Mémoire Présenté Diagnostic moléculaire du
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N° d’Ordre……………..BioGeMA UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------UNITE DE FORMATION ET DE RECHERCHE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE (UFR/SVT) LABORATOIRE DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE (LABIOGENE) Mémoire Présenté Par : OUEDRAOGO Rogomenoma Alice Pour l’obtention du Master II de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire Appliquées de l’Université de Ouagadougou SUR LE THEME: Diagnostic moléculaire du cytomégalovirus, de l’herpès virus humain de type 6 et d’Epstein-Barr virus par la PCR en temps réel chez les femmes enceintes du centre médical saint Camille de Ouagadougou. Soutenu le16 Novembre 2013 devant le jury composé de : Président : Nicolas BARRO, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou ; Membres : Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou ; Virginio PIETRA, Chargé de Recherche, Université de Brescia, Italie ; Djénéba OUERMI, Maitre Assistant, Université de Ouagadougou. Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA De nos jours, les connaissances avancées en génétique et biologie moléculaires sont incontournables pour conduire des études de hautes valeurs ajoutées en sciences biologiques. Les outils de la Biologie moléculaire ont permis d’accomplir de grands progrès dans le domaine du diagnostic, de la pharmacie, de la thérapeutique, de l’agriculture et même dans l’aide à la justice par l’identification humaine. Les Universités et les laboratoires de recherche des Pays membres de l’UEMOA dans leur grande majorité, restent arrimés aux pays et laboratoires de recherche du Nord pour leurs besoins en recherches et activités en génétique et biologie moléculaires. Cet état de fait est lié au déficit en personnel qualifié et le manque de ressources financières et matériel pour conduire les recherches en local in situ. Cela a pour conséquence, une non maîtrise de la finalité ainsi que de l’utilisation des résultats et produits des recherches que nous conduisons, une surenchère du coût des examens et des études en biologie et génétique moléculaires. Un autre corollaire et non des moindres de cet état de fait est la fuite de capitaux mais également la fuite des cerveaux car les étudiants les plus compétents envoyés dans les pays du Nord ont tendance à y rester. Le master en Biologie Moléculaire et en génétique moléculaires appliquées (BioGeMA) a pour but de combler le vide constaté dans l’expertise en génétique et biologie moléculaires par la mise à disposition des pays de l’espace UEMOA, de personnels qualifiés, de haut niveau de compétences pour conduire des études et recherches en génétique et biologie moléculaires. Le master BioGeMA est : Un Master à dimension sous-régionale Géré par un réseau de chercheurs et praticiens en génétique et biologie moléculaires Soutenu par une plateforme technologique sous-régionale à LABIOGENE (Laboratoire de Biologie et de Génétique Moléculaires) Ce Master a pour objectif de former des biologistes, des pharmaciens, des vétérinaires et des médecins biologistes capables d’effectuer des diagnostics biomoléculaires dans des centres hospitaliers et d’élaborer des études d’investigations dans des structures de recherches. En outre, il ouvrira la porte d’études doctorales aux meilleurs étudiants pour permettre la formation de chercheurs et d’enseignantschercheurs afin d’assurer la relève du corps enseignants, la constitution d’une masse critique d’experts africains et la mise en place d’un véritable réseau africain de recherche dans le domaine ci-dessus cité. Professeur Jacques SIMPORE Professeur Titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire UFR/SVT - École Doctorale Sciences et Technologies et Technologies Université de Ouagadougou – Burkina Faso Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page i DEDICACES Je dédie ce mémoire : A mon Père Yssouf Marc Désiré OUEDRAOGO et à ma Mère Salmata Cécile OUEDRAOGO/ SAWADOGO pour leur compréhension, bénédictions, encouragements et assistance ; A mes Sœurs, frères et Parents pour leur accompagnement, l’affection et la complicité, A tous les amis qui ont su nous encourager et nous faire sentir leur présence à nos côtés, A toutes ces femmes VIH séropositives qui souffrent dans leur chair et dans leur âme à cause du rejet de leur famille et/ou de notre société et à toutes les personnes qui s’investissent pour leur cause ; Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page ii REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé au Centre Médical Saint Camille et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) de Ouagadougou (Burkina Faso). Nous exprimons notre profonde gratitude : - à notre Maître et directeur de mémoire, le Professeur Jacques SIMPORE, Professeur titulaire de génétique et de biologie moléculaires ,directeur du CERBA/LABIOGENE, du laboratoire du CMSC et Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA) . Nous sommes très marquée de l’honneur que vous nous avez fait en nous acceptant dans vos laboratoires bien équipés, de nous encadrer avec rigueur, patience et une disponibilité permanente malgré vos multiples charges, de nous avoir choisi un thème pertinent et nous avoir entouré de votre soutien moral et matériel; - à notre Maître, le Professeur Nicolas BARRO, pour la haute supervision et le soutien dont il n’a cessé de montrer à notre endroit. Malgré vos multiples occupations, vous avez accepté de suivre et de juger ce travail. Soyez-en remercié - au Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA, aux Docteurs Charlemagne GNOULA et Virginio PIETRA pour la qualité de leur enseignement ; - au Docteur Cyrille BISSEYE, pour l’encadrement technique au laboratoire et son aide précieuse dans la réalisation de ce travail ; - aux Docteurs Djénéba OUERMI , Florencia DJIGMA, Linda Tani SAGNA et à madame Zoenabo DOUAMBA pour leur disponibilité, leurs conseils et leur contribution à la réalisation de ce travail ; - à tous nos enseignants du Master BioGéMA ; - à la Commission de l’UEMOA pour leur soutien financier dans la réalisation de nos travaux de mémoire du Master II à travers le Pacer II; - à la Conférence Episcopale Italienne (CEI) pour leur soutien financier ; à toute l’équipe du CERBA/LABIOGENE, au personnel du laboratoire du CMSC de OUAGADOUGOU et à tous les étudiants de notre promotion pour la bonne ambiance, les conseils et les encouragements ; Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page iii RESUME Introduction : Les herpès virus sont très répandus dans le monde entier. La présente étude se porte sur trois herpès virus, notamment EBV, CMV et HHV-6. Ces trois virus évoluant sous le modèle pandémique sont impliqués dans des infections congénitales pouvant provoquer des séquelles graves chez les nouveau-nés. L’objectif de cette étude est de déterminer les prévalences de CMV, EBV et HHV-6 chez les femmes enceintes de Ouagadougou à sérologie VIH plus ou moins connue. Méthode : nous avons diagnostiqué par PCR multiplex en temps réel l’infection à EBV, CMV et HHV-6 dans 200 échantillons constitués de plasma sanguin de femmes enceintes : dont 100 femmes VIH séropositifs et 100 femmes VIH séronégatifs. L’ADN de ces herpès virus humains a été extrait à l’aide du Kit «DNA-Sorb-B» de SACACE biotechnologies® puis amplifié grâce au Kit « Multiplex Real Time PCR Kit for quantitative detection and differentiation of Cytomegalovirus (CMV), Epstein Barr virus (EBV), and Human Herpes 6 virus (HHV6)» de SACACE biotechnologies®. Résultats : sur l’ensemble des 200 échantillons analysés, 18 (9,0%) étaient positifs à au moins un des trois virus, 12 (6,0%) étaient positifs au EBV, 13 (6,5%) positifs au CMV et 12 (6,0%) positifs au HHV-6. Parmi les 18 cas d’infections, nous avons trouvé 10 cas de coïnfections soit un taux de 55,6% (10/18) dont 90,0% (9,0/10) d’infection multiple EBV/CMV/HHV6 et 10,0% (1/10) d’association EBV/HHV6. Par ailleurs, des coïnfections EBV/CMV ou CMV/ HHV6 n’ont pas été détectées chez les femmes enceintes de notre étude. En fonction de la sérologie VIH, nous avons trouvé 12,0% d’infections aux Herpès Virus Humains (HHVs) chez les femmes VIH séronégatives et 6,0% chez les femmes VIH séropositives. Le taux de coïnfection était respectivement de 6,0% et 4,0%. Parmi les VIH séropositives, la PCR a révélé 7,1% (soit 6/85) d’infection HHVs chez celles qui n’étaient pas sous thérapie ARV et 0% chez les femmes enceintes VIH séropositives soumises à une thérapie ARV. Les HHVs ont été beaucoup plus isolés chez les ménagères (P= 0,418). Conclusion: Nous avons trouvé une faible prévalence du CMV, d’EBV et de HHV6 chez les femmes enceintes. La prévalence des herpès virus humains était plus élevée chez les femmes enceintes VIH négatives que chez les femmes enceintes VIH positives mais la différence n’était pas significative. Mots clés : Burkina Faso ; Femmes enceintes ; PCR Multiplexe en Temps Réel ; VIH ; CMV ; EBV et HHV-6 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page iv SUMMARY Introduction: The herpes virus is widespread worldwide. This study focuses on three herpes viruses, including EBV, CMV and HHV -6. These three viruses evolving under the pandemic model are involved in congenital infections can cause severe sequel in newborns. The objective of the study was to assess the prevalence of CMV, EBV and HHV-6 in pregnant women from Ouagadougou with HIV serology more or less known. Method: we determined by multiplex real-time PCR EBV infection, CMV and HHV-6 in 200 samples consisting of blood plasma of pregnant women including 100 women HIV positive and 100 women HIV negative. The DNA of the human herpes virus was extracted using the kit "DNA -Sorb - B" of Sacace biotechnology ® then amplified using the Kit " Multiplex Real Time PCR Kit for quantitative detection and differentiation of Cytomegalovirus (CMV) Epstein Barr virus (EBV ) and Human Herpes virus 6 ( HHV-6 ) "of Sacace biotechnology ® Results: Of all 200 samples analyzed, 18 (9.0 %) were positive for at least one of the three viruses, 12 (6.0%) were positive for EBV, 13 (6.5%) were positive for CMV and 12 (6.0%) positive for HHV -6. Among the 18 cases of infection, we found 10 cases of co-infection with a rate of 55.6 % (10/18), that 90% (9/10) EBV/CMV/HHV6 multiple infection and 10.0% (1/10) association EBV/HHV6. In addition EBV / CMV co-infection or CMV / HHV-6 were not detected in pregnant women in our study. Based on HIV status, we found 12.0% HHVs infections in HIV -negative and 6.0% in HIV negative. The co-infection rate was 6.0 % and 4.0%. Among HIV-positive, PCR revealed 7.1% (6 /85) HHVs infection among those who were not on ART and 0.0% among HIVpositive pregnant women submitted to ARV therapy. The HHVs infection varies depending on the occupation. These HHVs were much more isolated from the household (P = 0.418). Conclusion: We found a low prevalence of CMV, EBV and HHV-6 in pregnant women. The prevalence of the human herpes virus was higher in HIV -negative women than among HIVpositive. Keywords: Burkina Faso; Pregnant woman; Multiplex Real-Time PCR; HIV; CMV; EBV and HHV6 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page v TABLE DE MATIERES Préface du Coordonnateur du Master BIOGEMA ................................................................ i DEDICACES ............................................................................................................................. ii REMERCIEMENTS ................................................................................................................. iii RESUME ................................................................................................................................... iv SUMMARY ............................................................................................................................... v TABLE DE MATIERES ........................................................................................................... vi LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... viii LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. ix LISTE DES ABREVIATIONS ................................................................................................. x INTRODUCTION ...................................................................................................................... 