La tuberculose Outils immunologiques innovants de détection de la tuberculose latente Expérience au CHU de Nancy avec le test T-Spot.TB™ Marcelo de Carvalho PU-PH, Laboratoire d'Immunologie CHU de Nancy, Université de Lorraine • • • L’infection primaire et le « priming » de la réponse immune anti-tuberculose • • • • • • 1er contact avec le bacille Déposition alvéolaire de quelques bacilles, chancre d’inoculation (foyer primaire) Multiplication dans les macrophages alvéolaires après phagocytose Drainage vers le ganglion hilaire satellite, dissémination (foyers 2aires) Mise en place d’une réponse à médiation cellulaire Accumulation de cellules monocytaires d’allure épithélioïde avec couronne de lymphocytes et nécrose caséeuse Un tiers de la population mondiale est infectée (estim. 2 milliards d’individus) par Mycobacterium tuberculosis 9 millions de nouveaux cas et 1,4 Millions de décès en 2010 Maladie pulmonaire dans 70% des cas mais atteinte possible d’autres organes Tuberculose active et latente Exposition à une personne présentant une TB active Si exposition insuffisante : tous les germes disparaissent - Les symptômes suggèrent une TB La personne devient infectée - Pas de symptômes, mais BK toujours présent - Pathogène non détectable - Examens radiologiques pouvant être normaux - Pas de réponse Anticorps 5% Contrôle initial de l’ infection par les cellules T, mais l’infection est toujours présente et n cliniquement sous ivatio jacente Réact 5% Maladie symptomatique Pathologie en cours Les patients peuvent alors infecter d’autres personnes - BK peut être détecté dans l’expectoration ou autres échantillons par examen direct, culture ou biologie moléculaire - Les examens radiologiques montrent une pathologie pulmonaire Diagnostic difficile - Détection par l’ IDR à la tuberculine et tests IGRAS L’infection demeure jusqu’à la mort Sans traitement, ~50% décèderont TB LATENTE TB ACTIVE - Diagnostic compliqué dans la TB non pulmonaire (enfants particulièrement vulnérables) Immunité cellulaire Immunité cellulaire Lymphocytes T naïfs IL-2 IL-4 • Génération de diversité du TCR dans le thymus – Sélections positive et négative – TCR spécifique d’Ag • Circulent dans le sang périphérique et organes lymphoïdes secondaires IFNg Interactions CPA- cellules T Sécrétion de cytokines – – – – TNFa Cytotoxicité Faible fréquence (~1/100.000 pour un Ag donné) Expriment CCR7 (récepteur chémokines) et CD45RA Passage par HEV vers la zone lymphocytaire T « Scannent » les cellules dendritiques pour reconnaissance de l’Ag Prolifération / Apoptose Réponses immunes cellulaires spécifiques d’Ag Phases de l’immunité adaptative • • • • • Reconnaissance spécifique de l’antigène Activation Différentiation et expansion clonale Contrôle de l’infection et contraction clonale Mémoire (hétérogénéité) Immunité cellulaire anti-TB Mémoire immunologique • Plus grande fréquence des clones spécifiques ~ 1/10.000 • Meilleur performance – forte affinité de leur immunorécepteur – seuil de déclenchement de leur activation plus facilement atteint (dose moindre d’Ag) – moindre exigence en signaux de costimulation – sensibilité étendue aux différentes cytokines capables d’induire leur prolifération (IL-2, IL-7, IL-15) – fonction effectrice rapidement opérationnelle – présence au sein même des tissus périphériques O’Garra A et al. Ann Rev Immunol 2013 Réponse cellulaire TH1 anti-TB • Facteurs indispensables pour le contrôle de la tuberculose (réponse TH1) – IL-12 – LT CD4 – IFN-γ – TNF-α • Autres acteurs – LT CD8 – LTγδ et iNKT (reconnaissance de antigènes lipidiques) – LB (rôle mineur des Abs) Tuberculose active et latente • Le développement de la maladie active (et sa sévérité) est multifactoriel (interactions entre l’hôte, l’environnement et le bacille) – Facteurs de risque connus • Co-infection VIH et autres immunodéficiences, diabètes • Malnutrition et pauvreté – Equilibre entre facteurs protecteurs… • IFN-γ, TNF-α, apoptose, TH1 – … et délétères de la réponse immunitaire • Treg, IL-10, nécrose, immunopathologie de l’inflammation exacerbée (IL-17 et neutrophiles) – Influence de la souche et quantité du bacille, polymorphismes génétiques chez l’hôte, co-infections Comment éradiquer la tuberculose ? • Les nouveaux cas de TB sont générés par le réservoir de TB latente. • Il faut éliminer ce réservoir infectieux. • Cette «épidémie masquée» de personnes infectées par la TB latente est énorme. • La croissance de la TB latente devient une « bombe à retardement » clinique. • Il faut désamorcer cette bombe en dépistant et traitant les TB latentes. - risque de réactivation divisé par 10 - mais effets adverses du traitement… TB active – 9 millions de nouveaux cas par an - Malheureusement