Régulation et fonction du récepteur GPR84 dans le cerveau dans
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JULIE PAGÉ RÉGULATION ET FONCTION DU RÉCEPTEUR GPR84 DANS LE CERVEAU DANS DES CONDITIONS INFLAMMATOIRES Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en physiologie-endocrinologie pour l' obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.) FACUL TÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LA V AL QUÉBEC 2009 © Julie Pagé, 2009 II Résumé Lors d'études antérieures, l'analyse du transcriptome des cellules micro gliales à l'aide de micropuces à ADN nous a permis d'identifier le récepteur transmembranaire GPR84. Dans la présente étude, nous avons testé l 'hypothèse que la transcription du GPR84 est augmentée dans la microglie durant l'inflammation. Plus précisément, nous avons étudié la régulation du GPR84 dans le cerveau durant une endotoxinémie et une encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAB) . Nos résultats ont montré une augmentation de l'expression du GPR84 au cours de ces deux conditions inflammatoires, et ce uniquement dans la microglie. Nous avons ensuite tenté d'identifier le rôle du GPR84 en testant l 'hypothèse selon laquelle ce récepteur modulerait le développement des symptômes dûs à l'inflammation. À l'aide de souris déficientes en GPR84, nous avons évalué l'influence de ce récepteur durant une EAB, une endotoxinémie et une encéphalite induite , par le virus de l 'herpès simplex de type 1. Nous n'avons observé aucune influence du GPR84 dans ces modèles. Nous concluons que le GPR84 est exprimé non spécifiquement dans plusieurs conditions neuroinflammatoires, mais qu'il n'y exerce pas toujours un effet significatif et que son rôle reste inconnu. III Avant-propos C'est après plus de deux années de théorie acquise à l' Université de Trois-Rivières que Luc Vallières m' a permis d' acquérir concrètement une expérience sur le terrain en m ' acceuillant dans son laboratoire dans le cadre d' un stage. Mon apprentissage s' est ensuite poursuivi par un captivant projet de maîtrise dans le domaine, en plein essor, qu'est la neuroimmunologie. Arrivant à la dernière étape qui couronne la réalisation de ma maîtrise, je peux dire que ce projet m ' a fait grandir à tous les points de vue. Evidemment, j ' ai appronfondi mes connaissances scientifiques et, de plus, j ' ai pu me familiariser avec le milieu de la recherche ainsi qu'avec ses hauts et ses bas, rendant l'expérience des plus palpitantes. Tout d'abord, je veux remercier le Dr. Luc Vallières de m'avoir ouvert la porte de son laboratoire et de m ' avoir bien conseillé et dirigé tout au long de mon proj et. Etant touj ours disponible, à l'écoute, honnête, optimiste et rigoureux, il a su être un directeur hors paIr. Tout au long de ce périple, j'ai été entouré d'une formidable équipe de travail. Je remercie Pierrot Tremblay, Alma Posvandizc, Julie Audoy, Jérôme Villeneuve, Hugo Galarneau, Marie-Josée Beaudet, Andréanne Bédard et Caroline Bouchard qui ont toujours été là tant pour le soutien moral que pour les conseils judicieux. Merci à toute l'équipe vous avez été une superbe belle gang, j'ai eu beaucoup de plaisir à travailler avec vous et je ne vous oublie pas. Mon projet de maîtrise se divise en deux partie soit l'étude de la régulation du GPR84 dans l'inflammation que l'on retrouve au chapitre 2 et l' étude de sa fonction durant l'inflammation que l'on retrouve au chapitre 3. Je dois remercier particulièrement Caroline Bouchard qui a contribué à la majeur partie des résultats figurant dans le chapitre 2. Grâce à elle je disposais d'une base solide afin d'amorcer mon projet. Ce dernier a débuté par IV l' étude de l'expression du GPR84 par la microglie dans l'EAE (Figure 6 du Chapitre 2) et s'est poursuivi par l'étude de la fonction du GPR84 dans des conditions neuroinflammatoires (Chapitre 3). Je veux remercier mes parents, Louise et Réjean, de m' avoir encouragé à persévérer tout au long de mes études et d'avoir toujours été là au bon moment pour me donner la petite tape dans le dos nécessaire. Merci aussi à ma soeur Mylène et à mon frère Sébastien. La belle complicité que nous avons ensemble me permet de constamment évoluer dans la vie. Un merci particulier à mon compagnon de vie qui, malgré les différentes épreuves, a toujours su trouver les mots pour me réconforter. Merci Patrick, de m' avoir épaulé durant cette importante étape de ma vie, sans toi je n' y serais tout simplement pas arrivé. Merci à tous d' avoir contribué à cette réussite personnelle. v Table des matières Résumé..................................................................................................................................11 Avant-propos .......................................................................................................................111 Table des matières ................................................................................................................ V Liste des figures ............................................................................................................... VIII Liste des tableaux ................................................................................................................. X Liste des abréviations ......................................................................................................... XI INTRODUCTION ................................................................................................... 1 1. 1.1. Structure et fonction des GPCRs .............................................................. .......... .... 2 1.1. 1. Classification des GPCRs .................................................................... ..... ..... 2 1.1.2. Structure des GPCRs et protéines G ................................................. ..... ........ 4 1.1.3. Signalisation intracellulaire des GPCRs .................................... .................... 7 1.2. Système immunitaire inné .................................................................................... 14 1.2.1. Réponse innée .............................................................................................. 14 1.2.2. Réponse innée dans le système nerveux central .......................................... 15 1.3. GPCRs dans le système immunitaire ................................................................... 16 1.3 .1. 1.4. Expression et fonctions des GPCRs chez les leucocytes ............................. 16 GPCRs et les maladies neuroinflammatoires ....................................................... 24 1.4.1 . Implication des GPCRs dans l' EAE ............................................................ 25 1.4.2. Implication des GPCRs dans l'endotoxinémie ............................................ 29 1.5. Objectifs des travaux ............................................................................................ 32 G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 84, A MICROGLIA-ASSOCIATED 2. PROTEIN EXPRESSED IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS ........... 33 2.1. Résumé ................................................................................................................. 33 2.2. Abstract ................................................................................................................ 34 2.3. Introduction .................................................................................... ...................... 34 2.4. Materials and methods ................................................................... ...................... 36 2.4.1 . AnimaIs ........................................................................................................ 36 VI 2.4.2. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) ..... .. .............. ........... . 36 2.4.3 . Intravenous injection ofTNF ................................................................... ... . 36 2.4.4. Intracerebral injection of TNF ............ .................. ........................ .. ........ ..... 36 2.4.5 . EAE induction ........................................... ................................................ ... 37 2.4.6. Tissue preparation .................................. ................................... ................. .. 37 2.4.7. cDNA cloning ................................................................................... ........... 37 2.4.8. ln situ hybridization .................... .................. ................................. ..... ..... .... 38 2.4.9. Combined immunohistochemistry and in situ hybridization ....................... 39 2.4. 10. Volumetric analysis ............................................................. ............. ............ 39 2.4.1 1. Cell counting .......................................................................................... ...... 39 2.4. 12. Imaging ................................................. .................................. ........ .... ......... 40 2.4.13. Optical densitometry .................................................................................... 40 2.4.14. Cell culture ................................................................................................... 40 2.4.15. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ............................................... 41 2.4.16. Statistical analysis ........................................................................................ 42 2.5. Results .................................................................................................................. 42 2.5.1. Microglia express GPR84 during endotoxemia ........................................... 42 2.5 .2. Peripheral monocytic cells express GPR84 in response to LPS .................. 43 2.5 .3. Proinflammatory cytokines induce GPR84 expression in cultured microglia through a dexamethasone-insensitive mechanism ...................................... ................. 44 2.5.4. TNF induces GPR84 expression in the brain ............................................... 44 2.5.5. TNF and IL-1 partially mediate the induction of GPR84 expression in microglia by LPS ......................................................................................................... 45 2.5.6. 2.6. 3. Microglia express GPR84 during EAE ........................................................ 46 Discussion ............................................................................................................ 46 GPR84 FUNCTION IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS ............ 55 3.1. Résumé ..................................................................................................... ............ 55 3.2. Abstract ................................................................................................................ 56 3.3. Introduction .......................................................................................................... 57 3.4. Materials and Methods ......................................................................................... 58 VII 3.4.1. AnimaIs ........................................................................................................ 58 3.4.2. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) ................................. 58 3.4.3. Active induction ofEAE .............................................................................. 58 3.4.4. T-maze test ................................................................................................... 59 3.4.5. cDNA cloning .............................................................................................. 59 3.4.6. RNA preparation and microarray analysis ................................................... 59 3.4.7. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) ............................................... 60 3.4.8. Herpes simplex virus encephalitis induction ............................................... 60 3.4.9. Statistics ....................................................................................................... 61 3.5. 3.5.1. Effect of GPR84 during endotoxemia .......................................................... 62 3.5.2. Influence of GPR84 on EAE development .................................................. 62 3.5.3. Importance of GPR84 in experimental herpes simplex virus encephalitis .. 63 3.6. 4. Results .................................................................................................................. 62 Discussion ............................................................................................................ 64 CONCLUSION ...................................................................................................... 72 RÉFÉRENCE BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................... 75 VIII Liste des figures CHAPITRE 1 : INTRODUCTION Figure 1 - Représentation trois dimensions des résidus conservés d'un récepteur GPCR de la famille de la rhodopsine ...................................................................................... 5 Figure 2 - Schématisation du cycle GDP/GTP des protéines G suite à l' activation d' un GPCR par son ligand ............................................................................................... 6 Figure 3 - Schéma montrant l' implication de plusieurs molécules, dont le calcium, dans l' activation du facteur de transcription NF AT ..................................................... 10 Figure 4 - Représentation des différents mécanismes impliqués dans la diversité de la signalisation cellulaire en réponse à un seul agoniste ........................................... 12 Figure 5 - Illustration montrant les différentes fonctions occupées par les GPCRs chez le macrophage ........................................................................................................... 17 Figure 6 - Représentation des différentes voies de signalisation impliquées suite à l' activation de BLTI ............................................................................................. 19 Figure 7 - Schéma montrant les différents rôles de PAF ainsi que les cellules ciblées ..... 21 Figure 8 - Schématisation des interactions cellulaires du modèle de l'EAE tel qu' on le comprend actuellement ......................................................................................... 26 CHAPITRE 2: ASSOCIATED G PROTEIN-COUPLED PROTE IN EXPRESSED RECEPTOR 84, A IN MICROGLIA NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS Figure 9 - GPR84 is strongly expressed by microglia during endotoxemia......................... 49 Figure 10 -GPR84 is expressed by peripheral macrophages and, to a lesser extent, monocytes upon stimulation with LPS .................................................................. 50 Figure Il - GPR84 expression is induced in cultured microglia by proinflarnrnatory molecules through a dexamethasone-insensitive mechanism ................................ 51 Figure 12 - GPR84 expression is induced after intracerebral injection of TNF ................... 52 Figure 13 - Reduced expression of GPR84 in mice deficient in TNF and/or IL-l ............... 53 Figure 14 - GPR84 is expressed in the CNS during EAE ..................................................... 54 IX CHAPITRE 3: GPR84 FUNCTION IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS Figure 15 - Effect ofLPS on the behavior of GPR84 WT and GPR84 KO mice ................. 68 Figure 16 - Gene expression in GPR84 knockout and wild-type mice stimulated with LPS ......................................................................................................................... 69 Figure 17 - Influence of GPR84 during EAE ........................................................................ 70 Figure 18 - Effect of GPR84 during experimental herpes simplex virus encephalitis .......... 71 x Liste des tableaux CHAPITRE 3: GPR84 FUNCTION IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS Tableau 1 - Primers used for quantitative RT-PCR .................................................. .... ..... ... 66 Tableau 2 - Genes identified by microarray as being differentially regulated between GPR84 knockout and wild-type mice 6h after LPS treatment. ................ ....... ....... 67 XI Liste des abréviations ADN Acide désoxyribonucléique AKAP Protéines d' ancrage A kinase AMPc Hormone adénocorticotrope AP Protéine Activatrice APP Protéine précurseur amyloïde ARN Acide ribonucléique ATF Facteur d' activation de la transcription ATP Adénosine triphosphate BHE Barrière hémato-encéphalique BLT Récepteur au leukotriène B4 Calcium CASR Récepteur sensible au calcium CBP Protéine liant CREB CCR Récepteur de chimiokines C-C CRE Élément de réponse à l' AMPc CREB Protéine liant les éléments de réponse de l' AMPc CREM Modulateur des éléments de réponse à l' AMPc CVO Organe circumventriculaire CX3CR Récepteur de chimiokines C-X-3-C CXCR Récepteur de chimiokines C-X-C DAG Diacylglycérol EAE Encéphalomyélite auto immunitaire expérimentale EDF Famille des gènes de différentiation endothéliale ERK Kinases régulées par le signal extérieur FPR Peptide N-formylé GABA Acide gamma-aminobutyrique GDI Inhibiteur de dissociation de la guanine GDP Guanosine diphosphate GEF Facteur d'échange de la guanine XII GPCR G protein-coupled receptor GRK GPCRkinase GRM Récepteurs métabotropiques du glutamate GTP Guanosine triphosphate HSV Virus herpès simplex ICAM Immune ceU adhesion molecule IFN Interféron IKK IkB kinase IL Interleukine iNOS Inducible NO synthase IP 3 Inositol l , 4, 5-triphosphate IRAK Interleukin-receptor-associated kinase JNK Kinases c-Jun N-terminal KO Knockout LPA Acide lysophosphatidique LPS Lipopolysaccharide LTB4 Leucotriène B4 MAP Mitogen-activated-protein MOG Myelin oligodendrocyte glycoprotein MyD Myeloid differentiation primary response gene NFAT Facteur nucléaire des lymphocytes T activés NF-KB Nuclear factor kB NK NK Neurokine Natural kiUer NO Oxyde nitrique NPY Neuropeptide Y OVLT Organum vasculum of the lamina terminalis PAF Facteur activateur des plaquettes PAMP Pathogen-associated molecular pattern PAR Protéase activé PCR Polymerase chain reaction XIII PO Prostaglandine POE Prostaglandine E PI-3K Phosphoinosi tide 3 -kinase P1P2 Phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate PKA Protéine kinase A PKC PLC Protéine kinase C qRT-PCR Real-time reverse transcription-PCR ROS Regulators ofG protein signaling SAPK Protéines kinases activées par le stress SNC Système nerveux central SP Substance P TAS Récepteurs gustatif Th T helper TLR Toll-like receptor TNF Tumor necrosis factor TRAF TNF receptor-associated factor TREM Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cells VCAM Vascular cel! adhesion molecule WT wild-type XCR Récepteur de chimiokines X-C Phospholipase C CHAPITRE 1 1. INTRODUCTION On sait depuis peu que le système immunitaire et le système nerveux sont en étroite relation. En effet, une réponse immunitaire peut se développer à l'intérieur du cerveau débutant au niveau des régions dépourvues de jonctions serrées. On retrouve deux types de macrophages impliqués dans la réponse immunitaire à l' intérieur du système nerveux central (SNC), soit les cellules microgliales et les cellules péri vasculaires, qui ont chacunes des fonctions qui leurs sont propres. Les macrophages représentent la première ligne de défense contre un agresseur. Ils agissent en tant que cellules régulatrices et effectrices dans les réponses immunitaire et inflammatoire. L'action des phagocytes mononucléaires peut être bénéfique par l'attaque et la neutralisation de pathogènes envahisseurs de même que par la sécrétion de facteurs neurotrophiques. Toutefois, dans certaines pathologies telle que la sclérose en plaques, les macrophages ont plutôt une action néfaste en agissant comme cellules présentatrices d'antigènes et en sécrétant des cytokines et molécules cytotoxiques. Afin de moduler, selon les pathologies, l'activité microgliale par activation ou inhibition cellulaire, on doit connaître la régulation de ces cellules. L'élucidation des voies de signalisation dirigeant la formation et l'activation des cellules microgliales permettra de développer des immunosuppresseurs ayant une spécificité supérieure afin d' établir un meilleur contrôle de l'inflammation. Afin d'approfondir le processus de régulation des cellules microgliales, on a récemment analysé le transcriptome de ces cellules et identifié des gènes spécifiquement exprimés par la microglie. Parmi eux, on retrouve le gène G protein-coupled receptor 84 (GPR84) codant un récepteur transmembranaire couplé aux protéines G (GPCR), dont l' expression est inductible dans différentes conditions inflammatoires. Ce récepteur représente un intérêt scientifique car même si la fonction exacte du GPR84 n'est pas encore connue, les GPCRs sont des cibles thérapeutiques de choix dans le domaine pharmaceutique (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). En effet, presque la moitié des drogues modernes visent ces récepteurs. 