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UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL
RÉPONSE IMMUNITAIRE DES LYMPHOCYTES MURINS
EXPOSÉS À DES MÉTAUX LOURDS
MÉMOIRE
PRÉSENTÉ
COMME EXIGENCE PARTIELLE
DE LA MAÎTRISE EN BIOLOGIE
PAR
MARLÈNE FORTIER
AVRIL 2006
UNIVERSITÉ DU QUÉBEC À MONTRÉAL
Service des bibliothèques
Avertissement
La diffusion de ce mémoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a signé
le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles
supérieurs (SDU-522 - Rév.01-2006). Cette autorisation stipule que «conformément à
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l'Université du Québec à Montréal une licence non exclusive d'utilisation et de
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commercialiser ou non ce travail dont [il] possède un exemplaire.»
REMERCIEMENTS
Premièrement, j'aimerais remercier mon directeur de recherche M. Gaston Chevalier,
ainsi que mon co-directeur M. Michel Foumier pour leur appui, leur compréhension
ainsi que leur aide apportés lors de mes recherches ainsi que pendant la rédaction de
ce mémoire.
Je tiens également à remercier:
Mme Pauline Brousseau pour ses conseils et commentaires constructifs.
Toute l'équipe de laboratoire du Pr. Michel Foumier et plus particulièrement Mme
Julie De Gagné, qui en plus d'être devenue une amie, a été d'une grande aide et d'un
grand support lors des expériences et des cours.
Je tiens aussi à remercier ma famille, mon copain Daniel et mon fils Nicolas pour
leur patience et leur soutien.
À tous, un gros merci!
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES FIGURES
v
LISTE DES ABRÉVIATIONS
RÉSUMÉ
vi
viii
INTRODUCTION
,
1
CHAPITRE 1
ÉTAT DES COJ'JNAISSANCES
1.1 Le système immunitaire
4
1.2 Les métaux lourds
5
1.2.1 Le mercure
5
1.2.1 A Le méthylmercure
7
1.2.1 B Le chlorure de mercure
8
1.2.2 Le cadmium
Il
1.2.3 Le zinc
14
1.2,4 Le sélénium
15
1.3 Activation des lymphocytes et thiols intracellulaires
18
1.4 Apoptose
21
1.5 Différence entre les lymphocytes et les macrophages
21
1.6 Hypothèses de travail
22
1.7 Objectifs de travail
22
CHAPITRE II
ARTICLE SOUMIS ET ACCEPTÉ POUR PUBLICATION
Cellular Response ofMouse Splenocytes to Heavy Metals Exposure
25
CHAPITRE III
Discussion
75
Conclusion
88
Perspectives futures
89
CHAPITRE IV
Résultats non-soumis pour publication
90
IV
APPENDICE A
Courbe dose-réponse avec la concanavaline A
94
RÉFÉRENCES
95
LISTE DES FIGURES
Figure 1:
Courbe dose-réponse du pourcentage d'apoptose des lymphocytes pré­
activés et non pré-activés en présence de chlorure de mercure (HgCh)
page: 90.
Figure 2:
Courbe dose-réponse du pourcentage d'apoptose des lymphocytes pré­
activés et non pré-activés en présence de chlorure de cadmium (CdCh)
page: 91.
Figure 3:
Courbe dose-réponse du pourcentage d'apoptose des lymphocytes pré­
activés et non pré-activés en présence de tétrachlorure de sélénium
(SeCI4) page: 92.
Figure 4:
Détermination de la concentration optimale de concanavaline A page:
94.
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN
Acide désoxyribonucléique
ARN
Acide ribonucléique
BSA
Bovine serum albumine
CdCh
Chlorure de cadmium
CIso
Concentration provoquant 50% d'inhibition
CMF
5-Ch1orométhylfluorescéine
CMFDA
5-Chlorométhylfluorescéine diacétate
CMHII
Complexe majeur d'histocompatibilité de classe II
Con A
Concanavaline A
CPA
Cellules présentatrices d'antigènes
DMSO
Sulfoxyde de diméthy1e
DPM
Désintégrations par minute
EROs
Espèces réactives de l'oxygène
FBS
Sérum de veau fœtal (Fœtal bovine serum)
GSH
Glutathion
GSH-Px
Enzyme glutathion peroxydase
GSSG
Glutathion sous sa forme oxydée
GST
Glutathion S-transférase
Hg
Mercure élémentaire
HgCh
Chlorure de mercure (mercure inorganique)
IgA
Immunoglobuline chaîne a (alpha)
IgE
Immunoglobuiine chaîne c (epsilon)
IgG
Immunoglobuline chaîne y (gamma)
IgG1
Immunoglobuline chaîne y -1 (gamma-1)
IgM
Immunoglobuline chaîne f.l (mu)
IL-2
Interleukine-2
IL-4
Interleukine-4
LDH
Lactate déshydrogénase
MeHgC1
Chlorure de méthylmercure (mercure organique)
Vll
MT
Métallothionéine
NEM
N-éthylmaleimide
NK
Cellules tueuses naturelles (Natural Killer Cells)
PBS
Tampon phosphate en solution saline (Phosphate buffer saline)
PHA
Phytohémagglutinine
PI
Iodure de propidium (Propidium iodide)
PMA
4~-Phorbol 12~-myristate
Se
Sélénium
SEA
Antigène d'œuf de Schistosome (Schistosome Egg Antigen)
SeCl 4
Tétrachlorure de sélénium
SH
Groupements sulihydryles
SOD
Superoxyde dismutase
TCR
Récepteur de cellules T (T-cell receptor)
ZnCh
Chlorure de zinc
l3a-acétate
RÉSUMÉ
Parmi les contaminants environnementaux reconnus pour leur toxicité et leur
propagation à travers le monde, les métaux lourds sont certainement d'une première
préoccupation. Des études démontrent que les métaux lourds peuvent altérer
différents systèmes dont le système immunitaire. Ils peuvent induire des effets
immunomodulateurs qui poulTont avoir comme conséquences, l'augmentation de la
susceptibilité à des agents infectieux, l'apparition de maladies néoplasiques et de
maladies auto-immunes. Afin de se protéger de cette agression, les cellules
immunitaires induisent des thiols (cystéines, glutathion, métalloprotéines) qui sont
des molécules capables de neutraliser les métaux en s'y liant et ainsi protéger
l'organisme des effets néfastes. La pré-activation de ces cellules augmenterait leur
contenu intracellulaire en thiols et les rendrait donc plus résistantes à l'effet néfaste
des métaux lourds. Dans cette étude, nous avons voulu démontrer, l'effet de la pré­
activation des lymphocytes avec la concanavaline A sur la toxicité de certains
métaux lourds tels que le mercure (organique et inorganique), le cadmium, le zinc et
le sélénium. Nous avons mesuré la prolifération Iymphoblastique, la viabilité,
l'apoptose ainsi que le niveau de thiols intracellulaires dans ces cellules pré-activées
ou non pré-activées. Pour la prolifération lymphoblastique, les cellules pré-activées
ont été significativement plus résistantes que les cellules au repos pour les deux
formes de mercure, le cadmium et le zinc. Le niveau de thiols a été significativement
augmenté chez les lymphocytes pré-activés de même que la viabilité, alors que
l'apoptose a été augmentée dans les lymphocytes pré-activés par rapport à leur
contrôle respectif en présence de mercure inorganique, de zinc et de sélénium. Les
résultats suggèrent que la pré-activation des lymphocytes entraîne une augmentation
du niveau de thiols intracellulaires leur procurant une meilleure protection contre
l'effet néfaste des métaux lourds.
INTRODUCTION
Parmi les contaminants environnementaux reconnus pour leur toxicité et leur
propagation à travers le monde, les métaux lourds sont certainement d'une première
préoccupation. L'industrialisation a provoqué une augmentation remarquée de ceux­
ci dans l'environnement. Ils provoquent un changement dans l'homéostasie de
plusieurs systèmes physiologiques spécialement le système immunitaire. Les métaux
lourds diffèrent des autres substances toxiques car ils sont ni créés, ni détruits par
l'humain (Goyer, 2001). Les métaux lourds, dont le mercure, le cadmium et le
plomb,
sont
environnement.
des
éléments
Toutefois,
chimiques
l'exposition
naturellement
à
ces
présents
éléments
a
dans
été
notre
augmentée
considérablement suite à des activités humaines (médicales ou industrielles) (
Foulkes, 2000;Goyer, 2001) à un point tel que les niveaux dangereux sont
certainement
atteints
dans
un
nombre
croissant
d'écosystèmes
(Foulkes,
2000;Lawrence & McCabe, 2002). Les métaux lourds tels que le mercure, le
cadmium et le zinc sont aussi d'importants polluants des systèmes aquatiques qui
peuvent altérer les réponses immunitaires chez plusieurs espèces de poissons
(Sanchez-Dardon et al., 1999). Ils peuvent causer des dommages cellulaires par
différents mécanismes incluant des effets directs sur la membrane cellulaire et
certains organelles altérant ainsi la transduction du signal ou affectant les systèmes
enzymatiques à l'intérieur de la cellule (Tsangaris & Tzortzatou-Stathopoulou,
1998). Les métaux lourds peuvent induire des immunosuppressions (Fournier et al.,
2000) rendant l'organisme plus susceptible à des infections ou des cancers (Schuppe
et al., 1998). Ils peuvent provoquer le déclenchement de réactions immunitaires
anormales telles que des allergies, des réactions dites d'hypersensibilité ou de l'auto­
immunité (Lawrence, 1985;Lawrence et aL, 1996;Selgrade, 1999). De plus, certains
d'entre eux peuvent agir sur le système immunitaire à des doses ne provoquant
aucune autre manifestation de toxicité (Exon, 1984). Cette action néfaste des métaux
lourds a été démontrée sur le système immunitaire et d'autres systèmes
physiologiques chez l'humain et les animaux (Foulkes, 2000;Worth et al., 2001).
La fonction du système immunitaire est de reconnaître et d'éliminer
rapidement les agents pathogènes potentiellement dangereux pour l'hôte. Lorsque le
2
système immunitaire répond adéquatement, les substances étrangères sont éliminées
rapidement et efficacement (Zelikoff et al., 1994).
Les réponses immunitaires sont essentiellement dûes à l'action des leucocytes
dont il existe différents types. Un premier groupe important de leucocytes est formé
par les cellules phagocytaires telles que les monocytes, les macrophages et les
polynucléaires neutrophiles. Un deuxième groupe important de leucocytes est
constitué par les lymphocytes. Ces cellules sont à l'origine des réponses
immunitaires adaptatives car elles reconnaissent des microorganismes de façon
spécifique, que ceux-ci soient à l'intérieur des cellules de l'hôte ou à l'extérieur dans
les liquides biologiques. Tous les lymphocytes sont dérivés de cellules souches de la
moelle osseuse, mais on distingue les lymphocytes T, qui se différencient dans le
thymus, et les lymphocytes B, qui se différencient dans la moelle osseuse (chez les
mammifères adultes) (Roitt et al., 1997).
Afin de se protéger contre l'effet néfaste des métaux lourds, la cellule induit
des thiols (cystéines, glutathion, métalloprotéines), qui sont des molécules capables
de neutraliser les métaux en s'y liant (Dickinson & Forman, 2002a;Dickinson &
Forman, 2002b). Il existe deux classes de thiols, les petites molécules non
enzymatiques ayant des groupements sulfhydryles et des protéines qui immobilisent
et empêchent les métaux de dénaturer les protéines de haut poids moléculaire en se
liant directement aux métaux (Hultberg et al., 2001 ;Dickinson & Forman,
2002a;Dickinson & Forman, 2002b). En pré-activant la cellule, que ce soit avec un
mitogène: phytohémagglutinine (PHA) ou concanavaline A (Con A), nous
augmentons le contenu intracellulaire en thiols et plus spécifiquement en glutathion
(GSH) ce qui a pour effet de protéger cette cellule contre l'effet néfaste des métaux
lourds (Hamilos et al., 1989;Lawrence et al., 1996;Dickinson & Forman, 2002b).
Ce mémoire sera divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre se veut une
revue de la littérature exposant l'état actuel des connaissances. Le deuxième chapitre
consiste en un article qui a été soumis et accepté pour publication. Le troisième
chapitre consiste en une discussion sur les résultats obtenus qui mettra l'emphase sur
la signification de ces résultats par rapport aux données de la littérature et l'analyse
de ces résultats dans leur ensemble. Enfin, le quatrième chapitre contient les résultats
3
non soumis pour publication suivis de la bibliographie. Tous les résultats proviennent
de mes travaux de recherche et constituent le corpus principal de ce mémoire.
Chapitre l
ÉTAT DES CONNAISSANCES
1.1 Le système immunitaire
La fonction du système immunitaire est de protéger l'organisme en
reconnaissant et éliminant rapidement et efficacement les agents pathogènes
potentiellement dangereux pour l'hôte (Zelikoff et al., 1994;Sanchez-Dardon et al.,
1999). Toute réponse immunitaire implique d'abord la reconnaissance du pathogène
ou de toute autre substance étrangère, puis le développement d'une réaction destinée
à les éliminer. Les réponses immunitaires sont induites par différentes cellules et par
les molécules qu'elles secrètent. Les principales cellules impliquées dans les
réactions immunitaires sont les lymphocytes (cellules B, T, LGL), les phagocytes
(phagocytes mononucléés, neutrophiles, éosinophiles, etc) et les cellules accessoires
(basophiles, mastocytes, plaquettes, etc) (Roitt et al.,
1997). Les réponses
immunitaires peuvent être classées en deux grandes catégories: les réponses
naturelles (ou non-adaptatives) et les réponses immunitaires spécifiques (ou
adaptatives).
Un premier groupe important de leucocytes est formé par les cellules
phagocytaires telles que les monocytes, les macrophages et les polynucléaires
neutrophiles. Ces cellules captent les microorganismes, les intemalisent puis les
détruisent. Ces cellules sont très actives car elles répondent aux signaux cellulaires et
hormonaux et participent à une grande variété de réactions physiologiques et
pathologiques (Unanue & Allen, 1987). Comme elles utilisent des systèmes de
reconnaissance primitifs, non spécifiques qui leur permettent de s'attacher à des
produits microbiens très divers, elles sont responsables des réponses immunitaires
naturelles. Elles représentent, en fait, la première ligne de défense des infections
(Roitt et al., 1997). Les macrophages interviennent comme première ligne de défense
non spécifique en phagocytant les microorganismes et en libérant des cytokines. Ils
jouent le rôle de cellule présentatrice d'antigène (CPA) (Unanue, 1984). Ce sont
aussi des cellules effectrices susceptibles d'être activées par les lymphokines libérées
par les cellules T stimulées par l'antigène.
5
Un deuxième groupe important de leucocytes est constitué par les
lymphocytes. Les lymphocytes sont responsables de la reconnaissance spécifique des
micro-organismes, de sorte qu'ils engendrent des réponses immunitaires adaptatives.
Tous les lymphocytes sont dérivés de cellules souches de la moelle osseuse, mais on
distingue les lymphocytes T, qui se différencient dans le thymus, et les lymphocytes
B, qui se différencient dans la moelle osseuse (chez les mammifères adultes) (Roitt et
al., 1997). Les lymphocytes T jouent un rôle clé dans le système immunitaire, en
orchestrant les mécanismes de défense de l'hôte, en relâchant différents produits dans
le
système
tels
que
des
interleukines
et
de
l'interféron-gamma.
Un
dysfonctionnement des lymphocytes est considéré être un facteur d'une déficience du
système immunitaire (Unoshima et al., 2001).
1.2 Les métaux lourds
Les métaux lourds présents dans l'environnement peuvent altérer les
fonctions immunitaires et en particulier celles des lymphocytes (Schuppe et al.,
1998;Goyer, 2001). Les lymphocytes mis en présence de différents métaux, peuvent
se comporter différemment selon le type de métal, la dose (Tsangaris & Tzortzatou­
Stathopoulou, 1998) et l'espèce animale étudiée: de fortes concentrations de plomb et
de cadmium ont des effets immunosuppressifs sur la réponse des anticorps tandis que
de faibles doses augmentent cette même réponse chez les souris adultes et les lapins
(Borella & Giardino, 1991).
Le type de métal est aussi à prendre en considération. Des analyses in vitro de
la toxicité des métaux sur la réponse immunitaire humorale classifient les métaux
comme suit: Hg>Cu>Cd>Co>Cr>Mn>Zn>Sn démontrant hors de tout doute que le
mercure est le métal le plus toxique pour le système immunitaire (Lawrence, 1985).
1.2.1 Le mercure
Le mercure possède 3 formes chimiques: le mercure élémentaire (Hg), le
mercure inorganique (HgCh) et le mercure organique (MeHgCl). Il est très largement
répandu dans l'environnement mais sa principale source est le dégazage naturel de la
croûte terrestre, incluant les masses terrestres, les rivières et les océans (Zelikoff &
Thomas, 1998;Goyer, 2001). Cette source est estimée à produire entre 2700 et 6000
6
tonnes par année de mercure (Goyer, 2001). Les niveaux en mercure peuvent aussi
augmenter, conséquence des rejets des déchets des secteurs industriels, médicaux et
scientifiques. De plus, les vapeurs de mercure larguées par les amalgames
(plombages dentaires) peuvent être une source majeure de présence de mercure
inorganique chez l'humain (Zelikoff & Thomas, 1998). Les reins possèdent les plus
fortes concentrations en mercure après une exposition au mercure inorganique ainsi
qu'aux vapeurs de mercure tandis que le cerveau, en particulier, le cortex postérieur a
une plus grande affinité pour le mercure organique (Goyer, 2001). Il a été démontré
dans certaines expériences chez les animaux (rats et souris) et chez l'humain qu'une
exposition aux mercures organiques et/ou inorganiques entraîne l'activation du
système immunitaire menant à des effets néfastes comme des réactions allergiques
(augmentation des IgE dans le sérum) et des maladies auto-immunes (activation
polyclonale des lymphocytes B sous contrôle des lymphocytes auxiliaires CD4+)
(Lawrence, 1981;Dieter et aL, 1983;Pelletier et aL, 1994;Dantas & Queiroz, 1997).
De plus, les différentes formes de mercure reconnues pour être cytotoxiques peuvent
contribuer à développer des infections récurrentes et/ou chroniques (Aten et al.,
1995;Osorio et aL, 1995;Koropatnick & Zalups, 1997).
Les surdoses de mercure entraînent aussi des empoisonnements. Le cas le
plus connu d'empoisonnement par le méthylmercure a été découvert en 1956 dans
des localités de la baie de Minamata, au Japon, où le mercure rejeté par une usine de
produits chimiques s'était accumulé dans le poisson. Les milliers de personnes qui
vivaient dans la région et mangeaient du poisson et des crustacés de la baie ont
commencé à avoir des symptômes de ce qu'on a appelé la maladie de Minamata. Les
symptômes de ce trouble, qui s'attaque au système nerveux et au cerveau, incluent
l'engourdissement des membres et de la région péribuccale, la faiblesse musculaire,
une démarche instable, une vision tubulaire, l'empâtement de la parole, la perte de
l'ouïe et un comportement anormal (Gochfeld, 2003;Davidson et aL, 2004).
