03/03/2015 ACHILLE Flora L2 CR: CHABERT Julie BMCP Pr. Roll
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BMCP – Sénescence et stress cellulaire 03/03/2015 ACHILLE Flora L2 CR: CHABERT Julie BMCP Pr. Roll 22 pages Sénescence et stress cellulaire Plan A. Introduction et définitions B. Acteurs-clés et mécanismes moléculaires I. p53 et pRb, deux acteurs-clés dans l'arrêt du cycle cellulaire II. Raccourcissement des télomères (sénescence réplicative) III. Lésion de l'ADN et altération de la matrice nucléaire IV. Stress oxydant V. Stress oncongénique VI.Voies métaboliques VII. Autophagie VIII. Les microARNs C. Caractéristiques de la cellule sénescente I. Modification des fonctions cellulaires avec arrêt du cycle cellulaire II. β-Galactosidase (pH=6,0) et p16Ink4a III. Modifications chromatiniennes IV.Modifications du miRNome - « GeromiRs » V. Inflammation, NF-κB - « Inflammaging » VI.SASP ( Senescence-Associated Secretory Phenotype ) D. Sénescence et pathologie I. Cancer II. Progeria de Hutchinson-Gilford A. Introduction et définitions La sénescence a été premièrement montrée par Hayflick en 1961. C’est un phénomène observé in vitro sur des cellules en culture (par exemple à partir d’une biopsie de peau) : après un certain nombre de divisions (appelées « passage »), les cellules vont entrer en sénescence. C’est la sénescence réplicative. Ce phénomène se produit quelles que soient les conditions de culture : la prolifération cellulaire est limitée ; après un certain nombre de divisions cellulaire, un arrêt irréversible du cycle intervient en phase G1. La sénescence est donc différente de la quiescence, qui est, elle, réversible. Il y a donc une véritable « horloge mitotique » qui conditionne la cellule. Les cellules sénescentes ne sont pas mortes, elles sont actives sur le plan métabolique, et peuvent survivre des semaines voire des années. Les cellules normales ne se divisent pas indéfiniment et le nombre de divisions cellulaires pour lequel une population cellulaire devient sénescente dépend du type de cellule. Toutes les cellules ne sont donc pas égales en ce qui concerne leur réplication et leur entrée en sénescence. 1/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Une cellule normale a une durée de vie limitée, avec des capacités de prolifération qui vont diminuer au cours du temps (c’est-à-dire au cours des divisions) jusqu’à atteindre une limite, appelée limite de Hayflick, à partir de laquelle les cellules vont entrer en sénescence. Quelques cellules sont capables de dépasser cette limite, et vont pouvoir devenir immortelles avec une durée de vie illimitée. Parmi ces cellules, il y a celles de la lignée germinale, les cellules souches embryonnaires, et dans un contexte pathologique, les cellules tumorales. Culture primaire et lignée cellulaire : - La culture primaire : Il s’agit de cellules en culture (biopsie de peau par exemple) avec un potentiel de division (nombre de passages) limité. Les cellules prolifèrent dans la boite de culture (plus ou moins rapidement en fonction de leurs capacités de prolifération), puis arrivent en confluence (elles ont totalement envahi la boite de Pétri). Si on les laisse, il va y avoir une inhibition de contact et elles vont entrer en apoptose. Afin de garder les cellules vivantes, on les « décroche » de la boite en utilisant la trypsine qui va inhiber les adhérences. Puis on fait des « passages » : on passe les cellules dans plusieurs boites successives, en quantité moindre pour qu’elles puissent redémarrer leur prolifération. Les cellules vieillissent au cours des passages et perdent leur capacité de prolifération, puis entrent en sénescence. - Les lignées cellulaires : culture cellulaire établie dont les cellules ont la capacité de se multiplier indéfiniment. Elles ont dépassé la limite de Hayflick et sont donc immortelles. On peut obtenir ces lignées cellulaires immortelles à partir de cellules de culture primaire en y introduisant un oncogène (viral ou cellulaire). Dans le commerce on peut acheter des cellules immortalisées pour faire des manipulations en recherche par exemple. On distingue la sénescence réplicative (que nous venons d'aborder) de la sénescence précoce, due à un stress cellulaire. Elle n’est pas conditionnée par un nombre de passages ou de divisions in vitro. On parle alors de sénescence prématurée ou induite par le stress. Il y a plusieurs stress cellulaires : - Les lésions irréparables de l’ADN - Le stress oxydant - L’activation d’un oncogène - Les drogues psychotoxiques 2/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Il y a une importance fonctionnelle de la sénescence : elle contribue au phénomène de vieillissement de l’organisme. Les cellules sénescentes s’accumulent avec l’âge ce qui peut altérer l’intégrité et les fonctions tissulaires. Mais elle a aussi un effet bénéfique, c’est un mécanisme de suppression de tumeurs, comme l’apoptose, bien qu’il soit imparfait. B. Acteurs-clés et mécanismes moléculaires I. p53 et pRb, deux acteurs clés dans l’arrêt du cycle cellulaire Les protéines p53 et pRb (protéine du rétinoblastome) sont deux acteurs clés dans l’arrêt du cycle cellulaire dans le cadre de la sénescence. Ce sont les produits (protéines) de deux gènes suppresseurs de tumeurs, exprimés physiologiquement dans toutes les cellules normales (très faiblement pour p53), et qui contrôlent l’expression de gènes. - p53 est un facteur de transcription (FRT) se fixant sur les régions régulatrices de gènes cibles. pRb sous forme active (hypo-phosphorylée) bloque le cycle cellulaire en phase G1 via la séquestration du facteur de transcription E2F : c’est un frein moléculaire du cycle cellulaire. Un stress cellulaire entraîne une modification quantitative de p53 et une modification qualitative (phosphorylation) de pRb, avec une inactivation des kinases CDK. Ceci entraîne un arrêt du cycle cellulaire. Le contrôle de la sénescence par la voie p53 : Sous l’effet de signaux de sénescence, un gène va être exprimé et produire deux protéines : p14 et p19 qui vont réguler négativement la quantité MDM2. MDM2 est une ubiquitine ligase qui fixe p53 et induit sa dégradation. La quantité de p53 va augmenter car elle sera moins dégradée, et elle induit une augmentation de p21 qui va quant à elle inhiber le couple cycline E/CDK2, ce qui va provoquer un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 3/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire La protéine p53 a un rôle très important puisqu’elle contrôle le moment où (c'est-à-dire après combien de divisions cellulaires) les cellules entrent en sénescence. Pour confirmer ce rôle, on peut faire des modèles murins : - Chez la souris p53-/- (KO de p53) : les cellules n'entrent pas en sénescence, cependant la souris meurt de manière prématurée du fait d'une augmentation de formation de tumeurs. Cela montre le mécanisme suppresseur de tumeur de la p53. - Chez la souris mutante avec p53 surexprimée : les souris sont résistantes au développement de tumeurs mais subissent en revanche un vieillissement prématuré. Ces expériences montrent que lorsqu’il n’y a pas de sénescence, il va y avoir une tendance à la cancérisation ; en revanche la sénescence fait qu’il y aura peu ou pas de cancers, mais un vieillissement. P53 est donc la « gardienne du génome » par son mécanisme suppresseur de tumeur. Le contrôle de la sénescence par la voie pRb : Les signaux de sénescence vont aussi provoquer une augmentation de la protéine p16 qui va inhiber le couple cycline D/CDK4, ce qui va entraîner la diminution de la phosphorylation de pRb, donc l’augmentation de sa forme active hypo-phosphorylée. pRb peut alors séquestrer E2F ce qui a aussi pour effet l’arrêt du cycle cellulaire en G1, le ralentissement des phases de réplication (S) et mitose (M). II. Raccourcissement des télomères (sénescence réplicative) Le phénomène de raccourcissement des télomères est à l'origine de la sénescence réplicative. Les télomères correspondent à des séquences répétées TTAGGG associées à des protéines spécialisées formant ce que l'on appelle un capping (un chapeau protecteur). Ils sont situés aux extrémités des chromosomes et les stabilisent, empêchant ainsi la fusion de l’ADN entre deux chromosomes et l'instabilité. On peut utiliser des techniques d’hybridation FISH pour les marquer. 