2 Chapitre1: Introduction L' élucidation du rôle de certains GPCRs, particulièrement GPR84, au nIveau immunitaire durant l' inflammation nous permettrait de développer des thérapies antiinflammatoires plus spécifiques ayant moins d' effets secondaires chez le patient. 1.1. Structure et fonction des GPCRs 1.1.1. Classification des GPCRs Les GPCRs représentent une des plus grandes familles de protéines du génome des mammifères. Leurs fonctions varient, mais plusieurs éléments structuraux sont communs entre les différents GPCRs (Schioth and Fredriksson 2005). Afin qu' une protéine soit classée parmi les GPCRs, elle doit répondre à deux principales caractéristiques (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003) : la première étant d' être composée de sept séquences consécutives représentant sept hélices alpha de TMl à TM7 qui traversent la membrane plasmique de façon à former un récepteur permettant de transmettre le signal d' un ligand extracellulaire à l'intérieur de la cellule. La deuxième correspond à la capacité de la protéine d' interagir avec une protéine G. De nombreux ligands ciblent ces récepteurs, incluant des ions, des odorants organiques, des amines, des peptides, des lipides, des nucléotides et des photons (Lombardi, Kavelaars et al. 2002). Plusieurs GPCRs sont exprimés et ont un rôle à jouer au niveau du système immunitaire, tels des récepteurs aux chimiokines, à certains médiateurs de l'inflammation (leucotriènes, prostaglandines) et aux neurotransmetteurs. Récemment, des études phylogénétiques ont permis d'analyser et de classer la plupart des GPCRs du génome humain. Les GPCRs sont classées selon cinq grandes familles principales soit : Glutamate (G), Rhodopsine (R), Adhésion (A), Frizzled/Taste2 (F), et Sécrétine (S), qui représentent le système de classement GRAFS. 1.1.1.1. Cette Famille du Glutamate famille contient plusieurs récepteurs connus dont huit récepteurs métabotropiques du glutamate (GRM), deux récepteurs de l'acide gamma-aminobutyrique (GABA), un récepteur sensible au calcium (CASR) et cinq récepteurs gustatif (TASl) (Schioth and Fredriksson 2005). Ces récepteurs possèdent un domaine de reconnaissance au ligand, à l' intérieur de la portion N-terminale, formé par deux lobes distincts séparés par Chapitre1: Introduction 3 une cavité. Les récepteurs de la famille du glutamate se retrouvent chez les bilatériens incluant le zebrafish et le fugu et font partie des plus anciennes familles de GPCRs. 1.1.1.2. Famille des récepteurs de l'Adhésion Les récepteurs de cette famille sont pour la plupart composés de régions GPCR-like traversant la membrane plasmique et qui sont reliées par différents domaines fonctionnels (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). La portion N-terminale contient entre 200 et 2800 acides aminés et renferme des motifs adhesion-like tels: EGF-like, mucin-like et des motifs riches en cystéine. Ces derniers permettent à ces récepteurs d' avoir une fonction au niveau de l' adhésion, d' où leur nom. 1.1.1.3. Famille des récepteurs FrizzlediTaste2 Il n ' y a pas de similarité évidente entre les récepteurs des branches taste2 (TAS2) et frizzled, néanmoins on retrouve différentes séquences concensus entre les deux groupes de récepteurs (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Les récepteurs TAS2 sont exprimés par la langue et l'épithélium du palais, mais leur fonction exacte n'est pas connue. Les récepteurs frizzled possèdent une portion N-terminale d'environ 200 acides aminés contenant des cystéines conservées. Les frizzled ont un rôle dans le contrôle du devenir cellulaire, de la prolifération et de la polarité durant le développement métazoaire. 1.1.1.4. Famille des récepteurs Sécrétine Ces récepteurs ont la capacité de lier des peptides de grande taille et ont une activité paracrine (Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Parmi cette famille, on retrouve des récepteurs de plusieurs hormones et peptides distincts dont la sécrétine, la calcitonine et le glucagon (Hermans 2003). La portion N-terminale permet la liaison de ligands et est formée d'environ 60 à 80 acides aminés contenant des résidus cystéine. 1.1.1.5. Famille de la Rhodopsine La famille de la rhodopsine est la principale famille de GPCR qui est composée de près de 700 récepteurs différents dont plusieurs répondent à des neurotransmetteurs, prostaglandines, peptides et neuropeptides (Hermans 2003). Les récepteurs de cette famille sont caractérisés par la présence d'un motif NSxxNPxxY dans le segment TM7 et d'un Chapitre1: Introduction 4 motif DRY à l'extrémité cytoplasmique du segment TM3 (Schioth and Fredriksson 2005). Le motif DRY serait impliqué au niveau de la structure dynamique du récepteur ainsi que dans le couplage des protéines G. Comme la portion N-terminale comporte peu d'acides aminés, les ligands se lient habituellement aux récepteurs à l' intérieur d'une cavité entre les segments TMs. Cette famille peut être divisée en quatre principaux groupes soit a, ~, y, 8 et 13 sous-groupes. La composition du récepteur GPR84 lui permet de s' apparenter aux récepteurs de cette famille (Wittenberger, Schaller et al. 2001 ; Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003). Il contient les caractéristiques structurales nécessaires, dont le motif DRY en TM3 ainsi que plusieurs autres résidus conservés à l' intérieur des segments TM! à TM7. Par contre, le GPR84 n'est pas classé à l' intérieur d'une sous-famille parce qu'aucun récepteur ne lui est étroitement lié. Il entre ainsi dans la catégorie des récepteurs orphelins. 1.1.2. Structure des GPCRs et protéines G 1.1.2.1. Structure des GPCRs Même si les grandes variétés de GPCRs sont impliquées dans une multitude de fonctions cellulaires différentes, les récepteurs de cette famille possèdent des caractéristiques structurales qui leurs sont communes. Les GPCRs sont constitués d'une chaîne peptidique de sept segments hydrophobes formant des hélices-a, séparées par des boucles hydrophiles intra et extracellulaires (Hermans 2003). Dans la plupart des cas, les boucles extracellulaires ainsi que la portion NH2-terminale, qui est extracellulaire, permettent la liaison des ligands aux récepteurs. Pour leur part, les domaines des boucles intracellulaires et la portion COOH -terminale sont liés à des médiateurs intracellulaires dont les protéines G. Les domaines conservés entre les différents GPCRs sont généralement situés à l'intérieur des segments transmembranaires. Chapitrel: Introduction 5 Extracellulaire (1 NPxxY motif TM1-2-7 Arg-Cage (Dry motif) TM3-5-6 Cytopla,sme Tiré et adapté de Bal/esteras et al. (2001) Figure 1 - Représentation trois dimensions des résidus conservés d'un récepteur GPCR de la famille de la rhodopsine. 1.1.2.2. Structure des Protéines G Il est connu que la majorité des signaux intracellulaires délivrés suite à l'activation des GPCRs le sont par l'entremise des protéines G associées au récepteur. Aujourd' hui on sait que plusieurs autres protéines peuvent jouer ce rôle (Tilakaratne and Sexton 2005). Les protéines G hétérotrimériques liées aux GPCRs sont formées de 3 sous-unités; a , ~ et y. On dénombre 23 types de sous-unités alpha qui sont regroupés dans 4 catégories soit; Gai/o, Gas, Gaq ll, Gal2 (Hermans 2003). Chacune possède des caractéristiques spécifiques qui lui permettent d ' agir auprès d'un certain type d' effecteur. Ces sous-unités sont composées d ' un domaine de liaison aux nucléotides ainsi qu'un domaine hélice-a et ont la capacité de lier le GTP. Elles interagissent avec leur récepteur ainsi qu' avec plusieurs molécules effectrices. Les sous unités ~ et y peuvent se retrouver sous 6 à 12 types différents. Elles fonctionnent en tant qu'hétérodimère qui s'associe à Ga. Chapitre!: Introduction 6 Les protéines G hétérotrimériques, en absence de ligand, sont associées au récepteur GPCR au niveau de la surface intracellulaire. Lorsqu' un agoniste (facteur d'échange de la guanine, GEF) se lie au récepteur, on observe des modifications structurales au niveau des régions intracytoplasmiques qui vont affecter la sous unité a (McCudden, Hains et al. 2005). L'échange de la guano sine diphosphate (GDP) présent sur cette sous-unité sera favorisé au profit de la guanosine triphosphate (GTP). Pour leur part, les sous unités ~y agissent plutôt comme un inhibiteur de dissociation de la guanine (GDI) en s' associant au Ga. Lorsque le GTP se lie à Ga, s'en suit une dissociation de G~y. Les deux molécules ainsi séparées peuvent aller interagir avec plusieurs protéines effectrices de la signalisation cellulaire ce qui inclut le système de seconds messagers. Après un certain temps, le Ga hydrolyse le GTP en GDP grâce à son activité GTPase et retourne ainsi à son état inactif. Le G~y se joint au Ga ce qui met fin à toutes activités signalétiques. Le cycle de l'activation des protéines G est illustré par la figure 2. Une étude investiguant la spécificité des proteines G au GPR84 suggère que ce récepteur signaliserait par une voie sensible à la toxine pertussis en utilisant les sous-unités de la catégorie Gi/o (Wang, Wu et al. 2006). ~ . GEF GOP GTfO .L .. $ .~ ..~~ .. 7~, p. 1 ~ GAP ... 1 1 @J ct- effectri ce ~ .-effectri ce Tiré et adapté de McCudden, Hains et al. (2005) Figure 2 - Schématisation du cycle GDP/GTP des protéines G suite à l'activation d'un GPCR par son ligand. Chapitre1: Introduction 7 1.1.3. Signalisation intracellulaire des GPCRs Les récepteurs GPCRs peuvent induire une foule d' activités cellulaires par l' entremise de l' activation de différentes voies de signalisation. Ceci implique les différentes sous-unités des protéines G qui, une fois activées, vont cibler spécifiquement divers effecteurs tels l' adénylate cyclase, les phospholipases et les canaux ioniques. 1.1.3.1. Voie de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) 1.1.3.1.1. Adénylate cyclase La première molécule effectrice de Ga à être identifiée fut l' adénylate cyclase. Dans la plupart des cas, cette enzyme est stimulée par la sous-unité Gas après liaison de ligands activateurs sur le GPCR et est inhibée par la Gai/o après liaison de ligands inhibiteurs (McCudden, Rains et al. 2005). Ceci permet une régulation signalétique qui contrôle la durée du signal intracellulaire. Les sous unités G~y ont aussi une influence sur l' adénylate cyclase quoique moins fréquemment observée. On retrouve une forte présence des différentes isoformes de l' adénylate cyclase au niveau du cerveau des mammifères (Ranoune and Defer 2001). Cette enzyme est transmembranaire et possède deux sousunités catalytiques qui, en présence de magnésium, peuvent catalyser l' adénosine triphosphate (ATP) en AMPc. Ce dernier représente un second messager d'importance dans la signalisation des GPCRs qui agit en se liant à la protéine kinase A (PKA) et en l' activant. 1.1.3.1.2. Protéine kinase A La PKA est une protéine tétramérique située dans le cytoplasme cellulaire formée de 2 sous-unités catalytiques et de 2 sous-unités régulatrices (Taylor, Buechler et al. 1990). On connaît différents types d'unités régulatrices soit RIa, d'unités catalytiques a, ~, Rl~, RIla, Rll~ et 3 types y. Les unités régulatrices sont composées d'un domaine D/D en N-terminale qui permet la liaison de la PKA aux protéines d'ancrage A kinase (AKAP) qui ont un rôle à jouer au niveau de l'organisation des réponses cellulaires (Taylor, Kim et al. 2005). Ce domaine D/D est lié au domaine A liant l'AMPc et la portion C-terminale contient elle aussi un domaine de liaison à l'AMPc (domaine B) qui est libre de lier le second messager. Le tétramère de la PKA peut être activé par un total de quatre molécules d'AMPc (Taylor, Buechler et al. 1990). Tout d'abord, lorsque l'AMPe entre en contact Chapitrel: Introduction 8 avec la PKA, les 2 sites du domaine B, situés en C-terminal, sont disponibles pour liaison du second messager. Une fois que les molécules d'AMPc sont liées à la PKA, il s'en suit un changement conformationnel qui va pennettre l'exposition des deux autres sites de liaison de l'AMPc, situés à l'intérieur du domaine A. Les sous-unités catalytiques sont ainsi libérées et deviennent actives. Il existe un grand nombre de substrats pouvant être phosphorylés par la PKA menant à l'activation de ces différents enzymes, facteurs de transcriptions et autres. La principale cible de la PKA dans la signalisation par les GPCRs est le facteur de transcription CREB (protéine liant les éléments de réponse de l' AMPc). 1.1.3.1.3. Facteur de transcription CREB La protéine CREB est un facteur de transcription ubiquitaire dont l' AMPc règle l'activation (Mayr and Montminy 2001). Le facteur 1 d'activation de la transcription (ATF1) et le modulateur des éléments de réponse à l'AMPc (CREM) font aussi partie de la famille CREB. Il existe un grand nombre de variants d'épissage des gènes codant CREM et CREB. Grâce à l' AMPc, les unités catalytiques de la PKA sont libérées et vont alors diffuser vers le noyau cellulaire et aller phosphoryler CREB au niveau du résidu sérine 133. Le facteur CREB phosphorylé peut ensuite se lier à des promoteurs contenant un élément de réponse à l'AMPc (CRE) qui correspond à la séquence 3' -TGACGTCA-5' et recruter des co-activateurs dont CBP (protéine liant CREB). Une quantité impressionnante de gènes possèdent cette séquence à l'intérieur de leur promoteur, dont des gènes impliqués dans la régulation immunitaire, la croissance, le métabolisme et bien d'autres. 1.1.3.2. Voie des phosphoinositols L'activation des GPCRs par leur ligand mène à l'activation de différentes voies de signalisation intracellulaire dont la voie des phosphoinositols impliquant l'enzyme phospholipase C. Quatre sous familles différentes de cette enzyme sont connues soit: B, y, 8, E (Rhee 2001). La PLC~ peut être activée par les protéines G hétérotrimériques et plus particulièrement par les sous-unités Gaq/11 et GBy. La PLCB activée présente à la membrane cellulaire va hydrolyser le phosphatidylinositol 4, 5-biphosphate (PIP2) en Chapitre!: Introduction 9 diacylglycérol (DAG) et en inositol 1, 4, 5-triphosphate (IP 3) , deux seconds messagers intracellulaires. 1.1.3.2.1. Inositol triphosphate L' IP 3 est un second messager produit, entre autre, suite à l'activation des récepteurs GPCRs (Wilcox, Primrose et al. 1998). Il a un rôle important à jouer au niveau de la libération du Ca2+ intracellulaire, qui est un messager impliqué dans une multitude de fonctions cellulaires et physiologiques. Des récepteurs de l' IP 3 sont présents sous forme de tétramères particulièrement au niveau du réticulum endoplasmique, formant ainsi des canaux calciques pouvant laisser passer les ions de Ca2+. L' ouverture des canaux peut être déclenchée lorsqu' il y a liaison des molécules d'IP 3 à la surface de leur récepteur. Il s' en suivra une augmentation du calcium intracellulaire qui pourra soit activer la protéine kinase C (PKC), soit se lier à la calmoduline. Le calcium a la capacité d'induire l' activation du facteur de transcription nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT), qui est un facteur d'importance au niveau de la réponse immunitaire suite à l'activation des récepteurs GPCRs (Hogan, Chen et al. 2003). En absence de calcium, le facteur est retrouvé dans le cytoplasme de la cellule où il est hautement phosphorylé sur ses résidus sérines, le rendant inactif. Les ions Ca2+ libérés du réticulum endoplasmique vont activer plusieurs enzymes dépendantes de la calmoduline, telle la calcineurine phosphatase. La calcineurine déphosphoryle le NF AT sur ses domaines régulateurs permettant sa translocation au noyau cellulaire. NF AT possède donc des sites de liaison à l'ADN qui sont libres, permettant au facteur de transcription de se lier à la région régulatrice de plusieurs gènes du système immunitaire, dont des cytokines et des récepteurs de la surface cellulaire. L'activation de NFAT est d'ailleurs ciblée pour la régulation de la réponse immunitaire (Lee and Park 2006). En effet, la cyclosporine A, un puissant immunosuppresseur, inhibe l'activation de NFAT en empêchant son activation par la calcineurine. Chapitre!: Introduction 10 Ca 2 + ? ? DAG, PTK + PKC. RasGRP as CsA FK506 MAPK A utre (PI3K) AP-1~ IF.os~n ~_ ~ r+ Gènes ciblés ~ Tiré et adapté de Hogan, Chen et al. (2 003) Figure 3 - Schéma montrant l'implication de plusieurs molécules, dont le calcium, dans l' activation du facteur de transcription NF AT. 1.1.3.2.2. Diacylglycérol Le DAG est formé à partir du PIP 2 membranaire par la PLC. Il demeure au niveau de la membrane cellulaire et permet l' activation de la protéine kinase C (PKC) une sérine/thréonine kinase (Farago and Nishizuka 1990). Le DAG augmente l' affinité de la PKC pour le Ca2 + et les phospholipides permettant l'activation de la PKC. Il existe différentes isoformes de l' enzyme PKC qui varient par leur structure, leur localisation et leur fonction. La PKCu, une fois active, peut aller activer la cascade des MAP kinases en se liant à la RAF-1 kinase dans le cytoplasme cellulaire (Casabona 1997). La PKCÇ, quant à elle, a un rôle à jouer dans l' activation de la transcription de gènes proinflammatoires, car elle phosphoryle IKB qui est une molécule inhibant l' activation du NFKB. Le NFKB libéré agit en tant que facteur de transcription qui est impliqué dans la transcription d' une grande quantité de gènes de l' inflammation. Alors, selon les isoformes de la PKC, celle-ci active différentes cascades signalétiques importantes. Chapitre1: Introduction 1.1.3.3. Il Voie des MAP kinases Les récepteurs GPCRs, lorsqu' ils sont activés, peuvent stimuler de différentes façons la voie des MAP kinases (mitogen-activated-protein) (Luttrell 2002). Trois grandes catégories se distinguent, soit: les signaux déclenchés par les effecteurs classiques des protéines G, ceux déclenchés par le couplage des GPCRs aux tyrosines kinases de plusieurs récepteurs et ceux déclenchés par l' interaction entre les ~-arrestines et les MAP kinases. Les MAP kinases sont des sérines/thréonines kinases impliquées dans plusieurs activités cellulaires dont la croissance, la division et l' apoptose. Il existe trois grandes classes de MAP kinases: les ERK (kinases régulées par le signal extérieur), les JNKlSAPK (kinases c-Jun N-terminal/protéines kinases activées par le stress), et les MAP kinases p38. Plusieurs études ont montré que les sous-unités Gaq et G~'Y sont impliquées dans la signalisation des GPCRs via les MAP kinases (Gutkind 1998). On sait que l' activation des MAP kinases par G~'Y ne requiert pas nécessairement l' activation de la PLC et de la PKC, mais est dépendante de Ras, une protéine contrôlant l'activation des ERKs. Plusieurs études démontrent que l'activation de Ras par G~'Y impliquerait la liaison de la protéine Src à G~'Y , laquelle phosphorylerait Shc permettant le recrutement de GRB2 et de SOS menant à l'activation de Ras. L'activation des MAP kinases par les GPCRs peut mener à l' activation des ERKs et à la déphosphorylation d'un facteur de transcription important, le ELK-1 , qui est impliqué, entre autre, dans la prolifération cellulaire. 