques drainant. Elles vont alors
stimuler les cellules T allospécifiques par une voie d’alloreconnaissance qualifiée de « directe »
qui implique l’interaction du récepteur à l’antigène des lymphocytes T (TCR) avec les molécules
de CMH allogéniques exprimées par les DC du donneur. Sauf dans le cas particulier de la greffe de
moelle osseuse, le nombre de DC allogéniques est fini puisque ces cellules ne sont pas renouvelées. La voie d’alloreconnaissance directe est donc principalement associée au rejet aigu. B. Les
DC du receveur activent les cellules T allospécifiques par une voie « indirecte », essentiellement
impliquée dans l’initiation et le développement du rejet chronique. Elle est dépendante de la
présentation de peptides allogéniques par les molécules de CMH endogènes. Les antigènes du
donneur, sous forme de cellules mortes ou de molécules solubles, sont captés par phagocytose
ou pinocytose par les DC du receveur (1). Ils sont alors dirigés vers la voie de biosynthèse des
molécules du CMH II sur lesquelles ils sont chargés sous forme de peptides après protéolyse (2).
Ce processus aboutit à l’activation des lymphocytes T CD4+ allospécifiques. Certaines populations
de DC sont aussi capables de présenter, par un mécanisme de cross-présentation, les antigènes
exogènes allogéniques aux cellules T CD8+ via les molécules du CMH I (3).
690
Nouvelles.indd 690
qui nous a permis de prévenir le rejet
d’une allogreffe de moelle osseuse [7].
Après purification, nous avons augmenté
le nombre de lymphocytes T régulateurs
issus du receveur via une étape de culture
in vitro. Afin d’enrichir la population
obtenue en précurseurs allospécifiques,
nous avons utilisé des cellules présentatrices d’antigènes du donneur comme
source de signal mitogène. Nous avons
alors testé la capacité des cellules T
régulatrices du receveur ainsi obtenues à
contrôler les mécanismes de rejet après
allogreffe de moelle osseuse chez des
animaux conditionnés par une irradiation non-lymphoablative. Le but avoué
du prétraitement était de libérer des
niches pour les cellules souches hématopoïétiques allogéniques et de déprimer transitoirement et partiellement la
réactivité du système immunitaire afin
de faciliter l’action de la population
suppressive injectée. Dans ce système,
nous avons montré que les cellules régulatrices issues du receveur et amplifiées
selon notre protocole contrôlent de façon
durable le rejet dirigé contre la moelle
osseuse allogénique. Contrairement aux
drogues immunosuppressives, nous avons
observé que ce traitement inhibe uniquement le compartiment alloréactif, et non
le système immunitaire dans sa globalité.
Notre procédure permet donc un contrôle
total du rejet tout en évitant les effets
secondaires des drogues. L’intérêt de ce
type d’approche repose aussi sur le fait
qu’à leur tour, les cellules hématopoïétiques allogéniques transférées participent
à l’induction de tolérance des lymphocytes T et B néosynthétisés dans les organes
lymphoïdes primaires ainsi qu’à la survie
de la population régulatrice injectée.
Encouragés par ces résultats, nous avons
utilisé le même protocole pour tenter de
prévenir le rejet de tissus ou d’organes
solides [8]. Contrairement aux résultats obtenus après allogreffe de moelle
osseuse, les cellules T régulatrices n’ont
que légèrement retardé la destruction
de greffes allogéniques de cœur ou de
peau. Étant donné que les lymphocytes T
régulateurs ne survivent qu’en présence
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Une préactivation
des cellules T régulatrices
par les voies d’alloreconnaissance
directes et indirectes est nécessaire
pour inhiber totalement les
mécanismes de rejet aigu et chronique
Le rejet d’allogreffe est orchestré par des
lymphocytes T susceptibles de reconnaître
les alloantigènes de deux façons fondamentalement distinctes (Figure 2). À court
terme, les cellules T allospécifiques sont
stimulées « directement » par les cellules présentatrices d’antigène du donneur
migrant du greffon aux organes lymphoïdes draînants. Dans ce cas, les cellules T
de l’hôte reconnaissent donc les peptides
allogéniques présentés par les molécules
du CMH du donneur. Cette voie d’activation est essentiellement associée aux
épisodes de rejet aigu. À plus long terme,
les cellules présentatrices d’antigène de
l’hôte colonisent le tissu greffé, captent
des antigènes, avant d’activer « indirectement » d’autres lymphocytes T allospécifiques. Ces derniers, qui reconnaissent donc des complexes formés par des
molécules du CMH du soi et des peptides
allogéniques, vont alors initier les mécanismes de rejet chronique. Le protocole de
culture que nous avions établi ne permettait d’enrichir la population régulatrice
qu’en cellules reconnaissant les antigènes
du donneur par la voie directe. Nous avons
M/S n° 8-9, vol. 24, août-septembre 2008
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Sur le chemin
d’une utilisation clinique ?
Si ces données sont encourageantes, de
nombreux obstacles restent cependant à
résoudre avant de transposer notre approche à la clinique humaine. Le premier est
logistique puisqu’il conviendra de contrôler le rejet de la moelle et de l’organe le
temps nécessaire à la culture des cellules T
régulatrices. Le deuxième concerne le fait
que les lymphocytes T mémoires jouent un
rôle important dans le rejet de greffe chez
l’homme. Les souris de laboratoire étant
élevées et maintenues dans des structures
exemptes de pathogènes, leur système
immunitaire en est quasiment dépourvu.
