These

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté de Médecine
IRIBHM
Activation des cellules rétiniennes lors d’uvéites autoimmunes
expérimentales: Rôle des cytokines pro‐inflammatoires et effet du transfert du gène SOCS1
Maya MAKHOUL
En vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur : Pr. François Willermain
Co‐promoteur: Dr. Catherine Bruyns
Année académique 2011‐2012
Ce travail a pu être réalisé grâce au soutien financier des Fonds pour la formation à la Recherche dans l’industrie et dans l’Agriculture (FRIA) ainsi qu’aux fonds de la fondation David et Alice Van Buuren et aux fonds de la Recherche en Ophtalmologie (FRO). Remerciements J’exprime mes remerciements les plus sincères au Professeur François Willermain qui m’a fait l’honneur de m’accueillir dans son laboratoire et m’avoir fait découvrir cette discipline complexe et variée qu’est l’immunologie oculaire. Tes compétences alliées à tes grandes qualités pédagogiques et humaines sont exemplaires. Merci pour ton aide, tes encouragements et ta grande disponibilité, malgré les nombreuses « casquettes » que tu dois porter. Je tiens aussi à remercier très chaleureusement le Dr Laure Caspers qui m’a accueillie au sein de son équipe. J’exprime mes profonds remerciements au Dr Catherine Bruyns pour l’aide précieuse qu’elle a apporté à la réalisation de ce travail, pour ces conseils constructifs, ses commentaires pertinents et pour son aide lors de la correction de ce manuscrit. Que les dieux de l’orthographe soient toujours avec François et moi. Merci d’avoir jugé mon travail à de très nombreuses reprises avec honnêteté et sincérité. Mes remerciements vont également à mes collègues le Dr Lia Judice, ma grande sœur de labo, le Dr Valérie Elmaleh, le Dr Daphina Draganova, le Dr Magda Bazewicz, le Dr Philippe Koch, qui par leurs encouragements et leurs soutiens ont pleinement contribués à la réalisation de ce travail. A vous tous un grand Merci. Merci à Lise, ancienne doctorante au laboratoire et amie depuis maintenant 5 ans. Merci pour ton amitié et tous les moments partagés au sein ou en dehors du labo. Merci aussi pour tes conseils et ta grande contribution à la mise en page de ce manuscrit. Le regard attentif et esthétique que tu as toujours su porter à mes présentations n’a pas d’égale. Je remercie très particulièrement Olivier, Catherine et Abdel pour leurs aides et leurs grandes disponibilités. A mes parents, mes amis Kaouthar, Alain, Anitha et Mohamed, merci de m’avoir entouré de votre affection et de votre soutien tout au long de ces années de thèse. Votre confiance et vos encouragements m’ont été si précieux pendant tout l’accomplissement de ce travail. Si j’en suis là, c’est grâce à vous. A ma sœur Dorine, ce travail t’est dédié. Me supporter n’est pas toujours facile, mais ton amour, ta patience, ta générosité et ta présence ont été les ressorts indispensables de ce travail. Merci d’être toi et merci d’être là. Makhoul Maya Liste des abréviations AAV: Adeno‐Associated Virus ICAM1: Intracellular Adhesion Molecule ACAID: Anterior Chamber Associated Immune Deviation IFN: Interferon Ag S: Arrestin IL: Intreleukin IPAF: Ice Protease Activating Factor Ag: Antigen IRAK: IL‐1 Receptor‐Associated Kinase AICD: Activation‐ Induced Cell Death AIRE: AutoImmune Regulator IRAK: Interleukin Receptor Associated Kinase IRBP: Interphotoreceptor Binding Protein APECED: Autoimmune PolyEndocrinopathy Can‐
didiasis Ectodermal Dystrophy IRF: Interferon Regulating Factor BCR: B Cell Receptor IκB: Inhibitor of kappa B BHR: Barrière Hémato‐Rétinienne JAK: Janus Kinase CCL: Chemokine (C‐C motif) Ligand LFA1: Lymphocyte Function Associated Antigen CFA: Complete Freund’s Adjuvant LPS: Lipopolysaccharide CIITA: Class II Transactivator LT: Lymphocyte CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité MAI: Maladie AutoImmune CPA : Cell Presenting Antigen MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase CsA : Cyclosporine A MCP1: Monocyte Chimoattractant Protein 1 CTL : Lectine du Type C MIP: Macrophage Inflammatory Protein CTLA4: Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 MyD88: Myeloid Differentiation primary responses gene (88) CXCL: Chemokine (C‐X‐C motif) Ligand DAMP: Damage Associated Molecular Pattern NAIP: Neuronal Apoptosis Inhibition Protease DC: Dendritic cell NALP: Nacht‐LRR and Pyrin‐domain‐containing protein EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis NF‐κB: Nuclear factor κB EPR: Epithelium Pigmentaire Rétinien NK: Natural Killer FADD: Fas Associated Death Domain NLR: Nod Like Receptor Foxp3: Forkhead box p3 NO: Nitric Oxid GAS: Gamma‐Activated Sequence NOD: Nucleotide Binding Oligomérisation G‐CSF: Granulocyte Colony Stimulating Factor NOS2: Nitric Oxide Synthase 2 GITR: Glucocorticoid‐Induced TNFR‐Related pro‐
tein PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern HLA: Human Leukocyte Antigen PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell PD‐1: Programed Death Protein‐1 PECAM1: Platelet Endothelial Cell Adhesion 1 PGN: Peptidoglycan PI3K: Phosphoinositide 3‐kinase PRR: Pattern Recognition Receptor PTX: Pertussis Toxin RAG: Recombination Activating Gene RIP: Receptor Interacting Kinase SOCS: Suppressor Of Cytokine Signaling STAT: Signal Transducers and Activators of Tran‐
scription TAK: TGF‐β‐Activated Kinase TCR: T Cell Receptor TGFβ: Transforming Growth Factor‐β TLR: Toll Like Receptor TNF(R): Tumor Necrosis Factor (Receptor) TRADD: TNF Receptor Death Domain TRAF: TNF Receptor Associated Factor TRIF: TIR‐domain containing adapter inducing IFNβ UAE: Uvéite Autoimmune Expérimentale UIE: Uvéite Induite par Endotoxine VCAM1: Vascular Adhesion Molecule VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor VIP: Vasoactive Intestinal Peptide VKH: Vogt‐Koyanagi‐Harada VLA‐4: Very Late Antigen 4 ZO‐1: Zonula‐Occludens 1 α‐MSH: α‐Melanocyte‐Stimulating Hormone Table des matières
TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................... 1
INTRODUCTION ............................................................................................................................ 3
1.
2.
Anatomie de l’œil
1.1
Anatomie de la rétine ................................................................................................................................. 3
1.2
Les cellules gliales de la rétine .................................................................................................................... 5
1.3
La barrière hémato-rétinienne ................................................................................................................... 5
Le système immunitaire
4.
6
2.1
Introduction ............................................................................................................................................... 6
2.2
Immunité innée.......................................................................................................................................... 6
2.2.1
Barrière physico-chimique
6
2.2.2
Les récepteurs de reconnaissance des pathogènes de l’immunité innée
7
2.2.3
L’œil et l’immunité innée
8
2.2.4
Désordre associé à l’immunité innée : maladies auto-inflammatoires
9
2.3
3.
3
Immunité adaptative .................................................................................................................................. 9
2.3.1
La tolérance centrale
10
2.3.2
Présentation classique d’antigène et activation des lymphocytes T naïfs
11
2.3.3
La tolérance périphérique
12
2.3.4
Régulation de l’immunité adaptative par le système de l’immunité innée
13
2.3.5
Désordre associé à l’immunité adaptative : les maladies auto-immunes
14
Le privilège immun oculaire
15
3.1
Introduction ..............................................................................................................................................15
3.2
Mécanismes impliqués dans le privilège immun oculaire ...........................................................................15
3.2.1
L’ignorance immunologique
16
3.2.2
Inhibition par des substances immunosuppressives
16
3.2.3
Déviation immune associée au segment antérieur
16
Les uvéites
17
4.1
Classification des uvéites ...........................................................................................................................17
4.2
Epidémiologie des uvéites .........................................................................................................................18
4.3
Les uvéites non-infectieuses ......................................................................................................................18
4.4
Les modèles expérimentaux d’uvéites .......................................................................................................20
4.4.1
Uvéite induite par endotoxine (UIE)
20
1
4.4.2
Uvéite autoimmune expérimentale (UAE)
20
4.4.3
Uvéite induite par transfert adoptif de cellules dendritiques (DC-UAE)
21
4.4.4
Uvéite induite par transfert adoptif de LT
22
4.5
5.
