L`importance des protéines DEAD-box
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Projet de recherche 2006/2007 L’importance des protéines DEAD-box (RNA hélicases ATPdépendantes) dans l’export des ARNm : interactions entre DDX19A et les facteurs d’export Roberto MARTIN Fabrice LE POGAM Sommaire I°) INTRODUCTION : ............................................................................................................ 3 - La maturation des ARNm :....................................................................................... 3 - Le rôle des speckles (Interchromatin Granule Clusters) : ..................................... 5 - L’export des ARNm au niveau des pores nucléaires :............................................ 5 - Couplage entre transcription et transport : ............................................................ 7 - Nouvelles approches pour dévoiler la dynamique de l’expression des gènes :..... 7 II°) Résultats :........................................................................................................................... 8 1°) Fonction de la protéine Dbp5 :...................................................................................... 9 2°) Activité ATP-dépendante de la protéine Dbp5 :........................................................ 11 3°) Intéraction entre Dbp5 et les filaments du pore nucléaire : la protéine Gle1......... 11 4°) Interaction génétique entre la voie des InsP et l’export des ARNm :...................... 13 - InsP6 se fixe directement sur la partie CTD de Gle1, ce qui augmente l’activité de Dbp5 : ..................................................................................................................... 13 - InsP6 régule l’interaction entre Dbp5 et Gle1 in vivo : ......................................... 14 5°) Intéraction entre Dbp5 et les mRNP : Mex67............................................................ 15 III°) Projet de recherche : ..................................................................................................... 16 1°) Rappel sur les DEAD-box protéines et en particulier sur Dbp5 :............................ 17 - Les DEAD-box protéines :....................................................................................... 17 2°) Modèle d’étude : ........................................................................................................... 18 3°) Etude de l’interaction entre DDX19A (Dbp5 dans la levure) et les protéines associé au mRNP : TAP (Mex67 dans la levure), PAB1 et ALY (Yra1 dans la levure) ........... 19 A°) Technique d’immunoprécipitation : ...................................................................... 19 - Expérience : .............................................................................................................. 20 - Stratégie : .................................................................................................................. 20 - Résultats : ................................................................................................................. 20 B°) BRET : ...................................................................................................................... 20 - Expérience : .............................................................................................................. 21 - Stratégie : .................................................................................................................. 21 - Résultats : ................................................................................................................. 21 4°) Etude des motifs indispensables entre DDX19A et les protéines TAP puis PABP1 et ALY (s’il y a eu interaction) :........................................................................................ 22 - Stratégie : .................................................................................................................. 22 - Expérience : .............................................................................................................. 23 - Résultats : ................................................................................................................. 24 5°) Injection d’ARNm fluorescents pour évaluer le rôle de la protéine DDX19A dans l’export : .............................................................................................................................. 24 - Stratégie : .................................................................................................................. 24 - Expérience : .............................................................................................................. 24 - Résultats : ................................................................................................................. 25 IV°) Conclusion et perspectives : .......................................................................................... 25 I°) INTRODUCTION : Dans les cellules eucaryotes, les sites de transcription (noyau) et de traduction (cytoplasme) sont séparés par une membrane nucléaire. Le transport des ARN entre le noyau et le cytoplasme via les pores nucléaires est un processus essentiel pour l’expression des gènes. Ces dernières années, l’étude des mécanismes de transport des différentes classes d’ARN a nettement augmenté [1] et [2]. Ces études ont montré que le mécanisme d’export des ARNm est beaucoup plus compliqué que ceux des autres ARN. - La maturation des ARNm : La plupart des ARNm sont transcrit sous forme de précurseur (pré-ARNm) qui doivent être maturés avant l’export vers le cytoplasme (Figure 1). Il y a un intense débat pour discuter si cette maturation se produit après ou pendant la transcription [3]. La maturation du messager inclut l’ajout d’un cap en 5’, l’épissage des introns et la poly-adénylation en 3’. La transcription des ARNm est catalysée par l’ARN polymérase II localisée dans le noyau. Le domaine C-terminal (CTD) de la grande sous-unité de cette polymérase recrute des facteurs