1.1.3.4. Autres voies de signalisation et croisements 1.1.3.4.1. Canaux ioniques Les GPCRs peuvent réguler différents canaux ioniques de façon directe par les sous-unités Gas et Gai/o ou indirectement par l'action de seconds messagers intracytoplasmiques tel l' AMPc. Gas agit en activant les canaux sodiques et chloriques permettant leur ouverture, tandis que Gai/o permet l'ouverture des canaux potassiques et la fermeture des canaux sodiques et chloriques. 1.1.3.4.2. Croisements entre les différentes voies Comme une cellule contient un grand nombre de différents récepteurs à sa surface et que les récepteurs GPCRs peuvent activer plusieurs voies de signalisation intracellulaires, il Chapitrel: Introduction 12 n' est pas surprenant qu' il y ait des interactions entre ces voies. Il existe de nombreux types de GPCRs qui peuvent agir avec plusieurs protéines G et permettre une signalisation multifonctionnelle (Selbie and Hill 1998). On compte quatre grands mécanismes impliqués dans la diversité de la signalisation cellulaire en réponse à un seul agoniste (Hermans 2003). Tout d' abord, plusieurs isoformes d' un même récepteur existent dû à l' épissage alternatif et à l' édition de l' ARN (acide ribonucléique) ce qui permet à un agoniste de lier différents sous-types d'un récepteur menant à deux réponses distinctes, tel qu' illustré dans la figure 4-A. Ensuite, un récepteur spécifique peut activer différentes voies de signalisation intracellulaires via un seul type de protéine G (figure 4-B), ou via la modulation d' effecteurs secondaires qui engendrent une activation indirecte (figure 4-C). Finalement, il est connu qu'un même récepteur peut se lier à différentes protéines G et réguler des réponses intracellulaires distinctes (figure 4-D). La complexité de la diversité des signaux intracellulaires est grandement augmentée lorsqu'on tient compte des interactions possibles en présence de plus d'un agoniste à la surface cellulaire. A e B G1 ~ ~ ....Q .... Réponse A G .....Q .... Réponse B ..... D G . ....kJ~ Réponse A ..... RéponseS G1~ Réponse A ....0 ~ Réponse B G1 ~k:).... ~Q.... Réponse A Réponse B Tiré et adapté de Hermans (2003) Figure 4 - Représentation des différents mécanismes impliqués dans la diversité de la signalisation cellulaire en réponse à un seul agoniste. Chapitre1: Introduction 1.1.3.5. 13 Mécanismes de régulation des GPCRs Durant la réponse immunitaire, plusieurs médiateurs de l' inflammation, délivrant leur signal chimioattracteur via les GPCRs, induisent le recrutement des cellules immunitaires au site inflammatoire. Ces cellules, principalement des neutrophiles et des phagocytes mononucléaires, vont sécréter certaines enzymes de dégradation et des métabolites toxiques après libération de leurs granules. La rapide désensibilisation ainsi que l' internalisation des GPCRs sont alors importantes afin de contrôler le potentiel cytotoxique des leucocytes et d' éviter la progression d'une inflammation chronique, de désordres allergiques ou autoimmunitaires (Lombardi, Kavelaars et al. 2002; Vroon, Heijnen et al. 2006). À ce jour, les mécanismes de régulation qui sont spécifiques au GPR84 sont touj ours inconnus. 1.1.3.5.1. L 'internalisation Deux classes de protéines sont principalement impliquées dans la régulation des GPCRs, soit les GPCRs kinases (GRK) et les ~-arrestines (Lombardi, Kavelaars et al. 2002). Elles permettent de briser l'interaction entre le récepteur et la protéine G, empêchant l'activation de cette dernière. De plus, les ~-arrestines facilitent l' endocytose des GPCRs. L' internalisation des récepteurs peut être agoniste-dépendante ou agoniste-indépendante. Dans le cas où il y a présence d'un agoniste, celui-ci se lie au récepteur, les GRKs sont recrutées et phosphorylent la surface cytoplasmique du récepteur; ensuite la transloquée à la membrane et se lie au récepteur. La ~-arrestine ~-arrestine est permet le découplage des protéines G effectrices ainsi que le recrutement de la protéine AP-2 et de la clathrine. Cette dernière forme les puits tapissés de clathrines permettant l'inclusion du complexe ligandrécepteur. Le puits se ressert grâce à la GTPase dynamine et provoque l'endocytose par formation de vésicules. Les récepteurs ainsi séquestrés peuvent être recyclés à la membrane plasmique ou être dégradés dans les endosomes. 1.1.3.5.2. La désensibilisation La désensibilisation des GPCRs est un mécanisme de rétrocontrôle qui protège le récepteur d'une activation continue. Les GRKs et les RGS (regulators of G protein signaling) représentent deux types de protéines impliquées dans la régulation de la durée du 14 Chapitrel: Introduction signal de GPCR. Plusieurs GPCRs exprimés à la surface des cellules immunitaires, tels les récepteurs aux chimiokines, au PAF, à la PGE1 et à plusieurs autres molécules inflammatoires, sont des substrats pour les GRKs (Lombardi, Kavelaars et al. 2002). En effet, les GRK2, 3, 5 et 6 sont exprimés chez les leucocytes du sang périphérique et dans certaines lignées cellulaires myéloïdes et lymphoïdes où elles agissent en désensibilisant les GPCRs. Lorsqu' un agoniste se lie au GPCR, les GRKs vont phosphoryler le récepteur et permettre le recrutement de la ~-arrestine (Vroon, Heijnen et al. 2006). Ceci empêche la liaison du récepteur aux protéines G effectrices et stimule son internalisation. Les RGS sont exprimés chez les leucocytes et vont réguler la signalisation des GPCRs par leurs actions ciblant principalement les sous-unités Gai et Gaq des protéines G (Lombardi, Kavelaars et al. 2002). Ils agissent à quatre différents niveaux soit en inhibant la dissociation du GDP de la protéine G, en accélérant l'hydrolyse du GTP sur la sous-unité a , en inhibant la liaison d' effecteurs au Ga-GTP ou en inhibant directement les molécules effectrices (Cho, Harrison et al. 2004). La plupart des récepteurs GPCRs répondant aux chimiokines déclenchent la signalisation intracellulaire via leur couplage aux sous-unités Gai ou Gaq (Lombardi, Kavelaars et al. 2002). Comme les protéines RGS ciblent ces sous-unités, elles modulent donc l'activation des cellules immunitaires répondant aux chimiokines et aux autres chimioattractants permettant ainsi d'intervenir dans le processus de chimiotaxie. 1.2. Système immunitaire inné 1.2.1. Réponse innée La réponse immunitaire innée est la première ligne de défense contre l' attaque et l'invasion d'agresseurs exogènes, tels les pathogènes (Blais and Rivest 2003). Cette réponse met en branle des mécanismes de défense n'étant pas restreints à un pathogène en particulier. Parmi ces mécanismes on retrouve une augmentation du débit sanguin et de la perméabilité vasculaire menant à l'infiltration des leucocytes par diapédèse dans le tissu ciblé, ainsi qu'une augmentation de la température corporelle et la sécrétion de protéines plasmatiques par le foie. Les cellules impliquées dans la réponse innée comprennent les granulocytes, éosinophiles, cellules NK (natural killer) et les macrophages qui sont les joueurs clés. Chapitre!: Introduction 15 Les pathogènes sont reconnus par l 'hôte grâce à la présence, à leur surface, d' éléments appelés PAMPs (pathogen-associated mo/ecular patterns) (Rive st 2003). On retrouve différents P AMPs selon les microorganismes, comme par exemple la lipopolysaccharide (LPS) présent dans la membrane des bactéries Gram négatif ou les peptidoglycanes sur les bactéries Gram positif. Ces P AMPs sont reconnus entre autres par les récepteurs TLRs (Toll-like receptors) présents à la surface des cellules myéloïdes retrouvées dans le tissu atteint, tels les macrophages ou les cellules micro gliales (Blais and Rivest 2003). Ce dernier type cellulaire constitue la population de macrophages résidant dans le parenchyme du SNC. Il existe différents TLRs qui ont la capacité de lier un ou plusieurs types de P AMPs particuliers. TLR2 reconnaît les P AMPs présents sur les bactéries Gram positif tandis que TLR4 lie plutôt les éléments des bactéries Gram négatif. Pour sa part, le TLR5 est le récepteur reconnaissant la flagelline. Le TLR3 et le TLR9 vont plutôt induire une réponse immunitaire une fois les bactéries phagocytées, car ils reconnaissent l' ARN double brin et l'ADN (acide désoxyribonucléique) respectivement. Les récepteurs de la famille des TLRs possèdent un domaine TIR (Toll/IL-IR) à l' intérieur de leur portion cytoplasmique qui s'associe à la protéine adaptatrice MyD88, laquelle est présente dans le cytoplasme. L'activation subséquente des protéines IRAK (interleukin- receptor-associated kinase) suivie de TRAF6 (TNF receptor-associated factor) active en retour le complexe IKK (IK~ kinase). La kinase IKK permet la dégradation de IK~ après sa phosphorylation et mène à la libération du facteur de transcription NF-KB. La protéine TRAF6 a aussi la capacité d'aller activer la voie des MAPK menant à l'activation et à la translocation nucléaire du facteur de transcription AP-1 (activator protein 1). Les facteurs AP-I et NF -KB sont impliqués dans la transcription de gènes codant des molécules proinflammatoires, telles les cytokines TNF (tumor necrosis factor) et IL-I (interleukine-I) ainsi que des chimiokines. 1.2.2. Réponse innée dans le système nerveux central La réponse immunitaire innée qui se développe à l'intérieur du SNC suite à l'agression causée par un pathogène implique un type de macrophage spécialisé: la microglie (Vilhardt 2005). Ces cellules sont présentes dans les CVOs (organes Chapitrel: Introduction 16 circumventriculaires), dépourvus de barrière hémato-encéphalique (BHE), où débute la réaction immunitaire au cerveau, mais sont aussi présentes au niveau du parenchyme cérébral. À l' état de repos, la microglie a une morphologie ramifiée et possède une activité neurotrophique. À l' intérieur des CVOs, la microglie est disposée de façon à répondre aux PAMPs circulants. La liaison des PAMPs aux TLRs mène à l' activation de la cellule microgliale et enclenche la sécrétion de cytokines, dont le TNF-u et l ' IL-1~ , via l' activation du facteur de transcription NF -KB. Le TNF -u peut ensuite aller à son tour activer les microglies avoisinantes propageant ainsi la réponse immunitaire dans le parenchyme cérébral. La microglie peut aussi répondre à un stress endogène, car on observe une activation micro gliale dans certaines pathologies où il y a lésion du tissu nerveux, mort cellulaire ou dégénérescence. La microglie, dans la réponse innée, a pour fonctions d'éliminer l'intrus ou ses toxines par phagocytose, d' induire l'inflammation par sécrétion de chimiokines permettant l'invasion tissulaire de cellules effectrices et de présenter les antigènes aux lymphocytes menant à l'activation de l'immunité acquise qui développe une réponse spécifique aux antigènes (Aloisi 2001; AccoUa 2006). 1.3. GPCRs dans le système immunitaire 1.3.1. Expression et fonctions des GPCRs chez les leucocytes Il existe plus de 1000 gènes codant des GPCRs dans le génome des mammifères. Ceux -ci sont exprimés dans une grande variété de tissus et par plusieurs types cellulaires et répondent à différents stimuli, tels des neurotransmetteurs, des molécules odorantes, des chimiokines, des hormones, des protéases et autres ligands. Les GPCRs sont donc impliqués dans plusieurs fonctions physiologiques différentes incluant leurs rôles au niveau du système immunitaire. À cet effet, il est connu que les cellules immunitaires tels les lymphocytes, monocytes, granulocytes et macrophages répondent, via leurs GPCRs, entre autres, aux chimiokines, catécholamines, leucotriènes, prostaglandines, anaphylatoxines (C5a et C3a), peptides N-formylés, à l'acétylcholine, la substance P, l'adénosine, l'histamine et au facteur activateur des plaquettes (PAF) (Lombardi, Kavelaars et al. 2002), suggérant un rôle de ces récepteurs dans la fonction immunitaire. L' expression des GPCRs varie selon les types cellulaires et peut se modifier au cours de la vie d'une Chapitre1: Introduction 17 cellule selon son développement, où suivant son activation, menant à une variété de réponses cellulaires et d'interactions entre différents récepteurs. Le macrophage est une cellule du système immunitaire fortement impliquée au niveau de l'inflammation aiguë et chronique (Lattin, Zidar et al. 2007). Plusieurs GPCRs ont un rôle dans la régulation de différentes fonctions des macrophages, dont les principales sont la chimiotaxie, l'activation cellulaire et la survie (Figure 5). Fottcbon nott-COf1fII.Ie (nouveaux GPCR3 ~ aux mactOpIJagu GPCR'65 ftêcepElA MrgkJ.IK 5, 6, 13 AclNaI.ionl PIOduc6on de médialeürs irlhmma~ Aecepteur C5i1 AecepteuJ'&. œ&. cntnlCklne&. Aecepteur lie la d1fII'eI1C1a1on endOtI1 AecepteuJ'&. lie ,'et"IIIa1e11'1e AecepteuJ'&. EP Aecepteuf5 œ&. pepIdes fIXm)té6 AêcepIIeUr'&. leucœténe 84 Aecepteur œ la 1 Aecepteur ~y '*' '*' ~r '*' ractaJrœ racttvaIIon pIaqU~ AecepteuJ'&. [je&. ~ activée&. Tiré et adapté de Lattin, Zidar et al. (2007) Figure 5 - Illustration montrant les différentes fonctions occupées par les GPCRs chez le macrophage. 1.3.1.1. Les molécules chimioattractantes Une des plus grandes catégories de molécules se liant aux GPCRs et ayant un rôle dans la réponse immunitaire sont les chimioattractants (Le, Li et al. 2000). Ces molécules ont la capacité d'enclencher la polymérisation de l'actine, de mobiliser le calcium intracellulaire, de modifier la conformation cellulaire et d'augmenter l'expression de molécules d'adhésion à la surface des cellules dans le but de favoriser l'adhésion et la migration des leucocytes. Dans cette catégorie, on retrouve principalement les peptides Nformylés, les leucotriènes, les chimiokines, le PAF et le C5a. Les récepteurs GPCRs répondant à ces molécules sont spécifiquement exprimés à la surface d'un ou de plusieurs types de cellules immunitaires. Chapitrel: Introduction 18 Les peptides N -formylés proviennent des bactéries Gram négatif et sont les chimioattractants les plus puissants auprès des phagocytes, principalement chez les neutrophiles et les monocytes (Le, Li et al. 2000). Néanmoins, on retrouve aussi la présence des récepteurs liant les peptides N-formylés (FPRs) à la surface des cellules dendritiques, des astrocytes, des macrophages et des microglies. L' activation du GPCR FPRI mène, chez les monocytes et les neutrophiles, à une modification de la conformation cellulaire, à l'augmentation de l'adhésion, à la chimiotaxie, à la dégranulation ainsi qu' à la promotion de la phagocytose. Chez les macrophages, les récepteurs FPR1 , FPR-like-l et 2 sont exprimés au niveau de l' ARNm et de la protéine et peuvent être activés par un peptide Nformylé, mais aussi par d' autres protéines bactériennes non formylées (Lattin, Zidar et al. 2007). Une fois qu'un FPR est activé, il peut déclencher la locomotion cellulaire ainsi que l' expression du iNOS et du NO chez les macrophages péritonéaux et des interleukines ILl a , IL- l ~ et IL-6 chez les monocytes. Ces GPCRs ont donc un important rôle antimicro bien. Parmi les leucotriènes, on retrouve le leucotriène B4 (LTB4), dérivé de l' acide arachidonique, qui est un agent chimioattractant ainsi qu' un facteur d'activation ciblant les macrophages, granulocytes, monocytes, éosinophiles et les mastocytes (Johnson and Druey 2002; Toda, Yokomizo et al. 2002). LTB4 est principalement sécrété par les mastocytes, les macrophages alvéolaires et les macrophages péritonéaux murins et cible deux différents GPCRs, soit BLT1 et BLT2. BLT1, via l'activation des sous-unités signalétiques Gai et Ga16 des protéines G, possède plusieurs fonctions importantes au niveau de l' inflammation. L'activation du BLT1 par LTB4 permet, entre autres, d' enclencher la chimiotaxie et l'activation cellulaire, d'induire l'adhésion des leucocytes aux cellules endothéliales, de permettre la relâche d'enzymes lysosomales et d'induire la production d' IL-2 ainsi que son récepteur. La figure 6 montre les voies de signalisation empruntées suite à l'activation du GPCR BLTI. Chapitrel: Introduction 19 LTB4 i 1 CaZ+ Membrane plasmatique ~- BLTI adénylcyclase inhibition l cAMP PI3K \ PLC PLC \ IP3 1 IP3 + Canal ~J Récepteur IP3 G~ Chimiotaxie II-- PTX / Relâche d'enzymes Ca2+ t ~ PTX Tiré et adapté de Toda, Yokomizo et al. (2 002) Figure 6 - Représentation des différentes voies de signalisation impliquées suite à l'activation de BLTl. Les chimiokines ont un double rôle en agissant à la fois sur le système immunitaire et sur le SNC (Ransohoff, Liu et al. 2007). En effet, les GPCRs des chimiokines sont présents dans tous les types cellulaires impliqués dans le système immunitaire ainsi que dans le tissu nerveux, i.e. au niveau des astrocytes, oligodendrocytes, neurones et microglies. Les chimiokines sont de petites molécules exprimées constitutivement (homéostatiques) ou sécrétées durant la réponse inflammatoire (inflammatoires) qUI modulent plusieurs fonctions dans le processus inflammatoire et dans l' immunité. Les chimiokines ont comme principal rôle de diriger le trafic des leucocytes, mais ils ont aussi une action sur l'adhésion, la phagocytose, la sécrétion de cytokines, l' activation, la prolifération, l' apoptose et l'angiogénèse (Cartier, Hartley et al. 2005). Il existe environ 50 20 Chapitrel: Introduction chimiokines ainsi que 20 différents récepteurs aux chimiokines qui sont classés, selon leur structure, dans l'une des quatre catégories suivantes: CCR, CXCR, XCR et CX3CR. Les CCRs sont reconnus pour diriger le trafic plus particulièrement des monocytes ainsi que des lymphocytes, tandis que les CXCRs permettent la chimiotaxie des neutrophiles et des lymphocytes. Le CX3CRI est présent entres autres sur les microglies et répond à la fractalkine, une chimiokine spécifiquement exprimée par les neurones du cerveau. Les cytokines pro-inflammatoires ainsi que le contact avec le pathogène déclenchent l' expression de chimiokines, telles CCL5 et CXCL12 ce qui mène au recrutement de cellules effectrices au tissu inflammé. Les chimiokines enclenchent les interactions cellulaires menant au contact entre les cellules et à la chimiotaxie (Ransohoff, Liu et al. 2007). Deux signaux médiés par les chimiokines entrent en jeu dans le processus d' extravasation: le premier induit l'arrêt des leucocytes et un changement de conformation des intégrines liant ainsi fortement les leucocytes sur les molécules d' adhésion de l'endothélium et le second déclenche la réorganisation du cytosquelette et la chimiotaxie. La signalisation suivant l'activation du GPCR passe par la sous-unité G~y qui va activer les protéines effectrices PLC et PI-3K (phosphoinositide 3-kinase) (Cartier, Hartley et al. 2005). Le PAF (patelet-activating factor) est synthétisé par différentes cellules dont plusieurs ont un rôle dans l'inflammation et l'homéostasie (Zimmerman, Mclntyre et al. 2002). Le récepteur traduisant le signal de PAF est un GPCR (P AFR) qui est présent sur les plaquettes, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles et les macrophages. Cela justifie le fait qu' il soit impliqué à la fois dans la thrombose et dans la réponse immunitaire inflammatoire (Figure 7). 