stimulation de l`immunité innée pulmonaire avec

CLAUDIA MATHIEU
STIMULATION DE L’IMMUNITÉ INNÉE
PULMONAIRE AVEC DES NANOPARTICULES
DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DE LA PAPAYE
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)
MICROBIOLOGIE-IMMUNOLOGIE
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2012
© Claudia Mathieu, 2012
ii
Résumé
La stimulation de la réponse immunitaire dans les poumons est d’intérêt majeur pour
la prévention des infections respiratoires. Nous avons démontré précédemment que
les nanoparticules du virus de la mosaïque papaye (PapMV) augmentent les réponses
immunitaires spécifiques contre des antigènes et induisent une activation systémique
de l’immunité innée. Dans cette étude, l’accumulation d’IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α,
MIP-1β,
MIP-2,
IL-9
et
IP-10
et
le
recrutement
de
neutrophiles,
de
monocytes/macrophages et de lymphocytes dans les poumons de souris a permis de
démontrer la capacité des nanoparticules du PapMV à stimuler l'immunité innée
pulmonaire. De plus, cette stimulation est suffisante pour protéger des souris contre
une infection létale au virus influenza en absence d’antigènes spécifiques du virus.
Ces résultats suggèrent que les nanoparticules du PapMV stimulent efficacement
l'immunité innée des muqueuses en établissant un état antimicrobien, et renforcent
leur potentiel comme adjuvant mucosal.
iii
Abstract
Stimulation of immune responses in the lungs is one of the most effective ways to
prevent respiratory infections. We previously demonstrated that papaya mosaic virus
(PapMV) nanoparticles can increase specific immune responses towards antigens and
can induce systemic activation of the innate immunity. In this study, the accumulation
of IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 and IP-10 followed by the
recruitment of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes in the lungs of
mice demonstrated the ability of PapMV nanoparticles to stimulate lung innate
immunity. In addition, this stimulation was sufficient to protect mice against a lethal
influenza virus challenge in the absence of specific antigens. These results suggest
that PapMV nanoparticles efficiently stimulate mucosal innate immunity and
therefore are promising candidates to establish a non-specific antimicrobial state at
mucosal surfaces. Moreover, these data strengthen the potential of PapMV
nanoparticles as a mucosal adjuvant.
iv
Avant-Propos
Ce mémoire contient un article qui sera soumis sous peu pour publication dans un
journal scientifique. Cet article est le produit de mon travail de recherche durant mes
deux années de maîtrise, et ayant dirigé entièrement les projets, j’en suis l’auteure
principale.
J’ai participé à tous les processus de réflexion et de décision quant à l’orientation
qu’a pris le projet durant ma maîtrise. J’ai également rédigé ou modifié l’ensemble
des protocoles utilisés dans les expériences présentées dans ce document. J’ai
effectué toutes les expériences seule, ou avec l’aide précieuse d’Annie Guérin et de
Gervais Rioux. Je remercie également ces derniers pour leurs capacités techniques
irréprochables. Leur aide m’a permis d’obtenir des résultats clairs et concis. Gervais
Rioux,
en
plus
d’avoir
participé
aux
expériences,
a
également
contribué
intellectuellement à l’avancement du projet et a apporté des modifications pertinentes
à l’article ci-joint, et mérite donc le titre de co-auteur de cet article. Le Dr. Denis
Leclerc a supervisé et a participé aux décisions de toutes les expériences de mon
projet de maîtrise et a co-écrit l’article inséré dans ce mémoire.
Un immense merci à Marilène Bolduc et à Marie-Ève Laliberté-Gagné, qui ont
produit, purifié, dosé et assuré la qualité des protéines que j’ai utilisées durant mes
expériences.
Un merci tout spécial à Marie-Christine Dumas pour ses conseils, à Nathalie Majeau
pour son regard critique ainsi qu’à Audrey Filion et à Cindy Babin pour leur aide et
leur patience.
Je tiens à remercier mon directeur Denis Leclerc pour sa supervision, pour la
confiance dont il a fait preuve envers moi et pour m’avoir permis de réaliser mon
projet de maîtrise dans son laboratoire.
v
Au Dr F. Mambé
vi
Table des matières
RÉSUMÉ ..................................................................................................................................................................... II
ABSTRACT................................................................................................................................................................. III
AVANT-PROPOS ..................................................................................................................................................... IV
TABLE DES MATIÈRES............................................................................................................................................ VI
LISTE DES FIGURES................................................................................................................................................ VII
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ...............................................................................................................................1
1. LE SYSTÈME IMMUNITAIRE INNÉE ..........................................................................................................................1
1.1. Les récepteurs.........................................................................................................................................1
1.1.1. Les TLRs ............................................................................................................................................. 1
1.1.2. Les NLR .............................................................................................................................................. 2
1.1.3. Les hélicases ...................................................................................................................................... 3
1.1.4. Les lectines ........................................................................................................................................ 4
1.2. Le complément .......................................................................................................................................6
1.3. Les cytokin es ...........................................................................................................................................8
1.4. Les cellules...............................................................................................................................................8
1.4.1. Les ma crophages ............................................................................................................................... 8
1.4.2. Les granulocytes ................................................................................................................................ 9
1.4.3. Les cellules dendri tiques ................................................................................................................. 10
1.4.4. Les cellules NK ................................................................................................................................. 10
1.5. L’immunité innée de la muqueuse respira toire ............................................................................. 10
1.5.1. L’épi thélium respi ratoi re................................................................................................................. 10
1.5.1.1. Les récepteurs ........................................................................................................................ 10
1.5.1.2. Les molécules antimicrobiennes ........................................................................................... 11
1.5.1.3. Les dérivés réactifs de l’oxygène ........................................................................................... 12
1.5.1.4. Les cytokines .......................................................................................................................... 12
1.5.2. Les cellules....................................................................................................................................... 13
2. LA PROTECTION ANTIMICROBIENNE NON-SPÉCIFIQUE .......................................................................................... 15
2.1. Histo rique ............................................................................................................................................. 15
2.2. La résistance pulmonaire innée........................................................................................................ 15
3. LES NANOPARTICULES DU PAPMV ..................................................................................................................... 17
CHAPITRE 2 : LA STIMULATION DE L’IMMUNITÉ INNÉE DES POUMONS AVEC DES NANOPARTICULES
DU PAPMV GÉNÈRE UNE PROTECTION CONTRE UNE INFECTION LÉTALE AVEC LE VIRUS DE
L’INFLUEN ZA EN SOURIS ..................................................................................................................................... 19
RÉSUMÉ ................................................................................................................................................................ 19
ABSTRACT ............................................................................................................................................................. 21
I NTRODUCTION...................................................................................................................................................... 22
MATERIALS AND METHODS.................................................................................................................................... 24
RESULTS................................................................................................................................................................ 27
DISCUSSION .......................................................................................................................................................... 31
ACKNOWLEDGMENT .............................................................................................................................................. 35
REFERENCES .......................................................................................................................................................... 36
FIGURE LEGENDS ................................................................................................................................................... 39
TITLES OF SUPPLEMENTARY MATERIAL .................................................................................................................... 42
CHAPITRE 3 : DISCUSSION................................................................................................................................... 57
CHAPITRE 4 : CONCLUSION ................................................................................................................................. 61
BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................................................... 62
vii
Liste des figures
Figures :
Figure 1-1 : La cascade de signalisation des TLRs ...............................................................................................2
Figure 1-2 : Voie d’activation des NLRs et de l’inflammasome........................................................................3
Figure 1-3 : Le mécanisme d’activation des hélicases RIG-I et MDA5 ............................................................4
Figure 1-4 : Le rôle des lectines dans les APCs....................................................................................................6
Figure 1-5 : Les voies d’activation du complément............................................................................................7
Figure 1-6 : Les mécanismes de défense de l’épithélium respiratoire ........................................................ 13
Figure 2-1. PapMV nanoparticles induce early lung cytokines and chemokine secretion in the lungs. 43
Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are secreted in the lungs upon stimulation
with PapMV nanoparticles........................................................................................................................ 44
Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine secretion in the lungs. ... 45
Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in the lungs. .................. 46
Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to an influenza lethal challenge.
....................................................................................................................................................................... 47
Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dose-dependent manner with one
treatment of PapMV nanoparticles. ....................................................................................................... 48
Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is critical for protection to
influenza A infection. ................................................................................................................................. 49
Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term protection to an influenza
infection. ...................................................................................................................................................... 50
Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated and permit to extend
the protection period to influenza infection. ........................................................................................ 51
Figure 3-1 : Les nanoparticules du PapMV comme adjuvant mucosal........................................................ 59
Figures supplémentaires :
Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during a
lethal influenza challenge. ........................................................................................................................ 52
Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no
mortality during an influenza challenge................................................................................................. 53
Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days significantly showed A)
lower symptoms and B) complete survival during a lethal influenza challenge. ............................ 54
Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle stimulation show A, C) no
symptom and B, D) complete survival during a lethal influenza challenge. .................................... 55
Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low symptoms and B) no
mortality during a lethal influenza challenge. ....................................................................................... 56
1
Chapitre 1 : Introduction
1. Le système immunitaire innée
Le système immunitaire inné constitue la première ligne de défense contre l’invasion
de pathogènes. La réponse générée par une stimulation de l’immunité innée est rapide
et non-spécifique et est coordonnée par un ensemble de cellules immunes et non
immunes,
de molécules de communication et de récepteurs. L’activation de
l’immunité innée est déclenchée par la reconnaissance de motifs conservés sur les
pathogènes appelés PAMPs, pour «Pathogen-associated molecular patterns». Ces
PAMPs sont reconnus par les cellules immunitaires via des «Pattern recognition
receptors» (PRR), et vont induire une cascade de signalisation qui va conduire à la
production de médiateurs moléculaires. Ces protéines sont des cytokines et des
chimiokines qui vont agir sur le recrutement et l’état d’activation d’autres cellules, et
sont donc responsables de la réaction inflammatoire. Ainsi, les défenses seront
augmentées au site de pénétration du pathogène pour éviter sa dissémination. Par la
suite, le système immunitaire innée va présenter des antigènes du pathogène au
système immunitaire adaptatif, qui va produire une réponse spécifique et de longue
durée contre ce pathogène.