intervenant dans la maturation des ARNm. De plus, des composants de la machinerie de capping et de polyadénylation interagissent avec ces régions CTD [4], ce qui prouve que ces processus moléculaires sont coordonnés. Le capping se produit pendant la transcription, dès que le néotranscrit atteint une longueur de 20-25 nucléotides, il s’agit de l’ajout d’un GpppG en 5´. Une fois dans le cytoplasme, des protéines comme iEF4 ou encore le CBC (Cap-Binding Complex) reconnaîtront le cap est permettront l’interaction avec le ribosome. La polyadénylation est commune à tous les mRNA à l’exception de ceux codant pour les histones. Le pré-mRNA néo-transcrit possède un signal de polyadénylation qui sera reconnu par au moins deux protéines, en étroite collaboration avec le domaine C-terminal de la RNA polymérase II. En effet la machinerie de polyadénylation est peu caractérisée et on estime qu’il y a intervention d’une douzaine de protéines dans ce processus. Les facteurs d’épissage, qui se trouvent concentrés au niveau des IGC (Interchromatin Granule Clusters ou Speckles) sont recrutés dans les points de transcription. L’épissage consiste à l’excision des régions non-codantes (introns) du pré-mRNA pour obtenir à la fin un mRNA fonctionnel composé uniquement d’exons. Il peut faire intervenir deux molécules de pré-mRNA différentes (on parle alors de trans-splicing) ou uniquement un pré-mRNA (cissplicing). Cette réaction est catalysée par le spliceosome, un complexe enzymatique constitué de plusieurs protéines (plus de 300) et de 4 ribonucléoprotéines (U1, U2, U5 et U4/U6), [5]. L’épissage commence après la reconnaissance par ce complexe des séquences consensus caractérisant les jonctions exon/intron dans le pré-mRNA, définies comme les sites 3’ et 5’ d’epissage. Le site d’épissage 5’ est caractérisé par une séquence de 8 nucléotides AG\GURAGU, où \ représente la liaison exon/intron. Le site d’épissage 3’ contient 3 séquences consensus : le point de branchement, une région riche en pyrimidine et le site de splicing YAG\G. En plus de ce mécanisme, on a identifié d’autres éléments intervenant dans l’epissage : exonic splicing silencers and enhancers, intronic splicing silencers and enhancers. Figure 1 : Schéma général de l’export des ARNm vers le cytoplasme Fixation d’un complexe lors de la transcription (THO), composé des protéines Hpr1p, Tho2p, Mft1p, Thp2p [6]. Renommé TREX (Transcription mRNA Export compleXe) par [7]. Car d’autres protéines interagissent avec des facteurs liés à l’export des ARNm (Aly, UAP56). Puis export du mRNp au niveau du NPC à l’aide de Dbp5. - Le rôle des speckles (Interchromatin Granule Clusters) : Les speckles composés d’un ou plusieurs domaines SC35 [8] possèdent la machinerie biochimique nécessaire à la transcription (ARN pol II, WT1), l’épissage (SR protéine : SC35, ASF/SF2 ; snRNPs) et l’export des ARNm (Aly/REF). Il y a plus de 75 protéines présentent dans les speckles [9]. Bien que concentrées au niveau des domaines SC35, ces molécules sont aussi distribuées dans tout le noyau [10]. La forte concentration de facteurs protéiques nécessaires aux différentes étapes de l’expression des gènes au niveau des speckles facilite un rapide recyclage et / ou réassemblage des complexes macromoléculaires nécessaire pour une expression efficace des gènes hyperactif. Des expériences où l’on injecte des pré-ARNm marqués par fluorescence dans le noyau montrent, qu’après transcription, les mRNP s’adressent vers les speckles [11]. Le domaine SC35 est le centre d’activité de l’expression des gènes. L’hypothèse est que la transcription, l’épissage et la maturation des ARNm ont lieu à la périphérie des speckles. Puis les ARNm vont être stockés à l’intérieur des domaines SC35. Il y a alors une vérification de l’ARNm et puis export, s’il est bien mature, vers le cytoplasme via les pores nucléaires. En effet, il a été démontré que des ARN-polyA immobiles sont localisés au niveau des speckles (mais leur rôle reste inconnu). De plus, une inhibition des gènes qui synthétisent les protéines de transport engendre une accumulation des ARNm au niveau du domaine SC35 des speckles. - L’export des ARNm au niveau des pores nucléaires : Avant la traduction, l’ARNm doit franchir la membrane nucléaire qui est constituée de nombreux complexes : les pores nucléaires (Figure 2). L’identification de plusieurs facteurs nécessaires au transport nucléoplasmique des ARNm a aidé à mieux comprendre ce mécanisme. Des approches génétiques et biochimiques sur la levure (S.cerevisiae et S.pombe) ont permis d’identifier les protéines requises pour l’export des ARNm. Les protéines intervenant dans l’export des ARNm (Yra1p/REF, PABP) sont recrutés par les ARNm pendant la transcription. La découverte du TREX (transcription ARNm export complexe) aide à éclaircir ce mécanisme. Des protéines appartenant à ce complexe ont été identifiées. C’est le cas des protéines Sub2p (composant du spliceosome) et Yra1p (protéine de fixation à la queue polyA de l’ARN). Pendant la transcription, des composants du TREX sont recrutés et facilitent l’export des néo-transcrits. De même, on a localisé des orthologues des gènes codant pour ces protéines dans toutes les cellules eucaryotes [12], ce qui est la preuve que ce mécanisme est bien conservé dans l’évolution. Par exemple : l’adaptateur d’export des ARNm Yra1p/REF (Aly/REF chez les mammifères) ou le récepteur hétérodimère Mex67p–Mtr2p (TAP/NXF1–p15/NXT1 chez les mammifères). De plus, des résultats suggèrent qu’il y aurait plus de facteurs impliqués, jouant le rôle d’adaptateurs, dans l’interaction entre TAP/NFX1 et les ARNm chez les mammifères. Avant l’export, l’ARNm se trouve compléxé à d’autres protéines et de ce fait il adopte des structures particulières en tant que mRNP. Le passage à travers le pore nucléaire requiert la réorganisation de la molécule d’ ARNm par des processus energie-dépendants. A ce niveau les RNA hélicases, enzymes ATP-dépendantes capables de défaire les structures secondaires de l’ARNm, pourraient jouer un rôle