Lorsque nous voulons évaluer la toxicité du mercure ainsi que son potentiel
d'altérer les fonctions immunitaires, nous devons prendre en considération la source
de mercure, la voie d'exposition, sa bio-disponibilité, sa distribution à travers
7
l'organisme, son métabolisme et ses modes d'action (Shenker et al.,
1999;Sweet & Zelikoff, 2001).
1.2.1A Méthylmercure (MeHgCl), forme organique
Lorsque le mercure est rejeté dans les cours d'eau, les lacs et d'autres
environnements aquatiques, des bactéries peuvent le transfonner en sa forme
organique très toxique: le méthylmercure. Sous cette fonne, il peut-être absorbé par
la faune aquatique (poissons, mammifères marins), qui en augmente la concentration
(bio-accumulation) à mesure qu'il monte dans la chaîne alimentaire jusqu'aux
poissons et ensuite aux êtres humains (Jannalagadda & Prasada Rao, 1993;Thompson
et al., 1998). Les niveaux environnementaux de méthylmercure dépendent donc de
l'équilibre entre la méthylation et la déméthylation par les bactéries (Jannalagadda &
Prasada Rao, 1993).
Tous les composés de mercure sont capables de franchir la barrière
placentaire mais la
fonne organique traverse plus librement que la forme
inorganique. La haute solubilité lipidique du mercure organique fait en sorte qu'il
diffuse plus aisément à travers les membranes (Wild et al., 1997). On associe les
effets toxiques du méthylmercure en premier sur son organe cible le cerveau mais ses
effets toxiques ont aussi des répercussions sur d'autres organes tels les reins, les
poumons, le cœur, les intestins et les yeux chez les adultes exposés (Thompson et al.,
1998). Dans les différentes études précédentes, on a observé qu'une exposition par
voie orale au mercure organique chez les lapins diminuait significativement les titres
des anticorps à la suite d'inoculation par des virus. Une exposition prolongée au
méthylmercure affectait aussi la sensibilité des souris Webster à des virus. Les
niveaux d'IgG, d'IgGI et d'IgE dans le sérum de souris étaient aussi augmentés
chez les souris exposées au méthylmercure (Wild et al., 1997). On a aussi noté une
diminution du poids du thymus et une diminution du nombre de cellule dans le
thymus, une diminution de la réponse lymphocytaire en présence de Con A
(lymphocytes T) et de LPS (lymphocytes B) et une diminution de la réponse des
cellules NK (natural killer cells) (Thompson et al., 1998). Par contre, on a noté une
augmentation de la prolifération des lymphocytes T chez les rats Sprague-Dawley
après 8 semaines d'exposition orale et, par la suite, une diminution après 16 semaines
d'exposition continue au méthylmercure contenu dans l'eau que l'on donnait à boire
8
(Wild et al., 1997). On a aussi remarqué que dépendamment du genre et de l'espèce,
le méthylmercure peut s'avérer plus ou moins toxique. Les souris mâles Balb/C
seraient plus sensibles au mercure organique (MeHgCl) que les souris mâles C57Bl/6
et les souris femelles C57B1I6 seraient plus sensibles que les souris mâles de cette
même espèce (Thompson et aL, 1998). Le mercure organique a aussi le potentiel de
modifier la structure des organes lymphoïdes: il augmente le poids du thymus et de la
rate et provoque aussi des changements dans la cellularité (Wild et aL, 1997).
Le méthylmercure se lie aux groupements sulfhydryls (SH) dans les tissus
comme les reins, les poumons, le cœur, les intestins et les yeux d 'humains exposés;
l'accumulation de mercure organique dans ces tissus est reliée à la concentration de
glutathion (GSH) dans ces mêmes tissus. Les niveaux élevés de GSH protègeraient
donc la cellule contre les effets toxiques du mercure organique in vitro.
Des études antérieures ont démontré que la réponse de la prolifération
lymphocytaire était directement corrélée avec le taux de GSH. Le contenu en GSH
était plus abondant dans les sous populations CD4/CD8 de cellules de rates qui sont
en prédominance des lymphocytes B. Ceci indique donc une toxicité plus marquée
du MeHgCl pour cette sous population. On a aussi remarqué qu'un changement dans
la concentration de GSH intracellulaire affecte aussi le flux calcique dans les
lymphocytes T. Une diminution du niveau de GSH entraîne une diminution du
calcium intracellulaire et diminue la phosphorylation de la phospholipase C-yl
tyrosine. Ceci suggère qu'il se produit un évènement au début de la signalisation des
cellules T qui est dépendant du glutathion intracellulaire (GSH) qui est lui-même
diminué par les effets néfastes du mercure organique (Thompson et aL, 1998). Le
MeHgCl réduirait la concentration de GSH et diminuerait l'activité de l'enzyme
glutathion S-transférase, cette diminution de GSH entraînerait une perte du potentiel
de membrane mitochondriale et par conséquent une production d'espèces réactives
de l'oxygène (EROs) (Shenker et aL, 1999).
1.2.1B Chlorure de mercure (HgCI2), forme inorganique
Cette fOlme de mercure est aussi largement répandue dans l'environnement
découlant principalement d'usages industriels ou faisant partie d'amalgame dentaire
(Shenker et aL, 1992). Elle est la deuxième forme la plus toxique de mercure (fig la).
Les composés inorganiques de mercure ne franchissent pas aisément la barrière
9
hémato-encéphalique et la barrière placentaire, mais s'accumulent dans les reins
provoquant quelquefois des insuffisances rénales. Le mercure inorganique induit
aussi des lésions gastro-intestinales. Hautement irritant, il peut provoquer des cloques
et des ulcères sur les lèvres et la langue. Les éruptions cutanées, la transpiration
excessive, l'ilTitabilité, la fibrillation musculaire, la faiblesse et l'hypertension
artérielle sont autant de symptômes de l'exposition à des niveaux élevés de composés
inorganique du mercure (Santé Canada, 2004). Le chlorure de mercure peut causer
des maladies auto-immunes et induire la synthèse d'IgE qui joue un rôle primordial
dans la manifestation d'allergies. Cette immunomodulation par le HgCh a été
démontrée, chez les rongeurs, par l'augmentation de la sécrétion d'IL-4 par les
mastocytes qui provoquent le développement de lymphocytes TH2 (sous-population
de T CD4+). Le relarguage de l'histamine varie en fonction de la concentration de
mercure retrouvée dans le milieu dans les expériences faites in vitro avec des
basophiles provenant de sang humain (Strenzke et aL, 2001). L'histamine est un
médiateur chimique libéré par les basophiles et les mastocytes lors de la
dégranulation qui peut-être responsable des symptômes de l'allergie (Roitt et aL,
1997). Une étude a démontré que les lymphocytes T ont proliféré après une
exposition de 30).lM au mercure inorganique après 5 à 6 jours (Zelikoff & Thomas,
1998), tandis que d'autres chercheurs ont observé une diminution de la stimulation
des lymphocytes in vitro en présence de PHA et Con A lorsque les cellules sont
exposées au mercure inorganique (Shanna & Dugyala, 1996). Des expériences
antérieures utilisant une lignée cellulaire de cellules transfectées (NIH 3T3), ont
2
démontré que les ions Hg + ont fonné des complexes très stables non seulement avec
les groupements sulfuydryles (SH) des protéines mais aussi avec des molécules de
faibles poids moléculaires comme le glutathion (GSH) et les métallothionéines
(MTs). Ce qui fait qu'une exposition au Hg2+, mais à de faibles concentrations (0.1-5
).lM), augmente la concentration cellulaire de GSH et induit la synthèse de MTs.
Cependant, des doses plus élevées de HgCh (10-1000 ).lM)) diminuent la quantité de
GSH (qui est un important éliminateur des radicaux libres) provocant l'oxydation du
milieu. La synthèse des MTs a été induite mais cette induction a pris un certain temps
10
et les MTs ne se sont pas liées assez rapidement pour freiner les effets nocifs et
toxiques du HgCIz in vitro (Schurz et al., 2000).
On a aussi remarqué que des formes chimiques différentes de mercure
peuvent aussi avoir différents effets sur le système immunitaire. Le sulfure de
méthylmercure semble avoir des effets très différents sur le système immunitaire que
la forme chlorée. En effet, le sulfure de méthylmercure affecte seulement le poids du
thymus et n'a pas d'effet sur l'activité des cellules NK (Natural killer cells) (Wild et
al.,
1997). Par contre
le
méthylmercure chloré
augmente la prolifération
lymphocytaire tandis que la forme sulfureuse la diminue (Thompson et al., 1998).
Lorsque nous voulons étudier les effets du mercure sur le système
immunitaire, nous devons vraiment prendre en considération, la forme de mercure, le
genre d'exposition, la durée de l'exposition, l'espèce animale étudiée et le sexe de
l'animal.
Le mercure sous ses deux formes (organique et inorganique) déclenche des
réactions en cascade qui finissent par l'apoptose des cellules. Des recherches
précédentes sur la voie apoptotique des cellules lymphoïdes humaines ont démontré
que les deux formes de mercure (organique et inorganique) sont des inducteurs
d'apoptose mais par des mécanismes très différents. Le processus d' apoptose est
régulé par des changements progressifs au niveau cellulaire. Un de ces changements
majeurs est la perte d'intégrité de la membrane cellulaire entraînant une perte du
potentiel trans-membranaire mitochondrial, la génération des espèces réactives de
l'oxygène (EROs) et un relâchement du cytochrome c du cytosol. Dans les études
antérieures, il a été démontré que le méthylmercure augmente la présence du
cytochrome c dans le cytosol après 8 heures d'exposition, tandis que le chlorure de
mercure n'affecte en rien son niveau. Une explication possible a été que le
relâchement du cytochrome c est stabilisé par certaines protéines anti-apoptotiques
qui contrôlent les pores mitochondriales dont la Bcl-2. On a retrouvé des niveaux de
BcI-2 beaucoup plus élevés dans les lymphocytes T exposés au HgCI2 ce qui fait
penser que ce métal pourrait auto-réguler cette protéine et par le fait même diminuer
le phénomène d' apoptose (Shenker et al., 2000).
11
1.2.2 Le cadmium
Le cadmium, métal blanc argenté, est un contaminant environnemental très
envahissant. La source primaire d'exposition de la population est par l'eau potable
contaminée, la nourriture (viande, poisson, fruits) (Leffel et al., 2003) et la fumée de
cigarette (Goyer, 2001;Misra et al., 2002). Les concentrations en cadmium ont été
fortement augmentées dûes à l'industrialisation (exploitation minière et extraction
par fusion) (Misra et al., 2002) et aux pratiques intenses de l'agriculture (Foulkes,
2000).
Aux États-Unis, la nourriture peut contenir des concentrations en cadmium
variant de 2 à 40 ppb, tandis que la fumée de cigarette atteint des niveaux de 1000 à
3000 ppb. Les poumons sont les organes cibles du cadmium lors d'une toxicité aiguë
tandis que les reins et les os sont les cibles lors d'une exposition prolongée. Le
cadmium influence l'homéostasie des systèmes en particulier le système immunitaire
en développant des effets toxiques sur les reins, sur le système reproducteur,
endocrinien et en influençant le développement de maladies cancéreuses et
tératogènes (Fels et al., 1994;Coles et al., 1995). Les fOlmes les plus solubles de
cadmium sont généralement les plus toxiques. Parmi celles-là, le chlorure de
cadmium est la forme la plus soluble et donc par-dessus tout la plus toxique (Zelikoff
& Thomas, 1998). À cause de ces effets toxiques, le cadmium est associé avec les
risques élevés de cancers, comme celui des poumons et de la prostate (Misra et al.,
2002). Le cadmium tend à s'accumuler dans les viscères spécialement dans le foie et
les reins (Tsangaris &
Tzortzatou-Stathopoulou,
1998) où
les plus fortes
concentrations sont généralement retrouvées dans les organismes âgés (Jannalagadda
& Prasada Rao, 1993).
Un cas d'empoisonnement chronique a été rapporté dû à l'ingestion chronique
de cadmium. Cette maladie appelée itai-itai a été observée en premier lieu au Japon.
La rivière Jinzu servant d'eau de consommation et à l'agriculture, dont la culture du
riz, a été contaminée pendant de nombreuses années, par les déchets provenant de
minerais de zinc, de cuivre et de plomb dans lesquels il y avait de fortes
concentrations en cadmium. Des gens buvant cette eau et consommant du riz ont été
ainsi contaminés par le cadmium et ont souffert de symptômes très douloureux
comme
des
douleurs
lombaires
et
musculaires,
des
fractures
spontanées
12
accompagnées de défonnation osseuse (El
Azzouzi et al., 1994). Des études
antérieures ont aussi démontré que la prise de suppléments de zinc et de calcium
pouvait jouer un rôle important dans l'absorption du cadmium au niveau des
intestins. Un apport journalier en zinc induit la biosynthèse des métallothionéines
(MTs) qui lient le cadmium dans les cellules intestinales diminuant ainsi sa toxicité
(Jannalagadda & Prasada Rao, 1993).
Plusieurs études sur le cadmium et ses effets sur le système immunitaire ont
été réalisées dans le passé avec les animaux et plus spécifiquement avec les rongeurs.
Plusieurs des résultats obtenus apparaissent souvent contradictoires quoiqu'il est clair
que le cadmium module les réponses immunitaires que ce soit au niveau de la
réponse
immunitaire humorale (lymphocytes B) ou à médiation cellulaire
(lymphocytes T) (Descotes, 1992). Les réponses humorales semblent augmentées ou
non affectées par des doses faibles d'exposition aiguë au cadmium tandis
qu'inversement la production d'anticorps est supprimée chez les animaux exposés à
des doses modérées ou fortes en cadmium (Descotes, 1992;Zelikoff & Thomas,
1998). L'immunité à médiation cellulaire est soit augmentée ou supprimée par le
cadmium, dépendant des indices mesurés. Il en va de même pour l'immunité non
spécifique qui
démontre aussi
beaucoup de
variations
dans
les
réponses
immunologiques suivant une exposition au cadmium (Zelikoff & Thomas, 1998). On
a aussi détenniné que si les résultats sont si conflictuels cela dépend de la vOIe
d'exposition du cadmium ainsi que de la dose administrée (Leffel et al., 2003).
Des exemples d'études comme cette étude in vitro qui a démontré qu'une
exposition au cadmium à des concentrations de 10- 1 à 10,sM pendant une heure a
réduit significativement la phagocytose des macrophages péritonéaux. Après 20
heures d'exposition, l'activité phagocytique est revenue à la nonnale. La flambée
oxydative par ces mêmes macrophages a aussi été diminuée suivant l'exposition au
cadmium pendant 15 minutes. Le cadmium a inhibé la consommation d'oxygène, le
métabolisme du glucose et le relâchement des espèces réactives de l'oxygène (EROs)
lesquels ont inhibé l'activité antibactérienne dans les macrophages alvéolaires.
Cependant le métabolisme oxydatif des macrophages péritonéaux a été augmenté
lorsque ces cellules ont été exposées au cadmium (10-4 à lü,sM) pour une heure. Une
13
exposition au cadmium a aussi altéré la mobilité des macrophages, la sensibilité des
cytokines ainsi que l'activité cytotoxique (Zelikoff & Thomas, 1998).
Les réponses engendrées par les lymphocytes varient en fonction des doses de
cadmium utilisées. Il a été observé une stimulation à des faibles doses et une
suppression à des doses plus élevées (Krocova et a1., 2000). Dans les études in vivo
et in vitro, il a été démontré que des faibles concentrations en cadmium augmentent
légèrement
les
réponses
humorales
tandis
que
les
fortes
doses
sont
immunosuppressives (Lawrence, 1981 ;Ohsawa et a1., 1986;Otsuka & Ohsawa,
1991). Le cadmium diminue les titres des anticorps, les plages de lyse ainsi que la
mémoire immunologique (Koller, 1982). Au niveau cellulaire, il inhibe la synthèse
de l'ADN et de l'ARN des lymphocytes B chez la souris. Il provoque l'arrêt du cycle
cellulaire des lymphocytes B et de l'expression des antigènes de surface (Daum et
a1., 1993). Le cadmium interfère avec les réponses immunitaires en supprimant la
prolifération des lymphocytes (Wayland et a1., 2002), il inhibe l'activité des cellules
NK (Sgagias et a1., 1989) et des macrophages (Burchiel et a1., 1987), abolissant ainsi
les défenses naturelles. Le cadmium induit l'apoptose dans plusieurs types cellulaires
(lymphocytes T,B hépatocytes ...) (Tsangaris & TZOlizatou-Stathopoulou, 1998;Shen
et a1., 2001).
L'accumulation de cadmium dans les reins sans effet toxique apparent est
rendue possible grâce à la fonnation de cadmium-thionéine ou métallothionéine
(MT), un complexe métal-protéine de faible poids moléculaire
(~
6500) (Goyer,
2001). L'induction de MTs, dans une lignée de cellules provenant de cellules rénales
humaines, a été démontrée après une exposition au cadmium. En effet, l'induction de
MTs provenant de la lignée cellulaire LCPK, s'est produite seulement après 6 heures
d'exposition au cadmium. Ce qui fait dire à plusieurs chercheurs que les dommages
faits aux reins par le cadmium sont souvent influencés par le niveau de MTs
intracellulaires ainsi que par les concentrations des autres composés thiols dont le
glutathion (GSH) qui sont eux-mêmes très variés d'un individu à un autre (Rodilla et
a1., 1998). Les MTs seraient aussi induites de façon très variée dans les leucocytes
humains suivant
une exposition au cadmium. D'après celiaines études, les
monocytes seraient les plus sensibles au cadmium et induiraient le plus de MTs, les
lymphocytes seraient aussi sensibles à ce métal et déclencheraient la production de
14
MTs mais à un degré moindre que les monocytes tandis que les granulocytes
demeureraient insensibles au traitement avec le cadmium (Yurkow & DeCoste,
1999). Ce déclenchement aussi varié de MTs dans les différentes populations
cellulaires affecte aussi la toxicité du cadmium face à ces cellules. L'expression de
MTs dans les cellules éloigne aussi la mort cellulaire programmée de ces cellules:
l'apoptose. Une étude réalisée sur des lignées cellulaires mises en présence de
cadmium démontrait des concentrations très variables de cadmium nécessaires pour
induire l'apoptose dans ces cellules suggérant que la dose mortelle de cadmium était
liée au nombre de transcriptions de MTs intracellulaires pour chacune de ces lignées
(Tsangaris & Tzortzatou-Stathopoulou, 1998).