6.
Vision générale de la physiopathologie des uvéites auto-immunes ............................................................22
Rôle de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéite non infectieuse
5.1
Introduction ..............................................................................................................................................24
5.2
Effet des cytokines sur les cellules de l’EPR ................................................................................................24
24
5.2.1
Effets de l’IFNγ
24
5.2.2
Régulateur négatif de la signalisation : SOCS
25
5.2.3
Effets du TNFα et de l’IL-1β sur l’EPR
26
5.2.4
Effet de l’IL-17 et de l’IL-22
27
5.2.5
Effet des cytokines proinflammatoires sur les cellules gliales
29
Traitements des uvéites non-infectieuses
30
6.1
Les corticostéroïdes ..................................................................................................................................30
6.2
Les immunosuppresseurs ..........................................................................................................................31
6.2.1
Les antimétabolites
31
6.2.2
Les inhibiteurs des cellules T
31
6.2.3
Les agents alkylants
31
6.2.4
Les agents biologiques
32
6.3
Thérapeutique expérimentale ...................................................................................................................32
6.3.1
Inhibition de l’activation des cellules rétiniennes par transfert de gènes codant pour des cytokines
anti-inflammatoires
32
OBJECTIFS DU TRAVAIL ............................................................................................................... 34
RÉSULTATS ................................................................................................................................. 35
1.
Caractérisation de l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien lors d’uvéite autoimmune expérimentale
2.
Le TNFα inhibe l’expression du CMH II induite par l’IFNγ au niveau des cellules de l’épithélium pigmentaire
rétinien
3.
37
Etude de la surexpression rétinienne du gène SOCS1 dans un modèle murin d’uvéite autoimmune
expérimentale
4.
35
39
Effet de la surexpression stable du gène SOCS1 dans l’activation in vitro d’épithélium pigmentaire rétinien
par des cytokines pro-inflammatoires
41
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................................... 51
RÉSUMÉ ..................................................................................................................................... 77
2
Introduction
1. Anatomie de l’œil
L’œil consiste en 3 couches concentriques entourant un milieu transparent. Il y a tout d’abord
une enveloppe fibreuse cornéo-sclérale. La couche intermédiaire, vasculaire, est l’uvée qui est
constituée de l’iris, du corps ciliaire et de la choroïde. L’iris sépare la chambre antérieure du
cristallin. En arrière de l’iris et du cristallin se trouve la chambre postérieure occupée par le vitré.
Enfin, la couche interne, neurale, est celle de la rétine (figure 1)
1.1 Anatomie de la rétine
Fonctionnellement, la rétine a deux grandes composantes : la neuro-rétine formée de plusieurs
assises cellulaires qui tapissent la partie postérieure du globe oculaire et la couche de
l’épithélium pigmentaire qui est la couche la plus externe de la rétine. Nous allons décrire ses
différentes couches d’arrière en avant (figure2).
L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)
L’EPR est une des couches cellulaires les plus importantes du système visuel, notamment vital à
la survie des cellules photoréceptrices (cônes et bâtonnets). Elle participe à la régulation de la
réponse immunitaire locale ainsi qu’au maintien du privilège immun de l’œil. Elle est constituée
d’une couche monocellulaire de cellules hexagonales et doit son nom à l’apparence brunâtre qui
est dû aux mélanosomes. On estime qu’un œil adulte contient de 4 à 6 millions de cellules de
l’EPR. Postérieurement, l’épithélium pigmentaire repose sur la membrane de Bruch puis la
chorio-capillaire qui sert de support vasculaire au tiers externe de la rétine. Latéralement, les
cellules de l’EPR sont reliées entre elles par des zonulae occludentes, et des zonulae adherentes.
Les zonulae occludens constituent des jonctions intercellulaires « serrées » (tight junction)
caractérisées par la fusion des membranes cellulaires de deux cellules adjacentes de l’EPR. Ces
jonctions serrées sont à la base de la barrière hémato-rétinienne externe, puisqu’elles
empêchent le passage passif de molécules, même de petit poids moléculaire de la circulation
choroïdienne vers la rétine neurosensorielle. La surface apicale (antérieure) des cellules de l’EPR
3
Outer Limiting Membrane Inner Limiting (OLM)
Membrane (ILM)
ller
Mu
s
cell
Ganglion cells+ Astrocytes
RPE cells
Bipolar cells
Photoreceptor cells
Figure 1 : Anatomie de l’œil et de la rétine. fait face à l’espace sous-rétinien. L’espace sous-rétinien qui est un espace virtuel est limité
antérieurement par la membrane limitante externe, formée par les zonulae adhérents qui
attachent les photorécepteurs entre eux et à une cellule de Müller voisine.
La couche des photorécepteurs
Les cellules photosensibles de la rétine sont les photorécepteurs représentés par les cônes et les
bâtonnets. Il y a approximativement 100 millions de bâtonnets et 5 millions de cônes dans l’œil
humain. Ils sont composés d’un segment externe, d’un segment interne, d'un noyau et d'une
fibre interne. Les segments externes des photorécepteurs contiennent le pigment visuel, la
rhodopsine ; ils baignent dans la matrice interphotorécepteur et sont entourés par les villosités
des cellules de l’EPR. La fonction des photorécepteurs est de convertir l’énergie lumineuse en
influx électrique qui sera propagé par les cellules bipolaires puis par les cellules ganglionnaires,
dont les axones constituent le nerf optique, transmettant l’information jusqu’au cortex visuel.
La membrane limitante externe
Sous la lumière du microscope optique, la membrane limitante externe semble séparer les
articles externes des photorécepteurs de leurs noyaux situés dans la couche nucléaire externe.
On sait grâce à la microscopie électronique que la membrane limitante externe est composée
par les zonulae adhérents qui joignent les cellules de Müller entre elles et avec les
photorécepteurs.
La couche nucléaire externe
Elle contient le soma et le noyau des photorécepteurs.
La couche plexiforme externe
La couche plexiforme externe marque la jonction entre les neurones de premier
(photorécepteurs) et deuxième ordre (cellules bipolaires) de la rétine.
La couche nucléaire externe
Elle est constituée par les noyaux des cellules bipolaires. On y trouve également les noyaux des
cellules horizontales et amacrines qui modulent l'influx visuel venant des photorécepteurs ainsi
que les noyaux des cellules gliales principales de la rétine, les cellules de Müller.
La couche plexiforme interne
4
Internal limiting membrane
Nerve fiber layer
Ganglion cell layer
Neural retina
Inner plexiform layer
Inner nuclear layer
Outer plexiform layer
Outer nuclear layer
Photoreceptors
RPE
Choroid Sclera
Choroid vessel
Figure 2 : Coupe histologique de la rétine.
Section transversale montrant les 10 couches cellulaires de la rétine: l’EPR, la couche des photorécepteurs, la limitante externe, la couche nucléaire externe, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire interne, la couche plexiforme interne, la couche des cellules ganglionnaires, la couche des fibres nerveuses et la membrane limitante interne. Adapté de R. Caspi et al .,2010
La couche plexiforme interne représente les synapses entre les cellules bipolaires et les
neurones de troisième ordre que sont les cellules ganglionnaires. Elle contient également un
abondant réseau vasculaire.
La couche des cellules ganglionnaires
Elle contient principalement les noyaux des cellules ganglionnaires, ainsi que des éléments gliaux
et vasculaires.
La couche des fibres
La couche des fibres est constituée par les axones des cellules ganglionnaires, des cellules gliales
et des gros vaisseaux dérivant de l’artère et de la veine centrale de la rétine.
La membrane limitante interne.
C’est l’élément le plus interne de la rétine : véritable membrane basale sur laquelle repose
l’apposition ininterrompue des pieds des cellules Müller.
