L`importance des protéines DEAD-box

Projet de recherche
2006/2007
L’importance des protéines
DEAD-box (RNA hélicases ATP-
dépendantes) dans l’export des ARNm :
interactions entre DDX19A et les
facteurs d’export
Roberto MARTIN
Fabrice LE POGAM

Sommaire
I°) INTRODUCTION :............................................................................................................3
- La maturation des ARNm :.......................................................................................3
- Le rôle des speckles (Interchromatin Granule Clusters) :.....................................5
- L’export des ARNm au niveau des pores nucléaires :............................................5
- Couplage entre transcription et transport : ............................................................7
- Nouvelles approches pour dévoiler la dynamique de l’expression des gènes :.....7
II°) Résultats :...........................................................................................................................8
1°) Fonction de la protéine Dbp5 :......................................................................................9
2°) Activité ATP-dépendante de la protéine Dbp5 :........................................................11
3°) Intéraction entre Dbp5 et les filaments du pore nucléaire : la protéine Gle1.........11
4°) Interaction génétique entre la voie des InsP et l’export des ARNm :......................13
- InsP6 se fixe directement sur la partie CTD de Gle1, ce qui augmente l’activité
de Dbp5 :.....................................................................................................................13
- InsP6 régule l’interaction entre Dbp5 et Gle1 in vivo :.........................................14
5°) Intéraction entre Dbp5 et les mRNP : Mex67............................................................15
III°) Projet de recherche : .....................................................................................................16
1°) Rappel sur les DEAD-box protéines et en particulier sur Dbp5 :............................17
- Les DEAD-box protéines :.......................................................................................17
2°) Modèle d’étude :...........................................................................................................18
3°) Etude de l’interaction entre DDX19A (Dbp5 dans la levure) et les protéines associé
au mRNP : TAP (Mex67 dans la levure), PAB1 et ALY (Yra1 dans la levure)...........19
A°) Technique d’immunoprécipitation :......................................................................19
- Expérience :..............................................................................................................20
- Stratégie :..................................................................................................................20
- Résultats : .................................................................................................................20
B°) BRET :......................................................................................................................20
- Expérience :..............................................................................................................21
- Stratégie :..................................................................................................................21
- Résultats : .................................................................................................................21
4°) Etude des motifs indispensables entre DDX19A et les protéines TAP puis PABP1
et ALY (s’il y a eu interaction) :........................................................................................22
- Stratégie :..................................................................................................................22
- Expérience :..............................................................................................................23
- Résultats : .................................................................................................................24
5°) Injection d’ARNm fluorescents pour évaluer le rôle de la protéine DDX19A dans
l’export :..............................................................................................................................24
- Stratégie :..................................................................................................................24
- Expérience :..............................................................................................................24
- Résultats : .................................................................................................................25
IV°) Conclusion et perspectives :..........................................................................................25

I°) INTRODUCTION :
Dans les cellules eucaryotes, les sites de transcription (noyau) et de traduction
(cytoplasme) sont séparés par une membrane nucléaire. Le transport des ARN entre le noyau
et le cytoplasme via les pores nucléaires est un processus essentiel pour l’expression des
gènes. Ces dernières années, l’étude des mécanismes de transport des différentes classes
d’ARN a nettement augmenté [1] et [2]. Ces études ont montré que le mécanisme d’export
des ARNm est beaucoup plus compliqué que ceux des autres ARN.
- La maturation des ARNm :
La plupart des ARNm sont transcrit sous forme de précurseur (pré-ARNm) qui doivent
être maturés avant l’export vers le cytoplasme (Figure 1). Il y a un intense débat pour discuter
si cette maturation se produit après ou pendant la transcription [3]. La maturation du messager
inclut l’ajout d’un cap en 5’, l’épissage des introns et la poly-adénylation en 3’.
La transcription des ARNm est catalysée par l’ARN polymérase II localisée dans le
noyau. Le domaine C-terminal (CTD) de la grande sous-unité de cette polymérase recrute des
facteurs intervenant dans la maturation des ARNm. De plus, des composants de la machinerie
de capping et de polyadénylation interagissent avec ces régions CTD [4], ce qui prouve que
ces processus moléculaires sont coordonnés.
Le capping se produit pendant la transcription, dès que le néotranscrit atteint une
longueur de 20-25 nucléotides, il s’agit de l’ajout d’un GpppG en 5´. Une fois dans le
cytoplasme, des protéines comme iEF4 ou encore le CBC (Cap-Binding Complex)
reconnaîtront le cap est permettront l’interaction avec le ribosome.
La polyadénylation est commune à tous les mRNA à l’exception de ceux codant pour
les histones. Le pré-mRNA néo-transcrit possède un signal de polyadénylation qui sera
reconnu par au moins deux protéines, en étroite collaboration avec le domaine C-terminal de
la RNA polymérase II. En effet la machinerie de polyadénylation est peu caractérisée et on
estime qu’il y a intervention d’une douzaine de protéines dans ce processus.
Les facteurs d’épissage, qui se trouvent concentrés au niveau des IGC (Interchromatin
Granule Clusters ou Speckles) sont recrutés dans les points de transcription. L’épissage
consiste à l’excision des régions non-codantes (introns) du pré-mRNA pour obtenir à la fin un
mRNA fonctionnel composé uniquement d’exons. Il peut faire intervenir deux molécules de
pré-mRNA différentes (on parle alors de trans-splicing) ou uniquement un pré-mRNA (cis-
splicing).