1.2.3 Le zinc
Le zinc est reconnu pour jouer un rôle central dans le système immunitaire
(Shankar & Prasad, 1998). C'est un élément essentiel au bon maintien de la fonction
immunitaire (Unoshima et al., 2001). Il est omniprésent dans plusieurs aliments, en
particulier, les fruits de mer, la viande, les graines, les produits laitiers, les noix et les
légumes, dans l'eau et dans l'air. L'apport quotidien en zinc d'un Américain peut
varier entre 12 et 15 mg, la plupart venant de la nourriture (Goyer, 2001). Des études
sur les animaux en 1930, les premières documentées, ont rapporté la nécessité du
zinc pour la survie et le développement animal. Malheureusement, ce n'est que vers
1960 que les travaux de Prasad sur l'importance du zinc dans les populations furent
appréciés. Depuis ce temps on sait que le zinc exerce des effets omniprésents sur le
système immunitaire, sur la résistance à la maladie et sur la santé en général
(Shankar & Prasad, 1998). Le corps humain contient entre 2 et 4 grammes de zinc
mais dans le plasma sa concentration est seulement entre 12 et 16 ~lmol/L. Bien que
la concentration plasmatique est très infime, le zinc est très mobile et
immunologiquement très important. Dans le sérum, il est majoritairement lié à des
protéines en prédominance l'albumine, l'a2-macroglobuline et la transferrine, mais
seulement, les ions de zinc libres semblent biologiquement actifs (lbs & Rink, 2003;
Tapiero & Tew, 2003). Plus de 200 métalloenzymes requièrent la présence de zinc
comme co-facteur (Shankar & Prasad, 1998) car il est essentiel pour les facteurs de
transcription et de réplication (lbs & Rink, 2003). Le zinc modifie la composition de
15
l'a2-macroglobuline et augmente ses interactions avec les cytokines et les protéases
qui indirectement influencent les fonctions immunitaires (Tapiero & Tew, 2003). Le
zinc joue un rôle fonctionnel et structural dans plusieurs protéines impliquées dans la
réplication et la transcription inverse de l'ADN (Mocchegiani et al., 2000).
Le zinc protège les structures biologiques contre les radicaux libres en
maintenant un niveau adéquat de MTs, en étant un composé essentiel de la
su peroxyde dismutase (SOD), en étant un agent protecteur pour les thiols et en
prévenant les interactions entre des groupes chimiques et le fer pour former des
radicaux libres (Tapiero & Tew, 2003). Une déficience en zinc entraîne un large
éventail d'effets cliniques. Une déficience sévère en zinc est caractérisée par une
fonction immunitaire fortement supprimée qui entraîne des infections fréquentes, des
dermatites, de la diarrhée, perte des cheveux et des troubles mentaux (Kay &
Tasman-Jones, 1975;Walsh et al., 1994).
Les fonctions de l'immunité naturelle sont altérées par des changements dans
les concentrations en zinc. In vitro ces changements se traduisent par une activité
homéostasique perturbée dans les granulocytes tandis qu'in vivo, l'activité des
cellules NK, la phagocytose produite par les macrophages et la flambée oxydative
produite par les neutrophiles sont aussi affectées par une diminution des niveaux de
zinc (Allen et al., 1983;Keen & Gershwin, 1990;Vallee & Falchuk, 1993).
Une déficience en zinc augmente la fragilité osmotique des globules rouges,
diminue l'homéostasie cellulaire, le nombre de cellule-Tet la réponse des cellules T
aux mitogènes provenant des plantes. En fait, le zinc est considéré comme un
mitogène naturel pour la prolifération des lymphocytes T (Tapiero & Tew, 2003).
Une déficience en zinc entraîne aussi une atrophie du thymus, l'organe central des
lymphocytes en développement (Shankar & Prasad, 1998) .
Par contre une surdose a entraîné une immunostimulation des lymphocytes T
et des macrophages chez la souris. Un supplément de zinc améliore la réponse
immunitaire en modulant la production de cytokines (Unoshima et al., 2001).
1.2.4 Le sélénium
Le sélénium (Se) est un élément trace retrouvé dans la nourriture, en
particulier les céréales, les grains, les légumes (Tapiero et al., 2003), les fruits de
mer, en particulier, les crevettes, la viande, ainsi que les produits laitiers (Goyer,
16
2001). La dose quotidienne recommandée est d'environ 1 flg/kg du poids corporel.
Les formes alimentaires du sélénium sont variables selon les espèces de plantes ou la
nature des protéines animales ingérées. On retrouve aussi du sélénium en quantité
variable dans les sols et les sédiments des différentes régions à travers le monde, ce
qui affecte beaucoup le niveau de Se chez les animaux ainsi que chez les humains qui
consomment les produits locaux (Arthur et al., 2003). La teneur en sélénium dans les
plantes peut varier selon que le sol est riche ou pas de cet élément (Tapiero et al.,
2003). La disponibilité du Se, ainsi que ses composés, est reliée à leur forme
chimique ainsi qu'à leur solubilité. On retrouve le sélénium dans la nature et dans les
4
systèmes biologiques sous fonne de sélénate (Se 6+), de sélénite (Se +), de sélénium
élémentaire (Seo) et sélénide (Se 2 -). Les sélénates sont relativement solubles, tandis
que les sélénites et le Se élémentaire sont très peu solubles (Goyer, 2001). Le
sélénium est converti par les plantes en Se-méthionine qui représente un taux
supérieur de 50% de tout le Se contenu dans les plantes, tandis que la sélénocystine
(Se-Cys), la méthyl-sélénium-cystine (méthyl-Se-Cys) et la y-glutamyl-Se-méthyl­
Cys représentent des quantités négligeables de Se (Tapiero et al., 2003). Le sélénium
est distribué dans tous les organes mais s'accumule principalement dans le foie, les
reins, le sang, le cerveau, le muscle cardiaque, la peau et les testicules. En cas
d'intoxication, il s'accumule dans les reins beaucoup plus que dans le foie. Il se
trouve dans les ongles et les cheveux en cas d'administration prolongée.
En pathologie humaine, il y a peu d'intoxication au Se, par contre les
carences sont fréquentes. Un exemple frappant de la carence en sélénium est la
maladie de Keshan, qui affecte les résidents de la république de Chine, chez les
enfants de moins de 15 ans ainsi que les femmes en âge de procréer. Cette maladie
est caractérisée par une insuffisance cardiaque sévère, une dégénération des fibres du
myocarde et leur remplacement par de la fibrose ainsi que des cicatrices (Yang et al.,
1983;Goyer,2001).
La toxicité environnementale du Se chez les humains est rare. Cependant
lorsque ces effets sont présents, ils peuvent causer de l'anémie hypochromique et une
leucopénie. On a rapporté aussi des cas d'intoxication aiguë et subaiguë
d'empoisonnement chez l'humain lors de l'ingestion accidentelle d'acide sélénique
17
(30g/L) ou de comprimés vitaminiques renfermant des fortes concentrations en
sélénium. Ces ingestions de fortes doses en Se provoquent des troubles gastro­
intestinaux (vomissements, diarrhée), des changements capillaires, au niveau des
ongles, des manifestations neurologiques incluant l'acroparesthésie (douleur sous
forme de brûlures, de picotements affectant surtout les mains et les pieds), de
faiblesses, de convulsions et une diminution des fonctions cognitives (Tinggi, 2003).
Contrairement aux autres métaux qui diminuent les fonctions du système
immunitaire, le sélénium a le pouvoir de stimuler les fonctions des cellules
immunitaires plutôt que de les supprimer (Koller, 1980).
Les effets antioxydants du Se seraient médiatisés par l'enzyme glutathion­
peroxydase qui est localisée dans le cytosol et la matrice mitochondriale des cellules
où elle exerce un rôle fondamental dans la réduction et l'inactivation du peroxyde
d 'hydrogène et des hydroperoxydes lipidiques. En tout 5 de ces peroxydases ont été
identifiées comme opérant dans différents tissus et cellules (Arthur et al., 2003).
Plusieurs
études
ont
démontré
qu'une
déficience
en
sélénium
est
accompagnée d'une diminution de la compétence des cellules immunitaires.
L'immunité à médiation cenulaire, qui comprend entre autres les lymphocytes T et la
fonction des cenules B (lymphocytes B), serait altérée. Par contre en supplémentant
les individus en sélénium, il a été observé des effets immunostimulants tels qu'une
augmentation de la prolifération des lymphocytes T en réponse à une stimulation
antigénique, de par le fait même une augmentation des lymphocytes T cytotoxiques
et une diminution des cellules cancéreuses. Les cellules NK (Natural Killer Cells)
seraient aussi augmentées. La prise de suppléments de Se a en effet augmenté de
118% les lymphocytes T-cytotoxiques et de 82% les ceIJules NK. Le mécanisme
semble de très près lié à la facilité du Se de régulariser à la hausse l'expression des
récepteurs de l'interleukine-2 (1L-2) à la surface des lymphocytes activés et des
cellules NK facilitant leur interaction avec \'IL-2. Cette interaction est cruciale pour
l'expansion clonale et la différenciation dans les lymphocytes T-cytotoxiques
(Rayman, 2000). Des lymphocytes déficients en Se vont proliférés moins bien en
réponse à un mitogène tandis que dans les macrophages, la synthèse des leucotriènes
B4 va aussi être perturbée par une déficience en sélénium. La réponse humorale est
aussi affectée par une diminution (chez les rats) d'IgM, d'IgG et d'IgA et chez
18
l'humain par une diminution d'IgM suivant une déficience en sélénium (Arthur et al.,
2003).
Basé sur des expériences animales, le sélénium provoquerait des effets
tératogènes, une perte de fertilité et des problèmes congénitaux (Hogberg &
Alexander, 1986), quoiqu'il ait un effet protecteur contre les agents cancérigènes. Il
serait un antidote des effets toxiques des métaux en particulier le cadmium, le
mercure, le cuivre et le thallium (Luster et al., 1987;Wang et al., 2001). Des études
suggèrent que le sélénium pourrait jouer un rôle de protection des mammifères
marins contre leur intoxication au mercure (Burk et al., 1977;Lindh et al., 1996;
Wang et al., 2001). Le Se est un élément essentiel qui peut prévenir la nécrose du
foie dans une déficience en vitamine E (Tinggi, 2003). Il a été identifié comme un
important composé de l'enzyme glutathion peroxidase laquelle est importante dans
les mécanismes de défense contre l'oxydation cellulaire par les espèces réactives de
l'oxygène (EROs) (Mueller et al., 2003;Tapiero et al., 2003;Tinggi, 2003).
Malgré toute l'immense recherche qui se fait sur la toxicité du sélénium chez
l'animal et l'humain, les modes d'action des niveaux de sélénium moléculaire et
cellulaire ne sont pas tous bien compris. Par contre, on sait que la toxicité du
sélénium ne dépend pas seulement de la forme et de la quantité ingérées mais aussi
d'une multitude d'autres facteurs tels que l'espèce, l'âge, l'état physiologique, les
interactions entre les aliments et la voie d'administration (Tinggi, 2003).
1.3 Activation des lymphocytes et thiols intracellulaires
Au cours des réponses immunitaires, une activation des cellules T (et B et
CPA) survient à différents endroits et à des moments différents. L'activation des
lymphocytes conduit à leur prolifération et à leur différenciation en cellules
effectrices. Les mitogènes (dont la Con A) sont une catégorie de molécules qui
activent les cellules B et T de façon non spécifique de l'antigène. La plupart des
cellules T peuvent être stimulées par la phytohémagglutinine (PHA) extraite du
haricot rouge, et la concanavaline A (Con A) extraite d'un autre haricot. Ces lectines
végétales multivalentes se lient à des résidus oligosaccharidiques des glycoprotéines
membranaires impliquées dans l'activation des cellules T, par exemple le TCR et le
19
CD2. La stimulation par le mitogène entraîne alors une activation du lymphocyte qui
se transforme en lymphoblaste. Cette activation prends environ 18 heures, par la suite
le lymphoblaste entreprend une expansion clonale par la répétition de sa division,
suivie par la différenciation des nouvelles cellules en cellules effectrices (Hamilos et
aL, 1991;Janeway et al., 1997;Roitt et aL, 1997). En pré-activant les lymphocytes
avec la Con A, nous les faisons progresser de la phase GO vers la phase G 1 du cycle
cellulaire. Cette progression est caractérisée par l'expression du récepteur de l'IL-2,
par la production d'IL-2 et quelques synthèses d'ARN. En pré-activant les
lymphocytes avec la Con A, nous augmentons aussi leur contenu en thiols
intracellulaires, dont le plus abondant est le glutathion (GSH). Des études antérieures
ont démontrées que le glutathion est essentiel à la prolifération des lymphocytes, car
une diminution en GSH entraîne une profonde inhibition de cette prolifération
(Hamilos et al., 1991).
La pré-activation de nos cellules ainsi que la présence de métaux lourds dans
les milieux de culture ont induit la production de thiols intracellulaires (cystéines,
glutathion, métallothionéines). Les thiols sont aussi connus pour jouer un rôle
esentiel dans l'activation et la prolifération cellulaire. Les thiols intracellulaires, dont
le plus abondant est le glutathion, protègent la cellule contre les effets néfastes des
métaux lourds (Hultberg et al., 2001) et des stress oxydatifs qu'ils provoquent. La
réponse cellulaire à un stress provoque des changements dans son contenu en thiols
et plus particulièrement en glutathion. Le glutathion est un thiol, non protéique, le
plus abondant dans les organismes vivants (Dickinson & Forman, 2002a; Dickinson
& Forman, 2002b). Il est présent majoritairement à l'état réduit (GSH) dans les
cellules; une augmentation de la forme oxydée (GSSG) traduit un stress oxydant
(Dickinson & Forman, 2002b). Cependant, ce n'est pas le glutathion qui répond à
toutes ces fom1es d'agression, mais plutôt son enzyme la glutathion-peroxydase
(GSH-Px) laquelle est mise en œuvre pour la destruction des espèces réactives de
l'oxygène (EROs).
En effet, le concept selon lequel l'oxygène, molécule
indispensable pour la vie aérobie peut entraîner des dommages cellulaires importants
par formation de dérivés oxygénés (les radicaux libres) est de mieux en mieux établi.
De nombreuses études épidémiologiques et cliniques ont plus que suggéré le rôle de
ces EROs dans le développement de nombreux processus pathologiques comme
20
l'artériosclérose et la cancérogenèse. Pour se protéger des effets toxiques de
l'oxygène, l'organisme a développé des systèmes de défense antioxydants composés
d'enzymes comme la glutathion peroxydase. En situation physiologique, ces
systèmes antioxydants ont la capacité de réguler parfaitement la production des
EROs. Un stress oxydant surviendra lorsqu'il y aura un déséquilibre dans cette
balance pro-oxydants/ an ti-oxydants en faveur des EROs (De La Fuente et al., 2002).
Une exposition aux EROs ou aux composés qui génèrent des EROs (métaux lourds)
peut augmenter le contenu intracellulaire en glutathion en augmentant le taux de
synthèse de celui-ci (Dickinson & Forman, 2002a).
Plusieurs
conditions
différentes sont reconnues pour provoquer des
changements intracellulaires en GSH. Ceci inclut la présence de métaux lourds, de
fortes concentrations en glucose ainsi que des chocs thermiques (Dickinson &
Forman, 2002b). Dans la cellule, le glutathion forme des conjugués avec une grande
variété de composés électrophiles via l'action de la glutathion S-transférase (GST).
Le glutathion ainsi conjugué est alors excrété de la cellule (Dickinson & Forman,
2002a). Le glutathion, considéré comme un important co-facteur de l'activation et de
la prolifération des lymphocytes, est aussi reconnu pour réguler l'expresssion des
gènes ainsi que l'induction d'apoptose dans les lymphocytes T (Hamilos et aL,
1991 ;Zurgil et al., 1999;Knight, 2000).
Le glutathion forme des complexes avec plusieurs métaux lourds et peut
protéger la cellule contre la toxicité des métaux. Il est aussi connu que la diminution
du glutathion cellulaire augmente la toxicité des métaux. Le métabolisme du
glutathion semble aussi différer dépendamment des métaux. Les ions de cuivre font
voir principalement des effets très différents de ceux du mercure et du cadmium
(Hultberg et al., 1998).
Outre son rôle d'antioxydant, le GSH est impliqué pour Jouer un rôle
important dans l'initiation et la progression de l'activation cellulaire dans la
population lymphocytaire. Par contre, une diminution du GSH intracellulaire inhibe
l'activation par les mitogènes. Le 2-mercaptoéthanol, qui est un thiol de faible poids
moléculaire et une riche source de cystéine peut augmenter aussi le GSH
intracellulaire et par le fait même augmenter la prolifération des cellules. Dans une
étude précédente, il a été déterminé que les changements dans le contenu
21
intracellulaire en GSH peuvent
altérer l'activation et la prolifération cellulaire
(Fidelus et al., 1987). Lorsqu'une cellule est activée par une lectine ou un antigène,
plusieurs réactions biochimiques interviennent à l'intérieur de celle-ci que ce soit les
processus de transport membranaire, la synthèse des protéines, la synthèse de l'ADN
et de l' ARN : tous ces phénomènes augmentent l'activité dans les cellules activées.
Une augmentation des thiols intracellulaires et par conséquent une résistance accrue
aux métaux lourds a aussi été observé chez des lymphocytes stimulés avec la
phytohémagglutinine (PHA) (Lawrence et al., 1996).
1.4 Apoptose
L'apoptose est une mort cellulaire programmée procédant par différentes
phases soit une phase d'induction, une phase de régulation et une phase effectrice.
Différente de la nécrose, cette mort cellulaire est un processus essentiel dans le
maintien de l'homéostasie cellulaire pathologique et physiologique (Saikumar et al.,
1999). Les changements détectés au cours de la mort cellulaire par apoptose sont une
fragmentation de l'ADN, une rupture du noyau et des altérations de la morphologie
de la cellule dont la condensation de la chromatine. La cellule se détruit alors de
l'intérieur, se rétractant et se dégradant jusqu'à ce qu'il n'en reste plus rien (Wyllie et
al., 1980;Janeway et al., 1997;Shen et al., 2001). L'apoptose des cellules
immunitaires peut avoir des conséquences sérieuses sur l'homéostasie et l'immunité
cellulaires (Unoshima et al., 2001). Beaucoup de lymphocytes meurent par apoptose
dans le thymus lorsqu'ils ne peuvent bénéficier d'une sélection positive ou lorsqu'ils
sont négativement sélectionnés après avoir reconnu un antigène du Soi. L'apoptose
est aussi le mécanisme majeur qui contrôle la sélection des lymphocytes T, la
différenciation et le développement de ceux-ci (Shen et al., 2001).
