CLAUDIA MATHIEU STIMULATION DE L’IMMUNITÉ INNÉE PULMONAIRE AVEC DES NANOPARTICULES DU VIRUS DE LA MOSAÏQUE DE LA PAPAYE Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie-Immunologie pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.) MICROBIOLOGIE-IMMUNOLOGIE FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC 2012 © Claudia Mathieu, 2012 ii Résumé La stimulation de la réponse immunitaire dans les poumons est d’intérêt majeur pour la prévention des infections respiratoires. Nous avons démontré précédemment que les nanoparticules du virus de la mosaïque papaye (PapMV) augmentent les réponses immunitaires spécifiques contre des antigènes et induisent une activation systémique de l’immunité innée. Dans cette étude, l’accumulation d’IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 et IP-10 et le recrutement de neutrophiles, de monocytes/macrophages et de lymphocytes dans les poumons de souris a permis de démontrer la capacité des nanoparticules du PapMV à stimuler l'immunité innée pulmonaire. De plus, cette stimulation est suffisante pour protéger des souris contre une infection létale au virus influenza en absence d’antigènes spécifiques du virus. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules du PapMV stimulent efficacement l'immunité innée des muqueuses en établissant un état antimicrobien, et renforcent leur potentiel comme adjuvant mucosal. iii Abstract Stimulation of immune responses in the lungs is one of the most effective ways to prevent respiratory infections. We previously demonstrated that papaya mosaic virus (PapMV) nanoparticles can increase specific immune responses towards antigens and can induce systemic activation of the innate immunity. In this study, the accumulation of IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 and IP-10 followed by the recruitment of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes in the lungs of mice demonstrated the ability of PapMV nanoparticles to stimulate lung innate immunity. In addition, this stimulation was sufficient to protect mice against a lethal influenza virus challenge in the absence of specific antigens. These results suggest that PapMV nanoparticles efficiently stimulate mucosal innate immunity and therefore are promising candidates to establish a non-specific antimicrobial state at mucosal surfaces. Moreover, these data strengthen the potential of PapMV nanoparticles as a mucosal adjuvant. iv Avant-Propos Ce mémoire contient un article qui sera soumis sous peu pour publication dans un journal scientifique. Cet article est le produit de mon travail de recherche durant mes deux années de maîtrise, et ayant dirigé entièrement les projets, j’en suis l’auteure principale. J’ai participé à tous les processus de réflexion et de décision quant à l’orientation qu’a pris le projet durant ma maîtrise. J’ai également rédigé ou modifié l’ensemble des protocoles utilisés dans les expériences présentées dans ce document. J’ai effectué toutes les expériences seule, ou avec l’aide précieuse d’Annie Guérin et de Gervais Rioux. Je remercie également ces derniers pour leurs capacités techniques irréprochables. Leur aide m’a permis d’obtenir des résultats clairs et concis. Gervais Rioux, en plus d’avoir participé aux expériences, a également contribué intellectuellement à l’avancement du projet et a apporté des modifications pertinentes à l’article ci-joint, et mérite donc le titre de co-auteur de cet article. Le Dr. Denis Leclerc a supervisé et a participé aux décisions de toutes les expériences de mon projet de maîtrise et a co-écrit l’article inséré dans ce mémoire. Un immense merci à Marilène Bolduc et à Marie-Ève Laliberté-Gagné, qui ont produit, purifié, dosé et assuré la qualité des protéines que j’ai utilisées durant mes expériences. Un merci tout spécial à Marie-Christine Dumas pour ses conseils, à Nathalie Majeau pour son regard critique ainsi qu’à Audrey Filion et à Cindy Babin pour leur aide et leur patience. Je tiens à remercier mon directeur Denis Leclerc pour sa supervision, pour la confiance dont il a fait preuve envers moi et pour m’avoir permis de réaliser mon projet de maîtrise dans son laboratoire. v Au Dr F. Mambé vi Table des matières RÉSUMÉ ..................................................................................................................................................................... II ABSTRACT................................................................................................................................................................. III AVANT-PROPOS ..................................................................................................................................................... IV TABLE DES MATIÈRES............................................................................................................................................ VI LISTE DES FIGURES................................................................................................................................................ VII CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ...............................................................................................................................1 1. LE SYSTÈME IMMUNITAIRE INNÉE ..........................................................................................................................1 1.1. Les récepteurs.........................................................................................................................................1 1.1.1. Les TLRs ............................................................................................................................................. 1 1.1.2. Les NLR .............................................................................................................................................. 2 1.1.3. Les hélicases ...................................................................................................................................... 3 1.1.4. Les lectines ........................................................................................................................................ 4 1.2. Le complément .......................................................................................................................................6 1.3. Les cytokin es ...........................................................................................................................................8 1.4. Les cellules...............................................................................................................................................8 1.4.1. Les ma crophages ............................................................................................................................... 8 1.4.2. Les granulocytes ................................................................................................................................ 9 1.4.3. Les cellules dendri tiques ................................................................................................................. 10 1.4.4. Les cellules NK ................................................................................................................................. 10 1.5. L’immunité innée de la muqueuse respira toire ............................................................................. 10 1.5.1. L’épi thélium respi ratoi re................................................................................................................. 10 1.5.1.1. Les récepteurs ........................................................................................................................ 10 1.5.1.2. Les molécules antimicrobiennes ........................................................................................... 11 1.5.1.3. Les dérivés réactifs de l’oxygène ........................................................................................... 12 1.5.1.4. Les cytokines .......................................................................................................................... 12 1.5.2. Les cellules....................................................................................................................................... 13 2. LA PROTECTION ANTIMICROBIENNE NON-SPÉCIFIQUE .......................................................................................... 15 2.1. Histo rique ............................................................................................................................................. 15 2.2. La résistance pulmonaire innée........................................................................................................ 15 3. LES NANOPARTICULES DU PAPMV ..................................................................................................................... 17 CHAPITRE 2 : LA STIMULATION DE L’IMMUNITÉ INNÉE DES POUMONS AVEC DES NANOPARTICULES DU PAPMV GÉNÈRE UNE PROTECTION CONTRE UNE INFECTION LÉTALE AVEC LE VIRUS DE L’INFLUEN ZA EN SOURIS ..................................................................................................................................... 19 RÉSUMÉ ................................................................................................................................................................ 19 ABSTRACT ............................................................................................................................................................. 21 I NTRODUCTION...................................................................................................................................................... 22 MATERIALS AND METHODS.................................................................................................................................... 24 RESULTS................................................................................................................................................................ 27 DISCUSSION .......................................................................................................................................................... 31 ACKNOWLEDGMENT .............................................................................................................................................. 35 REFERENCES .......................................................................................................................................................... 36 FIGURE LEGENDS ................................................................................................................................................... 39 TITLES OF SUPPLEMENTARY MATERIAL .................................................................................................................... 42 CHAPITRE 3 : DISCUSSION................................................................................................................................... 57 CHAPITRE 4 : CONCLUSION ................................................................................................................................. 61 BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................................................... 