1 1. GENERALITES ..................................................................................................................... 3 1.1. Généralités sur le CMV .................................................................................................. 3 1.2. GENERALITE SUR EBV............................................................................................. 11 1.3. GENERALITE SUR HHV6 .......................................................................................... 18 2. OBJECTIFS ......................................................................................................................... 25 2.1. Objectif principal ........................................................................................................... 25 2.2- Objectifs spécifiques ..................................................................................................... 25 3. MATERIEL ET METHODES ............................................................................................ 26 3.1. Cadre de l’étude ............................................................................................................. 26 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page vi 3.2. Matériel .......................................................................................................................... 27 3.3. Méthodes ....................................................................................................................... 28 4. RESULTATS ....................................................................................................................... 35 4.1. Caractéristiques sociodémographiques des femmes enceintes dépistées aux HHVs. .. 35 4.2. Prévalence générale des infections HHVs (EBV, CMV, HHV6) détectées chez les femmes enceintes par PCR en temps réel ............................................................................. 36 4.3. Infection à CMV, EBV et HHV-6 en fonction de l'âge, du statut VIH et de la thérapie ARV ...................................................................................................................................... 37 4.4. Impact du traitement antirétroviral sur la prévalence des HHVs (EBV, CMV, HHV6)38 4.5. Corrélation entre l’infection aux HHVs et l’avortement, la profession, le stade évolutif de la grossesse ...................................................................................................................... 39 5. DISCUSSION ...................................................................................................................... 41 CONCLUSION ........................................................................................................................ 44 RECOMMANDATIONS ......................................................................................................... 45 PERSPECTIVES ...................................................................................................................... 46 REFERENCES ......................................................................................................................... 47 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page vii LISTE DES TABLEAUX Tableau 1:Model de diagnostic de routine/détection d'EBV (adapté de RalfD. 2004) ......................... 16 Tableau 2: Méthodes de diagnostic de HHV6 ....................................................................................... 23 Tableau 3: Programme d'amplification de la PCR multiplex en temps réel .......................................... 32 Tableau 4: Exemple d'analyse qualitative des résultats PCR…………………………………46 Tableau 5:Caractéristiques sociodémographiques des femmes enceintes…………………....49 Tableau 6: Prévalence des HHVs (EBV, CMV, HHV6) chez les femmes enceintes………..50 Tableau 7: Infection à CMV, EBV, HHV6 en fonction de l'âge, de la sérologie VIH et de la thérapie ARV…………………………………………………………………………………51 Tableau 8: Répartition des HHVs en fonction de l'avortement, la profession et du terme de la grossesse………………………………………………………………………………………53 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page viii LISTE DES FIGURES Figure 1: Image du Cytomégalo virus ........................................................................................ 4 Figure 2: Structure génomique du Cytomégalo virus. ............................................................... 4 Figure 3: Représentation des voies du CMV chez le fœtus et la réponse du SI potentiellement important dans la transmission et la prévention du CMV .......................................................... 8 Figure 4: Représentation schématique d'Epstein Barr virus..................................................... 13 Figure 5: Model d'infection d'Epstein Barr virus chez l'Homme ............................................. 14 Figure 6: représentation schématique du cycle de réplication lytique de HHV6 ..................... 20 Figure 7 : Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de sacace Biotechnologie ....... Erreur ! Signet non défini. Figure 8: Photo lors de l'extraction de l'ADN de EBV, CMV et HHV6 au CERBA/ LABIOGENE ........................................................................................................................... 30 Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page ix LISTE DES ABREVIATIONS ADN: : Acide Désoxy Ribonucléique ARN : Acide Ribonucléique ARV : Anti Rétro Viraux CD4 : Classe de Différenciation de type 4 CMSC : Centre Médical Saint Camille CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni DRL : Direct Repeats Left DRR : Direct Repeats Right EBV : Epstein - Barr virus ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EBNA : EBV Nuclear Antigen Gp : Glycoprotéine HHV6 : Human Herpes Virus 6 HBLV : B-lymphotrope virus humain IF : Interferon Il : Interleukine IFA : Immuno Fluorescence Assay IST : Infection sexuellement transmissible INSD : Institut National de Statistique et de la Démographie LABIOGENE : Laboratoire de biologie et de génétique Moléculaire Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page x LCR : Liquide Céphalo Rachidien NK : Natural Killers ORFs : Open Reading Frame PCR : Réaction de Polymérisation en Chaîne PBMC : Peripheric Blood Mononuclear Cells PFA : Phosphonoformique Acide PTME : Programme de prévention de la transmission mère- enfant PV/VIH : Personne vivant avec le VIH SEP ou ES : Sclérose en Plaques SIDA : Syndrome de l’Immuno Déficience Acquise SNC : Système Nerveux Central TNF : Tumor Necrosis Factor UL : Unique Longue US : Unique Short VIH : Virus de l’Immunodéficience Humaine Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page xi INTRODUCTION INTRODUCTION Les herpès virus font partie des virus les plus répandus. Désignés par HHVs (Herpes Human Virus), ce sont des virus à ADN, responsables de diverses maladies chez les humains et les animaux. Chez l’Homme, huit types d’herpès virus classés de HHV-1 à HHV-8, sont responsables de pathologies (Adjei et al, 2008). Dans cette étude nous nous intéresserons à l’herpès virus 4 ou Epstein Barr Virus (EBV), à l’herpès virus 5 ou Cytomégalovirus (CMV) et à l’herpès virus 6 (HHV-6). L’EBV, le CMV et le HHV-6 évoluent tous sur le modèle pandémique. Ces virus sont principalement responsables de la mononucléose infectieuse (CMV, EBV), de l’exanthème subit (HHV6) et de la roséole. Ils sont également impliqués dans de nombreux cancers tels que le cancer de Burkitt, le cancer du nasopharynx, le cancer du colon, du cerveau… (Macsween et al, 2003 ; Ghandi et al, 2004 ; Boeckh et al, 2011). L’EBV, le CMV et le HHV-6 vivent surtout en latence dans les organismes qu’ils infectent et ne causent des pathologies que dans quelques rares cas. Les infections sont généralement asymptomatiques ou bénignes chez les personnes immunocompétentes mais graves chez l’immunodéprimé (Lilleri et al, 2007) et la femme enceinte ( Loewendorf et al, 2010). Des études antérieures ont révélé des prévalences très diversifiées de ces virus chez les femmes enceintes. Chez ces dernières, l’infection au CMV représentait 10,1% en Koweït (AlAwadhi et al, 2013), 18,2% en Suisse (Azam et al, 2001), 30,2% en Allemagne (Enders et al, 2001), 0,8% en Italie (Gervasi et al, 2012). La prévalence d’EBV s’élevait à 98% en Caroline du nord (Haeri et al, 2010) et 0,1% en Italie (Gervasi et al, 2012). Quant au HHV6, Gervasi et al. avaient rapporté une prévalence de 1% en Italie (Gervasi et al, 2012). En Afrique, des études se rapportaient principalement au CMV avec une prévalence de 72,1% en Iran (Bagheri et al, 2012), 30,0% en Israël (Yinon et al, 2006). Cette prévalence était de 12,0% en Egypte (Zaki et al, 2007). Cependant, le risque de transmission de la mère à l’enfant variait de 40% -50% en Philadelphie (Stagno, 2001), de 24% à 75% aux USA (Kenneson et al, 2007) et était de 30,8% en Italie (Ravello et al, 2002). La coïnfection HHVs et virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un facteur de risque additionnel (Marshall et al, 2010). Cependant, l’Afrique subsaharienne semble détenir la plus forte prévalence de l’infection à VIH à travers sa population sexuellement active (environ Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 1 4,3% des femmes et 1,5% des hommes infectés en 2005) rapporté par Biddlecom et al, 2007. En effet, au Ghana, Adjei et al, 2008 ont rapporté que parmi les donneurs de sang VIHséronégatifs, les séroprévalences globales du CMV et d’EBV ont été respectivement de 77,6% et 20,0%, contre 59,2% et 87,2% chez les VIH-séropositifs. Alors que les herpès virus constituent un véritable problème de santé publique pour les femmes enceintes et les nouveau-nés, très peu de données existent sur la prévalence de ces virus chez les femmes enceintes en Afrique et plus particulièrement au Burkina Faso. De plus, la capacité à identifier de manière fiable leur primo-infection pendant la grossesse, et donc d’intégrer les options de traitement possible pour le fœtus (traitement par des CMVimmunoglobulines rapporté par Nigro et al, 2013 en Italie) permet de réduire le taux d’infection et de mortalité infantile. Il est important de détecter l’infection par ces virus à travers un outil de diagnostic plus efficace d’où l’intérêt porté sur le choix de notre thème de recherche. C’est dans cette optique que nous avons entrepris cette étude qui vise à faire le diagnostic moléculaire du CMV, EBV et HHV6 par la PCR en temps réel chez les femmes enceintes au centre médicale Saint Camille de Ouagadougou. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 2 REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 1. GENERALITES 1.1. Généralités sur le CMV 1.1.1. Historique du CMV Diagnostiqué responsable de maladies des inclusions cytomégaliques depuis 1904, le Cytomégalo virus (CMV) fut isolé en 1956 sur culture de cellules fibroblastiques humaines (Birdsong, 1956 ; Takos, 1956). 1.1.1.1. Classification du CMV La taxonomie permet de classer le CMV dans le règne animal, le sous-règne des virus, la classe des herpesviridae, la famille des herpès virus humains, la sous-famille des betaherpesvirinae, le genre cytomegalovirus et l’espèce des herpès virus humain de type 5 (HHV5) (Moore et al, 1996). 