primordial. Dans le mécanisme d’export des ARNm, le rôle de la protéine Dbp5 semble particulièrement interessant. Il s’agit d’une RNA hélicase appartenant à la famille des DEADbox proteins qui a été trouvé au niveau du complexe de pores nucléaires [13]. Elle est capable d’interagir avec les mRNP, la machinerie de transcription [14] et des protéines appartenant au complexe du pore nucléaire [15]. Tout celà nous fait penser que Dbp5 pourrait intervenir directement dans l’export des ARNm, peut-être en jouant le rôle de chaperone. Cytoplasme Figure 2 : Export des ARNm au niveau des pores nucléaires. Dbp5 interagit avec les filaments cytoplasmiques des pores nucléaires (NPC). Et plus précisément avec les protéines Nup42 et Gle1. Puis Dbp5 accompagne l’ARNm à travers le pore nucléaire. Et après le passage de l’ARNm dans le cytoplasme, une partie des facteurs protéiques d’export est libérée. Ce transport pourrait être énergie dépendant. - Couplage entre transcription et transport : Des études récentes ont montré que le Cap et la queue polyA facilitent l’export des ARNm. En effet, il a été montré qu’en absence de Cap et/ou de queue polyA, l’export des ARNm est beaucoup plus lent. [16] ont montré le couplage entre transcription et transport. En effet, après injection dans le noyau d’ARNm fluorescents possédant ou non des introns, on a constaté que les ARNm qui subissent l’épissage sont très rapidement exportés vers la cytoplasme, tandis que les ARNm ne possédant pas d’intron (et donc pas epissés) sont exportés très lentement. Ces résultats suggèrent que l’étape d’épissage des pré-ARNm est étroitement lié à l’export des ARNm. D’autre part, l’activation transcriptionnelle de certains gènes provoquent leur déplacement à la périphérie nucléaire, où ils interagissent avec les composants du complexe du pore nucléaire, tandis que certains gènes s’expriment en restant à l’intérieur du noyau. - Nouvelles approches pour dévoiler la dynamique de l’expression des gènes : La régulation de l’expression génique est caractérisée grâce à des approches biochimiques et moléculaires, sans prendre en compte les restrictions spatiales que présente l’architecture nucléaire. De ce fait les lois biophysiques du milieu où se trouve le gène exprimé ainsi que la possible existence d’une structure nucléaire peuvent influencer l’expression des gènes. En effet on étudie la distribution et le mouvement des ARNm dans le noyau par des hybridations in situ, en utilisant des sondes fluorescentes polyT. Mais de nombreuses difficultés sont à surmonter telles que la spécificité de l’hybridation de la sonde avec les queux polyA, les problèmes de phototoxicité pour la cellule et les phénomènes de photoblanchiement, ce qui complique l’interprétation des résultats. De plus ces études se font sur des modèles cellulaires bien définis : cellules de levure et oocytes de Xénope. Les études de mouvement d’ARN sur des cellules d’Eucaryotes supérieurs ne sont possibles qu’après injection de la sonde fluorescente dans le noyau, due aux difficultés pour transformer de façon stable ces cellules avec les constructions d’intérêt sans perturber le système. La tendance actuelle est d’utiliser de nouvelles approches in vivo pour étudier les activités transcriptionnelles. La détection se fait souvent par fluorescence et avec une instrumentation parfaitement adaptée, ce qui permet de caractériser en temps réel l’influence de l’environnement nucléoplasmique sur l’expression des gènes et le mouvement des ARNm . De cette façon on a pu observer la fréquence et la durée de la transcription d’un gène. De même on a pu constater le passage des mRNA à proximité les speckles après transcription et avant l’export vers le cytoplasme. II°) Résultats : Durant l’expression des gènes, les ARNm sont associés à des protéines, le complexe ainsi formé est appelé RNPm (pour ribonucléoparticule). La plus part des protéines qui se fixent sur l’ARNm sont recrutées pendant la transcription. Puis les RNPm sont exportés vers le cytoplasme. Pour cela, ils doivent traverser la membrane nucléaire au niveau des NPC. Une protéine essentielle à l’export est la DEAD-box hélicase Dpb5 qui se fixe sur les filaments du complexe du pore nucléaire (NPC) par l’intermédiaire de Gle1 et du phosphate inositol InsP6. Dans la levure, la machinerie enzymatique prévue pour moduler le remodelage de l’ARNm pendant son export est activée par des interactions critiques qui ont lieu au niveau des filaments du NPC (Figure 3). Les facteurs clés de ce processus sont Dbp5, Gle1 (un composé du filament cytoplasmique du NPC) et InsP6. Figure 3 : Interaction entre Dbp5 et l’extrémité du filament cytoplasmique du NPC. Le filament cytoplasmique est composé des protéines Nup. Gle1 et InsP6 vont stabiliser l’interaction de Dbp5 avec le filament cytoplasmique. 1°) Fonction de la protéine Dbp5 : Des mutants thermosensibles pour la protéine Dbp5 ont été isolés grâce à des méthodes de mutagénèse dirigée par PCR et plasmid-shuffling (Figure 4). Les effets de cette mutation sont analysés. Figure 4 : Mutations introduites dans la protéine Les motifs caractéristiques des protéines appartenant à la famille des hélicases sont surlignés en noir (I, Ia, II, III, IV, V et VI). On a ensuite testé les effets de la mutation dbp5 sur la croissance cellulaire. Ces courbes représentent la croissance des souches DBP5 (témoin), dbp5-1 et dbp5-2 dans du milieu YPD à 30ºC ou à 37ºC. La croissance cellulaire a été déterminé par la densité optique à 600 nm. La flèche indique le moment où se produit l’augmentation de la température (Figure 5). Figure 5 : Effets de la mutation Dbp5 sur la croissance On observe bien qu’à peine deux heures suite au passage à 37ºC, les mutants thermosensibles dbp5 arrêtent la croissance et rentrent en phase stationnaire. Ces mutants dbp5 sont thermosensibles. La mutation sur Dbp5 a aussi des effets sur la synthèse protéique. Ce gel SDS-PAGE révèle la synthèse de protéines des 4 souches de levure. La révélation se fait grâce à la coloration de Bradford (Figure 6). Figure 6 : Effets de la mutation dbp5 sur la synthèse protéique On voit bien que la synthèse protéique des mutants dbp5-1 et dbp5-2 (cultivés à 37ºC) est plus faible que pour la souche WT à la même température. La souche ded1-199 est un mutant pour une autre Dead/Box protein qui a été incubée à 15ºC : la synthèse protéique est nulle. Dbp5 est une protéine hautement conservée dans l’évolution (Figure 7). La protéine est présente dans la levure, l’oeuf de Xénope (stade IV), la Drosophile, la souris (PC-12) et les cellules humaines (Hela, Jurkat). Figure 7 : Immunoblot de Dbp5 Cet immunoblot détecte la présence de la protéine Dbp5 chez plusieurs lignées cellulaires. La détection se fait par un anticorps polyclonal anti-Dbp5 couplé à un deuxième anticorps avec activité peroxidase. 