1.5 Différences entre les lymphocytes et les macrophages
Les macrophages sont très différents des lymphocytes de par leurs fonctions
mais aussi morphologiquement. Les macrophages ont un noyau plus petit que les
lymphocytes et un espace cytoplasmique plus volumineux (Roitt et al., 1997). Étant
22
donné leurs cytoplasmes plus volumineux, les macrophages possèdent plus de
cystéine et de glutathion que les lymphocytes. (Droge et al., 1995). Les macrophages
interviennent comme première ligne de défense non spécifique en phagocytant les
microorganismes et en libérant des cytokines. Ils jouent le rôle de cellule
présentatrice d'antigène (CPA). Ce sont aussi des cellules effectrices susceptibles
d'être activées par les lymphokines libérées par les cellules T stimulées par
l'antigène (Roitt et al., 1997). Il a été démontré que les macrophages activés ont la
capacité de donner des quantités substantielles de cystéines aux lymphocytes et ainsi
d'augmenter par le fait même le glutathion intracellulaire dans les lymphocytes
(Droge et al., 1995).
1.6 Hypothèses de travail
Pour faire suite à ces connaissances, les hypothèses de travail pour mon projet de
maîtrise étaient que:
1- La pré-activation des cellules offre une meilleure protection contre l'action
toxique des métaux lourds: les agents mitogéniques, tels que la concanavaline A,
augmentent la résistance des lymphocytes T.
2- La pré-activation des cellules augmente le contenu intracellulaire en thiols. Le
glutathion, un des thiols les plus abondants, est considéré comme un cofacteur
important dans l'activation des lymphocytes (Fidelus et al., 1987).
3- Les lymphocytes pré-activés produisent moins de thiols que les macrophages pré­
activés.
1. 7 Ojectifs de travail:
Pour vérifier ces hypothèses de travail, les objectifs ont été:
. Évaluer la toxicité des métaux lourds (MeHgCl, HgCh, ZnCIz, CdCh, SeCI 4) suite à
des expositions in vitro avec des lymphocytes.
. Déterminer l'effet de la pré-activation, avec la concanavaline A, des lymphocytes sur
la courbe de toxicité.
23
· Déterminer si l'effet protecteur de la pré-activation est lié à des différences de
niveaux intracellulaires en thiols.
· Mesurer l'indice d'apoptose dans les lymphocytes pré-activés et non pré-activés.
· Faire une brève comparaison entre les lymphocytes et les macrophages pré-activés et
non pré-activés en mesurant leur différence de sensibilité vis-à-vis les 5 métaux à
l'étude.
CHAPITRE II
ARTICLE SOUMIS POUR PUBLICATION
L'article "Cellular Response of Mouse Splenocytes to Heavy Metals Exposure"
a été soumis et accepté pour publication dans la revue Toxicological and
Environmental Chemistry.
La rédaction de cet article a été réalisée conjointement avec Mme Julie De
Gagné, étudiante à la maitrise à l'lNRS-IAF, car cet article inclus les résultats des
lymphocytes et des macrophages murins. Mme De Gagné a réalisé les expériences et
les analyses sur les macrophages tandis que ma contribution consiste à la réalisation
complète des expériences portant sur les lymphocytes ainsi qu'à l'analyse des résultats
des lymphocytes murins.
Title: Cellular Response ofMouse Splenocytes to Heavy Metals Exposure
Authors: Julie De Gagné l +, Marlène Fortier 1+, Gaston Chevalier 2 and
Michel Fournier
1 INRS-Institut
1*
Armand-Frappier, 245 bou!. Hymus, Pointe-Claire, Qc, Canada,
H9R IG6.
2
Université du Québec à Montréal, TüXEN and Département des sciences
biologiques, 1200 St-Alexandre, Montréal, Qc, Canada, H3B 3H5.
+Both authors contributed equally to this study
* To whom a1l correspondence should be addressed :
Michel Fournier
INRS-Institut Annand-Frappier
245 Hymus Bou!. Pointe-Claire,
Québec, Canada, H9R 1G6
Tel: (514) 630-8824
Fax: (514) 630-8850
E-mail: [email protected]
Key Words: immunotoxicity, activation, heavy metals, thiols
ABSTRACT
Among environmental contaminants recognised for their toxicity and global
presence, heavy metals are certainly a major concem. They can elicit a number
of immunomodulatory effects leading ultimately to an enhanced susceptibility
(sensitivity) of immune ce11s to microbial agents and appearance of neoplastic
diseases and autoimmune phenomena. Heavy metals also provoke changes in
the function(s) of immune ce11s. A striking biological effect of heavy metals is
the induction of intracellular thiols (cysteine, glutathione, metal1othioneins).
Thiols are involved in many physiological processes, including protection from
free radical damage, and detoxification of chemicals. The purpose of this study
was to assess the differences of susceptibility (sensitivity) in both pre-activated
(concanavalin A was used) and non pre-activated cel1s in the presence of heavy
metals. 5 were evaluated on murine splenocytes. The lymphoblastic
proliferation test was performed for lymphocytes and a phagocytosis test for
macrophages. Data showed that the levels of thiols in the pre-activated ce11s are
greater than non pre-activated cel1s fol1owing exposure to various heavy
metals; macrophages were more resistant than lymphocytes to the toxic effects
of heavy metals and pre-activated cel1s are more resistant than cel1s at rest. One
possible explanation is that macrophages produce more thiols than lymphocytes
and this provides increased protection from deleterious effects of heavy metals.
INTRODUCTION
Among environmental contaminants recognized for their toxicity and world­
wide presence, heavy metals are certainly a major concem. Certain heavy
metals are essential for life in trace amounts but exert toxic effects under
certain conditions (e.g. zinc and selenium). Others, for which no biological
function has been established, produce toxicity even at very low levels (e.g.
mercury and cadmium) (DeMoor & Koropatnick, 2000). Heavy metals are
persistent and ubiquitous in the environment and they originate both from
natural
sources and
from
human activities.
Laboratory
research and
epidemiological data of human cohorts occupationally exposed to these
chemicals indicate that metals affect several physiological systems of the body.
Metals modulate the activities of immunocompetent cells by a variety of
mechanisms(Lawrence & McCabe, 2002). One mechanism whereby metals
alter health is through modulation of immune homeostasis (Zelikoff et al.,
1994). Depending on the particular metal, its concentration and bio10gic
availability, and a host of other factors, the outcome of this modulation may be
either immunoenhancement or immunosuppression. The general premise and
object of concem is that metals, by modulating immunoregulatory activities,
may disrupt immune homeostasis, leading to either immunodeficient or
autoimmune state (Lawrence & McCabe, 2002). Immunomodulation can
change the defence capacity of the immune system against different infectious
and tumours, or ca promote the development of allergic reactions and/or
autoimmune
diseases
(Institoris
et
al.,
1999).
Elemental
mercury
is
disseminated in the environment due to natural events and human activities. In
aquatic environments, mercury is primarily converted to methy1mercury
(MeHg) by microbial action and accumulates in certain species of fish and
marine mammals (Thompson et al., 1998; Jannalagadda & Prasada Rao, 1993).
Exposure to mercury results mainly from the ingestion of prey contaminated
with MeHg (Thompson et al., 1998). Exposure to low concentrations of
mercury (in its various chemical forms) can depress or stimulate the immune
system and even induce autoimmune disease in various animal species
28
(Zelikoff & Thomas,1998). Exposure to both organic and inorganic mercury
results in immune activation leading to adverse outcomes related to allergy and
autoimmune disease (Lawrence, 1981; Dieter et aL, 1983; Pelletier et al., 1994;
Dantas & Queiroz, 1997). Mercurial species have been shown to be cytotoxic
and to possibly contribute to chronic and/or recurrent infection (Aten et aL,
1995; Osorio et aL, 1995; Koropatnick & Zalups, 1997).
Cadmium is also ubiquitous in the environment due to natural events and
human activities. The industrial uses of Cd 2+ have increased dramatically in the
last several decades and now include nickel/cadmium batteries, electroplating,
pigments, and plastic. Cd2+ also enters the environment as a result of mining
and smelting of various other metals (Misra et aL, 2002). For the general
population, cadmium exposure occurs primarily through contaminated drinking
water, food supplies (Leffel et aL, 2003) and cigarette smoking (Misra et aL,
2ÜÜ2;Goyer,2001 ). Cadmium tends to be accumulated in the viscera of
vertebrates, especially the liver and the kidneys (Tsangaris & Tzortzatou­
Stathopoulou, 1998). Cadmium may exert toxic effects on organisms, including
nephrotoxicity, carcinogenicity, teratogenicity and endocrine and reproductive
toxicities, either by direct action on specifie body tissues or more generally, by
influencing homeostatic mechanisms, such as the immune system (Fels et aL,
1994; Coles et aL, 1995). Mostly from in vivo animal models, cadmium is able
to damage both the humoral immune response and cell-mediated immunity
(Descotes, 1992). Cadmium toxicity has been implicated in alterations of the
immune system which include reduce antibody titers, reduced plaque-forming
cel1 (PFC) numbers, and depressed immunological memory (Koller, 1982). In
vitro and in vivo studies have shown that low concentrations of cadmium
slightly enhanced humoral immune responses, whereas, high doses were
immunosuppressive (Lawrence, 1981; Ohsawa et al., 1986; Otsuka & Ohsawa,
1991).
Selenium is an essential trace element for animaIs and humans that is obtained
from dietary sources such as cereals, grains and vegetables. The nutritional
importance of selenium is thought to be attributable to its function as a
component of the active site of the enzyme glutathione peroxidase (GSH-Px)
29
(Tapiero et al., 2003). Selenium has the potential to produce adverse health
effects from both excess and deficiency (Goyer, 2001). Selenium produces loss
of fertility and congenital defects and is considered embryotoxic and
teratogenic on the basis of animal experiments (Hogberg & Alexander, 1986).
The most extensively documented deficiency of selenium in humans is Keshan
disease. This is an endemic cardiomyopathy that occurs most frequently in
children under 15 years of age and in women of child-bearing age (Yang et al.,
1983). Not al1 metals suppress the immune response. Selenium is unique
among metals in that it general1y potentiates the immune response rather
suppressing it (Koller, 1980). Selenium enhances the primary immune response
and hemagglutinating titers of mice immunized with sheep red blood cells
(Spallholz et al., 1973a Spallholz et al., 1973b; Spallholz et al., 1975). There
are several studies that shown that selenium has protective effect against
mercury toxicity, from both organic and inorganic mercury compounds (Lindh
et al., 1996; Burk et al., 1977).
Zinc is an essential micronutrient that is involved in the regulation of cellular
functions and the maintenance of immune function (Unoshima et al., 2001).
Zinc is ubiquitous in the environment so that it is present in most food sources,
water and air. Zinc toxicity from excessive ingestion is uncommon, but a
deficiency results in a wide spectrum of clinical effects because more than 200
metalloenzymes require zinc as a cofactor (Goyer, 2001). Zinc is known to play
a central role in the immune system, and zinc-deficient persons experience
increased susceptibility to a variety of pathogens. Zinc exerts its ubiquitous
effects on immune function disease resistance, and general health. Severe zinc
deficience is characterized by severely depressed immune function, frequent
infections, diarrhea and mental disturbances (Shankar & Prasad, 1998). The
major impairment in zinc-deficient organisms appears to arise from effects on
T lymphocytes whose numbers are reduced, and on macrophages, whose
function is altered (Vallee & Falchuk, 1993).
When immune cells are affected by foreign products, cells respond to
extracellular signaIs through a variety of mechanisms, including immune cell
stimulation, i.e. immune induction initiated by interaction of extracellular
30
ligands such as cytokines and other signaling molecules. Most of the major
intracellular pathways including membrane transport processes, protein, RNA,
and DNA synthesis show increased activity in lectin-stimulated cells (Hamilos
et aL, 1991). Thiols-containing compounds are involved in the function of
many enzymes, structural proteins and receptors, and heavy metals may
severely disturb many metabolic functions in the cell (Hultberg et aL, 1998).
Glutathione is considered an important cofactor in lymphocyte activation and
proliferation (Knight, 2000). This would suggest that modulation of cellular
thiols may contribute to the immunomodulatory effects of heavy metals. The
intracellular level in thiols was measured with the CMFDA which is a non­
fluorescent probe that diffuses through membranes. An advantage of using
CMFDA to measure intracellular thiol levels is its ability to facilitate
quantitative measurements of living cells (Zurgil et aL, 1999). Since the
induction of metallothionein biosynthesis by metal ions is relatively slow,
considerable toxicity by metal ions could occur before the establishment of
effective levels of metallothionein (Hultberg et aL, 1998). Hultberg et aL,
(1998) suggested that glutathione could possibly function as a primary defense
against metal ion toxicity during this period. Since the exposure time with the
heavy metals was 3 hr, GSH may be in part, the principal component that was
measured. Furthermore, it was previously demonstrated that GSH was the
dominant thiol inside the cell and that cysteine is largely found on the outside
of the cell (Hultberg et aL, 2001).
Glutathione (GSH), a ubiquitous tripeptide is the most abundant (millimolar
range) intracellular non-proteinic thiol. Glutathione forms complexes with
several heavy metal ions and may thus function in the protection against metal
toxicity (Hultberg et aL, 1998; Dickinson & Forman, 2002; Hultberg et aL,
2001). It is weil known that lymphocyte proliferation in response to mitogenic
lectins is directly dependant upon glutathione availability. There is a correlation
between GSH levels and activation but the precise raie for GSH in the
activation process remains unclear (Hamilos et aL, 1989).
Apoptosis is a distinct forrn of cell death with characteristic morphoJogical and
biochemical changes including cel1 shrinkage, plasma membrane blebbing,
31
nuclear chromatin condensation, and DNA fragmentation (Wyllie et al., 1980).
Different from necrosis, apoptosis is a genetically controlled active cell death
process and has been implicated as a critical physiological or pathological
process in development and tissue homeostasis as well as in many diseases
(Saikumar et al., 1999).
The pur-pose of our study was to evaluate the toxicity of 5 selected heavy
metals found in the environment on pre-activated (with Con A) and non pre­
activated immune cells from different cel1 populations: lymphocytes and
macrophages. The immune competence of cells was determined using the
phagocytosis assay for macrophages and blastogenesis for lymphocytes. In
each cell population the levels of intracellular thiols and apoptosis were
assessed. Concentration-response curves were used to study the immunotoxic
potential of each metal for each population of cells.
MATERlAL AND METHODS
Substances under investigation
The following 5 heavy metal were selected: cadmium chloride (CdCh),
mercuric chloride (HgCIz), methylmercuric chloride (MeHgCl), selenium
tetrachloride (SeCI4) and zinc chloride (ZnCh) from Sigma Aldrich (St Louis,
MO, USA). A stock solution of MeHgCL and ZnCh was prepared in dimethyl
sulfoxide (DMSO) and anhydrous ethyl alcohol (Commercial Alcohols Inc.;
Brampton, Ontario, Canada) respectively. For the other metals, the stock
solutions were prepared in distilled water. The chemicals were diluted in a
culture media, RPMI 1640,(Gibco Life Technologies; Grand Island, NY, USA)
supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml
penicillin, and 100 ).l.g1ml streptomycin (Gibco Life Technologies; Grand
Island, NY, USA) so that the final DMSO or anhydrous ethyl alcohol
concentration in the culture did not exceed 0.1 %.
Preparation of cell suspensions
C57BLl6 female mice were obtained from Charles River Canada Inc (Qc,
Canada). Mice arrived at the animal facility at 3-4 weeks of age, weighing
between 12 to 15 g, and were placed in an exposure room with an automatic
12hr light/dark cycle and fed with a standard rodent diet and tap water ad
libitum. After 2 weeks of acclimation, the mice were killed by CO 2 inhalation
and the spleen was aseptically removed and place in RPMI 1640 medium. The
cell suspensions were then filtered through nylon wool into Pasteur pipettes,
washed two times in RPMI, and then retrieved by centrifugation at 1200 rpm
for 10 min. Cells were resuspended in supplemented RPMI 1640 (Brousseau et
aL, 1998). The concentration of murine macrophages was adjusted to
1x10 6 cells/ml in culture medium and lymphocytes were adjusted to 5xl0 6
cens/ml in the same medium. Viability of cells was determined by trypan blue
dye exclusion using a light microscope before culturing the cells.
33
Cell pre-activation
The cel1s were pre-activated by exposure to concanavalin A (Con A) from
Sigma Aldrich (St-Louis, MO, USA) to a final concentration of 20
~g/ml
for
macrophages and 2.5 flg/ml for lymphocytes and incubated at 37°C in a 5%
C02 atrnosphere for up to 30 min and 18 hr respectively. The non pre-activated
cells (without Con A) were exposed to supplemented RPMI for the same time
under the same conditions. After the exposure, cells were washed and then
resuspended in supplemented RPMI.
Exposure protocol
Lymphocytes and macrophages were exposed to individual metals (CdCh,
MeHgCI, HgCh, SeCI 4 or ZnCh) to final concentrations of lO- 9 to lO-3M in
order to obtain concentration-response curves. Except for the lymphocyte
proliferation where we incubated together the pre-activated lymphocytes and
non pre-activated with metals for 48 hr, both ce11s populations were incubated
at 3rC in a 5% C02 atrnosphere for up to 3 hr with concentration-response
curve of each meta1. After
exposure, the cel1s were washed and then
resuspended in RPMI medium for viability (lymphocytes and macrophages),
phagocytosis (macrophages), apoptosis (lymphocytes and macrophages) assays,
as well as, in PBS containing 1% of glucose (PBS-G) for the evaluation of
intracel1ular levels of thiols (lymphocytes and macrophages).
Cel1 viability using flow cytometry
Viability of lymphocytes and macrophages was assessed after a 3 hr exposure
to the metals. Both cells populations were cultured in two replicates per
treatrnent group at 5xl0 5 cel1s per tubes. Propidium iodide (PI) was added to
each tube to a final concentration of 1.5
~g/ml.
Cytolethality and viability were
determined after PI staining, measuring the PI fluorescence of 5000 cens at 600
nm by flow cytometry.
Detennination of macrophages phagocytic activity
Phagocytosis was assessed by detelmining the ingestion of latex fluorescent
beads by flow cytometry. After the pre-activation (with Con A) or not (with
RPMI), and exposure with metals, macrophages were cultured in two replicates
34
per treatment group at 5x 105 cells per tubes. They were incubated under
constant agitation at 37°C for 90 min (optimal time for assay) with latex
fluorescent beads at an approximate ratio of 100: 1 beads/cells. At the end of the
exposure period, the cells were 1ayered over a 3% bovine serum album in (BSA)
gradient and centrifuged at 150xg for 8 min at 4°C to rem ove free beads or
beads which adhered to the surface of the cells. The cel1 pellets were then re­
suspended in 0.5 ml of 0.5% phosphate-buffered forma lin, and the number of
engulfed beads was determined using a FACSCalibur flow cytometer.