Des travaux complémentaires sont donc
nécessaires afin d’évaluer la capacité des
cellules T régulatrices à contrôler l’alloréactivité des lymphocytes mémoires. Le
troisième obstacle est lié à la purification
des cellules régulatrices. Chez des animaux de laboratoire, un enrichissement
basé sur l’expression du marqueur CD25
permet d’obtenir une population virtuellement pure de cellules suppressives. Chez
l’homme, la situation est plus complexe
puisque le marqueur CD25 est exprimé
par les cellules T activés et que Foxp3, de
par sa localisation nucléaire, n’est pas
exploitable. Des études récentes semblent
suggérer que d’autres marqueurs, tels que
CD127 ou FR4, pourraient être utilisés [9,
10].
Même si la route est encore longue, notre
travail suggère que les cellules T régulatrices pourront être utilisées en clinique afin d’induire un état de tolérance
à un greffon allogénique. Le bénéfice
attendu pour les patients est immense
puisque ce type d’approche permettra
de contrôler totalement et durablement
les mécanismes de rejet sans induire de
toxicité et sans favoriser le développement de néoplasmes ou d’infections
opportunistes. ‡
Tregs-based immunotherapy:
an efficient way to fully inhibit
acute and chronic rejection
MAGAZINE
émis l’hypothèse selon laquelle l’absence
de contrôle des mécanismes de rejet chronique était due à l’absence, dans la population injectée, de cellules suppressives
reconnaissant les alloantigènes par voie
indirecte. Nous avons donc modifié notre
protocole de culture in vitro afin de générer une population de cellules T régulatrices enrichie en précurseurs capables de
reconnaître les alloantigènes à la fois par
les voies directe et indirecte. En utilisant
cette population, nous avons pu inhiber totalement les mécanismes de rejet
chronique et ainsi protéger à long terme
des doubles greffes de moelle osseuse et
de peau ou de cœur. En développant une
stratégie permettant de dévier les deux
mécanismes d’induction de tolérance au
soi de leur fonction première, nous avons
donc induit un état de tolérance durable
et spécifique à des allogreffes de tissus
et d’organes.
NOUVELLES
des antigènes pour lesquels ils sont spécifiques, et que contrairement à la moelle
osseuse, les tissus solides n’ont que peu
de cellules présentatrices d’antigènes
capables de délivrer les signaux nécessaires, nous avons testé si la co-injection
de moelle osseuse allogénique avec les
cellules T régulatrices pourrait favoriser
la protection de la greffe solide. Dans ce
contexte, les lymphocytes T régulateurs
préviennent donc le rejet de la moelle
qui en retour favorise leur survie. Cette
approche nous a permis d’inhiber efficacement les épisodes de rejet aigu mais
pas le développement du rejet chronique.
Ce résultat démontre qu’un chimérisme
hématopoïétique ne garantit pas la survie
des greffes à long terme.
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RESUME
Thibault Santolaria
INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D’ORGANES SOLIDES PAR LES
LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+FOXP3+
Directeur de Thèse : Joost van Meerwijk
Thèse soutenue à Toulouse, le 26 janvier 2009
La principale limite à la transplantation d’organe réside dans l’initiation d’une
forte réponse immune dirigée contre le greffon. Si l’utilisation de drogues
immunosuppressives a largement permis de contrôler l’apparition du rejet aigu, de
nombreux patients souffrent d’un rejet chronique qui conduit inévitablement à la
destruction de l’organe transplanté. L’induction d’une tolérance immunologique vis-àvis des antigènes du greffon pourrait permettre de s’affranchir du rejet ainsi que de la
nécessité d’un traitement à vie avec des drogues immunosuppressives. Une
tolérance similaire existe déjà à l’état physiologique vis-à-vis des antigènes du soi.
Elle est médiée en périphérie par une sous population lymphocytaire douée de
propriétés immunosuppressives : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+.
Lors de ce travail de thèse, j’ai pu montrer que, chez des souris irradiées à
des doses cliniquement applicables, l’injection de cellules régulatrices
CD4+CD25+Foxp3+ stimulées in vitro avec des alloantigens, induit une tolérance
durable et spécifique vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et, par la suite, de
cœur ou de peau. Les Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par la voie
directe d’alloreconnaissance inhibent uniquement le développement du rejet aigu, en
dépit de l’état de chimérisme induit. En revanche, des Tregs spécifiques pour les
antigènes présentés par les voies directe et indirecte de reconnaissance préviennent
l’apparition des phases de rejet aigu et chronique. Nos résultats démontrent ainsi le
fort potentiel des Tregs, activés de manière appropriée, pour de futures approches
de thérapie cellulaire, dans le but d’induire une tolérance durable aux greffes
allogéniques.
Mots clés : lymphocytes T régulateurs, transplantation, mécanismes d’action
Discipline : Immunologie
Equipe Tolerance et Autoimmunité
INSERM U563, Hôpital Purpan
31024 Toulouse cedex 3
8