62 vii Liste des figures Figures : Figure 1-1 : La cascade de signalisation des TLRs ...............................................................................................2 Figure 1-2 : Voie d’activation des NLRs et de l’inflammasome........................................................................3 Figure 1-3 : Le mécanisme d’activation des hélicases RIG-I et MDA5 ............................................................4 Figure 1-4 : Le rôle des lectines dans les APCs....................................................................................................6 Figure 1-5 : Les voies d’activation du complément............................................................................................7 Figure 1-6 : Les mécanismes de défense de l’épithélium respiratoire ........................................................ 13 Figure 2-1. PapMV nanoparticles induce early lung cytokines and chemokine secretion in the lungs. 43 Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are secreted in the lungs upon stimulation with PapMV nanoparticles........................................................................................................................ 44 Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine secretion in the lungs. ... 45 Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in the lungs. .................. 46 Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to an influenza lethal challenge. ....................................................................................................................................................................... 47 Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dose-dependent manner with one treatment of PapMV nanoparticles. ....................................................................................................... 48 Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is critical for protection to influenza A infection. ................................................................................................................................. 49 Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term protection to an influenza infection. ...................................................................................................................................................... 50 Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated and permit to extend the protection period to influenza infection. ........................................................................................ 51 Figure 3-1 : Les nanoparticules du PapMV comme adjuvant mucosal........................................................ 59 Figures supplémentaires : Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during a lethal influenza challenge. ........................................................................................................................ 52 Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during an influenza challenge................................................................................................. 53 Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days significantly showed A) lower symptoms and B) complete survival during a lethal influenza challenge. ............................ 54 Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle stimulation show A, C) no symptom and B, D) complete survival during a lethal influenza challenge. .................................... 55 Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low symptoms and B) no mortality during a lethal influenza challenge. ....................................................................................... 56 1 Chapitre 1 : Introduction 1. Le système immunitaire innée Le système immunitaire inné constitue la première ligne de défense contre l’invasion de pathogènes. La réponse générée par une stimulation de l’immunité innée est rapide et non-spécifique et est coordonnée par un ensemble de cellules immunes et non immunes, de molécules de communication et de récepteurs. L’activation de l’immunité innée est déclenchée par la reconnaissance de motifs conservés sur les pathogènes appelés PAMPs, pour «Pathogen-associated molecular patterns». Ces PAMPs sont reconnus par les cellules immunitaires via des «Pattern recognition receptors» (PRR), et vont induire une cascade de signalisation qui va conduire à la production de médiateurs moléculaires. Ces protéines sont des cytokines et des chimiokines qui vont agir sur le recrutement et l’état d’activation d’autres cellules, et sont donc responsables de la réaction inflammatoire. Ainsi, les défenses seront augmentées au site de pénétration du pathogène pour éviter sa dissémination. Par la suite, le système immunitaire innée va présenter des antigènes du pathogène au système immunitaire adaptatif, qui va produire une réponse spécifique et de longue durée contre ce pathogène. 1.1. Les récepteurs 1.1.1. Les TLRs Les «Toll-like receptors» (TLR) sont une famille de PRRs qui est impliquée dans la reconnaissance de nombreux motifs présents sur les bactéries, virus, mycètes et parasites, et sont exprimés autant sur les cellules immunes que sur les cellules non immunes à des niveaux variables. Ces récepteurs sont très conservés chez les vertébrés et les invertébrés. Jusqu’à ce jour, 10 et 12 TLR fonctionnels ont été identifiés chez l’humain et la souris respectivement (Kawai and Akira, 2011). Après liaison avec son ligand, le récepteur induit une cascade de signalisation conduisant à la production de cytokines et de molécules pro-inflammatoires (Figure 1-1). Les virus étant des parasites obligatoires, ils nécessitent l’utilisation des composantes cellulaires pour se répliquer, impliquant qu’ils exposent leur matériel génétique aux 2 défenses cellulaires. Les récepteurs de l’immunité innée qui reconnaissent les acides nucléiques viraux sont localisés dans le cytoplasme ou dans des endosomes, ce qui évite leur interaction avec des acides nucléiques cellulaires du soi (Kawai and Akira, 2011). Parmi les membres de la famille des TLRs, le TLR-3 reconnait principalement l’ARN double brin et les TLR-7 et TLR-8, l’ARN simple brin (Heil et al., 2004). Figure 1-1 : La cascade de signalisation des TLRs Suite à la reconnaissance d’un PAMP, les TLRs subissent des changements conformationnels qui induisent leur dimérisation et le recrutement de protéines adaptatrices telles que MyD88, TIRAP et TRIF. Selon le type cellulaire, la cascade de signalisation engendrée par l’interaction TLR-PAMP va entraîner la sécrétion d’interféron de type I ou de cytokines pro-inflammatoires. (Kawai and Akira, 2011) 1.1.2. Les NLR Les «NOD-like receptors» (NLR) font également parti des PRR et sont retrouvés exclusivement dans des compartiments intracellulaires. Le plus récent modèle propose que l’interaction d’un NRL avec le PAMP qu’il reconnait provoque un 3 changement conformationnel du récepteur, ce qui induit le recrutement de caspases. L’activation des caspases est contrôlée par l’association de NLRs, qui forment de larges complexes protéiques appelés «inflammasomes» dont la composition varie selon le PAMP reconnu (Kanneganti, 2010). Les caspases sont des protéases responsables du clivage et de l’activation de cytokines pro-inflammatoires telles que l’IL-1β et l’IL-18 (Figure 1-2). Elles activent également des facteurs qui affectent la balance apoptotique et jouent un rôle dans l’activation de l’autophagie. Figure 1-2 : Voie d’activation des NLRs et de l’inflammasome L’interaction des NLRs avec des acides nucléiques viraux induit le recrutement et l’activation de caspases par la formation de complexes protéiques nommés «inflammasomes». Les caspases effectrices vont cliver les précurseurs de l’IL-1β et de l’IL-18 pour produire des cytokines pro-inflammatoires actives. (Kanneganti, 2010) 1.1.3. Les hélicases Un autre mécanisme de reconnaissance des virus par les cellules est la présence d’hélicases dans leur cytoplasme qui reconnaissent les acides nucléiques viraux. Les hélicases les plus reconnues pour leur rôle dans l’immunité innée sont «Retinoic acidinducible gene 1 protein» (RIG-I) et «melanoma-differentiation-associated gene 5» 4 (MDA5). La stimulation de RIG-I et de MDA5 induit la sécrétion d’interféron bêta (IFN-β), d’interféron alpha (IFN-α), d’IL-6 et d’IL-12 in vivo (Kato et al., 2006; Yoneyama et al., 2004). Les voies de signalisation induites par les hélicases sont dépendantes de la structure de l’acide nucléique reconnu, c’est-à-dire que les deux hélicases peuvent différencier l’ARN et l’ADN des virus ainsi que les acides nucléiques cellulaires (Jiang et al., 2011). Figure 1-3 : Le mécanisme d’activation des hélicases RIG-I et MDA5 Lors de la reconnaissance d’acides nucléiques viraux, la conformation de RIG-I et de MDA5 est modifiée pour favoriser l’interaction avec la protéine adaptatrice IPS-1. Cette interaction permet la transmission du signal jusqu’au noyau par des complexes de protéines kinases, où l’activation d’NFκB va conduire à la production d’IFN-β et d’autres cytokines antivirales. (Bruns and Horvath, 2012) 1.1.4. Les lectines Les lectines sont des protéines qui font partie d’une grande famille de récepteurs sécrétés ou membranaires qui reconnaissent des patrons de glycosylation. Plusieurs de ces récepteurs participent à l’immunité innée en reconnaissant spécifiquement des 5 structures de glycans sur des protéines et des lipides exprimés par des pathogènes (Figure 1-4). Les lectines de type C favorisent la présentation antigénique lorsqu’elles sont stimulées par leurs ligands (Geijtenbeek et al., 2004). Leur expression et leur fonction sont régulés aux sites d’inflammation (van Kooyk and Rabinovich, 2008). Ces récepteurs sont principalement exprimés à la surface des macrophages et des cellules dendritiques, bien que la Dectin-1 soit exprimée également sur les cellules NK, les neutrophiles, les éosinophiles, les monocytes et certaines sous-populations de lymphocytes T (Brown, 2006). Le DC-SIGN, une lectine de type C, joue également un rôle important dans la réponse immunitaire puisqu’il reconnait et est la cible de plusieurs pathogènes. La cascade de signalisation de certains TLRs est influencée par l’activation du DC-SIGN (Geijtenbeek et al., 2003). Mycobacterium tuberculosis, le VIH et Candida albicans ciblent tous le DC-SIGN pour affecter la réponse immunitaire des cellules dendritiques et assurer leur survie (Geijtenbeek et al., 2003). Les «mannose-bindind lectins» (MBL) ou «lectines liant le mannose» sont des lectines de type-C qui participent à la voie du complément, une autre composante majeure du système immunitaire innée (Fujita, 2002). 