Determination of lymphocyte proliferation
100 !-l1 of (5x10 s) pre-activated and non pre-activated lymphocytes, 100 !-lI of
Con A (2.5 ).lg/ml, final concentration) and 10 ).lI of each concentrations of
different metals (10-zM to lO-8M) were plated in flat bottom 96 weil-plates
under sterile conditions. The parent solutions of each metal was 21-times the
final concentration since the step of preparation involved a 1:21 the final
dilution to get the lO-3_ 10 -9 M. The cells were incubated for 48 hr at 37°C with
5% COz. 0.5 !-lCi of eH]-tritiated thymidine (6.7 Ci/mmo1; ICN , Mississauga,
Ontario) was then added to each weil, and the plates were further incubated for
18 hr at 37°C with 5% COz. The cells were the filtered using a Titertech cel1
harvester, and the incorporation of 3H-methyl-thymidine was measured using a
RackBeta from LK.B (Turku, Finland) scintillation counter. The results were
expressed in disintegration per minute (DPM). And triplicates were averaged
(Brousseau et aL, 1998)
Evaluation of intracel1ular thiol Jevels with CMFDA
A 5 mM stock solution of the 5-chloromethylfluorescein diacetate (CMFDA)
probe from MolecuJar Probe (Eugene, Oregon, USA) was prepared in DMSO
and stored at 4°C in the dark. After the pre-activation (with Con A) or not (with
RPMI) and exposure with meta1s, lymphocytes and macrophages were cu1tured
in two rep1icates per treatment group at 5x 105 cel1s per tubes in PBS containing
1% of glucose (PBS-G). Both cel1s populations were incubated at 37°C in a 5%
COz atmosphere for up to 45 minutes with the fluorescent CMFDA probe to a
final concentration of 5 !-lM. CMFDA penetrates the cel1, esterase hydro1ysis
35
converts it to fluorescent 5-chloromethyl fluorescein (CMF) VIa a process
called fluorochromasia. Intracellular CMF reacts with thiols on proteins and
peptides to form an impermeant, fluorescent aldehyde-conjugate product (SH­
F) (Zurgil et al., 1999). After the exposure period, the cells were washed and
suspended in 0.5 ml of PBS. The more thiols a cell possesses, the more the cell
fluoresces and this fluorescence can be measured using a FACSCalibur (Bec ton
Dickinson) flow cytometer. A negative control group was included using N­
ethylmaleimide (NEM) to block intracellular thiol groups. The cells were
treated with 100 /lM of NEM for 10 min, than washed before staining with
CMFDA.
Apoptosis assay using YO-PRO-l and PI dyes
The assay was performed using the Vybrant® Apoptosis Assay kit from
Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) which detects apoptosis on the basis
of changes that occur in the permeability of cell membranes. After the pre­
activation (with Con A) or not (with RPMI) and exposure with metals,
lymphocytes and macrophages were cultured in two replicates per treatrnent
6
group at lxl0 cells pel' tubes. One /lI of the YO-PRO-l stock solution and 1 /lI
of the PI stock solution were added to each tube and the cells were incubated
on ice for up to 30 min. At the end of the incubation period, the stained cells
were analyzed by flow cytometry, using an excitation wavelength of 488 nm
and measuring the fluorescent emission at 530 nm (FU) and> 575 nm (FU).
Statistical analysis
Data are presented as mean
± standard
deviation. The results were tested for
homogeneity using an analysis of variance (ANOVA). Significant differences
between treatrnent and control and between the activated and non-activated
cultures were determined by Tukey test using the JMP IN computer software
(SAS institute Inc, Cary, NC, USA). Differences between treatment means
were considered significant when p<0.05. Determination of ICs ü values was
performed by linear regression (y = a + bx) with at least 3 points chosen in a
linear section of the concentration-response curve with Excel (Microsoft Inc.).
RESULTS
Mice splenocytes ceIl viability after heavy metals exposure
For Iymphocyte's viability, illustrated in Figure 1a, inorganic and orgamc
mercury induced a cytotoxic effect on this population of cells. Organic mercury
was more cytotoxic than inorganic mercury. There was a significant decrease
(70%) in lymphocytes viability cultured in the presence of organic mercury at
concentrations ranging from lO-s to lO- J M, compared to the inorganic mercury,
where the viability of cells decrease of 80 % at concentrations ranging from 10­
4
to 10-3 M . Cadmium induced a significant decrease (90%) in lymphocyte
viability at concentrations ranging from 10-5 to 10-3M . Zinc decreased
4
significantly (90%) the lymphocyte viability at concentration ranging 10- to
1O-3M. For selenium, we observed a significant decrease in viability at
concentrations ranging 10-5 to 10-3 M .
For macrophage's viability, illustrated
10
Figure 1b, inorganic and orgamc
mercury induced a significant decrease in viability. Organic mercury decreased
significantly the macrophage viability (from 41 to 73% compared to the
control) at concentrations ranging 10-5 to 1O-3M. The inorganic mercury
obtained a same significant decrease (47 to 65% compared to the control) but
4
for the range between 10- to 10-3M . Cadmium induced a significant decrease
(20% compared to 10-4M) in macrophage viability at a concentration of 10-3M.
There was no significant difference in macrophage viability when cultured in
the presence of selenium or zinc.
Determination ofICso value for lymphocytes and macrophages
Linear regressions were performed on the data in order to obtain IC 50 values for
the lymphocytes proliferation and macrophages phagocytosis assays (i.e. 50%
suppression of phagocytosis and proliferation). These data are presented in
Table 1. Our results show that for ail heavy metals an effect was observed in
both lymphocytes and macrophages. ICso was calculated for aIl heavy metals
except for selenium in macrophages due to lack of measurable effect. Organic
mercury was the most toxic compound towards lymphocyte proliferation and
phagocytosis assay, with ICso values of 3.66 x 1O-7M for non pre-activated
lymphocytes and 7.46 x 10-sM for non pre-activated macrophages. ICso values
37
were in the range of 10-7 to 1O-5M for the non pre-activated lymphocytes and of
4
10-7 to 1O- M for the pre-activated lymphocytes. IC 50 values were in the range
of 10-5 to 10-4 M for the non pre-activated macrophages and 10-4M for the pre­
activated macrophages. The IC 50 values for the pre-activated cells were
significantly higher than the non pre-activated cells when exposed to cadmium,
inorganic mercury and zinc for lymphocytes and organic mercury for both
populations when exposed.
Macrophages phagocytic activity
Figure 2 represents an example of a concentration-response curve ofphagocytic
activity obtained with macrophages exposed to various concentrations of
cadmium. The phagocytosis % was higher in pre-activated cells than in non
pre-activated and significant differences were observed at ail concentrations
3
(except 1O- M), as weil as, in cells not exposed to cadmium. Also, we observed
a significant increase of phagocytosis with pre-activated cells were exposed to
a low concentration (lO-7M ) of cadmium. At the highest concentration tested
(i.e. 1O-3M), cadmium impaired phagocytic activity. Differences between pre­
activated cells
and
non pre-activated cells were observed when
the
macrophages were exposed to selenium (Fig. 3) and inorganic mercury (Fig. 4).
Lymphocytes proliferation
Figure 5 represents an example of a concentration-response curve of
lymphocytes proliferation obtained when cells were exposed to various
concentrations of cadmium.
There were significant differences at ail
concentrations between the non pre-activated and pre-activated cells except at
7
10- , 10-4 and 1O- 3M. There was a significant decrease of proliferation at 1O-8M
for both pre-activated and non pre-activated cells. In pre-activated cells at 10­
7M and in non pre-activated at 10-6M whereas a significant rise occurred in non
pre-activated cells at 10-7M . As cadmium concentration increased, there was a
trend was toward immunosuppression. Indeed at 10-5M and higher, cadmium
markedly impaired lymphocyte proliferation. Similar results were obtained for
mercury compounds (Figs. 6 and 7), selenium (Fig. 8) and zinc (Fig. 9).
38
Evaluation of intracellular level of thiols
Figure 10 represents an example of a concentration-response curve of
intracellular levels of thiols in lymphocytes and macrophages obtained when
cells were exposed to various concentrations of organic mercury. Pre-activated
splenocytes displayed a significant increase in intracellular thiols levels
compared to their non pre-activated counterparts when exposed to organic
mercury at concentrations ranging from 10-9 to 1O-6 M. There was also a
significant rise in thiols levels in pre-activated cells than non pre-activated
when they were not exposed to meta1. There was a significant fall in both pre­
activated and non pre-activated cells compared to the control when exposed to
higher concentrations of organic mercury (i.e. from 10-5 to 10-3M).
Figure Il represents an example of a concentration-response curve of
intracellular levels of thiols in lymphocytes and macrophages obtained when
cells were exposed to various concentrations of selenium. There was a
significant difference in thiols levels between non pre-activated and pre­
activated splenocytes at concentrations ranging 10-9 to 10-4 M even for cells that
were not exposed to selenium. There was a significant increase of intracellular
thiols in pre-activated lymphocytes compared to the non pre-activated when
exposed to selenium at concentrations ranging from 10-9 to 10-4M. However, a
higher concentration of selenium (i.e. 10'3M) induced a significant decrease in
intracellular thiols levels in pre-activated macrophages and in both pre­
activated and non pre-activated lymphocytes. Moreover, when compared to the
non pre-activated celIs, pre-activated showed a significant increased in
intracellular thiols content following exposure to inorganic mercury (Fig. 12),
zinc (Fig.13) and cadmium (Fig. 14). The intracellular thiols content of both
pre-activated and non pre-activated macrophages was significantly higher than
in lymphocytes when exposed to heavy metals (Figs. 10, Il, 12, 13 and 14).
Apoptosis in splenocytes after heavy metals exposure
Figure 15 represents an example of a concentration-response curve of
lymphocyte and macrophage apoptosis obtained when cells were exposed to
various concentrations of organic mercury. There was a significant increase in
apoptosis of mouse splenocytes when cultured with organic mercUlY at
39
concentrations ranging from 10-5 to 10-3M compared to the control. However,
7
low concentrations of organic mercury (i.e. from 10-8 to 1O. M) induced a
significant decrease in apoptosis in pre-activated macrophages compared to the
control. There was a significant difference between non pre-activated and pre­
activated cells at ail concentrations for macrophages and at concentrations
ranging from 10-5 to 10-3M for lymphocytes. Pre-activated macrophages
showed a higher % apoptosis than non pre-activated when cultured with low
concentration of organic mercury (i.e. from 10-9 to 10-6 M and even in the
control). In contrast, non pre-activated macrophages showed a higher %
apoptosis than pre-activated when cultured with the higher concentrations of
organic mercury (i.e. 10-5 to 1O.3M). Contrary to macrophages, pre- activated
lymphocytes showed a higher % apoptosis than non pre-activated lymphocytes
when cultured with higher concentrations of organic mercury (i.e. 10-5 to 10­
3M). Non pre-activated lymphocytes showed a higher apoptosis than pre­
activated lymphocytes when cultured with low concentration of organic
6
mercury, except for 1O- M (not significant).
Figure 16 represents an example of a concentration-response curve of
lymphocyte and macrophage apoptosis obtained when cells were exposed to
various concentrations of zinc. There was a significant rise in apoptosis of
mouse sp1enocytes when cultured with zinc at a concentration of 10,3M
compared to the control. Pre-activated lymphocytes showed a significantly
higher % apoptosis than non pre-activated lymphocytes at 10'7, 10-4 and 1O-3M.
Zinc induced a significant increase in apoptosis at 10'8 and 10'5 and 10-3M in
non pre-activated lymphocytes compared to the control. At 10,7, 10-4 and 10­
3M, in pre-activated lymphocytes and at 1O- 7M in non pre-activated
macrophages, we observed an increase of apoptosis also, compared to the
control. There was a significant difference between non pre-activated and pre­
activated macrophages at ail concentrations (except lO,3 M ) as weil as in cells
that were not exposed to zinc and at concentrations of 10'7, 10-4 and 1O,3 M for
lymphocytes.
ACKNOWLEDGMENT
This work was supported by the Toxic Substances Research Initiative of
Canada and Canada Research Chair in EnvironmentaI Immunotoxicology.
DISCUSSION
Animal studies have been useful in uncovenng mechanisms of metal
modulation of immunity. In vitro studies are an alternative approach to study
mechanisms of metal modulation of human lymphocyte reactivities (Lawrence
&
McCabe,
2002).
In
experimental animaIs,
toxicological
effects of
xenobiotics on the immune system may be manifest as changes in the weight
and histological appearance of lymphoid organs such as thymus, spleen and
lymph nodes, in altered numbers of blood leukocytes, and in impairment of
immune cell function(Yos et a1., 1989). Moreover, in vitro models allow the
use of specifie endpoints to determine the targets of toxic effects with great
precision and reproducibility (Olabarrieta et al., 2001).
Heavy metals toxicity
Heavy metals consist of a group of environmental threats with strongly toxic
effects. The mechanism producing cellular damage depends on the type of
metal, its subcellular distribution and also on the concentration of the exposure
(Tsangaris & Tzortzatou-Stathopoulou, 1998).Our results demonstrate that the
sensitivity of Iymphoid cells varies considerably with metal species as weil as
between cell populations (i.e. lymphocytes or macrophages) and treatrnents
(pre-activation or non pre-activated). Quantification of the sensitivity using
IC so indicates that organic mercury was the most potent inhibitor of
macrophage phagocytosis and lymphocyte proliferation (Table 1). Organic
mercury was the most cytotoxic compound with a cytotoxic concentration of ~
10-sM followed by inorganic mercury with a cytotoxic concentration of ~ 10-4M
(Figs. 1a and 2b). Thus, cytotoxic potential of methylmercury for splenocyte
cells appeared to be at least 10-fold greater than the cytotoxicity of mercury
chloride (Yoccia et a1., 1994). The cytotoxic concentration of cadmium to
lymphocytes was ~1O-4M, followed by selenium ~1O-4M and by zinc ~lO·JM
(Fig. lA). Zinc appeared to be more cytotoxic than selenium at a concentration
of lO-J M . For macrophages, the cytotoxic concentration of cadmium was ~10­
JM and was lower for zinc. In vitro analysis of metal toxicity on humoral
immunity ranked sorne metals as follows: Hg>Cu>Cd>Co>Cr>Mn>Zn>Sn
42
(Lawrence, 1985). Our results also demonstrate that lymphocytes are more
sensitive to heavy metals studied than macrophages.
Pre-activation
The effectiveness of Con A to pre-activate macrophages and lymphocytes when
exposed to heavy metals was confirmed. When macrophages were in the
presence of Con A (pre-activated) there was an increase in the expression of l­
A molecule (CMH II) when compared to the cells that were cultured in the
absence of Con A (non pre-activated) . The expression of the histocompatibility
II major complex by macrophages which was increased in the activation phase
was clearly associated with the presence of lymphocyte T antigens (Adams &
Hamilton, 1984; Adams, 1982). Furthermore, studies found an increased
expression of the molecule I-A in activated macrophages (Adams & Hamilton,
1984; Unanue & Allen, 1987). The membrane expression of the I-A molecule
(CMH II) was therefore reliable expression marker for macrophages in an
activated state (Unanue, 1984). In the case of lymphocytes, the incorporation of
tritiated thymidine in the pre-activated cells was more evident than in cells at
rest (non pre-activated). Lymphocytes normally exist as resting cells in the GO
phase of the cell cycle and when activated with Con A rapidly enter G 1 and
progress through the cell cycle (Janeway et a1., 1997). Analysis of the
incorporation of 3H-thymidine into the DNA of cells when cultured in presence
of Con A demonstrated the activating properties of Con A.
Phagocytosis
Macrophages, and their phagocytic function, play an important role in the non­
specific cellular immune response. These cells function to protect the host by
phagocytizing
foreign
material
(Ellis,
1977).
Phagocytic
activity
of
macrophages has been shawn to be a sensitive biological marker of toxicity in
both vertebrate and invertebrate (Dunier, 1994; Wong et a1., 1992; Zelikoff,
1993). In this study, all macrophages pre-activated with Con A showed a
phagocytic activity higher than macrophages at rest. We observed a significant
increase (19%) of phagocytosis compared to the control when the pre-activited
cells are with lO,7 M of cadmium and a light increase of phagocytosis for
macrophages at lower concentration (10-sM ta lü'8 M) for both pre-activated
43
and non pre-activated cells (Fig.2). A same phenomena was observed with
haemocytes when exposed to cadmium. In vitro studies have shown that the
phagocytic ability of haemocytes was observed when exposed to cadmium.
Cadmium appears to stimulate phagocytic and lysosomal activities in
haemocytes in vitro (Olabarrieta et al., 2001).
With
selenium
we found
and
increase
ln
the
phagocytosis for all
concentrations, excepted 10.4 and 10·3M, for macrophages pre-activated and
non pre-activated (Fig. 3). One of the possible explanation is that selenium is a
component of the active site of the enzyme glutathione peroxydase (GSH-Px).
This enzyme is one of several mammalian scavenging systems which protect
celis and membranes from damage by injurious oxygen radicals (Parnham et
al., 1983). Selenium deficiency, resulting in decreased GSH-Px activity in
neutrophils, has been reported to depress the phagocytic and microbiological
activities of neutrophils from rats and cattle (Serfass & Ganther, 1975; Boyne
& Arthur, 1979).
We observed a significant suppressive effect on phagocytosis in pre-activated
cells at all concentrations for the inorganic mercury (FigA). That is confirmed
by other study where the inorganic mercury was reported to have inhibitory
effects on the production of superoxyde and free radicals and on phagocytosis
(Zelikoff & Smialowicz, 1996).
Lymphocytes Proliferation
Heavy metals can induce immunopotentiating or immunosuppressive effects
which couId result in immunopathologic effects on numerous tissues.
Alteration of immune responsiveness has been related to the toxicity of heavy
metals (Vos, 1977). Like macrophages all lymphocytes pre-activated with Con
A showed an increase in the proliferation, doesn't matter the heavy metal used.
We observed a significative increase (49.5%) compared to the control for the
proliferation of lymphocytes (for the non pre-activated cells) when exposed to
7
cadmium at 10· M (Fig. 5). Same results was observed in vitro, where low
doses of Cd 2+ stimulated DNA synthesis, cel\ multiplication, and malignant
transformation (Misra et al., 2002). An other study shown arise level of
metallothionein in pre-activated cells which protect cells against the
44
immunotoxic effects of Cd (Sgagias et al., 1989). Mercury enhanced human
lymphocyte stimulation after 6 days of culture and also stimulated the
production of 132-microglobulin by lymphocytes (Ohsawa & Kimura, 1979).
However, other investigators have reported inhibitory effects; in vitro exposure
of human and murine lymphocytes to mercury compounds decreased their
response to phytohemagglutinin (PHA) and concanavalin A (ConA) stimulation
(Sharma & Dugyala, 1996). That is the phenomena that we observed with
inorganic mercury. In both pre-activated and non pre-activated cells, HgCh
decreased the proliferation of cells after 3 days of incubation (Fig.7). However,
we obtained a huge proliferation on T lymphocytes in presence of organic
mercury at ail concentrations for pre-activated cells (Fig. 6). We observed, in
other experiments in our lab, that organic mercury at lower concentrations
increases the proliferation of lymphocytes. Same results was confirmed by
other authors who they shown that the Iymphoproliferative response to T cell
mitogens, in Sprague-Dawley rats is enhanced after 8 weeks of oral exposure
and depressed after 16 weeks of continuous oral exposure to methyl mercury in
the drinking water. But several investigators have reported the effect of
mercury compounds on the lymphoproliferative response. Sorne have shawn an
increase in lymphocyte response after mitogen stimulation (Oltega et al., 1994);
other have reported a decrease in the lymphocyte (T & B cell) response after
exposure in vivo and in vitro (van der Meide et al., 1993). It is possible that
these differences in lymphocyte response depend on many variables that
include time of exposure (acute or chronic), route of exposure (intraperitoneal,
oral,etc.), form, and concentration of the compound (Wild et al., 1997).