1.1.1.2. Morphologie et structure génomique du CMV Le cytomégalovirus (figure 1) est le plus gros des herpès virus connu avec un diamètre de 105 nm. Il est constitué : d’une capside comportant 162 capsomères dont les protéines mineures (34kDa) et majeures (150kDa) de capsides ainsi que les protéines d’ancrage de l’ADN viral ; d’un tégument composé de plus de 20 phosphoprotéines dont la pp65 et la pp150 fortement immunogènes ; d’un double feuillet lipidique externe (péplos) dérivé de la membrane nucléaire de la cellule hôte et comportant les glycoprotéines virales de surface, que sont les glycoprotéines gB et gH ; cette enveloppe très fragile favorise une transmission interhumaine directe. L’enveloppe porte des glycoprotéines impliquées dans l’absorption de la particule virale sur les récepteurs cellulaires (gp55), la fusion avec la membrane cellulaire, l’assemblage du virion et la sortie des virus produits de la cellule infectée. Ces enveloppes entourent un génome de 230Kb représenté par un ADN double brin linéaire, codant environ 200 protéines dont 35 de structure. Il possède 2 sous-unités, dont une longue Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 3 (unique long ou UL) et une courte (unique short ou US) encadrées par des séquences répétitives (figure 2) (Gandhi et Khanna, 2004). Figure 1: Image du Cytomégalo virus (Source: Gandhi et Khanna, 2004) Figure 2: Structure génomique du Cytomégalo virus (Boeckh et al, 2011). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 4 1.1.2. Biologie du CMV L'encapsidation de l’ADN viral se fait dans le noyau de la cellule hôte. Le virus quitte ensuite le noyau par bourgeonnement de la membrane nucléaire modifiée par adjonction de glycoprotéines virales. La réplication de l’ADN viral, très différent de l’ADN cellulaire, ne peut être assurée par les enzymes cellulaires : elle exige un ADN polymérase virale, cible des antiviraux actuellement disponibles. Le CMV possède une phosphotransférase qui phosphoryle les nucléosides naturels ou les nucléosides synthétiques antiviraux (Arbeitskreis Blut, 2010). 1.1.3. Physiopathologie L’infection à CMV débute par une primo-infection asymptomatique. Le CMV étant un virus leucotrope, son acquisition est suivie d'une phase de dissémination sanguine transitoire ou virémie, lui permettant d’atteindre ses organes cibles (moelle osseuse, glandes salivaires, poumons, reins, foie, tube digestif, système nerveux central, le système nerveux périphérique, œil, épithélium génitaux). Il possède un tropisme cellulaire pour les monocytes / macrophages tissulaires (réplication virale : présence d’ARNm virale précoce et tardif), les polynucléaires neutrophiles, les cellules endothéliales (cellules endothéliales infectées dans le flux sanguin), les cellules épithéliales (cellules épithéliales pulmonaires et rénales), les cellules nerveuses (cellules de Schwann, neurones des ganglions optiques) (Arbeitskreis Blut, 2010). En effet, la réponse immunitaire spécifique associe non seulement une réponse humorale dont le rôle semble mineur mais aussi une réponse de type cellulaire notamment CD8 cytotoxique. Par un mimétisme moléculaire, le virus peut échapper à la réponse immunitaire cellulaire (séquestrant des chimiokines dans l’environnement cellulaire par expression des molécules homologues des récepteurs des chimiokines) ou inhiber l’expression des molécules du CMH de classe I ou II et limiter ainsi la lyse des cellules infectées (Schleiss, 2001). Après la primo-infection, une latence virale s’établie dans les monocytes/macrophages du sang périphérique, rénaux et pulmonaires et probablement aussi dans les cellules endothéliales vasculaires, les cellules souches de la moelle osseuse. En présence d’un stimulus (immunodépression, stimulation immunitaire allogénique), des réactivations virales peuvent survenir induisant une réinfection endogène, sans traduction clinique chez le sujet immunocompétent mais très grave en cas d’immunodépression (greffage d’organes, SIDA, fœtus, etc.) (Loewendorf et al, 2010). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 5 1.1.4. Epidémiologie 1.1.4.1. Mode de transmission générale du CMV Plus grand de la famille des herpès virus humain, le CMV a pour seul réservoir, l’homme. Virus très fragile, sa transmission se fait par contact direct à travers les sécrétions corporelles : l’urine, la salive, le lait maternel, le sang, le sperme, les larmes, les sécrétions vaginales (Kurath et al, 2010). Il induit une infection à répartition mondiale sans rythme saisonnier. La prévalence mondiale varie de 50% à 90% aux Etats Unis, 30,16% en Allemagne (Enders et al, 2001), et environ 100% dans les pays en voie de développement (Loewendorf et al, 2010). En Italie, l’incidence de la primo-infection du CMV chez les femmes enceintes est environ 1-7% avec un taux de transmission verticale d’environ 30-40% (Lazzarotto et al, 2011). 1.1.4.2. Mode de transmission verticale du CMV L’infection à CMV chez l’enfant est essentiellement la conséquence d’une transmission dite verticale ou périnatale , c'est-à-dire de la mère au fœtus ou au nouveau-né. L’infection verticale peut se produire avant la naissance via le placenta, pendant l'accouchement via les sécrétions cervicales et le sang, et après la naissance à travers l'allaitement maternel (Bonalumi et al, 2011 ; Schleiss, 2001). 1.1.5. Pathologies dues au CMV L’infection au CMV débute par une primo-infection si le sujet est précédemment séronégatif au CMV. Puis on aboutie à l’infection secondaire (excrétion intermittente du virus due à la réactivation d'un virus endogène ou l’exposition à une nouvelle souche de virus à partir d'une source exogène (Alford et al, 1990). Le CMV est responsable de maladies inflammatoires chroniques, de maladies vasculaires (Streblow et al, 2008) et des cancers humains spécifiques (Cobbs et al, 2002) (Michaelis et al, 2009). Cependant, la plupart des infections à CMV chez les femmes enceintes rencontrées sont asymptomatiques (~95%) (Boppana et al, 1999), mais une faible proportion souffre d'un syndrome mononucléosique, décrit depuis 1965 chez les adultes (Akhter et al, 2011). Les symptômes les plus fréquents incluent des malaises, une fièvre persistante (3 semaines), une myalgie, une lymphadénopathie cervicale, et rarement une pneumonie, une hépatite et un syndrome grippal (Gaytant et al, 2002). L’infection à CMV maternelle comporte un risque de transmission verticale variant de 24% à 75% (Peckham et al, 1991) avec des séquelles graves Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 6 chez le nouveau-né telles la perte auditive neurosensorielle (surdité, choriorétinite), un retard mental(une microcéphalie), une calcification cérébrale (à l’échographie), une atteinte digestive avec une hyperéchogénicité des anses intestinales, une thrombocytopénie, un retard de croissance intra-utérine, une hépato- splénomégalie (ictère, troubles hémorragiques), une pneumonie (Boppana et al, 2001), un dysfonctionnement hépatique (Pass et al, 2011). Dans quelques rares cas, chez le sujet immunocompétent, des infections graves peuvent survenir, entrainant des ulcérations coliques, gastro-œsophagiennes et méningo-encéphalites ; des myocardites et parfois le syndrome de Guillain-Barré dans 5-10% de cas (Gandhi et al, 2004). 1.1.6. Réponse immunitaire de l’hôte La protection immunitaire contre l’infection congénitale à CMV est complexe et nécessite un examen des réponses immunitaires de la mère, du fœtus et du placenta. L’échec de l'immunité innée est due soit à des facteurs génétiques de l’hôte, soit à l'état de tolérance immunitaire de la grossesse et/ou virales pour échapper au système immunitaire, qui peuvent contribuer à l'acquisition de l'infection. En effet, le virus est censé atteindre le placenta via le compartiment maternel ou par une infection ascendante via une extension locale dans le tractus génital (Schleiss, 2001). Quelle que soit la voie de l'infection, le profil immunologique du placenta peut aussi faciliter la transmission du CMV ou l’inhiber (Figure 3). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 7 Immunité maternelle a Augmentation de la réponse Th2 Expansion des Treg Conservation des réponses des CD4+ et CD8+ Réponse des cytokines modifiée Décroissance des cellules CD16+ et des NK c Facteurs viraux Evasion du SI, réinfection/stress, fatigue . b Immunité placentaire Cellules NK utérines, Treg, Aumgmentation de Il-10,dimunition de l’IFγ et d’IL-12 Activation du TLR2/4 Recepteur Fc du syncytiotrophoblaste Cytokines Cellules amniotiques : β défensines d Immunité fœtale Réponse CD4+et CD8+ Cytokines, chimiokines réponse d’IgM du fœtus réponse d’IgG transplacentaire cellules T/ gamma delta Figure 3: Représentation des voies du CMV chez le fœtus et la réponse du SI potentiellement important dans la transmission et la prévention du CMV (Schleiss 2011). Légende : TH2 : lymphocytes T helper 2 ; Treg : lymphocytes T Régulateurs ; NK : Natural killers ; IL-10 : interleukine 10 ; IL-12 : Interleukine 12 ; IFγ : interféron gamma ;TLR : Toll Like Receptor ; Ig : immunoglobuline. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 8 1.1.7. Diagnostic de l’infection à CMV La plupart des infections à CMV chez les femmes enceintes rencontrées sont asymptomatiques. Diverses techniques sont utilisées pour diagnostiquer l’infection à CMV. Ces techniques se basent sur la recherche des signes cliniques, du virus, de ses antigènes, de son ADN ou de son ARN. Méthodes indirectes -Examen clinique : elle se base sur les signes d’une infection à CMV associé à la détection du virus. Selon Schleiss, 2001, chez le fœtus, il consiste à identifier les infections fœtales par les tests prénataux non-invasives (examen d’échographie : restriction de la croissance fœtale, ventriculomégalie cérébrale, ascite, calcifications intracrâniennes, anomalie du volume du liquide amniotique (Oglio- hydramnios), microcéphalie, intestin hyperéchogène, un épanchement pleural, des calcifications hépatiques) et invasives (amniocentèse) lorsque les tests sérologiques de la mère sont positifs. -Test sérologique: actuellement réalisé à l’aide de trousses ELISA, il est basé sur la recherche d’IgG et IgM anti-CMV dans le sérum de la femme enceinte. La détermination d’avidité des IgG anti-CMV, réalisée entre la 16è à la 18è semaine de grossesse, identifie toutes les femmes qui auront un fœtus / nouveau-né infectés (sensibilité à 100%). Après la 20e semaine de gestation, la sensibilité est considérablement réduite (62,5%). Un indice d'avidité élevée au cours des 12-16 premières semaines de gestation pourrait être considéré comme un bon indicateur d’infection passée. La présence de vraies IgM combiné à un indice d’avidité faible / modéré équivaut à un diagnostic de séroconversion (Bonalumi et al, 2011). Selon Weisblum et al, 2011, la détection d'IgM spécifiques dans le sérum néonatal révèle également une infection congénitale. Méthodes directes -PCR : elle présente l’avantage d’être rapide, plus sensible et réalisable de manière différée sur des prélèvements stockés congelés (plasma sanguin, leucocytes, urines, LCR, biopsies, liquide amniotique) par rapport aux techniques immunologiques (Enan et al, 2011). Cependant, la PCR en temps réel se révèle plus sensible et plus spécifique que les autres techniques PCR (Drago et al, 2004). Pour les femmes ayant contracté une primo-infection entre quatre et trente semaines de gestation, les tests virologiques présentent une faible Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 9 sensibilité (14,3% pour les tests antigénémie et 47,6% pour la PCR) dans la détection de la transmission verticale du CMV (Bonalumi et al, 2011). -La culture virale : c’est une technique très spécifique mais longue (exige au moins 21 jours). La culture virale peut être réalisée à partir de divers prélèvements : sang, urines, biopsies, LCR, salive, lavage broncho-alvéolaire, liquide amniotique. C’est une technique non utilisée en routine mais utilisée lors de la recherche de résistance aux antiviraux. -Recherche des Antigènes viraux : Elle consiste à rechercher les Antigènes pp65 dans les polynucléaires circulants par une méthode d’immunofluorescence sur lame. Elle permet de détecter et de quantifier le nombre de cellules sanguines circulantes infectées par le CMV en phase réplicative. La révélation est faite par immunofluorescence à l’aide d’anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine pp65. La détection de la virémie par cette technique est plus sensible que la culture virale. 