cours

Eucaryotes
ADN
Procaryotes
(bactéries)
exon
ADN
ARN
transcription
transcription
ARNm
traduction
protéine
ARNm
protéine
Hybridation d'acides nucléiques (AN) ou de protéines
Notion de complémentarité: reconnaissance moléculaire
(séquence -AN- ou structure -protéine-)
Complexe sonde-cible (hybride)
ADN-ADN (sonde= complémentaire antiparallèle)
ADN-ARN
protéine-protéine (complexe Ac/Ag)
Hybridation - est spécifique (sonde /cible)
- a lieu même en présence d'un large excès de
molécules similaires mais non identiques
--> détection d'une molécule d'ADN ou d'ARN, ou de
protéine dans un mélange en contenant des milliers de
similaires "trouver une aiguille dans une meule de foin"
traduction
ADN: double brin (A, T, G, C)
ARN: simple brin (A, U, G, C)
Protéines: acides aminés
Dénaturation-renaturation ADN
Principe: Dénaturation (séparation des brins par rupture des liaisons
hydrogènes: tre> Tm ou pH> 12) d'ADN double brins de séquences
différentes
puis réassociation spécifique (conditions favorables de tre et pH)
--> hybridation des ADN simple brin pour former les homoduplex originels.
La température de fusion (Tm)
Un fragment d'ADN de séquence donnée a une Tm qui correspond à la
température où 50% des fragments sont sous forme simple brin.
Hybridation d'acides nucléiques et détection
Mélange AN
Tm dépend de la longueur du fragment d'ADN, de sa composition en
bases, de la présence de certains ions dans le milieu.
Les brins ne peuvent
se renaturer entre
eux, mais peuvent
s'hybrider avec une
sonde marquée s'il y
a complémentarité
Températures d'hybridation et de lavage < à Tm sonde ( 5 à 10°C) -->
favoriser et conserver l'association de la sonde sur sa cible et défavoriser les
mésappariements de la sonde avec une séquence homologue.
Hybridation peut avoir lieu
Les sondes d'acides nucléiques
en solution
support solide :
immobilisation sur membrane, sur verre
colonies bactériennes
chromosome
coupe de tissus...
Objectif : détecter la présence d'un acide nucléique d'une
séquence donnée par utilisation d'une sonde complémentaire
fragment d'ADN ou ARN marqué
sonde radioactive (incorporation de nucléotides radioactifs)
sonde froide
générée in vitro avec une séquence complémentaire de la
séquence recherchée
fragment de restriction
produit PCR
synthèse "commerciale"
Les sondes radioactives (suite)
Les sondes radioactives (chaudes)
sondes mono ou double brins
Phosphate32 (radio-isotope le + utilisé), Soufre35, H3 (tritium)
Incorporé dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs
nucléotides triP radiomarqués
- marquage en 5': T4 polynucléotide kinase ajoute 1P32 en 5' (sonde peu radioactive)
- par amorçage au hasard (Random Priming)
Dénaturation
de la sonde
D NA pol
+dATP,
dGTP,dTTP
+dCTP*
Ajout cocktail
hexamers (6nt,
contenant toutes le
séquences possibles
Dénaturation sonde
et cible
Hybridation
- marquage en 3' :
*avec une ADN polymérase: ADN pol I ou T4, Taq pol(PCR)
(sondes très radioactives car incorporation de x nt*)
+ ATP32
ADN pol I
5'
3'
*avec une exonucléase
*avec une terminal transférase
- marquage par "translation de coupure" (Nick Translation): DNAseI
(conditions ménagées) pour générer quelques coupures simple brin dans le
fragment d'intérêt, puis ADN pol.I pour dégrader l'ADN dans sens 5'-3' au
niveau de ces coupures et repolymériser en présence d'un nt radioactif.
sondes d'ARN (ribosondes) (rendements d'hybridation meilleurs par
rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables)
Attention : les sondes radioactives présentent de nombreux inconvénients :
1. nécessité de se protéger contre le rayonnement émis, maniement des
sondes inconfortable
2. décroissance rapide du P32, d'ou besoin de marquer les sondes
fréquemment
Les sondes froides
Hybridation in situ sur chromosome
digoxigénine
marquage par la biotine-streptavidine.
fluorophore
Attention: problème de sensibilité -->leur utilisation ne fait pas toujours
l'unanimité
Objectif : déterminer sur quel chromosome et dans quelle région se
trouve le gène dont on possède la sonde.