Excepted for 10-8 M (and 10-4 & 10-3 M (cytotoxicity) of selenium, we obtained
an increase in the proliferation with lymphocytes when the cells are pre­
activated (Fig. 8). The pre-activation with Con A increase thiols contents inside
the cells and we know that the lymphocyte proliferation in response to
mitogenic lectins is directly dependent upon glutathion (GSH) availability
(Hami10s et al., 1989). Selenium is "unique" among the metals in that it
generally potentiates the immune response rather than suppressing (Koller,
1980). That is the effect that we obtained for intermediate concentrations of
45
selenium (10'S, lO'7 and lO'6M) in non pre-activated cells. These concentrations
of selenium enhanced the proliferation of lymphocytes T.
The proliferation of lymphocytes T was increased for ail concentrations with
zinc chloride in cells pre-activated with Con A compared to the control (Fig. 9).
The same results was obtained on response of lymphocytes to mitogens PHA,
Con A, LPS and SEA when animaIs are fed with a supplementation of zinc
(Koller, 1980). Generally, a zinc deficiency resuIts not only in decreased
lymphocyte concentrations, but in depressed T and B lymphocyte function.
Sorne data suggest that the primary effect of zinc deficiency is deletion of T
and B lymphocytes with little loss of function in the surviving cells (Shankar &
Prasad, 1998).
Thiols measurement
Metals such as mercury and cadmium are know to exhibit a high affinity for
thiol groups and may therefore severely disturb many metabolic functions in
the cell (Hultberg et al., 1998). Glutathione (GSH) is the most abundant, non­
protein thiol, being found in the millimolar range in most cells. The response of
a cell to a stressor, such as heavy metals, involves changes in thiol content
(Dickinson & Forman, 2002).
Many different conditions are known to change intracellular glutathione
content including heavy metals. Exposure to compounds that generate reactive
species such as heavy metals increase the content of GSH by enhancing the rate
of GSH synthesis (Dickinson & Forman, 2002). There was a significant
decrease in glutathione levels in both pre-activated and non pre-activated cells
when exposed to higher concentrations of organic mercury (i.e. from 10·5M to
lO'3M) (Fig. 10). Decrease in intracellular glutathione levels was demonstrated
in in vitro and in vivo studies involving heavy metals (Yasutake & Hirayama,
1994). Even a partial depletion of intracellular GSH pool has a dramatic
consequence on the process of blast transformation and proliferation, as weil as
for the generation of cytotoxic T cells (Zurgil et al., 1999). Non pre-activated
macrophages showed a significant decrease in intracellular thiols levels when
exposed to low a concentration of organic mercury (i.e.lO,sM) which
46
demonstrates that non pre-activated macrophages may be more sensitive (Fig.
10).
These results demonstrated that pre-activated ceUs are more resistant than non
pre-activated ceUs since % viability of pre-activated ceUs is greater than non
pre-activated. It was demonstrated that the pre-activation of ceUs by a mitogen
such as Con A or PHA significantly increased the content of intracellular in
GSH (Lawrence et al.,
1996). Most intraceUular mechanisms such as
membrane transport, protein synthesis and RNA and DNA synthesis display
activity increase following an activation oflectin (Hamilos et al., 1991). In this
sense, activation protects the cells since cellular activity is increased as weil as
the thiols content allowing for the sequestration of a greater quantity of metals
(Figs. 10,11,12,13 and 14).
Apoptosis
Apoptosis was identified as the major mechanism by which inflammatory cells
are removed during an inflammatory injury (MA, 2003). Our results
demonstrate the difference in susceptibility present in both cellular populations,
and that lymphocytes were more sensitive than macrophages when exposed to
heavy metals. High concentrations of metals also induced a higher % apoptosis
in lymphocytes than macrophages. That was the case for the pre-activated cells
and the non pre-activated when exposed to organic mercury and pre-activated
ceUs when exposed to zinc (Figs. 15 and 16) and as weU as for cadmium,
inorganic mercury and selenium (results not shown). Previous work showed
that low levels of organic merCUIY (0.6 to 5 j..tM) induce apoptosis in human T­
ceUs (DeMoor & Koropatnick, 2000). Our results demonstrate that pre­
activated macrophages underwent a higher % apoptosis at concentrations
ranging forrn 10·9 M to 10·6M when exposed to organic mercury and from 10'
9M
to lO-4 M when exposed to zinc. This was also hue for cells that were not
exposed to heavy metals. A low level of apoptosis induced by Con A was noted
in macrophages at concentrations where metals are not cytotoxic. Con A,
normally a mitogen of T-lymphocytes, was found to be a cell-cyc1e­
independent apoptosis inducing agent in cultured murine macrophage PU5-1.8
cells (Su en et a1., 2000). Pre-activated lymphocytes displayed a higher %
47
apoptosis than non pre-activated when cultured with high concentrations of
organic mercury and zinc. Impairment of apoptosis activity leads to an
accumulation of activated cell in the body which in tum leads to auto-immune
phenomena or inflammation.
Our results demonstrate the difference in susceptibility present in both cellular
populations, and that lymphocytes are more sensitive than macrophages when
exposed to heavy metals.
This study confirms and extends these observations showing that pre-activation
of macrophages and lymphocytes are also sensitive to the effect of heavy
metals than the non pre-activated cel1s.
Legends of figures
Figure la. Percentage ofviability ofmouse lymphocytes after 3 hr exposure to heavy
metals (cadmium chloride, methylmercuric chloride, mercuric chloride, selenium
tetrachloride and zinc chloride) at concentrations ranging from 1O-9M to 1O-3M. *
denotes a significant difference when compared to the control with p<O.OS.
Figure 1b. Percentage of viability of mouse macrophages after 3 hr exposure to
heavy metals at concentrations ranging from IO-9M to IO·3M .
* denotes
a significant
difference when compared to the control with p<O.OS.
Figure 2. Effect of a 3 hr exposure to cadmium chloride in both pre-activated and
non pre-activated mouse macrophages phagocytosis.
*
denotes a significant
difference when compared to the non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre­
activated), .. (pre-activated), denotes a significant difference when compared to the
control group with p<O.OS.
Figure 3. Effect of a 3 hr exposure to selenium chloride in both pre-activated and non
pre-activated mouse macrophages phagocytosis.
*
denotes a significant difference
when compared to the non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), ..
(pre-activated), denotes a significant difference when compared to the control group
with p<O.OS.
Figure 4. Effect of a 3 hr exposure to mercury chloride in both pre-activated and non
pre-activated mouse macrophages phagocytosis.
*
denotes a significant difference
when compared to the non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), ..
(pre-activated), denotes a significant difference when compared to the control group
with p<O.OS.
Figure S. Effect of a 3 hr exposure to cadmium chloride on cell proliferation in both
pre-activated and non pre-activated mouse lymphocytes identified by 3H-methyl­
thymidine incorporation.
* denotes
a significant difference when compared to the
non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes
a significant difference when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 6. Effect of a 3 hr exposure to methylmercuric chIo ride on cell proliferation in
both pre-activated and non pre-activated mouse lymphocytes identified by 3H_
methyl-thymidine incorporation.
* denotes a significant difference when compared to
49
the non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated),
denotes a significant difference when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 7. Effect of a 3 hr exposure to mercury chloride on cell proliferation in both
pre-activated and non pre-activated mouse lymphocytes identified by 3H-methyl­
thymidine incorporation.
* denotes
a significant difference when compared to the
non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes
a significant difference when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 8. Effect of a 3 hr exposure to selenium chloride on cell proliferation in both
pre-activated and non pre-activated mouse lymphocytes identified by 3H-methyl­
thymidine incorporation.
*
denotes a significant difference when compared to the
non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes
a significant difference when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 9. Effect of a 3 hr exposure to zinc chloride on cell proliferation in both pre­
activated and non pre-activated mouse lymphocytes identified by 3H-methyl­
thymidine incorporation.
* denotes
a significant difference when compared to the
non pre-activated cells with p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes
a significant difference when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 10. Determination of intracellular levels of thiols in both pre-activated and
non pre-activated mouse splenocytes after a 3 hr methylmercuric chloride exposure.
* denotes a significant difference when compared to the non pre-activated cells with
p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes a significant difference
when compared to the control group with p<O.OS.
Figure Il. Determination of intracellular levels of thiols in both pre-activated and
non pre-activated mouse splenocytes after a 3 hr selenium tetrachloride exposure.
*
denotes a significant difference when compared to the non pre-activated cells with
p<O.OS. • (non pre-activated), .. (pre-activated), denotes a significant difference
when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 12. Determination of intracel1u1ar levels of thiols in both pre-activated and
non pre-activated mouse splenocytes after a 3 hr mercury chloride exposure.
*
denotes a significant difference when compared to the non pre-activated cel1s with
50
p<O.OS. • (non pre-activated), ... (pre-activated), denotes a significant difference
when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 13. Determination of intracellular levels of thiols in both pre-activated and
non pre-activated mouse splenocytes after a 3 hr zinc chloride exposure.
* denotes a
significant difference when compared to the non pre-activated cells with p<O.OS. •
(non pre-activated), ... (pre-activated), denotes a significant difference when
compared to the control group with p<O.OS.
Figure 14. Determination of intracellular levels of thiols in both pre-activated and
non pre-activated mouse splenocytes after a 3 hr cadmium chloride exposure.
*
denotes a significant difference when compared to the non pre-activated cells with
p<O.OS. • (non pre-activated), ... (pre-activated), denotes a significant difference
when compared to the control group with p<O.OS.
Figure 15. Percentage of apoptosis in mouse splenocytes after 3 hr exposure to
methylmercuric chloride at concentrations ranging from IO·9M to IO'3M .
* denotes a
significant difference when compared to the control with p<O.OS. • (non pre­
activated), ... (pre-activated), denotes a significant difference when compared to the
control group with p<O.OS.
Figure 16. Percentage of apoptosis in mouse splenocytes after 3 hr exposure to zinc
9
3
chloride at concentrations ranging from 10· M to 10· M. * denotes a significant
difference when compared to the control with p<O.OS. • (non pre-activated), ... (pre­
activated), denotes a significant difference when compared to the control group with
p<O.OS.
51
100
""""-Cd
90
---+- Hg
80
"""'
~
60
organlc
---Hg
inorganic
---')t(- Se
50
Zn
70
0
'-'
È
:ë
os
';;
-.;
U
40
30
20
10
0
Control
1.00E­
1.00E­
09
08
1.00E­
07
1.00E­
06
1.00E­
05
Concentrations (M)
Figure la.
1.00E­
04
1.00E­
03
52
100
90
80
70
~
0
.è
:ô
-+-Cd
60
os
50
-.;
40
*
___ Hg
.~
U
-+- Hg organic
inorganic
~Se
Zn
30
20
10
0
Control
IOOE-09 I.OOE-08 I.OOE-O? I.OOE-06 I.OOE-OS 1.00E-04 I.OOE-03
Concentrations (M)
Figure 1b.
53
Table 1. rcso value of aU tested metals for the lymphocytes proliferation assay and
macrophages phagocytosis assay after 3 hours of exposure.
Non pre-activated
Pre-activated
Lymphocytes
Macrophages
Lymphocytes
Macrophages
6
628EIO·
M
,
4,88E10·4 M
s M*
419EIO,
,
5,63E10·4 M
Mercuric chio ride
1,79EIO· 6 M
3,18E10·4 M
5,32EIO·6 M *
3,67E10·4 M
Methylmercuric
chloride
3,66E10·7 M
7,46EIO' s M
7,68EIO·7 M*
1,42EI0-4 M *
Selenium
tetrachloride
5,89El O's M
N.A.
6,98ElO' s M
N.A.
Zinc chloride
8,35EIO' s M
5,44E10·4 M
5,57EI0-4 M *
5,58ElO·4 M
Cadmium
chio ride
* denotes a significant difference when compared to the non pre-activated cells with
p < 0.05.
54
*
30
*
+
25
,-.
20
:::'
<> ?
'--'
'"
.~
0
~
*
15
<.J
0
~
*
*
rf
t
~
*
~
~
o pre-activated
o non pre-activated
*
~
+
~lJ
<'l
..c:
c.
10
5
o
Control
100E-9
1.00E-8
1.00E-7
1.00E-6
Concentrations (M)
Figure 2.
100E-5
100E-4
100E-3
55
35
30
*
1
•
1
~ t
*
25
j
~
-t
o pre-acti vated
*
o non
•
*
*
t
*
If
~
f
10
pre-activated
~
~
~
*
~
rt 8c
5
o
Control
1.00E-9
1.00E-S
1.00E-7
1.00E-6
Concentrations (M)
Figure 3.
1.00E-5
1.00E-4
1.00E-3
56
30"
*
+
25
;?
o
*
*
+
+
*
*
o pre-activated
+
Onan pre-acti vated
20
*
'-'
+
'"
r;;
~
o""
bJ)
15
~
~ 10
+
5
Control
J.ÛÛE-9
J.ÛÛE-8
I.ÛÛE-7
1.0ÛE-6
Concentrations (M)
Figure 4.
I.ÛÛE-5
J.ÛÛE-4
J.ÛÛE-3
57
100000
*
*
*
90000
• •
+
*
60000
~
0
50000
40000
o non pre-activated
+
70000
~
ŒI pre-activated
*
80000
L
~
d
ffi
il
30000
[
20000
10000
11
0
Control
I,OOE­
09
1,00E­
08
+ •
I,OOE­
I,OOE­
J ,OOE­
J,OOE­
I,OOE­
07
06
05
04
03
Concentrations (M)
Figure 5.
+ •
._-,
58
*
+
160000
*
+
140000
III pre-activated
120000
o non pre-activated
100000
~
c.
Cl
80000
*
*
60000
40000
20000
+ •
0
Control
I,OOE­
09
1,00E­
08
1,00E­
07
I,OOE­
06
Concentrations (M)
Figure 6.
+ •
r--
I,OOE­
05
1,00E­
04
+ •
,--,
1,00E­
03
59
160000
*
*
+
140000
100000
ff
Q.
~
Cl
rlI pre-acti vated
+
120000
80000
*
f
ff
Onan pre-activated
*
+
+
60000
~
40000
1',
20000
0
I~~
ff
1­
Control
1.00E­
09
1.00E­
08
1.00E­
07
I.OOE­
06
Concentrations (M)
Figure 7.
*
+
~
I.OOE­
05
+ •
+ •
······r--·
I.OOE­
04
1.00E­
03
1
60
*
160000
140000
+
*
+
~
*
pre-activated
o non
pre-activated
120000
100000
~
Q.
Q
80000
60000
40000
20000
+ •
+ •
I.OOE­
04
I.OOE­
03
0
Control
I.OOE­
09
1.00E­
08
I.OOE­
07
I.OOE­
06
Concentrations (M)
Figure 8.
I.OOE­
OS
61
160000 ]
•
140000 ,
120000
*
*
*
*
•
*
I:l..
Q
40000
~
f
~
20000
1
~
ffi
Control
1.00E­
09
1.00E­
08
I.OOE­
07
~'
:~.
n•
I~
Ij
0
1.00E­
06
Concentrations (M)
Figure 9.
0 non pre-acti vated
1
80000
60000
*
*
100000
~
I!I pre-acti vated
1.00E­
05
1.00E­
04
•
I.OOE­
03
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Concentrations (1\1)
Figure 15.
.
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68
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30
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1.00E­
I.OOE­
08
07
06
05
04
03
Concentrations (M)
Figure 16.
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CHAPITRE III
DISCUSSION
Les études, in vitro, chez les ammaux sont des approches alternatives nous
pennettant d'étudier les mécanismes de modulation des métaux lourds sur le système
immunitaire humain et en particulier, en ce qui nous intéresse dans cette recherche, sur les
lymphocytes (Lawrence & McCabe, 2002). Dans les modèles animaux, les effets
toxicologiques des métaux lourds, sur le système immunitaire se manifestent par des
changements dans le poids et l'apparence histologique des organes lymphoïdes tels le
thymus, la rate et les ganglions lymphatiques. On dénote aussi un nombre modifié de
globules blancs ainsi que des changements dans les fonctions des cellules immunitaires
(Vos et al., 1989). De plus avec les modèles animaux in vitro, nous pouvons utiliser des
doses limites pour mesurer la toxicité d'un produit avec une grande précision et
reproductibilité (Olabarrieta et al., 2001).
Les métaux lourds étudiés dans cette recherche (mercure (organique et
inorganique), cadmium, zinc et le sélénium) peuvent affecter le système immunitaire à
différents degrés selon leur toxicité (Lawrence, 1985). Ils peuvent altérer aussi bien la
réponse immunitaire non-adaptative (naturelle) en augmentant le risque des infections
ainsi que la réponse adaptative (spécifique) en augmentant le développement de maladies
néoplasiques et auto-immunes (Vos et al., 1989).
Toxicité des différents métaux
Les métaux lourds sont une menace environnementale possédant des effets très
toxiques sur le système immunitaire et en particulier sur les lymphocytes. Les mécanismes
par lesquels les effets des métaux sont induits dans la cellule dépendent en effet du type de
métal, sa distribution et sa concentration intracellulaire (Tsangaris & TZOltzatoU­
Stathopoulou, 1998). Afin de mesurer le degré de toxicité de chacun des métaux à l'étude,
nous avons fait pour chaque métal une courbe dose-réponse en présence de lymphocytes
de rate de souris. Comme le démontre la figure 1a de l'article, le chlorure de
méthylmercure s'est avéré le métal le plus toxique suivi du chlorure de mercure. La
76
5
cytotoxicité du mercure organique s'est produite à une concentration de lü- M et celle du
mercure inorganique à une concentration de 10-4M , ce qui fait dire que le chlorure de
méthylmercure est dix fois plus toxique que le chlorure de mercure (Voccia et al., 1994).
Le mercure et ses congénères sont des substances extrêmement toxiques. Les différentes
formes de mercure que ce soit organique ou inorganique ainsi que les vapeurs de mercure
peuvent altérer le système immunitaire même à de très faibles doses. Le mercure est
capable de provoquer des maladies auto-immunes et de promouvoir des infections
chroniques. Ces insuffisances immunitaires peuvent déclencher le développement et la
progression de cancers (Shenker et al., 2000).