1.1.8. Prophylaxie et thérapie de l’infection à CMV Les tentatives de mise en place d’un vaccin anti-CMV date des années 1970. Selon nos connaissances actuelles, il n’existe pas de vaccin efficace ni de traitement antiviral pendant la grossesse. Du fait de symptômes alarmant lors de l’infection, la prévention repose essentiellement sur le respect des règles d’hygiènes. De façon générale, les molécules antivirales utilisées pour le traitement préventif et curatif de l’infection à CMV sont essentiellement la Ganciclovir ou DHPG, l'acide phosphonoformique (PFA) ou Foscarnet, la Valganciclovir, Valaciclovir. Malheureusement, Foscarnet et Ganciclovir ont des effets secondaires: neutropénie pour la DHPG, anémie et insuffisance rénale pour le PFA. L’Aciclovir et la valaciclovir sont des inhibiteurs de la thymidine kinase. La Ganciclovir, un analogue nucléotidique mono phosphate, est un inhibiteur compétitif du DNA polymérase UL54. Une mutation du gène UL54 (gène de l’ADN polymérase) entraine une résistance du CMV à la Gancyclovir, à la Valacyclovir et à la cidofovir. La mutation du gène UL97 (gène de la protéine kinase) entraine une résistance à la Gancyclovir et à la Valacyclovir (Hakki et al, 2011). Si l’utilisation des gammaglobulines reste controversée, les traitements prophylactiques par ganciclovir oral ou par le valaciclovir, prodrogue de Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 10 l’aciclovir, contribuent à retarder les premières manifestations de l’infection et diminuent la mortalité associée au CMV après greffe (Meyers et al, 1988). Lorsque le diagnostic d'infections fœtales à CMV est posé sur des critères échographiques et la recherche de cytomégalovirus par PCR, il est possible de pratiquer une interruption médicale de grossesse. 1.2. GENERALITE SUR EBV 1.2.1. Historique de EBV Le Virus Epstein-Barr (EBV), découvert en 1964 par microscopie électronique à partir d’une lignée cellulaire de lymphome de Burkitt (lymphome de cellule B chez les enfants Africain d’âge compris entre 2 et 14 ans en zone endémique de paludisme), est responsable d’une maladie décrite pour la première fois en Ouganda dans les années 1950 par Denis Burkitt (Epstein et al, 1964). Ce virus fut nommé en l’honneur de Michael Anthony Epstein et de son étudiante Yvonne .M. Barr. En 1968, EBV a été associé à la mononucléose infectieuse par le Dr Henle et son équipe. En 1970, l’ADN viral fut détecté dans les tissus de patients atteints de carcinome du nasopharynx. Dans les années 1980, EBV a été associé au lymphome non-hodgkinien et leucoplasie orale-chevelue chez les patients atteints du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) (Cohen, 2000). 1.2.1.1. Classification de l’EBV Le virus Epstein Barr est classé dans le règne animal, le sous-règne des virus, la classe des Herpesviridae, la famille des Herpesviridae humains, la sous-famille des Gamma- herpesvirinae, le genre des Lymphocryptovirus, à l’espèce : type HHV4 ou Epstein-Barr Virus. Sur le plan mondial, deux types de virus sont observés, EBV-1 et EBV-2 (ou bien type A et type B) mais les études séroépidémiologiques et l’isolation du virus suggèrent que le type B est principalement restreint à l’Afrique contrairement au type A retrouvé en Europe et en Amérique du Nord (Cohen, 2000). Les maladies causées sont les mêmes mais les gènes exprimés lors de la latence présentent quelques différences (Moore et al, 1996). 1.2.1.2. Morphologie et structure génomique du virus d’Epstein Barr Virus enveloppé, son génome viral est enfermé à l'intérieur d'une nucléocapside (~100 nm de diamètre avec 162 capsomères et un core) qui est, à son tour, entourée par l'enveloppe virale Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 11 dérivant de la membrane cellulaire et contenant des glycoprotéines variables d’un virus à l’autre (gp350/220, gp85/25 et gp42 nécessaires à l’infection) (Figure4). Le génome d’ EBV est constitué d'une molécule d’ADN linéaire double brin de 172 Kpb qui code près de 100 protéines virales importantes pour la régulation de l'expression des gènes viraux, reproduisant l’ADN viral et formant les composants structurels du virion nécessaire à la modulation de la réponse immunitaire de l'hôte. Ce génome contient des répétitions internes en tandem, « internal repeat » (IR1) s’intercalent entre deux régions uniques : « unique short » (US) et « unique long » (UL). Il possède environ 100 gènes dont 8 exprimés lors de la phase de latence du virus que sont : EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3 EBNA-LP, LMP-1, LMP-2, EBER-1 et EBER-2 (COHEN, 2000 ; Mascween et al, 2003). Ainsi : EBNA-1 assure le maintien du génome viral et coordonne la réplication de l’épisome lors de la division cellulaire. EBNA-2 est essentiel à l’expression des protéines EBNA-1 et EBNA-3 et au processus d’immortalisation des lymphocytes B. Il transactive l’expression du marqueur d’activation CD23 du lymphocyte B et régule positivement l’expression du récepteur CD21 du virus, c-fgr et les gènes de latence LMP-1 et LMP-2. EBNA-3 est très polymorphique et diffère selon le type de virus. Il est constitué d’une famille de 3 gènes (EBNA-3A, EBNA-3B et EBNA-3C) de haut poids moléculaire localisé en tandem sur le génome du virus Epstein-Barr. EBNA-LP est un ensemble de protéines extrêmement polymorphiques. Cependant la fonction d’EBNA-LP demeure floue, elle pourrait jouer un rôle dans le traitement de l'ARN ou être associée avec certaines protéines de régulation nucléaire. LMP-1 est exprimé en absence d’EBNA-2 pendant l’activation du cycle lytique des lymphocytes B. Cette protéine protège les lymphocytes B infectés de l’apoptose en partie par l’activation de l’oncogène bcl-2. De plus, l’action de transformation de LMP-1 semble impliquer les protéines de signalisation de TRAF (tumornecrosis factor receptor-associated factors) LMP-2 est une protéine de membrane contenant 12 domaines transmembranaires hydrophobiques qui sont colocalisés avec LMP-1 dans la membrane plasmique des lymphocytes infectés. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 12 EBER-1 et EBER-2 sont les ARN du virus Epstein-Barr les plus abondants durant la latence des cellules B infectées. Ces petits ARN sont codés sous forme non polyadénylé. La majorité des EBER est localisé dans le noyau où ils sont complexés avec la protéine. Figure 4: Représentation schématique d'Epstein Barr virus (Source: http://cullenlab.duhs.duke.edu/research/ebv/) 1.2.2. Biologie de EBV EBV infecte les surfaces des muqueuses et maintien son cycle vital dans les cellules épithéliales, pour lesquelles il a un bon tropisme. Le virus peut infecter directement les lymphocytes B, ou indirectement via les cellules épithéliales causant ainsi plusieurs maladies tumorales. Après l'infection primaire, l’ADN viral du gamma herpès virus persiste dans les noyaux de cellules lymphoïdes sous une forme latente circulaire épisomique. En réponse à des signaux extracellulaires, le virus latent peut être activé, ce qui conduit à la production de descendance virale infectieuse (Cohen, 2000). 1.2.3. Physiopathologie de EBV Avant que le virus ne pénètre dans la cellule hôte, la glycoprotéine gp 350/220 se lie au récepteur viral, la molécule CD21 (le récepteur du complément C3d), à la surface du lymphocyte B (Cohen, 2000). D’autres glycoprotéines virales, gp 25, gp 85 et gp 42 forment un complexe nécessaire à la pénétration du virus dans la cellule. La protéine gp 42 se lie aux molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII) et est nécessaire à la fusion du virus avec la membrane cellulaire du lymphocyte (Mullen et al, 2002). Durant la Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 13 primo infection, les cellules B infectées entrent en cycle lytique, produisent des virions et expriment les protéines virales de latence. Après avoir infecté les cellules B, le génome viral linéaire devient circulaire, formant un épisome, et reste généralement latent dans ces cellules B. Le virus se réplique dans les cellules de l'oropharynx entrainant une production du virus et leurs disséminations dans la salive ainsi que l’infection d’autres cellules épithéliales. Le virus infecte les cellules épithéliales et les autres cellules en utilisant un mécanisme semblable à celui utilisé dans l’infection des lymphocytes B. En limitant fortement l'expression du gène viral pendant la latence, EBV, réduit le nombre de protéines virales qui permet la reconnaissance des cellules infectées par les cellules T cytotoxiques. Certaines cellules B initialement infectées sont maintenues en quiescence par l’effet des NK et des cellules T cytotoxiques. Après convalescence, EBV est présent dans le sang périphérique en latence dans les cellules B mémoire. Une réactivation du virus peut survenir avec expression d’autres protéines virales de latence, entrainant leur reconnaissance et leur destruction par les cellules T cytotoxiques (Figure 5). Figure 5: Model d'infection d'Epstein Barr virus chez l'Homme (Source : Cohen, 2000) Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 14 1.2.4. Epidémiologie et mode de transmission Le réservoir du virus d’Epstein Barr est strictement humain. Il se transmet principalement par la salive mais aussi par les relations sexuelles, la transplantation d’organes solides, la transfusion sanguine, ou de la mère infectée à l’enfant (Macsween et al, 2003). Plus de 90% des adultes dans le monde sont infectés par EBV dont 95% aux Etats Unis (35-40ans) (Macsween et al, 2003), 20% et 87% respectivement chez les donneurs de sang VIH- et VIH+ au Ghana (Adjei et al, 2008). L’infection se fait pendant l’enfance, l’adolescence ou à l’âge adulte. Chez les femmes enceintes, 98% sont infectées (Haeri et al, 2010) en Caroline du nord (USA). 1.2.5. Pathologies dues au EBV Alors que la plupart des infections à EBV des nourrissons et des enfants sont asymptomatiques ou présentent des symptômes non spécifiques, l’infection des adolescents et des adultes entraînent souvent la mononucléose infectieuse. Les pathologies associées à l’infection à EBV sont plus fatales chez l’immunodéprimé : -Sujets immunocompétents : Mononucléose infectieuse se manifestant par fièvre, lymphadénopathie, pharyngite, splénomégalie, pétéchies palatales, hépatomégalie. En cas de complication on note une anémie hémolytique, thrombocytopénie, myocardite, hépatite, ulcères génitaux, rupture de la rate, éruptions cutanées, complications neurologiques telle que le syndrome de Guillain-Barré, l'encéphalite et la méningite. Certains cancers tels le carcinome du nasopharynx, le lymphome de Burkitt, la maladie de Hodgkin peuvent être associée à EBV (Cohen, 2000). -Sujets immunodéprimés : Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X (ou syndrome de Purtilo), lymphome de Burkitt, lymphome monoblastique, lymphome cérébral, maladie de Hodgkin, leucoplasie orale –chevelue, toux et éruption cutanée (enfant) (Cohen, 2000 ; Slykera et al, 2013). Malgré le silence de l’infection latente par EBV, ce virus est un facteur de risque majeur aux tumeurs malignes dans le monde notamment le carcinome du nasopharynx et le cancer gastrique. Il existe un risque de développer un lymphome de Hodgkin à 2,4 ans après une mononucléose infectieuse. EBV est également la cause la plus courante de cancer chez les enfants en Afrique équatoriale notamment le lymphome de Burkitt endémique. En effet, les Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 15 enfants infectés par le VIH courent un risque de cancer estimé 40 fois plus élever (Biggar et al, 2000). 1.2.6. Méthodes de diagnostic de l’EBV Les méthodes sérologiques utilisent des tests tels ELISA ou la détection par immunofluorescence tandis que les méthodes moléculaires procèdent par des tests PCR et l’analyse de type Southern blot. Tableau 1:Model de diagnostic de routine/détection d'EBV (adapté de RalfD. 