2°) Activité ATP-dépendante de la protéine Dbp5 : La fixation de Dbp5 sur l’ARN a été analysée par mesure de changement de fluorescence (Figure 8). Figure 8 : Etude de la fixation de Dbp5 sur l’ARN A.Expérience de polarisation de fluorescence en présence d’AMP 1mM avec des concentrations croissantes en Dbp5. B. Une sonde P32 ARN db contenant un extrémité 5’ARN sb est incubé avec un excès de Dbp5 en présence ou en absence d’ATP 1mM pendant 10 min à 30°c. Puis un gel de polyacrylamide en condition natif est réalisé. Dbp5 seul est très peu capable de fixer les ARN qu’ils soit double brin (rond noir) ou simple brin (rond blanc). Par contre, Dbp5 en présence d’ATP est capable de dérouler l’ARN double brin. Cela signifie que l’ATP est nécessaire à l’activité de Dbp5. Ces résultats suggèrent également que la fixation de Dbp5 sur l’ARN est passagère et que Dbp5 est rapidement dissocié de l’ARN. 3°) Intéraction entre Dbp5 et les filaments du pore nucléaire : la protéine Gle1 Dbp5 seul ne peux pas stabiliser la fixation de l’ARNm ou hydrolyser l’ATP en condition physiologique. Des études [17] et [18] ont montré que des composants se trouvant associés des filaments du pore nucléaire, Gle1 et InsP6, régulent l’activité de Dbp5. Une mutation de Gle1 engendre une forte déficience dans l’export des ARNm. - Le domaine CTD de Gle1 active Dbp5 in vitro : Pour mieux caractériser le rôle de Dbp5 dans l’export des ARNm, des mesures d’activité enzymatique [14] ont réalisé dans la levure S. cerevisiae (Tableau 1). Tableau 1 : Gle1 stimule Dbp5 La partie CTD de Gle1 augmente considérablement l’activité ATPasique de Dbp5 (Figure 9). Elle diminue 6 fois le KM de Dbp5 pour l’ATP et elle augmente 4 fois le kcat. Cela engendre une augmentation globale de 27 fois de l’efficacité catalytique (kcat/KM) de Dbp5. Les effets de Gle1 sur l’activité de Dbp5 en présence d’une concentration saturante en ARN a aussi été testé. Et il a été montré que ces deux stimulateurs ont un effet synergique sur l’activité ATPasique de Dbp5 (Figure 10). Une expérience de titration révèle qu’en présence de Gle1, la concentration d’ARN nécessaire pour activer Dbp5 diminue considérablement. On observe une diminution de 25 fois pour le Kstim de Dbp5 pour les ARNm. Ce qui indique que Gle1 augmente grandement l’affinité de Dbp5 pour l’ARNm. Figure 9 : Gle1 stimule l’activité ATPasique de Dbp5 Test d’activité avec 2 µM de Dbp5, 1µg d’ARN et 2 µM de Gle1 en présence de concentration croissante en ATP. 4°) Interaction génétique entre la voie des InsP et l’export des ARNm : La voie métabolique qui produit InsP6 a été découverte par un criblage génétique. Cette voie régule la fonction de Gle1. Bien que non essentiel à la survie des levures, l’importance des InsP6 dans l’export des ARNm a été mise en évidence car elle augmentait la mortalité des cellules Dbp5 déficientes. InsP6 est aussi essentiel à la survie cellulaire en condition de stress (haute concentration de sel, haute température et carence de certains nutriments [19]. - InsP6 se fixe directement sur la partie CTD de Gle1, ce qui augmente l’activité de Dbp5 : [14] et [15] ont montré que l’activité ATPase ARN dépendant de Dbp5 est stimulé par l’interaction avec Gle1 et InsP6. Cette interaction réduit également la concentration en ATP et ARN nécessaire à l’activation optimale de Dbp5. Ce qui engendre un gain d’activité de Dbp5 de plus de 400 fois par rapport à Dbp5 seul (Tableau 2). Tableau 2 : Gle1 et InsP6 stimule Dbp5 La fixation de InsP6 sur Dbp5 et l’interaction entre les différents partenaires de Dbp5 a été caractérisée par chromatographie d’exclusion (Figure 10). Aucune interaction entre Dbp5 et InsP6 n’a été observée alors que l’on observe une coélution entre la partie CTD de Gle1 et InsP6 indiquant la formation d’un complexe stable in vitro. Figure 10 : Gle1 et InsP6 forme un complexe stable in vitro Les protéines ont été quantifiées par test de Bradford. La présence d’ARN est indispensable pour que l’on observe l’effet de InsP6 sur le gain d’activité de Dbp5 pour le turnover de l’ATP (Figure 11). Figure 11 : ARN indispensable a l’augmentation d’activité de Dbp5 liée à InsP6 Test d’activité avec 1 µM de Dbp5, 2 µM de Gle1 avec des concentrations croissantes d’ATP en présence ou en absence de 50 µg d’ARN. - InsP6 régule l’interaction entre Dbp5 et Gle1 in vivo : Des études biochimiques [1], suggèrent que InsP6 stabilise l’interaction entre Dbp5 et Gle1 in vivo. L’interaction entre Gle1 et Dbp5 a été analysée par la technique de double hybride dans des cellules WT (sauvage) et des cellules mutante pour la synthèse de InsPs (Figure 12). Figure 12 : Effets des cellules mutantes InsPs sur l’interaction entre Dbp5 et Gle1 plc1 et ipk2 : mutantes pour InsP5 et InsP6 ; ipk1 et kcs1 : mutantes pour InsP7 et InsP8. Gle1 interagit fortement avec Dbp5 dans les cellules WT. Alors que l’on observe une forte diminution de cette interaction dans les cellules mutantes pour InsP5 et InsP6. Les cellules mutantes pour InsP7 et InsP8 n’ont pas d’effet sur l’interaction entre Dbp5 et Gle1. Ce qui signifie que InsP5 et InsP6 stabilise fortement cette interaction. Une étude de InsP5 sur l’activité de Dbp5 est ensuite réalisée. On observe un gain d’activité mais beaucoup moins important que InsP6 (Figure 13). Figure 13 : Activité ATPase de Dbp5 en présence de Gle1 et InsP5 ou InsP6. Test d’activité avec : Dpb5 : 500nM, ATP : 1 mM, ARN : 1 µM, Gle1 250 nM et InsP6 ou InsP5 : 100 nM. Dpb5, Gle1 et InsP6 ne sont pas localisé exclusivement dans le NPC. Dbp5 se déplace aléatoirement entre le noyau et le cytoplasme. Il interagit avec les facteurs du complexe d’élongation (TFIIH) et Yra1, une protéine du mRNP qui augmente l’export des ARNm. Gle1 se déplace également entre le noyau et le cytoplasme. Quant à InsP6, elle est capable de diffuser dans toute la cellule. 