6 Figure 1-4 : Le rôle des lectines dans les APCs. La reconnaissance par les lectines de motifs formés de glycans à la surface des pathogènes conduit à l’activation et la maturation des cellules présentatrices d’antigènes (APCs), à la production de cytokines, et à l’augmentation de leur capacité à présenter les antigènes. (van Kooyk and Rabinovich, 2008) 1.2. Le complément La voie du complément participe activement à l’établissement de la réponse immunitaire innée en stimulant trois principales fonctions biologiques; l’opsonisation des pathogènes, l’activation et le recrutement de cellules immunes, et l’élimination directe des pathogènes (Fujita, 2002). La cascade du complément implique plus de trente protéines membranaires et plasmatiques qui participent à une chaine de réactions de clivage et d’assemblage de complexes qui va aboutir à la conversion de la protéine C3 en deux fragments effecteurs (Figure 1-5). La protéine C3 possède une activité opsonisante intrinsèque. Le fragment de plus grande taille de la protéine C3, le C3b, peut s’associer à la protéine C5 et conduire à la formation du complexe d’attaque dirigeant la lyse du pathogène. Le petit fragment C3a est une 7 anaphylatoxine qui entraîne la libération des granules antimicrobiennes contenues dans le cytoplasme des cellules endothéliales, des mastocytes et des cellules phagocytaires. Il est également responsable de l’activation et du recrutement de cellules immunes (Walport, 2001). Bien que la cascade du complément implique des protéines plasmatiques, des fragments effecteurs du complément peuvent être retrouvés dans la muqueuse respiratoire humaine et murine (Bolger et al., 2007). Figure 1-5 : Les voies d’activation du complément Il y a trois voies d’activation du complément; la voie classique, la voie des lectines et la voie alternative. La voie classique est activée suite à des interactions anticorps – antigènes, la voie des lectines implique la reconnaissance de patrons de glycosylation sur des pathogènes par des lectines, et la voie alternative est induite lorsque des composantes du complément se fixent directement sur certains antigènes microbiens. (Fujita, 2002) 8 1.3. Les cytokines La reconnaissance de PAMPs par les PRRs induit une cascade de signalisation qui aboutit à la production et à la sécrétion de médiateurs inflammatoires appelés cytokines. Les chimiokines sont une famille de cytokines dont la sécrétion induit la migration de cellules immunes du sang vers le site d’infection, permettant ainsi de localiser la réponse immunitaire contre le pathogène. Selon la nature des cytokines, l’interaction avec leurs récepteurs peut affecter le comportement de la cellule productrice autant que celui des cellules adjacentes. Leur rôle est primordial dans l’harmonisation et le contrôle de la réponse immunitaire innée, puisqu’une déplétion in vivo de différentes cytokines produit une réponse immunitaire aberrante ou affaiblie en réponse à une infection (Wack et al., 2011). Les cytokines sont regroupées en plusieurs familles, selon qu’elles ont un rôle plutôt pro-inflammatoire, antiviral ou qu’elles soient impliquées dans la réponse immunitaire innée ou adaptative. La plupart des virus ont évolué pour contrer l’effet des cytokines en incorporant dans leur génome des gènes qui codent pour des récepteurs solubles de cytokines (Alcamí and Smith, 1995) ou qui interfèrent avec la signalisation induite par les cytokines (Bahar et al., 2011). 1.4. Les cellules Les cellules non immunes expriment différentes combinaisons de récepteurs immuns et participent donc à l’établissement de la réponse immunitaire innée. Cependant, ce sont principalement les cellules de lignée myéloïde qui sont spécialisées dans l’orchestration de la réponse immunitaire. Les lymphocytes sont surtout spécialisés dans la réponse immunitaire adaptative, bien que les cellules NK soient impliquées dans la réponse immunitaire innée. Les lymphocytes B sont responsables de la production d’anticorps spécifiques aux pathogènes, et les lymphocytes T vont d’une part reconnaître et éliminer les cellules infectées, et d’autre part assister les lymphocytes B. 1.4.1. Les macrophages Les macrophages sont des cellules résidant dans presque tous les tissus et constituent la forme mature des monocytes, qui circulent dans le sang et se différentient lors de 9 leur migration dans un tissu (Janeway et al., 2008). Les macrophages participent à plusieurs niveaux de la réponse immunitaire innée, d’abord par leur capacité à reconnaître et phagocyter les pathogènes, puis par l’orchestration de la réaction inflammatoire en sécrétant des cytokines et des chimiokines. Les pathogènes pénètrent souvent l’organisme par les muqueuses, et les macrophages qui tapissent ces surfaces sont parmi les premières cellules à réagir (Miyata and van Eeden, 2011). Leur principal rôle est de contrôler la réponse inflammatoire face aux nombreux agresseurs qui tapissent les voies respiratoires. 1.4.2. Les granulocytes Les granulocytes sont une famille de cellules comptant trois sous-types; les éosinophiles, les basophiles et les neutrophiles. Ces cellules partagent la caractéristique de posséder des granules dans leur cytoplasme, et se distinguent par la capacité de ces granules à retenir des colorants neutres, basiques ou à base d’éosine. Le rôle des éosinophiles et des basophiles dans la protection contre les pathogènes demeure encore nébuleux. Les éosinophiles s’accumulent dans les tissus et libèrent des protéines cationiques et des dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) lors d’infections parasitaires (Williams, 2004), mais sont surtout associés à des formes sévères d’asthme en Amérique du Nord (Wenzel, 2006). Les basophiles quant à eux ont été identifiés comme responsables du développement de l’inflammation dans certains types d’allergies chroniques (Mukai et al., 2005). D’autre part, les neutrophiles sont reconnus pour leurs nombreuses fonctions effectrices lors d’infections et leur contribution dans l’élimination de pathogènes. Dès le début d’une invasion microbienne, les macrophages et plusieurs cellules tissulaires vont sécréter des chimiokines pour recruter une grande quantité de neutrophiles au site d’infection. Suivant ce gradient chimiotactique, les neutrophiles vont migrer à partir du sang pour aller phagocyter les pathogènes. Le processus de phagocytose enclenche ensuite la libération de granules qui contiennent des peptides antimicrobiens, des enzymes protéolytiques et des ROS (Segel et al., 2011). 10 1.4.3. Les cellules dendritiques Les cellules dendritiques font partis des phagocytes professionnels avec les granulocytes et les macrophages. Les cellules dendritiques échantillonnent constamment l’environnement par le processus de phagocytose. Leur rôle premier n’est pas l’élimination des pathogènes mais plutôt la présentation d’antigènes. En effet, les cellules dendritiques sont responsables du passage de la réponse immunitaire innée vers une réponse adaptative caractérisée par une protection spécifique de longue durée. Elles expriment un large répertoire de PRRs dont l’activation initie une cascade de signalisation conduisant à la maturation de la cellule et à l’activation du l’immunité adaptative (Huang et al., 2012). 1.4.4. Les cellules NK Les «Natural Killer» (NK) sont les seules cellules de la lignée lymphoïde à être considérées comme des effecteurs de l’immunité innée. Elles se distinguent par leur capacité à reconnaître et à éliminer les cellules de l’hôte qui sont infectées, sans toutefois détruire les cellules saines (Karlhofer et al., 1992). Elles ne sont pas des phagocytes mais vont plutôt détruire les pathogènes via la libération de granules cytotoxiques capable d’induire l’apoptose des cellules infectées, de la même façon que le font les lymphocytes T cytotoxiques (Wang et al., 2012). Les cellules NK sont rapidement activées en réponse aux interferons et aux cytokines produites par les macrophages et vont à leur tour sécréter d’autres cytokines dans le but de contenir l’infection jusqu’à l’apparition d’une réponse immunitaire spécifique (Janeway et al., 2008). 1.5. L’immunité innée de la muqueuse respiratoire 1.5.1. L’épithélium respiratoire Les cellules épithéliales pulmonaires sont constamment en contact avec l’environnement extérieur; elles participent donc activement à la réponse immunitaire innée par la sécrétion de molécules antimicrobiennes et de cytokines et par leur interaction directe avec des cellules immunes (Figure 1-6). 1.5.1.1. Les récepteurs 11 Les pathogènes ayant franchi la barrière de mucus et le glycocalyx recouvrant l’épithélium respiratoire atteignent le côté apical des cellules épithéliales, ou réussissent à pénétrer le cytosol en traversant les membranes. Pour réagir contre les pathogènes, les cellules épithéliales expriment les TLRs 1 à 9 en surface ou à l’intérieur d’endosomes, chaque TLR reconnaissant spécifiquement des composants bactériens, viraux ou fongiques. Les récepteurs NOD et les hélicases RIG-I et MDA5, également retrouvés principalement le dans le cytosol des peptidoglycan bactérien cellules et les épithéliales, acides reconnaissent nucléiques viraux, respectivement (Shaw et al., 2008). 1.5.1.2. Les molécules antimicrobiennes Les cellules épithéliales produisent des glycoprotéines membranaires appelées mucines qui forment, avec d’autres glycoprotéines et glycolipides, le glycocalyx. Les mucines sont le principal constituant du mucus qui recouvre la muqueuse respiratoire. En plus d’adhérer aux microorganismes, ces mucines peuvent avoir un effet antimicrobien direct ou transporter d’autres molécules antimicrobiennes (Linden et al., 2008). Les petits peptides cationiques tels que les cathélicidines et les défensines– β sont des molécules antimicrobiennes également sécrétées en grande quantité par les cellules épithéliales pour protéger la muqueuse. Ces peptides exercent un effet antimicrobien direct contre les bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram négatif, les mycètes et les pathogènes viraux (Schutte and McCray, 2002). La sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de chimiokines par les leucocytes locaux est augmentée par les peptides antimicrobiens, ce qui leur confère une capacité chimiotactique indirecte (Lai and Gallo, 2009). Les cellules épithéliales sécrètent de plus grosses protéines antimicrobiennes qui participent à la destruction des pathogènes. Parmi elles, le lysozyme hydrolyse le peptidoglycan, entrainant la lyse des bactéries à Gram négatif. La lactoferrine, elle, séquestrerait le fer et diminuerait sa disponibilité pour les pathogènes, en plus d’exercer un effet bactéricide direct (Evans et al., 2010b) et une activité antivirale contre les virus à ARN et à ADN (Vareille et al., 2011). Tel que mentionné précédemment (section 1.1.4), les collectines sont des PRRs qui reconnaissent des patrons de glycosylation sur les pathogènes. L’épithélium respiratoire, en plus d’exprimer des collectines 12 membranaires, sécrètent des collectines solubles dont les membres les plus étudiés sont SP-A et SP-D (Surfactant Protein A et D). La liaison de SP-A ou SP-D aux pathogènes engendre leur opsonisation et leur neutralisation par agglutination, et modulent les réponses immunitaires des cellules dendritiques et des lymphocytes T (Evans et al., 2010a). La combinaison dans le poumon de ces molécules antimicrobiennes génère des effets synergiques sur la destruction des pathogènes, même lorsqu’elles se trouvent en concentration non-inhibitrice (Singh et al., 2000). 