21 Chapitre!: Introduction S - ulus physiologique Oëdanchement: paümIDgi~e Plaquettes P s oocytes, -Activ, ·on -Adhe - ~ ammatoire = PAF~r Tiré et adapté de Zimmerman, Mclntyre et al. (2002) Figure 7 - Schéma montrant les différents rôles de PAF ainsi que les cellules ciblées. En effet, le PAF synthétisé par les cellules endothéliales permet de réguler l' activation et l' adhésion des neutrophiles, soit les étapes initiales de la diapédèse. Chez les monocytes, l' activation du GPCR de PAF enclenche l' activation et la translocation nucléaire du facteur de transcription NF -KB impliqué dans la transcription de gènes proinflammatoires. Le PAF induit aussi la chimiotaxie des éosinophiles, la dégranulation et la production d' anions superoxydés via l' activation de la sous-unité Gai de la protéine G liée au récepteur (Johnson and Druey 2002). Les macrophages possèdent un GPCR répondant au PAF qui permet de réguler l' activation et la migration cellulaire. En effet, chez les macrophages péritonéaux murins, l'activation de PAFR par PAF déclenche la chimiotaxie et ce, de façon dose-dépendante (Lattin, Zidar et al. 2007). Il a aussi été observé que des antagonistes de PAF inhibent la production de NO et d'ARNm de iNOS régulés par la LPS chez les macrophages murins, ce qui montre un lien entre PAF et la réponse à la LPS. PAF est aussi connu pour son implication dans différentes pathologies inflammatoires. Chapitrel: Introduction 22 L' anaphylatoxine C5a est un élément clé dans le système du complément, mais est aussi reconnue comme ayant des fonctions dans la régulation de la réponse immunitaire innée (Guo and Ward 2005). C5a se lie au GPCR C5aR à la surface des neutrophiles monocytes ou macrophages et est impliquée dans la chimiotaxie de ces cellules ainsi que dans la phagocytose et la libération de granules enzymatiques chez les neutrophiles. C5a module aussi la sécrétion de certaines cytokines par les monocytes et macrophages humains et murins dont le TNP-a, l ' IL-l~ et l' IL-6, tous impliqués dans le processus inflammatoire (Hawlisch, Wills-Karp et al. 2004). Le système C5a/C5aR déclenche, chez les macrophages péritonéaux murins, la production de PGE2 et d' anions superoxydés, qui sont d' importants éléments proinflammatoires (Lattin, Zidar et al. 2007). Considérant les différentes fonctions de l' anaphylatoxine C5a, il n'est pas surprenant que celle-ci joue un rôle important dans plusieurs modèles de maladies inflammatoires, telle l' arthrite induite par l' injection de collagène en combinaison avec l'adjuvant complet de Freund (Wang, Kristan et al. 2000). 1.3.1.2. Les molécules activatrices et inductrices de médiateurs inflammatoires Les GPCRs régulent différentes fonctions chez le macrophage, dont celles d'activateur cellulaire et d'inducteur de médiateurs de l'inflammation (Lattin, Zidar et al. 2007). Dans cette catégorie on retrouve plusieurs récepteurs ayant ces fonctions en plus d'être chimioattractants, tels certains récepteurs aux chimiokines, les peptides N-formylés, le C5aR et le PAPR. Propres à cette catégorie sont les GPCRs répondant aux prostaglandines, à la substance P, au neuropeptide Y, à l' endothéline, aux protéases activées ainsi qu' à certains gènes de différenciation endothéliale. Durant l'inflammation au cerveau, plusieurs stimuli peuvent activer les cellules résidentes du SNC dont les microglies et les astrocytes. À partir de l'acide arachidonique, ces cellules peuvent produire des prostaglandines (PGs), qui sont connues comme agissant entre autres en tant que médiateurs de l'inflammation (Tzeng, Hsiao et al. 2005). Les cytokines, le PAF ainsi que les acides aminés augmentent la production de PGs par les microglies. La PGE2 est la principale PG sécrétée suite à l'activation cellulaire par l'inflammation. Elle est principalement produite par les fibroblastes et les macrophages et régule l' agrégation plaquettaire ainsi que la fonction immunitaire (Lattin, Zidar et al. 2007). Il existe quatre différents types de récepteurs à la PGE2, soit les GPCRs EP 1 à EP4, qui ont Chapitre!: Introduction 23 chacun des fonctions différentes une fois activés. Ils transmettent le signal à l' intérieur de la cellule médiant entre autres les fonctions neuronales d'éveil et de sommeil, la température corporelle, la perception de la douleur et l'hypertension. Lorsqu' elle est administrée in vivo la PGE2 déclenche une réponse inflammatoire aiguë caractérisée par une infiltration de leucocytes, de l' œdème ainsi que de la douleur. La PGE2 est connue pour son action proinflammatoire, mais, depuis peu, des études ont montré qu' elle pouvait aussi jouer un rôle immunosuppresseur dans le SNC inflammé (Tzeng, Hsiao et al. 2005). En effet chez les monocytes et les macrophages, la PGE2 supprime la production de cytokines inflammatoires (Lattin, Zidar et al. 2007). Plus précisément, on observe que les macrophages humains et murins stimulés par cette prostaglandine augmentent leur production d'IL-IO, tandis qu' ils diminuent celle de l' IL-12, dirigeant ainsi la réponse immunitaire vers une réponse Th2 . Il existe une communication bidirectionnelle entre le système nerveux et le système immunitaire qui est assuré par plusieurs facteurs solubles, dont les cytokines et les neuropeptides (O'Connor, O'Connell et al. 2004). La substance P (SP) est un neurotransmetteur qui agit en tant que médiateur de cette communication. Elle est sécrétée par les fibres nerveuses ainsi que par certaines cellules immunitaires, tels les macrophages, cellules dendritiques, lymphocytes et éosinophiles. La SP se lie majoritairement au récepteur neurokine-1 (NK-IR) exprimé entre autres à la surface des astrocytes, neurones, macrophages, microglies, mastocytes, lymphocytes, cellules stromales et pro géniteurs hématopoïétiques (Rameshwar 1997). L'expression de SP ainsi que de son récepteur est induite par la LPS. L'activation du récepteur NK-1 déclenche une activité proinflammatoire en augmentant, entre autres, la sécrétion des cytokines IL-l, IL-6, TNF -u chez les monocytes et les macrophages humains dérivés des monocytes et de l'IL-2 chez les cellules T. La SP stimule la prolifération lymphocytaire, la réparation tissulaire, la chimiotaxie, la phagocytose et la libération d'histamine. Le neuropeptide Y (NPY), pour sa part, est sécrété par les nerfs périphériques sympathiques ainsi que par les macrophages, permettant un échange entre les systèmes immunitaire et nerveux (Lattin, Zidar et al. 2007). Le NPY, principalement via le GPCR y IR, module les fonctions immunitaires de chimiotaxie et d'activation cellulaire chez le macrophage. Chapitre!: Introduction 24 Certains GPCRs de la famille des gènes de différentiation endothéliale (EDF) sont impliqués dans l' activation ainsi que la survie des macrophages (Lattin, Zidar et al. 2007). L' acide lysophosphatidique (LP A) ainsi que la sphingosine-I-phosphate (S 1P), deux ligands ciblant les EDFs, sont exprimés par les cellules immunitaires activées, tels les neutrophiles, éosinophiles et macrophages. La LP A a un rôle important de cicatrisation en agissant sur son récepteur à la surface des cellules endothéliales. Suite à l'activation du récepteur, l' expression de plusieurs molécules d' adhésion, ainsi que de certaines cytokines, est déclenché, ce qui permet le recrutement de macrophages au site lésé. De plus, comme certains EDFs sont présents à la surface des monocytes et des macrophages, on pense que la LP A pourrait agir directement sur ces cellules. Les récepteurs de protéases activées (PARs) sont des GPRCs qui comptent dans leur famille la PAR-I et la P AR-2, tous deux impliqués dans la régulation immunitaire (Lattin, Zidar et al. 2007). Les PARs sont activés par clivage de leur domaine amino-terminal. On retrouve ces récepteurs sur les macrophages et les monocytes périphériques humains. Chez ces derniers, l' activation des PARs par la thrombine induit l'expression des médiateurs de l' inflammation MCP-I (CCL2) et IL-6 (Colognato, Slupsky et al. 2003; Lattin, Zidar et al. 2007)). Le récepteur GPR84 est exprimé par les macrophages, les microglies, les lymphocytes T et B ainsi que les éosinophiles et les neutrophiles. Il régulerait l'expression de l'IL-4 par les cellules T activées (Venkataraman and Kuo 2005). En effet, on observe une augmentation d'IL-4, chez les cellules T activées des souris déficientes en GPR84 comparativement aux souris sauvages. Toutefois, la fonction de GPR84 chez les autres types cellulaires, dont les microglies, n' est toujours pas connue. 1.4. GPCRs et les maladies neuroinflammatoires Une des caractéristiques des maladies neurodégénératives, telle la sclérose en plaques, est que l'on y observe la présence d'inflammation (Block and Hong 2005). Cette inflammation n'est pas toujours une réponse à un dommage et peut être impliquée dans la progression de la maladie, pouvant même causer la mort neuronale. Dans la plupart des maladies neuroinflammatoires, on retrouve une inflammation locale venant des cellules résidentes du cerveau dont les microglies, ainsi qu'une infiltration de leucocytes venant de Chapitre!: Introduction 25 la périphérie dont les macrophages (Mc Geer, Akiyama et al. 1989; Eng, Ghimikar et al. 1996; Kurkowska-Jastrzebska, Wronska et al. 1999). Les macrophages et microglies activés ont un rôle de protection contre les agresseurs mais peuvent aussi être néfastes pour le SNC. En effet, plusieurs facteurs proinflammatoires (IL-l , TNF -a) sécrétés par ces cellules peuvent être toxiques pour les neurones. Différents GPCRs à la surface des macrophages sont importants dans la régulation des fonctions cellulaires et certains d' entres eux ont un rôle à jouer dans la progression des maladies neuroinflammatoires (Block and Hong 2005). Des modèles animaux dont ceux de l' encéphalomyélite auto immunitaire expérimentale (EAE), de la LPS et de l' encéphalite induite par l' herpès simplex virus de type 1 sont utilisés afin d' étudier le rôle de ces récepteurs. 1.4.1. Implication des GPCRs dans l'EAE L'EAE est un modèle de maladie inflammatoire démyélinisante qui est largement utilisé en neuroimmunologie parce qu' il présente des ressemblances cliniques et histopathologiques avec la sclérose en plaques. L'EAE est induite chez les souris par injection de protéines de la myéline mélangées à un adjuvant en combinaison avec la toxine de pertussis. Parmi les symptômes physiques, on peut observer une faiblesse musculaire, une coordination difficile, ainsi qu'une paralysie des membres postérieurs. Même si le mécanisme menant à la démyelinisation n'est pas connu, on sait que les cellules T helper 1 (Thl) jouent un rôle primordial dans l'induction et le développement de la maladie. De récentes découvertes démontrent aussi l'implication des cellules Th17, Th2 et T régulatrices toutes CD4+. Toutefois, d'autres cellules sont aussi impliquées dans le processus de démyélinisation inflammatoire, tels les macrophages et les microglies (figure 8) (El Behi, Dubucquoi et al. 2005). Parmi leurs fonctions, on note la présentation antigénique, la sécrétion de cytokines pro inflammatoires ainsi que la phagocytose de la myéline. 26 Chapitre!: Introduction ceue C04+ ... __ ... -..... __ .......... .... • • • ~ ..._..._. _ • •• "'"coel~1e T Tiré et adapté de El Behi, Dubucquoi et al. (2 005) Figure 8 - Schématisation des interactions cellulaires du modèle de l'EAE tel qu'on le comprend actuellement. Les cellules T sont activées pour une première fois en périphérie par les cellules dendritiques présentant des antigènes dérivant de la myéline. Elles migrent ensuite au SNe où elles seront réactivées entre autres par les microglies et agiront en tant que cellules effectrices sécrétant des facteurs proinflammatoires. Certains GPCRs exprimés à la surface des macrophages ont été étudiés afin de déterminer s'ils ont un rôle dans l'induction, la progression et/ou la sévérité de l' EAE. Parmi eux on compte les récepteurs de certaines chimiokines, de la LTB4, du C5a, de la substance P ainsi que du PAF. Des études utilisant des souris knockout ont montré que les GPCRs CCRI , CCR2, CCR8, CXCR2 et CX3CRI sont impliqués dans le trafic de plusieurs cellules immunitaires durant l'EAE (Ransohoff, Liu et al. 2007). Chez les souris déficientes en CCRI , on observe une diminution de l'accumulation des monocytes et macrophages dans le SNC, ce qui causerait une atténuation d'environ 50% des symptômes de l'EAE (Cartier, Hartley et al. 2005). Les animaux CCR8 knockout développent une forme atténuée et tardive d' EAE qui pourrait être due à une diminution de l'activation des microglies et des macrophages. Pour Chapitre!: Introduction 27 ce qui est du récepteur CCR2, celui-ci augmenterait l' accumulation de monocytes et les dommages au tissu nerveux durant l' EAE (Ransohoff, Liu et al. 2007). En effet, des études ont montré que sans CCR2, il n ' y a presque pas d' infiltration de monocytes et peu de démyélinisation. Le récepteur de la fractalkine CX3CR1 est lui aussi essentiel durant l' EAE, notamment pour le recrutement des cellules NK au SNC (Ransohoff, Liu et al. 2007). Il n' est toutefois pas impliqué dans le recrutement des cellules T, NK-T et des monocytes. Les souris déficientes pour ce récepteur développent plus rapidement de sévères symptômes de l' EAE se caractérisant par la paralysie, des hémorragies et un haut taux de mortalité. CXCR2 pour sa part, possède une activité régulatrice à la fois de l' infiltration des monocytes et de la réparation des tissus lésés. En somme, dans l'EAE, plusieurs GPCRs répondant aux chimiokines ont un rôle important au niveau de la migration des cellules immunitaires dans le SNC. LTB4 est un leucotriène impliqué dans le développement de l' EAE par son action sur les eosinophiles (Gladue, Carroll et al. 1996). En effet, en bloquant le GPCR de LTB4 on observe une diminution de l'infiltration de ces cellules dans la partie inférieure de la moelle épinière et une diminution ou même l'absence des symptômes décrivant l' EAE. LTB4 agit sur la migration des éosinophiles, soit en ayant un effet chimioattractant directement sur ces cellules, soit en stimulant la sécrétion d'agents chimioattractants par les cellules T. Dans l'EAE, C5aR est présent dans les méninges et le parenchyme à tous les stades de la maladie (Nataf, Davoust et al. 1998). C5aR est exprimé à la fois par les cellules infiltrantes et par les cellules résidentes du SNC. Des hybridations in situ montrent qu' on retrouve une forte expression de ce récepteur principalement par les microglies et astrocytes. Comme C5a et son récepteur sont connus pour leur activité inflammatoire, des études ont été réalisées afin de déterminer le rôle de ce complexe dans l'EAE (Reiman, Gerard et al. 2002; Reiman, Campos Torres et al. 2005). Il a été démontré que la délétion ou l'expression de C5aR dans le cerveau n'influence pas le développement de l'EAE. En effet, on observe aucune différence dans la sévérité de la maladie, l'infiltration des macrophages et cellules T dans la moelle épinière et dans l'expression de gènes proinflammatoires entre les souris modifiées et sauvages. Chapitre!: Introduction 28 Différentes études ont été réalisées afin de détenniner le rôle du système SPI NK-1R dans l' EAE (Nessler, Stadelmann et al. 2006; Reinke, Johnson et al. 2006). Les souris déficientes en NK-1 présentent, dans la phase chronique de l'EAE, une diminution des symptômes et de l' inflammation, ainsi qu' une augmentation de la mobilité. On observe une diminution dans le cerveau du nombre de cellules T CD4+ activées et/ou produisant de l' IFN-y réduisant ainsi l' inflammation. L' antagoniste à NK-1R, CP-96 345, est aussi utilisé afin d'évaluer la fonction de ce GPCR (Nessler, Stadelmann et al. 2006). Lorsqu'il est administré aux animaux avant le début des symptômes de l'EAE, CP-96 345 aurait un effet protecteur en diminuant l' incidence et la sévérité de la maladie. De plus, cet antagoniste réduit l'expression des molécules d' adhésion ICAM-l et VCAM-l sur les vaisseaux cérébraux diminuant ainsi l'infiltration des cellules inflammatoires au cerveau. Les cellules T des animaux traités sécrètent moins de cytokines pro-inflammatoires après restimulation in vitro avec le peptide PLP 139-51. Ces résultats montrent que NK-1R aurait une fonction de maintien de l'inflammation dans l'EAE par l'augmentation de l'activation des cellules T, de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires et de l'adhésion des cellules T à la BRE. Il a été montré que le neuropeptide NPY a aussi un rôle à jouer dans la régulation de l' EAE, durant la phase d'induction. NPY est exprimé par les neurones ainsi que les macrophages et agit via son récepteur YI exprimé sur les cellules T (Bedoui, Miyake et al. 2003). L'administration de NPY exogène ou d'un agoniste du récepteur YI dans la phase d'induction de l'EAE inhibe les signes cliniques de la maladie de façon dose-dépendante. À l'inverse, bloquer ce récepteur fait devancer les symptômes. L'inhibition de l'EAE serait due à une modification du profil des cytokines sécrétées par les cellules T, soit de Thl vers Th2. NPY aurait donc un effet protecteur durant l'EAE. PAF est un facteur qui, en activant son GPCR, génèrerait différents effets selon la phase de l' EAE. L'expression de PAF et de PAFR sont en corrélation avec les symptômes de l'EAE. Une étude réalisée à l'aide de souris EAE traitées avec différents antagonistes de PAF a échoué à démontrer un effet dans l'induction de la maladie (Vela, Garcia Merino et al. 1991). Par contre, une étude récemment réalisée avec des souris déficientes en PAFR a rapporté des résultats différents (Kihara, Ishii et al. 2005). Chez les animaux PAFR-1-, on observe une diminution de l'expression de certains médiateurs de l'inflammation (IL-6, 29 Chapitre!: Introduction CCR2) dans la moelle épinière avant le début des symptômes. PAF semble donc avoir un rôle dans la phase d' induction en augmentant la production de cytokines et l' infiltration de cellules inflammatoires dans le SNC. Dans la phase chronique de l'EAE, l' absence du récepteur de PAF diminue l' incidence et la sévérité de la maladie, ainsi que l'inflammation la démyélinisation et l' activité phagocytique des macrophages. Ainsi, PAF semble avoir un effet négatif sur la rémission de l' EAE en augmentant la phagocytose par les macrophages qui vont sécréter des facteurs proinflammatoires, tel le TNF -u, et favoriser l' inflammation et la démyélinisation. Le GPR84 est un récepteur fortement exprimé durant l' EAE et ce, proportionnellement au niveau de sévérité de la maladie (chapitre 2) (Bouchard, Page et al. 2007). Par contre, à ce jour, aucun rôle durant l' EAE ne lui a été attribué. 