1.2 Les cellules gliales de la rétine
Les cellules de Müller, les astrocytes et la microglie constituent le tissu glial rétinien. Les cellules
de Müller sont de grandes cellules qui s’étendent verticalement des photorécepteurs à la
membrane limitante interne. Elles ont une structure complexe avec de nombreuses expansions
cytoplasmiques. Leur noyau se situe dans la couche nucléaire interne. La membrane limitante
externe n’est en fait que la juxtaposition des jonctions intercellulaires étroites et serrées entre
les expansions des cellules de Müller et les segments internes des photorécepteurs. Les cellules
de Müller ne jouent pas seulement un rôle de soutien passif. Elles interviennent dans
l’homéostasie de la matrice extracellulaire et jouent aussi un rôle dans la régulation immunitaire
locale. Il existe 2 autres types de cellules gliales : 1) les astrocytes qui se trouvent dans la couche
des fibres optiques 2) les cellules microgliales (macrophages de la rétine) qui dérivent de
précurseurs hématopoïétiques.
1.3 La barrière hémato-rétinienne
La barrière hémato-rétinienne (BHR) protège anatomiquement la rétine, tissu vulnérable qui n’a
pas la possibilité de se réparer des lésions induites par les cellules inflammatoires infiltrantes1.
Cette BHR est constituée d’une partie interne qui repose sur la présence de jonctions étanches
5
Blood vessel
N
E Müller cell
U
R
O
R
E
T
I
N
A
Internal BRB
External BRB
EPR
EPR
E
P
R
Th17
Choroïd
Th1
Figure 3: La Barrière hémato‐rétinienne (BHR) en situation physiologique.
La BHR est composée de deux parties. La BHR interne repose sur la présence de jonctions serrées entre les cellules endothéliales des vaisseaux rétiniens, renforcées par des extensions des cellules de Müller et des astrocytes. La BHR externe est formée par les jonctions serrées entre les cellules de l’EPR. En situation physiologique, la BHR bloque l’accès des lymphocytes à la neurorétine. des cellules endothéliales rétiniennes renforcées par des extensions des cellules de Müller et des
astrocytes2 . La BHR externe est formée par une couche unicellulaire de l’épithélium pigmentaire
rétinien (EPR) maintenue par des jonctions serrées. Ces BHR limitent l’entrée des cellules et des
molécules venant de la circulation sanguine dans le tissu oculaire et permettent de préserver
l’homéostasie immunologique de l’œil (figure 3).
2. Le système immunitaire
2.1 Introduction
Le terme immunité évoque les mécanismes de défense qu’un organisme développe à l’encontre
des microorganismes. Les fonctions du système immunitaire sont 1) de défendre de l’invasion
des microorganismes tout en tolérant les commensaux 2) d’éliminer les constituants altérés de
l’organisme. Afin d’assurer ces fonctions, deux stratégies différentes ont été développées au
cours de l’évolution. Le système immunitaire inné et adaptatif. L’immunité innée assure une
réponse rapide et identique à chaque rencontre avec un agent pathogène tandis que l’immunité
adaptative (ou acquise ou spécifique) possède une «mémoire ». Cette mémoire immunologique
est une caractéristique exclusive du système adaptatif : l’efficacité de la réponse croit à chaque
nouveau contact avec un même antigène. Un seul contact avec un antigène peut donc être
suffisant pour induire une réponse immunitaire persistante et protectrice. Une collaboration
étroite entre les 2 systèmes est indispensable pour assurer la défense de l’organisme contre les
agents infectieux.
2.2 Immunité innée
2.2.1 Barrière physico-chimique
Afin de prévenir l’entrée des pathogènes dans les tissus, l’organisme dispose de multiples
moyens : des barrières physiques, des flux, des agents chimiques, des substances bactéricides,
une flore commensale, etc. La peau qui est constituée d’un épithélium kératinisé à plusieurs
couches est tout d’abord une formidable barrière naturelle lorsqu’elle n’est pas lésée. L’entrée
de la plupart des pathogènes s’effectue au niveau des épithélio qui tapissent les muqueuses
respiratoires, digestives etc. Un rôle mécanique important est joué à ce niveau par le mucus, qui
est un piège très efficace contre les agents pathogènes dont il inhibe l’adhésion, favorisant leur
6
Pattern Recognition Receptor (PRR)
Family
Cellular location
Toll like receptors (TLRs)
Plasma membranes and endosomes
C‐type lectins (CTLs)
Plasma membrane
Retinoic acid‐inducible gene (RIG‐1)‐like helicase (RHLs)
Cytoplasmic
NOD‐like receptor (NLRs)
Cytoplasmic
Table 1 : Les différents récepteurs PRR et leurs localisations cellulaires élimination par les mouvements ciliés ou le péristaltisme intestinal. Certaines cellules de ces
épithélio produisent rapidement des peptides antimicrobiens, les défensines, dont la synthèse
est induite par des cytokines et des agents infectieux. Elles exercent une activité anti-infectieuse
microbicide (dépolarisation et perméabilisation membranaire) mais surtout, elles amplifient la
réponse inflammatoire et stimulent la réponse immunitaire adaptative. De très nombreuses
autres molécules comme les acides gras de la peau, le lysozyme et la phospholipase A2 des
larmes et de la salive, le pH acide de l’estomac, les enzymes digestives et les sels biliaires du
tractus gastro-intestinal s’opposent directement à l’entrée des pathogènes et participent ainsi à
la défense innée en constituant une barrière chimique et enzymatique. Il est également
important de mentionner le rôle protecteur joué par la flore commensale qui dans certains
organes, entre en compétition avec les pathogènes pour les nutriments et pour la fixation à des
récepteurs spécifiques.
2.2.2 Les récepteurs de reconnaissance des pathogènes de l’immunité innée
L’activation de l’immunité innée qui constitue une première ligne de défense contre les
pathogènes est médiée par des récepteurs PRRs (Pattern recognition Receptor) qui
reconnaissent des motifs hautement conservés présents chez de nombreux pathogènes, appelés
PAMP (Pathogen-Associated Molecular pattern) (tableau1). Les PAMPs sont exclusivement
synthétisés par des microbes pathogènes et commensaux, jamais par leur hôte et sont essentiels
à leur survie. Les récepteurs PRRs sont exprimés sur les phagocytes, les cellules dendritiques
(DC) et de nombreux autres types cellulaires tels que les cellules endothéliales et épithéliales.
Différentes familles de PRR ont été décrites. Les TLRs et les lectines du type C (CTL) sont
exprimés sur la membrane plasmique et endosomiale. Les TLRs qui reconnaissent les acides
nucléiques (ADN et ARN) sont exprimés au niveau cytoplasmique. Les NLRs (Nod Like Receptor)
sont eux aussi exprimés en intracellulaire. Un TLR a été décrit pour la première fois chez la
drosophile comme une protéine transmembranaire intervenant lors du développement
embryonnaire3. Chez l’homme, il existe 13 TLRs qui ont des fonctions différentes selon leur
localisation et les ligands qu’ils peuvent reconnaître4, 5. Ils sont soit exprimés sur la membrane
cellulaire, soit dans le cytoplasme par de nombreuses cellules du système immunitaire (cellule
dendritique, macrophage, lymphocyte T et B, et polymorphonucléaire) mais aussi à la surface de
7
PAMPs
TLR
ADN, ARN Endosome
MyD88
TRIF
NF‐κB
NOD2
TRIF
NOD1
MyD88
TLR
AP‐1
Inflammasone
NLRP‐
IPAF/NAL
P
Cytokines proinfl.
Cleavage
IRF
IFNα, IFNβ
Pro‐caspase
caspase1
Pro‐IL‐1
IL‐1
Figure 4 : Les récepteurs PRRs et leurs voies de signalisation.
Les récepteurs aux PAMPs induisent des voies de signalisation différentes après leur activation par des composantes de la paroi bactérienne mais aussi par des acides nucléiques viraux et bactériens. Ils activent les facteurs de transcription NF‐κB, AP‐1 et IRF qui sont impliqués dans des cascades proinflammatoires. Les pathogènes intracellulaires peuvent également être détectés par d’autres récepteurs, les Nod like receptors (NLRs). Lors de leur activation NOD1 et NOD2 vont s’oligomériser et activer la voie NF‐κB et la voie AP‐1. Ils vont également induire la formation d’un assemblage des récepteurs IPAF/NALP1 et NALP3 appelé inflammasome qui va activer la caspase‐1 et favoriser la maturation et la sécrétion d’IL‐1.
cellules épithéliales6, 7. Ces récepteurs sont activés par des composants de la paroi bactérienne
mais aussi par les acides nucléiques viraux et bactériens. La stimulation des TLRs active la voie du
NF-κB et des MAPK (Mitogen activated protein kinase), induisant la production de molécules
proinflammatoires. La transcription des IRF (Interferon Regulating Factor) est aussi un élément
central lié à l’activation de cette classe de récepteur6, 8, 9 (figure4).