1.5.1.3. Les dérivés réactifs de l’oxygène En réponse aux infections ou suivant une stimulation thérapeutique, les cellules épithéliales génèrent des dérivés réactifs de l’oxygène à des concentrations bactéricides (Gerson et al., 2000). Trois enzymes constitutives et inductibles exprimées par les cellules épithéliales, les oxyde nitrique synthétases (NOS), sont responsables de la production d’oxyde nitrique (NO) dans le poumon. L’importance du NO dans la résistance pulmonaire à l’infection est supportée par des expériences qui démontrent que certains virus se répliquent davantage en l’absence de NOS (Zheng et al., 2004), et qu’une surexpression de ces enzymes protègent contre des infections virales (Zheng et al., 2003). L’épithélium respiratoire génère également du peroxyde d’hydrogène (H2 O2 ), dont les effets bactéricides sont augmentés en présence de peroxydases, des enzymes aussi produites par les cellules épithéliales (Wijkstrom-Frei et al., 2003). 1.5.1.4. Les cytokines L’IFN-α et l’IFN-β sont des molécules antivirales qui jouent un rôle central dans la réponse innée contre les cellules infectées. Ces cytokines sont sécrétées dans le poumon par les cellules épithéliales, et suivant l’interaction avec leur récepteur, elles vont induire l’expression de plusieurs gènes qui codent pour des protéines interférant spécifiquement avec la réplication virale, la production et le transport de protéines virales (Samuel, 2001). Le recrutement de cellules immunes est essentiel pour la résistance du poumon à l’infection et l’épithélium respiratoire produit une grande variété de chimiokines pour en assurer le maintien. Les cellules épithéliales recrutent des neutrophiles aux poumons par la production d’IL-8, de CXCL1 et CXCL5, des 13 macrophages par la sécrétion d’IL-1β, de MIP-1α, MCP-1 et TNF-α, et des cellules NK par la production d’IFNα/β et de MIP-1α (Vareille et al., 2011). Figure 1-6 : Les mécanismes de défense de l’épithélium respiratoire Les cellules épithéliales respiratoires modulent les réponses immunitaires en produisant des substances antimicrobiennes telles que la lactoferrine, les interférons (IFNs), les β-défensines et l’oxyde nitrique (NO) contenus dans le mucus, et en sécrétant des cytokines et des chimiokines qui permettent le recrutement et l’activation de cellules immunes. (Vareille et al., 2011) 1.5.2. Les cellules Les premières cellules à rencontrer des pathogènes dans la muqueuse respiratoire sont les cellules épithéliales (section 1.5.1) et les macrophages résidents du poumon (Kohlmeier and Woodland, 2009). Les macrophages alvéolaires sont équipés de PRRs pour reconnaitre et réagir contre les pathogènes et ont été identifiés comme principaux producteurs d’IFN-α dans le poumon durant certaines infections virales (Kumagai et al., 2007). Les macrophages alvéolaires sécrètent peu de cytokines proinflammatoires et ont une activité phagocytaire faible dans un poumon sain (Holt, 1978). Cependant, en présence de pathogènes, l’activation de ces cellules se traduit 14 par l’augmentation de la phagocytose et la sécrétion abondante d’IL-1β, d’IL-6, de TNF-α et d’IL-8, qui vont contribuer aux réactions inflammatoires locales et systémiques (Janeway et al., 2008). Les macrophages activés sécrètent aussi de l’IL12 et de l’IL-10, ce qui conduit à l’activation des cellules NK et à la régulation de la réponse immunitaire adaptative (Vareille et al., 2011). Les chimiokines sécrétées par les cellules épithéliales et les macrophages pulmonaires vont induire le recrutement de monocytes, de neutrophiles et de cellules NK du sang vers le poumon. Suivant la phagocytose de pathogènes, les neutrophiles et les monocytes différenciés en macrophages sécrètent des peptides antimicrobiens et produisent de l’oxyde nitrique (NO), l’anion superoxyde O 2 - et du peroxyde d’hydrogène (H2 O 2 ) toxiques aux bactéries (Janeway et al., 2008). Les cellules NK recrutées aux poumons vont produire des cytokines comme l’IFN-γ qui sont importantes dans la réponse antivirale et dans l’activation indépendante de l’antigène des cellules présentatrices d’antigènes (Vareille et al., 2011). 15 2. La protection antimicrobienne non-spécifique 2.1. Historique Depuis le 16e siècle, on reconnait qu’une pré-infection peut avoir un effet sur une infection subséquente. Ce n’est cependant qu’au début du 20e siècle que des études ont démontré in vivo que la présence de deux pathogènes engendrait des effets antagonistes ou synergiques sur la résistance à l’infection. Les études de Shope et collaborateurs en 1931 ont permis d’établir que le phénotype sévère de grippe porcine était observable seulement lors d’une colonisation concomitante du virus de la grippe porcine et de la bactérie Haemophilus influenza, et que ce phénotype n’était pas reproductible par les pathogènes individuels. Par la suite, des études similaires utilisant Bacillus anthracis, Brucella suis, Mycobacterium tuberculosis et Brucella abortus pour induire une infection primaire et secondaire ont démontrés que les effets sur le phénotype pathologique étaient influencés par le site physiologique d’infection et par la voie d’administration des pathogènes (Henderson et al., 1956; Nyka, 1956). Un peu plus tard, des études se sont concentrées sur l’utilisation de composés immunostimulants tels que le LPS (Jean et al., 1998; Walmrath et al., 1996), des extraits bactériens (Adlam et al., 1972; Clark, 1979), des peptides antimicrobiens (Bals et al., 1999) et des ligands de récepteurs immuns (Krieg et al., 1998) pour étudier le phénomène de protection antimicrobienne non-spécifique. Cette protection ne fait pas appel à la reconnaissance d’antigènes spécifiques mais plutôt à celle de motifs conservés qui induisent une réaction immunitaire rapide, de courte durée et qui a un effet sur une large population microbienne. 2.2. La résistance pulmonaire innée Les études de Dickey, Evans et Tuvim ont grandement contribué à éclaircir les mécanismes d’induction de la résistance innée du poumon. Ils ont démontré que l’administration d’un lysat d’une souche non typable d’Haemophilus influenza (NTHi) par aérosol dans la muqueuse respiratoire permettait de protéger des souris contre un large éventail d’infections respiratoires bactériennes, virales et fongiques (Evans et al., 2010c; Tuvim et al., 2009). Cette stimulation de l’immunité innée induisait le recrutement de neutrophiles aux poumons, qui n’étaient cependant pas 16 responsables de la protection non-spécifique puisqu’une déplétion en neutrophiles précédant le traitement avec le lysat de NTHi n’affectait pas le phénotype de protection. Les macrophages résidents avaient également été écartés comme potentiels responsables de la protection par une expérience de déplétion in vivo similaire. La suite de ces travaux a révélé qu’immédiatement après stimulation, le transcriptome de l’épithélium respiratoire était modifié pour augmenter la production de peptides antimicrobiens, de cytokines, de chimiokines, de récepteurs immuns et de protéines de signalisation intracellulaire. De plus, la stimulation de plusieurs lignées de cellules épithéliales murines et humaines par le lysat de NTHi induisaient la lyse de bactéries in vitro (Evans et al., 2010c). Ces résultats ont permis d’impliquer l’épithélium respiratoire comme principal moteur de la réponse antimicrobienne déclenchée par la stimulation de l’immunité innée pulmonaire. Cependant, d’autres études qui comparait la stimulation de l’immunité innée de trois dérivés bactériens ont démontré que selon la nature de l’immunostimulant, la réponse immunitaire innée pouvait passer par différentes voies d’activation et conduire néanmoins à une protection contre le virus de l’influenza (Abdul-Careem et al., 2011). Dans cette étude, la protection était associée à l’expression de cytokines et au recrutement de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes, et il y était suggéré que la rencontre du virus avec cet environnement renforcé en défenses immunitaires conduisait à l’élimination rapide du virus. Un autre groupe a démontré que les macrophages étaient partiellement responsables de la protection contre une infection virale induite après une stimulation mucosale avec un ligand du TLR-4 (AbdulCareem et al., 2011). Bref, il semble que les effets concertés d’une stimulation de l’immunité innée par un mélange de ligands de PRRs soient responsables de la résistance à une infection microbienne subséquente. 17 3. Les nanoparticules du PapMV Les virus de plantes, en plus d’être non-infectieux chez les mammifères, peuvent être utilisés pour l’expression d’antigènes tout en conservant leur capacité à stimuler le système immunitaire (Pogue et al., 2002). La présentation d’antigènes, la sécurité et la stimulation de l’immunité sont des caractéristiques recherchées dans le développement de vaccins, et les virus végétaux sont désignés comme d’excellents candidats comme plateforme vaccinale et comme adjuvant. Le virus de la mosaïque de la papaye (PapMV) est un virus de plante filamenteux de la famille des Potexvirus dont la structure est composée de plusieurs centaines de sous-unités de la protéine de capside enroulées autour du génome viral, un ARN simple brin positif (Sit et al., 1989). Le PapMV seul induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, l’agrégation des radeaux lipidiques et l’expression de molécules de co-stimulation sur les cellules dendritiques et les macrophages (Acosta-Ramírez et al., 2008). En exprimant la protéine de capside du PapMV dans la bactérie E. coli, il est possible de produire et de purifier des nanoparticules du PapMV. Ces nanoparticules reproduisent la structure cristalline et répétitive du PapMV tout en étant non-infectieuses (Tremblay et al., 2006). Plusieurs études de notre groupe et de collaborateurs ont démontré la capacité de plateforme vaccinale et les effets d’adjuvant des nanoparticules du PapMV (AcostaRamírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis et al., 2007; Lacasse et al., 2008; Leclerc et al., 2007; Savard et al., 2011). La capacité des nanoparticules du PapMV à produire une réponse immunitaire de longue durée a été exploitée afin de produire des anticorps contre un épitope fusionné du virus de l’hépatite C (HCV) (Denis et al., 2007). Également, la fusion sur les nanoparticules du PapMV du peptide conservé M2e dérivé de la protéine M2 du virus de l’influenza a permis d’induire une réponse humorale protégeant des souris contre une infection létale au virus de l’influenza (Denis et al., 2008). Il a aussi démontré que la fusion d’un épitope spécifique aux lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sur les nanoparticules du PapMV engendre une expansion rapide de CTL spécifiques et conduit à la protection contre une infection à LCMV (Lacasse et al., 2008). La présentation croisée d’épitopes portés par les 18 nanoparticules du PapMV, via les molécules du CMH de classe I et l’expansion de lymphocytes T spécifiques à ces antigènes, a permis de désigner les nanoparticules du PapMV comme potentielle plateforme vaccinale contre les maladies infectieuses chroniques et les cancers (Leclerc et al., 2007). Des études récentes de notre groupe ont établi une corrélation entre la stabilité thermique des nanoparticules et leur potentiel immunologique, établissant de nouveaux critères dans la conception de vaccins (Rioux et al., 2012). Les nanoparticules du PapMV peuvent être utilisées dans des préparations vaccinales comme adjuvant, pour augmenter la réponse immunitaire spécifique contre des antigènes peu immunogènes contenus dans les vaccins, et élargir l’effet protecteur du vaccin à plusieurs souches d’un même virus. En effet, l’ajout des nanoparticules du PapMV au vaccin trivalent contre l’influenza augmente la réponse humorale et cellulaire contre la protéine NP d’influenza, permettant d’amplifier réponse immunitaire et de protéger contre une souche d’influenza différente de celles présentes dans le vaccin (Savard et al., 2011). De plus, la réponse en IgG2a contre la porine OmpC de Salmonella typhi est augmentée en présence des nanoparticules du PapMV, ce qui conduit à une meilleure protection contre une infection avec ce pathogène (Acosta-Ramírez et al., 2008). Puisqu’une réponse adaptative robuste doit d’abord passer par une stimulation efficace du système immunitaire innée, nous nous sommes intéressés à la stimulation de l’immunité innée par les nanoparticules du PapMV pour tenter de comprendre sa capacité d’adjuvant. Les nanoparticules sont reconnues par les cellules immunes et transportées aux ganglions lymphatiques in vivo et induisent la sécrétion de cytokines par des splénocytes murins ex vivo. Cependant, la capacité des nanoparticules à stimuler l’immunité innée dans un tissu comme la muqueuse respiratoire et à établir un état antimicrobien capable d’induire une protection non spécifique contre des pathogènes demeurait inconnue jusqu’aux présents travaux. 