4/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire A chaque cycle cellulaire, il y a un raccourcissement du télomère des chromosomes (on perd 50 à 200pb à l'extrémité 3' à chaque réplication d'ADN). Lorsque le télomère est trop court, il y a un arrêt des divisions, entraînant ainsi la sénescence et la mort cellulaire. La taille des télomères dans les cellules germinales est plus importante que dans les cellules somatiques (10 kb contre 15 à 20kb) expliquant ainsi pourquoi les cellules germinales se divisent plus longtemps. Les cellules en culture entrent en sénescence pour une longueur de télomère donnée (pour la plupart des cellules : entre 4 et 6kb ce qui correspond à un nombre de divisions compris entre 50 et 70). La télomérase est une enzyme dont le rôle est de lutter contre le raccourcissement des télomères en synthétisant de l’ADN à l’extrémité 3’ des télomères. C’est une ribonucléoprotéine (RNP), c’est-à-dire une association d’un ARN et d’une protéine. La présence de la séquence d'ARN est importante dans la mesure où elle va jouer le rôle de matrice permettant le rallongement de quelques nucléotides en s'hybridant temporairement à l'ADN télomérique. C'est grâce à ce mécanisme que l'on peut avoir le maintien de la longueur des télomères. NB : Le vert correspond aux cinq nucléotides TTTTA de la première ligne et au trois G au dessus des flèches. Quant au rouge, il s'agit de la ligne du dessous, en entier. 5/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire En réalité, la plupart des cellules n'expriment pas cette RNP ou du moins très faiblement. Seules quelques cellules la surexpriment de manière physiologique, ce qui explique qu’elles puissent vivre beaucoup plus longtemps, voire indéfiniment. Ce sont les cellules germinales, les cellules souches, quelques cellules somatiques adultes, mais aussi dans un contexte pathologique, les cellules tumorales. Réalisation de modèles murins : - Les souris KO pour la télomérase (télomérase-/-) ont une durée de vie diminuée, une perte de fertilité, une atrophie tissulaire, une insuffisance rénale, mais aussi une diminution du nombre de cancers et une augmentation de la p53 dans les tissus. Il y a donc une entrée en sénescence précoce. Le raccourcissement des télomères entraîne en effet une augmentation de p53. - La surexpression de télomérase dans des fibroblastes humains a pour effet de maintenir la sénescence, voire de les immortaliser. La télomérase est un mécanisme de survie des cellules, mais ce n’est pas le seul mécanisme en cause. III. Lésions de l’ADN et altération de la matrice nucléaire Elles vont entraîner une sénescence précoce. Les lésions irréparables, les cassures double-brin par des rayons ionisants, l'altération de protéines (enzymes de réparation…) et le dysfonctionnement des télomères par exemple entraînent un dépassement des capacités de réparation. Ceux-ci caractérisent le stress cellulaire et induisent la sénescence prématurée. La matrice nucléaire est très importante pour maintenir les capacités de réparation. Elle est composée par des protéines de la famille des filaments intermédiaires nucléaires : lamines A et C, B1 et B2. La lamina sous l'enveloppe nucléaire forme un réseau assez dense interagissant avec les protéines de l’enveloppe nucléaire. Il y a de plus un dialogue très important entre les protéines de la matrice nucléaire et les fonctions du noyau (structure…). Toute anomalie de la matrice nucléaire peut avoir un retentissement sur la structure et les fonctions du noyau. Par exemple dans la Progeria, il y a production d’une protéine lamine A anormale, ce qui provoque des anomalies nucléaires et des anomalies de réparation de l’ADN, et donc une sénescence précoce. 6/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire IV. Stress oxydant Le stress oxydant est en relation avec la production des espèces réactives de l'oxygène ERO, ou ROS (reactive oxygen species). Elles correspondent à la production par la mitochondrie et à partir de l’oxygène, de différentes espèces réactives : Ces ROS ont plusieurs origines endogènes : la mitochondrie majoritairement, mais aussi le peroxysome, la NADPH oxydase de la membrane plasmique, ou encore le réticulum (cytochromes P450). Elles peuvent aussi avoir une origine exogène, par exemple l’exposition aux UV ou aux xénobiotiques. Elles ont un rôle physiologique (elles ne sont pas toujours toxiques) car elles sont impliquées dans des cascades de signalisation cellulaire, à des niveaux faibles. Ce n’est que lorsqu’elles s’accumulent qu’elles vont avoir un rôle toxique pour la cellule qui pourra alors entrer en apoptose ou sénescence. Leur production se fait majoritairement dans la mitochondrie, au niveau des sites I et III de la chaîne respiratoire. Cette production est faible en conditions normales, mais lors d’un dysfonctionnement de la chaîne, il y aura une hyperproduction.. 