En pratique:
- préparation des chromosomes
- hybridation directement sur les préparations fixées sur lame
- Sonde marquée au tritium (H3): rayonnement très court, donne donc une
localisation fine de la zone émettant la radioactivité.
- résultat lu sous microscope : les signaux positifs
apparaissent sous forme de grains noirs disposés
sur les chromosomes.
Détection d'un
gène de Drosophile
Hybridation sur coupe de tissu
Hybridation in situ
Détection du virus d'Epstein-Barr (sonde reconnaissant ARN = génome du
virus)
Objectif : déterminer quelle sous population du tissu exprime un ARN
donné (un tissu est généralement constitué de différents types cellulaires, pas
toujours faciles à séparer)
- coloration nucléaire bleu foncée des noyaux infectes
- contre coloration verte des autres noyaux
Indications: Syndromes lymphoproliferatifs et lymphomes
Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec
une sonde d'un gène impliqué dans le développement embryonnaire
Southern-Blot
Hybridation sur colonie de bactéries, sur plage de lyse
Objectif: détecter parmi un grand nombre de bactéries ou de phages
recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherché
(criblage de banque).
Boîtes avec colonies
bact ou phages
(milliers à millions)
Coussin de NaOH
(éclattement cellules +
dénaturation ADN
But: Détecter la présence de séquences d'ADN spécifiques dans un
mélange
Edwin Southern eut l'idée de transférer des fragments de restriction
séparés dans un gel, sur une membrane susceptible de subir le
traitement d'hybridation
Gel
Hybridation
Membrane
Autoradiogramme
Lavages
+ Sonde
+ sonde
Prise
d'empreinte
(nylon ou
nitrocellulose)
Fixation
(cuisson ou UV)
Autoradiographi
Localisation des
clones d'intérêt
Fragment
d'intérêt
Electrophorèse
électrophorèse sur gel d'agarose
+dénaturation dans le gel des
fragments de restriction (NaOH)
1. Mélange d'AN à séparer
(chargés négativement)
2. Dépôt sur gel d'agarose (0,5 à 20kb) ou
polyacrylamide (< 1000b) (%)
3. Marqueur (tailles connues)
4. Champs électrique
5. Migration: les molécules chargés
négativement migrent vers l'anode par
les pores du gel, à une vitesse
inversement proportionnelle à leur
masse moléculaire (nb de bases)
6. Visualisation des AN: bromure
d'éthydium s'intercale entre les
bases des AN et émet une
fluorescence orange après excitation
aux UV
7. Estimation de la taille et
quantité des fragments par
comparaison avec le marqueur
(seuil de détection: qq ng)
Préhybridation
Avant contact avec la sonde spécifique, la membrane est préincubée avec de
l'ADN pour en éliminer tous les sites qui n'ont pas été saturés par l'ADN lors
du transfert.