Les récepteurs CTL quant à eux lient le mannose et le glucose et sont principalement exprimés
par les cellules dendritiques et les macrophages. Ils jouent un rôle important dans la dégradation
du microorganisme et la présentation d’antigène en association avec les complexes majeurs
d’histocompatibilité (CMH) qui va activer le système immunitaire adaptatif.
La détection intracellulaire des motifs microbiens n’est pas seulement limitée aux TLRs. Une
autre famille de récepteurs a été identifiée : les NLRs. La famille des NLRs regroupe les sousfamilles des protéines NODs (Nucleotide-binding Oligomerization Domain) des NALPs (NACHTLRR
and
Pyrin-domain-containing
proteins)
et
d’IPAF/NAIP
(Ice-Protease
Activating
Factor/neuronal apoptosis Inhibitor Protease). Ils sont exprimés par de nombreux types
cellulaires et activent le NF-κB, l’IRF (Interferon Regulatory Factor) et les MAPK (Mitogen
Activated Protein Kinase). L’activation de certains NLRs induit l’assemblage des récepteurs
IPAF/NALP1 et NALP3 au sein de l’inflammasome, qui va activer la caspase1, protéine clé dans
l’activation des cytokines proinflammatoires de la famille de l’IL-110, 11.
2.2.3 L’œil et l’immunité innée
L’œil et ses annexes constituent un petit compartiment de l’organisme, particulièrement exposé
et possédant une multiplicité de moyens de défense. Pour la protection oculaire, les barrières
mécaniques sont assurées d’une part par les cils et le clignement des paupières et d’autre part
par les cellules de l’épithélium cornéen qui sont liées par des jonctions serrées et forment une
couche cellulaire protectrice entre milieux intérieur et extérieur. Le film lacrymal, par ces trois
couches (lipidique, aqueuse, et mucinique) constitue quant à lui une barrière chimique vis-à-vis
des pathogènes12. L’œil bénéficie aussi d’un tissu lymphoïde associé aux muqueuses caractérisé
par la production abondante d’anticorps naturels et d’une flore commensale qui empêche
l’implantation de germes pathogènes. Enfin, l’expression par différentes cellules de l’œil de
8
nombreux TLRs et NLRs et leur implication dans la réponse immunitaire innée participe
activement à la protection oculaire13.
2.2.4 Désordre associé à l’immunité innée : maladies auto-inflammatoires
Le concept de maladie auto-inflammatoire fut proposé en 2000 par Galon et al. pour définir des
pathologies inflammatoires chroniques apparaissant en l’absence d’infection et de mise en
évidence d’auto-Ac ou de lymphocytes T autoréactifs, à la différence des pathologies
autoimmunes. Certaines comme la goutte sont d’origine métabolique, d’autres, comme la
maladie de Crohn, sont multifactorielles. Ces pathologies sont associées à une activation
exacerbée du système immunitaire inné. La goutte par exemple est induite par des dépôts de
cristaux d’acide urique au niveau articulaire, qui va activer l’oligomérisation de l’inflammasome
NALP14. Si la maladie de Crohn a de nombreuses causes, l’existence de polymorphismes de NOD2
semble particulièrement influer sur la susceptibilité à développer cette pathologie15,
16
. Les
fièvres périodiques héréditaires sont aussi des maladies auto-inflammatoires. Les mutations qui
en sont responsables sont extrêmement variées, mais conduisent pour la plupart à la sécrétion
non régulée d’IL-1β17.
2.3 Immunité adaptative
La réponse adaptative, seconde ligne de défense est apparue avec les vertébrés à mâchoires il y
a environ 550 millions d’années. Cette transition, brutale, reste encore énigmatique, source de
nombreuses spéculations. L’immunité adaptative repose sur l’expression par les lymphocytes T
et B de récepteurs à l’antigène hautement spécifiques (TCR et BCR). Ces récepteurs sont
composés d’une chaîne α/lourde et d’une chaîne β/légère. Chaque chaîne contient un segment
V (variable) un segment C (constant) et un segment J (Jonction) dont la recombinaison est
assurée par un ensemble d’enzymes portant le nom de recombinase V(D)J composé de protéines
RAG1 et RAG2 (Recombination-Activating gene). Ce processus assez complexe permet de
générer un nombre quasi illimité de TCR/BCR capables de reconnaître un très large répertoire
d’antigènes. Cependant, ce processus aléatoire conduit à l’émergence de clones lymphocytaires
potentiellement autoréactifs (reconnaissant des protéines du soi) et donc dangereux pour
9
l’organisme. Pour pallier à cela, des mécanismes de tolérance centrale sont mis en place afin
d’éliminer ces lymphocytes exprimant des récepteurs autoréactifs.
2.3.1 La tolérance centrale
Les lymphocytes B reconnaissent les antigènes solubles natifs ; les lymphocytes T ne
reconnaissent que des petits peptides qui résultent du processing intracellulaire d’antigènes
natifs qui leur sont présentés en association avec des molécules du complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH) à la surface des cellules présentatrices d’antigène (CPA). La structure
reconnue par le TCR dérive donc à la fois de la molécule du CMH et du peptide antigénique :
l’organisme doit sélectionner d’abord les lymphocytes T qui reconnaissent des molécules du
CMH du soi puis exclure ceux qui reconnaissent des auto-antigènes
18
. Cette sélection en deux
étapes se fait pendant l’ontogenèse au niveau du thymus. Les cellules T, dont le TCR possède
une affinité modérée pour les molécules du CMH présentes à la surface des cellules épithéliales
du cortex thymiques, sont sélectionnées positivement. Près de 95% des lymphocytes T ne seront
pas sélectionnés à ce stade et mourront par apoptose. Ensuite, les lymphocytes T dont le TCR
reconnaît avec une grande affinité un peptide du soi présenté par des molécules du CMH de
cellules dendritiques et de la médullaire thymique seront sélectionnés négativement. Par
ailleurs, les lymphocytes T qui possèdent une affinité intermédiaire pour les molécules du CMH,
sont susceptibles de se différencier en T régulateurs, sur lesquels nous reviendrons
ultérieurement. De plus, il est important de signaler que les thymocytes en voie de
différenciation ont aussi la possibilité d’effectuer, grâce aux recombinases RAG, une réédition de
leur TCR ayant une forte affinité pour un antigène de soi. A la fin de ce processus, les
lymphocytes T autoréactifs auront donc été éliminés et seuls les lymphocytes dont le TCR
reconnaît un peptide du non soi sur un CMH du soi, seront sélectionnés19. Un dernier
mécanisme de tolérance prenant place dans le thymus est l’anergie lymphocytaire qui sera
davantage détaillée dans la partie consacrée à la tolérance périphérique. Une sélection négative
des lymphocytes B autoréactifs a lieu au niveau de la moelle osseuse.
Cette délétion des lymphocytes T autoréactifs induite dans le thymus constitue donc la tolérance
centrale. Néanmoins, de nombreux auto-antigènes ne sont pas présents dans le thymus ou sont
présents en trop faible quantité pour induire une tolérance. Ces antigènes sont appelés
10
IL‐23
Figure 5: Présentation d’antigène et polarisation lymphocytaire en différents sous ‐types. Représentation des différentes lignées cellulaires T auxilliaires impliquées dans la physiopathologie de l’UAE. Adapté de O’Shea J.J et al,2010.
cryptiques et sont typiquement exprimés dans les organes immuns privilégiés. Dans le cas de
l’œil, il s’agit principalement des protéines impliquées dans la phototransduction et le cycle des
rétinoïdes
20
. Malgré la tolérance centrale, il existe donc des lymphocytes T et B qui
reconnaissent des auto-antigènes. Les mécanismes qui inhibent l’activation pathologique de ces
lymphocytes T et B autoréactifs constituent la tolérance périphérique que nous développerons
après avoir introduit la présentation antigénique.