19 Chapitre 2 : La stimulation de l’immunité innée des poumons avec des nanoparticules du PapMV génère une protection contre une infection létale avec le virus de l’influenza en souris Résumé Les nanoparticules du PapMV ont un effet d’adjuvant et peuvent être utilisées pour améliorer l’efficacité des vaccins saisonniers contre la grippe. Il est probable que les nanoparticules du PapMV soient reconnues par le système immunitaire comme un motif moléculaire associé aux pathogènes et que cette reconnaissance favorise l’amélioration de la réponse immunitaire contre les antigènes du vaccin. Dans cette étude, nous avons démontré que les nanoparticules du PapMV seules engendrent une forte réponse immunitaire innée pulmonaire qui conduit à la protection contre une infection létale du virus influenza. Cette stimulation de l’immunité, en plus d’induire durant quelques jours le recrutement de neutrophiles, de monocytes/macrophages et de lymphocytes, induit l’accumulation d’IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 et IP-10 dans les poumons des souris quelques heures après une instillation avec les nanoparticules du PapMV. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules du PapMV stimulent efficacement l’immunité innée pulmonaire et sont donc un excellent candidat pour établir un état antimicrobien non-spécifique dans la muqueuse. De plus, ces données renforcent le potentiel des nanoparticules du PapMV comme adjuvant mucosal. 20 Induction of the innate immune response in the lung by PapMV nanoparticles leads to protection against lethal influenza challenge in mice Claudia MATHIEU, Gervais RIOUX and Denis LECLERC Department Microbiology Infectiology and Immunology, Infectious disease research centre, Laval University, 2705 boul. Laurier, Quebec city, PQ, Canada G1V 4G2 Contact: Phone numbers: (418) 654-2705, Fax numbers: (418) 654-2715, E-mail: [email protected] 21 Abstract PapMV nanoparticles have an adjuvant activity that can be used to improve seasonal flu vaccines (Savard et al., 2011). We also demonstrated that PapMV nanoparticles can be used as a vaccine platform for the induction of a humoral (Denis et al., 2009) or CTL response (Lacasse et al., 2008, Leclerc et al., 2007) to the epitope fused to its surface. It is likely that PapMV nanoparticles can be recognized by the immune system as a pathogen associated molecular pattern (PAMP) that will induce the immune response to the vaccine antigens. In this report, we show that PapMV nanoparticles alone can trigger a strong innate immune stimulation that leads to protection against a lethal influenza challenge. This stimulation, together with the recruitment of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes, triggered the accumulation of IL-6, TNF-α, KC, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, IL-9 and IP-10 in the lungs of mice a few hours following instillation of PapMV nanoparticles. The protection was optimal after two treatments given on a 7-day interval. The duration of the protection was at least 5 days but could be prolonged by repeating the instillation every week for more than 10 weeks. These results suggest that PapMV nanoparticles are efficient to stimulate mucosal innate immunity and therefore are a potential candidate to establish non-specific antimicrobial state at mucosal surfaces. Furthermore, these data strengthen the potential of PapMV nanoparticles as a mucosal adjuvant. 22 Introduction Papaya Mosaic Virus (PapMV) nanoparticles have a tremendous potential as both adjuvant and vaccine platform (Acosta-Ramírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis et al., 2007; Lacasse et al., 2008; Leclerc et al., 2007; Rioux et al., 2012; Savard et al., 2011). PapMV nanoparticles are composed of subunits of PapMV coat protein assembled around a non-coding single-stranded RNA that results in a rod-shaped particle similar to the virus isolated from plants (Tremblay et al., 2006). It was suggested that PapMV is recognized by the immune system as a pathogen-associated molecular pattern (PAMP) and that it can induce lipid raft aggregation, secretion of pro-inflammatory cytokines and up-regulation of co-stimulatory molecules on dendritic cells and macrophages (Acosta-Ramírez et al., 2008; Lacasse et al., 2008). PapMV nanoparticles administered with the trivalent inactivated flu vaccine increased both the cellular and humoral responses to the vaccine antigens, broadened the immune response and increased protection against an heterosubtypic strain of influenza (Savard et al., 2011). PapMV nanoparticles used as a carrier for fused antigens elicited the production of antibodies against the fused epitope (Denis et al., 2007; Rioux et al., 2012) and a protective humoral response against lethal influenza challenge when fused to M2e peptide derived from influenza M2 protein (Denis et al., 2008). PapMV nanoparticles can also induce cross presentation of CTL epitopes to the major histocompatibility complex molecule I (MHC class I) (Leclerc et al., 2007), leading to protection against a viral challenge (Lacasse et al., 2008). The efficacy of the PapMV nanoparticles in inducing adaptive immune responses is probably linked to its ability to trigger the innate immune system. In vivo, activation of the innate immune system can be measured by the secretion of cytokines and chemokines, which act to establish a localized antimicrobial state by the recruitment of immune cells and by the release of toxic compounds (Kohlmeier and Woodland, 2009). We showed that PapMV alone is able to trigger secretion of IL-2, IL-5, IL-6 MIP-1α and KC in the spleen of animals immunized by the subcutaneous route. However, since the mucosal immunity differs from the systemic immune response, it is unknown if PapMV nanoparticles could efficiently trigger an innate immune 23 response in lungs. Mucosal surfaces in the lungs are constantly interacting with the external environment and are equipped with a robust innate immune system to prevent invasion of pathogens (Vareille et al., 2011). A stimulation of lungs with a bacterial lysate or with Toll-like receptor (TLR) ligands is able to induce protection against multiple respiratory pathogens (Abdul-Careem et al., 2011; Clement et al., 2008; Tuvim et al., 2012) Therefore, the working hypothesis of this study was that PapMV nanoparticles alone could trigger an innate immune response in lungs that would induce an antiviral state leading to protection to an influenza challenge (Mitchell et al., 2008). 24 Materials and Methods Production of PapMV nanoparticles PapMV coat proteins and nanoparticles were kindly provided by Folia Biotech (Quebec City, Canada). LPS contamination was always less than 50 endotoxin units (EU) / mg of protein. Animals Seven to eight-week old BALB/C mice were purchased from Charles River Laboratories. All protocols involving animals were approved by the «Comité de Protection des Animaux - CHUQ (CPA-CHUQ)». The approval of this project is found under the authorization number 2010148-1. Intranasal treatments Mice anesthetized with isoflurane were treated intranasally either with 50 µl of a solution of Tris-HCl 10 mM pH 8 containing 60 µg of PapMV nanoparticles or with 50 µl of Tris-HCl 10 mM pH 8 alone (buffer). For the experiment presented on Figure 2-6, the solution of Tris-HCl 10 mM pH 8 contained 50 µg, 100 µg or 150 µg of PapMV nanoparticles. For the experiment presented on Figure 2-5, the solution of Tris-HCl 10 mM pH 8 contained 60 µg of monomers of PapMV nucleocapsid or 3 µg of single-stranded RNA, which corresponds to the amount of monomers and ssRNA found in 60 µg of PapMV nanoparticles, respectively. Bronchoalveolar lavage (BAL) Mice were euthanized by intraperitoneal injection of 100 µl pentobarbital sodium (Euthanyl®, Bimeda-MTC Animal Health Inc., Cambridge, ON). After the trachea was exposed and cannulated, lungs were washed once with 0,6 ml of sterile Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO) for cytokine and chemokine measurements or six times with 0,6 ml of DPBS-0,5 mM EDTA for cell count. An average of 0,5 ml and 3,0 ml of BAL fluid per mouse was 25 recovered respectively. Cells from BAL fluids were pelleted by centrifuging at 1800 rpm on Beckman GS-6R for 10 minutes at 4°C. Cytokine and chemokine in BAL fluids For cytokine and chemokine measurements in BAL, supernatants were frozen at 80°C before analysis with Milliplex Map Mouse Cytokine/Chemokine - Premixed 32 Plex (Millipore Billerica, MA), according to the manufacturer’s instructions. The 32plex was built for detection of Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL9, IP-10, KC, LIF, LIX, M-CSF, MCP-1, MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-2, RANTES, TNF-α and VEGF . The same samples were also analyzed for IFN-α detection with Verikine Mouse Interferon Alpha Elisa (PBL Interferon source), according to the manufacturer’s instructions. For the experiment presented on Figure 2-1, concentrations of cytokines in the BAL of animals treated only with buffer were subtracted from concentrations of cytokines in the BAL of animals treated with PapMV nanoparticles. Immune cells in BAL fluids For investigation of cellular recruitment, total cell numbers in pellets were determined using a hemacytometer. Differential cell counts were obtained from 150 000 BAL cells spun onto slides with a cytocentrifuge (Thermo Scientific, Asheville, NC) before Diff-Quick staining (Siemens, Newark, USA). Two hundred cells were classified based on characteristic morphology observed with an optical microscope and the percentage of specific cell types (neutrophils, lymphocytes, monocytes/macrophages, and