7/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Les ROS sont contrebalancées par des mécanismes de défense mis en place par la cellule : - La SOD (SuperOxyde Dismutase) qui transforme l’anion super oxyde O 2- en peroxyde d’hydrogène H2O2 - La glutathion peroxydase et la catalase qui hydrolysent le peroxyde d'oxygène en H2O. - La glutathion réductase - Les radicaux scavenger hydrophiles (acide ascorbique : Vitamine C) et lipophiles (tocophérol : Vitamine E) - Flavonoïde et carotène On peut mesurer cette activité au cours du stress oxydant par des techniques biochimiques, ou en quantifiant la production de ROS par cytométrie de flux. En situation physiologique, on a un équilibre REDOX entre la production de ROS et d’anti oxydants. Les ROS produits suite à une stimulation (signalisation, stress cellulaire, inflammation ou irradiation) pourront être un signal pour la cellule dans des conditions physiologiques. Elles seront importantes notamment pour la croissance, le développement, les mécanismes d’inflammation, et l’adaptation cellulaire. En revanche, lorsque la concentration de ROS augmente, elles deviennent toxiques pour l’ADN, l’ARN, les protéines, les lipides et les sucres. La cellule en présence de production de ces espèces va s’adapter : - Induction des gènes codant pour des enzymes anti-oxydantes, des enzymes de réparation de l’ADN… - Répression des systèmes de production de ROS : chaîne respiratoire, cytochrome P450, NADPH oxydase Il se produit un stress oxydant lorsqu’il y a un déséquilibre, les capacités anti-oxydantes sont dépassées, il y a une toxicité au niveau : - Des lipides avec une diminution de la fluidité membranaire - De l’ADN avec une oxydation de bases entraînant des lésions de l’ADN - Des protéines avec l’inactivation de certaines enzymes. 8/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Théorie radiculaire du vieillissement : implication de l’hyperoxydation cellulaire à l’origine du vieillissement. C’est pour ça qu'on dit qu’il faut manger ou boire des anti-oxydants. La surexpression de la superoxyde dismutase sur des fibroblastes humains en culture primaire entraîne une augmentation de leur durée de vie. La souris KO pour la superoxyde dismutase va avoir une induction précoce de la sénescence via une augmentation de la p53. La théorie radiculaire de Harman ( 1956 ). Au cours du vieillissement, il a une diminution de l'intégrité mitochondriale avec des altérations morphologiques fonctionnelles (la production de ROS est augmentée, celle d'ATP diminuée). C’est un dysfonctionnement de la respiration mitochondriale au profit de la production de réactifs toxiques. L'altération globale d'un ensemble de fonctions physiologiques entraîne une susceptibilité aux maladies. La théorie soutient que ces altérations sont dues à l'accumulation de molécules oxydées, ce qui explique les conséquences cellulaires de l'oxydation qui en résultent au niveau de l’ADN, des protéines et des lipides. Cette théorie n’est pas fausse mais ce n’est pas le seul mécanisme mis en jeu V. Stress oncogénique Les protéines Ras sont des protéines G monomériques associées à la membrane plasmique par un groupement farnésyl. Elles sont activées suite à la fixation de facteurs de croissance à leur récepteur tyrosine kinase. Il y a autophosphorylation du récepteur puis activation de Ras (échange du GDP par du GTP) par les protéines GrB2 et SOS. Il s’ensuit une cascade de protéines kinases à l’intérieur de la cellule faisant intervenir Raf et la protéine kinase MEK. Puis ERK est activée et entre dans le noyau et va agir via ETF (qui est un FRT) sur l’expression des gènes. 9/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Lorsqu’il y a une hyperfonction de cette cascade, il va y avoir un stress oncogénique qui peut être à l’origine de cancers. Il y a par exemple des mutations activatrices de Ras, une hyperactivation constitutive du récepteur… Ces phénomènes vont être à l’origine de thérapies ciblées : on essaye d’identifier les mutations spécifiques activatrices des récepteurs par exemple, et on va adopter une thérapie ciblant cette hyperactivation. Le traitement est spécifique et adapté à la carte d’identité moléculaire de la tumeur. Ces thérapies sont utilisées en routine dans certains cancers (poumon…). Dans les lignées cellulaires établies, l’activation de l’oncogène Ras ou Raf entraîne une cancérisation avec un pouvoir de transformation. Dans les cellules en culture primaire : - L’activation de Ras ou Raf ne donne un pouvoir de transformation aux cellules normales que si il y a activation d’un autre oncogène. - S’il n’y a pas d’activation d’un autre oncogène, il y aura arrêt du cycle cellulaire entraînant donc une sénescence après un faible nombre de divisions sans faire intervenir le raccourcissement des télomères, c’est une sénescence prématurée. 