1.4.2. Implication des GPCRs dans l'endotoxinémie Le modèle murin d'endotoxinémie permet d'étudier les effets d'une inflammation disséminée à travers le corps (Yadavalli, Auletta et al. 2001). Il s'apparente aux symptômes cliniques de la septicémie, qui est une maladie aïgue et systémique souvent déclenchée par une infection de bactéries Gram négatif menant à la relâche intravasculaire d' endotoxines. Plusieurs manifestations en découlent, dont le choc septique, le recrutement de leucocytes à l'intérieur des organes ainsi que des blessures à ces derniers. Dans ce modèle, l' injection intrapéritonéale de lipopolyssacharide (LPS) active les macrophages péritonéaux résidents qui vont exprimer des cytokines pro-inflammatoires dans le sang, tels l' IL-l ~ et le TNF-u (Cheng, Lukacs et al. 2002). Une activation endothéliale systémique se crée menant à une inflammation des différents tissus et organes. Plusieurs études ont montré que la LPS peut réguler l'expression de différents GPCRs chez les macrophages et autres types cellulaires, ce qui a poussé les chercheurs à étudier le rôle de ces GPCRs dans endotoxinémie. Parmi les plus connus, on dénombre certaines chimiokines, la PGE2, l'anaphylatoxine C5a et le PAF. Il a été observé que plusieurs GPCRs aux chimiokines, dont CCR2, CCR3 , CCR4 et CX3CR1 , auraient un rôle à jouer dans le développement de l'endotoxinémie. CCR3 est un récepteur ciblé par plusieurs ligands différents, dont l'eotaxine/CCLII et MCP-l/CCL2. CCL Il est une chimiokine ayant une activité chimioattractante sur les éosinophiles (Cheng, Chapitre!: Introduction 30 Lukacs et al. 2002). On observe une augmentation de son expreSSIon dans certaines maladies inflammatoires n ' impliquant pas d' infiltration d' éosinophiles ou suite à une administration de LPS. Des études ont démontré que, durant l' endotoxinémie, il y a une augmentation de l' infiltration des neutrophiles péritonéaux chez les souris CCL 11-1-. De plus, l' administration de CCLII à ces souris supprime l' infiltration des neutrophiles. Ceci indique que CCL Il , via CCR3 , aurait un rôle de régulateur négatif du recrutement des neutrophiles aux tissus inflammés (Cheng, Lukacs et al. 2002). Pour ça part, MCP-l est une molécule chimioattractante pour les monocytes, mastocytes, basophiles et cellules T qui a une activité régulatrice dans plusieurs maladies inflammatoires (Gomes, Figueiredo et al. 2006). Son action est déclenchée par l' activation du récepteur CCR3 ou CCR2, auxquels MCP-l se lie. On observe dans l' endotoxinémie que les souris déficientes en MCP-l sont plus susceptibles à la réponse inflammatoire systémique et sécrètent moins d' IL-IO. Ainsi, MCP-l , par son action via CCR3 et/ou CCR2, aurait un effet anti-inflammatoire protecteur en induisant l'expression d' IL-l 0 par les macrophages. Le récepteur de la fractalkine, CX3CRl , aurait lui aussi un rôle protecteur lors de la réponse inflammatoire causée par la LPS (Ransohoff, Liu et al. 2007). Chez les souris déficientes pour ce récepteur, on observe une augmentation de l'activation microgliale dispersée dans la matière grise et des dommages neuronaux après stimulation avec la LPS. Des micropuces à ADN ont montré que ces cellules micro gliales expriment en plus grande quantité certains gènes proinflammatoires tel l' IL-la. Ainsi, CX3CRI permet de restreindre la neurotoxicité des cellules microgliales (Cardona, Pioro et al. 2006). Quant au récepteur CCR4, celui-ci aurait plutôt un effet pro-inflammatoire durant l' endotoxinémie (Chvatchko, Hoogewerf et al. 2000). En effet, on observe une résistance au développement de l' endotoxinémie ainsi qu'une réduction de la mortalité chez les souris CCR4-1-. Cette résistance pourrait découler de la diminution de la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, TNF -a et IL l-p chez les animaux déficients en CCR4. En somme, dans l'endotoxinémie, plusieurs GPCRs répondant aux chimiokines ont un rôle dans la régulation de la réponse inflammatoire. C5a est une molécule, impliquée dans le système du complément, qui est activée entre autres par la LPS (Blatteis, Li et al. 2004). Elle régule en partie les différents effets du choc septique, dont la fièvre, via l'activation de son GPCR C5aR. Chez le rat, lors de l' endotoxinémie, C5a déclenche certains changements hémodynamiques dont Chapitre!: Introduction 31 l ' hypotension et la perméabilité vasculaire (Smedegard, Cui et al. 1989). Des études faites sur des souris déficientes en C5 démontrent que cette molécule est importante pour la sécrétion systémique de TNF et dans l' induction de lésions aux différents organes durant l' endotoxinémie (Barton and Warren 1993). Plusieurs études ont montré que PAF et son GPCR, P AFR, sont impliqués dans la réponse inflammatoire systémique induite par la LPS (Lo, Cryer et al. 1997; Bulger, Arbabi et al. 2002). En inhibant PAF avec différents antagonistes ou en bloquant son récepteur, on observe, in vitro, une inhibition de la production de TNF par les macrophages durant l' endotoxinémie. Ceci indique que PAF, dans la réponse à la LPS, aurait un effet proinflammatoire en augmentant la sécrétion de TNF par les macrophages. De plus, une autre étude a démontré que si l' on bloque P AFR avec un antagoniste, il y a une diminution dosedépendante de l' activation du facteur de transcription NF-KB suite à la stimulation avec la LPS (lm, Han et al. 1997). Ainsi, PAF sécrété lors de l' endotoxinémie permettrait l' induction de la sécrétion du TNF par l' activation de NF-KB. Des études démontrent le rôle de la PGE2 dans le développement de la fièvre durant l' endotoxinémie (Ivanov and Romanovsky 2004; Romanovsky, Almeida et al. 2005). Selon ces dernières, la LPS induirait l'expression d'enzymes permettant la production de la PGE2 par les cellules endothéliales et périvasculaires du cerveau. En effet, on sait maintenant qu'un trafic de signaux est possible entre le système immunitaire et le cerveau, principalement via l' organum vasculum of the lamina terminalis (OVLT), où la barrière hémato-encéphalique est incomplète. La PGE2 ainsi produite peut activer les neurones thermiques qui vont déclencher l'induction de la fièvre. Al' inverse, la PGE2 a aussi un effet anti-inflammatoire sur les cellules microgliales (Levi, Minghetti et al. 1998). In vitro, la PGE2 inhibe l'expression de TNF et augmente celle de l'IL-10 sur les cellules microgliales stimulées à la LPS. Elle inhibe aussi l'expression de B7-2, une molécule importante pour la présentation antigénique, chez les microglies stimulées avec la LPS et l'IFN-y. Le GPR84 est exprimé par les microglies dans le cerveau des souris traitées à la LPS (chapitre 2) (Bouchard, Page et al. 2007). Toutefois, sa fonction durant l'endotoxinémie est toujours inconnue. Chapitre!: Introduction 1.5. 32 Objectifs des travaux Les travaux réalisés dans notre laboratoire visent à comprendre les mécanismes impliqués dans la régulation des macrophages. L' analyse de l' expression différentielle entre les cellules microgliales et périvasculaires est le point de départ d' un programme ayant comme but à long terme de développer des alternatives thérapeutiques pouvant moduler plus spécifiquement ces cellules afin d' avoir un meilleur contrôle de l' inflammation au niveau thérapeutique. L' analyse du transcriptome des monocytes, macrophages et cellules microgliales à l' aide de micropuces à ADN nous a permis d' identifier le GPR84, un récepteur peu présent chez les cellules microgliales murines saines mais induit durant l' inflammation (Bedard, Tremblay et al. 2007). La présente étude a été séparée en deux objectifs. Le premier a été d' étudier la régulation de GPR84 dans le cerveau à l' aide de modèles pro-inflammatoires (chapitre2 (Bouchard, Page et al. 2007)). Nous avons testé l'hypothèse que la transcription du récepteur GPR84 chez les microglies soit augmentée durant l'inflammation. Dans la seconde partie de l'étude, présentée au chapitre 3, nous avons analysé la fonction de GPR84 dans le processus inflammatoire à l' aide de différents modèles inflammatoires. Nous avons testé l' hypothèse selon laquelle le récepteur GPR84 modulerait le développement des symptômes dus à l'inflammation. À l' aide de souris déficientes en GPR84, nous avons évalué l'influence qu'a ce récepteur sur les manifestations physiques de l' EAE, de l' endotoxinémie ainsi que de l'encéphalite induite par le virus herpès simplex de type 1 (HSV-l ). CHAPITRE 2 2. G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR 84, A MICROGLIA-ASSOCIATED PROTEIN EXPRESSED IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS 1 Caroline Bouchard, Julie Pagé, Andréanne Bédard, Pierrot Tremblay and Luc Vallières 2.1. Résumé Le récepteur couplé aux protéines G GPR84 est un membre nouvellement identifié de la superfamille des récepteurs à sept domaines transmembranaires, dont le ligand endogène, la fonction et la régulation demeurent inconnus. Dans cette étude, nous rapportons une robuste expression du GPR84 dans les cellules microgliales chez les souris souffrant d'endotoxinémie. Cet effet fut aussi observé dans des populations de macrophages périphériques et, à une moindre mesure, dans les monocytes. L'expression du GPR84, au cours de l' endotoxinémie, est gouvernée, du moins en partie, par des cytokines proinflammatoires, notamment le TNF et l'IL-l , car des souris déficientes en l'une ou l' autre de ces cytokines comportaient un nombre considérablement diminué de cellules exprimant le GPR84 dans leur cortex cérébral comparativement aux souris de type sauvage, en réponse à la LPS. De plus, lorsqu'il fut injecté intracérébralement ou encore additionné à des cultures microgliales, le TNF recombinant stimulait l'expression du GPR84 par le biais d'un mécanisme insensible à la dexaméthasone. Finalement, nous avons démontré que la production du GPR84 par la microglie se présentait non seulement durant la phase aiguë de l'endotoxinémie, mais également durant l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale 1 Article publié dans le journal Glia Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 34 (EAE), un modèle de la sclérose en plaques. En conclusion, cette étude rapporte l'identification d'un nouveau marqueur, sensible, de l'activation microgliale, lequel pourrait jouer un rôle important dans la régulation des processus neuroinflammatoires. 2.2. Abstract G protein-coupled receptor 84 (GPR84) is a recently discovered member of the seven transmembrane receptor superfamily whose function and regulation are unknown. Here we report that in mice suffering from endotoxemia, microglia expresses GPR84 in a strong and sustained manner. This property is ~hared by subpopulations of peripheral macrophages and, to a much lesser extent, monocytes. The induction of GPR84 expression by endotoxin is mediated, at least in part, by proinflammatory cytokines, notably tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1 (IL-1), because mice lacking either one or both of these molecules have fewer GPR84-expressing cells in their cerebral cortex than wild-type mice during the early phase of endotoxemia. Moreover, when injected intracerebrally or added to microglial cultures, recombinant TNF stimulates GPR84 expression through a dexamethasone-insensitive mechanism. Finally, we show that microglia produce GPR84 not only during endotoxemia, but also during experimental auto immune encephalomyelitis (EAE), a model of multiple sclerosis. In conclusion, this study reports the identification of a new sensitive marker of microglial activation, which may play an important regulatory role in neuroimmunological processes, acting downstream to the effects of proinflammatory mediators. 2.3. Introduction GPR84 (also called EX33) is a newly discovered orphan receptor of the rhodopsin superfamily that shows only limited similarity to known receptors (Wittenberger, Schaller et al. 2001; Yousefi, Cooper et al. 2001; Joost and Methner 2002; Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003; Foord, Bonner et al. 2005). It is predicted to contain seven transmembrane domains linked by altemating intracellular and extracellular loops. According to phylogenetic studies (Wittenberger, Schaller et al. 2001; Joost and Methner 2002; Fredriksson, Lagerstrom et al. 2003), GPR84 can be classified in a heterogeneous subgroup Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated prote in 35 expressed in neuroinflammatory conditions of distantly related receptors that include those for biogenic amInes and phospholipid mediators, but whether the natural ligand of GPR84 belongs to one of these classes of signaling molecules remains to be determined. GPR84 was first identified as being predominantly expressed in myeloid cells including neutrophils, eosinophils and phorbol ester-activated peripheral blood mononuclear cells, suggesting a role for GPR84 in immune function (Yousefi, Cooper et al. 2001). GPR84-deficient mice have been generated and exhibit no obvious abnormalities, although T lymphocytes collected from these mice secrete higher levels of interleukin-4 than wild-type T cells in response to CD3 crosslinking in culture (Venkataraman and Kuo 2005). No other function has been ascribed to GPR84 thus far. The primary immune effector cells of the central nervous system, microglia, are of myeloid-monocytic origin. These cells play detrimental and beneficial roles in many pathologies, such as multiple sclerosis (Heppner, Greter et al. 2005), Alzheimer' s disease (Simard, Soulet et al. 2006) and cerebral tumors (Villeneuve, Tremblay et al. 2005). Unfortunately, there is no way at present to selectively manipulate these cells for therapeutic purposes, but this possibility may emerge from a better understanding of the mechanisms that govern their development and function. To identify novel signaling pathways involved in microglia biology, we have recently compared the transcriptomes of microglia, monocytes and spleen macrophages after isolation by flow cytometry using oligonucleotide microarrays (submitted manuscript). GPR84 was among the genes identified as being highly expressed in freshly-purified microglia, but subsequent work revealed very few GPR84-expressing cells in the brains of healthy adult mice. In the present study, we explored the possibility that the GPR84 gene is transcriptionally inducible in microglia. The results indicate that these cells express GPR84 under different inflammatory conditions, notably endotoxemia and EAE, suggesting a role for GPR84 in the regulation of microglia and neuroinflammatory processes. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 2.4. 36 Materials and methods 2.4.1. Animais C57BL/6 mice purchased from Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canada) were adapted to standard laboratory conditions for 1 week before any manipulation. C57BL/6 mice deficient in TNF, IL-l or both and their wild-type controls were generated from breeders originally obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Genotypes were confirmed by PCR as described previously (Turrin and Rivest 2006). AU experiments were done on males aged 2 to 3 months in accordance with CUITent guidelines of the Canadian Council on Animal Care. 2.4.2. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) LPS from Escherichia coli 055:B5 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) was dissolved in pyrogen-free saline and injected intraperitoneally at a dose of 1 mg/kg. Control mice were treated identically, except that LPS was substituted by saline. 2.4.3. Intravenous injection of TNF Recombinant mouse TNF (R&D Systems, Minneapolis, MN) was dissolved in pyrogen-free saline and injected via a tail vein at a dose of 100 ng per animal. Control mice were treated identically, except that TNF was substituted by saline. 2.4.4. Intracerebral injection of TNF Mice were anesthetized, shaved and immobilized in a stereotaxic frame. A midline incision was made on the scalp, foUowed by a circular craniotomy over the right hemisphere, 1.7 mm lateral and 1 mm rostral from bregma. After removal of the dura mater, a 28-gauge stainless steel internaI cannula (Plastics One, Roanoke, VA) connected to a 5-f.l1 Hamilton syringe by polyethylene tubing was advanced into the caudoputamen at a depth of 3.5 mm from the skull surface. Thereafter, 1 f.ll of pyrogen-free saline containing 100 ng of TNF was injected over 2 min using a UMPII micropump (World Precision Instruments, Saratoga, FL). After the injection, the syringe was left in place for 2 min Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinjlammatory conditions 37 before being withdrawn very slowly. Control mice were treated identically, except that TNF was substituted by saline. 2.4.5. EAE induction Mice were injected subcutaneously on day 0 and 7 with 200 J.!l of emulsion containing 300 J.!g of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (synthesized by Service de Synthèse de Peptide de l'Est du Québec, Québec, QC Canada) in saline with an equal volume of complete Freund's adjuvant containing 500 J.!g of killed Mycobacterium tuberculosis H37 RA (Difco Laboratories, Detroit, MI). In addition 500 ng of pertussis toxin (List Biological Laboratories, Campbell, CA) were injected intraperitoneally immediately and 48 h after the first immunization. Mice were monitored daily for clinical signs of EAE and scored as follows: 0, no detectable signs; 1, tail flaccidity; 2, hindlimb weakness and poor righting ability; 3, hindlimb paralysis/paresis; 4, hindlimb paralysis and forelimb paraparesis; 5, moribund or dead. 2.4.6. Tissue preparation Mice were anesthetized and transcardially perfused with 10 ml of saline, followed by ice-cold 4% paraformaldehyde in borate buffer, pH 9.5, over 10 min. Their brains, spinal cords and spleens were removed, postfixed for 2 days at 4 oC and then cryoprotected overnight in the same fixative supplemented with 20% sucrose. The brains and spleens were cut at 30 J.!m using a freezing microtome, collected in cryoprotectant (30% ethylene glycol, 20% glycerol, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4) and stored at -20 oC until histological analysis. Spinal cord segments were cut at 30 J.!m using a cryostat, mounted onto Snowcoat X-tra slides (Surgipath, Winnipeg, MB, Canada) and stored at -20 oC. 2.4.7. cDNA cloning Total RNA from BV2 cells, cultured with LPS as described below, was isolated using the GenElute Mammalian Total RNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) following the manufacturer's protocol. Five micrograms of RNA was reverse transcribed for 50 min at 42 oC with Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). Partial cDNAs were PCR amplified with Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) and the following Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 38 primers: GPR84, forward 5' -CTGGAAGCCTGACTGCCCCTCAAAA-3 ' and reverse 5'CTCCTTGGGTCACACAGGGTTGACG-3 '; TNF, forward 5' -CCCAGAAAAGCA- AGCAGCCAACCA-3 ' and reverse 5' -GAGAGGCCAGGTGGGGACAGCTC-3 '. The PCR conditions consisted of an initial denaturation step (94 oC, 2 min), followed by 30 cycles ofPCR reaction (94 oC for 15 sec, 63 oC for 30 sec, 68 oC for 100 sec), and then by a final extension step (68 oC, 2 min). The amplicons were cloned into the PCR-Blunt 11TOPO vector (Invitrogen) and automatically sequenced from both ends to confirm identity. Before riboprobe synthesis (see below), the plasmids were linearized and purified with a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA). 2.4.8. In situ hybridization GPR84 and TNF mRNAs were detected by radioisotopic in situ hybridization according to a previously described protocol (Simmons, Arriza et al. 1989). Briefly, sections were mounted onto Superfrost slides (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), postfixed with 4% paraformaldehyde in borate buffer, pH 9.5, for 20 min, digested with 10 Jlg/ml proteinase K at 37°C for 25 min, acetylated with 0.25% acetic anhydride for 10 min and dehydrated. Antisense and sense cRNA probes were transcribed from linearized cDNAs in the presence of eSS]-UTP and eSS]-CTP (Perkin-Elmer, Foster City, CA), purified by phenol-chloroform extraction and ammonium acetate-ethanol precipitation, then applied to the slides at a concentration of2 x 10 7 cpm/ml in hybridization buffer (50% formamide, 0.3 M NaCI, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, lx Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, 2 J.lg/ml tRNA and 10 mM dithiothreitol). After incubation at 60 oC for 14 h, the slides were treated with 20 J.lg/ml ribonuclease A for 30 min at 37°C, washed in a solution containing 15 mM NaCI and 1.5 mM sodium citrate for 30 min at 65 oC, dehydrated and exposed to Biomax film (Kodak, Rochester, NY) for 22 h. After film autoradiography, slides were defatted in xylene, dipped into Kodak NTB2 emulsion, exposed at 4 oC for 21 days, developed in Kodak D 19 developer for 3.5 min at 14-16 oC, fixed in Kodak rapid fixer for 5 min, counterstained with 0.25% thionin, dehydrated and coverslipped with a mixture of di styrene , tricresyl phosphate and xylene (DPX; Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 39 2.4.9. Combined immunohistoehemistry and in situ hybridization Free-floating sections were washed in 50 mM potassium phosphate-buffered saline (KPBS) and treated with an avidin-biotin blocking kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The sections were then incubated sequentially for 2 h at room temperature with rabbit anti-Iba1 (1:1000; Waco Chemicals, Richmond, VA) and goat anti-rabbit (1:400; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) antibodies in KPBS supplemented with 2% heparin sulfate. After a one-hour incubation in ABC solution CV ector Laboratories), the staining was developed for 9 min in KPBS containing 0.5 mg/ml diaminobenzidine, 2 mg/ml 13D(+ )-glucose and 1 Jll/ml glucose oxidase. Each of those steps was followed by four 5-min rinses in KPBS. Following staining, the sections were processed for in situ hybridization detection of GPR84 as described above, except that thionin counterstaining was omitted. 2.4.10. Volumetrie analysis AlI quantitative analyses were done by an observer who was blind to the treatment status of the material. Systematically sampled sections (every 10th section through the brain) were processed for in situ hybridation detection of GPR84 as described above. The volume occupied by GPR84+ cells was estimated by the Cavalieri method using Stereo Investigator software (Microbrightfield, Colchester, VT) driving a motorized stage (Ludl, Hawthorne, NY) on a Nikon E800 microscope with a 4x Plan Apochromat objective (numerical aperture 0.1). A point grid of 300 x 300 Jlm was overlaid on each section and the points that fell within the region of interest were counted. Point counts were converted to volume estimates taking into account sampling frequency, magnification, grid size, and section thickness. 