Le chlorure de cadmium s'est avéré le troisième métal le plus toxique, diminuant
la viabilité des lymphocytes de 80% après 48 heures d'incubation pour une concentration
de 10-4M . La toxicité du cadmium dépend de plusieurs facteurs dont le mode
d'administration
du
métal,
la
dose,
l'espèce
étudiée
ainsi
que
des
facteurs
environnementaux et nutritionnels. Des études antérieures ont démontré que le cadmium
n'affecte pas la viabilité des cellules de moules (Mytdus galloprovincialis) à des doses où
la viabilité des cellules d'une lignée cellulaire LLC-PKI (cellules provenant du tube rénal
proximal) est significativement diminuée. Ceci indique que les cellules de la lignée sont
plus sensibles au cadmium que les cellules de moules (Olabarrieta et al., 2001). On a noté
le même genre d'observation où les macrophages murins ont été plus résistants à l'effet du
cadmium que les lymphocytes. Ceci est probablement dû au fait que les macrophages
produisent plus de thiols (voir fig. 14 de l'article) dont les métallothionéines (MTs) qui
éliminent rapidement le cadmium hors de la cellule. Les sévères dommages du cadmium
sur les lymphocytes peuvent être dûs au bas taux de MTs avec une forte accumulation de
cadmium intracellulaire (Olabarrieta et al., 2001).
Le chlorure de zinc a causé de la cytotoxicité au niveau des lymphocytes à des
3
concentrations de lü- M seulement. Le zinc n'est pas reconnu comme étant très toxique
car il est aussi considéré comme un antioxydant contre les effets néfastes du cadmium.
Les interactions du zinc avec le cadmium et le plomb peuvent modifier la toxicité de ces
métaux (Goyer, 2001). Il a été démontré auparavant que la toxicité du zinc après
administration, in vivo, était relativement faible parce que ce métal était redistribué très
rapidement dans le corps. Plusieurs études ont démontré que les cellules mises en culture
provenant de rongeurs, d'humains (en particulier de la prostate), de fibroblastes, ou de
77
lignée cellulaire Hela démontrent une sévère toxicité en présence de concentrations de
zinc plus grandes que 100 )..lM
Cl 0--4M).
Le traitement des hépatocytes de rats en présence
de concentrations de zinc plus grandes que 50 )..lM a aussi démontré une cytotoxicité. Par
contre d'autres chercheurs n'ont rapporté aucune toxicité chez les cultures de cellules
rénales de rats ainsi que des monocytes humains en utilisant les mêmes doses. Ce qui fait
dire qu'il y a deux facteurs importants à prendre en considération losque nous exposons
des cellules in vitro en présence de zinc:
Cl) que la distribution du zinc in vivo est régulée
par des mécanismes homéostatiques qui jouent principalement un rôle dans le niveau de
métal absorbé par le foie et que (2) sous des conditions normales, le degré d'excrétion du
zinc par l'urine peut-être relativement élevé. Ces deux systèmes de régulation sont absents
des expériences faites in vitro et peuvent être difficilement simulés (Rodilla et al., 1998).
Le tétrachlorure de sélénium s'est avéré le métal le moins toxique en diminuant la
viabilité de seulement 56% par rapport au contrôle. Le sélénium est considéré comme
jouant un rôle d'antioxydant grâce à son enzyme glutathion peroxydase (Tinggi, 2003).
Dans une étude antérieure, les effets antioxydants du sélénium ont protégé la lignée
cellulaire K-562 des effets toxiques du cadmium en augmentant sa viabilité (Frisk et al.,
2002). Le sélénium a aussi eu un effet protecteur sur les lignées cellulaires des cellules de
dauphins contre la toxicité du mercure inorganique (Wang et al., 2001).
En général, les analyses, in vitro, démontre une toxicité des métaux lourds sur la
réponse humorale selon l'ordre suivant :Hg>Cu>Cd>Co>Cr>Mn>Zn>Sn (Lawrence,
1985). Nos résultats démontrent aussi que les lymphocytes sont plus sensibles que les
macrophages à l'effet toxique des métaux lourds étudiés (figures la et ab de l'article).
Pré-activation des lymphocytes
La pré-activation des lymphocytes avec la concanavaline A (Con A) avait pour but
de les faire progresser de la phase GO vers la phase G 1 du cycle cellulaire (Janeway et al.,
1997) sans pour autant provoquer leur mitose et leur prolifération. Nous avons donc laissé
la Con A en présence des lymphocytes pour une durée de 18 heures seulement. Il a été
démontré que la stimulation ou l'activation des cellules T avec un antigène ou avec des
78
mitogènes polyclonaux (Con A) transforme ces cellules T, (en deçà de quelques heures)
d'apparences petites avec un petit cytoplasme, en un large lymphoblaste avec un
cytoplasme abondant (Hamilos et al., 1991 ;Droge et al., 1995). L'activation des cellules
est représentée dans les graphiques, par tous les contrôles, où les désintégrations par
minute (DPM), des contrôles pré-activés, sont supérieures à ceux non pré-activés (figures
5,6,7,8 et 9 de l'article). Cet état d'activation provoque une augmentation du volume
cellulaire, un cytoplasme volumineux contenant divers organites, en particulier les
mitochondries et les polyribosomes libres (Roitt et al., 1997). Ce processus génère une
demande extrême pour plusieurs métabolites et ce, aux limites des capacités du transport
membranaire (Droge et al., 1995). Des études ont démontré qu'en diminuant le niveau de
glutathion intracellulaire, nous inhibons l'activation des lymphocytes T induite par un
mitogène tel la Con A (Hamilos et al., 1991). Plusieurs études ont aussi démontré qu'une
première partie de la prolifération des lymphocytes T (i.e. l'activation) est affectée par une
diminution en glutathion (GSH). Ce qui fait qu'en activant (nous parlerons dans le
mémoire d'une pré-activation, car cette étape technique précède toutes les autres étapes
qui cherchent à évaluer la réponse des lymphocytes pré-activés ou pas (au repos) face à 5
métaux lourds) les lymphocytes avec la Con A, nous augmentons leur contenu
intraceJ1ulaire en thiols et plus spécifiquement en GSH, qui est le thiol le plus abondant
dans la cellule. Le glutathion maintient le système d'oxydo-réduction (REDOX) dans la
cellule en éliminant les radicaux libres. Il se conjugue aux substances toxiques (métaux
lourds) et les élimine (Kavanagh et al., 1990).
L'activation des macrophages par la Con A a provoqué une augmentation de
l'expression de la molécule I-A à leur surface comparée aux macrophages non pré-activés
(Adams & Hamilton, 1984;Unanue & Allen, 1987). L'expression de l'la est en relation
avec leur pouvoir de présenter l'antigène aux lymphocytes (Adams, 1982;Adams &
Hamilton, 1984). Une perte de l'expression de l'la se traduit par une réduction de la
présentation de l'antigène tandis qu'une augmentation de l'acquisition de l'la à la surface
des macrophages par la Con A se traduit par une augmentation de leur fonction de cellules
accessoires (Unanue, 1984).
79
Effet de la pré-activation sur la courbe de toxicité et effet protecteur de la pré-activation
La transformation Iymphoblastique est un test très utilisé en immunologie car elle
permet de quantifier la prolifération lymphocytaire suite à une stimulation avec un
antigène ou un mitogène. Par ce test, nous avons voulu démontrer les effets de la pré­
activation avec la Con A sur les courbes de toxicité des 5 métaux à l'étude. Pour quantifier
cet effet, nous avons fait des courbes dose-réponse avec des lymphocytes pré-activés et
non pré-activés en présence de ces métaux lourds (figures 5,6,7,8 et 9 de l'article). Nous
avons calculé les concentrations inhibitrices 50 (CIso) qui sont les concentrations qui
inhibent 50% de la prolifération des lymphocytes (Table 1 de l'article). Comme on a pu le
constater tous les lymphocytes pré-activés ont proliféré beaucoup plus que ceux non pré­
activés et ce, peut importe le métal utilisé et dans les plages de concentrations où il n'y a
pas eu de mortalité cellulaire. La pré-activation des lymphocytes a aussi augmenté leur
CI so , les rendant plus résistantes à l'effet néfaste des métaux lourds étudiés. Les
lymphocytes pré-activés ont été entre 1.2 et 6.7 fois plus résistants que les lymphocytes
non pré-activés (table 1 de l'article). Nous avons vu que la pré-activation des lymphocytes
par la concanavaline A augmentait le contenu intracellulaire en glutathion et favorisait une
augmentation de la prolifération ainsi qu'une résistance accrue des lymphocytes face aux
métaux lourds (figures 5,6,7,8 et 9 de l'article).
Tous les lymphocytes pré-activés avec la Con A ont démontré un niveau plus élevé
de thiols que ceux non pré-activés et ce pour tous les métaux aux concentrations où il n'y
a pas eu de cytotoxicité (figures 10,11,12,13 et 14 de l'article).
Mercure organique et inorganique
Une augmentation de la prolifération des lymphocytes pré-activés pour les plus
faibles concentrations en mercure organique (10.9 à 10·7M) a été observée lors de notre
recherche (figure 6 de l'article). Dans les recherches antérieures, il a été démontré que le
mercure a augmenté la stimulation des lymphocytes humains après 6 jours de culture et a
stimulé aussi la production de 13 2-microglobuline (Ohsawa & Kimura, 1979). Les
.(
lymphocytes pré-activés ont démontré un niveau de thiols plus élevé que ceux non préactivés en présence de mercure organique (figure IOde l'article). D'autres études ont
aussi rapporté que le mercure organique influence le métabolisme du GSH à l'intérieur de
la cellule lors d'exposition in vivo. Ses chercheurs ont remarqué une augmentation de la
80
synthèse de la GSH dans le foie et les reins des souris exposées in vivo au MeHgCl. Ils
ont conclu que le mercure organique induisait l'altération du métabolisme de la GSH via
l'enzyme y-glutamylcystéine synthétase qui se trouve augmentée dans les groupes traités
au mercure organique. Ce qui laisse supposer que les fortes concentrations en GSH dans
les cel1ules pré-activées ont fait en sorte qu'il y a eu une inhibition de l'effet toxique du
mercure sur les cellules aux concentrations où il ne provoque pas de mort cel1ulaire (de
10-9 à 1O-6M).
Cette augmentation de GSH aurait pour effet de protéger l'organisme contre
l'action toxique et néfaste du méthylmercure (Yasutake & Hirayama, 1994). C'est aussi ce
que nous avons observé lors du dosage des thiols intracellulaires, en particulier le GSH, en
présence de mercure organique. Nos concentrations (représentées par la moyenne de
fluorescence) en thiols intracel1ulaires ont augmenté par rapport au contrôle aux mêmes
concentrations où il y a eu augmentation de la prolifération (figure 10 de l'article) dans les
cellules pré-activées. Nous avons aussi observé, dans notre labo, lors de multiples
expériences antérieures, in vitro, que le mercure organique favorise la prolifération des
lymphocytes T aux doses non toxiques (résultats non publiés). Ce qui est aussi confirmé
par d'autres chercheurs qui ont démontré que la prolifération des lymphocytes Test
augmentée après 8 semaines d'exposition orale chez les rats au mercure organique pour
par la suite être diminuée après 16 semaines de traitement (Wild et al., 1997).
En présence de mercure inorganique, nous avons observé une diminution de la
prolifération des lymphocytes T pré-activés et non pré-activés avec la Con A (figure 7 de
l'article). D'autres chercheurs ont rapporté des résultats similaires lorsqu'une exposition
in vitro des lymphocytes humains et murins avec le chlorure de mercure a diminué leur
réponse à la phytohémagglutinine (PHA) et leur stimulation à la Con A (Sharma &
Dugyala, 1996).
Plusieurs études sur le mercure orgamque et inorganique ont démontré une
augmentation de la stimulation (Ortega et al., 1994), tandis que d'autres ont démontré un
effet inhibiteur après des expositions in vitro et in vivo (van der Meide et al., 1993). Il est
possible que les différences dans ces résultats dépendent de plusieurs variables comme le
temps d'exposition (aigu ou chronique), la voie d'exposition (intra-péritonéale, orale
etc ... ), la forme de mercure utilisée ainsi que sa concentration (Wild et al., 1997).
81
Cadmium
Pour le chlorure de cadmium, nous avons observé une augmentation significative
de la prolifération des lymphocytes non pré-activés avec la Con A à la concentration 10­
SM et une augmentation non significative pour ce même groupe de cellules à la
concentration 10-sM (figure 5). Des résultats similaires ont aussi été observés, in vitro,
antérieurement où des faibles doses de cadmium ont provoqué une stimulation de la
synthèse de l'ADN, la multiplication cellulaire et des transformations malignes (Misra et
al., 2002). Par contre, les lymphocytes pré-activés ont proliféré moins que leur contrôle
respectif et ce, pour toutes les concentrations, comme si l'effet de les avoir pré-activés au
début les rendait plus sensibles au cadmium même à faible dose. Une autre étude a aussi
démontré une élévation des MTs dans les cellules pré-activées qui les ont protégées contre
les effets immunotoxiques du cadmium (Sgagias et al., 1989).
Zinc
La prolifération des lymphocytes T a été augmentée pour toutes les concentrations
en zinc (sauf 10-3M où il y a cytoxtoxicité) dans les cellules pré-activées avec la Con A
(figure 9 de l'a11icle). Des résultats similaires ont été obtenus avec des lymphocytes en
réponse à la PHA, Con A, LPS et SEA chez des animaux supplémentés en zinc (Koller,
1980). Un supplément de zinc augmente le nombre de cellules T (CD4+ et CD8+
cytotoxiques), le nombre de cellules NK et élève la production d 'IL-2 et son récepteur (lbs
& Rink, 2003). Ceci est aussi confirmé par d'autres études où une augmentation en zinc
dans la diète augmente la réponse et les fonctions des lymphocytes et des macrophages
chez la souris et le rat (Shankar & Prasad, 1998).
Le niveau de glutathion intracellulaire a aussi été augmenté dans les concentrations
de JO-9 à JO-sM dans les lymphocytes pré-activés (figure 13 de l'article). Nous pouvons
remarquer qu'en augmentant les concentrations en zinc, nous augmentons aussi le niveau
de thiols dans les cellules pré-activées ou non par la Con A. Les métallothionéines (MTs)
qui font parties de la grande famille des thiols ont beaucoup d'affinité pour le zinc. En
augmentant les concentrations en zinc, nous augmentons par le fait même le niveau de
MTs intracellulaires qui lient le métal et protège la cellule des effets toxiques. Le zinc lié
aux MTs joue un rôle clé dans l'homéostasie de la cellule et par le fait même dans la
protection du système immunitaire (Mocchegiani et al., 2000).
82
Sélénium
Toutes les concentrations sauf 10-8, 10-4 (cytotoxicité) et 1O-3M (cytotoxicité) en
sélénium ont augmenté la prolifération des lymphocytes T dans les cellules pré-activées
avec la Con A (figure 8 de l'article). Dans les cellules non pré-activées, il y a eu aussi
7
augmentation de la prolifération pour les concentrations intermédiaires: 10-8,10- et 1O-6M.
Les niveaux de prolifération sont aussi similaires dans les 2 séries de cellules, ce qui fait
dire que le sélénium est très peu toxique, qu'il est un élément essentiel, un anti-oxydant
cellulaire, jouant un rôle de désintoxication cellulaire (Soares et aL, 2003; Tapiero et aL,
2003). Le sélénium est un métal unique (parmi les métaux) qui généralement augmente les
réponses immunitaires plutôt que de les supprimer (Koller, 1980). Les effets antioxydants
du Se seraient médiés par l'enzyme glutathion-peroxydase des cellules. Cet enzyme joue
un rôle fondamental dans la réduction et l'inactivation du peroxyde d'hydrogène.
Une augmentation du GSH intracellulaire dans les lymphocytes pré-activés et non
pré-activés a aussi été mesurée lors de cette recherche (figure II de l'article). Toutes les
concentrations en sélénium ont augmenté le niveau de thiols intracellulaires, exceptées
pour la concentration 1O-3 M dans les lymphocytes pré-activés.
Apoptose dans les lymphocytes pré-activés et non pré-activés
Nous avons mesuré l'apoptose dans les lymphocytes activés et non activés en
faisant des courbes dose-réponse avec différents métaux.
Mercure organique
Pour les faibles concentrations de mercure organique (10-9 , 10-8 et 1O-7M), nous
avons obtenu un pourcentage d'apoptose légèrement plus élevé dans les lymphocytes non
pré-activés que ceux pré-activés avec la Con A (figure 15 de l'article). Pour les autres
concentrations, les lymphocytes pré-activés ont démontré un indice d'apoptose beaucoup
plus prononcé que ceux non pré-activés. Le pourcentage le plus élevé (75%) a même été
atteint à une concentration où on dénote beaucoup de mortalité lymphocytaire (1 a-SM).
Des études antérieures sur l'apoptose et le mercure organique ont démontré que lorsque le
mercure entre dans la cellule, il y a immédiatement une baisse en thiols et cette baisse
entraîne une production des EROs et l'oxydation des lipides mitochondriaux. Cette
combinaison EROs et diminution des thiols provoque une activation de la caspase qui
83
s'esquisse en mort cellulaire (Shenker et al., 1999). Dans notre expérience, il n'y a pas eu
de baisse en thiols intracellulaires au contact du mercure organique (figure 10 de l'article)
sauf, aux concentrations cytotoxiques (10- 5 à 1O-3M). Tous les lymphocytes pré-activés ont
eu une augmentation significative (pL 0.05) du niveau de thiols intracellulaires tandis que
les cellules non pré-activées ont eu un niveau égal ou légèrement supérieur en thiols
comparé à leur contrôle respectif. Ces valeurs en thiols correspondent aux valeurs de
l'apoptose, car lorsque nous avons des valeurs élevées en thiols, comme dans les
lymphocytes pré-activés, les pourcentages d'apoptose sont plutôt faibles, excepté pour 10­
6M ,
où il y a eu augmentation non significative de l'indice d'apoptose.
Mercure inorganique
Pour le mercure inorganique, le pourcentage d'apoptose a augmenté avec les
concentrations croissantes de mercure pour les lymphocytes pré-activés avec la Con A.
Pour les cellules non pré-activées, le pourcentage d'apoptose a légèrement diminué dans
les valeurs 10-9 à 10-6 M pour augmenter significativement à partir de 10-5 jusqu'à 1O-3M
où on observe de la mortalité. Des études précédentes ont démontré que le fait de pré­
activer des lymphocytes humains avec de la PHA ou de la PMA augmentait leur
résistance au mercure et diminuait l'apoptose. Leur proposition était que les cellules pré­
activées généraient du GSH intracellulaire qui lui contrôlait la formation des EROs dans la
cellule et réduisait par le fait même le phénomène d'apoptose. En regardant nos données
de thiols intracellulaires pour le mercure inorganique (figure 12 de l'article), nous
observons que le niveau de GSH est relativement le même pour le contrôle et pour toutes
les concentrations de mercure dans les lymphocytes pré-activés. Le niveau va diminuer
significativement à partir des concentrations 10-5 jusqu'à 1O-3M. Par contre pour les
lymphocytes non pré-activés, les concentrations de GSH sont à peu près les mêmes que le
contrôle excepté, aux concentrations 10-
4
3
et 10· M. En regardant ces données, on
s'aperçoit que le niveau de thiols intracellulaires n'est pas très élevé que l'on soit en
présence de fortes concentrations de mercure ou non, ce qui fait dire que le mercure a
quand même exercé sa toxicité peut importe le fait que les cellules étaient pré-activées ou
non. Le plus haut taux d'apoptose a été obtenu à la concentration 1O-5 M , concentration qui
précède la concentration où on observe la cytotoxicité du mercure inorganique. Avec la
concentration cytotoxique (10-4 M), les cellules non pré-activées ont eu un plus haut taux
d'apoptose que les cellules pré-activées, ce qui vient corréler ici les données des autres
84
chercheurs qui ont trouvé que les cellules non pré-activées avaient un plus haut taux
d'apoptose que les cellules pré-activées (Close et al., 1999).