10/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire VI. Voies métaboliques - IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) et IGF-1R (son récepteur) Cette voie appartient à l’axe somatotrope : L'hormone hypothalamique entraîne l'activation d'une hormone hypophysaire. Au niveau du foie, l'IGF-1 est activé avec des effets périphériques (croissance, différenciation, reproduction, métabolisme et vieillissement). Lorsqu’on inactive cet axe, on va avoir un effet sur la croissance, la reproduction et le vieillissement avec une longévité augmentée de 20 à 40%. Mécanisme : la diminution du taux circulant d’IGF-1 ou une carence en son récepteur entraîne l’augmentation de la résistance au stress oxydant. - L’insuline et son récepteur On obtient une augmentation de la longévité chez des souris pour lesquelles le récepteur de l'insuline est inactivé dans le tissu adipeux. La restriction calorique obtenue (différente d'un déficit nutritionnel) est très efficace chez les mammifères grâce à une diminution du métabolisme basal et donc une diminution de la consommation de dioxygène et de production d’espèces réactives de l’oxygène, et donc une augmentation de la résistance au stress oxydant. La restriction calorique semble aussi efficace chez l’Homme puisque les habitants de l’île d’Okinawa au Japon comptent un grand nombre de centenaires, et adoptent dans leur mode de vie une restriction calorique. Il s'agit donc d'une augmentation de la résistance au stress oxydant grâce à plusieurs mécanismes : - Diminution des dégâts oxydants - Diminution des produits de glycation (fixation de sucres sur des protéines) - Diminution du taux d'IGF Une souris avec restriction calorique depuis la naissance aura une masse corporelle bien inférieure à la souris qui suit une alimentation normale, mais sa durée de vie sera plus longue. Une souris avec restriction calorique depuis l'âge de 12 mois aura une masse corporelle légèrement inférieure à la souris qui suit une alimentation normale et sa durée de vie sera également allongée. Plus la restriction calorique est faite tôt, plus les souris vont vivre longtemps Les rats ayant subi une restriction calorique ont une consommation d’oxygène plus faible que des rats normaux et leur production de dérivés réactifs est aussi diminuée. 11/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire - SIRT 1 (sirtuine 1) Il s'agit d'une protéine importante : une histone déacetylase de la famille des sirtuines. Elle a donc un impact sur la régulation épigénétique. Elle est orthologue de Sirt-2 chez C.Elegans et la drosophile, elle-même impliquée dans la longévité. Une sur-expression de Sirt-2 chez la souris entraînera une augmentation des défenses anti-oxydantes et une augmentation de la longévité. Elle est activée par : - La restriction calorique - Resvératrol : polyphénol présent dans certains fruits comme le raisin (peau) et le vin rouge. On sait qu’elle augmente la résistance à la sénescence, et qu'elle est impliquée dans une multitude de fonctions bénéfiques pour les cellules : diminution du stress oxydant, augmentation de la réparation de l’ADN, diminution de la quantité de p53, rôle dans la suppression de tumeurs… - Klotho Il s'agit d'une hormone qui supprime l'auto-phosphorylation de l'IR et de l'IGF-1R nécessaire à leur activation. Elle entraîne donc une augmentation de la résistance au stress oxydant par diminution de la production de ROS et donc par stimulation d'enzymes de défenses anti-oxydantes. La sur-expression chez la souris de klotho entraîne une augmentation de longévité de 20%. La souris KO pour Klotho présente un vieillissement accéléré. 12/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire VII. Autophagie Ce phénomène est présent dans les cellules eucaryotes. Il s'agit d'un processus de dégradation de matériel cellulaire. Le matériel va être séquestré dans une membrane. Le matériel sera ensuite délivré aux lysosomes selon 3 mécanismes : - Macro-autophagie en haut sur le schéma, et sur le schéma ci contre. - Autophagie médiée par les chaperonnes : reconnaissance des protéines par Lamp2 avec l’aide d’une chaperonne Hsp, puis translocation dans le lysosome de la protéine à dégrader, à gauche sur le schéma. - Micro-autophagie : mécanisme d’invagination directe de la membrane lysosomale, en bas à droite sur le schéma. Il se forme une membrane qui va entourer l’organite à éliminer pour former ce que l'on appelle l'autophagosome dans un premier temps. La deuxième étape est la fusion avec le lysosome qui apporte des hydrolases acides. Cette fusion permet la dégradation et le recyclage des éléments. 