2.3.2 Présentation classique d’antigène et activation des lymphocytes T naïfs
Après leur développement dans le thymus, les lymphocytes T naïfs circulent entre la circulation
sanguine et les organes lymphoïdes secondaires. Ils expriment soit le marqueur CD4
(lymphocytes T helper), soit CD8 (lymphocyte T cytotoxique) selon qu’ils sont prêts à reconnaître
un antigène dérivé d’un pathogène extracellulaire ou intracellulaire18. Les seules CPA capables
d’activer des lymphocytes T naïfs sont les cellules dendritiques ; les macrophages et les
lymphocytes B peuvent également agir comme CPA, mais pas pour induire des réponses
primaires. Il est également bien établi que la présentation d’antigènes aux lymphocytes T
implique deux signaux21. Le premier signal constitue la présentation d’antigène en elle-même et
est délivré par l’engagement du complexe TCR/CD3 à la surface du lymphocyte T avec le peptide
antigénique présenté par les molécules du CMH à la surface de la CPA. Les lymphocytes T CD4
reconnaissent les peptides liés aux CMH de classe II et les lymphocytes CD8 ceux liés aux CMH de
classe I. Un deuxième signal est donné par l’interaction des molécules co-stimulatrices, B7.1
(CD80) et B7.2 (CD86) exprimés sur la CPA et leur ligand CD28 exprimé par la cellule T. De plus,
l’interaction du CD40 avec son ligand le CD40L (CD154) est requise pour une activation complète
des lymphocytes T, puisque l’engagement du CD40 à la surface de la CPA induit une
augmentation de l’expression des molécules co-stimulatrices. Le premier et deuxième signal
sont indispensables et communs à toute présentation classique d’antigène. Par contre, le type
de cytokines sécrétées par la CPA peut varier et est capital pour la différenciation du lymphocyte
activé22. En effet, selon la nature des cytokines présentes lors de cette activation, l’IL-12, l’IL-4,
l’IL-6/TGFβ ou TGFβ, les précurseurs CD4+ se différencient respectivement en cellule Th1, Th2,
Th17 et Treg23(figure5). Le premier critère qui permet de différencier ces sous-classes de LT
helper est le profil cytokinique qu’elles expriment. Les TCD4 Th1 sécrètent de l’IL-2, de l’IFNγ et
11
du TNFα tandis que les TCD4+ Th2 sécrètent plutôt de l’IL-4, 5, 10 et 13 et les Th17 de l’IL-17A-F,
de l’IL-21 et de l’IL- 22 et les T regs du TGFβ et de l’IL-10. D’un point de vue fonctionnel, la
réponse Th1 stimule l’immunité cellulaire et participe à la défense contre les microorganismes
intracellulaires, tandis que la réponse Th2 stimule l’immunité humorale et permet de lutter
contre les infections aux helminthes. Le sous-type Th17 quant à lui semble impliqué dans la lutte
contre les microorganismes extracellulaires par l’induction d’une réponse plutôt granulocytaire.
Le sous-type Th2 est souvent associé aux réponses allergiques, tandis que les cellules Th1 et
Th17 semblent impliquées dans de nombreuses maladies auto-immunes, telles que la sclérose
en plaques, la polyarthrite et aussi les uvéites24-26.
2.3.3 La tolérance périphérique
Comme nous l’avons vu, certains lymphocytes T autoréactifs échappent à la sélection thymique
et sont normalement maintenus quiescents par des mécanismes de tolérance périphérique.
Les 4 mécanismes de tolérance périphérique qui peuvent s’exercer sur les lymphocytes T sont
l’anergie, la délétion clonale par apoptose, l’ignorance immune et l’immunorégulation.
L’anergie est définie comme l’inactivation fonctionnelle des lymphocytes T qui survient lorsque
ces cellules reconnaissent des antigènes en absence de costimulation. Dans ces conditions, les
récepteurs d’antigène des lymphocytes T (TCR) peuvent perdre leurs capacités à transmettre des
signaux activateurs, ou peuvent engager préférentiellement un de leurs récepteurs inhibiteurs
de la famille de CD28, CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4) ou PD-1 (Programmed Death
Protein-1).
Un autre mécanisme de tolérance périphérique est la délétion clonale par apoptose. Deux
mécanismes d’apoptose sont impliqués dans la délétion clonale des lymphocytes T : d’une part
l’apoptose passive lorsque les cellules T sont privées de facteurs de croissance (IL-2, IL-4, IL-9, IL15, IL-21) permettant l’activation de facteurs anti-apoptotiques, d’autre part l’apoptose active
induite par la fixation de l’IL-2 sur son récepteur (Activeted Induced Cell Death). De plus, la
reconnaissance des autoantigènes peut entraîner la coexpression des récepteurs de mort et de
leurs ligands. Le récepteur de mort le mieux connu est une protéine FAS qui est exprimée sur de
12
nombreux types cellulaires et le ligand de Fas (FasL), qui est exprimée surtout sur les
lymphocytes T activés.
L’ignorance immune qui est liée à la compartimentalisation des cellules immunitaires participe
également à la tolérance périphérique. Un lymphocyte autoréactif naïf ne migre pas vers les
organes périphériques ; il circule uniquement entre le sang, la rate et les ganglions. Ainsi, si
l’autoantigène est présents dans un organe solide et qu’il ne gagne jamais les ganglions, les
lymphocytes autoréactifs ne pourront jamais être activés et ne migreront donc pas dans le tissu
potentiellement cible de la réaction auto-immune.
L’immunorégulation est le dernier mécanisme de tolérance périphérique. Il correspond à la
suppression de la prolifération et de l’activation de clones T autoréactifs par les lymphocytes T
régulateurs (cellules T CD4+CD25high) et par les cellules NK27, 28. Leur mécanisme d’action est
décrit par certains auteurs comme étant dépendant d’un contact cellulaire 29, 30 ; pour d’autres, il
dépend d’une sécrétion d’IL-10 ou de TGFβ (Transforming Growth Factor-β), de même que
l’intervention de molécules membranaires notamment celle la molécule CTLA4 et du GITR
(Glucocorticoid-Induced Tumor-necrosis factor like Receptor). Enfin, le développement et la
fonction de ces cellules dépendent d’un facteur de transcription Foxp3 mais aussi de l’IL-2. Des
mutations du gène Foxp3 chez l’homme et la souris causent une maladie auto-immune
systémique qui touche plusieurs organes.
2.3.4 Régulation de l’immunité adaptative par le système de l’immunité
innée
Une avancée importante dans la compréhension du fonctionnement du système immunitaire a
été apportée par Charles Janeway qui a proposé qu’un des aspects du système immunitaire inné
est d’informer le système immunitaire adaptatif sur la nature de l’antigène 31. Il est important de
se rappeler à ce stade qu’un antigène peut dériver d’une protéine du soi, d’une protéine
symbiotique ou d’un agent pathogène. La théorie de Janeway prédit l’existence des PRRs et
postule que leur activation pourrait aider les cellules présentatrices d’antigène à distinguer entre
les antigènes infectieux et les antigènes non infectieux. Cette hypothèse est aujourd’hui
largement acceptée et le rôle des PRRs dans la formation de la réponse immunitaire adaptative
13
est bien démontré32. Dans ce contexte, il a été montré que différents TLRs régulent de façon
différentielle la synthèse des membres de la famille de l’IL-12 (IL-12p70, IL-23 et IL-27) et ainsi
orientent la différenciation de l’immunité adaptative vers un profil Th1, Th2 ou Th1733. Fait
intéressant, l’hypothèse de Janeway a été étendue à un modèle de danger plus généralisé par
Matzinger
34
. Dans cette théorie du danger, le signal qui informe la cellule sur la nature de
l’antigène ne passe pas uniquement par les PAMPS, mais est élargi à d’autres molécules
produites lors de lésions tissulaires ou de mort cellulaire. En référence au nom de PAMPs, le
terme DAMPs (Damage-Associated Molecular pattern molecules) a été introduit pour définir
cette nouvelle famille de signaux endogènes qui sont aussi connus sous le nom d’alarmines. En
conséquence, une série de molécules endogènes (cristaux d’urates, des nucléotides etc) ont des
propriétés adjuvants ou proinflammatoires 35. Des données récentes ont mis en évidence que les
cellules non-hématopoétiques jouent également un rôle important dans la détection de signaux
de danger et dans la manière dont ils façonnent la réponse immunitaire adaptative36. Pour
terminer, on peut donc conclure que la manière dont le système immunitaire innée traduit le
contexte de la présentation antigénique module la réponse de l’immunité adaptative.