eosinophils) was determined. The cell counts of animals treated with the buffer alone were subtracted from the cell counts of animals treated with PapMV nanoparticles. Influenza infection Mice anesthetized under isoflurane were treated intranasally with 50 µl of a solution of DPBS containing 1LD50 or 1,5LD50 of influenza A A/WSN/33 (H1N1). Mice 26 were monitored daily during fourteen days for clinical symptoms such as weight loss, abnormal behavior, ruffled fur and survival. Infections were performed at different time points after the treatments, as indicated in each figure legend. Statistical analysis Concentrations of cytokines and chemokines in BAL fluids collected 6 hours after the last treatment, cellular recruitment and weight losses during infection were analysed with a parametric ANOVA test followed by Tukey's post-test to compare differences among groups of mice. Concentrations of cytokines and chemokines in BAL fluids collected 24 or 48 hours after the last treatment were analysed with Student’s t test with Welch correction. Values of *p < 0.05, **p < 0.01 and ***p < 0.0001 were considered statistically GraphPad PRISM 5.01. significant. Statistical analyses were performed with 27 Results PapMV nanoparticles trigger an early production of IL-6, TNF-α and KC in the lung. To verify if PapMV nanoparticles stimulate mucosal innate immunity, two wellknown pro-inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) and one chemokine (KC) were measured in the lungs of mice treated once or twice at different time intervals with PapMV nanoparticles. Strong and early IL-6, TNF-α and KC secretion was detected for groups of mice treated once and twice with PapMV nanoparticles (Figure 2-1), implying an efficient stimulation of the innate immunity. The levels were all significantly higher in the group treated twice on a 7-day interval (Figure 2-1). This suggests that the time interval between treatments is critical since the optimal interval was found at 7 days. To draw a complete profile of lung stimulation by PapMV nanoparticles, an array of 33 cytokines and chemokines (see material and methods) with different roles and functions were measured at different time points. Since we already detected cytokines and chemokines six hours after the last PapMV nanoparticle treatment and that the optimal interval between two treatments is 7 days (Figure 2-1), we first evaluated the complete cytokine and chemokine profile in these conditions. In addition to IL-6, TNF-α and KC, the cytokine IL-9 and the chemokines MIP-1α, MIP-1β, MIP-2 and IP-10 were significantly secreted in the lungs of mice after stimulation with PapMV nanoparticles (Figure 2-2). We have also evaluated if cytokines and chemokines after two PapMV nanoparticle treatments given in a 7-day interval were found in the BAL fluids collected 24 and 48 hours after the treatments. Of the 33 cytokines and chemokines measured, only KC, IL-9 and IP-10 were detectable 24 hours after the treatments and at lower levels than earlier measurements (Figure 2-3). None of the 33 cytokines and chemokines measured was detected in BAL fluids collected 48 hours after the treatments. Finally, IFN-α was never detected at any time point. 28 Immune cells recruitment in lungs after PapMV nanoparticles stimulation To investigate the presence of cellular recruitment following secretion of cytokines and chemokines induced by PapMV nanoparticles, cells from BAL fluids were counted, and stained to characterise the cell types migrating in the lungs upon inflammation triggered by the PapMV treatments. PapMV nanoparticles induced early recruitment of neutrophils six hours after PapMV treatments (Figure 2-4). The number of neutrophils decreased gradually over time. No difference was found with the control buffer at day 7 post treatments. Recruitment of monocytes/macrophages and lymphocytes appeared 3 days after the treatments and persisted up to day seven. However, monocytes/macrophages outnumbered other cell types on day three and were the most numerous cell type recruited at day five compared to any other time point. Total recruited cells were significantly higher three days after the PapMV treatments compared with six hours and seven days (Figure 2-4), suggesting that stimulation of innate immune defenses are optimal at this time point. Stimulation of lung innate immunity with PapMV nanoparticles protects mice against lethal influenza infection Stimulation of lung innate defenses increases resistance against respiratory infections (Evans et al., 2010c). To confirm that this stimulation can be translated into protection to a viral disease, we evaluated if stimulation by PapMV nanoparticles induced protection against a lethal dose of influenza virus A/WSN/33. Interestingly, treated mice were resistant to infection, as showed by absence of symptoms (Figure S2-1A), 100% survival (Figure S2-1B) and a minimal weight loss as compared with control mice (Figure 2-5). To confirm that the structure of the nanoparticles is important for the trigger of the protection, we also treated mice with the PapMV coat protein (CP) alone or only the ssRNA contained in the nanoparticles. The amount of PapMV CP and RNA used reflected the amount found in the nanoparticles and corresponded respectively to 60µg of PapMV CP and 3µg of ssRNA. None of those treatments were beneficial to induce protection and only the nanoparticles induced the protective innate immunity. We previously demonstrated that two treatments with a low dose of PapMV nanoparticles is necessary to trigger a significant innate 29 immune response (Figures 2-1 and 2-2). To assess the capacity of one treatment to induce protection against influenza infection, mice received increasing doses of 50, 100 and 150µg of PapMV nanoparticles. As expected, the low dose was not protective, but the two higher doses provided a significant protection to the challenge with influenza, as showed by a minimal weight loss (Figure 2-6), absence of symptoms (Figure S2-2A) and 100% survival (Figure S2-2B). These results demonstrate that the increment of the dose can compensate for the number of treatments. We showed that the strongest inflammation was measured in the lung when PapMV nanoparticles were given twice on a 7-day interval (Figure 2-1). To investigate if the period between the treatments affects the level of protection against influenza infection, mice were treated once or twice at different time intervals between the two treatments with PapMV nanoparticles and infected as before three days later with a lethal dose of influenza A/WSN/33. Interestingly, only mice that received treatments separated by seven days significantly showed lower symptoms (Figure S2-3A), complete survival (Figure S2-3B) and maintained their weight throughout the infection compared with mice treated with buffer (Figure 2-7). Mice treated once or twice at other time intervals were not protected from weight loss during infection, indicating the 7-day interval is optimal (Figure 2-7). To evaluate the duration of the protection against influenza infection following PapMV nanoparticle lung stimulation, mice were treated twice on a 7-day interval and infected with influenza at different times after treatments. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle stimulation were fully protected from infection, as showed by the absence of symptoms (Figure S2-4A), complete survival (Figure S2-4B), and complete maintenance of body weight during the infection (Figure 2-8). On the other hand, mice infected seven days after PapMV nanoparticle stimulation showed only partial protection while mice infected ten days after treatments displayed similar weight losses than the control group (Figure 2-8). These results are in agreement with the persistence of the immune cells in the lung 30 presented in Figure 2-4. This suggests that protection against influenza infection persists for at least five days after PapMV nanoparticle lung stimulation. To evaluate if we could extend the protection period by administrating multiple treatments and if repetitive administrations of PapMV nanoparticles would be tolerated, mice were treated 2, 5 or 10 times on a 7-day interval. Full protection was observed for mice that received two, five or ten PapMV nanoparticle treatments (Figure 2-9); they had no symptoms or weight loss neither during infection nor treatments (Figures S2-5A-B). 31 Discussion PapMV nanoparticles have been thoroughly described as strong inducers of adaptive immunity, with their capacity to properly enhance immunogenicity of antigens (Acosta-Ramírez et al., 2008; Denis et al., 2008; Denis et al., 2007; Lacasse et al., 2008; Savard et al., 2011). Here, we first report that these nanoparticles efficiently stimulate lung innate immunity and that this stimulation is sufficient to induce an antimicrobial state that provides complete protection against influenza infection. Early pro-inflammatory cytokine and chemokine secretion was observed following PapMV nanoparticle pulmonary stimulation. The secretion lasted up to twenty-four hours post-stimulation for some of these cytokines, but none were still measurable at forty-eight hours post-stimulation. Upon activation, macrophages can secrete IL-6, KC and TNF-α [8], and could be involved in recognition and response to PapMV nanoparticles considering that alveolar macrophages are initially present in lungs before stimulation (Miyata and van Eeden, 2011). Neutrophils can synthesize and secrete IL-8, MIP-1α, MIP-1β and IP-10 in vitro [7], therefore they could be responsible for the presence of these chemokines in the BAL fluids of mice treated with PapMV nanoparticles. Only two treatments of PapMV nanoparticles given on a 7-day interval elicited both strong cytokine and chemokine secretion and a full protection against lethal influenza infection. These data suggests that the efficacy of the protection depends on the quality of the innate immune stimulation, which is modulated by PapMV nanoparticle treatments interval. It is not clear why a 7-day interval between two successive treatments is important to optimize the protection observed and the levels of cytokines and chemokines in the lung. We detected high levels of IgM directed against PapMV nanoparticles in the blood of mice 7 days after the first treatment, before the administration of the second instillation. It is possible that IgMs, which take usually 7 days to significantly accumulate in the lungs, could activate the complement and contribute to the innate immune response that is triggered by PapMV nanoparticles. 