et uniquement la partie émergée de l’iceberg ! TB Latente - “Épidémie masquée” -2 milliards de personnes infectées Test diagnostic cutané pour TB latente Le diagnostic de la tuberculose latente repose sur un test cutané développé il y a 100 ans : l’ IDR (intradermoréaction) C’est le test diagnostic le plus ancien encore utilisé. • Spécificité faible: réactions croisées entre l’IDR et le BCG et/ou les mycobactéries environnementales • Sensibilité insuffisante : 75-90% pour les TB actives – plus faible pour les TB disséminées ou les infections HIV, – inconnu pour les TB latentes • Besoin de 2 visites : l’injection puis la lecture de l’induration 2 jours après • Variabilité selon l’opérateur (inoculation & lecture) • • Standardisation du réactif Inflammation & cicatrisation douloureuses Justification de l’approche immunologique cellulaire T • M. tuberculosis : pathogène intracellulaire, difficile à détecter et à isoler chez les patients infectés • La réponse humorale aux infections à M. tuberculosis est faible • L’infection à M. tuberculosis induit une forte réponse immunitaire de type Th1 • Les cellules T sécrétrices d’interférongamma spécifiques de M.tuberculosis pourraient être un marqueur spécifique de l’infection De l’IDR aux IGRAs? • Bases immunologiques – Des cellules T – Des cytokines • Une réponse immunologique in vivo (IDR) • Réponse immunologique in vitro – Dosages de cytokines – Elisa, Elispot – IGRAs = Interferon Gamma Releasing Assays Principe des IGRAs Introduction au test T-SPOT.TB™ Methodology Méthodologie • Culture cellulaire avec un pool de peptides des épitopes immunodominants des protéines du BK non présentes dans le BCG : CFP-10 et ESAT-6 – Présentation par les molécules HLA de classe I et classe II (stimulation des Lymphos T CD4+ et CD8+) • Quantification de la production d’IFN-γ – ELISA – ELISPOT – (Marquage intracellulaires des cytokines, cytométrie en flux) Etape 1 – Préparation des cellules •Tube hépariné •Séparation des cellules mononuclées par gradient de densité (Ficoll) •Recueil des lymphocytes, monocytes et cellules dendritiques •Lavage et comptage •Ajouter 2.5x105 cellules par puits •Ajouter antigènes aux puits 4 puits différents : témoin négatif, témoin positif, panel A (ESAT-6), panel B (CFP-10) •Incuber overnight • Detects TB indirectly by measuring the response of TB-specific effector T cells – Uses the generic ELISPOT technique – Purified White Blood Cells (PBMCs) challenged with TB-specific antigens (ESAT-6, CFP10) – The interferon gamma “footprint” of each reacting T cell produces a “spot” – Spots are measured to give quantitative measure of the numbers of individual T cells reacting • The test can also be used on nonblood samples – To detect TB-specific T cells in specific body fluids (e.g. BAL, CSF) – Results shown to help rule in active TB disease in that location Etape 2 – Révélation des spots • Lavage plaques • Ajouter réactif détection pendant 60 minutes • Lavage plaques • Ajouter substrat; spots en 7 minutes • Lavage et séchage des plaques -ve +ve Etape 3 – Comptage des spots Adaptable à la routine clinique • Comptage des spots à l’oeil, loupe, microscope • Lecteur elispot automatisé – – – Lecture standardisée Calcul du nombre de spots et mémorisation des données Automatisation possible des settings • Technique simple +/-, rapide, automatisable +/-. • Kits, équipements et logiciels validés selon standards internationaux. • Robuste et reproductible. • Adaptable à tout liquide biologique contenant des LT Un autre test IGRA: Quantiferon®-TB Gold Exemples de résultats • PHA vs Panel A, Panel B • • • • • • Principe similaire au TSPOT.TB™ Méthode sur sang total Prélèvement de sang directement dans 3 tubes: Tube négatif Tube Mitogène (PHA, contrôle +) Tube Ags TB : CFP-10, ESAT-6 et TB 7.7 QuantiFERON®-TB Gold • • • • Critères pour le choix du test T-spot.TB™ Agitation vigoureuse des tubes (Ags sur la paroi) Incubation à 37°C overnight Centrifugation et recueil du plasma Quantification d’IFNg plasmatique par ELISA Différence 1 – Lavage (purification) et comptage Correction des lymphopénies (250.000 cellules/puits) Critères pour le choix du test T-spot.TB™ Différence 2 – Production cytokinique au niveau cellulaire Pas de courbe standard Elisa Critères pour le choix du test T-spot.TB™ Différence 3 – Mesure de cellules T individuelles Ex: 1000pg IFNg/mL: 2 cellules produisant 500 pg chacune ou 1000 cellules produisant 1 pg chacune? Critères pour le choix du test T-spot.TB™ • Moins d’influence de paramètres préanalytiques – Tubes standards – Pas d’agitation particulière – Pas d’ordre de prélèvement des tubes – Pas de tubes trop ou pas assez remplis – Pas d’influence de l’attente pré-incubation – Plus facile pour accréditation • maîtrise à 100% du test par le laboratoire Expérience du Laboratoire d’Immunologie CHU de Nancy Brabois Critères pour le choix du test T-spot.TB™ • Purification, Standardisation et comptage – Cytokines ou médicaments (immunosuppresseurs) plasmatiques éliminés de l’incubation avec l’Ag. – Diminution du « bruit de fond » cytokinique. Pas d’interférence avec l’activation lymphocytaire T – Correction des lymphopénies (250.000 cellules/puits) – Résultats standardisés permettant le monitoring longitudinal des fréquences de lymphocytes spécifiques : avant – après traitement (antituberculeux, anti-TNF,…) – Possibilité de réaliser l’analyse dans les liquides contenant de lymphocytes T (LBA, ascite,…) • Sensibilité accrue – D’après la littérature au moins 10% de plus (?) Expérience nancéienne • Services – De 2004 à 2007 - Depuis juin 2004 - Sources des prélèvements - Luxembourg (dans la journée) - Région (dans la journée) - CHU - Séries - 5 - 10 patients par jour, - ~2000/an - du lundi au jeudi • Rhumatologie – Depuis 2007 • Rhumatologie • CLAT • Tous services cliniques (Gastroentérologie, Maladies Infectieuses, Médecine Interne, Dermatologie, Réa …) • Médecine du Travail • Indéterminés ~7% (5% ctrl PHA négatif et 2% témoin négatif réactif) • Positifs – 17,5% Haut Conseil de la Santé Publique Avis relatif à l’utilisation des tests de détection de la production d’interféron-g Haut Conseil de la Santé Publique Avis relatif à l’utilisation des tests de détection de la production d’interféron-g • Ne doivent être utilisés que pour le seul diagnostic de l’infection tuberculeuse latente et uniquement dans l’objectif de la traiter • Pas indiqués dans le diagnostic de la tuberculose maladie, mais aide dans certains cas de diagnostic difficile chez l’enfant (<5 ans) • Diagnostic de l’infection tuberculeuse latente – Formes pauci-bacillaires – Chez l’adulte en cas de certains cas de TB extra-pulmonaire – Dépistage d’infections récentes • enquêtes autour des cas – Dépistage des infections anciennes réactivation par l’immunodépression • avant mise sous traitement par anti-TNF alpha • patients infectés par le VIH – Dépistage et surveillance • migrants récents et personnels de santé. Perspectives • Évaluation de l’immunité anti-tuberculose avant et après traitement – Comparaison cytokines intracellulaires par cytométrie en flux et ELISPOT – Challenge = différencier tuberculose active et latente Évaluation de la sécrétion de cytokines par marquage intracytoplasmique • Évaluation globale de l’immunité cellulaire T – Complémentaire et plus informative que la recherche par ELISPOT de lymphocytes T sécrétant IFNg (la réponse IFNg isolée n’est pas suffisante pour évaluer la magnitude et la présence ou absence d’une immunité spécifique vis-à-vis des pathogènes) – Développement de nouvelles pistes dans le management clinique des infections Évaluation des lymphocytes spécifiques de M. tuberculosis Analyse • Sélection des sous populations lymphocytaires T CD4+ et CD8+ et de mémoire Culture cellulaire avec l’Ag • Cellules : PBMC • Antigène – Pool de peptides des épitopes immunodominants CFP-10 et ESAT6 (15aa, overlap de 11 aa) • présentation par les molécules HLA de classe I et classe II • stimulation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ – Contrôles négatif (milieu seul) et positif (mitogène) • Culture overnight • Phénotypage et acquisition au cytomètre en flux Conclusion Réponses polyfonctionnelles • IGRAS – Aide au diagnostique de la TB latente – Suivi « longitudinal »? • Après traitement par anti-TNF? • Après traitement anti-TB? • Place à l’évaluation globale de l’immunité anti-TB (réponses polyfonctionnelles) T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold avantages et inconvénients avantages et inconvénients T-spot.TB™ Pré-analytique T-spot.TB™ Quantiferon-TB Gold Pas de tubes spécifiques Pas de manipulations ou volumes sanguins particuliers Tubes spécifiques Ordre de prélèvement (?) Volumes sanguins particuliers Agitation particulière des tubes Quantiferon-TB Gold 3 antigènes Analytique Correction des lymphopénies Résultats quantitatifs (cellules individuelles) Possibilité d’évaluer autres liquides biologiques (LBA,…) Plus grande technicité requise (personnel et matériel) Technicité plus simple Coût plus élevé (BHN Moindre coût (BHN200) 400) T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold avantages et inconvénients Post-analytique T-spot.TB™ Quantiferon-TB Gold Possibilité d’un rendu des résultats rapide (24hs) Attente pour remplir une plaque Elisa avant de rendre les résultats Plus d’information (nombre de cellules positives): résultats standardisés permettant le suivi longitudinal