cours

Eucaryotes Procaryotes
(bactéries)
ADN
ARNm
protéine
ADN exon
ARNm
ARN transcription
traduction
protéine
transcription
traduction
ADN: double brin (A, T, G, C)
ARN: simple brin (A, U, G, C)
Protéines: acides aminés
Hybridation d'acides nucléiques (AN) ou de protéines
Notion de complémentarité: reconnaissance moléculaire
(séquence -AN- ou structure -protéine-)
Complexe sonde-cible (hybride)
ADN-ADN (sonde= complémentaire antiparallèle)
ADN-ARN
protéine-protéine (complexe Ac/Ag)
Hybridation - est spécifique (sonde /cible)
- a lieu même en présence d'un large excès de
molécules similaires mais non identiques
--> détection d'une molécule d'ADN ou d'ARN, ou de
protéine dans un mélange en contenant des milliers de
similaires "trouver une ai
g
uille dans une meule de foin"
Dénaturation-renaturation ADN
Principe: Dénaturation (séparation des brins par rupture des liaisons
hydrogènes: tre> Tm ou pH> 12) d'ADN double brins de séquences
différentes
puis réassociation spécifique (conditions favorables de tre et pH)
--> hybridation des ADN simple brin pour former les homoduplex originels.

La température de fusion (Tm)
Un fragment d'ADN de séquence donnée a une Tm qui correspond à la
température où 50% des fragments sont sous forme simple brin.
Tm dépend de la longueur du fragment d'ADN, de sa composition en
bases, de la présence de certains ions dans le milieu.
Hybridation d'acides nucléiques et détection
Températures d'hybridation et de lavage < à Tm sonde ( 5 à 10°C) -->
favoriser et conserver l'association de la sonde sur sa cible et défavoriser les
mésappariements de la sonde avec une séquence homologue.
Les brins ne peuvent
se renaturer entre
eux, mais peuvent
s'hybrider avec une
sonde marquée s'il y
a complémentarité
Mélange AN
Hybridation peut avoir lieu
en solution
support solide :
immobilisation sur membrane, sur verre
colonies bactériennes
chromosome
coupe de tissus...
Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une
séquence donnée par utilisation d'une sonde complémentaire
Les sondes d'acides nucléiques
fragment d'ADN ou ARN marqué
sonde radioactive (incorporation de nucléotides radioactifs)
sonde froide
générée in vitro avec une séquence complémentaire de la
séquence recherchée
fragment de restriction
produit PCR
synthèse "commerciale"

Les sondes radioactives (chaudes)
sondes mono ou double brins
Phosphate32 (radio-isotope le + utilisé), Soufre35, H3 (tritium)
Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs
nucléotides triP radiomarqués
- marquage en 5': T4 polynucléotide kinase ajoute 1P32 en 5' (sonde peu radioactive)
- par amorçage au hasard (Random Priming)
Dénaturation
de la sonde Ajout cocktail hexamers (6nt,
contenant toutes le
séquences possible
s
D NA pol
+dATP,
dGTP,dTTP
+dCTP*
Dénaturation sond
e
et cible
Hybridation
5'
3'
ADN pol I
+ ATP32
Les sondes radioactives (suite)
- marquage en 3' :
*avec une ADN polymérase: ADN pol I ou T4, Taq pol(PCR)
(sondes très radioactives car incorporation de x nt*)
*avec une exonucléase
*avec une terminal transférase
- marquage par "translation de coupure" (Nick Translation): DNAseI
(conditions ménagées) pour générer quelques coupures simple brin dans le
fragment d'intérêt, puis ADN pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au
niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nt radioactif.
sondes d'ARN (ribosondes) (rendements d'hybridation meilleurs par
rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables)
Attention :les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :
1.nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des
sondes inconfortable
2. décroissance rapide du P32, d'ou besoin de marquer les sondes
fréquemment
Les sondes froides
digoxigénine
marquage par la biotine-streptavidine.
fluorophore
Attention:problème de sensibilité -->leur utilisation ne fait pas toujours
l'unanimité
Hybridation in situ sur chromosome
Objectif : déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se
trouve le gène dont on possède la sonde.
En pratique:
- préparation des chromosomes
- hybridation directement sur les préparations fixées sur lame
- Sonde marquée au tritium (H3): rayonnement très court, donne donc une
localisation fine de la zone émettant la radioactivité.
- résultat lu sous microscope : les signaux positifs
apparaissent sous forme de grains noirs disposés
sur les chromosomes.
Détection d'un
gène de Drosophile