2004) METHODES SUBTRAT, ANTIGENE, COMMENTAIRE ANALYTE Détection des acides nucléiques / PCR Hybridation in situ, PCR Lymphocytes, plasma, Méthode de choix en cas sérum, LCR, biopsies (tissus) EBV/Méningo-encéphalite suspectée(LCR) ; utilisée pour détecter pour charge viral et réactivation Tissu tumoral Détection d’EBV/ tumeurs Tissu tumoral Détection d’EBV/ tumeurs Cellules de la lignée Performant dans les laboratoires lymphoïde de lymphocytes spécialisés, longue attente (4-8 de patients semaines) Lysats d’EBV-lignées de Haute spécificité, méthode de cellules transformées ou confirmation, statuant les lysats d’EBV /protéines possibles infections d’EBV avec recombinées ; seulement un seul échantillon de in situ Antigènes viraux, immunohistochimie et immunocytologie Isolation du virus Analyse Western blot sérum Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 16 METHODES SUBTRAT, ANTIGENE, COMMENTAIRE ANALYTE EIA, ELISA Lysats d’EBV-lignées de Rapide, très sensible ; avec un cellules transformées ; lysats seul échantillon de sérum d’EBV ; protéines recombinées ; combinaison de lysats et protéines recombinées Réaction de fixation du Lysats d’EBV-lignées de Moins sensible, moins spécifique, complément cellules transformées n’est pas généralement utilisé, impossibilité de montrer les stades d’infections possibles d’EBV avec un seul échantillon de sérum Détermination d’avidité Titration des anticorps en Méthode spécial utilisée pour des IgG, IFA, et/ou absence ou présence de confirmation de résultats ELISA ou Analyse quantités élevées d’urée indéterminés (les anticorps d’une Western blot infection aigue à EBV sont d’avidité faible) 1.2.7. Prophylaxie et thérapie de l’infection à EBV A l’heure actuelle aucun vaccin n’est disponible contre l’infection à EBV. La prévention se fait par le respect strict des règles d’hygiènes. Pour la prophylaxie, les antiviraux tels que l’acyclovir, la valacyclovir, la ganciclovir et la valganciclovir sont utilisés en routine après transplantation d’organe pour prévenir les infections aux herpès virus. Quant aux femmes enceintes, la prophylaxie repose sur des règles d’hygiènes. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 17 1.3. GENERALITE SUR HHV6 1.3.1. Historique du HHV6 Plus proche du CMV, le HHV6, isolé pour la première fois en 1986 à partir de cellules sanguines mononucléaires périphériques (PBMC) de patients atteints de troubles lymphoprolifératifs (Salahuddin et al, 1986), il fut d’abord appelé Human B-lymphotrope virus humain (HBLV) par Salahuddin, vu son tropisme pour les lymphocytes B. Par ailleurs, d’autres études ont montré que ce virus infecte également les lymphocytes CD4+. Il prend alors le nom d’Herpès virus 6 (HHV6) (BRAUN et al, 1997). Il se compose de deux variantes, HHV-6A et HHV-6B (Gravel et al, 2012). Ces deux espèces virales identifiées, diffèrent assez dans l’épidémiologie, la pathogenèse et la séquence génomique. En 1988, le HHV-6B a été isolé comme agent étiologique de l’exanthème subit (ES) ou roséole infantile et maladies fébriles (DANIEL et al, 1997). 1.3.1.1. Classification de HHV6 L’herpès virus humain 6 (HHV6) est un beta-lymphotrope virus qui fut classé par le comité international de taxonomie dans le règne animal, le sous-règne des virus, la classe des herpesviridae, l’ordre des Herpes virales, la famille des Herpesviridae, la sous-famille des Betaherpesvirinae, le genre des Roseolovirus et dans l’espèce : HHV-6A et HHV-6B (Tyler, 2003). 1.3.1.2. Morphologie et structure génomique de HHV6 Différent des autres herpès virus par des caractéristiques sérologique et morphologique, HHV6 présente un diamètre d’environ 200 nm avec quatre éléments majeurs de structure (BRAUN et al, 1997 ; De Bolle et al, 2005) : - un noyau, d’environ 60 nm de diamètre, contenant le génome viral composé d’ADN bicaténaire linéaire de 160 et de 162 kb respectivement pour le type A et B. - une nucléocapside à symétrie icosaédrique de 90 à 110 nm contenant 162 capsomères, - un tégument protéique, d’épaisseur comprise entre 20 et 40 nm, constitué de phosphoprotéines et d’enzymes nécessaires au métabolisme nucléotidique et à la réplication de l’ADN, - une enveloppe, dérivant des membranes cellulaires, composée d’une bicouche lipidique dans laquelle sont enchâssées de nombreux spicules de glycoprotéines virales. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 18 Les génomes de la souche U1102 de l’HHV-6A et des souches Z29 et HST de l’HHV-6B ont été entièrement séquencés (Dominguez et al, 1999). Elle consiste en une région unique (U1 à U100) de 143kb (variant A) à 145 kb (variant B), flanquée de régions terminales répétées et orientées dans le même sens, nommées DRL et DRR pour Direct Repeats Left et Direct Repeats Right. Le génome de l’HHV-6B contient 97 gènes codant 119 cadres ouverts de lecture (ou ORFs : Open Reading Frame) dont 9 sont absents dans le génome de l’HHV-6A. Ces 9 ORFs sont annotés B1 à B9. Par ailleurs 9 autres ORFs de l’HHV-6A n’ont pas de correspondance chez l’HHV-6B, à cause de mutations dans le cadre de lecture (Dominguez et al, 1999). 1.3.2. Biologie de l’HHV6 HHV6 présente un tropisme pour les cellules humaines telles que les lymphocytes T CD4+ et CD8+ (Lusso et al, 1988), les monocytes/macrophages, les cellules endothéliales (des tubules rénaux), les cellules épithéliales des glandes salivaires et le système nerveux central (neurones, oligoendrocytes, astrocytes, cellules micro gliales, NK), les cellules souches hématopoïétiques (Hall et al, 1998). En effet, HHV-6 entre dans la cellule par interaction avec les récepteurs CD46, présents sur la membrane de toutes les cellules nucléées (Santoro et al, 1999) (figure 6). Le ligand de HHV-6A qui interagit avec le récepteur CD46 de la cellule est le complexe gH-gL-gQ (glycoprotéines H, L, et Q codées respectivement par les gènes U48, U82 et U100) (Mori et al, 2003). Pour le HHV-6B les mécanismes de pénétration du virus dans la cellule ne sont pas jusque-là bien définie (Takatsuka et al, 2003). L’entrée du virus se fait par endocytose du récepteur médié après que l'enveloppe virale ait été éliminée, et la nucléocapside transporté vers le noyau (Tyler, 2003). Après la primo-infection, le HHV-6 reste latent ou persistant dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC), le système nerveux central (CNS), les cellules lymphoïdes, la moelle osseuse, les glandes salivaires, les poumons, le rein et l'appareil génital féminin. La grossesse, l’immunosuppression, les syndromes d'hypersensibilité et l’infection aiguë par d'autres virus (Par exemple, la dengue, la rougeole, …), favorisent la réactivation du virus (BRAUN et al, 1997 ; Tyler, 2003) avec une possibilité de transmission périnatale du virus. Le génome du HHV-6 peut s’intégré dans les chromosomes de l'homme à une fréquence de 0,2% - 0,8% (Caserta et al, 2007). Selon Gravel et al, 2012, le virus maternel chromosomiquement intégré (ciHHV-6) peut se réactiver au cours de la grossesse, et être Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 19 transmise par voie transplacentaire au fœtus (Caserta et al, 2007). Ce qui peut engendrer la mort ou une encéphalopathie (Figure6). Figure 6: représentation schématique du cycle de réplication lytique de HHV6 (Source : De Bolle et al, 2005) Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 20 1.3.3. Epidémiologie Répartition : acquise en âge très précoce, la séroprévalence révélée par la PCR est d’environ 10,0% des nourrissons à l’âge de 1 mois, comparativement à 66% à 1 an à cause de la baisse des anticorps maternels (Tyler, 2003) au Colorado. On estime la population portant le HHV-6 de façon intermittente dans la salive entre 80 et 90% (Di Luca et al, 1995), 80,6% dans les PBMC et 3,3% dans les sécrétions cervicales (Caserta et al, 2007). Chez les femmes enceintes, elle est estimée à 2,2% en Italie (Gervasi et al, 2012), 22,2% et 7,5% à New York (Rochester) dans les cellules mononucléaires de sang périphérique et les sécrétions cervicales respectivement (Caserta et al, 2007). Mode de transmission : L’infection semble se faire horizontalement par contact direct à travers la salive, les sécrétions respiratoires, le don de sang, de tissus ou d’organes ou les rapports sexuels (Caserta et al, 2007). Néanmoins, plusieurs études suggèrent que la transmission intra-utérine ou périnatale peut se produire. En effet, après la primo-infection le virus demeure dans les cellules mononucléaires de sang périphérique, le SNC, les glandes salivaires et le tractus génital féminin (Caserta et al, 2007). Certains cas d’avortement sont associés à la présence de HHV6 chez le fœtus (les lymphocytes du sang périphérique, le thymus, le foie, la rate, le cerveau et le LCR, les tissus des villosités choriales du fœtus) de mères VIH-positifs (BRAUN et al, 1997). Le HHV6 peut donc être responsable de transmission verticale à travers le liquide amniotique (Gervasi MT et al, 2012) ou une intégration chromosomique du virus dans le génome maternel de 0,2% à 0,8% (Caserta et al, 2007). 1.3.4. Pathologies dues au HHV6 HHV6, virus omniprésent dans les populations humaines, est responsable d’infections lytiques caractérisées par la fièvre et des éruptions cutanées. Chez les enfants, l’infection se présente comme une sclérose en plaques (ES) ou roséole infantile dont l’agent causal s’avère être le HHV-6B, maladie caractérisée par une forte fièvre persistante (39 ou 40°C) suivie d’une éruption cutanée débutant sur le tronc et se diffusant au visage et aux membres (BRAUN et al, 1997). Des complications peuvent survenir après la primo-infection notamment des cas de dysfonctionnement hépatique , hépato-splénomégalie, hépatite aigue (parfois fulminante), la thrombocytopénie, syndrome d'activation des macrophages, de Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 21 véritables méningites, des angines sans toux, des adénopathies cervicales, l'œdème des paupières, des papules de la muqueuse du palais, conduisant à la mort (De Bolle et al, 2005) . En cas d’infection à HHV6, les symptômes associés à une réactivation chez les sujets immunodéprimés semblent être : fièvre, cytopénie ; pneumopathie (greffés de moelle, transplantés de foie,) ; encéphalite (greffés de moelle) ; insuffisance médullaire, retard à la prise de greffe (greffés de moelle) ; colite (patients sidéens) ; hépatite aiguë (transplantés de foie) ou syndrome d’activation macrophagique; rétinite (patients du SIDA) ; cofacteur du CMV (transplantés d’organes solides) ; rejet de greffe (transplantés de rein et de foie ), (Caserta et al, 2007), une jaunisse, la lymphadénopathie généralisée et une leucocytose, histiocytose sinusale avec lymphadénopathie massif qui se caractérise par une adénopathie cervicale indolore, survenant dans les exacerbations et des rémissions (BRAUN et al, 1997). HHV6 peut accentuer l’immunodépression et la progression vers le SIDA (Lusso et al, 1989). HHV-6 est également associé à certains cancers comme le lymphome T cutané, le lymphome immunoblastique, la leucémie lymphoïde aigüe (Salahudin et al, 1986), le lymphome de Hodgkin (Torelli et al, 1991). 