32 Although IFN-α, a member of type I interferon family, is a cytokine produced early following viral infection and is commonly associated with early antiviral responses in the lungs (Kohlmeier and Woodland, 2009), we could not detect it after PapMV nanoparticle stimulation. Tuvim et al. obtained similar results with their lysate of nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) and the combination of TLR ligands, which induced protection to respiratory pathogens in the absence of INF-α (Tuvim et al., 2012). These data suggest that IFN-α is not essential for protection against influenza infection induced by PapMV nanoparticle stimulation. After cytokine and chemokine secretion, the inflammatory reaction induced by PapMV nanoparticle continued with early recruitment of neutrophils in the lungs, followed by the migration of monocytes/macrophages and lymphocytes. The recruitment of these particular cell types is consistent with the specific chemokines secreted after PapMV nanoparticle stimulation. For instance, KC and MIP-2 are both ligands for CXCR2, acting as chemoattractants for neutrophils (Mark et al., 2007), while MIP-1α, MIP-1β and IP-10 are chemokines for monocytes and natural killer (NK) cells (Lee et al., 2009; Lillard, 2002). The presence of multiple chemoattractants for NK cells may imply that the lymphocytes recruited in the lungs following PapMV nanoparticle stimulation could be NK cells, as they meet both criteria of being part of the lymphoid lineage and actors of innate immunity (Janeway et al., 2008). As opposed to the rapid clearance of cytokines and chemokines in the lungs, monocytes/macrophages and lymphocytes persisted up to day seven post-stimulation. These persistent recruited cells are likely to play a role in the protection against subsequent influenza infection, as the duration of the protection correlates with the persistence of neutrophils, monocytes/macrophages and lymphocytes. Many human diseases are associated with neutrophil defects, yet it has been demonstrated that neutrophils are not essential for influenza clearance (Mark et al., 2007). Furthermore, depletion of neutrophils or macrophages does not interfere with protection against bacterial pulmonary infection in a similar model of stimulation of lung innate immunity (Clement et al., 2008). It is unclear if neutrophils are involved in the 33 protection to influenza in our model, however it is important to consider that lung epithelial cells can certainly play an active role in the orchestration of the innate immune cascade as well as in the protection against influenza infection followed by PapMV nanoparticle lung stimulation. Epithelial cells can trigger multiple mechanisms that regulate immunity, for instance by the production of functional molecules and interactions with immunes cells (Vareille et al., 2011). Entire nanoparticles but not its individual components provided protection against influenza infection, suggesting that the unique structure of PapMV nanoparticles is essential for their stimulation of pulmonary innate immunity. Our group has previously shown that subunits of PapMV capsid alone were incapable of inducing humoral responses (Denis et al., 2008). It is possible that the single-stranded RNA hidden in the structure of PapMV nanoparticles interacts with immune receptors, and that the nanoparticle itself is the vehicle to bring the ligand into the proper cellular compartment. Indeed, most receptors that recognizes single-stranded RNA, such as TLR-7, RIG-I and MDA5, are localized in endosomes or in the cytoplasm to favor interactions with viral nucleic acids rather than cellular ones (Heil et al., 2003; Yoneyama et al., 2004). Moreover, promoting localized antiviral state and recruiting inflammatory cells are features of innate recognition of viral components by patterns recognition receptors (PRRs) (Kohlmeier and Woodland, 2009), it is thus reasonable to believe that the nucleic acid contained in PapMV nanoparticles is partly responsible for the activation of lung innate immunity by the nanoparticles. This is currently under investigation in the laboratory. The possibility to rapidly create a transient antimicrobial state by stimulating the respiratory mucosal innate immunity with PapMV nanoparticles is very attractive as a preventive measure to protect towards a new pandemic in the absence of vaccines. Several applications can be considered, like for health workers that need to travel in endemic areas in case of pandemics, or for patients with dysfunctions of adaptive immunity that could benefit from stimulation of mucosal innate immunity to prevent opportunistic infections. 34 PapMV nanoparticles have several advantages compared to other immunostimulants. All parameters of their production is completely controlled, they can be produced at low cost in bacterial expression system, and they appear to be very well tolerated since we have not observed any adverse reactions in animals treated with PapMV nanoparticles. In addition, since PapMV nanoparticles originate from a plant virus, they are naturally biocompatible and biodegradable and not likely to cause side effects due to unwanted interactions with human receptors, (Manchester and Steinmetz, 2011). Rapid clearance of this immunostimulant has been previously showed by our group (Savard et al., 2011), and this is desired to reduce toxic side effects. Finally, the capacity of PapMV nanoparticles to stimulate lung innate immunity strongly suggests that it could also induce mucosal adaptive responses and therefore be tested as a mucosal adjuvant in vaccine preparations. 35 Acknowledgment We would like to thank Folia Biotech for kindly providing the proteins used in the experiments presented. 36 References Abdul-Careem, M., Firoz Mian, M., Gillgrass, A., Chenoweth, M., Barra, N., Chan, T., Al-Garawi, A., Chew, M., Yue, G., van Roojen, N., Xing, Z., Ashkar, A., 2011. FimH, a TLR4 ligand, induces innate antiviral responses in the lung leading to protection against lethal influenza infection in mice. Antiviral Research 92, 346-401. 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Data are represented as mean ± SEM (n=5) for each group. *** p<0.001 for IL-6 and TNF-α concentrations for the 7 days as compared with all other groups. For KC, *** p<0.001 for the 7 days as compared with the 1X PapMV group, ** p<0.01 as compared with the 1 day group and * p<0.05 as compared with the 3 days and the 3 hours groups. Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are se creted in the lungs upon stimulation with PapMV nanoparticles. Lung cytokines and chemokines levels were measured in BAL fluids of Balb/C mice treated by the intranasal route with PapMV nanoparticles once (1X PapMV Nano) or twice on a 7-day interval (2X PapMV Nano), or with buffer. BALs were obtained 6 hours after the last treatment. Data are represented for individual mouse (n = 5) for each group. *** p<0.001, ** p<0.01, * p<0.05 Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine secretion in the lungs. Mice were treated twice as described in Figure 2-2. BALs were harvested 24 hours after the second treatment. Data are represented for individual mouse of each group; IP-10 and IL-9 n = 5, KC n=4. * p<0.05 Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in the lungs. Lung cellular recruitment was quantified in mice treated by the intranasal route with PapMV nanoparticles twice on a 7-day interval (PapMV Nano), or with buffer. Quantitation of cells in BAL fluids was assessed 6 hours, 3, 5 and 7 days after the second treatment. Monocytes/macrophages, lymphocytes and neutrophils were observed on slides from individual mouse for each groups. ** p<0.01 40 Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to a lethal influenza challenge. Weight loss of mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by intranasal route twice on a 7-day interval with PapMV nanoparticles (PapMV Nano), with monomers of PapMV nucleocapsid (PapMV monomers), with the single-stranded RNA contained in PapMV nanoparticles (PapMV ssRNA) or with buffer. Infection was performed three days after the last treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001 for mice treated with PapMV Nano compared with mice treated with PapMV monomers and compared with mice treated with buffer, * p<0.05 for mice treated with PapMV Nano compared with mice treated with PapMV ssRNA. Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dosedependent manner with one treatment of PapMV nanoparticles. Weight loss of mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal route once with 150µg (1X PapMV Nano 150µg), 100µg (1X PapMV Nano 100µg), 50µg (1X PapMV Nano 50µg) of PapMV nanoparticles, or with buffer. Infection was performed three days after the treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001 for mice treated with 150µg of PapMV Nano and *p<0.05 for mice treated with 100µg of PapMV Nano compared with mice treated with buffer. Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is critical for protection to influenza A infection. Weight loss of mice infected with 1,5LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal route once (1X PapMV Nano) or twice with PapMV Nanoparticles on a seven-day interval (2X PapMV Nano 7 days), on a three-day interval (2X PapMV Nano 3 days), on a one-day interval (2X PapMV Nano 1 day), on a three-hour interval (2X PapMV Nano 3 hours) or with buffer. Infection was performed three days after the last treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). ** p<0.01 for mice treated twice with PapMV Nano on a seven-day interval compared with mice treated with buffer. 41 Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term protection to an influenza infection. Weight loss of mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal route with PapMV nanoparticles twice on a 7-day interval or with buffer. Infection was performed (A) one to three days (PapMV Nano -1, -2, -3 day) or (B) three to 10 days (PapMV Nano -3, -5, -7, -10 days) after the PapMV nanoparticle treatments. Mice treated with buffer were infected three days after the last treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). ** p<0.01 for PapMV Nano -3 days, * p<0.05 for PapMV Nano -2 days and *** p<0.001 for PapMV Nano -1 day, all compared with mice treated with buffer. *** p<0.001 for mice infected three or five days after the PapMV Nano treatment compared with mice infected after ten days and compared with mice treated with buffer. Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated and permit to extend the protection period to influenza infection. Weight loss of mice infected with 1LD50 influenza A/WSN/33 was measured for mice pretreated by the intranasal route with two (2X PapMV Nano), five (5X PapMV Nano) or ten (10X PapMV Nano) doses of PapMV nanoparticles, or with buffer. Multiple treatments were given on a 7-day interval and infection was performed three days after the last treatment. Data are represented as mean ± SEM (n=10). *** p<0.001 for mice treated with 2X PapMV Nano, ** p<0.01 for mice treated with 10X PapMV Nano and for mice treated with 5X PapMV Nano compared with mice treated with buffer. 42 Titles of supplementary material Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during a lethal influenza challenge. Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during an influenza challenge. Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days significantly showed A) lower symptoms and B) complete survival during a lethal influenza challenge. Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle stimulation show A, C) no symptom and B, D) complete survival during a lethal influenza challenge. Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low symptoms and B) no mortality during a lethal influenza challenge. 