Hybridation in situ
Détection du virus d'Epstein-Barr (sonde reconnaissant ARN = génome du
virus)
- coloration nucléaire bleu foncée des noyaux infectes
- contre coloration verte des autres noyaux
Indications: Syndromes lymphoproliferatifs et lymphomes
Hybridation sur coupe de tissu
Objectif : déterminer quelle sous population du tissu exprime un ARN
donné (un tissu est généralement constitué de différents types cellulaires, pas
toujours faciles à séparer)
Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec
une sonde d'un gène impliqué dans le développement embryonnaire
Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
Objectif: détecter parmi un grand nombre de bactéries ou de phages
recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherché
(criblage de banque).
Boîtes avec colonies
bact ou phages
(milliers à millions)
Prise
d'empreinte
(nylon ou
nitrocellulose)
Coussin de NaOH
(éclattement cellules +
dénaturation ADN
Fixation
(cuisson ou UV)
+ Sonde
Hybridation
Autoradiographi
Localisation des
clones d'intérêt
Lavages
Southern-Blot
But: Détecter la présence de séquences d'ADN spécifiques dans un
mélange
Edwin Southern eut l'idée de transférer des fragments de restriction
séparés dans un gel, sur une membrane susceptible de subir le
traitement d'hybridation
Gel Membrane Autoradiogramme
Fragment
d'intérêt
+ sonde

1. Mélange d'AN à séparer
(chargés négativement)
2. Dépôt sur gel d'agarose (0,5 à 20kb) ou
polyacrylamide (< 1000b) (%)
3. Marqueur (tailles connues)
4. Champs électrique
5. Migration: les molécules chargés
négativement migrent vers l'anode par
les pores du gel, à une vitesse
inversement proportionnelle à leur
masse moléculaire (nb de bases)
6. Visualisation des AN: bromure
d'éthydium s'intercale entre les
bases des AN et émet une
fluorescence orange après excitation
aux UV
7. Estimation de la taille et
quantité des fragments par
comparaison avec le marqueur
(seuil de détection: qq ng)
Electrophorèse électrophorèse sur gel d'agarose
+dénaturation dans le gel des
fragments de restriction (NaOH)
+ fixation de l'ADN sur la
membrane par cuisson
(nitrocellulose) ou exposition
U.V (nylon)
transfert sur support
solide par capillarité
(buvardage = blot)
hybridation avec une sonde
marquée dénaturée
Southern-blot
P
r
éh
y
b
r
id
at
i
on
Avant contact avec la sonde spécifique, la membrane est préincubée avec de
l'ADN pour en éliminer tous les sites qui n'ont pas été saturés par l'ADN lors
du transfert.
Hybridation
Ajouter la sonde dénaturée à la solution d'hybridation
La température d'hybridation est définie par le Tm de la sonde soit ~65°C pour
une sonde de + de 100 bases
Applications du Southern-blot
Carte de restriction d'un gène (utilisation de différentes enzymes): détection
de ré-arrangements (délétions ou insertions)
Diagnostic prénatal: différencier forme sauvage et mutante d'un gène
(hybridation avec sonde "sauvage" et "mutante") --> ADN fœtus anormal ne
s'hybridera qu'avec la sonde "mutante"
Identification de gènes d'une parenté éloignée: hybridation à faible
stringence (permet appariement même imparfait) --> nouvelle famille de
régulateurs du développement embryonnaire chez la Drosophile, membres de
cette famille présents chez l'homme
Même principe que le Southern-blot mais ici ce sont les ARN qui sont
étudiés (pas de digestion préalable mais traitement au formaldéhyde pour casser
structures secondaires )
Applications:
- apprécier distribution d'un ARN dans les tissus, étudier son abondance relative
- déterminer la taille d'un ARN
- détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes
d'épissage de l'ARN
Northern-blot
Détection maximale à 96h
d'un ARNm particulier dans
des globules blancs de
patients atteints de leucémie
et induit à différencier
NI 96h 48h