2.3.5 Désordre associé à l’immunité adaptative : les maladies auto-immunes
Les maladies autoimmunes (MAI) sont des atteintes chroniques qui résultent de la rupture de la
tolérance des LT vis-à-vis des antigènes de soi. Elles touchent environ 5 à 7% de la population
dans les pays occidentaux37; on en connaît plus de 40 et quasiment tous les organes peuvent
être touchés. Ces pathologies peuvent être classées en MAI spécifiques d’organes et MAI
systémiques. Cette classification s’appuie sur des critères cliniques. Les MAI spécifiques d’organe
ont une expression limitée à un organe (sclérose en plaque et certaines uvéites). Les MAI
systémiques, quant à elles affectent plusieurs organes. Les MAI se différencient également en
fonction de l’origine des lésions observées au cours de ces atteintes. Celles-ci sont les
conséquences soit d’une réponse immunitaire humorale où les lésions sont secondaires à la
présence d’autoanticorps pathogènes, soit cellulaire où les LT sont responsables des lésions. Les
MAI sont d’origines multifactorielles impliquant à la fois des facteurs génétiques et des facteurs
environnementaux. Les MAI sont parfois d’origine monogénique comme le syndrome APECED,
lié à une mutation du gène AIRE codant pour un facteur de transcription, qui régule l’expression
14
thymique de certains antigènes. Cependant, la plupart des MAI sont d’origine multigénique. Leur
développement dépend de la présence de plusieurs gènes de susceptibilité et de l’interaction
entre ces gènes qui donnent à un individu une susceptibilité à développer la maladie. Le
développement d’une encéphalomyélite autoimmune par exemple est associé à la présence
d’une dizaine de loci de susceptibilités différentes38. Différents facteurs environnementaux
responsables du développement de MAI ont été impliqués : des agents infectieux, des agents
toxiques, des agents médicamenteux. Ces agents peuvent mimer des antigènes du soi
(mimétisme moléculaire) et modifier la réponse immunitaire.
3. Le privilège immun oculaire
3.1 Introduction
En 1873, Van Dooremal montre que des cellules tumorales humaines prolifèrent dans la
chambre antérieure d’œil de lapins, mais nulle part ailleurs dans le corps. Ces expériences sont
répétées et étendues à d’autres espèces animales par Peter Medawar qui crée le terme de
« privilège immun » pour désigner cette tolérance inattendue de greffons au niveau de certains
organes39. A l’époque, Medawar considérait que le privilège immun était dû à une ignorance
immunologique. Du fait de l’absence de drainage lymphatique de l’œil et de l’existence d’une
BHR, l’hypothèse était que le matériel antigénique était séquestré à l’intérieur de l’œil et qu’en
conséquence le système immunitaire ignorait simplement sa présence. Des travaux plus récents,
réalisés par Streilein ont démontré sans équivoque que la séparation entre le système
immunitaire et l’œil ne représentait qu’une partie du phénomène complexe du privilège
immun40. En effet, il a été bien établi que le privilège immun est aussi le résultat de mécanismes
actifs impliquant d’une part des cellules résidentes de l’œil et d’autre part, l’expression
thymique des antigènes rétiniens et leur contrôle sur le répertoire des cellules T spécifiques
d’antigènes oculaires.
3.2 Mécanismes impliqués dans le privilège immun oculaire
Le modèle actuel du privilège immun oculaire repose sur l’association des trois éléments :
l’ignorance immunologique, la sécrétion des substances immunosuppressives solubles et
membranaires et l’ACAID (Anterior chamber associated immune deviation).
15
3.2.1 L’ignorance immunologique
La chambre postérieure de l’œil est séparée du système immunitaire par une barrière hématorétinienne composée de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et des cellules endothéliales des
vaisseaux rétiniens renforcées par les prolongements de cellules de Müller. En outre, bien que la
surface externe de l’œil et l’espace sous-conjonctival soient drainés par la lymphe jusqu’aux
ganglions régionaux, les autres structures oculaires, notamment les plus internes, ne sont pas
drainées par la lymphe.
3.2.2 Inhibition par des substances immunosuppressives
Bien que la BHR empêche le passage des protéines, elle est moins efficace pour prévenir
l’infiltration des lymphocytes activés41. Cependant, les lymphocytes entrant dans l’œil sont
confrontés à un environnement peu propice à leur activation. Premièrement, l’œil comporte
très peu de cellules exprimant des molécules du CMHII pouvant jouer le rôle de cellules
présentatrices d’antigène. Deuxièmement, les cellules résidentes oculaires(les cellules gliales de
Müller, les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, les cellules endothéliales de la cornée et
les cellules épithéliales du corps ciliaire et de l’iris) sont capables d’inhiber l’activation
lymphocytaire par des mécanismes impliquant des molécules membranaires42-45.Parmi celles-ci
on note une forme membranaire du TGF-β, le FasL, le CTLA4, la galectine et la
thrombospondine42,
46, 47
. Troisièmement, les fluides oculaires sont riches en molécules
immunosuppressives notamment le TGF-β, α-MSH ou le VIP produit par ces cellules oculaires48.
Ces facteurs solubles inhibent non seulement l’activation des lymphocytes mais aussi des
cellules de l’immunité innée comme les cellules NK, les macrophages, les polynucléaires
neutrophiles
49
. Enfin, les inhibiteurs de l’activation du complément sont exprimés de façon
constitutive et fonctionnelle dans l’œil50,
51
. Leur rôle dans le maintien de l’environnement
immunosuppresseur oculaire est démontré par l’augmentation de l’inflammation en leur
absence52, 53.
3.2.3 Déviation immune associée au segment antérieur
Le dernier mécanisme expliquant le privilège immun oculaire concerne le phénomène connu
sous le terme de « Anterior Chamber-Associated Immune Deviation » (ACAID). Une protéine
16
étrangère injectée dans la chambre antérieure de l’œil n’est pas ignorée par le système
immunitaire, au contraire, elle induit une déviation de la réponse immune caractérisée par une
diminution des réactions d’hypersensibilité retardée, l’induction d’une réponse à anticorps et la
différenciation/activation de cellules T régulatrices. L’induction de l’ACAID nécessite la migration
de CPA de la chambre antérieure de l’œil vers la rate. Au niveau splénique, elles recrutent des
cellules T natural killer par le biais de la production de MIP2 (Macrophage inflammatory protein
2). Les lymphocytes B de la zone marginale sont aussi nécessaires à la mise en place de
mécanismes qui culminent avec la production de cellules TCD4 et TCD8 régulatrices. Les
premières inhibent l’induction de la réponse immunitaire afférente, alors que les secondes
inhibent son expression (réponse immunitaire efférente). Les antigènes placés dans l’espace
sous-rétinien induisent une déviation de la réponse immunitaire similaire à l’ACAID54, 55.
4. Les uvéites
4.1 Classification des uvéites
L’uvéite est une pathologie fréquente caractérisée par l’atteinte inflammatoire de l’uvée ainsi
que, dans certains cas, des structures oculaires adjacentes : le vitré, la rétine ou le nerf optique.
Les uvéites relèvent d’étiologies très diverses et sont souvent de cause indéterminée ou
idiopathique. Dans le cas où une étiologie est retrouvée, 4 catégories d’uvéites peuvent être
distinguées : les uvéites infectieuses (groupe des herpes virus, toxoplasmose, tuberculose,
syphilis, maladie de Lyme, brucellose, bartonellose etc.) les uvéites non infectieuses, secondaires
à une maladie systémique (spondylarthrite ankylosante, rhumatisme psoriasique, uvéite liée à
HLA B27, arthrite juvénile idiopathique de l’enfant, sarcoidose, maladie de Behçet, syndrome de
Vogt-Koyanagi-Harada, sclérose en plaques) à des entités ophtalmologiques supposées non
infectieuses (chorioretinopathie de Birdshot) et à des causes médicamenteuses (rifabutine,
etanercept, sulfamides)56,
57
. Lorsqu’aucune cause n’est retrouvée, on parle d’uvéites
idiopathiques et on considère qu’il s’agit d’une atteinte autoimmunitaire limitée à l’œil.