5°) Intéraction entre Dbp5 et les mRNP : Mex67 De nombreuses protéines (facteurs d’export) s’associent aux ARNm pour former la mRNP qui traversera le pore nucléaire. Des protéines comme Mex67 (TAP chez les mammifères) jouent le rôle d’adaptateurs et servent de lien direct entre le mRNP et les protéines du NPC. La plupart des protéines qui se fixent sur l’ARN retourne dans le noyau après le passage du NPC pour être recyclées et réutilisées pour l’export de nouveaux transcrits [20]. Les DEADbox protéines (Dbp) utilisent l’hydrolyse de l’ATP pour dissocier les protéines du mRNP [21]. D’autres études [22] et [23], ont montré que Dbp5 déplace les protéines de l’ARN. Dbp5 change la composition en protéines du mRNP au cours de l’export (Figure 14). Une étude récente [24], a montré que Dbp5 régulait la fixation et la libération de Mex67. Figure 14 : Représentation schématique du remodelage d’un mRNP par Dbp5. Dbp5 associé au mRNA est recruté par les filaments cytoplasmique, ce qui permet le passage du NPC et le relarguage de certaines protéines associées au mRNA. Dans ces travaux, les auteurs démontrent l’interaction entre Dbp5 et une protéine associée aux mRNP, la protéine Mex67 (protéine TAP chez les humains). Pour cela, Des extraits cellulaires ont été préparés à partir de levures exprimant les protéines de fusion Dbp5-ProtA et Mex67-GFP. La protéine Dbp5-ProtA a ensuite été purifiée à l’aide d’une colonne d’affinité utilisant des IgG et des immunoblot ont été réalisés avec un anticorps anti-GFP (Figure 15). Extrait cellulaire total Après élution Figure 15 : Dbp5 peut être recruté par Mex67 et interagir avec le mRNP. L’immunoblot avec l’extrait total sert de témoin : on peut voir que la protéine Mex67-GFP est toujours détectée, et que l’anticorps anti-GFP reconnaît légèrement la protéine A (pistes 3 et 4). Après élution de la protéine Dbp5-ProtA, on voit bien que l’immunoblot donne un signal qui correspond à la présence de la protéine Mex67-GFP (pistes 7 et 8). De plus ce signal devient presque indétectable si un traitement à la RNAse précède l’élution (piste 6). Ces résultats prouvent qu’il y a bien interaction entre Dbp5 et Mex67, et que cette interaction est fortement conditionnée par la présence d’ARNm. La possibilité que la protéine Dbp5 intervienne dans l’export des ARN en interagissant avec ces protéines associées est envisageable. III°) Projet de recherche : Les résultats présentés précédemment, ont mis en évidence que la protéine Dbp5 (Hélicase à activité ATPasique) est responsable du passage des mRNP à travers le pore nucléaire. Ces études ont également révélées que Dbp5 était stabilisé par les protéines Gle1 et InsP6 au niveau du filament cytoplasmique du NPC. Ainsi que Dbp5 rentrait en interaction avec Mex67 (protéine permettant l’export) au niveau du mRNP avant le passage du NPC. Tous ces résultats, nous permettent d’envisager un projet de recherche dont le but est de développer des tests in vivo afin de déterminer le rôle de la protéine Dbp5 (DEAD-box protein 5) dans l’export nucléocytoplasmique des ARN polyadénilés. Et plus particulièrement, de déterminer, si Dbp5 (DDX19A chez l’humain) interagit avec d’autres protéines que Mex67 (TAP chez les l’humain) au niveau du mRNP. Puis de déterminer quels motifs de Dbp5 et Mex67 sont indispensable a cette interaction. 1°) Rappel sur les DEAD-box protéines et en particulier sur Dbp5 : Les protéines à activité hélicase jouent un rôle important dans l’expression des gènes et on retrouve ces protéines dans de nombreux processus [25]. Les hélicases p68 et p72 ont été identifiées comme des activateurs de la transcription (activation de la transcription de p53) et sont capables d’interagir avec de nombreux facteurs d’épissage et d’export. Les helicases de la famille des protéines DEAD-box sont impliquées dans l’assemblage du spliceosome, l’épissage et l’export. De même les protéines DEAD-box interviennent dans la formation du complexe eIF4F pour l’initiation de la traduction. - Les DEAD-box protéines : Ces protéines appartiennent à la superfamille des hélicases SF2, tout comme les familles de protéines DEAH, DexH, DecD. Les protéines DEAD-box représentent la plus grande famille d’hélicases et se caractérisent par 9 motifs bien conservés (Figure 16), qui interviennent dans les activités ATPase et hélicase de ces enzymes, ainsi que dans l’interaction avec les ARNm. Le nom de cette famille dérive de la séquence peptidique D-EA-D (Asp, Glu, Ala, Asp) au niveau du motif II. Figure 16 : Motifs caractéristiques des protéines DEAD-box Les hélicases et les protéines DEAD-box sont associées à presque tous les processus faisant intervenir l’ARN. La protéine DEAD-box p68 est requise pour dissocier U1 snRNP du site 5’ de splicing de façon ATP-dépendante. De même la protéine Sub2/UAP56 (RNA hélicase de la famille DecD) est un composant du spliceosome qui se maintient associé à l’EJC (exon juntion complex), tout comme la protéine eIF4AIII (DEAD-box), pendant l’export nucléaire. De plus 14 protéines DEAD-box interviennent dans la biogénèse des ribosomes. Quelques hélicases SF1 et SF2 ont été co-cristallisées en interaction avec leur NTP et du DNA/RNA. On observe des variations structurelles selon si le nucléotide triphosphate ou l’oligonucléotide se trouvent liées ou pas à la protéine [26]. Aucune protéine DEAD-box a été co-cristallisé avec ses substrats, mais on présume que les mêmes changements conformationnels peuvent se produire quand les protéines DEAD-box lient l’ATP ou à l’ARN. Le gène DBP5 (DDBJ/EMBL/GenBank accesion No.U28135) [27], très conservé dans l’évolution, fut identifié pendant des recherches visant à découvrir de nouveaux gènes codant pour la famille des DEAD-box protéines sur la levure (Saccharomyces cerevisiae). Cette protéine, avec son activité RNA hélicase, est responsable du passage des mRNP à travers le pore nucléaire. 