Cette réaction est catalysée par le spliceosome, un complexe enzymatique constitué de
plusieurs protéines (plus de 300) et de 4 ribonucléoprotéines (U1, U2, U5 et U4/U6), [5].
L’épissage commence après la reconnaissance par ce complexe des séquences consensus
caractérisant les jonctions exon/intron dans le pré-mRNA, définies comme les sites 3’ et 5’
d’epissage. Le site d’épissage 5’ est caractérisé par une séquence de 8 nucléotides
AG\GURAGU, où \ représente la liaison exon/intron. Le site d’épissage 3’ contient 3
séquences consensus : le point de branchement, une région riche en pyrimidine et le site de
splicing YAG\G. En plus de ce mécanisme, on a identifié d’autres éléments intervenant dans
l’epissage : exonic splicing silencers and enhancers, intronic splicing silencers and enhancers.
Figure 1 : Schéma général de l’export des ARNm vers le cytoplasme
Fixation d’un complexe lors de la transcription (THO), composé des protéines Hpr1p, Tho2p, Mft1p, Thp2p [6].
Renommé TREX (Transcription mRNA Export compleXe) par [7]. Car d’autres protéines interagissent avec des
facteurs liés à l’export des ARNm (Aly, UAP56). Puis export du mRNp au niveau du NPC à l’aide de Dbp5.

- Le rôle des speckles (Interchromatin Granule Clusters) :
Les speckles composés d’un ou plusieurs domaines SC35 [8] possèdent la machinerie
biochimique nécessaire à la transcription (ARN pol II, WT1), l’épissage (SR protéine : SC35,
ASF/SF2 ; snRNPs) et l’export des ARNm (Aly/REF). Il y a plus de 75 protéines présentent
dans les speckles [9]. Bien que concentrées au niveau des domaines SC35, ces molécules sont
aussi distribuées dans tout le noyau [10]. La forte concentration de facteurs protéiques
nécessaires aux différentes étapes de l’expression des gènes au niveau des speckles facilite un
rapide recyclage et / ou réassemblage des complexes macromoléculaires nécessaire pour une
expression efficace des gènes hyperactif.
Des expériences où l’on injecte des pré-ARNm marqués par fluorescence dans le
noyau montrent, qu’après transcription, les mRNP s’adressent vers les speckles [11]. Le
domaine SC35 est le centre d’activité de l’expression des gènes. L’hypothèse est que la
transcription, l’épissage et la maturation des ARNm ont lieu à la périphérie des speckles. Puis
les ARNm vont être stockés à l’intérieur des domaines SC35. Il y a alors une vérification de
l’ARNm et puis export, s’il est bien mature, vers le cytoplasme via les pores nucléaires. En
effet, il a été démontré que des ARN-polyA immobiles sont localisés au niveau des speckles
(mais leur rôle reste inconnu). De plus, une inhibition des gènes qui synthétisent les protéines
de transport engendre une accumulation des ARNm au niveau du domaine SC35 des speckles.
- L’export des ARNm au niveau des pores nucléaires :
Avant la traduction, l’ARNm doit franchir la membrane nucléaire qui est constituée de
nombreux complexes : les pores nucléaires (Figure 2). L’identification de plusieurs facteurs
nécessaires au transport nucléoplasmique des ARNm a aidé à mieux comprendre ce
mécanisme. Des approches génétiques et biochimiques sur la levure (S.cerevisiae et S.pombe)
ont permis d’identifier les protéines requises pour l’export des ARNm. Les protéines
intervenant dans l’export des ARNm (Yra1p/REF, PABP) sont recrutés par les ARNm
pendant la transcription. La découverte du TREX (transcription ARNm export complexe) aide
à éclaircir ce mécanisme. Des protéines appartenant à ce complexe ont été identifiées. C’est le
cas des protéines Sub2p (composant du spliceosome) et Yra1p (protéine de fixation à la queue
polyA de l’ARN). Pendant la transcription, des composants du TREX sont recrutés et
facilitent l’export des néo-transcrits. De même, on a localisé des orthologues des gènes codant
pour ces protéines dans toutes les cellules eucaryotes [12], ce qui est la preuve que ce
mécanisme est bien conservé dans l’évolution. Par exemple : l’adaptateur d’export des ARNm