2.4.11. Cell eounting th Systematically sampled sections (every 10th section through the brain or 6 section through the spinal cord) were hybridized for GPR84 mRNA as described above. Labeled cells were counted in the cerebral cortex or the T1-TI0 of the spinal cord using the optical fractionator method and Stereo Investigator software. The region of interest was traced using a 4x Plan Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 40 Apochromat objective (numerical aperture 0.1) and sampled using a 40x Plan Apochromat oil objective (numerical aperture 1.4). The counting parameters for the brain were as follows: distance between counting frames, 400 x 400 f.lm; counting frame size, 100 x 100 f.lm; disector height, 10 f.lm; guard zone thickness, 22 f.lm. For the spinal cord, the counting parameters were the following: distance between counting frames, 500 x 1000 f.lm; counting frame size, 80 x 80 f.lm; disector height, 8 f.lm; guard zone thickness, 21 f.lm. The counting unit was defined as a cluster of emulsion grains with a diameter not larger than 21 f.lm. The clusters were counted only if they laid within the disector area and did not intersect forbidden lines. 2.4.12. Imaging Photomicrographs were taken using a Retiga EX monochrome camera (QImaging, Bumaby, BC, Canada) mounted on a Nikon E800 microscope. The images were adjusted for contrast, brightness and sharpness using Photoshop 7 (Adobe Systems, San Jose, CA). 2.4.13. Optical densitometry In situ hybridization signaIs were quantified at the single-cell level by optical density readings. Sections of the dorsal cerebral cortex were photographed (12-bit, grayscale) in dark-field microscopy using a 10x Plan Apochromat objective. On each image, the intensity of all the signaIs was analyzed with ImageJ software 1.36. Each signal was circled using the round selection tool of a fixed dimension (40 x 40 pixels) and the mean optical intensity of that area was recorded. The value was subtracted from the average of 6 background measurements. 2.4.14. Cell culture BV2 mouse microglial cells were seeded at 1 x 106 cells/well in 6-well plates and grown for 24 h in Dulbecco's modified Eagle's medium (Wisent, Saint-Bruno, QC, Canada) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 110 mg/L sodium pyruvate, 100 U/ml penicillin and 100 f.lg/ml streptomycine THP-1 hurnan monocytes were seeded at 2 x 106 cells in T25 flasks and grown for either 24 h Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein 41 expressed in neuroinflammatory conditions under the same conditions as BV2 cells or for 72 h in the presence of 100 ng/ml phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma-Aldrich). The medium was then replaced with fresh medium supplemented with one or a combination of the following: recombinant mouse TNF, IL-1 and IL-6 (R&D Systems; < 1 endotoxin unit per Ilg), PGE2 (Sigma-Aldrich), goat anti-lNF, anti-IL-1 and anti-IL-6 antibodies (R&D Systems), dexamethasone phosphate (Sabex, Boucherville, QC, Canada) and LPS. Cells were cultured for 6 h under these conditions before total RNA isolation. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) 2.4.15. RNA from BV2 cells and Ficoll-purified leukocytes was isolated uSlng the GenElute Marnrnalian Total RNA Miniprep Kit or the Trizol reagent (Sigma), respectively. RNA quantity and quality were assessed using the RNA 6000 Nano LabChip and Agilent Bioanalyser 2100 (Agilent, Mountain View, CA). 1.25 Ilg of total RNA was reverse transcribed for 10 min at 25 oC and 120 min at 42 oC using a random primer hexamer and Superscript II reverse transcriptase. Quantitative PCR was conducted in duplicate in a final volume of 15 III containing lx Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 10 nM Z-tailed forward primer (GPR84, 5- ACTGAACCTGACCGTACAGTGAAAACTGGGAACCTCAGTCTC-3; 18S rRNA, 5ACTGAACCTGACCGTACATGCATGTCTAAGTACGCACGG-3), 100 nM untailed reverse primer (GPR84, 5-TTGGCATCTGAGCTGTTCCA-3; TLR2, 5-CGTTTTTACCACCCGGATCC-3; 18S rRNA, 5-AATGAGCCATTCGCAGTTTCA-3), 100 nM Amplifluor Uniprimer (Chemicon, Temecula, CA) and 2 III cDNA. Amplification was done using the ABI PRISM 7900 sequence detector (Applied Biosystems) under the following conditions: 2 min at 50 oC, 4 min at 95 oC, followed by 55 cycles of 15 sec at 95 oC and 40 sec at 55 oC. Ribosomal 18S RNA was used as an internaI control to normalize the expression levels of GPR84 mRNA. Data were analyzed using SDS 2.0 software (Applied Biosystems). Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 2.4.16. 42 Statistical analysis Means were compared using the unpaired t test or one-way ANOV A when the data met the assumptions of normality (Shapiro-Wilk W test) and homogeneity of variance (Levene' s test). As an alternative, the Wilcoxon rank-sum or Kruskal-Wallis test was used when the distribution was abnormal or the Welch ANOVA when the variances were une quaI. The Tukey-Kramer HSD or Dunn' s test was used for parametric or nonparametric post hoc multiple comparisons, respectively. A two-way ANOVA, followed by the Tukey test, was used when more than one independent variable was being evaluated. The relationship between the number of GPR84+ cells and the clinical score of EAE was examined using the Spearman rank correlation test. AlI statistical analyses used an alpha of 0.05 and were done with Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA). 2.5. Results 2.5.1. Microglia express GPR84 duriog endotoxemia To verify whether GPR84 expression is upregulated in the nervous system during endotoxemia, brain sections from mice injected intraperitoneally with LPS or saline were analyzed for the presence of GPR84 mRNA by radioisotopic in situ hybridization. While very few positive cells were detectable in normal conditions (Fig. la) and 1 h after LPS injection (data not shown) , many strongly positive cells were observed along the leptomeninges and blood vessels 3 h after LPS treatment (Fig. 1b,e). At all the other time points examined (i.e., 6, 12 and 24 h), GPR84-expressing cells were found in large numbers, distributed rather evenly across the parenchyma, from the olfactory bulb to the medulla (Fig. lc,d,f,g). To determine the identity of these cells, adjacent sections were doubly labeled for GPR84 mRNA and the monocytic cell marker Ibal by combined in situ hybridization and immunohistochemistry. We found that GPR84 mRNA was virtually always colocalized with Iba1 (Fig. lh), and that a majority of Iba1 + cells expressed this transcript from 6 to 24 h after LPS injection. Additional sections hybridized with a sense riboprobe exhibited no signal (data not shown) , confirming the specificity of the method. Furthermore, we analyzed total RNA extracted from the brains of mice killed 6 or 24 h Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated prote in expressed in neuroinflammatory conditions 43 after LPS injection by qRT-PCR. As expected, the results showed that the levels of GPR84 mRNA were increased at these time points (Fig. li) and closely paralleled those of TLR2 (Fig. lj), an inflammatory marker known to be induced in the brain by LPS (Laflamme, Soucy et al. 2001). Altogether, these results indicate that microglia selectively express GPR84 during endotoxemia in a strong and sustained manner. 2.5.2. Peripheral monocytic cells express GPR84 in response to LPS To address the question of whether GPR84 is expressed only by microglia or also by other populations of monocytic cells, we first analyzed spleen sections from LPS-treated and control mice by in situ hybridization. Similarly to what we observed in the brain, almost no signal was detected under normal conditions (Fig. 2a,b) and 1 h after LPS injection (data not shown) , but many positive cells were observed from 3 to 24 h posttreatment (Fig. 2e,d). Duallabeling confirmed that the majority of GPR84+ cells were Iba1 + macrophages (Fig. 2e). Interestingly, these cells were mainly located in the red pulp and much less frequently in the white pulp (Fig. 2e), indicating that GPR84 is differentially expressed among subsets of macrophages. Next, to determine whether GPR84 expression is upregulated in leukocytes during endotoxemia, blood samples collected from mice 6 h after intraperitoneal injection ofLPS or saline were analyzed by qRT-PCR. As shown in Fig. 2f, the leukocytic levels of GPR84 mRNA were very low in LPS-treated mice, but significantly higher than in normal mice. To examine more specifically the ability of monocytes, the common precursors of microglia and peripheral macrophages, to produce GPR84, cultures ofnon-adherent cells of the monocytic line THP-1 were exposed for 6 h to LPS, and RNA extracted from these cells were analyzed by qRT-PCR. As a positive control, THP-1 cells previously differentiated into adherent macrophages in the presence of phorbol ester were treated identically. Consistent with the above results, a relatively small but significant increase in the levels of GPR84 mRNA was observed in undifferentiated THP -1 cells, whereas these levels were 6 to 7 time higher in their differentiated counterparts (Fig. 2i). Together, these results indicate that monocytic cells other than microglia can express GPR84 upon appropriate stimulation, and suggest that GPR84 might play a more important role in macrophages than in monocytes. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 44 2.5.3. Proinflammatory cytokines induce GPR84 expression in cultured microglia through a dexamethasone-insensitive mechanism Because LPS is thought not to cross the blood-brain barrier (Nadeau and Rivest 2000; Singh and Jiang 2004), it is possible that proinflammatory molecules rapidly produced within the brain in response to endotoxin mediate the induction of GPR84 expression. To explore this possibility, we cultured BV2 microglial cells for 6 h with either LPS, as a positive control, or different mediators known to be expressed in the brain during endotoxemia. Quantitative RT -PCR analysis showed that molecules able to stimulate the NF-KB pathway, namely LPS, TNF and, to a lesser extent, IL-l , but not IL-6 nor PGE2 enhanced the levels of GPR84 mRNA in BV2 cells (Fig. 3a). The effects of TNF and IL-I were blocked by the addition of the corresponding antibodies to the culture medium (Fig. 3b), but not by the addition of anti -IL-6 antibody, confirming the specificity of the results. To gain insight into the mechanism that govems GPR84 gene transcription, we examined its sensitivity to the glucocorticoid agonist dexamethasone. This steroid has been shown to repress about half of the LPS-inducible genes in macrophages by disrupting interactions between the p65 subunit of NF -KB and interferon regulatory factor 3 (Ogawa, Lozach et al. 2005). As revealed by qRT-PCR, addition of dexamethasone to the culture medium at a concentration as high as 1 ~g/ml did not block the induction of GPR84 expression by LPS or TNF (Fig. 3e). As a positive control, RNA extracted from LPSstimulated cells incubated with or without dexamethasone were analyzed for IL-6 expression, which is known to be sensitive to dexamethasone (Ogawa, Lozach et al. 2005). As expected, a 3.8-fold reduction of LPS-induced IL-6 expression was observed in dexamethasone-treated cells (Fig. 3d). Altogether, these results demonstrate that proinflammatory cytokines, notably TNF, stimulate GPR84 expression in cultured microglia through a dexamethasone-insensitive pathway. 2.5.4. TNF induces GPR84 expression in the brain To confirm in vivo the ability of TNF to induce GPR84 expression in microglia, brain sections from mi ce killed 3 or 6 h after intracerebral injection of TNF or saline were analyzed by in situ hybridization. Strong signaIs were found only around the needle track in Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinjlammatory conditions 45 control mice (Fig. 4a), but in a large proportion of the ipsilateral hemisphere in TNFtreated animaIs (Fig. 4b-e). More precisely, stereological analysis revealed that the volume occupied by GPR84+ cells was about 4 times larger in TNF-treated mice compared to controls (Fig. 4t). However, this volume was similar at both time points, suggesting that TNF reached its maximal effect early after injection. To determine whether this response was dependent on the route of administration, additional mice were injected intravenously with TNF and killed at the same time points, but no increase in GPR84 expression was noted in any region of the brain (data not shown). Overall, these results raise the possibility that TNF, produced within the nervous system in response to endotoxin, mediates the induction of GPR84 expression, as it is the case for other genes such as CD 14 (N adeau and Rivest 2000). 2.5.5. TNF and IL-l partially mediate the induction of GPR84 expression in microglia by LPS To investigate the importance of TNF and IL-1 in the regulation of GPR84 expression in microglia during endotoxemia, mice deficient or not in TNF, IL-1 or both, and sharing the same genetic background, were injected intraperitoneally with LPS and killed 6 h later. Their brains were processed for in situ hybridization, and the number of GPR84+ cells was estimated in the cerebral cortex using unbiased methods. As shown in Fig. 5a-e, we found that the density of GPR84+ cells was reduced by 42% in IL-1-knockout mice, 56% in TNF-knockout mice and 72% in double knockout mice compared with wildtype littermates. To complement this result, we measured the intensity of hybridization signaIs for GPR84 mRNA in the cerebral cortex at the single-celllevel by optical density readings. The data revealed that the relative abundance of GPR84 mRNA per cell was reduced by 49% in IL-1-knockout mice, 68% in TNF-knockouts and 76% in double knockouts (Fig. St). In other words, not only there were fewer GPR84+ microglia in the brains of mice lacking TNF and/or IL-l , but also microglia that were identified as being positive expressed lower levels of GPR84 mRNA (Fig. 5g). Therefore, our results indicate that the induction of GPR84 expression in the brain during endotoxemia is mainly mediated by TNF and, to a lesser extent, IL-l. However, the fact that GPR84 expression was not Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinjlammatory conditions 46 totally abolished in double knockout mlce suggests that other mediators might also contribute to this effect. 2.5.6. Microglia express GPR84 during EAE TNF and other proinflammatory cytokines are known to be produced in the nervous system in many pathological and traumatic conditions (Allan and Rothwell 2001 ; Nguyen, Julien et al. 2002). GPR84 could thus be expressed not only during endotoxemia but also in other neuroinflammatory conditions in which TNF is produced, notably multiple sclerosis. To examine this possibility, mi ce were immunized with a MOG peptide to induce EAE, and their brains and spinal cords were collected for in situ hybridization. As shown in Fig. 6, numerous GPR84+ cells were found throughout the CNS ofEAE mice. In contrast to what we observed during the later phases of endotoxemia, these cells were not evenly distributed, but formed clusters, often near blood vessels. Stereological analysis on sagittal sections of the spinal cord (TI-TIO) revealed that GPR84+ cells were already abundant at the onset of EAE (Fig. 6g), and that their number tends to increase with disease severity (Spearman rank correlation test, P = 0.003, R = 0.80). These results suggest that GPR84 might contribute to the development of neuroinflammatory diseases such as multiple sclerosis. 2.6. Discussion In this study, we examined the regulation of a newly discovered gene expressed by myeloid cells, namely GPR84, for which very little information is available. The main finding is that GPR84 gene transcription is strongly induced in microglia by diverse inflammatory stimuli of exogenous or endogenous origin. In pathological conditions, such as endotoxemia and auto immune demyelinating disease, GPR84 expression in the CNS is widespread and sustained in time. These observations lead us to propose that GPR84, a membrane receptor predicted to interact with G protein subunits, is important for the regulation of microglia, although its precise function remains to be determined. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 47 The present work shows that endotoxemia induces a wave of GPR84 gene expression in the brain that starts along the meninges and vasculature and propagates through aIl parenchymal regions within a few hours. It is generally believed that endotoxin does not cross the blood-brain barrier (Nadeau and Rivest 2000; Singh and Jiang 2004), implying that soluble mediators released by activated cells (e.g. , endothelia, perivascular macrophages) are responsible for the induction of GPR84 gene transcription. In an attempt to identify such mediators, we examined the effect of TNF, because it has been shown that intracerebral administration of anti-TNF antibody blocked LPS induction of CD 14 expression in microglia (Nadeau and Rivest 2000). We also examined the effect of IL-l , because this cytokine has overlapping roles with TNF and could thus compensate for its absence. Our results support the concept that TNF and, to a lesser extent, IL-I mediate the effect of LPS on GPR84 expression in the brain, and that the lack of either one of these cytokines is not compensate by the other. It remains to be determined whether other mediators contribute to the stimulation of GPR84 expression in the conditions examined here or in response to different immune stimuli. Our results predict that GPR84 would be expressed in the CNS not only during endotoxemia and multiple sclerosis, but also in aIl neurological conditions in which TNF or IL-lB are produced, such as brain injury, infection, cancer and Alzheimer' s disease. In future studies, it will be important to determine whether GPR84 signaling contributes to the development of inflammation in these conditions, and what the consequence of its dysregulation is. Furthermore, for basic science and therapeutic purposes, it would be useful to identify agents able to inhibit this pathway. Our results indicate that GPR84 gene transcription is not affected by dexamethasone, perhaps because its is induced by a MyD88-independent mechanism or requires coactivators other than the interferon regulatory factors, as suggested for other LPS-inducible, glucocorticoid-resistant genes (Ogawa, Lozach et al. 2005). As an alternative, it would be interesting to examine the effects of other immunosuppressors, such as cannabinoids, which have recently been shown to interfere with LPS/CDI4/TLR4 signaling, probably through a MyD88-independent pathway (Eljaschewitsch, Witting et al. 2006; Rivest 2006). Furthermore, the development of specific inhibitors for GPR84 should be of great interest in the pharmaceutical industry, Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinflammatory conditions 48 as small-molecule GPR modulators are estimated to account for nearly half of the most popular drugs on the market today (Menzaghi, Behan et al. 2002). Because GPR84 is expressed only after appropriate immunostimulation and seems restricted to the myeloid compartment, such antagonists could prove more specific, less toxic and thus safer than other immunomodulators currently available. Most proteins known to be produced by microglia can also be produced by their monocyte precursors. Only a few proteins, such as TREM2 (Schmid, Sautkulis et al. 2002), have been identified with certainty as being expressed more abundantly in microglia compared to monocytes. The present work reveals that microglia and sorne populations of peripheral macrophages, such as those of the splenic red pulp, have the ability to produce much higher levels of GPR84 than monocytes and other types of macrophages, such as those of the splenic white pulp. This observation suggests that GPR84 might play a predominant role in sorne populations of macrophages, including microglia, and not in monocytes. GPR84 can thus be added to the short list of genes known as being expressed preferentially in microglia versus monocytes. In conclusion, this study identifies GPR84 as a new player in the biology of microglia, and shows for the first time that its expression is highly inducible under inflammatory conditions. The greatest challenges are now to detennine the precise role of GPR84, to identify its natural ligand, and to explore the possibility of targeting this signaling pathway for therapeutic benefit. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein 49 expressed in neuroinjlammatory conditions Figure 1. GPR84 is strongly expressed by microglia during endotoxemia. a, Dark-field photomicrographs showing virtually no in situ hybridization signa l for GPR84 mRNA in brain sections from a mouse killed 3 h after sal ine injection. b-d, Strong hybridization signais for GPR84 mRNA in brain sections of mice killed 3,6 or 24 h after intraperitoneal LPS injection, respectively. e-g, Dark-field and bright-field images showing GPR84-producing cells at higher magnifications (blue, Nissl counterstaining). Note that the expression of GPR84 mRNA is restricted to the leptomeninges and blood vessels 3 h after LPS injection, but is widespread at 24 h. h, Double labeling for the microglial marker Ibal (brown, immunoperoxidase staining) and GPR84 mRNA (black grains, in situ hybridization). Arrows indicate doubly labeled cells. i, Increased levels of GPR84 mRNA were detected in the brains of LPS-treated mice, as determined by qRT-PCR. Data are expressed as a ratio to 185 rRNA (mean ± SE). *Two-way ANOVA (treatment, P < 0.0001; time, P = 0.012; treatment, P = 0.013) followed by Tukey-Kramer test. j, A strong correlation was found between the levels of GPR84 and TLR2 mRNAs, as determined by qRT-PCR (Pearson correlation, P < 0.0001, R =0.96). Abbreviations: BV, blood vessel; Cer, cerebellum; Cor, cerebral cortex; CC, corpus callosum; Cp, caudoputamen; D3V, dorsal third ventricle; EC, external capsule; GrOG, granule cell layer of the dentate gyrus; Hip, hippocampus; Lep, leptomeninges; MoDG, molecular layer of the dentate gyrus; PoDG, polymorphic layer of the dentate gyrus; Tha, thalamus. · ," A i:-..· ~ '(. .. 50 ~;( QI Z 40 >0:: QI * • LPS .... ~~ ~~ I.:J~ • ex: 00 Z~ , 15 o 12 ~'= ~Vl 30 0: 0 ;i J~ ~ . ... •.. 1 • 9 LPS6h 0: 0 E; 20 N.~ 0:'" ....J ~ 10 t-g 6h 24h Time after injection 6 3 o LPS 24h • Saline 6 or24h o 10 20 30 40 50 GPR84 mRNA levels (relative to 18S rRNA) 60 Scale bars: a-d, 1 mm; e, f, 250 ~m; g, 50 ~m;h,20 !-lm. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein expressed in neuroinjlammatory conditions Figure 2. GPR84 is expressed by peripheral macrophages and, to a lesser extent, monocytes upon stimulation with LPS. Q, b, Dark-field and bright-field photomicrographs showing no in situ hybridiza- tion signal for GPR84 mRNA in spleen sections from a mouse killed 24 h after saline injection. Blue, thionin counterstaining. d, Strong hybridization signais (white or black grains) for GPR84 mRNA in spleen sections from a mouse killed 24 h after intraperitoneal LPS injection. Note the difference between the red and white pulp. C, e, Double labeling for the macrophage marker Iba 1 (brown, immunoperoxidase staining) and GPR84 mRNA (black grains, in situ hybridization). Arrows indicate double-Iabeled cells. f, qRT-PCR analysis revealed a small but significant increase in GPR84 expression in blood leukocytes collected from mice 6 h after LPS injection. Increased levels of GPR84 mRNA were also recorded in cultured THP-l cells, undifferentiated (monocytes) or differentiated into macrophages by exposure to phorbol ester, 6 h after the addition of LPS. Data are expressed as a ratio to 185 rRNA (mean ± SE). *Student's t test, P = 0.0057 (blood), 0.0017 (monocytes) or 0.0169 (macrophages). Abbreviations: RP, red pulp; WP, white pulp. Scale bars: Q,C, 100 ~m; b, d, 20 ~m; e, 10 ~m. 50 Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein 51 expressed in neuroinflammatory conditions a 125 ë ce t: z 8 a: ", E > ~ ~ a: c: (3 -5 b * 3.5 "'< >a: 100 Qi Z 3.0 QI ... a: 0 * * * * 50 E '" ~ .~ g:~ TNF IL-l ë • PBS E 10 40 ~ Ant ibody: PBS ~ ~ ~u.. alZ alZ alL-l aTNF a1L-6 0.. - o.. ~ ~u.. o.. ~ 50 40 ~ 30 c: ~ - "5 20 '0 ;g 20 ~~~ g c: '0 Cytoki ne: 60 ce 8 z '"> a: ;g 10 0.5 IL-6 PGE2 d 80 E > ~~ g: ~ ","5 1.5 0.0 LPS 100 a: '" 60 2.0 '" ~ 1.0 * 25 C ce t: z 8 ~ ~ 2.5 75 '0 ;g 4.0 LPS TNF LPS LPS + Dex Figure 3. GPR84 expression is induced in cultu red microg lia by proinflammatory molecules t hrough a dexamethasone-insensitive mechanism. Quantitative RT-PCR analysis showed increased levels of GPR84 mRNA in BV2 microglial cells exposed for 6 h to LPS, TNF or IL-l , but not t o IL-6 nor PGE2, compared to those in control ce Ils. Concentrations used: LPS, 1 IJg/ml; cytokines and PGE2, 100 ng /ml. Data are expressed as mean ± SE. * Kruskal -Wallis ANOVA followed by Dun n's test, P = 0.01. Q, b, The increase of GPR84 mRNA in BV2 cells in response to TNF (10 ng/ml) or IL-l (10 ng/ml ) was blocked by co-incu bation with the corresponding antibody (aTNF or ail-l , 8 1l9/ml), but not with anti-ll-6 antibody (all-6, 8 1l9/ ml). *Signifi ca ntly different from untreated ce lls (two-way-ANOVA followed by Tu key-Kramer test, P < 0.0001). c, The induction of GPR84 expression in BV2 cells by lPS (1 1l9/ml) or TNF (100 ng/ml) was not inhibited by the addition of dexamethasone (Dex; 1 Ilg/ml). d, As a positive control fo r the experiment shown in c, a 3.8-fold reduction of lPS-induced Il-6 expression was detected in cells treated with dexamethasone (1 1l9/ml). *Student's t test, P = 0.0063. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated prote in expressed in neuroinflammatory conditions 52 Figure 4. GPR84 expression is induced after intracerebral injection ofTNF. a-c, Dark-field photomicrographs showing in situ hybridization signais for GPR84 mRNA in brain sections of mice killed 3 or 6 h after injection of TNF (100 ng) or saline into the right caudoputamen. Note that GPR84-expressing cells were present only around the needle track (arrowhead) in the control mouse (a), but in a large proportion of the ipsilateral hemisphere in TNF-injected mice (b, c). d, e, Dark-field and bright-field images showing GPR84+ cells at higher magnifications (blue, Nissl counterstaining). A dashed line separate the area containing GPR84+ cells (right) from the area devoid of such cells (left). f, As estimated by the Cavalieri method, the volume occupied by GPR84+ cells in TNF-injected mice was ..... 4 times that in control mice. No difference was observed between the time points examined. Data are expressed as mean ± SE. *Two-way ANOVA followed by Tukey-Kramer test, P < 0.0001. Abbreviations: Cor, cerebral cortex; CC, corpus callosum; Cp, caudoputamen; Hip, hippocampus; LV, lateral ventricle. Scale bars: a-c, 1 mm; d, 250 ~m; e, 20 ~m. Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated protein 53 expressed in neuroinflammatory conditions Figure s. Reduced expression of GPR84 in mice deficient in TNF and/or IL-1. a-d, Dark-field phot om icrographs showing in situ hybrid ization signa is for GPR84 mRNA in brai n sections of mice killed 6 h after intraperitonea l injection of LPS. e, Stereological analysis revealed reduced numbers of GPR84+ cells in the cerebral cortex in mice lacking IL-l , TNF or both, compared w ith wild-type (WT) littermates. Data are expressed as mean ± SE. *Welch ANOVA followed by Tukey-Kramer test, P < 0.0001. f, Densitometric analysis revea led lower levels of GPR84 mRNA in cortical microglia in the knockouts. Data are expressed as mean ± SE. *Welch ANOVA followed by TukeyKramer test, P < 0.0001. e 18000 É f - 7000 ~ 6000 ~ 15000 z-;:; E ~ 12000 + ~ 9000 E '§ 5000 a.. ~:o o~ ~~ CI: 6000 00 CI: ~ Abbreviations: Cor, cerebral cortex; Hip, hippocampus; Tha, thalamus. v>- ~ ~ 4000 v ; g, A positive correlation was found between the number of GPR84+ cells and the relative abundance of GPR84 mRNA per cell (Pearson correlation, P < 0.0001 , R = 0.85). ~Q 3000 § c( IL-l - 9= o WT TNF IL-l+TNF Knockouts - IL-l - z-;:; TNF IL-l+TNF Knockouts - * 7000 E'§ 6000 ~ ~ 5000 ~ ~] 4000 o~ .S~ ~ Scale bar: a-d, 200 lJm. 8000 Q.I ~ CI: 2000 1000 ..c WT 3000 3000 * OoQ 8 2000 "§ - • •• o 0 <JS * * *WT o 0 'tt IL-l KO tt TNFKO 1000 • ..c IL-l+TNF KO c( 5000 10000 15000 GPR84 mRNA+ cells/mm 3 20000 25000 Chapitre 2: G Protein-coupled receptor 84, a microglia-associated prote in 54 expressed in neuroinjlammatory conditions 1 2 EAE score Figure 6. GRP84 is expressed in the CNS during EAE. b, Dark-field photomicrographs showing in situ hybridization signais for GPR84 mRNA in brain and spinal cord sections, respectively, of EAE mice with a Q, c1inical score of 3. c, A coronal section of the spinal cord from a EAE mouse showing many GPR84+ cells, preferentially located in the white matter. d, Higher magnification in bright-field of the boxed area in c. Blue, Nissl counterstaining. e, f, Bright-field images showing c1usters of GPR84-expressing cells near blood vessels (asterisk). g, Stereological cell counts revealed that the number of GPR84-positive cells in the spinal cords of EAE mice tent to increase with disease severity (Spearman rank correlation test, P = 0.003, R = 0.80). Data are expressed as mean ± SE. *Welch ANOVA followed by Tukey-Kramer test, P = 0.03. Abbreviations: Cor, cerebral cortex; CP, caudoputamen; Hip, hippocampus. Scale bars: Q, b, 1 mm; c, 100 Ilm; d, 25 Ilm; e,f, 50 Ilm. CHAPITRE 3 3. GPR84 FUNCTION IN NEUROINFLAMMATORY CONDITIONS Julie Pagé, Caroline Bouchard, Yan Sergerie, Pierrot Tremblay and Luc Vallières 3.1. Résumé Le récepteur couplé aux protéines G GPR84 est un récepteur orphelin nouvellement identifié qui est exprimé dans différentes conditions inflammatoires, mais sa fonction exacte est toujours inconnue. Dans cette étude, nous avons exploré le rôle du GPR84 dans des conditions neuroinflammatoires. Plus précisément, nous avons comparé le comportement et la survie de souris GPR84 déficientes (GPR84-1-) et sauvages (GPR84+/+) durant une endotoxinémie, une encéphalite induite par le virus de l 'herpes de type 1 (HSV1) et une encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE). Pour chacun de ces modèles inflammatoires, nous n' avons observé aucune différence significative sur le comportement ou la survie entre les deux groupes de souris. En conclusion, cette étude suggère que le GPR84 ne joue pas un rôle important dans les maladies neuroinflammatoires étudiées. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 3.2. 56 Abstract G protein-coupled receptor 84 (GPR84) is a newly identified orphan receptor ofthat is expressed under inflammatory conditions, but its exact function remains unknown. In this study, we explored the role of GPR84 during various neuroinflammatory conditions. We compared the behavior and survival of GPR84 knockout (GPR84-1-) and wild-type (GPR84+1+) mice during endotoxemia, herpes simplex virus (HSV -1) encephalitis and experimental auto immune encephalomyelitis (EAE). In each ofthese inflammatory models, we observed no significant difference in the behavior or survival of the animaIs of both groups. In conclusion, this study suggests that GPR84 does not play an important role in inflammatory models studied. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 3.3. 57 Introduction The mouse and human G protein-coupled receptor 84 (GPR84) genes encode proteins of 396 amino acids with 85% identity and 90% similarity. GPR84 is a receptor characterized by a single-chain of seven transmembrane domains linked by three intracellular and three extracellular loops (Wittenberger, Schaller et al. 2001 ; Venkataraman and Kuo 2005 ; Wang, Wu et al. 2006). 1t belongs to the rhodopsin superfamily, but since it could not be related to any known subfamily, it has been classified in a new subgroup of orphan GPCRs. The first study on GPR84 revealed its presence in bone marrow, lung and peripheral leukocytes, with the highest transcript levels in immune cells, including neutrophils, eosinophils and phorbol ester-activated peripheral blood mononuclear cells (Yousefi, Cooper et al. 2001). GPR84 serves as a receptor for medium-chain free fatty acids (FF As) with a carbon chain containing 9 to 14 carbons and its activation increases the production of interleukin-12 p40 subunit after lipopolysaccharide stimulation in vitro (Wang, Wu et al. 2006). A study that used GPR84-deficient mi ce proposed a role of the receptor in the regulation of interleukin-4 expression by activated T cells in vitro (Venkataraman and Kuo 2005). However, the exact function of GPR84 in vivo remains to be determined. Cells participating in the innate immune response, especially microglia, the resident macrophages of the central nervous system, can play a detrimental and/or beneficial role in many pathologies, such as multiple sclerosis (Heppner, Greter et al. 2005), Alzheimer' s disease (Simard, Soulet et al. 2006) and cerebral tumors (Villeneuve, Tremblay et al. 2005). We recently explored the possibility that the GPR84 gene is inducible in microglia. The results indicate that GPR84 is expressed in the brain during inflammatory conditions such as endotoxemia and experimental auto immune encephalomyelitis (EAE), a widely used animal model for multiple sclerosis (Wang, Wu et al. 2006; Bouchard, Page et al. 2007). However, in the present study, we report that GPR84 does not influence the progression of these diseases. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 3.4. 58 Materials and Methods 3.4.1. Animais C57BL/6 mice purchased from Charles River Laboratories (Montréal, QC, Canada) were adapted to standard laboratory conditions for 1 week before any manipulation. C57BL/6 mice deficient in GPR84 and their wild-type controls were generated from breeders originally obtained from The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Genotypes were determined by PCR using DNA extracted from ear punches and the following primers: 5-ACAGCTCAGATGCCAACTTCTCCTG-3 , 5-TCCTAGAGCAATGAGACAG AGGGTG-3 , and 5-GACGAGTTCTTCTGAGGGGATCGATC-3. The amplicons (wildtype allele, 344 bp; mutant allele 558 bp) were resolved and visualized on a 1% agarose gel. AlI experiments were done on mice aged 2 to 3 months in accordance with current guidelines of the Canadian Council on Animal Care. 3.4.2. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) LPS from Escherichia coli 055:B5 (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) was dissolved in pyrogen-free saline and injected intraperitoneally at a dose of 1 mg/kg. Control mice were treated identicalIy, except that LPS was substituted by saline. 3.4.3. Active induction of EAE Mice were injected subcutaneously on days 0 and 7 with 200 J.lL of emulsion containing 300 J.lg of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) peptide 35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) (synthesized by Service de Synthèse de Peptide de l'Est du Québec, Québec, QC, Canada) diluted in saline with an equal volume of complete Freund's adjuvant (CFA) containing 500 J.lg of killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI). In addition, 500 ng of Pertussis toxin (List Biological Laboratories, Campbell, CA) were injected intraperitoneally immediately and 48 h after the first immunization. Mice were monitored daily for clinical signs of EAE and scored as follows: 0, no detectable signs; 1, tail flaccidity; 2, hindlimb weakness and po or righting ability; 3, hindlimb paralysis/paresis; 4, hindlimb paralysis and forelimb paraparesis; 5, moribond or dead. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 59 3.4.4. T -maze test Mice were randomly assigned to treatment groups and habituated to the test room for 1 day prior to experimentation. One hour before and 1, 3, 6, 12, 24, 36 h after injection of LPS or saline, the social exploration behavior (rearing) and locomotor activity (segment crossed) of each mouse were recorded using a T -maze separated in equal segments (Deacon and Rawlins 2006). The animaIs were placed in the first segment and the number of rearing and segment crossed was counted. 3.4.5. cDNA cloning Five micrograms of mouse brain total RNA was reverse transcripted for 50 min at 42°C with Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlbad, CA). Partial cDNAs were PCR amplified with Platinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) and the following primers: GPR84, forward 5'-CTGGAAGCCTGACTGCCCCTCAAAA-3 ', and reverse 5' CTCCTTGGGTCACACAGGGTTGACG-3 ' . The PCR conditions consisted of an initial denaturation step (94°C, 2 min), followed by 40 cycles of PCR reaction (94°C for 15 sec, 60°C for 30 sec, 68°C for 1 min 40 sec), and then by a final extension step (68°C, 2 min). The amplicons were cloned into the PCR-Blunt II-TOPO vector (Invitrogen) and automatically sequenced from both ends to confirm their identity. Before the riboprobe synthesis (see below), the plasmids were linearized and purified with a Qiaquick PCR purification kit (Qiagen, Valencia, CA). 3.4.6. RNA preparation and microarray analysis Mice were anesthetized with isoflurane and their brain removed and grinded in 2 mL of Trizol reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Total RNA was extracted following the manufacturer' s instructions. The RNA integrity and yield were assessed by microcapillarity electrophoresis (Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Twelve nanograms of total RNA were converted to cDNA, which was amplified and transcribed to produce biotinylated cRNA using the Small Sample Labeling Protocol Version 2 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Fifteen micrograms of fragmented cRNA were hybridized in duplicate to Affymetrix Mouse genome 430 2.0 arrays for 16 h at 45°C with constant rotation at 60 rpm. The arrays were washed and stained with streptavidin- Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 60 phycoerythrin (10 J.lg/ml; Vector Laboratories, Burlingame, CA) uSlng the Affymetrix Fluidics Station 400 (protocol EukGE-WS2A v5), then read using the Affymetrix GeneChip Scanner 3000. Microarray data were analyzed with the statistical software R (version 2.3.1 ; available from http://www.r-project.org) and add-on packages from the Bioconductor project (version 1.8; available from http://www.bioconductor.org).Briefly. after assessing array quality using the AffyPLM and AffyQCReport packages, the hybridization signaIs were background-corrected, normalized and summarized with the GCRMA package. To identify differentially expressed genes, empirical Bayes moderated t-statistics were computed with the LIMMA package, adjusting the corresponding P-values using the Benjamini and Hochberg' s method to control the [aIse discovery rate at 5%. Annotations were obtained from the Affymetrix web site. 3.4.7. Real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Total RNA was isolated from brains using the Trizol reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) following the manufacturer' s instructions. RNA quantity and quality were assessed using the RNA 6000 Nano LabChip and Agilent Bioanalyser 2100 (Agilent, Mountain View, CA). RNA (4 f.lg) was reverse transcribed for 10 min at 25°C and 120 min at 42°C using a random primer hexamer and Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen). Quantitative PCR was conducted in duplicate in a final volume of 15 f.ll containing lx Univers al PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), 10 nM Z-tailed forward primer (Table 1), 100 nM untailed reverse primer (Table 1), 100 nM Amplifluor Uniprimer (Chemicon, Temecula, CA) and 2 III cDNA. Amplification was done using the ABI PRISM 7900 sequence detector (Applied Biosystems) under the following conditions: 2 min at 50°C, 4 min at 95°C, followed by 55 cycles of 15 sec at 95°C and 40 sec at 55°C. Ribosomal 18S RNA was used as an internaI control to normalize the expression levels of each transcript. Data were analyzed using SDS 2.0 software (Applied Biosystems). 