1.1. Les récepteurs
1.1.1. Les TLRs
Les «Toll-like receptors» (TLR) sont une famille de PRRs qui est impliquée dans la
reconnaissance de nombreux motifs présents sur les bactéries, virus, mycètes et
parasites, et sont exprimés autant sur les cellules immunes que sur les cellules non
immunes à des niveaux variables. Ces récepteurs sont très conservés chez les
vertébrés et les invertébrés. Jusqu’à ce jour, 10 et 12 TLR fonctionnels ont été
identifiés chez l’humain et la souris respectivement (Kawai and Akira, 2011). Après
liaison avec son ligand, le récepteur induit une cascade de signalisation conduisant à
la production de cytokines et de molécules pro-inflammatoires (Figure 1-1). Les virus
étant
des
parasites
obligatoires,
ils
nécessitent
l’utilisation
des composantes
cellulaires pour se répliquer, impliquant qu’ils exposent leur matériel génétique aux
2
défenses cellulaires. Les récepteurs de l’immunité innée qui reconnaissent les acides
nucléiques viraux sont localisés dans le cytoplasme ou dans des endosomes, ce qui
évite leur interaction avec des acides nucléiques cellulaires du soi (Kawai and Akira,
2011). Parmi les membres de la famille des TLRs, le TLR-3 reconnait principalement
l’ARN double brin et les TLR-7 et TLR-8, l’ARN simple brin (Heil et al., 2004).
Figure 1-1 : La cascade de signalisation des TLRs
Suite à la reconnaissance d’un PAMP, les TLRs subissent des changements
conformationnels qui induisent leur dimérisation et le recrutement de protéines
adaptatrices telles que MyD88, TIRAP et TRIF. Selon le type cellulaire, la cascade de
signalisation engendrée par l’interaction TLR-PAMP va entraîner la sécrétion
d’interféron de type I ou de cytokines pro-inflammatoires. (Kawai and Akira, 2011)
1.1.2. Les NLR
Les «NOD-like receptors» (NLR) font également parti des PRR et sont retrouvés
exclusivement dans des compartiments intracellulaires. Le plus récent modèle
propose que l’interaction d’un NRL avec le PAMP qu’il reconnait provoque un
3
changement conformationnel du récepteur, ce qui induit le recrutement de caspases.
L’activation des caspases est contrôlée par l’association de NLRs, qui forment de
larges complexes protéiques appelés «inflammasomes» dont la composition varie
selon le PAMP reconnu (Kanneganti, 2010). Les caspases sont des protéases
responsables du clivage et de l’activation de cytokines pro-inflammatoires telles que
l’IL-1β et l’IL-18 (Figure 1-2). Elles activent également des facteurs qui affectent la
balance apoptotique et jouent un rôle dans l’activation de l’autophagie.
Figure 1-2 : Voie d’activation des NLRs et de l’inflammasome
L’interaction des NLRs avec des acides nucléiques viraux induit le recrutement et
l’activation de caspases par la formation de complexes protéiques nommés
«inflammasomes». Les caspases effectrices vont cliver les précurseurs de l’IL-1β et
de l’IL-18 pour produire des cytokines pro-inflammatoires actives. (Kanneganti,
2010)
1.1.3. Les hélicases
Un autre mécanisme de reconnaissance des virus par les cellules est la présence
d’hélicases dans leur cytoplasme qui reconnaissent les acides nucléiques viraux. Les
hélicases les plus reconnues pour leur rôle dans l’immunité innée sont «Retinoic acidinducible gene 1 protein» (RIG-I) et «melanoma-differentiation-associated gene 5»
4
(MDA5). La stimulation de RIG-I et de MDA5 induit la sécrétion d’interféron bêta
(IFN-β), d’interféron alpha (IFN-α), d’IL-6 et d’IL-12 in vivo (Kato et al., 2006;
Yoneyama et al., 2004). Les voies de signalisation induites par les hélicases sont
dépendantes de la structure de l’acide nucléique reconnu, c’est-à-dire que les deux
hélicases peuvent différencier l’ARN et l’ADN des virus ainsi que les acides
nucléiques cellulaires (Jiang et al., 2011).
Figure 1-3 : Le mécanisme d’activation des hélicases RIG-I et MDA5
Lors de la reconnaissance d’acides nucléiques viraux, la conformation de RIG-I et de
MDA5 est modifiée pour favoriser l’interaction avec la protéine adaptatrice IPS-1.
Cette interaction permet la transmission du signal jusqu’au noyau par des complexes
de protéines kinases, où l’activation d’NFκB va conduire à la production d’IFN-β et
d’autres cytokines antivirales. (Bruns and Horvath, 2012)
1.1.4. Les lectines
Les lectines sont des protéines qui font partie d’une grande famille de récepteurs
sécrétés ou membranaires qui reconnaissent des patrons de glycosylation. Plusieurs
de ces récepteurs participent à l’immunité innée en reconnaissant spécifiquement des
5
structures de glycans sur des protéines et des lipides exprimés par des pathogènes
(Figure 1-4). Les lectines de type C favorisent la présentation antigénique lorsqu’elles
sont stimulées par leurs ligands (Geijtenbeek et al., 2004). Leur expression et leur
fonction sont régulés aux sites d’inflammation (van Kooyk and Rabinovich, 2008).
Ces récepteurs sont principalement exprimés à la surface des macrophages et des
cellules dendritiques, bien que la Dectin-1 soit exprimée également sur les cellules
NK, les neutrophiles, les éosinophiles, les monocytes et certaines sous-populations de
lymphocytes T (Brown, 2006). Le DC-SIGN, une lectine de type C, joue également
un rôle important dans la réponse immunitaire puisqu’il reconnait et est la cible de
plusieurs pathogènes. La cascade de signalisation de certains TLRs est influencée par
l’activation du DC-SIGN (Geijtenbeek et al., 2003). Mycobacterium tuberculosis, le
VIH et Candida albicans ciblent tous le DC-SIGN pour affecter la réponse
immunitaire des cellules dendritiques et assurer leur survie (Geijtenbeek et al., 2003).
Les «mannose-bindind lectins» (MBL) ou «lectines liant le mannose» sont des
lectines de type-C qui participent à la voie du complément, une autre composante
majeure du système immunitaire innée (Fujita, 2002).
6
Figure 1-4 : Le rôle des lectines dans les APCs.
La reconnaissance par les lectines de motifs formés de glycans à la surface des
pathogènes conduit à l’activation et la maturation des cellules présentatrices
d’antigènes (APCs), à la production de cytokines, et à l’augmentation de leur capacité
à présenter les antigènes. (van Kooyk and Rabinovich, 2008)
1.2. Le complément
La voie du complément participe activement à l’établissement de la réponse
immunitaire innée en stimulant trois principales fonctions biologiques; l’opsonisation
des pathogènes, l’activation et le recrutement de cellules immunes, et l’élimination
directe des pathogènes (Fujita, 2002). La cascade du complément implique plus de
trente protéines membranaires et plasmatiques qui participent à une chaine de
réactions de clivage et d’assemblage de complexes qui va aboutir à la conversion de
la protéine C3 en deux fragments effecteurs (Figure 1-5). La protéine C3 possède une
activité opsonisante intrinsèque. Le fragment de plus grande taille de la protéine C3,
le C3b, peut s’associer à la protéine C5 et conduire à la formation du complexe
d’attaque dirigeant la lyse du pathogène.
Le petit fragment C3a est une
7
anaphylatoxine qui entraîne la libération des granules antimicrobiennes contenues
dans le cytoplasme des cellules endothéliales, des mastocytes et des cellules
phagocytaires. Il est également responsable de l’activation et du recrutement de
cellules immunes (Walport, 2001). Bien que la cascade du complément implique des
protéines plasmatiques, des fragments effecteurs du complément peuvent être
retrouvés dans la muqueuse respiratoire humaine et murine (Bolger et al., 2007).
Figure 1-5 : Les voies d’activation du complément
Il y a trois voies d’activation du complément; la voie classique, la voie des lectines et
la voie alternative. La voie classique est activée suite à des interactions anticorps –
antigènes, la voie des lectines implique la reconnaissance de patrons de glycosylation
sur des pathogènes par des lectines, et la voie alternative est induite lorsque des
composantes du complément se fixent directement sur certains antigènes microbiens.
(Fujita, 2002)
8
1.3. Les cytokines
La reconnaissance de PAMPs par les PRRs induit une cascade de signalisation qui
aboutit à la production et à la sécrétion de médiateurs inflammatoires appelés
cytokines. Les chimiokines sont une famille de cytokines dont la sécrétion induit la
migration de cellules immunes du sang vers le site d’infection, permettant ainsi de
localiser la réponse immunitaire contre le pathogène. Selon la nature des cytokines,
l’interaction avec leurs récepteurs peut affecter le comportement de la cellule
productrice autant que celui des cellules adjacentes. Leur rôle est primordial dans
l’harmonisation et le contrôle de la réponse immunitaire innée, puisqu’une déplétion
in vivo de différentes cytokines produit une réponse immunitaire aberrante ou
affaiblie en réponse à une infection (Wack et al., 2011). Les cytokines sont
regroupées en plusieurs familles, selon qu’elles ont un rôle plutôt pro-inflammatoire,
antiviral ou qu’elles soient impliquées dans la réponse immunitaire innée ou
adaptative. La plupart des virus ont évolué pour contrer l’effet des cytokines en
incorporant dans leur génome des gènes qui codent pour des récepteurs solubles de
cytokines (Alcamí and Smith, 1995) ou qui interfèrent avec la signalisation induite
par les cytokines (Bahar et al., 2011).