1.3.5. Interactions moléculaires entre VIH et HHV6 in vitro La plupart des nouveau-nés sont protégés contre l'infection primaire à HHV-6 par la présence d'anticorps spécifiques maternels. En outre, les personnes infectées par le HHV-6A et HHV6B peuvent exprimer une réponse humorale dépendant du poids relatif de la primo-infection ou de la réactivation. Les données cliniques indiquent cependant une baisse importante de la réponse immunitaire cellulaire pour le contrôle de la primo-infection ou la réactivation du HHV-6 chez les sujets immunodéprimés notamment les VIH+ car le HHV-6 et le VIH-1 sont en synergie immunosuppresseur (Henri Agut). Lors d’une infection mixte, on note : - une transactivation du VIH par HHV6, -une réinduction de l’expression de CD4 dans les lymphocytes CD8+ et les cellules NK par le HHV6, permettant l’infection ultérieure par le VIH, -une destruction combinée des lymphocytes CD4+ par le VIH et le HHV6 -une induction de l’expression des cytokines pro-inflammatoires par le HHV6 : expression accrue de l’IFN-α (d’interféron alpha), du TNF-α (tumor necrosis factor alpha), de l’IL-1β (interleukine-1b). L’IFN-α exogène supprime la réplication de HHV-6 in vitro. L’infection Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 22 de PBMC par HHV6 induit également in vitro une augmentation de la cytotoxicité des cellules NK. L'IL-15 peut être important pour l'activation des défenses de l'hôte, y compris l'amélioration de l'activité des cellules NK Ces interactions moléculaires peuvent engendrer in vivo l’augmentation de la réplication du VIH, la destruction des tissus lymphoïdes, la réplication du HHV6 (Henri Agut). 1.3.6. Méthodes de diagnostic de l’HHV6 Des méthodes ont été développées pour la détection du virus, de ses antigènes et des acides nucléiques en vue de renforcer le diagnostic clinique basé sur les symptômes de la maladie. Ces tests de diagnostic sont résumés dans le tableau suivant (Salahuddin et al, 1986 ; Parker et Weber, 1993 ; Caserta et al, 2010 ; Caselli et al, 2012) : Tableau 2: Méthodes de diagnostic de HHV6 Méthodes directes Méthodes indirectes Prélèvements (sérodiagnostics) •Isolement en culture de •Immunofluorescence lymphocytes indirecte(IFA) • lymphocytes ou cellules ou anti mononuclées de sang du complémentaire cordon, le plasma viraux • ELISA, • Autres fluides biologiques, • Hybridation in situ •tests immuno-enzymatiques puits • Détection des antigènes • PCR qualitative à base de 96 • PCR quantitative en temps en particulier sécrétions LCR, les cervicales de femmes enceintes et celles qui souffrent d’une IST • Tissus, biopsies. réel 1.3.7. Prophylaxie et thérapie de l’infection à HHV6 L'infection à HHV-6 est généralement asymptomatique, donc le traitement est rarement nécessaire. En cas de nécessité les principales molécules antivirales utilisées actuellement pour le traitement des infections à HHV-6 sont des inhibiteurs de l’ADN polymérase virale, telles que la ganciclovir, la valganciclovir, l’acyclovir, la valacyclovir, la cidofovir et le Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 23 foscarnet. Cependant, les données indiquent une plus grande sensibilité des HHV-6B au ganciclovir et le foscarnet que l'acyclovir, qui inhibent la réplication virale uniquement à des concentrations élevées. La sensibilité des HHV-6A à l'acyclovir et le foscarnet est similaire à celle du HHV-6B. Toutefois, certaines souches du HHV-6A (SIE et TAN) sont sensibles au ganciclovir, tandis que HHV-6A (GS) a été relativement résistant. Le foscarnet est également inhibiteur de HHV-6B. Les corticostéroïdes hydrocortisone et dexaméthasone ont montré à la fois l'amélioration de la suppression de la réplication du HHV6 in vitro. Ganciclovir a été associée à la résolution de l'insuffisance rénale et le rejet d'allogreffe chez un patient avec des titres d’IgM HHV-6 élevées. Les infections généralisées à HHV6 sont rares mais mortelles avec ou sans traitement d'où l'utilité d'une recherche préventive qui est prise désormais en compte dans les protocoles actuels. Il est donc important de suivre la séroépidémiologie d’HHV6 (Tyler, 2003). La prophylaxie repose principalement sur des règles d’hygiène notamment chez la femme enceinte. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 24 OBJECTIFS DU MEMOIRE 2. OBJECTIFS 2.1. Objectif principal L’objectif principal de cette étude est de diagnostiquer par la PCR en temps réel, le Cytomégalo virus, Epstein-Barr virus et l’Herpès Virus Humain de type 6 chez les femmes enceintes au centre médicale Saint Camille de Ouagadougou au Burkina Faso afin de contribuer à estimer leur séroprévalence chez les femmes enceintes au Burkina Faso. . 2.2- Objectifs spécifiques Pour réaliser notre objectif principal, plusieurs objectifs spécifiques ont été définis : Evaluer la prévalence des HHVs (CMV, HHV6, EBV) chez les femmes enceintes VIH séropositives présentant des symptômes ou non à travers un diagnostic moléculaire par la PCR en temps réel, Evaluer la prévalence des HHVs (CMV, HHV6, EBV) chez les femmes enceintes VIH séronégatives présentant des symptômes ou non à travers un diagnostic moléculaire par la PCR en temps réel, Evaluer la coïnfection des virus de l’herpès (CMV, HHV6, EBV) dans ces deux populations de femmes enceintes, Déterminer l’impact de la PCR dans le diagnostic du CMV, de l’EBV et du HHV-6, Déterminer l’impact de la thérapie à ARV sur la prévalence des HHVs (CMV, HHV6, EBV) chez les femmes enceintes VIH séropositives. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 25 MATERIEL ET METHODES 3. MATERIEL ET METHODES 3.1. Cadre de l’étude Notre étude s’est déroulée au centre médical Saint Camille (CMSC) qui est un centre médical très fréquenté de la ville de Ouagadougou, capitale du Burkina Faso. Le Burkina Faso est un pays enclavé situé en Afrique occidentale dans la boucle du Niger. Limité au Nord et à l’Ouest par le Mali, au Sud par la Cote d’Ivoire, le Ghana, le Togo et le Bénin, à l’Est par le Niger, il s’étend sur une superficie d’environ 274.222 Km 2 pour une population d’environ 14 millions d’habitants (INSD, 2011). La population est en majorité jeune (47,5%) et compte 57,1 % de femmes (INSD, 2009). La ville de Ouagadougou se découpe en 5 districts sanitaires (Signoghin, Baskuy, Nongremassom, Boulmiougou et Bogodogo). C’est un pays en voie de développement. Le centre médical Saint Camille (CMSC) de Ouagadougou est situé dans l’arrondissement de Bogodogo dans le district sanitaire du secteur 30. C’est un établissement à caractère caritatif situé au Secteur quatorze (14). Il couvre officiellement une population de 18 068 habitants, mais il reçoit des gestantes en provenance de toute la ville de Ouagadougou. Il est l’un des sites << sentinelles >> nationaux de surveillance épidémiologique du VIH/ SIDA chez la femme enceinte, et reçoit en moyenne plus de 4000 femmes enceintes par an en consultation prénatale. Le CMSC comprend une maternité, un service de pathologie néonatale, un service de pédiatrie, un service de santé maternelle et infantile (SMI), un dispensaire adulte, un dépôt pharmaceutique, un cabinet dentaire, un service d'imagerie médicale avec tomodensitométrie, des consultations spécialisées et un laboratoire d'analyse médicale (parasitologie, bactériologie, biochimie, hématologie, sérologie, immuno-virologie, biologie moléculaire). Le CMSC héberge depuis 2001 un programme de suivi des personnes vivant avec le VIH/SIDA (PVVIH/SIDA) et le Programme de Prévention de la Transmission Mère-Enfant (PTME) du VIH/SIDA. Tout comme le CERBA/LABIOGENE, il s’occupe du dépistage des femmes enceintes et de leur suivi même après l’accouchement et également de la prise en charge des personnes vivants avec le VIH qu’elles aient été dépistées dans ces centres ou non. Les prélèvements de sang, la détection du statut sérologique VIH pour les tests HHVs (CMV, EBV, HHV6) ont été faits au centre médical Saint Camille (CMSC) à la PTME. Les échantillons de plasma ont ensuite été acheminés dans le laboratoire du Centre de Recherche Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 26 Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) pour les analyses des HHVs (Extraction de l’ADN, caractérisation par PCR en temps réel). Le CERBA, antenne de recherche liée au CMSC abrite le laboratoire de biologie et de génétique (LABIOGENE) de l’Université de Ouagadougou au profit de la formation des jeunes médecins, pharmaciens et biologistes ; ainsi que pour les recherches fondamentales, pharmacologiques et de biologie moléculaire. 3.2. Matériel 3.2.1. Réactifs Réactifs pour l’extraction de l’ADN Kit «DNA-Sorb-B» de SACACE biotechnologies® (Ref K-1-1/B, lot 20C13B701) Réactifs pour l’amplification de l’ADN des HHVs (CMV, EBV, HHV6) Kit « Multiplex Real Time PCR Kit for quantitative detection and differentiation of Cytomegalovirus (CMV), Epstein Barr virus (EBV),and Human Herpes 6 virus (HHV6)» de SACACE biotechnologies® (Ref V48-100FRT, lot 17D13K814) . 3.2.2. Appareillage SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de “Sacace Biotechnologie” (figure 7) Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 27 Figure 7: Appareil SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de sacace Biotechnologie 3.2.3. Autre matériel Tube EDTA, milieu de transport (Transport medium du kit d’amplification Sacace), micropipettes, Vortex, Pipettes (réglable) et des embouts de pipette stériles avec filtres, incubateur, centrifugeuse pour tubes de type "Eppendorf", hotte, cryotubes, cryobox. 3.3. Méthodes 3.3.1. Type d’étude Il s’agit d’une étude transversale. 3.3.2. Population et période d’étude Nous avons orienté notre étude sur toutes les femmes enceintes sans distinction d’âge dont les plasmas sanguins ont été stockés lors du dépistage du VIH dans le cadre de la prévention de la transmission mère enfant (PTME) au Centre médical Saint Camille de Ouagadougou. Les consentements libres et éclairés des femmes étaient recueillis avant le dépistage. Pour ce faire, nous avons collecté 200 échantillons de plasma sanguin de femmes enceintes dont 100 VIH séropositifs et 100 VIH séronégatifs à la PTME. Notre étude s’est déroulée de Janvier à Juin 2013. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 28 Critères d’inclusion A l’aide des registres de la PTME, nous nous sommes intéressées aux échantillons provenant de femmes enceintes à tous les stades de grossesse. Certaines d’entre elles étaient déjà incluses dans le programme PTME ou référées au CMSC avant accouchement et avaient préalablement donné leur consentement libre et éclairé après avoir reçu d’amples explications sur l’intérêt de l’étude à laquelle elles sont invitées à participer. Critères de non inclusion Toutes femmes enceintes non dépistées au VIH. 3.3.4. Collecte des données Nos données ont été obtenues à partir des registres du programme PTME fournissant les renseignements suivants : nom, prénoms, âge, profession, situation matrimoniale, terme de grossesse, gestité, parité, avortement, enfants décédés, enfants vivants, statut VIH avant le dépistage en cours. Les femmes enceintes ont d’abord été dépistée au VIH à la PTME, puis le plasma collecté après centrifugation et conservé à - 80 °C. 3.3.5. Détection des HHVs (CMV, EBV, HHV6) 3.3.5.1. Extraction de l’ADN HHVs (EBV, CMV, HHV6) L’extraction s’est faite à l’aide du kit « DNA-Sorb-B » de SACACE biotechnologie ® » en suivant le protocole du fabricant Figure 8). Nous avons : chauffé la solution de lyse et la solution de lavage entre 60°C et 65°C pour faire disparaitre les cristaux ; mis 300µL de la solution de lyse dans des tubes de polypropylène y compris celui du control négatif de l’extraction (fournit avec le Kit d’amplification) ; ajouté 100 μl de l’échantillon aux tubes appropriés ; préparé les contrôles en ajoutant 100 μl de control négatif au tube C_ ; vortexé les tubes et les incuber à 65°C pendant 5 mn puis centrifuger à 5000g pendant 30 secondes ; vortexé vigoureusement le sorbent et ajouter 20 μl à chaque tube ; Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 29 vortexé 5 à 7 seconde et incuber les tubes à température ambiante 3 mn puis répéter cette étape ; centrifugé tous les tubes pendants 30 secondes à 1000g et à l’aide de micropipette nous avons prélevé et jeté le surnageant en changeant de cône par tube ; ajouté 300 μl de la solution de lavage 1 à chaque tube, vortexé vigoureusement et centrifuger pendant 30 secondes à 8000g puis prélevé et jeté le surnageant de chaque tube en changeant de cône par tube ; ajouté 500 μl de la solution de lavage 2 à chaque tube, vortexé vigoureusement et centrifugé pendant 30 secondes à 8000g puis prélever et jeté le surnageant de chaque tube en changeant de cône par