2°) Modèle d’étude : On utilisera pour les test in vivo, des cellules de mammifères, plus précisément des cellules HeLa. La plupart des études précédentes a été réalisées dans la levure, nous avons choisit les cellules Hela pour voir les effets de DDX19A sur le transport des mRNP sur des cellules d’eucaryote supérieur. Nous avons également choisi les cellules Hela car elles sont facilement microinjectables et que des études similaires ont déjà été réalisées [11], nous pourrons alors comparer nos résultats avec les résultats précédents. 3°) Etude de l’interaction entre DDX19A (Dbp5 dans la levure) et les protéines associé au mRNP : TAP (Mex67 dans la levure), PAB1 et ALY (Yra1 dans la levure) Les protéines Mex67, Yra1 et PAB1 de la levure ont pour homologues chez l’humain respectivement (Figure 17) : TAP, ALY et PAB1. ALY PAB1 TAP Figure 17 : Protéines associées au mRNP Dans le but d’identifier des nouvelles protéines interagissant avec la RNA hélicase DDX19A, on réalisera des expériences d’immunoprécipitions et de BRET. A°) Technique d’immunoprécipitation : Pour déterminer quelles sont les protéines associées à DDX19A, on devra transfecter les cellules HeLa avec une construction exprimant la protéine de fusion DDX19A-ProtA et une construction exprimant soit TAP-GFP, soit ALY-GFP ou soit PAB1-GFP (Figure 18). Plasmide 2 Plasmide 1 Cytoplasme Noyau Cellule HeLA Figure 18 : Cellule HeLa transfectées par deux plasmides. Le plasmide 1 est sous contrôle du promoteur fort S V40, il exprime la protéine de fusion TAP-GFP ou ALYGFP ou PAB1-GFP et il possède le gène de résistance méthotraxate. Le plasmide 2 est sous contrôle du promoteur fort SV40, il exprime la protéine de fusion DDX19A-ProtA et il possède le gène de résistance hygromycine. - Expérience : On choisira la méthode de transfection transitoire des cellules HeLa avec un plasmide exprimant la protéine de fusion DDX19A-ProtA. Ainsi on pourra capturer, pendant l’expression transitoire de la protéine de fusion, des nouveaux partenaires (fusionné à la GFP) de DDX19A. - Stratégie : Après s’être assurer que les plasmides soient bien exprimés dans la cellule (gène de résistance), des immunoprécipitations seront réalisées par la suite grâce à des IgG (couplés à des billes), possédant une grande affinité pour la protéine A. Si on co-immunoprécipite la protéine DDX19A avec un partenaire, on identifiera ce partenaire à l’aide d’un anticorps antiGFP. - Résultats : On détectera une bande sur l’immunoblot pour chaque protéines de fusion (si elle est présente). Si on observe une co-immunoprécipitation, on pourra dire que DDX19A interagit avec la ou les protéines d’export du mRNP d’intérêt. Pour confirmer les résultats obtenus par co-immunoprécipitation, on réalise des expériences de BRET afin de voir l’interaction entre DDX19A et ses différents partenaires (ALY, TAP et PAB1). B°) BRET : Pour détecter les interactions entre les protéines liées à la mRNP et DDX19A, l’hélicase responsable du remodelage du mRNP pour son passage à travers le pore nucléaire, on mettra au point des essais de BRET (bioluminescence résonance énergie transfert). On a déjà caractérisé l’interaction entre Dbp5 et la protéine Mex67 (TAP chez l’homme), un facteur d’export qui se lie au néo-transcrit pendant la transcription et qui permet son export vers le cytoplasme [23]. Dans le but de caractériser plus précisément les protéines de la mRNP qui interagissent avec DDX19A, afin de permettre l’export cytoplasmique, on va essayer de démontrer l’existence d’interactions entre DDX19A et d’autres protéines appartenant à la mRNP. Pour cela on a choisit de se focaliser sur les possibles interactions de DDX19A avec trois protéines caractérisées par leur importance dans l’export au niveau de la mRNP : les facteurs d’export ALY, TAP et PAB1. - Expérience : On réalisera deux expériences parallèles pour détecter l’interaction entre deux protéines nucléaires dans le nucléoplasme. Pour cela on transfectera de façon transitoire les cellules avec deux constructions différentes : DDX19A fusionnée à la Renilla luciferase (Rluc) et les protéines du mRNP (TAP, PAB1 et ALY) fusionnées à la GFP (cf. constructions précédentes). La protéine GFP (238a.a.) et la Rluc (314a.a.) ne devraient pas affecter le repliement ni l’activité des protéines. - Stratégie : On choisira de faire des transfections transitoires des cellules HeLa. Pour cela on transfectera ces cellules avec des vecteurs bactériens comportant les deux constructions : 1)Vecteur DDX19A-Luciférase et vecteur ALY-GFP 2)Vecteur DDX19A-Luciférase et vecteur PAB1-GFP 3)Vecteur DDX19A-Luciférase et vecteur TAP-GFP La sélection des cellules transfectées se fera par la résistance au méthotraxate (la construction DDX19A-Rluc possède le gène de résistance au méthotraxate). Toutes les constructions seront sous-contrôle d’un promoteur viral SV40. - Résultats : Après ajout du substrat (Deep blue C), et si l’interaction entre DDX19A et les protéines cibles se produit, on détectera avec un microscope à fluorescence, une émission correspondant à la longueur d’onde d’émission de la GFP (505-508 nm), qui aura été excitée par la Rluc (390-400 nm). Par les expériences de BRET et de co-immunoprécipitation, on aura détecté les protéines de l’export qui interagissent avec DDX19A. Ces protéines seront ensuite utilisées pour déterminer quels motifs qui sont indispensables pour l’interaction avec DDX19A. Pour cela, on réalisera des mutations dirigées sur la protéines DDX19A. 4°) Etude des motifs indispensables entre DDX19A et les protéines TAP puis PABP1 et ALY (s’il y a eu