1.4. Les cellules
Les cellules non immunes expriment différentes combinaisons de récepteurs immuns
et participent donc à l’établissement de la réponse immunitaire innée. Cependant, ce
sont principalement les cellules de lignée myéloïde qui sont spécialisées dans
l’orchestration de la réponse immunitaire. Les lymphocytes sont surtout spécialisés
dans la réponse immunitaire adaptative, bien que les cellules NK soient impliquées
dans la réponse immunitaire innée. Les lymphocytes B sont responsables de la
production d’anticorps spécifiques aux pathogènes, et les lymphocytes T vont d’une
part reconnaître et éliminer les cellules infectées, et d’autre part assister les
lymphocytes B.
1.4.1. Les macrophages
Les macrophages sont des cellules résidant dans presque tous les tissus et constituent
la forme mature des monocytes, qui circulent dans le sang et se différentient lors de
9
leur migration dans un tissu (Janeway et al., 2008). Les macrophages participent à
plusieurs niveaux de la réponse immunitaire innée, d’abord par leur capacité à
reconnaître et phagocyter les pathogènes, puis par l’orchestration de la réaction
inflammatoire en sécrétant des cytokines et des chimiokines. Les pathogènes
pénètrent souvent l’organisme par les muqueuses, et les macrophages qui tapissent
ces surfaces sont parmi les premières cellules à réagir (Miyata and van Eeden, 2011).
Leur principal rôle est de contrôler la réponse inflammatoire face aux nombreux
agresseurs qui tapissent les voies respiratoires.
1.4.2. Les granulocytes
Les granulocytes sont une famille de cellules comptant trois sous-types; les
éosinophiles,
les
basophiles
et
les
neutrophiles.
Ces
cellules
partagent
la
caractéristique de posséder des granules dans leur cytoplasme, et se distinguent par la
capacité de ces granules à retenir des colorants neutres, basiques ou à base d’éosine.
Le rôle des éosinophiles et des basophiles dans la protection contre les pathogènes
demeure encore nébuleux. Les éosinophiles s’accumulent dans les tissus et libèrent
des protéines cationiques et des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) lors d’infections
parasitaires (Williams, 2004), mais sont surtout associés à des formes sévères
d’asthme en Amérique du Nord (Wenzel, 2006). Les basophiles quant à eux ont été
identifiés comme responsables du développement de l’inflammation dans certains
types d’allergies chroniques (Mukai et al., 2005). D’autre part, les neutrophiles sont
reconnus pour leurs nombreuses fonctions effectrices lors d’infections et leur
contribution dans l’élimination de pathogènes.
Dès le début d’une invasion
microbienne, les macrophages et plusieurs cellules tissulaires vont sécréter des
chimiokines pour recruter une grande quantité de neutrophiles au site d’infection.
Suivant ce gradient chimiotactique, les neutrophiles vont migrer à partir du sang pour
aller phagocyter les pathogènes. Le processus de phagocytose enclenche ensuite la
libération de granules qui contiennent des peptides antimicrobiens, des enzymes
protéolytiques et des ROS (Segel et al., 2011).
10
1.4.3. Les cellules dendritiques
Les cellules dendritiques font partis des phagocytes professionnels avec les
granulocytes
et
les
macrophages.
Les
cellules
dendritiques
échantillonnent
constamment l’environnement par le processus de phagocytose. Leur rôle premier
n’est pas l’élimination des pathogènes mais plutôt la présentation d’antigènes. En
effet, les cellules dendritiques sont responsables du passage de la réponse
immunitaire innée vers une réponse adaptative caractérisée par une protection
spécifique de longue durée. Elles expriment un large répertoire de PRRs dont
l’activation initie une cascade de signalisation conduisant à la maturation de la cellule
et à l’activation du l’immunité adaptative (Huang et al., 2012).
1.4.4. Les cellules NK
Les «Natural Killer» (NK) sont les seules cellules de la lignée lymphoïde à être
considérées comme des effecteurs de l’immunité innée. Elles se distinguent par leur
capacité à reconnaître et à éliminer les cellules de l’hôte qui sont infectées, sans
toutefois détruire les cellules saines (Karlhofer et al., 1992). Elles ne sont pas des
phagocytes mais vont plutôt détruire les pathogènes via la libération de granules
cytotoxiques capable d’induire l’apoptose des cellules infectées, de la même façon
que le font les lymphocytes T cytotoxiques (Wang et al., 2012). Les cellules NK sont
rapidement activées en réponse aux interferons et aux cytokines produites par les
macrophages et vont à leur tour sécréter d’autres cytokines dans le but de contenir
l’infection jusqu’à l’apparition d’une réponse immunitaire spécifique (Janeway et al.,
2008).
1.5. L’immunité innée de la muqueuse respiratoire
1.5.1. L’épithélium respiratoire
Les
cellules
épithéliales
pulmonaires
sont
constamment
en
contact
avec
l’environnement extérieur; elles participent donc activement à la réponse immunitaire
innée par la sécrétion de molécules antimicrobiennes et de cytokines et par leur
interaction directe avec des cellules immunes (Figure 1-6).
1.5.1.1. Les récepteurs
11
Les pathogènes ayant franchi la barrière de mucus et le glycocalyx recouvrant
l’épithélium respiratoire atteignent le côté apical des cellules épithéliales, ou
réussissent à pénétrer le cytosol en traversant les membranes. Pour réagir contre les
pathogènes, les cellules épithéliales expriment les TLRs 1 à 9 en surface ou à
l’intérieur d’endosomes, chaque TLR reconnaissant spécifiquement des composants
bactériens, viraux ou fongiques. Les récepteurs NOD et les hélicases RIG-I et MDA5,
également
retrouvés
principalement
le
dans
le
cytosol des
peptidoglycan
bactérien
cellules
et
les
épithéliales,
acides
reconnaissent
nucléiques
viraux,
respectivement (Shaw et al., 2008).
1.5.1.2. Les molécules antimicrobiennes
Les cellules épithéliales produisent des glycoprotéines membranaires appelées
mucines qui forment, avec d’autres glycoprotéines et glycolipides, le glycocalyx. Les
mucines sont le principal constituant du mucus qui recouvre la muqueuse respiratoire.
En plus d’adhérer aux microorganismes, ces mucines peuvent avoir un effet
antimicrobien direct ou transporter d’autres molécules antimicrobiennes (Linden et
al., 2008). Les petits peptides cationiques tels que les cathélicidines et les défensines–
β sont des molécules antimicrobiennes également sécrétées en grande quantité par les
cellules épithéliales pour protéger la muqueuse. Ces peptides exercent un effet
antimicrobien direct contre les bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram négatif,
les mycètes et les pathogènes viraux (Schutte and McCray, 2002). La sécrétion de
cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines par les leucocytes locaux est
augmentée par les peptides antimicrobiens, ce qui leur confère une capacité
chimiotactique indirecte (Lai and Gallo, 2009). Les cellules épithéliales sécrètent de
plus grosses protéines antimicrobiennes qui participent à la destruction des
pathogènes. Parmi elles, le lysozyme hydrolyse le peptidoglycan, entrainant la lyse
des bactéries à Gram négatif. La lactoferrine, elle, séquestrerait le fer et diminuerait
sa disponibilité pour les pathogènes, en plus d’exercer un effet bactéricide direct
(Evans et al., 2010b) et une activité antivirale contre les virus à ARN et à ADN
(Vareille et al., 2011). Tel que mentionné précédemment (section 1.1.4), les
collectines sont des PRRs qui reconnaissent des patrons de glycosylation sur les
pathogènes.
L’épithélium
respiratoire,
en
plus
d’exprimer
des
collectines
12
membranaires, sécrètent des collectines solubles dont les membres les plus étudiés
sont SP-A et SP-D (Surfactant Protein A et D). La liaison de SP-A ou SP-D aux
pathogènes engendre leur opsonisation et leur neutralisation par agglutination, et
modulent les réponses immunitaires des cellules dendritiques et des lymphocytes T
(Evans et al., 2010a). La combinaison dans le poumon de ces molécules
antimicrobiennes génère des effets synergiques sur la destruction des pathogènes,
même lorsqu’elles se trouvent en concentration non-inhibitrice (Singh et al., 2000).
1.5.1.3. Les dérivés réactifs de l’oxygène
En réponse aux infections ou suivant une stimulation thérapeutique, les cellules
épithéliales génèrent des dérivés réactifs de l’oxygène à des concentrations
bactéricides (Gerson et al., 2000). Trois enzymes constitutives et inductibles
exprimées par les cellules épithéliales, les oxyde nitrique synthétases (NOS), sont
responsables de la production d’oxyde nitrique (NO) dans le poumon. L’importance
du NO dans la résistance pulmonaire à l’infection est supportée par des expériences
qui démontrent que certains virus se répliquent davantage en l’absence de NOS
(Zheng et al., 2004), et qu’une surexpression de ces enzymes protègent contre des
infections virales (Zheng et al., 2003). L’épithélium respiratoire génère également du
peroxyde d’hydrogène (H2 O2 ), dont les effets bactéricides sont augmentés en
présence de peroxydases, des enzymes aussi produites par les cellules épithéliales
(Wijkstrom-Frei et al., 2003).
1.5.1.4. Les cytokines
L’IFN-α et l’IFN-β sont des molécules antivirales qui jouent un rôle central dans la
réponse innée contre les cellules infectées. Ces cytokines sont sécrétées dans le
poumon par les cellules épithéliales, et suivant l’interaction avec leur récepteur, elles
vont induire l’expression de plusieurs gènes qui codent pour des protéines interférant
spécifiquement avec la réplication virale, la production et le transport de protéines
virales (Samuel, 2001). Le recrutement de cellules immunes est essentiel pour la
résistance du poumon à l’infection et l’épithélium respiratoire produit une grande
variété de chimiokines pour en assurer le maintien. Les cellules épithéliales recrutent
des neutrophiles aux poumons par la production d’IL-8, de CXCL1 et CXCL5, des
13
macrophages par la sécrétion d’IL-1β, de MIP-1α, MCP-1 et TNF-α, et des cellules
NK par la production d’IFNα/β et de MIP-1α (Vareille et al., 2011).