Cadmium
Plusieurs études ont démontré qu'une exposition au cadmium in vitro ou in vivo
induisait l'apoptose dans différents organes: foie, poumons, rein, prostate ainsi que dans
différentes cellules immunitaires incluant les lymphocytes T et B (Dong et al., 2001).
Dans notre recherche, le cadmium a induit l'apoptose pour toutes les concentrations
(excepté 10·5M pour les lymphocytes pré-activés) dans les cellules pré-activées et non pré­
activées. Nous avons remarqué que le phénomène d'apoptose était plus marqué dans les
cellules pré-activées que celles non pré-activées. Des études antérieures ont aussi
démontré que le cadmium induisait l'apoptose mais à des degrés différents selon l'espèce
cellulaire. Les lignées cellulaires Raji, qui sont des cellules cellulaires de lymphocytes B
ont été beaucoup plus sensibles à l'apoptose que les lignées CCRf-CEM (lymphocytes T)
et Molt-3 (lymphoblastes) qui ont démontré une résistance accrue au cadmium (Tsangaris
& Tzortzatou-Stathopoulou, 1998). C'est le phénomène que nous avons aussi observé
avec nos lymphocytes, pré-activés ou non, faisant augmenter l'apoptose de 115% dans les
cellules pré-activées par rapport à celles non pré-activées. Il faut mentionner ici que
l'indice élevé d'apoptose que nous avons obtenu est attribuable principalement à la forte
cytotoxicité du cadmium sur les lymphocytes qui se produit généralement à cette
concentration (figure la de l'article). Même à faible dose (l0·7M), nous avons eu une
augmentation significative des lymphocytes pré-activés avec la Con A. Des résultats
similaires ont été obtenus auparavant, par d'autres chercheurs, où on a démontré que le
cadmium à faible dose déclenche le phénomène d'apoptose chez les lignées de cellules - T
(El Azzouzi et al., 1994). Un des mécanismes, exploré par d'autres recherches, a été celui
qu'une exposition au cadmium provoquerait un changement cytoplasmique de la
concentration en Ca 2+ qui activerait la caspase-3 qui est un médiateur crucial dans le
phénomène d'apoptose (Shen et al., 2001). D'autres études ont démontré que le cadmium
augmenterait le calcium intracellulaire qui déclencherait l'activation de la caspase-3
provoquant ainsi la fragmentation de l'ADN ainsi que le relâchement du cytochrome c de
la mitochondrie (Crompton, 1999). Plusieurs de ces mécanismes restent cependant à être
élucidés.
85
Zinc
Toutes les concentrations en
ZinC
ont démonh'é un pourcentage d'apoptose
supérieur au contrôle et ce pour les lymphocytes pré-activés et non pré-activés exceptées,
pour une concentration seulement où le pourcentage est légèrement inférieur au contrôle
(10-6M pour les lymphocytes non pré-activés (figure 16 de l'article). Ces résultats obtenus
sont cependant contradictoires avec ceux obtenus lors d'expériences précédentes par
d'autres chercheurs. Plusieurs études faites, in vitro, antérieurement ont démontré qu'une
déficience en zinc augmente l'apoptose dans les lignées cellulaires lymphoïdes et
myéloïdes (Provinciali et al., 1995). Des concentrations aussi élevées que 600 IlM (6x 10­
4 M)
ont
diminué le pourcentage d'apoptose de 12% tandis que nous avons eu une
augmentation de 33%. Par contre pour les concentrations de 15 IlM, les études antérieures
ont démontré une augmentation de 455% du pourcentage d'apoptose tandis que nous
avons obtenu une augmentation de 80%. Une explication possible est que l'espèce de
cellules étudiées était différente pour ces expériences (thymocytes vs splénocytes) ainsi
que le temps d'exposition avec le zinc (20 minutes vs 3 heures). Par ailleurs, ces mêmes
chercheurs, lors d'une expérience subséquente, ont augmenté leur temps d'exposition à 8
heures et ensuite à 20 heures et leur pourcentage d'apoptose a été augmenté de 157%
seulement comparé à 455% obtenu auparavant. Ce qui laisse peut-être supposer qu'en
augmentant le temps d'incubation du zinc avec les cellules, nous diminuons la viabilité
des cellules et augmentons peut-être plus la nécrose que l'apoptose pour des doses plus
élevées en zinc. En pré-activant les lymphocytes, nous avons eu sensiblement la même
réponse qu'avec les cellules non pré-activées sauf à la concentration la plus élevée en zinc
où on a obtenu un indice d'apoptose plus élevé.
Sélénium
Pour les cellules pré-activées, l'indice d'apoptose à augmenter de façon graduelle
avec les concentrations croissantes en sélénium, pour atteindre son maximum à 10-3M. Par
contre pour les cellules non pré-activées le taux d'apoptose est demeuré soit égal (10-9M),
a légèrement diminué (10-8 et 1O-7M) ou a légèrement augmenté (10-6 et IO- SM) pour
augmenter significativement aux concentrations 10-4 et 10-3M (figure 3 du mémoire). Tl
est bien connu que le glutathion, qui est l'anti-oxydant majeur de la cellule est de très près
relié au métabolisme et à la bio-activité du sélénium. Lorsque nous pré-activons les
cellules avec la Con A, nous augmentons son contenu intracellulaitre en thiols et plus
86
particulièrement en glutathion (GSH) (Fig. Il de l'article). Mais le GSH peut jouer 2 rôles
en présence de sélénium: il peut jouer le rôle de pro-oxydant en augmentant la fonnation
des EROs, induire un stress oxydatif et augmenter l'apoptose. Il peut par contre jouer le
rôle d'anti-oxydant en provoquant une augmentation de la lactate déhydrogénase (LDH),
une inhibition de la croissance cellulaire et une diminution de l'apoptose (Shen et al.,
2000). Nous pouvons conclure selon nos résultats que le glutathion en présence de
sélénium a joué un rôle de pro-oxydant en augmentant l'apoptose chez les lymphocytes
pré-activés par rapport à ceux non activés et ce pour toutes les concentrations.
Comparer les niveaux de thiols entre les lymphocytes et les macrophages pré-activés et
non pré-activés
En tenninant cette étude, nous avons voulu faire une comparaison des niveaux de
thiols entre les deux populations, lymphocytes et macrophages, pré-activées et non pré­
activées. Le fait d'activer les deux populations a eu comme résultat que les niveaux de
glutathion et de cystéine de part et d'autre ont été augmentés. Par la suite, nous avons mis
ces deux populations respectives (cellules pré-activées et non pré-activées) en présence
des cinq métaux à l'étude. Comme le démontre les figures 10,11,12,13 et 14 de l'article
tous les macrophages pré-activés et non pré-activés ont obtenu un niveau de thiols
intracellulaires plus élevé que les lymphocytes et cela peu importe le métal présent (sauf
avec le CdCh à la concentration 1O-3 M (figure 14 de l'article)).
Très peu de chercheur ont mesuré les niveaux de thiols intracellulaires dans les
deux populations à l'intérieur de la même recherche et, ceux qui l'ont expérimentée, ont
utilisé des unités de mesure différentes pour les deux populations (Fayet al., 1994).
Comme nos résultats le démontrent les niveaux de thiols intracellulaires ont été plus
élevés dans les macrophages que dans les lymphocytes. En effet, les macrophages ont une
quantité considérable de cystéine qui leur pennet de synthétiser du glutathion et même de
participer à la fonnation du glutathion chez les lymphocytes. Il a été démontré que les
macrophages activés transféraient un grand nombre de cystéine réduite pour ainsi
augmenter le niveau intracellulaire en glutathion des cellules T activées se situant aux
alentours (Droge et al., 1995).
87
Les travaux de Droge et al., ont démontré que les thiols produits par les
macrophages augmentent le contenu intracellulaire en GSH dans les lymphocytes
régularisant par le fait même leur prolifération (Droge et al., 1995;Gmunder et al., 1990).
L'interaction entre les macrophages et les lymphocytes est donc essentielle afin de
répondre aux changements immunologiques qui s'effectuent lorsque la cellule est prise
avec différentes agressions. La réponse des lymphocytes à une grande variété de stimulis
requière la participation des macrophages comme cellules accessoires (Rosenberg &
Lipsky, 1979).
Une autre étude a démontré qu'en stimulant les macrophages avec
lipopolysaccharide (LPS),
un
nous induisons chez les macrophages la production de
plusieurs facteurs à effets protecteurs contre les effets néfastes des EROs. En effet, les
macrophages activés par le LPS vont relarguer des thiols, spécialement de la cystéine, qui
est un précurseur majeur du GSH, et réguler le GSH à l'intérieur des lymphocytes, les
protégeant par le fait même des stress oxyda tifs engendrés par les métaux lourds (Fayet
al., 1995).
Une autre étude a aussi démontré que le contact avec un contaminant comme le
diésel provoque une libération de thiols des macrophages et des lymphocytes mais de
façon très différente. Le niveau de thiols va être augmenté dans les deux populations mais
on va retrouver plus de GSH au niveau des macrophages et plus de cystéine au niveau des
lymphocytes, ce qui fait dire qu'une exposition à différents contaminants altère le
métabolisme des thiols dans les deux populations mais de façon très différente (AI­
Humadi et al., 2002).
En soumettant nos deux populations pré-activées et non pré-activées à différents
métaux lourds, nous avons observé que les macrophages produisent plus de thiols que les
lymphocytes, par des mécanismes différents, les rendant plus résistants à l'effet néfaste de
ces contaminants sur le système immunitaire.
CONCLUSION
Au cours de cette recherche, nous avons évalué l'effet de cinq métaux lourds
présents dans l'environnement mis en contact in vitro avec des cellules de rates de souris,
pré-activées ou non pré-activées afin d'obtenir des données immunotoxicologiques dans le
but d'évaluer le risque associé à ces expositions.
Notre premier objectif, qui était de déterminer la toxicité de ces cinq métaux lourds
suite à des expositions in vitro avec des lymphocytes murins, nous a permis d'observer
que le chlorure de méthylmercure était le métal le plus toxique suivi par le chlorure de
mercure, le premier s'avérant dix fois plus toxique que le deuxième. Le chlorure de
cadmium a été le troisième métal le plus toxique suivi du chlorure de zinc. Le
tétrachlorure de sélénium s'est avéré le métal le moins toxique en diminuant la viabilité
des lymphocytes de seulement 56% par rapport au contrôle.
Notre deuxième objectif, qui était de déterminer l'effet de la pré-activation des
lymphocytes murins, avec la Con A sur la courbe de toxicité, s'est avéré, en effet, très
concluant. La pré-activation des lymphocytes a augmenté les concentrations inhibitrices
50 (CI so ) rendant ces cellules plus résistantes à l'effet néfaste des métaux lourds étudiés.
Les lymphocytes pré-activés ont été entre 1.2 et 6.7 fois plus résistants que les
lymphocytes non pré-activés en présence des différents métaux (Table 1 de l'article).
Nous avons aussi démontré avec notre troisième objectif que tous les lymphocytes
pré-activés avec la Con A ont démontré un niveau plus élevé de thiols intracellulaires que
ceux non pré-activés et ce pour tous les métaux aux concentrations où, il n'y a pas eu de
cytotoxici té.
Avec le quatrième objectif, qui était de mesurer l'indice d'apoptose dans les
lymphocytes pré-activés et non pré-activés, les réponses obtenues ont été différentes selon
le métal étudié. Nous avons observé un pourcentage d'apoptose légèrement plus élevé
chez les lymphocytes non pré-activés que ceux pré-activés avec la Con A pour les faibles
concentrations de mercure organique. Avec les plus fortes concentrations, les lymphocytes
pré-activés ont démontré un phénomène d'apoptose beaucoup plus prononcé que ceux non
pré-activés. Pour le mercure inorganique, le pourcentage d'apoptose a augmenté avec les
concentrations croissantes de mercure pour les lymphocytes pré-activés avec la Con A. Le
cadmium a induit l'apoptose pour toutes les concentrations dans les cellules pré-activées
89
et non pré-activées. L'apoptose a cependant été plus marqué dans les lymphocytes pré­
activés que ceux non pré-activés. Pour le zinc, toutes les concentrations ont démontré un
pourcentage d'apoptose supérieur au contrôle et ce pour les lymphocytes pré-activés et
non pré-activés exceptées, pour une concentration seulement où l'indice d'apoptose est
légèrement inférieur au contrôle (lO'6M pour les lymphocytes non pré-activés). Avec les
cellules pré-activées, le taux d'apoptose à augmenter de façon graduelle avec les
concentrations croissantes en sélénium, pour atteindre son maximum à lü'3M . Par contre
9
pour les cellules non pré-activées le taux d'apoptose est demeuré soit égal (10' M), a
légèrement diminué (10' 8 et lü'7M) ou a légèrement augmenté (10'6 et lü'SM)
pour
augmenter significativement aux concentrations lü'4 et lü'3 M (figure 3 du mémoire).
Enfin, le dernier objectif qui était de comparer les niveaux de thiols entre les
macrophages et les lymphocytes pré-activés et non pré-activés, comme le démontre les
figures 10,11,12,13 et 14 de l'aI1icle, tous les macrophages pré-activés et non pré-activés
ont obtenus un niveau de thiols intracellulaires plus élevés que les lymphocytes et cela peu
importe le métal présent (sauf avec le CdCIz à la concentration lü'3M ( figure 14 de
1' article)).
En général, les études in vitro et in vivo chez les ammaux sont très utiles et
comparables aux études faites chez l'humain. Cette étude chez les souris in vitro nous a
permis de découvrir des mécanismes d'immunomodulation par les métaux qui pourraient
se retrouver chez l'humain: les systèmes murin et humain ayant des réactivités face aux
métaux très similaires (LawTence & McCabe, 2002). Cette étude nous a permis de vérifier
que la pré-activation des cellules avec la concanavaline A offre une meilleure protection
de la cellule contre l'action toxique des métaux lourds, qu'elle augmente le contenu
intracellulaire en thiols et que les macrophages ont un contenu intracellulaire en thiols
plus élevé que les lymphocytes.
PERSPECTIVES FUTURES
Après ces études in vitro, il serait intéressant de faire des expérimentations in vivo
chez la souris avec l'ingestion de ces mêmes métaux lourds via la nourriture. Il serait aussi
intéressant de faire des expérimentations in vivo en pré-traitant les souris avec des
substances anti-oxydantes telles que le sélénium et le zinc.
CHAPITRE IV
RÉSULTATS NON-SOUMIS POUR PUBLICATION
Les prochains graphiques (3) représentent les résultats obtenus pour le test
d'apoptose réalisé avec les lymphocytes pré-activés et non pré-activés. Ces graphiques
non pas été inclus dans l'article.
*
35
Iill!l
1
30
1
+
pré-activés
•
l1!l non pré-acti vés
25
o~
'-"
.., 20
'o"
g.c. 15
*
+
~
10 .
Contrôle
\OOE-9
l.OOE-8
\OOE-7
\OOE-G
J.OOE-S
\OOE-4
l.OOE-3
Concentrations (M)
Figure 1.
Courbe dose-réponse du % d'apoptose des lymphocytes pré-activés et non
pré-activés en présence de chlorure de mercure (HgCh). Les résultats sont exprimés en %
d'apoptose en fonction de la concentration en HgCh et sont présentés sous forme de
* signifie une différence significative entre les lymphocytes pré­
pré-activés. + (pré-activés) • (non pré-activés), signifie une différence
moyenne ± erreur-type.
activés et non
significative entre les lymphocytes pré-activés et non pré-activés par rapport à leur groupe
contrôle respectif. P< 0.05.
91
30
*
UI pré-activés
~ non pré-activés
+
25
*
.--- 20
o~
'-'
Il>
~
....c.
15
o
c.
~ 10
5
Contrôle
100E-9
I.OOE-8
I.OOE-7
100E-6
1.00E-5
1.00E-4
1.00E-3
Concentrations (M)
Figure 2.
Courbe dose-réponse du % d'apoptose des lymphocytes pré-activés et non
pré-activés en présence de chlorure de cadmium (CdCh). Les résultats sont exprimés en %
d'apoptose en fonction de la concentration en CdCh et sont présentés sous forme de
moyenne ± erreur-type.
* signifie une différence significative entre les lymphocytes pré­
activés et non pré-activés... (pré-activés) • (non pré-activés), signifie une différence
significative entre les lymphocytes pré-activés et non pré-activés par rapport à leur groupe
contrôle respectif. P< 0.05.
92
35
*
I:l pré-acti vés
1
30
~
+
non pré-activés
25
,-..
~
e....,20
~
*
\Il
0
go
15
0­
+
*
<1:
+
+
10
•
5
0
Contrôle
1.00E-9
1.00E-8
1.00E-7
1.00E-6
1.00E-5
1.00E-4
1.00E-3
Concentrations (M)
Figure 3.
Courbe dose-réponse du % d'apoptose des lymphocytes pré-activés et non
pré-activés en présence de tétrachlorure de sélénium (SeCl 4 ). Les résultats sont exprimés
en % d'apoptose en fonction de la concentration en SeCl4 et sont présentés sous forme de
moyenne ± erreur-type.
* signifie une différence significative entre les lymphocytes pré­
activés et non pré-activés... (pré-activés) • (non pré-activés), signifie une différence
significative entre les lymphocytes pré-activés et non pré-activés par rapport à leur groupe
contrôle respectif. P< 0.05.
APPENDICE A
94
Avant d'effectuer les proliférations lymphoblastiques avec les substances à tester,
la concentration optimale de mitogène à utiliser doit être déterminée. Cette concentration
optimale correspond à la concentration de mitogène la plus élevée avant celle provoquant
l'effet maximal sur un graphique représentant les désintégrations par minute (DPM) en
fonction de la concentration de mitogène. La figure 4 nous montre un exemple d'un tel
graphique dans le cas d'une détermination de concentration optimale de mitogène.
70000
60000
50000
~
40000
~
Q
30000
20000
10000
0
Contrôle
0,15
0,312
0,625
1,25
2,5
5
10
20
40
Concentrations
Figure 4.
Détermination de la concentration optimale de mitogène. Dans le cas
présent, la concentration optimale pour la concanavaline A serait de 1.25
~glml.
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