tube. Répéter cette étape ; incubé tous les tubes à 65oC pendant 5 mn, en les gardant ouvert ; ajouté 50 μl de DNA-éluant au culot et incubé à 65°C pendant 5 mn en vortexant périodiquement ; centrifugé à 12000g pendant 1mn ; retiré le surnageant (contenant l’ADN). Si l’amplification ne se fait pas immédiatement, l’ADN doit être conservé entre – 20°C et – 80°C. Figure 8: Photo lors de l'extraction de l'ADN de EBV, CMV et HHV6 au CERBA/ LABIOGENE Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 30 3.3.5.2. La PCR en temps réel Principe de la PCR en temps réel La technologie de la PCR en temps réel repose sur le suivi cycle par cycle de la réaction d’amplification enzymatique au moyen d’une molécule «reporter» fluorescente capable d’émettre dans des conditions données un rayonnement fluorescent dont l’intensité est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés durant la réaction de PCR et qui sera directement mesurée à un moment donné au cours de chaque cycle PCR . En observant la quantité de fluorescence émise à chaque cycle, il devient possible de suivre la réaction PCR durant sa phase exponentielle où la première augmentation significative dans la quantité d’amplicons est en corrélation directe avec la quantité initiale de la matrice originale cible (Template) (Elyse Poitras, 2002). Nous avons réalisé une PCR en temps réel multiplex pour la détection quantitative et la différenciation du cytomégalovirus (CMV), du virus d'Epstein Barr (EBV) et du virus de l'herpès humain de type 6 (HHV-6) dans les matières biologiques. L'ADN extrait à partir des échantillons, a été amplifié en utilisant des amorces fluorescentes et spécifiques de CMV, EBV, HHV6 et du gène de la beta-globine humain utilisé comme contrôle interne (IC) permettant de contrôler les étapes d’analyse PCR (extraction de l'ADN et l'amplification PCR). Nous avons quatre types de fluorescences à savoir : Fam pour une fluorescence de couleur verte, JOE pour une fluorescence de couleur jaune, ROX pour une fluorescence de couleur orange et Cy5 pour une fluorescence de couleur rouge. Protocole de la PCR en temps réel -Préparation des échantillons pour l’amplification : Préparation du PCR Mix : dans un tube PCR stérile, nous avons mélangé 10µl de PCRmix-1 "CMV/EBV/HHV6/IC", 5 µl de PCR-Buffer-FRT et 0,5 µl de Taq DNA polymérase. Ces volumes étaient multipliés par le nombre d’échantillons à tester en prenant en compte deux standards, un control positif et un control négatif avec une marge de 2. Puis nous avons vortexé et centrifugé pendant 2-3 sec. Mélange réactionnel : nous avons centrifugé le tube contenant l’extrait d’ADN (2mn à 12000-16000 g), et avons ajouté 15 µl de PCR-Mix à 10µl d’extrait d’échantillon d’ADN Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 31 dans un trip (soit un volume réactionnel total de 25 µl). Nous avons ensuite mélangé à la micropipette. Pour l’analyse qualitative, nous avons ensuite préparé 1 contrôle positif et 1 contrôle négatif en ajoutant 10 µl de RNA-buffer à 15 µl de PCR-Mix aux trips correspondant au negative control et 10µl d'ADN humain CMV/EBV/HHV6 (C+) à 15µl de PCR-Mix aux trips correspondant au positive control. Enfin pour l’analyse quantitative, nous avons préparé 2 calibrateurs 1 (KSG1) et 2 calibrateurs 2 (KSG2) en mélangeant dans chacun des 4 trips, 15µl de PCR-Mix à 10µl du calibrateur approprié. Le volume total de la réaction est de 25µl. Nous avons fermé les tubes et les avons transférer dans l'appareil dans cet ordre: échantillon, un contrôle négatif, un contrôle positif, des calibrateurs. - Programme d’amplification sur SaCycler-96 pour la PCR en temps réel du CMV/EBV/HHV6 Tableau 3: Programme d'amplification de la PCR multiplex en temps réel Etapes Température en °C Temps 1 95 15 min -- 95 5s -- 60 20 s -- 72 15 s -- 95 5s -- 60 30 s FAM, JOE/HEX/Cy3, 2 3 Détection de la florescence Cycles ROX/Texas Red, Cy5 72 15 s 1 5 40 -- 3.3.5.3. Analyse et interprétation des résultats L’analyse et l’interprétation des résultats se fait comme suit à l’aide de l’appareil PCR, SaCycler-96 Real Time PCR v.7.3 de sacace Biotechnologie (Tableau4) : Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 32 Tableau 4: Exemple d'analyse qualitative des résultats PCR 3.3.5.4. Performance - sensibilité : Le Kit CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM est capable de détecter les cas d’infection à partir de 5 copies de DNA par 105 cellules dans le sang total, dans les globules blancs et dans les biopsies de viscères. Dans les produits biologiques fluides elle est de 400 copies/ml - spécificité : Le Kit CMV/EBV/HHV-6 Quant Real-TM est utilisé pour la détection de l’ADN de l’EBV, du HHV-6 et du CMV. La spécificité du Kit a été confirmée par analyse de souche de référence du CMV AD 169, QCMD pour l’EBV. 3.3.6. Analyse des données Les données ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel standard Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 17.0 et du logiciel Epi Info 3.5.1. Le test de Chi carré à été utilisé pour les comparaisons. La différence a été significative pour p <0,05. Le logiciel End Note version 9.0.0 a été utilisé pour la bibliographie. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 33 3.3.7. Considérations éthiques Cette étude a été réalisée en tenant compte du consentement éclairé des femmes et l’autorisation du comité d’éthique de Saint Camille et du CERBA. Le respect de confidentialité et l’anonymat par rapport aux informations fournies était de mise. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 34 RESULTATS 4. RESULTATS Notre étude a porté sur 200 échantillons de sang. Nous avons diagnostiqué simultanément trois herpès virus humains à savoir le Cytomégalo virus (CMV), l’Epstein Barr virus (EBV) et l’herpès virus humain 6 (HHV6) par la PCR en temps réel chez les femmes enceintes. 4.1. Caractéristiques sociodémographiques des femmes enceintes dépistées aux HHVs. Les femmes enceintes de cette étude étaient âgées de 16 à 45 ans avec une moyenne d’âge de 28,18 ± 5,95 ans. L’âge des femmes enceintes VIH séropositives variait entre 17 et 45 ans avec un âge moyen de 30,04 ± 5,54 ans tandis que celui des VIH séronégatives variait entre 16 et 43 ans avec une moyenne de 26,31 ± 5,79 ans. Les femmes enceintes âgées de 20 à 30 ans et celles ayant plus de 30 ans étaient majoritairement représentées avec des taux de 54,50% et de 33,50% respectivement (Tableau 3). Des 200 enquêtées, 107 étaient des ménagères (53,50%), 54 du secteur informel (27,00%), 21 élèves/étudiantes (10,50%) et 18 salariées (9,00%). Les femmes enceintes ayant plus d’antécédents d’avortement et d’enfants décédés étaient du groupe des ménagères (7,00% et 14,00%) et du secteur informel (8,00% et 4,00%). Nous n’avons pas trouvé de différence significative entre la profession des femmes et la fréquence d’avortement ou la fréquence d’enfants décédés (p ˃ 0,05) mais les enfants décédés entre VIH+ et VIH-ont une différence significative (P ˂ 0,001). Dans cet échantillon de femmes enceintes, 50,00% (100/200) étaient VIH séropositives et 50,00% (100/200) VIH séronégatives. Parmi les 100 femmes VIH séropositives, 7,50% (15/200) étaient sous ARV dont 6% (12/200) sous prophylaxie ARV et 1,5% (03/200) sous trithérapie. La majorité des ménagères (40,19%) était infectée au VIH. Dans notre échantillon, la plus forte prévalence du VIH a été observée chez les femmes enceintes ménagères, salariées et du secteur informel (P ˂ 0,001) (Tableau 5). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 35 Tableau 5:Caractéristiques sociodémographiques des femmes enceintes Age ≤ 20 ] 20-30] ˃ 30 Profession Salariées Ménagères Elèves/Etudiantes Secteur informel Avortement Oui Non Enfants décédés Oui Non Protocole ARV Prophylaxie Traitement Femmes VIH- Femmes VIH+ Total n (%) n (%) n (%) 20(20,00) 57(57,00) 23(23,00) 4(4,00) 52(52,00) 44(44,00) 24(12,00) 109(54,50) 67(33,50) 8(8,00) 43(43,00) 16(16,00) 33(33,00) 10(10,00) 64(64,00) 5(5,00) 21(21,00) 18(9,00) 107(53,50) 21(10,50) 54(27,00) 10(10,00) 90(90,00) 14(14,00) 86(86,00) 24(12,00) 176(88,00) 11(11,00) 89(89,00) 30(30,00) 70(70,00) 41(20,50) 159(79,50) - 12(12,00) 3(3,00) 12(6,00) 3(1,50) 4.2. Prévalence générale des infections HHVs (EBV, CMV, HHV6) détectées chez les femmes enceintes par PCR en temps réel. Sur les 200 échantillons analysés, 9,00% (18/200) étaient positifs à au moins un des trois virus (EBV=2, CMV=4, HHV6= 2, EBV/HHV6=1, EBV/CMV/HHV6=9). Les femmes qui avaient une infection au CMV étaient majoritaires avec une fréquence de 6,50% soit 13/200 contre 6,00% (12/200) de femmes infectées au EBV et 6,00% (12/200) de femmes infectées au HHV6 (Tableau 6). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 36 Tableau 6: Prévalences des HHVs (EBV, CMV, HHV6) chez les femmes enceintes HHVs Prévalence EBV CMV HHV6 18/200 (9,0 %) 12/200 (6,0%) 13/200 (6,5%) 12/200 (6,0%) 5.57-14.07 IC 95% 3.28-10.50 3.65-11.10 3.28-10.50 IC 95% : intervalles de confiance à 95% Nous avons trouvé 10 cas de coïnfections sur les 18 femmes enceintes infectées par au moins un des trois herpès virus humains soit une fréquence de 55,56%. La coïnfection EBV/CMV/HHV6 était majoritaire (9/10 soit 90%). L’autre cas de coïnfection enregistrée est constitué d’EBV/HHV6 (1/10 soit 10%). Par ailleurs, les coïnfections EBV/CMV ou CMV/ HHV6 n’ont pas été détecté chez les femmes enceintes de notre étude. 4.3. Infection à CMV, EBV et HHV-6 en fonction de l'âge, du statut VIH et de la thérapie ARV L’analyse de nos résultats en fonction de l’âge nous montre une prévalence HHVs de 12,50% pour les femmes ayant moins de 20 ans, 6,42% pour celles ayant un âge compris entre 20 et 30 ans, 11,94% pour un âge supérieur à 30 ans. Les taux de coïnfections HHVs (CMV, EBV, HHV6) étaient respectivement de 4,17%, 6,50% et 4,48%. Il n’y avait pas de différence significative entre l’âge et la sérologie ou la coïnfection HHVs (P= 0,377 ; P= 0,821). En fonction de la sérologie VIH, nous avons trouvé 12,00% d’infections HHVs chez les VIH séronégatives et 6,00% chez les VIH séropositives. Le taux de coïnfection était respectivement de 6,00% et 4,00%. Nous n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative entre la sérologie VIH et l’infection ou la coïnfection HHVs (P= 0,138 ; P= 0,156) (tableau 7). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 37 Tableau 7: Infection à CMV, EBV, HHV6 en fonction de l'âge, de la sérologie VIH et de la thérapie ARV HHVs+ EBV + CMV+ HHV6+ n (%) n (%) n (%) n (%) Taux de coinfection n (%) Total ≤ 20 3 (12,5) 2(8,33) 1(4,17) 1(4,17) 1(4,17) 24 ] 20-30] 7 (6,42) 7(6,42) 6(5,50) 6(5,50) 6(6,50) 109 ˃ 30 8(11,94) 3(4,48) 6(8,96) 5(7,46) 3(4,48) 67 VIH- 12 (12) 7(7) 8(8) 8(8) 6 (6) 100 VIH+ 6 (6) 5(5) 5(5) 4(4) 4 (4) 100 Sans ARV 6 (7,06) 5(5,88) 5(5,88) 4(4,71) 10(11,76) 85 Sous ARV 0 (0) 0(0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 15 n Caractéristiques Age (ans) Sérologie VIH ARV 4.4. Impact du traitement antirétroviral sur la prévalence des HHVs (EBV, CMV, HHV6) Pour prévenir la transmission verticale du VIH, le protocole PTME en vigueur au BF (prophylaxie/traitement) soit l’option A OMS est le suivant : -pour un taux de CD4 ≤ 350 et/ ou au stade clinique OMS III ou IV, la femme enceinte est soumise à une trithérapie ; Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 38 -pour un taux de CD4˃ 350 et/ ou stade clinique I ou II, elle est sous prophylaxie : AZT à partir de la 14ième semaine de grossesse, puis une dose unique de Névirapine (NVP) et une première d’AZT/ 3TC au moment de l’accouchement (début du travail), après accouchement elle est mise sous AZT/ 3TC tous les jours pendant une semaine. Dans la population de femmes enceintes VIH séropositives, l’analyse par la PCR a révélé 7,06% (soit 6,00/85) d’infection HHVs chez celles qui n’étaient pas sous thérapie ARV. Par ailleurs, aucun herpès virus humain (0%) n’a été isolé chez les femmes enceintes VIH séropositives soumises à une thérapie ARV (Tableau 7). Cependant, cette différence n’est pas significative. 