Figure 1-6 : Les mécanismes de défense de l’épithélium respiratoire
Les cellules épithéliales respiratoires modulent les réponses immunitaires en
produisant des substances antimicrobiennes telles que la lactoferrine, les interférons
(IFNs), les β-défensines et l’oxyde nitrique (NO) contenus dans le mucus, et en
sécrétant des cytokines et des chimiokines qui permettent le recrutement et
l’activation de cellules immunes. (Vareille et al., 2011)
1.5.2. Les cellules
Les premières cellules à rencontrer des pathogènes dans la muqueuse respiratoire sont
les cellules épithéliales (section 1.5.1) et les macrophages résidents du poumon
(Kohlmeier and Woodland, 2009). Les macrophages alvéolaires sont équipés de
PRRs pour reconnaitre et réagir contre les pathogènes et ont été identifiés comme
principaux producteurs d’IFN-α dans le poumon durant certaines infections virales
(Kumagai et al., 2007). Les macrophages alvéolaires sécrètent peu de cytokines proinflammatoires et ont une activité phagocytaire faible dans un poumon sain (Holt,
1978). Cependant, en présence de pathogènes, l’activation de ces cellules se traduit
14
par l’augmentation de la phagocytose et la sécrétion abondante d’IL-1β, d’IL-6, de
TNF-α et d’IL-8, qui vont contribuer aux réactions inflammatoires locales et
systémiques (Janeway et al., 2008). Les macrophages activés sécrètent aussi de l’IL12 et de l’IL-10, ce qui conduit à l’activation des cellules NK et à la régulation de la
réponse immunitaire adaptative (Vareille et al., 2011). Les chimiokines sécrétées par
les cellules épithéliales et les macrophages pulmonaires vont induire le recrutement
de monocytes, de neutrophiles et de cellules NK du sang vers le poumon. Suivant la
phagocytose de pathogènes, les neutrophiles et les monocytes différenciés en
macrophages sécrètent des peptides antimicrobiens et produisent de l’oxyde nitrique
(NO), l’anion superoxyde O 2 - et du peroxyde d’hydrogène (H2 O 2 ) toxiques aux
bactéries (Janeway et al., 2008). Les cellules NK recrutées aux poumons vont
produire des cytokines comme l’IFN-γ qui sont importantes dans la réponse antivirale
et dans l’activation indépendante de l’antigène des cellules présentatrices d’antigènes
(Vareille et al., 2011).
15
2. La protection antimicrobienne non-spécifique
2.1. Historique
Depuis le 16e siècle, on reconnait qu’une pré-infection peut avoir un effet sur une
infection subséquente. Ce n’est cependant qu’au début du 20e siècle que des études
ont démontré in vivo que la présence de deux pathogènes engendrait des effets
antagonistes ou synergiques sur la résistance à l’infection. Les études de Shope et
collaborateurs en 1931 ont permis d’établir que le phénotype sévère de grippe porcine
était observable seulement lors d’une colonisation concomitante du virus de la grippe
porcine et de la bactérie Haemophilus influenza, et que ce phénotype n’était pas
reproductible par les pathogènes individuels. Par la suite, des études similaires
utilisant Bacillus anthracis, Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis et Brucella
abortus pour induire une infection primaire et secondaire ont démontrés que les effets
sur le phénotype pathologique étaient influencés par le site physiologique d’infection
et par la voie d’administration des pathogènes (Henderson et al., 1956; Nyka, 1956).
Un peu plus tard, des études se sont concentrées sur l’utilisation de composés
immunostimulants tels que le LPS (Jean et al., 1998; Walmrath et al., 1996), des
extraits bactériens (Adlam et al., 1972; Clark, 1979), des peptides antimicrobiens
(Bals et al., 1999) et des ligands de récepteurs immuns (Krieg et al., 1998) pour
étudier le phénomène de protection antimicrobienne non-spécifique. Cette protection
ne fait pas appel à la reconnaissance d’antigènes spécifiques mais plutôt à celle de
motifs conservés qui induisent une réaction immunitaire rapide, de courte durée et qui
a un effet sur une large population microbienne.
2.2. La résistance pulmonaire innée
Les études de Dickey, Evans et Tuvim ont grandement contribué à éclaircir les
mécanismes d’induction de la résistance innée du poumon. Ils ont démontré que
l’administration d’un lysat d’une souche non typable d’Haemophilus influenza
(NTHi) par aérosol dans la muqueuse respiratoire permettait de protéger des souris
contre un large éventail d’infections respiratoires bactériennes, virales et fongiques
(Evans et al., 2010c; Tuvim et al., 2009). Cette stimulation de l’immunité innée
induisait le recrutement de neutrophiles aux poumons, qui n’étaient cependant pas
16
responsables de la protection non-spécifique puisqu’une déplétion en neutrophiles
précédant le traitement avec le lysat de NTHi n’affectait pas le phénotype de
protection.
Les macrophages résidents avaient également été écartés comme
potentiels responsables de la protection par une expérience de déplétion in vivo
similaire. La suite de ces travaux a révélé qu’immédiatement après stimulation, le
transcriptome de l’épithélium respiratoire était modifié pour augmenter la production
de peptides antimicrobiens, de cytokines, de chimiokines, de récepteurs immuns et de
protéines de signalisation intracellulaire. De plus, la stimulation de plusieurs lignées
de cellules épithéliales murines et humaines par le lysat de NTHi induisaient la lyse
de bactéries in vitro (Evans et al., 2010c). Ces résultats ont permis d’impliquer
l’épithélium respiratoire comme principal moteur de la réponse antimicrobienne
déclenchée par la stimulation de l’immunité innée pulmonaire.
Cependant, d’autres études qui comparait la stimulation de l’immunité innée de trois
dérivés bactériens ont démontré que selon la nature de l’immunostimulant, la réponse
immunitaire innée pouvait passer par différentes voies d’activation et conduire
néanmoins à une protection contre le virus de l’influenza (Abdul-Careem et al.,
2011). Dans cette étude, la protection était associée à l’expression de cytokines et au
recrutement de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes, et il y était suggéré
que la rencontre du virus avec cet environnement renforcé en défenses immunitaires
conduisait à l’élimination rapide du virus. Un autre groupe a démontré que les
macrophages étaient partiellement responsables de la protection contre une infection
virale induite après une stimulation mucosale avec un ligand du TLR-4 (AbdulCareem et al., 2011). Bref, il semble que les effets concertés d’une stimulation de
l’immunité innée par un mélange de ligands de PRRs soient responsables de la
résistance à une infection microbienne subséquente.
17
3. Les nanoparticules du PapMV
Les virus de plantes, en plus d’être non-infectieux chez les mammifères, peuvent être
utilisés pour l’expression d’antigènes tout en conservant leur capacité à stimuler le
système immunitaire (Pogue et al., 2002). La présentation d’antigènes, la sécurité et
la
stimulation
de
l’immunité
sont
des
caractéristiques
recherchées
dans
le
développement de vaccins, et les virus végétaux sont désignés comme d’excellents
candidats comme plateforme vaccinale et comme adjuvant. Le virus de la mosaïque
de la papaye (PapMV) est un virus de plante filamenteux de la famille des Potexvirus
dont la structure est composée de plusieurs centaines de sous-unités de la protéine de
capside enroulées autour du génome viral, un ARN simple brin positif (Sit et al.,
1989).
Le PapMV seul induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires,
l’agrégation des radeaux lipidiques et l’expression de molécules de co-stimulation sur
les cellules dendritiques et les macrophages (Acosta-Ramírez et al., 2008). En
exprimant la protéine de capside du PapMV dans la bactérie E. coli, il est possible de
produire et de purifier des nanoparticules du PapMV. Ces nanoparticules reproduisent
la structure cristalline et répétitive du PapMV tout en étant non-infectieuses
(Tremblay et al., 2006).
Plusieurs études de notre groupe et de collaborateurs ont démontré la capacité de
plateforme vaccinale et les effets d’adjuvant des nanoparticules du PapMV (AcostaRamírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis et al., 2007; Lacasse et al., 2008;
Leclerc et al., 2007; Savard et al., 2011). La capacité des nanoparticules du PapMV à
produire une réponse immunitaire de longue durée a été exploitée afin de produire
des anticorps contre un épitope fusionné du virus de l’hépatite C (HCV) (Denis et al.,
2007). Également, la fusion sur les nanoparticules du PapMV du peptide conservé
M2e dérivé de la protéine M2 du virus de l’influenza a permis d’induire une réponse
humorale protégeant des souris contre une infection létale au virus de l’influenza
(Denis et al., 2008). Il a aussi démontré que la fusion d’un épitope spécifique aux
lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sur les nanoparticules du PapMV engendre une
expansion rapide de CTL spécifiques et conduit à la protection contre une infection à
LCMV (Lacasse et al., 2008). La présentation croisée d’épitopes portés par les
18
nanoparticules du PapMV, via les molécules du CMH de classe I et l’expansion de
lymphocytes T spécifiques à ces antigènes, a permis de désigner les nanoparticules du
PapMV comme potentielle plateforme vaccinale contre les maladies infectieuses
chroniques et les cancers (Leclerc et al., 2007). Des études récentes de notre groupe
ont établi une corrélation entre la stabilité thermique des nanoparticules et leur
potentiel immunologique, établissant de nouveaux critères dans la conception de
vaccins (Rioux et al., 2012).