13/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire L'autophagie est activée en cas de stress cellulaire, de privation de nourriture, d'hypothermie ou d'hypoxie. On observe une diminution du phénomène d’autophagie avec l’âge (au cours de la sénescence), mais quelques cas sont décrits pour lesquels il existe une augmentation. Avec la sénescence, il y aura donc une augmentation des organites cellulaires endommagés et une activité lysosomale plus faible. Cependant, pour les animaux ayant subi une restriction des apports caloriques, moins d’organites seront endommagés. La restriction calorique prévient la diminution de l’autophagie liée à l’âge. VIII. Les microARNs Il s'agit de petits ARNs non codants (18 à 25 nucléotides). Ils permettent la régulation de l'expression des gènes (post-transcriptionnelle et plus ou moins transcriptionnelle). Dicer est une enzyme permettant la maturation des miARNs. Chez la souris KO pour Dicer, un phénotype sénescent apparaît. Ce phénotype est dépendent de la p53. Les miARNs sont des acteurs clés pour prévenir la sénescence. Ils agissent en ciblant des molécules clés : - miR-24 qui réprime p16 - miR-128 qui cible le locus du gène Ink4a codant pour les protéines p16 p14 et p19 - miR-34 qui cible directement les régulateurs du cycle cellulaire et du stress oxydant, donc SIRT-1 (Ces exemples ne sont pas à retenir) C. Les caractéristiques de la cellule sénescente I. Modifications des fonctions cellulaires avec arrêt du cycle cellulaire En fonction du type cellulaire, il va y avoir une induction de l’apoptose, ou au contraire une résistance. Il va y avoir des modifications phénotypiques classiques avec une altération des fonctions cellulaires. Toutes les cellules sénescentes présentent : - Une augmentation du volume cellulaire et nucléaire - Une modification de l'organisation nucléaire (morphologie particulière, hétérochromatine réarrangée...) - Accumulation de lysosomes - Altération de la fonction d'autophagie - Augmentation de la quantité de mitochondrie - Altération du cytosquelette - Modification profil d'expression des gènes - Expression d'une β-galactosidase acide lysosomale (pH=6) spécifique. Permet le marquage des cellules sénescentes. a. Augmentation du volume cellulaire : Sur cette photo, on voit que les fibroblastes sénescents sont deux fois plus gros que les cellules normales. 14/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire b. Arrêt irréversible de la division cellulaire C’est un arrêt définitif du cycle en phase G1. Il est irréversible quel que soit le stimulus mitogène. Il a un double effet : - C’est un mécanisme bénéfique pour les organismes jeunes, car il a un rôle dans la suppression imparfaite de la tumorigénèse, l’entrée des cellules en sénescence empêchant la prolifération de cellules cancéreuses. - Pour les organismes âgés, l'effet cumulatif non spécifique à long terme entraîne une augmentation du nombre de cellules sénescentes qui entraînent également des lésions tissulaires. C’est un phénomène de pléiotropie antagoniste II. Marqueurs de la sénescence : bêta – galactosidase acide et p16Ink4a La bêta-galactosidase acide est un marqueur spécifique des cellules sénescentes. NB : On peut soit utiliser un marqueur coloré pour la détecter au microscope (photo du haut), soit utiliser la cytométrie de flux (photo du bas). Le deuxième marqueur important est le p16Ink4a. Il est non exprimé dans les cellules quiescentes ou différenciées. Il est détectable et identifiable au Western-Blot. L'augmentation est associée à la réduction des cellules souches observées dans de nombreux tissus au cours du vieillissement. III. Modifications chromatiniennes Ce sont des modifications épigénétiques qui entraînent une réorganisation de la chromatine avec un changement de la composition en histones et en modifications post-traductionnelles (méthylations...). La formation de foci d'hétérochromatine = SAHF (senescence associated hetero foci ) est une structure avec de nombreuses protéines. Le SAHF a un rôle dans la répression des gènes associés à la prolifération. Les points blancs sur la photo de droite correspondent à de l’hétérochromatine : chromatine très compactée où l’ADN ne peut pas être transcrit. 