Hybridation
Ajouter la sonde dénaturée à la solution d'hybridation
La température d'hybridation est définie par le Tm de la sonde soit ~65°C pour
une sonde de + de 100 bases
Applications du Southern-blot
Carte de restriction d'un gène (utilisation de différentes enzymes): détection
de ré-arrangements (délétions ou insertions)
Diagnostic prénatal: différencier forme sauvage et mutante d'un gène
(hybridation avec sonde "sauvage" et "mutante") --> ADN fœtus anormal ne
s'hybridera qu'avec la sonde "mutante"
Identification de gènes d'une parenté éloignée: hybridation à faible
stringence (permet appariement même imparfait) --> nouvelle famille de
régulateurs du développement embryonnaire chez la Drosophile, membres de
cette famille présents chez l'homme
transfert sur support
solide par capillarité
(buvardage = blot)
+ fixation de l'ADN sur la
membrane
par
cuisson
(nitrocellulose) ou exposition
U.V (nylon)
Southern-blot
hybridation avec une sonde
marquée dénaturée
Northern-blot
Même principe que le Southern-blot mais ici ce sont les ARN qui sont
étudiés (pas de digestion préalable mais traitement au formaldéhyde pour casser
structures secondaires )
Applications:
- apprécier distribution d'un ARN dans les tissus, étudier son abondance relative
- déterminer la taille d'un ARN
- détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes
d'épissage de l'ARN
NI
Détection maximale à 96h
d'un ARNm particulier dans
des globules blancs de
patients atteints de leucémie
et induit à différencier
96h
48h
Puces à ADN (Micro-arrays)
Dot-blot
Même principe que le Southern-blot mais sans séparation des AN
(ADN ou ARN)
- 21 sondes spécifiques des gènes de virulence
bactériens déposées en tâches (Dot)
A1, C4 et C8: contrôles s'hybridant à toutes les
souches d'E. coli
- hybridation avec l'ADN total des bactéries qui
doivent être testées ainsi qu'un contrôle -si ADN est complémentaire d'une sonde,
reconnaissance,
hybridation,
et
les
tâches
correspondantes sont alors marquées
--> échantillon: 6 gènes de virulence sont identifiés
en plus des trois gènes contrôle
Fin des 90's (séquençage génomes bactériens):
expression d'un seul gène --> profil d'expression d'un maximum de gènes
Mesure simultanée de l'expression de milliers de gènes en une seule
réaction d'hybridation
puces à ADN (représentatives d'un génome) hybridées avec des
ARN ou ADN fluorescents
détection signal par un laser (automate)
traitement informatique des données
"spotted micro-arrays"
ADN sb ou db (100aine de bases) est déposé par un robot sur une lamelle
de verre (1 spot = un gène)
Marquage "sonde" (ARN totaux) par incorporation nt fluorescents
(Cy3- et Cy5-dUTP) par reverse transcription
Utilisation de 2 fluorophores pour marquer le contrôle et le test
Mélange des "sondes" et révélation d'un fluorophore puis de l'autre
- E. coli cultivée en milieu riche ou minimal: expression de 4290 gènes
- Mycobacteirum tuberculosis changements d'expression suite au traitement
antituberculeux --> identification des gènes cibles de l'antibiotique
Chips
Sptotted micro-arrays
15-20
représentations
Une seule
représentation
Marquage
différentiel
RNA 1
+ fluor
RNA 2
+ fluor
RNA 1
+ biot
RNA 2
+ biot
2 hybridations
Chips
oligont synthétisés in situ sur lamelle de verre (1 gène est représenté par
15-20 oligont différents)
Marquage ARN par biotinylation
hybridation sur 2 lames différentes
9337 données/hybridation, soit par expérience 100000 données
--> analyse des données: normalisation, filtre puis détermination des profils
niveau similaire d'expression
Western-blot
Détection
But: Détecter la présence d'une protéine dans un mélange grâce à un anticorps
spécifique de celle-ci
Sandwich d'Ac
2
3
1
4
2ème Ac reconnait le 1er
Détection du signal
- 2ème Ac radioactif --> autoradiogramme
- 2ème Ac couplé à une enzyme (phosphatase alcaline ou
péroxydase) --> réaction colorée
- 2ème Ac couplé à la biotine --> révélation par l'avidine
Comparaison des
diffØrents blots
NB: "protein arrays" existent