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Outils immunologiques innovants de
détection de la tuberculose latente
Expérience au CHU de Nancy
avec le test T-Spot.TB™
Marcelo de Carvalho
PU-PH, Laboratoire d'Immunologie
CHU de Nancy, Université de Lorraine
La tuberculose
•Un tiers de la population mondiale est infectée (estim. 2
milliards d’individus) par Mycobacterium tuberculosis
•9 millions de nouveaux cas et 1,4 Millions de décès en 2010
•Maladie pulmonaire dans 70% des cas mais atteinte possible
d’autres organes
L’infection primaire et le
« priming » de la réponse immune
anti-tuberculose
•1er contact avec le bacille
•Déposition alvéolaire de quelques bacilles,
chancre d’inoculation (foyer primaire)
•Multiplication dans les macrophages
alvéolaires après phagocytose
•Drainage vers le ganglion hilaire satellite, dissémination
(foyers 2aires)
•Mise en place d’une réponse à médiation cellulaire
•Accumulation de cellules monocytaires
d’allure épithélioïde avec couronne de
lymphocytes et nécrose caséeuse
Tuberculose active et latente
Exposition à une personne présentant
une TB active
La personne devient infectée
Contrôle initial de
l’ infection par les
cellules T, mais
l’infection est toujours
présente et
cliniquement sous
jacente
TB LATENTE TB ACTIVE
Maladie
symptomatique
Pathologie en cours
Les patients peuvent
alors infecter d’autres
personnes
Sans traitement,
~50% décèderont
Réactivation
- Pas de symptômes,
mais BK toujours
présent
- Pathogène non
détectable
- Examens radiologiques
pouvant être normaux
- Pas de réponse
Anticorps
Diagnostic difficile
- Détection par l’ IDR à la
tuberculine et
tests IGRAS
L’infection demeure
jusqu’à la mort
- Les symptômes
suggèrent une TB
- BK peut être détecté
dans l’expectoration ou
autres échantillons par
examen direct, culture
ou biologie moléculaire
- Les examens
radiologiques montrent
une pathologie
pulmonaire
- Diagnostic compliqué
dans la TB non
pulmonaire (enfants
particulièrement
vulnérables)
Si exposition insuffisante : tous les germes
disparaissent
5%
5%

Immunité cellulaire
IL-4IL-2
TNFa
IFNg
Interactions
CPA- cellules T
Sécrétion de
cytokines
Prolifération /
Apoptose
Cytotoxicité
Immunité cellulaire
Lymphocytes T naïfs
•Génération de diversité du TCR dans le thymus
–Sélections positive et négative
–TCR spécifique d’Ag
•Circulent dans le sang périphérique et organes lymphoïdes
secondaires
–Faible fréquence (~1/100.000 pour un Ag donné)
–Expriment CCR7 (récepteur chémokines) et CD45RA
–Passage par HEV vers la zone lymphocytaire T
–« Scannent » les cellules dendritiques pour reconnaissance de l’Ag
Réponses immunes cellulaires
spécifiques d’Ag
Phases de l’immunité adaptative
•Reconnaissance spécifique de l’antigène
•Activation
•Différentiation et expansion clonale
•Contrôle de l’infection et contraction clonale
•Mémoire (hétérogénéité)

Mémoire immunologique
•Plus grande fréquence des clones spécifiques
~ 1/10.000
•Meilleur performance
–forte affinité de leur immunorécepteur
–seuil de déclenchement de leur activation plus
facilement atteint (dose moindre d’Ag)
–moindre exigence en signaux de costimulation
–sensibilité étendue aux différentes cytokines capables
d’induire leur prolifération (IL-2, IL-7, IL-15)
–fonction effectrice rapidement opérationnelle
–présence au sein même des tissus périphériques
Immunité cellulaire anti-TB
O’Garra A et al. Ann Rev Immunol
2013
Réponse cellulaire TH1 anti-TB
•Facteurs indispensables pour le contrôle de la
tuberculose (réponse TH1)
–IL-12
–LT CD4
–IFN-γ
–TNF-α
•Autres acteurs
–LT CD8
–LTγδ et iNKT (reconnaissance de antigènes
lipidiques)
–LB (rôle mineur des Abs)
Tuberculose active et latente
•Le développement de la maladie active (et sa sévérité) est multifactoriel
(interactions entre l’hôte, l’environnement et le bacille)
–Facteurs de risque connus
•Co-infection VIH et autres immunodéficiences, diabètes
•Malnutrition et pauvreté
–Equilibre entre facteurs protecteurs…
•IFN-γ, TNF-α, apoptose, TH1
–… et délétères de la réponse immunitaire
•Treg, IL-10, nécrose, immunopathologie de l’inflammation exacerbée (IL-17
et neutrophiles)
–Influence de la souche et quantité du bacille, polymorphismes génétiques
chez l’hôte, co-infections