15/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire IV. Modifications du miRNome – (« GeromiRs ») Il s'agit de modifications d'expression de miARNs modifiés dans les cellules sénescentes, avec en aval une régulation des gènes des voies impliquées dans la sénescence. On parle de géromiRs pour désigner les miARNs impliqués dans la sénescence et ciblant les protéines clés de la régulation du cycle cellulaire. Il est intéressant de les étudier dans des maladies comme la Progeria. V. Inflammation, NFkB Inflamma’aging : Il s'agit d'un état d'inflammation chronique, stérile. Il aboutit à une destruction cellulaire tissulaire avec des dysfonctions à l'origine de pathologies liées à l'âge. L’inflamma’aging est donc une inflammation chronique entraînant le vieillissement. Après l'arrêt du cycle cellulaire, il va y avoir une expression de cytokines pro-inflammatoires. L'IL-1a active le NF-κB qui entraîne ensuite l’expression d'autres cytokines pro-inflammatoire (IL6 et IL8), ce sont des secrétions spécifiques du SASP (phénotype sécrétoire de ces cellules, voir ci-dessous). Il contribue à la déplétion du pool de cellules souches adultes (niches) et entraîne l'altération de l'homéostasie tissulaire et cellulaire et donc le vieillissement. Le vieillissement entraîne également un épuisement du système immunitaire : on parle d'immuno-sénescence. C’est ce qui se passe avec le VIH, il y a une inflammation chronique en dehors de l’agression des LTCD4. 16/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire VI. SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype) Les cellules sénescentes vont modifier leur environnement. Les sécrétions (sécrétome ) du SASP sont spécifiques : - Protéines : cytokines (IL6, IL8), chémokines, facteurs de croissance, protéases (métalloprotéases) de la MEC qui entraînent donc une réponse inflammatoire, un chimiotactisme, le remodelage de la MEC et le maintien de l'état de sénescence. - Des acides nucléiques miARNs. Le SASP agit de façon autocrine ce qui renforce l'état sénescent de la cellule, et aussi de façon paracrine en stimulant la réponse inflammatoire et la dégénérescence tissulaire pro-tumorigène. Il va y avoir propagation de l’inflammation aux cellules alentours. Sur ce schéma : activation de NF-kB par la cellule, qui va sécréter des cytokines proinflammatoires avec un effet autocrine et paracrine (sur les cellules voisines, sénescentes ou non, mais ayant une action sur les deux). Parmi les miARNs sécrétés, il y a des miARNs qui ont un effet anti-inflammatoire, permettant de réguler négativement cette inflammation. Mais cet effet est relativement faible et ne pourra pas contrebalancer l’action des cytokines. 17/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Schéma récapitulatif : D. Sénescence et pathologies I. Cancer 18/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Comme l’apoptose, la sénescence est un mécanisme suppresseur de tumeurs. Lors d’une lésion de l’ADN, de l’altération des fonctions des télomères, de l’activation d’oncogènes, ou de l’augmentation de production de ROS, il y aura une activation de p53 puis p16 et p21, ce qui pourra soit : - entraîner une sénescence (premier mécanisme suppresseur de tumeurs), - soit aboutir à une réparation de l’ADN ou une résistance au stress - soit la cellule entre en apoptose (deuxième mécanisme suppresseur de tumeurs) La sénescence ou l’apoptose sont induites en réponse à des événements pouvant induire le cancer dans des cellules qui peuvent se diviser, aboutissant à la protection contre le développement de tumeurs. 19/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire • Dans les cellules normales, p53 et pRb sont actifs et il y a peu ou pas d’activité télomérase, il y a entrée en sénescence une fois la limite passée. • Si on inactive seulement une des deux protéines, l’entrée en sénescence est retardée mais pas empêchée : la cellule entre en sénescence avec des télomères très courts • Si on inactive à la fois p53 et pRb, les capacités de proliférations seront meilleures, et il va y avoir un phénomène de crise avec apparition de variants cellulaires immortels et généralement une réactivation de la télomérase. SASP et cancer Le SASP a une action pro-tumorigène : - L’IL6 et l’IL8 stimulent les cellules épithéliales prémalignes et malignes pour envahir la lame basale - Au niveau des fibrobalstes sénescents, il y