Actuellement, la classification des uvéites la plus utilisée en clinique est anatomique
(http://research.mssm.edu/sun). Elle est basée sur la localisation principale de l’inflammation
intraoculaire. On définit ainsi l’uvéite antérieure qui est associée à une atteinte de l’iris et du
corps ciliaire, l’uvéite intermédiaire qui est caractérisée par des signes inflammatoires au niveau
17
du corps ciliaire, de la pars plana et de l’extrême périphérie rétinienne et l’uvéite postérieure où
les signes inflammatoires sont au niveau de la rétine et de la choroïde. Enfin, le terme panuvéite
implique une atteinte de toutes les parties de l’œil, les structures situées en avant,
intermédiaires et en arrière.
4.2 Epidémiologie des uvéites
Les études portant sur l’épidémiologie de l’uvéite sont rares et souvent biaisées. La prévalence
totale (nombre de patients atteints ou ayant été atteints dans la population) a été estimée à 38
cas pour 100.000 en France dans les années 1980 et varie selon les études et les pays de 68 à
730 pour 100.00058, 59. Quant à l’incidence annuelle (nombre de patients atteints par an dans la
population), elle varie de 11 à 7 pour 100.000 habitants avec un pic entre 20 et 50 ans 60, 61. Sur
l’ensemble des uvéites, le sex-ratio est proche de 1 mais il varie en réalité fortement en fonction
de l’âge et des étiologies. Les uvéites sont essentiellement une maladie de l’adulte survenant à
un âge situé entre 20 et 40 ans 62. Quant à la distribution des étiologies elle varie nettement en
fonction des pays et cette variabilité est retrouvée pour presque toutes les formes anatomiques
d’uvéites63. En effet, plusieurs études ont montré que les atteintes antérieures sont les plus
fréquentes dans le monde occidental, alors que les données sont très différentes en Asie ou les
panuvéites sont les plus courantes64. Les raisons de ces différences sont multiples faisant à la fois
intervenir des critères génétiques et environnementaux. A l’heure actuelle, les uvéites non
infectieuses représentent deux tiers des causes d’uvéites chroniques dans les centres de
référence.
4.3 Les uvéites non-infectieuses
Les uvéites non-infectieuses sont une des principales causes de cécité dans les pays
industrialisés. Elles touchent 2 millions d’Américains et à l’origine de 10% d’handicap visuel aux
USA65. Certaines formes comme l’ophtalmie sympathique ou la maladie de Birdshot ne touchent
que l’œil alors que d’autres sont associées à des maladies systémiques comme la maladie de
Behçet, la sarcoïdose ou la maladie de Vogt-Koyanagi Harada. L’ensemble de ces uvéites sont
généralement considérées comme auto-immune. On retrouve effectivement plusieurs
arguments plaidant en faveur de phénomènes auto-immuns chez les patients atteints d’uvéite
18
non infectieuse. Premièrement, ces patients développent fréquemment une réponse
lymphocytaire à l’encontre de différents antigènes rétiniens (AgS, IRBP). Une telle autoréactivité
est également retrouvée chez les sujets sains. Néanmoins, le nombre de lymphocytes
spécifiques des antigènes rétiniens dans le sang des patients semble être supérieur aux sujets
sains66.
Deuxièment, il existe une forte association entre de nombreuses uvéites et certaines molécules
du complexe majeur d’histocompatibilité. Les plus frappantes sont l’association entre
l’ophtalmie sympathique et le VKH (réponse immune contre la mélanine) avec la molécule HLADR4 et la maladie de Birdshot avec la molécule HLA-A29 (réponse immune contre l’arrestine)67,
68
.
Troisièmement, de nombreuses données accumulées ces dernières années démontrent
l’implication et la prédominance des lymphocytes effecteurs TCD4+ de sous-type Th1 lors de ces
uvéites69,
70
.Si pendant de nombreuses années, le concept physiologique de l’uvéite a été
dominé par le rôle majeur des lymphocytes Th1, des données récentes ont clairement impliqué
le rôle des lymphocytes Th17 chez l’homme dans des uvéites autoimmunes comme la maladie
de Behçet, la maladie de Vogt Koyanagi Harado, et la maladie de Birdshot71-73.
Enfin, l’effet bénéfique des traitements ciblant l’activation des lymphocytes T (Cyclosporine A,
daclizumab) est également un argument en faveur du rôle de l’autoimmunité dans le
développement des uvéites non infectieuses. Néanmoins, il a été récemment démontré que
l’auto-inflammation participait également au développement d’uvéite non infectieuse chez
certains patients. Le meilleur exemple est certainement donné par les patients atteints du
syndrome de Blau, syndrome associé à une mutation de NOD2, dont le tableau caractéristique
comporte une uvéite. La vision actuelle, est que les uvéites non infectieuses représentent un
groupe très hétérogène où certaines formes sont plus médiées par des composantes
d’autoimmunité et d’autres par des composantes d’auto-inflammation. De manière élégante les
différents composants d’autoimmunité et d’auto-inflammation se retrouvent dans les différents
modèles expérimentaux d’uvéites. Nous allons discuter brièvement certains de ces modèles en
se concentrant sur leurs spécificités et leurs limites (figure6).
19
Uvéite non infectieuse :
Autoimmune ou autoinflammatoire ?
Autoimmune
Adoptive transfer
of EAU
Auto-inflammatoire
Experimental
autoimmune
uveitis (EAU)
Endotoxin
experimental uveitis
(EU)
Blau syndrome
Uveitis during
MS(Multiple
sclerosis)
Idiopathic
WDS
…
SPA (Spondylarthritis)
Sarcoidosis
Figure 6a: Uvéite non infectieuse: autoinflammatoire ou autoimmune
Les uvéites non infectieuses représentent un ensemble de maladies très hétérogène ou certaines formes sont plus médiées par des composantes d’autoimmunité et d’autres par des composantes d’autoinflammation. Le meilleur exemple est certainement donné par les patients atteints du syndrome de Blau où la seule composante autoinflammatoire est suffisante pour générer une uvéite.
Experimental autoimmune uveitis
PTX
CFA
IRBP
C57BL/6
EAU
J0
J21
CPM
LT proliferation
unstimulated
IRBP stimulated
Adoptive transfer
Pathogen pattern induced uveitis
IRBP activated lymphocytes Th1/Th17
J0
PAMPs: LPS
Uveiti
s
J18
Uveiti
s
24h
48h
Figure 6: Modèles expérimentauxd’uvéites Une uvéite peut être induite expérimentalement en utilisant des mécanismes auto‐immuns (transfert adoptif de lymphocytes autoréactifs), autoinflammatoires (PAMPs, LPS) ou les deux composantes (UAE).
4.4 Les modèles expérimentaux d’uvéites
4.4.1 Uvéite induite par endotoxine (UIE)
Rosembaum et ses collègues sont les premiers à avoir décrit une uvéite antérieure aiguë chez les
rats à la suite d’injection d’endotoxine dans le coussinet plantaire ( UIE)74. Ce modèle met en jeu
essentiellement les composants du système immunitaire inné et est caractérisé par une rupture
de la barrière hémato-oculaire, l’infiltration intraoculaire de cellules inflammatoires et par la
production de cytokines et chimiokines inflammatoires. Actuellement, beaucoup de données ont
été rapportées sur l’implication du TLR4 ainsi que sur les molécules adaptatrices MyD88 et TRIF
dans le développement de l’UIE 75. Par ailleurs, d’autres TLRs comme les TLR2, TLR4 et TLR9 sont
liés à des pathologies inflammatoires qui sont souvent associées à des uvéites76. Des études
récentes se sont intéressées à l’implication d’autres composants bactériens dans le
développement de l’inflammation intraoculaire. Le PGN (peptidoglycan) motif présent dans
toutes les parois des bactéries intracellulaires Gram+ et Gram- semble bien pouvoir déclencher
de l’inflammation oculaire mais les mécanismes par lesquels il opère ne sont pas entièrement
compris. On sait tout de même que ces PGN se fixent sur un des membres de la famille des
NLRs, NOD277.