4.5. Corrélation entre l’infection aux HHVs et l’avortement, la profession, le stade évolutif de la grossesse Les résultats du tableau 8 nous montrent que l’infection aux HHVs semble varier en fonction de la profession. Ces herpès virus humains ont été beaucoup plus isolés chez les ménagères. Il en est de même pour la coïnfection HHVs. Mais ces variations n’étaient pas significatives (P= 0,418). Selon le terme de la grossesse, la prévalence et le taux de coïnfection HHVs étaient respectivement de 5,63 % contre 5,63 % au 1er trimestre, 12,36% contre 4,49 % au 2ème trimestre et 7,50 % contre 5,00 % au 3ème trimestre de grossesse. Les différences entre l’infection HHVs et la coïnfection par rapport au terme de grossesse n’étaient pas significatives (P= 0,314 ; P=0,947). Le tableau 8 révèle que les taux d’infections aux HHVs étaient de 12,50% (3/24) chez les femmes enceintes ayant des antécédents d’avortement contre 8,52% (15/176) chez celles qui n’ont jamais avorté. Le taux de coïnfection était de 4,17% (1/24) et 5,11% (9/176) respectivement. Pour ces variations, les différences n’étaient pas significatives suivant les différents motifs recensés (P=0,796 ; P=0,765). Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 39 Tableau 8: Répartition des HHVs en fonction de l'avortement, la profession et du terme de grossesse HHVs EBV CMV HHV6 TAUX DE COINFECTION n (%) n (%) n (%) n (%) Fonctionnaire (n=18) 3 (16,67) 1 (5,56) 2 (11,11) 2 (11,11) 1 (5,56) Scolarisées (n=21) 3 (14,29) 3 (14,29) 2 (9,52) 2 (9,52) 2 (9,52) Ménagères (n=107) 9 (8,41) 7 (6,54) 7 (6,54) 7 (6,54) 6 (5,61) Secteur informel (n=54) 3 (5,56) 1 (1,85) 2 (3,70) 1 (1,85) 1 (1,85) 1er Trimestre (n=71) 4 (5,63) 4 (5,63) 3 (4,23) 4 (5,63) 4 (5,63) 2ème Trimestre (n=89) 11 (12,36) 6 (6,74) 7 (7,87) 6 (6,74) 4 (4,49) 3ème Trimestre (n=40) 3 (7,5) 2 (5) 3 (7,5) 2 (5) 2 (5) Oui (n=24) 3(12,5) 1 (4,17) 2 (8,33) 2 (8,33) 1 (4,17) Non (n=176) 15 (8,52) 11 (6,25) 11 (6,25) 10 (5,68) 9 (5,11) Profession Terme de grossesse Avortement Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 40 DISCUSSION 5. DISCUSSION La taille de l’échantillon, l’absence de données épidémiologiques précises, l’absence d’informations sur la primo-infection de ces herpès virus chez les femmes enceintes ne nous permettent pas de mesurer l’impact réel de la coïnfection HHVs/ VIH sur la santé publique et de généraliser les conclusions à l’ensemble de la population féminine du Burkina Faso. Néanmoins, cette étude nous a permis d’estimer la prévalence du CMV, d’EBV et de HHV6 chez les femmes enceintes à Ouagadougou. Les femmes enceintes de cette étude étaient âgées de 16 à 45 ans avec une moyenne d’âge de 30,04 ± 5,54 ans chez les femmes VIH séropositives et de 26,31 ± 5,79 ans chez les femmes VIH séronégatives. L’âge moyen de l’infection était de 30,17 ± 5,98 ans chez les femmes VIH séropositives et de 27,5 ± 7,44 ans chez les femmes VIH séronégatives. Dans cette étude, il n y avait pas d’association entre l’âge et l’infection aux HHVs (CMV, EBV, HHV6). Cela pourrait s’expliquer par le mode de transmission et le mimétisme moléculaire de ces herpès virus qui ne sont pas fonction de l’âge. La prévalence du CMV, EBV ou HHV6 semble liée à la profession des femmes enceintes, dont les ménagères sont significativement plus infectées (4,50%). La majorité des positives aux HHVs (61,11% soit 11/18) était au 2è trimestre de grossesse. Cette prévalence pourrait constituer un haut risque de transmission des herpès virus au fœtus. Ce qui est conforme à la forte prévalence de 2,20% d’acides nucléiques viraux de HHV6 détectés dans le liquide amniotique au cours du 2èm trimestre de grossesse par Gervasi et al, (2012) en Italie et 35% de réactivation d’EBV rapporté par Haeri et al, (2010) en Caroline du nord. Les infections à EBV, CMV et HHV6 sont beaucoup plus accentuées chez les femmes enceintes n’ayant pas d’antécédents d’avortement que celles qui en avaient mais cette différence n’était pas statistiquement significative. Les herpès virus sont responsables de certains cas d’avortement et pourraient en effet conférer à l’organisme maternel une certaine immunité. Nous avons trouvé des prévalences de 6,00%, 6,50% et 6,00% respectivement pour EBV, CMV et HHV6. Ces prévalences observées dans la population générale de femmes enceintes sont supérieures à celles de 0,10%, 0,80%, 1,00% rapportées par Gervasi et al, (2012) en Italie grâce à la PCR quantitative en temps réel. La discordance des résultats HHVs entre les Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 41 techniques PCR multiplexe en temps réel de notre étude et la PCR quantitative en temps réel des deux études antérieures menées par Gervasi et al, (2012) en Italie et Al-Awadhi et al, (2013) au Koweït, peuvent s’expliquer non seulement par la nature du fluide biologique utilisé mais aussi par les stades d’infection (primo-infection, réactivation, réinfection), l’état immunologique de la femme enceinte, la sensibilité et spécificité des tests, sans oublier le niveau de développement économique de ces femmes enceintes. En effet, la virémie serait plus élevée dans l’urine maternelle (Al-Awadhi et al, (2013) et le liquide amniotique (Gervasi et al, (2012) que dans le plasma sanguin. La prévalence de 6,5% de l’infection par CMV dans la population générale de femmes enceintes est comparable aux prévalences de 4,5% et 10,11% rapportées au Koweït (AlAwadhi et al, 2013) à travers la PCR nichée appliquée respectivement au sang du cordon et à l’urine maternelle. A l’inverse, cette prévalence au CMV est inférieure à celles de 12,00% , 18,18%, 30,00% ,30,16% rapportées respectivement en Egypte (el-Sayed Zaki et al, 2007) à travers des tests sérologiques de patientes ASR (avortement spontané récurrent), en Suisse (Azam et al, 2001) par PCR ( amniocentèse et sang fœtal), en Israël ( Yinon et al, 2006) grâce à la PCR effectué sur des grossesses gémellaires à travers le liquide amniotique et la culture du CMV après naissance, en Allemagne ( Enders et al, 2001) par des tests sérologiques (sang fœtal, liquide amniotique). La prévalence de 6,00% de l’infection à EBV est inférieure à celle de 98% rapportée par Haeri et al, 2010 en Caroline du nord (USA) à travers des tests sérologiques. Quand à l’infection au HHV6, sa prévalence 6% est supérieure à celle de 1% rapportée en Italie (Gervasi et al, 2012) et 1% aux Etats Unis (Caserta et al, 2004). La prévalence du HHV6 dépend non seulement sa localisation mais aussi du terme de grossesse. En effet, à New York, de la première moitié à la deuxième moitié de grossesse, cette prévalence était respectivement de 25,80% et 22,20% dans les cellules mononucléaires de sang périphériques(PBMC), 7,50% et 7,10% dans les sécrétions cervicales, 9,10% dans le placenta (Caserta et al, 2007). En Afrique, la coïnfection HHVs et virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est un facteur de risque additionnel (Marshall et al, 2010). Cependant, dans notre échantillon la Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 42 prévalence de l’infection à au moins un des trois virus (CMV, EBV, HHV6) était plus élevée chez les femmes enceintes VIH séronégatives que chez les VIH séropositives. Cependant cette différence n’était pas significative (P= 0,138). Sur l’ensemble des 15 femmes enceintes VIH séropositives de notre étude soumises à la thérapie ARV, aucune d’elles ne présentait une infection à l’un des HHVs. Nos résultats sont en concordance avec ceux de Silvia Bonalumi et al. 2011 en Italie. Ces résultats laissent penser que la thérapie antirétrovirale augmente le taux de cellules T CD4 empêchant ainsi la réactivation des herpès virus. Cela est conforme aux résultats rapporté au Burkina Faso (Ilboudo et al, 2009) sur le HHV8/VIH et en Alabama aux USA (O’Sullivan et al, 1999) sur l’impact de la trithérapie HAART sur la prévalence du CMV. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 43 CONCLUSION ET PERSPECTIVES CONCLUSION Nous avons déterminé simultanément par la PCR en temps réel l’ADN du CMV, d’EBV et de HHV6 dans 200 échantillons constitués de plasma de femmes enceintes VIH séropositifs et VIH séronégatifs. Ces herpès sont fréquents dans la population de femmes enceintes. Ils constituent une menace chez la femme enceinte à cause des complications et des risques pour le nouveau-né. Cette étude nous a révélé la vulnérabilité des femmes enceintes et de leurs fœtus au CMV, EBV, HHV6 ainsi qu’au VIH. Les prévalences de ces trois virus que nous avons évalués par la détection de l’ADN viral comme marqueur de l’infection sont faibles par rapport à celle trouvée par les études antérieures grâce aux techniques sérologiques ou d’autres techniques de PCR. Cette étude pilote de Ouagadougou met à la disposition des acteurs de la santé de nos populations, des données utiles sur ces herpès virus dans la sous région avec des techniques PCR à faible coût, plus spécifiques et plus sensibles que celles sérologiques. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 44 RECOMMANDATIONS A la PTME il serait important avec l’appui des chercheurs, de réaliser une étude à grande échelle sous régionale sur le diagnostic des herpès virus chez les femmes enceintes notamment les VIH positifs et de mettre à disposition une thérapie et une prophylaxie polyvalentes couvrant tous les herpès virus. A l’endroit du Ministère de la santé et de nos autorités nationales il serait indispensable : De mettre en place une surveillance systématique des femmes enceintes dans l’optique d’atteindre une meilleure lutte dans la transmission verticale du CMV, EBV et HHV6 et prévenir les risques de développements de cancers au Burkina Faso et également dans d’autres pays en voie de développement à haute prévalence de ces types de virus ; De faire des campagnes d’information, d’éducation et de sensibilisation de la population sur l’infection aux herpès virus humains et les risques de cancer ; D’organiser une campagne de dépistage par la PCR et subventionner la PCR. Quant aux femmes, s’en tenir aux règles d’hygiène et éviter strictement les facteurs de risques d’infection des herpès virus. Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 45 PERSPECTIVES Vu le niveau de développement économique, il serait nécessaire de rendre la PCR plus accessible comme outil de routine du dépistage et du diagnostic des infections par le CMV, L’EBV et le HHV6. Nous pourrions envisager dans de prochaines recherches de : 1. Réaliser une étude de grande envergure dans la sous région Ouest africaine, sur le diagnostic du CMV, EBV et HHV6 chez les femmes enceintes et leurs nouveaunés ; 2. Déterminer les génotypes de EBV et HHV6 circulants dans nos populations ; 3. Collaborer avec d’autres chercheurs pour mettre en place un vaccin spécifique à chacun de ces virus et un traitement compatible avec la grossesse ; 4. Evaluer la coinfection entre ces virus et le HPV chez la femme enceinte ainsi que le risque de développement de cancer ; 5. Pour vaincre les cancers viraux nous pourrions également étendre cette étude sur la population générale du Burkina en vu d’obtenir des valeurs plus objectives de l’épidémiologie de ces virus, puis de celle des pathologies dont ils sont responsables Master II / BioGéMA / 2012 / Rogomenoma Alice OUEDRAOGO Page 46 REFERENCES REFERENCES AKHTER S, KUSHWAHA S, WARSI M, ANWAR M, AHMAD M, AHMAD I, TALEGAONKAR S, KHAN Z, KHAR R. , AHMAD F (2011) Development and evaluation of nanosized niosomal dispersion for oral delivery of Ganciclovir. Drug Dev Ind Pharm, 38, 84-92. AL-AWADHI R, ALFADHLI S (2013) Prevalence of cytomegalovirus DNA in cord blood and voided urine obtained from pregnant women at the end of pregnancy. Medical principles and practice, 22, 194-9. AMBINDER R., ROBERTSON K, MOORE S, YANG J. (1996) Epstein-Barr virus as a therapeutic target in Hodgkin's disease and nasopharyngeal carcinoma. Semin Cancer Biol, 7, 217-26. 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