interaction) : Afin de déterminer si DDX19A joue un rôle clé dans l’export des ARNm en interagissant avec d’autres protéines, soit des facteurs d’export associés à l’ARNm soit des protéines associées au pore nucléaire, on mettra au point un protocole de mutagenèse dirigée de DDX19A au niveau des motifs qui pourraient participer aux interactions avec la mRNP. On a déjà caractérisé l’interaction entre DDX19A et la protéine TAP (Mex67 dans la levure), un facteur d’export qui se lie au néo-transcrit pendant la transcription et qui permet son export vers le cytoplasme [24]. Les protéines DEAD_box se caractérisent par 9 motifs bien conservés. La plupart de ces motifs sont communs aux hélicases et participent dans l’activité ATPase et hélicase de ces enzymes. Le motif V pourrait jouer un rôle essentiel dans la reconnaissance de la mRNP compétente pour l’export. Des mutations de ce motif sur la DEAD-box protein Prp28 ont une importante répercussion sur la croissance de la levure, ce qui indique son grande importance pour l’activité in vivo de la protéine [25]. De plus d’autres études ont montré que le motif V est essentiel pour stimuler l’activité ATPase du facteur d’epissage Prp22, suite à sa liaison à l’ARN [25]. On croit que ce motif pourrait permettre à la protéine DDX19A d’interagir avec une protéine associée à l’ARNm afin de stimuler l’activité de la protéine et ainsi permettre l’export. Plus précisément le motif V pourrait interagir directement avec deux facteurs d’export associés à l’ARNm, ALY, TAP et PAB1, pour réguler l’activité RNA-hélicase ATPdépendante de Dbp5. - Stratégie : Le motif V comporte le séquence consensus TDVxARGID. On trouve 2 résidus Aspartate (D) dans ce motif, résidu qui est capable d’interagir avec les résidus Arginine et Thréonine présents au niveau des motifs VI. De plus ce résidu est bien connu pour participer activement dans les interactions protéine-protéine. D’abord on réalisera une mutagenèse dirigée des deux résidus Aspartate présents au niveau du motif V de DDX19A. Le but est d’obtenir une protéine mutée tout en conservant son activité RNA hélicase ATP-dépendante. L’Aspartate se caractérise par une masse moléculaire de 133,10 g/mol et un pI de 2,85 (c’est l’acide aminé avec le plus petit pI). Pour la mutagenèse dirigée, on remplacera les deux résidus Aspartate de DDX19A par : -un résidu de masse moléculaire proche et de pI très différent : l’Asparagine (132,12g/mol et pI de 5,41) -un résidu de masse moléculaire très différente et un pI proche : le Glutamate (147,13 g/mol et pI de 3,15) Ensuite, après transfection transitoire des cellules HeLa , on déterminera si les interactions protéine-protéine identifiées par BRET continuent à se produire. - Expérience : On mettra au point un protocole de mutagenèse dirigée contre les deux résidus Aspartate du motif V. Pour cela on a choisit de remplacer ces deux résidus, de façon indépendante, soit par l’Asparagine soit par le Glutamate, dans le but d’obtenir une protéine mutée qui conserve son activité. La séquence du motif V sera donc : - TDVxARGID TNVxARGID - TDVxARGID TEVxARGID - TDVxARGID TDVxARGIN - TDVxARGID TDVxARGIE On transfectera de façon transitoire les cellules HeLa avec un vecteur bactérien, comportant la résistance au méthotraxate. Ce vecteur permettra l’expression de la protéine DDX19A correctement mutée fusionnée à la Rluc. L’expression de la protéine de fusion sera sous contrôle du promoteur viral SV40 (fort et constitutif). La sélection des cellules exprimant le plasmide se fera par la résistance au methrotraxate. Après transfection, on doit s’assurer que les mutations n’affectent pas la localisation ni l’activité de la protéine DDX19A. Pour cela on localisera la protéine de fusion DDX19A mutée-Rluc, en induisant la bioluminescence de la Rluc par l’ajout de son substrat. On devrait détecter DDX19A mutée au niveau de la membrane nucléaire. - Résultats : Grâce à notre expérience de BRET précédente, on aura déjà les informations concernant les interactions qui se produisent entre la RNA hélicase DDX19A et les protéines associées à l’ARNm. Si le transfert d’énergie détecté dans les expériences précédentes de BRET n’est plus détectable en utilisant la protéine DDX19A mutée, on pourra confirmer que la protéine DDX19A interagit avec les protéines associées à l’ARNm pour permettre l’export, et que cette interaction se produit grâce au motif V. 5°) Injection d’ARNm fluorescents pour évaluer le rôle de la protéine DDX19A dans l’export : Des travaux récents ont montré qu’il est possible de suivre par fluorescence le transport nucléocytoplasmique des ARNm [11]. En effet la suivie ce fait après l’injection des pre-ARNm marqués au Cy3 dans le noyau de cellules de mammifère. - Stratégie : Les pre-ARNm doivent comporter au moins un intron, et ne possèdent pas de queue polyA. Ceci va provoquer la prise en charge des pré-ARNm par la machinerie cellulaire d’epissage. Les pré-ARNm sont micro injectés dans le noyau des cellules à l’aide d’un microinjecteur, pendant 0,5 secondes à une pression de 50hPa. - Expérience : On cherche à évaluer les effets de la mutation de DDX19A sur l’export des ARNm. Pour cela on va microinjecter les pre-ARNm dans des cellules HeLa WT et dans des cellules HeLa exprimant de façon transitoire la protéine DDX19A mutée. Ainsi on pourra comparer l’export d’ARNm qui se produit dans les deux cellules. Dans les cellules HeLa exprimant de façon transitoire la protéine DDX19A mutée, il y aura compétition entre la protéine mutée et la protéine endogène exprimée dans la cellule. Pour évaluer l’export des ARNm dans les deux cas, on suivra l’apparition de fluorescence dans le cytoplasme. - Résultats : Dans les deux cas, on s’attend à détecter une augmentation progressive de la fluorescence cytoplasmique correspondant aux ARNm marqués Cy3 qui sont exportés. Dans le cas où la protéine DDX19A jouerait un rôle déterminant dans l’export des ARNm, on s’attend à voir un export d’ARNm beaucoup plus lent dans les cellules exprimant DXX19A mutée. De plus, si la mutation