3.4.8. Herpes simplex virus encephalitis induction AnimaIs were anesthetized by inhalation of isoflurane USP (Abbott Laboratories, Saint-Laurent, Québec, Canada). A total of 20 III of MEM medium (Gibco BRL, Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 61 Burlington, Ontario, Canada) containing 5 x 10 5 plaque-forming units (Pfu) of HSV-1 (clinical strain H25) were inoculated intranasally. Mice were weighted and monitored for signs of sickness daily for 16 days. The survival time was measured from the day of infection to the day of death. 3.4.9. Statistics Means were compared using the unpaired t test or one-way ANOV A when the data met the assumptions of normality (Shapiro-Wilk W test) and homogeneity of variance (Levene' s test). A multivariate analysis of variance (Manova) test was used when more than one independent variable were being evaluated. AlI statistical analyses used an alpha of 0.05 and were done with Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, CA) or JMP 5 software (SAS Institute, Cary, NC). Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 3.5. 62 Results 3.5.1. Effect of GPR84 during endotoxemia Since GPR84 expression is upregulated during endotoxemia, we addressed the question of whether GPR84 has an impact on behaviour activities of mice suffering of endotoxemia. GPR84-deficient and wild-type control mi ce were injected with LPS and observed at eight time points (0, 1, 3, 6, 12, 24, 36 and 48 h) for locomotion activity and rearing. As reported (Hart 1988), LPS reduced the social exploration behavior and locomotor activity of mice, but no intergroup difference was noted (Fig. 1 a-b). These results indicate that GPR84 is not involved in the behavioral changes induced by LPS. To examine the effect of GPR84 on gene expression, RNA samples extracted from the brains of GPR84 knockout and wild-type mice killed 6 or 24 h after LPS or saline injection were analyzed by DNA microarray. The samples were analysed in duplicate using arrays interrogating over 39000 transcripts. The raw data were normalized and quantified using the GCRMA algorithm, a stochastic-model-based procedure that takes into considers probe sequence information, such as GC content, and that was shown to perform better than other widely used algorithms (Wu and Irizarry 2004). We calculated the P value and the fold change between knockout and wild-type mice 6 h after LPS injection. We found 2040 genes with a P value < 0.05. Among them, none varied by more than two fold. To confirm our results, we chose 13 differentially regulated transcripts, which were analysed by quantitative PCR (Table 2). The selected genes had a P value < 0.01 and a fold change between 1.19 and 1.81. However, these differences were not confirmed by quantitative PCR; no difference was observed for the 13 transcripts (Fig. 2). A significant difference was detectable for the control gene GPR84 (Fig. 2a). These results suggest that GPR84 does not induce major transcriptional changes in the brain during endotoxemia. 3.5.2. Influence of GPR84 on EAE development Because GPR84 expression increases with the clinical score in EAE mlce (Bouchard, Page et al. 2007), we studied its role in the development of this disease. We immunized 15 GPR84-deficient mice (GPR84 -1-) and 15 wild-type controls (GPR84 +1+) with MOG 35-55 peptide. The animaIs were monitored daily for clinical signs of EAE Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 63 during 38 days, starting from the day of immunization. AlI animaIs developed EAE, starting approximately 13 days after immunization (Fig. 3a). No significant difference in disease severity, disease onset and survival was observed between the groups (Fig. 3a-b). These results demonstrate that GPR84 is not important for the development ofEAE. 3.5.3. Importance of GPR84 in experimental herpes simplex virus encephalitis It has been reported that double TNF and IL-1 ~ knockout mice are sensitive to herpes simplex virus type 1 (HSV -1) and die from encephalitis after ~ 117 h (Sergerie, Rivest et al. 2007). To examine whether GPR84 was similarly important in this model, GPR84-KO and WT mice (eight per group) were infected with the virus and examined daily during 12 days starting at day 4. We noted no significant difference in the weight and survival of the knockouts compared to the wild-types (Fig. 4). These results show that GPR84 is not crucial for the protection against HSV -1 encephalitis. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 3.6. 64 Discussion In this study, we analyzed the function of GPR84, a G protein-coupled receptor strongly expressed in macrophages in inflammatory models such as endotoxemia and EAE (Bouchard, Page et al. 2007). The results indicate that GPR84 does not play a significant role in the pathological conditions examined, including endotoxemia, EAE and herpes simplex virus encephalitis. Our analyses show that GPR84 does not mediate the behavioral effect of LPS. However, this technique presents intra-group variations which depend on the influence of several factors, like the environment and the basal behavior of animaIs. As a consequence, subtle changes in behavior were difficult to detect and cannot be excluded. In this study, we analysed the behavior based on the rearing and locomotor activity, but other behavioral aspects, such as fever, have not been studied and could have resulted in different outcomes. Furthermore, it would be interesting to analyse the behavioral effect of GPR84 in a more complete inflammation model than endotoxemia, such as the HSV -1 encephalitis. The present work shows that GPR84 seems not to have a significant influence on gene transcription during endotoxemia. On the other hand, microarray analysis and quantitative-peR, being more sensible than specific, are limited techniques for identification of small variations between gene expressions in a subpopulation of cells, like microglia within the brain. We reported that GPR84 is not involved in the protection against HSV-1 encephalitis. No impact was observed on weight and survival during the course of infection. The immune-mediated viral clearance is the result of multiple interactions between immune cells and molecules (Marques, Hu et al. 2006). During the immune response, the impact of GPR84 could be too small to be able to observe a significant impact on survival during HSV -1 encephalitis. We cannot exclude a more subtle role of GPR84 in the clearance of HSV -1. In conclusion, we studied the function of GPR84 in neuroinflammatory models. Our results did not allow us to determine the role of GPR84. However, macrophages are known to express several genes when activated by precise signaIs. AlI these genes do not have an Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 65 active role. Bouchard et al. (2007) have shown that GPR84 is non specificaUy induced in different inflammatory responses as the endotoxemia, the EAE and the cuprizone models, but we demonstrated that it does not play a significant role in aU of these conditions. Thus, the major function of GPR84 remains to be determined. Other inflammatory models should be tested in the future and the endogenous ligand of GPR84 should be identified. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 66 Table 1. Primers used for quantitative RT-PCR cDNA 18s 4430402118Rik Wdr13 Trmu H2a~ Sntb2 Gnas Socs3 Sd~ Irg1 Stra6 Ppargc1 a Ccl11 Oasl1 Tlr2 Gpr84 TNF Forward erimers (5'~3') * TGCATGTCTAAGTACGCACGG AGT AGGACCTTCGAGAGTGGGAG TGTGCCAACATCCCTAATCCA TGCCAGAATCAATAGGCGG GCCAAGTTTGTGATCCACTGTAAT CCTGAAACACTCTACAT AAAACCTCAA ACTTTCCAGAGTTCGCTCGC AATGTITACAATTTGCCTCAATCACT CCCTTCCACATGCTGTACACC ATTTATTAACTCTGGGAACTTCACAGATG TCTCTCTTCCTTCCACTCCCG ACGCAGGTCGAACGAAACTG AATATCAGCACCAGTCGCCC CGTCTTCAGTACCTTGCCAGC AAGATGCGCTTCCTGAATTTG GTGAAAACTGGGAACCTCAGTCTC AAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGC Reverse primers (5'-3') AATGAGCCATTCGCAGTTTCA AAGGACTTGTTCCAATGGGTGT TCCTCATAGAAAAATCACTGACCCT GCAGCGTAGACCCTCCTTCC ACATTTGTCTGCACCCCAGAC TCAGATTCGGGAGCTGTGCTA GCTCGGGAGTCGCATCCT CGGGCTGGAGGTGGATTT CTCCTTGCCCCAGCTCCT CCAGCACGTTCCACTTCCTC TGGAGTCTGACTTGGCTGCA TGCTTCCGTCCACAAAAGTACA TCCCATCTGGAACTACATGAAGC CACGACTTCTCACACCCCCT CGrnnTACCACCCGGATCC TTGGCATCTGAGCTGTTCCA CCTCCACTTGGTGGTTTGCT * The forward primers were flanked at their 5' -ends by the following sequence: actgaacctgaccgtaca. RefSeg X56974 NM_028922 NM_026137 NM_028063 NM_012015 NM_009229 NM_138658 NM_007707 NM_01 1521 L38281 NM_009291 NM_008904 NM_01 1330 NM_1 45209 NM_01 1905 NM 030720 NM- 013693 Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions 67 Table 2. Genes identified by microarray as being differentially regulated between GPR84 knockout and wild -type mice 6 h after LPS treatment Symbol Name 4430402118Rik RIKEN cDNA 4430402118 gene Wdr13 WD repeat domain 13 tRNA 5-methylaminomethyl-2-thiouridylate methyltransferase Trmu H2A histone family, member Y H2afy syntrophin , basic 2 Sntb2 GNAS (guanine nucleotide binding protein , alpha stimulating) complex locus Gnas suppressor of cytokine signaling 3 Socs3 Sdc4 syndecan 4 Irg1 immunoresponsive gene 1 Stra6 stimulated by retinoic acid gene 6 Ppargc1a peroxisome prol iferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha small chemokine (C-C motif) ligand 11 Ccl11 2'-5' oligoadenylate synthetase-like 1 Oasl1 *Negative values represent downregulated genes. P value (ko/wt) Fold change (ko/wt)* 1,OOE-07 1,26E-06 2,48E-06 6,82E-06 2,20E-05 0,000118 0,000137 0,000812 0,00094 0,001065 0,001339 0,002721 0,005583 1,4370 1,3256 1,4244 1,1921 1,7713 -1,2945 1,8131 1,6252 1,4114 1,6871 1,6551 1,4166 -1 ,6155 68 Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions a b 50 • GPR84-WT _GPR84-WT CI) en o GPR84-KO en 40 C) c 200 '0 o GPR84-KO fi) ~ (.) 150 II 'C: ë 30 c: CI) ~ 100 't- o CI) G; 20 oC E fi) z= 10 Qi oC 50 E ~ z o 1H 3H 6H 12H 24H 36H 48H o 1H 3H 6H 12H 24H 36H 48H Figure 1, Effect of LPS on the behavior of GPR84 WT and GPR84 KO mice, 15 mice per group were injected with LPS and were observed at differents time point like described in Materials and Methods. a-b, No difference in rearing and locomotor activity was observed between GPR84 WT and KO mice at any time point. Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions wt ka 6h ka wt 24h 6h 24h 69 6h 24h Figure 2. Gene expression in GPR84 knockout and wild-type mice stimulated with LPS. 10 mice per group were treated with LPS or saline and killed 6 or 24 hours later. Total RNA extracted from their brain was analysed by quantitative peR. Q, GPR84 control analysis showed the quality of the samples used. c-o, no significant difference were observed between GPR84 -/- and GPR84+/+ mice. 70 Chapitre 3: GPR84 function in neuroinflammatory conditions a 5 b - Gpr84 wt -Gpr84 ko 4,5 4 80 3,5 Q) 0 0 (ij 3 > .:; ~ 2,5 ~ rn :~ 60 (fJ ~ 2 Ü 10 40 1,5 20 1 0,5 0 0 0 5 10 15 20 25 Days post-immunization 30 35 0 5 10 15 20 25 30 Days post-immunization 35 40 Figure 3. Influence of GPR84 during EAE. Three pooled experiences of fifthteen animais per groups of normal (square, GPR84 +/+) and knockout mice (cercle, GPR84 -/-) were immunized w ith MOG35-55 peptide as described in Materials and Methods. Mice were monitored daily for clinical signs of EAE. The differences in clinica l scores are not statistically significant. b, Probability of survival of Gpr84 knockout and wi ld-type mice showing no significant difference between t he two groups. Q, Chapitre 3: GPR84 fu nction in neuroinflammatory conditions a 71 b 125 Q) ,5 10 Qi 100 en ca 80 .c ~ 0 75 ro 60 ~ - ~ .~ .r:. en 'Qi 50 ~ 25 è: ~ "al ::l U) -+- Gpr84 WT ~Gpr84 Gpr84 KOGp r84 WT- 40 cf? KO 20 0 0 0 4 5 6 8 9 10 11 Days post-infection 12 13 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Days post-infection Figure 4. Effect of GPR84 during experimenta l herpes simplex virus encephalitis, Body weight curves of herpes simplex virus (HSV)-l-infected GPR84 knockout and wild-type mice. Eight mice per group were inoculated with HSV-l (5 X 105 pfu in 20 uL of MEM). Mice were monitored daily for signs of sickness and weighted during twelve days starting at day 4. No significant difference was observed between the two groups. b, Probability of survival of Gpr84 knockout mice and wild-type controls showing no intergroup difference. Q, CHAPITRE 4 4. CONCLUSION L' activité des macrophages dans la réponse immunitaire fait aujourd'hui l' objet de plusieurs travaux de recherche. Comme ces cellules peuvent être à la fois bénéfiques et néfastes, la connaissance de leur régulation permettrait d' importantes avancées thérapeutiques. Le récepteur GPR84 étant fortement exprimé par les microglies durant l' inflammation causé par un traitement à la cuprizone (Bedard, Tremblay et al. 2007) et à la LPS (Bouchard, Page et al. 2007), nous nous sommes interressés à sa régulation et à sa fonction dans différents modèles pour lesquels une forte inflammation au cerveau est induite. Notre objectif premier était de démontrer l' inductibilité du GPR84 sous l' influence de la réponse immunitaire induite durant l'endotoxinémie et l'EAE. Notre second objectif était de définir la fonction de ce récepteur durant la réponse inflammatoire. Pour ce faire, nous avons réalisé des analyses de survie faites en utilisant des souris déficientes en GPR84. Différents modèles d' inflammation ont été étudiés soit, l' endotoxinémie, l' EAE et l'encéphalite induite par le HSV -1. Dans le chapitre 2, il a été démontré que l'expression de GPR84 par la microglie était inductible durant l' endotoxinémie. Ces résultats, ainsi que ceux montrant l'inductibilité de GPR84 par le TNF et autres cytokines pro-inflammatoires (IL-l , PGE2) nous ont poussé à nous questionner sur la fonction de GPR84 durant d'endotoxinémie. Les effets comportementaux de la LPS chez les souris se traduisent par une diminution de l'exploration, une diminution des mouvements et une perte de poids (Hart 1988). Nous avons étudié le rôle de GPR84 sur ces comportements à l'aide d'un modèle de labyrinthe (T-maze). Nos résultats n'ont révélé aucun impact du GPR84 au niveau comportemental. Par contre, durant l' endotoxinémie, le réseau complexe de l'expression des cytokines présente plusieurs interactions entre les signaux qui pourraient cacher le rôle du GPR84 sur le comportement. Il serait alors possible que le GPR84 ait un impact à l'échelle moléculaire non détectable par les critères comportementaux que nous avons évalués. C'est pourquoi Chapitre 4: Conclusion 73 nous avons étudié la fonction de ce récepteur sur l'expression différentielle des gènes. Les techniques très sensibles de micropuces à ADN et du RT-PCR ont montré que le GPR84 n'induit pas de changement transcriptionnel majeur. Par contre, ces analyses ont été réalisées sur des ARNs de cerveaux totaux, ils est alors plus difficile d' observer de petites variations concernant la sous-population des macrophages. Afin d' obtenir des résultats d' une plus grande spécificité, il aurait été intéressant d'analyser l'impact du GPR84 sur le transcriptome des macrophages uniquement, par exemple en culture cellulaire. Venkataraman et Kuo (2005) ont démontré qu'en l' absence de GPR84, les cellules T activées augmenteraient leur expression d' IL-4 mais pas d'IL-2 et d'IFN-y dirigeant ces cellules vers le phénotype Th2, reconnu comme ayant une activité anti-inflammatoire. Dans le chapitre 2, nous avons démontré que, durant l'EAE, le GPR84 est exprimé de façon directement proportionnelle à la sévérité de la maladie. Il serait donc possible que le GPR84 dans l' EAE ait une activité pro-inflammatoire influençant le développement de la maladie. Cependant, nous n' avons observé (chapitre 3) aucune influence du récepteur sur l'initiation, la survie ou la sévérité de l'EAE. Il serait, par contre, intéressant de vérifier la présence des différents sous-ensembles de cellules T chez les souris GPR84 sauvages et déficientes durant la maladie. L'immunisation active a été utilisée afin d' induire la maladie. Ce modèle implique l'induction d' une réponse immunitaire complète, débutant par une forte réaction inflammatoire se développant de façon chronique. On ne peut donc pas exclure la possibilité que le GPR84 joue un rôle dans le processus de remyélinisation. Ainsi, il serait intéressant d'étudier la fonction du GPR84 durant la phase de remyélinisation, en utilisant un modèle récidivant-remittent plutôt qu'un modèle chronique. L' encéphalite induite par l'herpes simplex virus de type 1 (HSV -1) implique de près la réponse immunitaire innée. En effet, les microglies sont les premiers défenseurs lors d'une attaque virale au cerveau (Sergerie, Rivest et al. 2007). Sergerie, Rivest et Boivin (2007) ont démontré que le TNF-a ainsi que l'IL-1~ sont nécessaires afin de monter une réponse immunitaire adéquate contre le HSV -1. Les souris déficientes en l'une de ces cytokines ou les deux ont une durée de vie inférieure aux souris sauvages. Au chapitre 2, nous avons démontré que le TNF et l'IL-l ont la capacité d'induire l'expression du GPR84 chez les micoglies in vitro. Nous avons donc voulu vérifier si le GPR84 avait un rôle Chapitre 4: Conclusion 74 protecteur dans la réponse immunitaire de l' encéphalite induite par le HSV-l. Nos résultats n ' ont révélé aucun impact significatif de l' absence du GPR84 sur la survie des souris, indiquant que ce récepteur n ' est pas essentiel à l' élimination du virus. Il est possible que ce récepteur, quoiqu' exprimé durant l'endotoxinémie et l'EAE, ne le soit pas durant l' encéphalite induite pas le HSV -1. Bien que cela serait surprenant, des hybridations in situ réalisées sur le tissus cérébral nous permettraient de vérifier le patron d' expression du GPR84 dans le cerveau durant l' encéphalite induite par le HSV -1. Dans l' ensemble, nos résultats nous permettent de tirer la conclusion que le GPR84 est un récepteur dont l' expression est induite non spécifiquement dans la plupart des maladies neuroinflammatoires tel que vu précédemment dans les modèles d' inflammation induite par la cuprizone, par la LPS et durant l'EAE (Bouchard, Page et al. 2007). Cependant, ce récepteur n' a pas nécessairement un rôle actif dans chacune de ces conditions et ceci est probablement dû à la présence ou non du ligand. Une étude, récemment réalisée, a permis d'identifier les chaines d'acides gras de longueur moyenne, entre 9 et 14 carbones, comme étant des ligands du GPR84 (Wang, Wu et al. 2006). Par contre, comme ces acides gras sont des lipides de types alimentaires et qu'ils activent le GPR84 qu' en concentrations supérieures à ce que l' on retrouve naturellement, ceci suggère qu' ils ne sont probablement pas des ligands naturels du GPR84. Ainsi, comme le ligand endogène du GPR84 est toujours inconnu, il est alors difficile d' identifier le rôle de ce récepteur. La fonction du GPR84 reste à être déterminée et pour ce faire, d'autres modèles devront être testés dans le futur. À cet effet, des résultats récemment obtenus dans le laboratoire après mon départ ont permis d'identifier un rôle du GPR84 dans la maladie d'Alzheimer. Il a été observé, chez des souris APP (protéine précurseur amyloïde) déficientes en GPR84, que les symtômes se développent plus rapidement et sont plus graves et ce, jusqu'au 12e mois de vie. De plus, une diminution du nombre de cellules microgliales dans le cortex cérébral a été observé chez ces souris, ce qui indique que le récepteur GPR84 aurait probablement un effet chimioattractant sur ces cellules et que son ligand serait présent dans le modèle d'Alzheimer. Ceci reste à confirmer dans le futur. 75 Références Bibliographiques Accolla, R. S. (2006). "Host defense mechanisms against pathogens." Surg Infect (Larchmt) 7 Suppl 2: S5-7. Allan, S. M. and N. 1. Rothwell (2001). "Cytokines and acute neurodegeneration." Nat Rev Neurosci 2(10): 734-44. Aloisi, F. (2001 ). "Immune function of microglia." Glia 36(2): 165-79. Ballesteros, J. and K. Palczewski (2001 ). "G protein-coupled receptor drug discovery: implications from the crystal structure of rhodopsin. " Curr ODin Drug Discov Devel 4(5): 561-74. Barton, P. A. and J. S. Warren (1993). "Complement component C5 modulates the systemic tumor necrosis factor response in murine endotoxic shock." Infect Immun 61(4): 1474-81. 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