43 Figure 2-1. PapMV nanoparticles induce early lung cytokines and chemokine secretion in the lungs. 44 Figure 2-2. A broad array of cytokines and chemokines are secreted in the lungs upon stimulation with PapMV nanoparticles. 45 Figure 2-3. PapMV nanoparticles induce mild late cytokine and chemokine secretion in the lungs. 46 Figure 2-4. PapMV nanoparticles induce strong recruitment of immune cells in the lungs. 47 Figure 2-5. PapMV nanoparticles lung stimulation induces protection to an influenza lethal challenge. 48 Figure 2-6. Protection against influenza A infection is improved in a dose-dependent manner with one treatment of PapMV nanoparticles. 49 Figure 2-7. The interval between the treatments with PapMV nanoparticles is critical for protection to influenza A infection. 50 Figure 2-8. Treatments with PapMV nanoparticles provide a short term protection to an influenza infection. 51 Figure 2-9. Multiple treatments with PapMV nanoparticles are well tolerated and permit to extend the protection period to influenza infection. 52 Figure S2-1. Mice treated with PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during a lethal influenza challenge. 53 Figure S2-2. Mice treated once with high doses of PapMV nanoparticles show A) no symptom or B) no mortality during an influenza challenge. 54 Figure S2-3. Only mice that received treatments separated by seven days significantly showed A) lower symptoms and B) complete survival during a lethal influenza challenge. 55 Figure S2-4. Mice infected 1, 2, 3 or 5 days following PapMV nanoparticle stimulation show A, C) no symptom and B, D) complete survival during a lethal influenza challenge. 56 Figure S2-5. Mice treated multiple times with PapMV nanoparticles show A) low symptoms and B) no mortality during a lethal influenza challenge. 57 Chapitre 3 : Discussion L’accumulation de cytokines, de chimiokines et le recrutement de neutrophiles, de monocytes/macrophages et de lymphocytes dans les poumons des souris ont permis d’établir l’efficacité des nanoparticules du PapMV à stimuler l’immunité innée pulmonaire. Bien que la mesure de ces médiateurs soit une preuve robuste d’une stimulation de nanoparticules l’immunité enclenchent innée, cette aucune étude n’explique cascade. Des collaborateurs comment les caractérisent présentement les effets de l’interaction des nanoparticules avec des cellules immunes isolées du sang et avec des modèles murins, toutefois il serait intéressant d’approfondir également le modèle pulmonaire. Les premières cellules à rencontrer et à réagir contre les nanoparticules du PapMV dans le poumon des souris sont les cellules résidentes, principalement les cellules épithéliales et les macrophages. Une lignée de cellules épithéliales murines pourrait être stimulée avec les nanoparticules du PapMV et les molécules antimicrobiennes, les cytokines et les composés réactifs de l’oxygène pourraient être mesurés. Cette expérience, en plus de démontrer que l’épithélium respiratoire réagit aux nanoparticules, pourrait établir la part de ces cellules dans la stimulation de l’immunité innée mesurée in vivo. Les mêmes techniques pourraient être utilisées pour tirer des conclusions similaires concernant des macrophages isolés de poumons de souris. Des lymphocytes ont été recrutés aux poumons après une stimulation avec les nanoparticules du PapMV, et il serait logique de croire que ces lymphocytes soient des cellules NK, puisqu’elles participent activement à l’immunité innée. Une expérience en fluorescence utilisant des marqueurs spécifiques des cellules NK sur des cellules provenant de lavages broncho-alvéolaires pourrait clarifier l’identité de ces cellules. La stimulation de l’immunité innée de la muqueuse respiratoire par les nanoparticules du PapMV établi un état antimicrobien qui permet de protéger contre une infection au virus de l’influenza. Le nombre de traitements de nanoparticules, l’intervalle entre chacun et le moment de l’infection ont été optimisés, et il serait pertinent de reproduire ces études dans un modèle plus près de l’humain, comme le furet. La protection induite par la stimulation de l’immunité pulmonaire avec les 58 nanoparticules n’a été évaluée que contre le virus de l’influenza, et des études contres d’autres pathogènes respiratoires, autant des bactéries que des virus ou des mycètes, pourraient élargir notre compréhension sur cette protection non spécifique. Il est évident que les conditions expérimentales déterminées dans l’étude avec influenza pourraient ne pas s’avérer optimales contre d’autres pathogènes respiratoires. Finalement, pour déterminer le rôle des cellules immunes recrutées aux poumons dans la protection, des déplétions individuelles de macrophages, de neutrophiles et de lymphocytes pourraient être effectuées dans des modèles murins avant l’infection à influenza. Les nanoparticules du PapMV ont été largement étudiées pour leur effet d’adjuvant, et les expériences présentées dans ce document ont permis de confirmer la capacité des nanoparticules à stimuler l’immunité innée mucosale. Ainsi, il s’est avéré logique d’évaluer la capacité d’adjuvant des nanoparticules dans un modèle de vaccination pulmonaire. Mes travaux ont montré que seul l’ajout des nanoparticules au vaccin trivalent contre l’influenza administré par voie intranasale permettait aux souris vaccinées d’être protégées complètement contre une infection létale avec ce pathogène (Figure 3-1), suggérant que les nanoparticules du PapMV sont un excellent candidat comme adjuvant dans les vaccins muqueux. 59 Figure 3-1 : Les nanoparticules du PapMV comme adjuvant mucosal Des souris ont été vaccinées par voie intranasale (i.n.) ou sous-cutanée (s.c.) avec le vaccin trivalent contre l’influenza (Flu) seul ou en présence de nanoparticules (PapMV), et ont ensuite été infectées 14 jours plus tard avec une souche d’influenza différente de celles présentes dans le vaccin. Le poids des souris a été mesuré durant 14 jours post-infection. Pour le groupe PapMV + Flu i.n., p<0.001 comparé au groupe buffer i.n. et p<0.01 comparé au groupe Flu i.n. La possibilité de créer rapidement un état antimicrobien transitoire par la stimulation de l’immunité innée des muqueuses respiratoires par les nanoparticules du PapMV pourrait devenir un moyen préventif en absence de vaccins. Lorsque des agents de la santé doivent se rendre dans une zone endémique pour identifier par exemple la souche circulante du virus de l’influenza et qu’aucun vaccin n’est disponible, il serait possible de croire que l’inhalation des nanoparticules du PapMV puisse diminuer les risques d’infection. Certains patients souffrant de dysfonctionnements du système immunitaire adaptatif pourraient également bénéficier d’une stimulation de l’immunité innée des muqueuses dans le but d’éviter les infections opportunistes. Finalement, cette stratégie pourrait être incorporée dans la lutte contre le bioterrorisme. Dans une situation où une telle attaque est déclenchée, l’identité de l’agent pathogène est souvent inconnue, et même si des vaccins contre tous les 60 pathogènes étaient disponibles en quantité suffisante pour la population, la réponse immunitaire adaptative prendrait des semaines à se développer (Evans et al., 2010c). Évidemment, le potentiel de protection d’une stimulation de l’immunité des muqueuses respiratoires est beaucoup plus grand contre des infections des voies respiratoires que contre un pathogène dont le site de pénétration de l’organisme est différent. Également, le choix d’un composé immunostimulant pour ce genre d’applications doit tenir compte de plusieurs facteurs. La vaste majorité des études documentant le phénomène de protection non-spécifique ont été réalisées avec des modèles animaux, ce qui n’écarte pas que le stimulant puisse avoir des effets toxiques sur l’ensemble de l’organisme. Il est donc fondamental de connaître la composition et la nature du stimulant avant son administration chez l’humain. En ce sens, les nanoparticules du PapMV possèdent beaucoup d’avantages par rapport à d’autres immunostimulants. Tous les paramètres de production des nanoparticules sont complètement contrôlés et peu couteux, et la production est simple, rapide et sans danger. Puisque ces nanoparticules sont d’origine biologique et infectent uniquement certains végétaux, elles sont naturellement biocompatibles et biodégradables, et peu susceptibles de causer des effets secondaires dus à leur interaction avec des récepteurs humains (Manchester and Steinmetz, 2011). La disparition rapide d’un immunostimulant est préférable pour éviter d’autres effets secondaires chez l’humain, et nous avons démontré que les nanoparticules du PapMV sont rapidement dégradées in vivo (Savard et al., 2011). 61 Chapitre 4 : Conclusion Les projets décrits dans ce mémoire ont permis de démontrer que les nanoparticules du PapMV ont une capacité intrinsèque à stimuler l’immunité innée des muqueuses. Cette stimulation a permis de protéger des souris contre une infection létale causée par le virus de l’influenza. Le potentiel d’adjuvant des nanoparticules du PapMV a déjà été largement documenté et les présents travaux apportent une compréhension nouvelle quant aux mécanismes par nanoparticules. lesquels Ainsi, des nous réponses pouvons immunitaires maintenant sont considérer induites par ces l’utilisation des nanoparticules du PapMV comme adjuvant dans des vaccins administrés par la voie mucosale. Cette voie est de plus en plus favorisée pour l’administration de vaccins car elle génère une réponse immunitaire robuste et efficace contre de nombreux pathogènes respiratoires ou transmissibles sexuellement. Il est clair que l’ajout des nanoparticules du PapMV dans différents vaccins pourrait être extrêmement bénéfique pour obtenir des taux élevés de protection. Ces travaux ont également mis en évidence la capacité des nanoparticules du PapMV à induire un état antimicrobien non-spécifique qui permet de protéger les voies respiratoires contre l’invasion du virus influenza. Cette propriété des nanoparticules est extrêmement intéressante puisqu’elle pourrait être utilisée pour prévenir des infections respiratoires dans des zones pandémiques, chez des personnes souffrant de troubles du système immunitaire et pour contrer le bioterrorisme. Bref, les nanoparticules du PapMV sont un outil polyvalent : elles peuvent être utilisées comme adjuvant pour augmenter les réponses immunitaires envers des antigènes, elles peuvent servir de plateforme vaccinale et elles peuvent induire une protection non-spécifique contre l’influenza en absence de vaccin. Il est évident que le potentiel des nanoparticules du PapMV dépasse le domaine de l’immunologie, et qu’elles pourraient être utiles dans le combat contre certains cancers et des maladies telles que l’asthme. 62 Bibliographie Abdul-Careem, M., Firoz Mian, M., Gillgrass, A., Chenoweth, M., Barra, N., Chan, T., Al-Garawi, A., Chew, M., Yue, G., van Roojen, N., Xing, Z., Ashkar, A., 2011. FimH, a TLR4 ligand, induces innate antiviral responses in the lung leading to protection against lethal influenza infection in mice. Antiviral Research 92, 346-401. 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