Les nanoparticules du PapMV peuvent être utilisées dans des préparations vaccinales
comme adjuvant, pour augmenter la réponse immunitaire spécifique contre des
antigènes peu immunogènes contenus dans les vaccins, et élargir l’effet protecteur du
vaccin à plusieurs souches d’un même virus. En effet, l’ajout des nanoparticules du
PapMV au vaccin trivalent contre l’influenza augmente la réponse humorale et
cellulaire
contre
la
protéine
NP
d’influenza,
permettant
d’amplifier
réponse
immunitaire et de protéger contre une souche d’influenza différente de celles
présentes dans le vaccin (Savard et al., 2011). De plus, la réponse en IgG2a contre la
porine OmpC de Salmonella typhi est augmentée en présence des nanoparticules du
PapMV, ce qui conduit à une meilleure protection contre une infection avec ce
pathogène (Acosta-Ramírez et al., 2008).
Puisqu’une réponse adaptative robuste doit d’abord passer par une stimulation
efficace du système immunitaire innée, nous nous sommes intéressés à la stimulation
de l’immunité innée par les nanoparticules du PapMV pour tenter de comprendre sa
capacité d’adjuvant. Les nanoparticules sont reconnues par les cellules immunes et
transportées aux ganglions lymphatiques in vivo et induisent la sécrétion de cytokines
par des splénocytes murins ex vivo. Cependant, la capacité des nanoparticules à
stimuler l’immunité innée dans un tissu comme la muqueuse respiratoire et à établir
un état antimicrobien capable d’induire une protection non spécifique contre des
pathogènes demeurait inconnue jusqu’aux présents travaux.
19
Chapitre 2 : La stimulation de l’immunité innée des
poumons avec des nanoparticules du PapMV génère
une protection contre une infection létale avec le virus
de l’influenza en souris
Résumé
Les nanoparticules du PapMV ont un effet d’adjuvant et peuvent être utilisées pour
améliorer l’efficacité des vaccins saisonniers contre la grippe. Il est probable que les
nanoparticules du PapMV soient reconnues par le système immunitaire comme un
motif moléculaire associé aux pathogènes et que cette reconnaissance favorise
l’amélioration de la réponse immunitaire contre les antigènes du vaccin. Dans cette
étude, nous avons démontré que les nanoparticules du PapMV seules engendrent une
forte réponse immunitaire innée pulmonaire qui conduit à la protection contre une
infection létale du virus influenza. Cette stimulation de l’immunité, en plus d’induire
durant quelques jours le recrutement de neutrophiles, de monocytes/macrophages et
de lymphocytes, induit l’accumulation d’IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2,
IL-9 et IP-10 dans les poumons des souris quelques heures après une instillation avec
les nanoparticules du PapMV. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules du
PapMV stimulent efficacement l’immunité innée pulmonaire et sont donc un
excellent candidat pour établir un état antimicrobien non-spécifique dans la
muqueuse. De plus, ces données renforcent le potentiel des nanoparticules du PapMV
comme adjuvant mucosal.
20
Induction of the innate immune response in the lung
by PapMV nanoparticles leads to protection against
lethal influenza challenge in mice
Claudia MATHIEU, Gervais RIOUX and Denis LECLERC
Department Microbiology Infectiology and Immunology, Infectious disease research
centre, Laval University, 2705 boul. Laurier, Quebec city, PQ, Canada G1V 4G2
Contact: Phone numbers: (418) 654-2705, Fax numbers: (418) 654-2715, E-mail:
[email protected]
21
Abstract
PapMV nanoparticles have an adjuvant activity that can be used to improve seasonal
flu vaccines (Savard et al., 2011). We also demonstrated that PapMV nanoparticles
can be used as a vaccine platform for the induction of a humoral (Denis et al., 2009)
or CTL response (Lacasse et al., 2008, Leclerc et al., 2007) to the epitope fused to its
surface. It is likely that PapMV nanoparticles can be recognized by the immune
system as a pathogen associated molecular pattern (PAMP) that will induce the
immune response to the vaccine antigens. In this report, we show that PapMV
nanoparticles alone can trigger a strong innate immune stimulation that leads to
protection against a lethal influenza challenge. This stimulation, together with the
recruitment of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes, triggered the
accumulation of IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 and IP-10 in the
lungs of mice a few hours following instillation of PapMV nanoparticles. The
protection was optimal after two treatments given on a 7-day interval. The duration of
the protection was at least 5 days but could be prolonged by repeating the instillation
every week for more than 10 weeks. These results suggest that PapMV nanoparticles
are efficient to stimulate mucosal innate immunity and therefore are a potential
candidate
to
establish
non-specific
antimicrobial state
at
mucosal surfaces.
Furthermore, these data strengthen the potential of PapMV nanoparticles as a
mucosal adjuvant.
22
Introduction
Papaya Mosaic Virus (PapMV) nanoparticles have a tremendous potential as both
adjuvant and vaccine platform (Acosta-Ramírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis
et al., 2007; Lacasse et al., 2008; Leclerc et al., 2007; Rioux et al., 2012; Savard et
al., 2011). PapMV nanoparticles are composed of subunits of PapMV coat protein
assembled around a non-coding single-stranded RNA that results in a rod-shaped
particle similar to the virus isolated from plants (Tremblay et al., 2006). It was
suggested that PapMV is recognized by the immune system as a pathogen-associated
molecular pattern (PAMP) and that it can induce lipid raft aggregation, secretion of
pro-inflammatory
cytokines
and
up-regulation
of co-stimulatory molecules on
dendritic cells and macrophages (Acosta-Ramírez et al., 2008; Lacasse et al., 2008).
PapMV
nanoparticles
administered
with
the
trivalent
inactivated
flu vaccine
increased both the cellular and humoral responses to the vaccine antigens, broadened
the immune response and increased protection against an heterosubtypic strain of
influenza (Savard et al., 2011). PapMV nanoparticles used as a carrier for fused
antigens elicited the production of antibodies against the fused epitope (Denis et al.,
2007; Rioux et al., 2012) and a protective humoral response against lethal influenza
challenge when fused to M2e peptide derived from influenza M2 protein (Denis et
al., 2008). PapMV nanoparticles can also induce cross presentation of CTL epitopes
to the major histocompatibility complex molecule I (MHC class I) (Leclerc et al.,
2007), leading to protection against a viral challenge (Lacasse et al., 2008).
The efficacy of the PapMV nanoparticles in inducing adaptive immune responses is
probably linked to its ability to trigger the innate immune system. In vivo, activation
of the innate immune system can be measured by the secretion of cytokines and
chemokines, which act to establish a localized antimicrobial state by the recruitment
of immune cells and by the release of toxic compounds (Kohlmeier and Woodland,
2009). We showed that PapMV alone is able to trigger secretion of IL-2, IL-5, IL-6
MIP-1α and KC in the spleen of animals immunized by the subcutaneous route.
However, since the mucosal immunity differs from the systemic immune response, it
is unknown if PapMV nanoparticles could efficiently trigger an innate immune
23
response in lungs. Mucosal surfaces in the lungs are constantly interacting with the
external environment and are equipped with a robust innate immune system to
prevent invasion of pathogens (Vareille et al., 2011). A stimulation of lungs with a
bacterial lysate or with Toll-like receptor (TLR) ligands is able to induce protection
against multiple respiratory pathogens (Abdul-Careem et al., 2011; Clement et al.,
2008; Tuvim et al., 2012)
Therefore, the working hypothesis of this study was that PapMV nanoparticles alone
could trigger an innate immune response in lungs that would induce an antiviral state
leading to protection to an influenza challenge (Mitchell et al., 2008).
24
Materials and Methods
Production of PapMV nanoparticles
PapMV coat proteins and nanoparticles were kindly provided by Folia Biotech
(Quebec City, Canada). LPS contamination was always less than 50 endotoxin units
(EU) / mg of protein.
Animals
Seven to eight-week old BALB/C mice were purchased from Charles River
Laboratories. All protocols involving animals were approved by the «Comité de
Protection des Animaux - CHUQ (CPA-CHUQ)». The approval of this project is
found under the authorization number 2010148-1.
Intranasal treatments
Mice anesthetized with isoflurane were treated intranasally either with 50 µl of a
solution of Tris-HCl 10 mM pH 8 containing 60 µg of PapMV nanoparticles or with
50 µl of Tris-HCl 10 mM pH 8 alone (buffer). For the experiment presented on
Figure 2-6, the solution of Tris-HCl 10 mM pH 8 contained 50 µg, 100 µg or 150 µg
of PapMV nanoparticles. For the experiment presented on Figure 2-5, the solution of
Tris-HCl 10 mM pH 8 contained 60 µg of monomers of PapMV nucleocapsid or 3 µg
of single-stranded RNA, which corresponds to the amount of monomers and ssRNA
found in 60 µg of PapMV nanoparticles, respectively.
Bronchoalveolar lavage (BAL)
Mice were euthanized by intraperitoneal injection of 100 µl pentobarbital sodium
(Euthanyl®, Bimeda-MTC Animal Health Inc., Cambridge, ON). After the trachea
was exposed and cannulated, lungs were washed once with 0,6 ml of sterile
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) for
cytokine and chemokine measurements or six times with 0,6 ml of DPBS-0,5 mM
EDTA for cell count. An average of 0,5 ml and 3,0 ml of BAL fluid per mouse was
25
recovered respectively. Cells from BAL fluids were pelleted by centrifuging at 1800
rpm on Beckman GS-6R for 10 minutes at 4°C.
Cytokine and chemokine in BAL fluids
For cytokine and chemokine measurements in BAL, supernatants were frozen at 80°C before analysis with Milliplex Map Mouse Cytokine/Chemokine - Premixed 32
Plex (Millipore Billerica, MA), according to the manufacturer’s instructions. The 32plex was built for detection of Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p40),
IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL9, IP-10, KC, LIF, LIX, M-CSF, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, RANTES,
TNF-α and VEGF . The same samples were also analyzed for IFN-α detection with
Verikine Mouse Interferon Alpha Elisa (PBL Interferon source), according to the
manufacturer’s
instructions.
For
the
experiment
presented
on
Figure
2-1,
concentrations of cytokines in the BAL of animals treated only with buffer were
subtracted from concentrations of cytokines in the BAL of animals treated with
PapMV nanoparticles.