de DDX19A fait diminuer le fluorescence cytoplasmique, donc le transport des ARNm, et si nos expériences de BRET le confirment, on pourra attribuer l’export des ARNm aux interactions se produisant entre DDX19A et es protéines associés à l’ARNm que l’on a ciblé (ALY, TAP et PAB1). IV°) Conclusion et perspectives : Après avoir caractériser les protéines qui interagissent avec la protéine DDX19A et d’avoir vu les motifs indispensables avec ces interactions, il serait intéressant de regarder si les protéines Gle1 et InsP6 (qui stabilise Dbp5 au niveau du filament cytoplasmique du NPC) stabilise également DDX19A pour l’interaction avec les protéines de l’export du mRNP. DDX19A est un membre d’une grande famille de DEAD-box protéine (il en existe 24 chez la levure) qui ont une fonction au niveau des évènement lié au ARN tel que : la biogénèse des ribosomes, l’épissage, l’export, le turnover des ARNm. Le mécanisme de régulation des DEAD-box protéine n’est pas connu. Il serait donc intéressant dans des recherches futures de définir quel processus cellulaire régules ces protéines essentielles. Bibliographies : 1 BR. Cullen, Nuclear RNA export pathways, mol. Cell. Boil., 2000, 20, 4181 – 4187. 2 BR. Cullen, Nuclear RNA export, J. Cell Sci., 2003, 116, 587 – 597. 3 KM. Neugebauer, On the importance of being co-transcriptional. J Cell Sci. 2002 Oct 15;115(Pt 20):3865-71 4 T.Maniatis, R.Reed, An extensive network of coupling among gene expression machines, Nature. 2002 Apr 4;416(6880):499-506 5 MS Jurica, MJ. Moore, Pre-mRNA splicing: awash in a sea of proteins. Mol Cell. 2003 Jul;12(1):5-14. 6 S. Chavez, T. Beilharz, AG. Rondon, H. Erjument-Bromage, P. Trempst, LG. Svejstrup, T. Lihtgow, A. Aguilera, A protein complex containing Tho2, Hpr1, Mft1 and a novel protein, Thp2, connects transcription elongation with mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae, EMBO J., 2000, 19, 5824-5834. 7 K. Strasser, S. Masuda, P. Mason, J. Pfannsiel, M. Oppizzi, S. Rodriguez-Navarro, AG. Rondon, A. Aguilera, K. Stuhl, R. Reed, E. Hurt,TREX is a conserved complex coupling transcription with messenger RNA export, Nature, 2002, 16, 304-308. 8 XD. Fu, T. Maniatis, Factor required for mammalian spliceosome assembly is localized to discrete regions in the nucleus, Nature, 1990, 343, 437–444. 9 LL. Hall, KP. Smith, M. Byron et JB. Lawrence, Molecular Anatomy of a Speckle, 2006, Anat. Record, 288, 664 – 675. 10 MJ. Kruhlak, MA. Lever, W. Fischle, E. Verdin, DP. Bazett-Jones, MJ. Hendzel, Reduced mobility of the ASF splicing factor through the nucleoplasm and steady-state speckle compartments, J Cell Biol, 2000, 150, 41– 51. 11 K. Tokunaga, T. Shibuya, Y. Ishihama, H. Tadakuma, M. Ide, M. Yoshida, T. Funatsu, Y. Ohshima, T. Tani, Nucleocytoplasmic transport of fluorescent mRNA in living mammalian cells : nuclear mRNA export is coupled to ongoing gene transcription, Genes to cells, 2006, 11, 305-317. 12 S.Jimeno, A.G.Rondon, R.Luna & A.Aguilera, The yeast THO complex and mRNA export factors link RNA metabolism with transcription and genome instability. EMBO J., 2002, 21, 3526-3535 13 CN. Cole and JJ Scarcelli, Transport of messenger RNA from the nucleus to the cytoplasme, Cell biol., 2006, 18, 299 –306 14 F.Estruch, CN. Cole, An early function during transcription for the yeast mRNA export factor Dbp5p/Rat8p suggested by its genetic and physical interactions with transcription factor IIH components, Mol Biol Cell. 2003 Apr;14(4):1664-76 15 CS. Weirich, JP Ertzberger, JM Berger, The N-terminal domain of Nup159 forms a beta-propeller that functions in mRNA export by tethering the helicase Dbp5 to the nuclear pore, Mol Cell. 2004 Dec 3;16(5):74960. 16 R. Reed, Coupling transcription, splicing and mRNA export, Curr Opin Cell Biol., 2003, 15, 326-331 17 CS. Weirich, JP. Erzberger, JS. Flick, JM. Berger, J. Thorner and K. Weis, Activation of the DExD/H-box protein Dbp5 by the nuclear-pore protein Gle1 and its coactivator InsP6 is required for mRNA export, Nat. cell. biol., 2006, 8, 668-676. 18 AR. Alcázar-Román1, EJ. Tran1, S. Guo1 and SR. 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Cell, 2005, 20, 645–651. 25 O. Cordin , J. Banroques, N. Kyle Tanner, P.Linder, The DEAD-box protein family of RNA helicases, Gene 2006, 367,17-37 26 DB. McKay, JM Caruthers, Helicase structure and mechanism, Curr. Opin. Struct. Biol., 2002, 12, 123-33 27 S.-I Tseng, L.Weaver, Y. Liu, M. Hitomi, M.Tartakoff and T-H. Chang, Dbp5p, a cytosolic RNA helicase, is required for poly(A)F RNA export, The EMBO Journal, 1998, 17, 2651 - 2662 Abstract Pendant l’expression des gènes, les ARNm néo-transcrits doivent traverser la membrane nucléaire pour être traduits en protéines dans le cytoplasme. Les mécanismes qui contrôlent le passage des ARNm à travers les pores nucléaires sont très mal connus et les protéines qui participent à cet export commencent à être caractérisées. Récemment a été découvert le complexe TREX, qui couple la maturation des ARNm avec leur export. En effet lorsque les ARNm se trouvent encore dans le nucléoplasme, ils sont associés à un grand nombre de protéines : on parle alors de ribonucléoparticule. Les RNPm adoptent des structures particulières et leur passage à travers le pore nucléaire nécessite d’une rémodélisation par des processus énergie-dépendants. C’est à ce niveau que les protéines de la famille DEAD-box, des RNA-hélicases ATP-dépendantes, pourraient jouer un rôle essentiel dans l’export nucléocytoplasmique des ARNm. Des travaux récents ont montré qu’une protéine DEAD-box est localisée au niveau du pore nucléaire et pourrait intervenir dans l’export des ARNm : la protéine Dbp5. Dans notre projet, on démontrera que la protéine Dbp5 interagit avec les facteurs d’export associés à l’ARNm dans les cellules d’eucaryote supérieur. Après avoir caractérisé l’interaction avec les facteurs d’export, on montrera, grâce à des ARNm fluorescents, que l’interaction entre Dbp5 et les facteurs d’export est responsable du passage des ARNm à travers le pore nucléaire.