a la sécrétion de VEGF qui va stimuler la migration et l’invasion de cellules endothéliales (angiogénèse alimentant la tumeur en vaisseaux). Il y a de plus la sécrétion de métalloprotéases qui vont moduler la matrice extracellulaire et augmenter le potentiel invasif. → Les cellules sénescentes à proximité des cellules tumorales vont avoir un effet néfaste en facilitant leur invasivité Exp in vitro - Lorsqu’on met des cellules épithéliales pré-cancéreuses en présence de fibroblastes sénescents, il va y avoir le développement de tumeurs. Lorsqu’on les met en présence de fibroblastes normaux ou pré-sénescents, il n’y aura pas de tumeurs II. Progéria La progéria de Hutchinson-Gilford dans sa forme classique correspond à un vieillissement accéléré : - Incidence : ¼ - 8 millions Poids normal à la naissance Retard staturo-pondéral très marqué (440g/an après 2 ans) Lipoatrophie (atrophie du tissu adipeux) et amyotrophie (atrophie musculaire) généralisées Taille finale 100-110cm Poids final 10-15kg Pas de maturation sexuelle Fonctions cognitives conservées Décès vers 13.5 ans (infarctus du myocarde +++) Il s'agit d'une mutation ponctuelle de novo du gène LMNA (code pour une protéine lamine) sur l’exon 11, ce qui entraîne l’apparition d’un site cryptique d’épissage, prématuré dans l’exon 11 (l’épissage normal se faisant entre l’exon 11 et l’exon 12, une partie de l’exon 11 ne sera pas présent). On obtient une protéine délétère, de 50AA, restant farnésylée (elle reste donc ancrée à l’enveloppe nucléaire, alors que la lamine A est soluble) appelée la progérine. 20/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Anomalies morphologique, désorganisation de l’hétéro-chromatine Suite à 23 passages in vitro (les passages reflètent les divisions cellulaires) : noyau dysmorphique, et accumulation de la progérine. Il va y avoir une anomalie induite de la matrice nucléaire à cause de l’accumulation de progérine au cours du vieillissement, et de plus une diminution de la lamine A normale dans le reste du noyau (la mutation est hétérozygote, il y a 50% de production de progérine et 50% de production de lamine A, donc si la progérine augmente, il y aura moins de lamine A normale). Les rôles structural et fonctionnel de la matrice nucléaire sont altérés (voir schéma) Il y a donc apparition d’une sénescence précoce, et c’est une maladie qui reflète très bien tous les mécanismes (dé)régulés au cours de la sénescence. On est en train d’essayer d’inverser ces phénomènes. Des recherches sont faites sur le vieillissement pathologique et physiologique. 21/22 BMCP – Sénescence et stress cellulaire Syndrome de Werner (WS) : « progeria de l’adulte » Signes de vieillissement prématuré : - Cheveux fins, gris et rares - Nez fin - « faciès d’oiseau » - Sclérodermie - Lipoatrophie au niveau du visage - Calcifications sous-cutanées - Athérosclérose précoce Il en existe deux formes : - Typique : o Mutation homozygote de RECQL2 qui est une ADN hélicases de la famille recQ, impliquée dans la réparation de l’ADN et le maintien des télomères o Petite taille, cataracte bilatérale, diabète (type 2), incidence élevée de cancers. - Atypique o Mutations hétérozygotes de LMNA o Pas de petite taille, pas de diabète, pas de néoplasie Le phénomène de vieillissement est très complexe avec de nombreux acteurs interconnectés : noyau, mitochondrie, lysosomes, matrice extracellulaire. Au cours de la progeria il y a production de progérine, qui est aussi produite de manière physiologique en très faible quantité, et qui s’accumule aussi au cours des passages. Si on prend des cellules d’un sujet âgé, elles auront la même morphologie au microscope que celles de patients atteints de progeria, et si on fait un western-blot, on y retrouvera de la progérine. Il y a donc un parallèle entre les vieillissements physiologique et pathologique, puisqu’on retrouve le même mécanisme (mais à un niveau très inférieur en physiologie). L’étude de maladies génétiques très rares (50 cas dans le monde) peut être très importante pour comprendre des mécanismes physiologiques. Les deux visages de la sénescence : - Sujet jeune : la sénescence est bénéfique : elle contribue à former une barrière anti-tumorale et intervient dans le processus de cicatrisation (visage avenant de la sénescence) - Sujet âgé : visage sournois de la sénescence : vieillissement, pathologies liées à l’âge avancé, cancers (mais pas dans la progéria car le vieillissement est trop rapide) 22/22