Immune cells in BAL fluids
For investigation of cellular recruitment,
total cell numbers in pellets were
determined using a hemacytometer. Differential cell counts were obtained from
150 000 BAL cells spun onto slides with a cytocentrifuge (Thermo Scientific,
Asheville, NC) before Diff-Quick staining (Siemens, Newark, USA). Two hundred
cells were classified based on characteristic morphology observed with an optical
microscope and the percentage of specific cell types (neutrophils, lymphocytes,
monocytes/macrophages, and eosinophils) was determined. The cell counts of
animals treated with the buffer alone were subtracted from the cell counts of animals
treated with PapMV nanoparticles.
Influenza infection
Mice anesthetized under isoflurane were treated intranasally with 50 µl of a solution
of DPBS containing 1LD50 or 1,5LD50 of influenza A A/WSN/33 (H1N1). Mice
26
were monitored daily during fourteen days for clinical symptoms such as weight loss,
abnormal behavior, ruffled fur and survival. Infections were performed at different
time points after the treatments, as indicated in each figure legend.
Statistical analysis
Concentrations of cytokines and chemokines in BAL fluids collected 6 hours after the
last treatment, cellular recruitment and weight losses during infection were analysed
with a parametric ANOVA test followed by Tukey's post-test to compare differences
among groups of mice. Concentrations of cytokines and chemokines in BAL fluids
collected 24 or 48 hours after the last treatment were analysed with Student’s t test
with Welch correction. Values of *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.0001 were
considered
statistically
GraphPad PRISM 5.01.
significant.
Statistical
analyses
were
performed
with
27
Results
PapMV nanoparticles trigger an early production of IL-6, TNF-α and KC in the
lung.
To verify if PapMV nanoparticles stimulate mucosal innate immunity, two wellknown pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and one chemokine (KC) were
measured in the lungs of mice treated once or twice at different time intervals with
PapMV nanoparticles. Strong and early IL-6, TNF-α and KC secretion was detected
for groups of mice treated once and twice with PapMV nanoparticles (Figure 2-1),
implying an efficient stimulation of the innate immunity. The levels were all
significantly higher in the group treated twice on a 7-day interval (Figure 2-1). This
suggests that the time interval between treatments is critical since the optimal interval
was found at 7 days.
To draw a complete profile of lung stimulation by PapMV nanoparticles, an array of
33 cytokines and chemokines (see material and methods) with different roles and
functions were measured at different time points. Since we already detected cytokines
and chemokines six hours after the last PapMV nanoparticle treatment and that the
optimal interval between two treatments is 7 days (Figure 2-1), we first evaluated the
complete cytokine and chemokine profile in these conditions. In addition to IL-6,
TNF-α and KC, the cytokine IL-9 and the chemokines MIP-1α, MIP-1β, MIP-2 and
IP-10 were significantly secreted in the lungs of mice after stimulation with PapMV
nanoparticles (Figure 2-2).
We have also evaluated if cytokines and chemokines after two PapMV nanoparticle
treatments given in a 7-day interval were found in the BAL fluids collected 24 and 48
hours after the treatments. Of the 33 cytokines and chemokines measured, only KC,
IL-9 and IP-10 were detectable 24 hours after the treatments and at lower levels than
earlier measurements (Figure 2-3). None of the 33 cytokines and chemokines
measured was detected in BAL fluids collected 48 hours after the treatments. Finally,
IFN-α was never detected at any time point.
28
Immune cells recruitment in lungs after PapMV nanoparticles stimulation
To investigate the presence of cellular recruitment following secretion of cytokines
and chemokines induced by PapMV nanoparticles, cells from BAL fluids were
counted, and stained to characterise the cell types migrating in the lungs upon
inflammation triggered by the PapMV treatments. PapMV nanoparticles induced
early recruitment of neutrophils six hours after PapMV treatments (Figure 2-4). The
number of neutrophils decreased gradually over time. No difference was found with
the control buffer at day 7 post treatments. Recruitment of monocytes/macrophages
and lymphocytes appeared 3 days after the treatments and persisted up to day seven.
However, monocytes/macrophages outnumbered other cell types on day three and
were the most numerous cell type recruited at day five compared to any other time
point. Total recruited cells were significantly higher three days after the PapMV
treatments compared with six hours and seven days (Figure 2-4), suggesting that
stimulation of innate immune defenses are optimal at this time point.
Stimulation of lung innate immunity with PapMV nanoparticles protects mice
against lethal influenza infection
Stimulation of lung innate defenses increases resistance against respiratory infections
(Evans et al., 2010c). To confirm that this stimulation can be translated into
protection to a viral disease, we evaluated if stimulation by PapMV nanoparticles
induced protection against a lethal dose of influenza virus A/WSN/33. Interestingly,
treated mice were resistant to infection, as showed by absence of symptoms (Figure
S2-1A), 100% survival (Figure S2-1B) and a minimal weight loss as compared with
control mice (Figure 2-5). To confirm that the structure of the nanoparticles is
important for the trigger of the protection, we also treated mice with the PapMV coat
protein (CP) alone or only the ssRNA contained in the nanoparticles. The amount of
PapMV CP and RNA used reflected the amount found in the nanoparticles and
corresponded respectively to 60µg of PapMV CP and 3µg of ssRNA. None of those
treatments were beneficial to induce protection and only the nanoparticles induced
the protective innate immunity. We previously demonstrated that two treatments with
a low dose of PapMV nanoparticles is necessary to trigger a significant innate
29
immune response (Figures 2-1 and 2-2). To assess the capacity of one treatment to
induce protection against influenza infection, mice received increasing doses of 50,
100 and 150µg of PapMV nanoparticles. As expected, the low dose was not
protective, but the two higher doses provided a significant protection to the challenge
with influenza, as showed by a minimal weight loss (Figure 2-6), absence of
symptoms (Figure S2-2A) and 100% survival (Figure S2-2B). These results
demonstrate that the increment of the dose can compensate for the number of
treatments.
We showed that the strongest inflammation was measured in the lung when PapMV
nanoparticles were given twice on a 7-day interval (Figure 2-1). To investigate if the
period between the treatments affects the level of protection against influenza
infection, mice were treated once or twice at different time intervals between the two
treatments with PapMV nanoparticles and infected as before three days later with a
lethal dose of influenza A/WSN/33. Interestingly, only mice that received treatments
separated by seven days significantly showed lower symptoms (Figure S2-3A),
complete survival (Figure S2-3B) and maintained their weight throughout the
infection compared with mice treated with buffer (Figure 2-7). Mice treated once or
twice at other time intervals were not protected from weight loss during infection,
indicating the 7-day interval is optimal (Figure 2-7).
To evaluate the duration of the protection against influenza infection following
PapMV nanoparticle lung stimulation, mice were treated twice on a 7-day interval
and infected with influenza at different times after treatments. Mice infected 1, 2, 3 or
5
days following PapMV nanoparticle stimulation were fully protected from
infection, as showed by the absence of symptoms (Figure S2-4A), complete survival
(Figure S2-4B), and complete maintenance of body weight during the infection
(Figure 2-8). On the other hand, mice infected seven days after PapMV nanoparticle
stimulation showed only partial protection while mice infected ten days after
treatments displayed similar weight losses than the control group (Figure 2-8). These
results are in agreement with the persistence of the immune cells in the lung
30
presented in Figure 2-4. This suggests that protection against influenza infection
persists for at least five days after PapMV nanoparticle lung stimulation.
To evaluate if we could extend the protection period by administrating multiple
treatments and if repetitive administrations of PapMV nanoparticles would be
tolerated, mice were treated 2, 5 or 10 times on a 7-day interval. Full protection was
observed for mice that received two, five or ten PapMV nanoparticle treatments
(Figure 2-9); they had no symptoms or weight loss neither during infection nor
treatments (Figures S2-5A-B).
31
Discussion
PapMV nanoparticles have been thoroughly described as strong inducers of adaptive
immunity, with their capacity to properly enhance immunogenicity of antigens
(Acosta-Ramírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis et al., 2007; Lacasse et al.,
2008; Savard et al., 2011). Here, we first report that these nanoparticles efficiently
stimulate lung innate immunity and that this stimulation is sufficient to induce an
antimicrobial state that provides complete protection against influenza infection.
Early pro-inflammatory cytokine and chemokine secretion was observed following
PapMV nanoparticle pulmonary stimulation. The secretion lasted up to twenty-four
hours post-stimulation for some of these cytokines, but none were still measurable at
forty-eight hours post-stimulation. Upon activation, macrophages can secrete IL-6,
KC and TNF-α [8], and could be involved in recognition and response to PapMV
nanoparticles considering that alveolar macrophages are initially present in lungs
before stimulation (Miyata and van Eeden, 2011). Neutrophils can synthesize and
secrete IL-8, MIP-1α, MIP-1β and IP-10 in vitro [7], therefore they could be
responsible for the presence of these chemokines in the BAL fluids of mice treated
with PapMV nanoparticles.
Only two treatments of PapMV nanoparticles given on a 7-day interval elicited both
strong cytokine and chemokine secretion and a full protection against lethal influenza
infection. These data suggests that the efficacy of the protection depends on the
quality of the innate immune stimulation, which is modulated by PapMV nanoparticle
treatments interval. It is not clear why a 7-day interval between two successive
treatments is important to optimize the protection observed and the levels of
cytokines and chemokines in the lung. We detected high levels of IgM directed
against PapMV nanoparticles in the blood of mice 7 days after the first treatment,
before the administration of the second instillation. It is possible that IgMs, which
take usually 7 days to significantly accumulate in the lungs, could activate the
complement and contribute to the innate immune response that is triggered by
PapMV nanoparticles.