•Les nouveaux cas de TB sont générés
par le réservoir de TB latente.
•Il faut éliminer ce réservoir infectieux.
•Cette «épidémie masquée» de
personnes infectées par la TB latente
est énorme.
•La croissance de la TB latente devient
une « bombe à retardement »
clinique.
•Il faut désamorcer cette bombe en
dépistant et traitant les TB latentes.
- risque de réactivation divisé par 10
- mais effets adverses du traitement…
Comment éradiquer la tuberculose ?
TB active
– 9 millions de nouveaux cas par an
- Malheureusement et uniquement la
partie émergée de l’iceberg !
TB Latente
- “Épidémie masquée”
-2 milliards de personnes
infectées
Justification de l’approche immunologique cellulaire
T
•M. tuberculosis : pathogène intracellulaire,
difficile à détecter et à isoler chez les
patients infectés
•La réponse humorale aux infections à M.
tuberculosis est faible
•L’infection à M. tuberculosis induit une forte
réponse immunitaire de type Th1
•Les cellules T sécrétrices d’interféron-
gamma spécifiques de M.tuberculosis
pourraient être un marqueur spécifique de
l’infection
Test diagnostic cutané pour TB latente
•Spécificité faible:
réactions croisées entre l’IDR et le BCG et/ou les
mycobactéries environnementales
•Sensibilité insuffisante :
75-90% pour les TB actives
–plus faible pour les TB disséminées ou les infections HIV,
–inconnu pour les TB latentes
•Besoin de 2 visites : l’injection puis la lecture de
l’induration 2 jours après
•Variabilité selon l’opérateur (inoculation & lecture)
•Standardisation du réactif
•Inflammation & cicatrisation douloureuses
Le diagnostic de la tuberculose latente repose sur un test cutané développé il y
a 100 ans : l’ IDR (intradermoréaction)
C’est le test diagnostic le plus ancien encore utilisé.
De l’IDR aux IGRAs?
•Bases immunologiques
–Des cellules T
–Des cytokines
•Une réponse immunologique
in vivo (IDR)
•Réponse
immunologique
in vitro
–Dosages de cytokines
–Elisa, Elispot
–IGRAs = Interferon
Gamma Releasing
Assays

Méthodologie
•Culture cellulaire avec un pool de peptides des
épitopes immunodominants des protéines du BK non
présentes dans le BCG : CFP-10 et ESAT-6
–Présentation par les molécules HLA de classe I et classe II
(stimulation des Lymphos T CD4+ et CD8+)
•Quantification de la production d’IFN-γ
–ELISA
–ELISPOT
–(Marquage intracellulaires des cytokines, cytométrie en flux)
Principe des IGRAs Introduction au test T-SPOT.TB™
•Detects TB indirectly by measuring
the response of TB-specific effector
T cells
–Uses the generic ELISPOT technique
–Purified White Blood Cells (PBMCs)
challenged with TB-specific antigens
(ESAT-6, CFP10)
–The interferon gamma “footprint” of
each reacting T cell produces a “spot”
–Spots are measured to give quantitative
measure of the numbers of individual T
cells reacting
•The test can also be used on non-
blood samples
–To detect TB-specific T cells in specific
body fluids (e.g. BAL, CSF)
–Results shown to help rule in active TB
disease in that location
Methodology
Etape 1 – Préparation des cellules
•Tube hépariné
•Séparation des cellules mononuclées par
gradient de densité (Ficoll)
•Recueil des lymphocytes, monocytes et
cellules dendritiques
•Lavage et comptage
•Ajouter 2.5x10
5
cellules par puits
•Ajouter antigènes aux puits
4 puits différents : témoin négatif, témoin positif,
panel A (ESAT-6), panel B (CFP-10)
•Incuber overnight
Etape 2 – Révélation des spots
•Lavage plaques
•Ajouter réactif détection
pendant 60 minutes
•Lavage plaques
•Ajouter substrat; spots en 7
minutes
•Lavage et séchage des plaques
-ve
+ve