32
Although IFN-α, a member of type I interferon family, is a cytokine produced early
following viral infection and is commonly associated with early antiviral responses in
the lungs (Kohlmeier and Woodland, 2009), we could not detect it after PapMV
nanoparticle stimulation. Tuvim et al. obtained similar results with their lysate of
nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) and the combination of TLR ligands,
which induced protection to respiratory pathogens in the absence of INF-α (Tuvim et
al., 2012). These data suggest that IFN-α is not essential for protection against
influenza infection induced by PapMV nanoparticle stimulation.
After cytokine and chemokine secretion, the inflammatory reaction induced by
PapMV nanoparticle continued with early recruitment of neutrophils in the lungs,
followed
by the migration of monocytes/macrophages and lymphocytes. The
recruitment of these particular cell types is consistent with the specific chemokines
secreted after PapMV nanoparticle stimulation. For instance, KC and MIP-2 are both
ligands for CXCR2, acting as chemoattractants for neutrophils (Mark et al., 2007),
while MIP-1α, MIP-1β and IP-10 are chemokines for monocytes and natural killer
(NK)
cells
(Lee
et
al.,
2009; Lillard,
2002).
The presence of multiple
chemoattractants for NK cells may imply that the lymphocytes recruited in the lungs
following PapMV nanoparticle stimulation could be NK cells, as they meet both
criteria of being part of the lymphoid lineage and actors of innate immunity (Janeway
et al., 2008).
As opposed to the rapid clearance of cytokines and chemokines in the lungs,
monocytes/macrophages and lymphocytes persisted up to day seven post-stimulation.
These persistent recruited cells are likely to play a role in the protection against
subsequent influenza infection, as the duration of the protection correlates with the
persistence of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes. Many human
diseases are associated with neutrophil defects, yet it has been demonstrated that
neutrophils are not essential for influenza clearance (Mark et al., 2007). Furthermore,
depletion of neutrophils or macrophages does not interfere with protection against
bacterial pulmonary infection in a similar model of stimulation of lung innate
immunity (Clement et al., 2008). It is unclear if neutrophils are involved in the
33
protection to influenza in our model, however it is important to consider that lung
epithelial cells can certainly play an active role in the orchestration of the innate
immune cascade as well as in the protection against influenza infection followed by
PapMV
nanoparticle
lung
stimulation.
Epithelial
cells
can
trigger
multiple
mechanisms that regulate immunity, for instance by the production of functional
molecules and interactions with immunes cells (Vareille et al., 2011).
Entire nanoparticles but not its individual components provided protection against
influenza infection, suggesting that the unique structure of PapMV nanoparticles is
essential for their stimulation of pulmonary innate immunity. Our group has
previously shown that subunits of PapMV capsid alone were incapable of inducing
humoral responses (Denis et al., 2008). It is possible that the single-stranded RNA
hidden in the structure of PapMV nanoparticles interacts with immune receptors, and
that the nanoparticle itself is the vehicle to bring the ligand into the proper cellular
compartment. Indeed, most receptors that recognizes single-stranded RNA, such as
TLR-7, RIG-I and MDA5, are localized in endosomes or in the cytoplasm to favor
interactions with viral nucleic acids rather than cellular ones (Heil et al., 2003;
Yoneyama et al., 2004). Moreover, promoting localized antiviral state and recruiting
inflammatory cells are features of innate recognition of viral components by patterns
recognition receptors (PRRs) (Kohlmeier and Woodland, 2009), it is thus reasonable
to believe that the nucleic acid contained in PapMV nanoparticles is partly
responsible for the activation of lung innate immunity by the nanoparticles. This is
currently under investigation in the laboratory.
The possibility to rapidly create a transient antimicrobial state by stimulating the
respiratory mucosal innate immunity with PapMV nanoparticles is very attractive as a
preventive measure to protect towards a new pandemic in the absence of vaccines.
Several applications can be considered, like for health workers that need to travel in
endemic areas in case of pandemics, or for patients with dysfunctions of adaptive
immunity that could benefit from stimulation of mucosal innate immunity to prevent
opportunistic infections.
34
PapMV nanoparticles have several advantages compared to other immunostimulants.
All parameters of their production is completely controlled, they can be produced at
low cost in bacterial expression system, and they appear to be very well tolerated
since we have not observed any adverse reactions in animals treated with PapMV
nanoparticles. In addition, since PapMV nanoparticles originate from a plant virus,
they are naturally biocompatible and biodegradable and not likely to cause side
effects due to unwanted interactions with human receptors, (Manchester and
Steinmetz, 2011). Rapid clearance of this immunostimulant has been previously
showed by our group (Savard et al., 2011), and this is desired to reduce toxic side
effects. Finally, the capacity of PapMV nanoparticles to stimulate lung innate
immunity strongly suggests that it could also induce mucosal adaptive responses and
therefore be tested as a mucosal adjuvant in vaccine preparations.
35
Acknowledgment
We would like to thank Folia Biotech for kindly providing the proteins used in the
experiments presented.
36
References
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function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature
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39
Figure legends
Figure 2-1. PapMV nanoparticles induce early lung cytokines and chemokine
secretion in the lungs. Levels of IL-6, TNF-α and KC were measured in the
broncho-alveolar lavage (BAL) of Balb/C mice 6 hours after the treatment with
papMV nanoparticles or with buffer. Mice were treated once (1X PapMV) or twice at
intervals of 3 hours, 1 day, 3 days or 7 days between the treatments. Data are
represented as mean ± SEM (n=5) for each group. *** p<0.001 for IL-6 and TNF-α
concentrations for the 7 days as compared with all other groups. For KC, ***
p<0.001 for the 7 days as compared with the 1X PapMV group, ** p<0.01 as
compared with the 1 day group and * p<0.05 as compared with the 3 days and the 3
hours groups.
Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are se creted in the lungs
upon stimulation with PapMV nanoparticles. Lung cytokines and chemokines
levels were measured in BAL fluids of Balb/C mice treated by the intranasal route
with PapMV nanoparticles once (1X PapMV Nano) or twice on a 7-day interval (2X
PapMV Nano), or with buffer. BALs were obtained 6 hours after the last treatment.
Data are represented for individual mouse (n = 5) for each group. *** p<0.001, **
p<0.01, * p<0.05
Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine
secretion in the lungs. Mice were treated twice as described in Figure 2-2. BALs
were harvested 24 hours after the second treatment. Data are represented for
individual mouse of each group; IP-10 and IL-9 n = 5, KC n=4. * p<0.05
Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in
the lungs. Lung cellular recruitment was quantified in mice treated by the intranasal
route with PapMV nanoparticles twice on a 7-day interval (PapMV Nano), or with
buffer. Quantitation of cells in BAL fluids was assessed 6 hours, 3, 5 and 7 days after
the second treatment. Monocytes/macrophages, lymphocytes and neutrophils were
observed on slides from individual mouse for each groups. ** p<0.01
40
Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to a lethal
influenza challenge. Weight loss of mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33
was measured for mice pretreated by intranasal route twice on a 7-day interval with
PapMV nanoparticles (PapMV Nano), with monomers of PapMV nucleocapsid
(PapMV
monomers),
with
the
single-stranded
RNA
contained
in
PapMV
nanoparticles (PapMV ssRNA) or with buffer. Infection was performed three days
after the last treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001
for mice treated with PapMV Nano compared with mice treated with PapMV
monomers and compared with mice treated with buffer, * p<0.05 for mice treated
with PapMV Nano compared with mice treated with PapMV ssRNA.
Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dosedependent manner with one treatment of PapMV nanoparticles. Weight loss of
mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by
the intranasal route once with 150µg (1X PapMV Nano 150µg), 100µg (1X PapMV
Nano 100µg), 50µg (1X PapMV Nano 50µg) of PapMV nanoparticles, or with
buffer. Infection was performed three days after the treatment. Data are represented
as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001 for mice treated with 150µg of PapMV Nano
and *p<0.05 for mice treated with 100µg of PapMV Nano compared with mice
treated with buffer.
Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is
critical for protection to influenza A infection. Weight loss of mice infected with
1,5LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal
route once (1X PapMV Nano) or twice with PapMV Nanoparticles on a seven-day
interval (2X PapMV Nano 7 days), on a three-day interval (2X PapMV Nano 3 days),
on a one-day interval (2X PapMV Nano 1 day), on a three-hour interval (2X PapMV
Nano 3 hours) or with buffer. Infection was performed three days after the last
treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). ** p<0.01 for mice treated
twice with PapMV Nano on a seven-day interval compared with mice treated with
buffer.
41
Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term
protection to an influenza infection. Weight loss of mice infected with 1LD50
influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal route with
PapMV nanoparticles twice on a 7-day interval or with buffer. Infection was
performed (A) one to three days (PapMV Nano -1, -2, -3 day) or (B) three to 10 days
(PapMV Nano -3, -5, -7, -10 days) after the PapMV nanoparticle treatments. Mice
treated with buffer were infected three days after the last treatment. Data are
represented as mean ± SEM (n=10). ** p<0.01 for PapMV Nano -3 days, * p<0.05
for PapMV Nano -2 days and *** p<0.001 for PapMV Nano -1 day, all compared
with mice treated with buffer. *** p<0.001 for mice infected three or five days after
the PapMV Nano treatment compared with mice infected after ten days and compared
with mice treated with buffer.
Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated
and permit to extend the protection period to influenza infection. Weight loss of
mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by
the intranasal route with two (2X PapMV Nano), five (5X PapMV Nano) or ten (10X
PapMV Nano) doses of PapMV nanoparticles, or with buffer. Multiple treatments
were given on a 7-day interval and infection was performed three days after the last
treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001 for mice treated
with 2X PapMV Nano, ** p<0.01 for mice treated with 10X PapMV Nano and for
mice treated with 5X PapMV Nano compared with mice treated with buffer.
42
Titles of supplementary material
Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no
mortality during a lethal influenza challenge.
Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no
symptom or B) no mortality during an influenza challenge.
Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days
significantly showed A) lower symptoms and B) complete survival during a lethal
influenza challenge.
Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle
stimulation show A, C) no symptom and B, D) complete survival during a lethal
influenza challenge.
Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low
symptoms and B) no mortality during a lethal influenza challenge.
43
Figure 2-1. PapMV nanoparticles induce early lung cytokines and chemokine
secretion in the lungs.
44
Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are secreted in the lungs upon
stimulation with PapMV nanoparticles.
45
Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine secretion
in the lungs.
46
Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in the
lungs.
47
Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to an influenza
lethal challenge.
48
Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dose-dependent
manner with one treatment of PapMV nanoparticles.
49
Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is critical
for protection to influenza A infection.
50
Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term protection to
an influenza infection.
51
Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated and
permit to extend the protection period to influenza infection.
52
Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no
mortality during a lethal influenza challenge.
53
Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no
symptom or B) no mortality during an influenza challenge.
54
Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days significantly
showed A) lower symptoms and B) complete survival during a lethal influenza
challenge.
55
Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle
stimulation show A, C) no symptom and B, D) complete survival during a lethal
influenza challenge.
56
Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low
symptoms and B) no mortality during a lethal influenza challenge.
57
Chapitre 3 : Discussion
L’accumulation de cytokines, de chimiokines et le recrutement de neutrophiles, de
monocytes/macrophages et de lymphocytes dans les poumons des souris ont permis
d’établir l’efficacité des nanoparticules du PapMV à stimuler l’immunité innée
pulmonaire. Bien que la mesure de ces médiateurs soit une preuve robuste d’une
stimulation
de
nanoparticules
l’immunité
enclenchent
innée,
cette
aucune
étude
n’explique
cascade.
Des
collaborateurs
comment
les
caractérisent
présentement les effets de l’interaction des nanoparticules avec des cellules immunes
isolées du sang et avec des modèles murins, toutefois il serait intéressant
d’approfondir également le modèle pulmonaire. Les premières cellules à rencontrer et
à réagir contre les nanoparticules du PapMV dans le poumon des souris sont les
cellules résidentes, principalement les cellules épithéliales et les macrophages. Une
lignée de cellules épithéliales murines pourrait être stimulée avec les nanoparticules
du PapMV et les molécules antimicrobiennes, les cytokines et les composés réactifs
de l’oxygène pourraient être mesurés. Cette expérience, en plus de démontrer que
l’épithélium respiratoire réagit aux nanoparticules, pourrait établir la part de ces
cellules dans la stimulation de l’immunité innée mesurée in vivo. Les mêmes
techniques pourraient être utilisées pour tirer des conclusions similaires concernant
des macrophages isolés de poumons de souris. Des lymphocytes ont été recrutés aux
poumons après une stimulation avec les nanoparticules du PapMV, et il serait logique
de croire que ces lymphocytes soient des cellules NK, puisqu’elles participent
activement à l’immunité innée.
Une expérience en fluorescence utilisant des
marqueurs spécifiques des cellules NK sur des cellules provenant de lavages
broncho-alvéolaires pourrait clarifier l’identité de ces cellules.
La stimulation de l’immunité innée de la muqueuse respiratoire par les nanoparticules
du PapMV établi un état antimicrobien qui permet de protéger contre une infection au
virus de l’influenza. Le nombre de traitements de nanoparticules, l’intervalle entre
chacun et le moment de l’infection ont été optimisés, et il serait pertinent de
reproduire ces études dans un modèle plus près de l’humain, comme le furet. La
protection
induite
par
la
stimulation
de
l’immunité
pulmonaire
avec
les
58
nanoparticules n’a été évaluée que contre le virus de l’influenza, et des études contres
d’autres pathogènes respiratoires, autant des bactéries que des virus ou des mycètes,
pourraient élargir notre compréhension sur cette protection non spécifique. Il est
évident que les conditions expérimentales déterminées dans l’étude avec influenza
pourraient ne pas s’avérer optimales contre d’autres pathogènes respiratoires.
Finalement, pour déterminer le rôle des cellules immunes recrutées aux poumons
dans la protection, des déplétions individuelles de macrophages, de neutrophiles et de
lymphocytes pourraient être effectuées dans des modèles murins avant l’infection à
influenza.
Les nanoparticules du PapMV ont été largement étudiées pour leur effet d’adjuvant,
et les expériences présentées dans ce document ont permis de confirmer la capacité
des nanoparticules à stimuler l’immunité innée mucosale. Ainsi, il s’est avéré logique
d’évaluer la capacité d’adjuvant des nanoparticules dans un modèle de vaccination
pulmonaire. Mes travaux ont montré que seul l’ajout des nanoparticules au vaccin
trivalent contre l’influenza administré par voie intranasale permettait aux souris
vaccinées d’être protégées complètement contre une infection létale avec ce
pathogène (Figure 3-1), suggérant que les nanoparticules du PapMV sont un excellent
candidat comme adjuvant dans les vaccins muqueux.
59
Figure 3-1 : Les nanoparticules du PapMV comme adjuvant mucosal
Des souris ont été vaccinées par voie intranasale (i.n.) ou sous-cutanée (s.c.) avec le
vaccin trivalent contre l’influenza (Flu) seul ou en présence de nanoparticules
(PapMV), et ont ensuite été infectées 14 jours plus tard avec une souche d’influenza
différente de celles présentes dans le vaccin. Le poids des souris a été mesuré durant
14 jours post-infection. Pour le groupe PapMV + Flu i.n., p<0.001 comparé au groupe
buffer i.n. et p<0.01 comparé au groupe Flu i.n.
La possibilité de créer rapidement un état antimicrobien transitoire par la stimulation
de l’immunité innée des muqueuses respiratoires par les nanoparticules du PapMV
pourrait devenir un moyen préventif en absence de vaccins. Lorsque des agents de la
santé doivent se rendre dans une zone endémique pour identifier par exemple la
souche circulante du virus de l’influenza et qu’aucun vaccin n’est disponible, il serait
possible de croire que l’inhalation des nanoparticules du PapMV puisse diminuer les
risques d’infection. Certains patients souffrant de dysfonctionnements du système
immunitaire
adaptatif
pourraient
également
bénéficier
d’une
stimulation
de
l’immunité innée des muqueuses dans le but d’éviter les infections opportunistes.
Finalement,
cette stratégie pourrait être incorporée dans la lutte contre le
bioterrorisme. Dans une situation où une telle attaque est déclenchée, l’identité de
l’agent pathogène est souvent inconnue, et même si des vaccins contre tous les
60
pathogènes étaient disponibles en quantité suffisante pour la population, la réponse
immunitaire adaptative prendrait des semaines à se développer (Evans et al., 2010c).
Évidemment,
le potentiel de protection d’une stimulation de l’immunité des
muqueuses respiratoires est beaucoup plus grand contre des infections des voies
respiratoires que contre un pathogène dont le site de pénétration de l’organisme est
différent. Également, le choix d’un composé immunostimulant pour ce genre
d’applications doit tenir compte de plusieurs facteurs. La vaste majorité des études
documentant le phénomène de protection non-spécifique ont été réalisées avec des
modèles animaux, ce qui n’écarte pas que le stimulant puisse avoir des effets toxiques
sur l’ensemble de l’organisme. Il est donc fondamental de connaître la composition et
la nature du stimulant avant son administration chez l’humain.
En ce sens, les nanoparticules du PapMV possèdent beaucoup d’avantages par
rapport à d’autres immunostimulants. Tous les paramètres de production des
nanoparticules sont complètement contrôlés et peu couteux, et la production est
simple, rapide et sans danger. Puisque ces nanoparticules sont d’origine biologique et
infectent uniquement certains végétaux, elles sont naturellement biocompatibles et
biodégradables, et peu susceptibles de causer des effets secondaires dus à leur
interaction avec des récepteurs humains (Manchester and Steinmetz, 2011). La
disparition rapide d’un immunostimulant est préférable pour éviter d’autres effets
secondaires chez l’humain, et nous avons démontré que les nanoparticules du PapMV
sont rapidement dégradées in vivo (Savard et al., 2011).
61
Chapitre 4 : Conclusion
Les projets décrits dans ce mémoire ont permis de démontrer que les nanoparticules
du PapMV ont une capacité intrinsèque à stimuler l’immunité innée des muqueuses.
Cette stimulation a permis de protéger des souris contre une infection létale causée
par le virus de l’influenza.
Le potentiel d’adjuvant des nanoparticules du PapMV a déjà été largement
documenté et les présents travaux apportent une compréhension nouvelle quant aux
mécanismes
par
nanoparticules.
lesquels
Ainsi,
des
nous
réponses
pouvons
immunitaires
maintenant
sont
considérer
induites
par
ces
l’utilisation
des
nanoparticules du PapMV comme adjuvant dans des vaccins administrés par la voie
mucosale. Cette voie est de plus en plus favorisée pour l’administration de vaccins
car elle génère une réponse immunitaire robuste et efficace contre de nombreux
pathogènes respiratoires ou transmissibles sexuellement. Il est clair que l’ajout des
nanoparticules du PapMV dans différents vaccins pourrait être extrêmement
bénéfique pour obtenir des taux élevés de protection.
Ces travaux ont également mis en évidence la capacité des nanoparticules du PapMV
à induire un état antimicrobien non-spécifique qui permet de protéger les voies
respiratoires contre l’invasion du virus influenza. Cette propriété des nanoparticules
est extrêmement intéressante puisqu’elle pourrait être utilisée pour prévenir des
infections respiratoires dans des zones pandémiques, chez des personnes souffrant de
troubles du système immunitaire et pour contrer le bioterrorisme.
Bref, les nanoparticules du PapMV sont un outil polyvalent : elles peuvent être
utilisées comme adjuvant pour augmenter les réponses immunitaires envers des
antigènes, elles peuvent servir de plateforme vaccinale et elles peuvent induire une
protection non-spécifique contre l’influenza en absence de vaccin. Il est évident que
le potentiel des nanoparticules du PapMV dépasse le domaine de l’immunologie, et
qu’elles pourraient être utiles dans le combat contre certains cancers et des maladies
telles que l’asthme.
62
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