4.4.2 Uvéite autoimmune expérimentale (UAE)
Wacker et al ont décrit le premier modèle animal d’UAE en 1965 en immunisant des cochons
d’Inde avec des extraits rétiniens. Cela a conduit à la découverte en 1977 du premier autoantigène rétinien, l’arrestine78. En 1986, Igal Gery et ses collaborateurs sont les premiers à avoir
identifié les propriétés fortement uvéitogéniques de l’IRBP chez les rats79. L’IRBP est une
protéine impliquée dans le transport de la vitamine A entre les cellules photoréceptrices et les
cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. L’IRBP s’est avéré être aussi très pathogénique
dans plusieurs souches de souris couramment disponibles. Néanmoins, comme chez l’homme, la
souris doit avoir un fond génétique permissif pour développer une uvéite. Les haplotypes H2
susceptibles sont H2r, H2k et H2b dans l’ordre de susceptibilité forte à modérée respectivement
chez les souris B10RIII>B10BR>C57BL/6. La susceptibilité des souches est dépendante de gènes
du CMHII. Il est évident que le CMHII n’intervient que de façon partielle dans la prédisposition
20
génétique, l’influence des gènes non-CMH (répertoire T, régulation hormonale et régulation des
cytokines et médiateurs inflammatoires) jouant également un rôle important dans leur
développement.
Pour l’induction de l’UAE, l’IRBP est émulsifié dans l’adjuvant complet de Freund (contenant des
Mycobacterium tuberculosis tuées). Par ailleurs, l’injection péritonéale de toxine de pertussis
est aussi nécessaire dans la plupart des modèles. Il existe différents peptides de l’IRBP qui sont
uvéitogènes. L’IRBP 161-180 est connu pour induire une uvéite sévère chez les souris de souche
B10RIII, impliquant principalement le pôle postérieur avec un détachement rétinien chez la
majorité des souris80. Le peptide 1-20 (et 1-16) cause des uvéites postérieures modérées chez les
souris C57Bl/6. Dans ce modèle, il y a activation de clones de lymphocytes autoréactifs Th1 et
Th17 avec une prédominance du sous-type Th17. Ces lymphocytes vont ensuite migrer au niveau
oculaire, reconnaître leur antigène, activer des cellules résidentes et des macrophages. Le profil
histologique est caractérisé par un infiltrat riche en neutrophile 81. Ce modèle est fortement
dépendant de l’effet adjuvant du CFA et du PTX qui donne définitivement une place à l’immunité
innée et à l’auto-inflammation dans le développement de l’UAE.
4.4.3 Uvéite induite par transfert adoptif de cellules dendritiques (DC-UAE)
L’UAE peut être aussi induite non plus par injection directe de l’antigène émulsifié dans du CFA
mais
par injection de cellules dendritiques (cellules professionnelles dans la présentation
antigénique) préalablement maturées (anti-CD40 et LPS in vitro) et pulsées avec de l’IRBP 16118082. Ce modèle diffère du modèle classique de l’IRBP parce que d’une part il est indépendant
de l’effet adjuvant (CFA/PTX) et d’autre part il est caractérisé par un influx de cellules T qui
produisent de grandes quantités d’IFNγ et très peu d’IL-17. Quand on immunise des souris
déficientes pour le gène de l’IFNγ par des DC pulsées à l’IRBP on protège contre la maladie
malgré une forte production d’IL-1781. Il est dès lors possible que l’utilisation d’adjuvants dans
certains modèles animaux de maladie autoimmune telle que l’EAE ou l’UAE pourrait biaiser
l’importance de l’IL-17 et expliquer les différences entre les modèles.
21
4.4.4 Uvéite induite par transfert adoptif de LT
Il est possible d’induire l’UAE, chez des souris naïves (non immunisés), en transférant les
lymphocytes Th1 ou Th17
provenant de souris immunisées par l’IRBP. En pratique, ces
lymphocytes sont isolés à partir de la rate et des ganglions des souris immunisés puis restimulés
in vitro. Les lymphocytes autoréactifs Th1 et Th17 sont ainsi amplifiés avant d’être transférés
dans une souris naïve. Par ailleurs, durant la période d’amplification, il est possible de les
polariser en un sous-type Th1 ou Th17 et donc de réaliser des transferts adoptifs Th1 ou Th17. La
polarisation vers un modèle Th1 est caractérisée par un infiltrat riche en macrophages et riche
en neutrophiles dans la polarisation Th1781. Les signes cliniques sont plus précoces, car les
lymphocytes transférés sont préalablement activés au sein des souris donneuses et restimulés in
vitro. L’utilisation de cette méthode a permis de déterminer le nombre minimal de lymphocytes
activés nécessaires pour induire l’UAE. De plus, il est possible de moduler, dans une certaine
limite, la sévérité de la maladie en variant le nombre de cellules Th1 ou Th17 injectées41, 83.
4.5 Vision générale de la physiopathologie des uvéites auto-immunes
La propension à développer une uvéite auto-immune est intimement liée aux lymphocytes T
autoréactifs qui reconnaissent les tissus rétiniens comme des tissus étrangers. L’élimination
incomplète des lymphocytes T effecteurs spécifiques d’antigènes rétiniens dans le thymus,
combinée au défaut des mécanismes de tolérance périphérique conduit à la circulation d’un
pool de cellules T non tolérisées. En effet, la séquestration des antigènes rétiniens et leur
séparation du système immunitaire par des barrières rétiniennes empêchent la libre circulation
des cellules entre l’œil et le reste l’organisme. Ainsi, les lymphocytes périphériques circulant
n’ont aucune chance de rencontrer les antigènes rétiniens dans des conditions normales noninflammatoires et n’ont donc aucune chance d’être tolérisés par ce biais. L’activation de ces
lymphocytes non tolérisés aura lieu donc en périphérie après exposition à un antigène rétinien
libéré au décours d’un trauma oculaire (ophtalmie sympathique) ou par cross-présentation d’un
antigène de micro-organisme mimant un antigène oculaire. De tels antigènes mimant les
antigènes oculaires ont été décrits84. L’œil semble donc extrêmement dépendant des
mécanismes de tolérance au soi qui ont lieu dans le thymus. La présence d’antigènes rétiniens
22
dans le thymus a été démontrée pour la première fois par l’équipe d’Egwagu 85. Ces auteurs ont
montré que le niveau d’expression thymique de l’antigène S et de l’IRBP dans différentes
souches de souris était inversement corrélé à la prédisposition des animaux à l’UAE induite par
un même antigène. Ainsi, les souches résistantes à l’UAE expriment des niveaux plus élevés
d’IRBP dans le thymus que les souches sensibles. Les souris greffées avec un thymus de souris
IRBP-KO développent des UAE très sévères avec des faibles doses d’IRBP. Une situation similaire
est observée chez les souris déficientes en gène AIRE, un facteur de transcription régulant
l’expression des antigènes rétiniens dans le thymus86. Les souris déficientes en AIRE développent
des auto-anticorps anti-rétinien spécifiques d’Ag exprimés au niveau de la couche des
photorécepteurs. En outre, ces souris présentent des infiltrats rétiniens associés à des
altérations des photorécepteurs, histologiquement très proches de ceux observés au cours de
l’UAE classique87. Inversement, des études récentes montrent que l’expression d’un Ag rétinien,
dans un environnement non-privilégié, induit une tolérance immune et protège contre le
développement de l’UAE. Ainsi la tolérance périphérique serait le maillon faible, incapable de
compenser les défauts de la tolérance centrale responsable de l’émigration de cellules T
spécifiques d’antigènes rétinien en périphérie. Ces cellules T non tolérisées pourraient être alors
activées par l’exposition à un antigène rétinien ou à un épitope croisé en présence d’agents
adjuvants provenant d’une infection ou d’une réponse inflammatoire concomittante. Malgré la
présence de T régulateurs naturels, si une quantité suffisante de cellules effectrices sont
activées, elles vont migrer jusqu'à l’œil. Des données de l’équipe de R.Caspi semblent montrer
que les premières cellules T uvéitogènes qui entrent dans l’œil le font de manière aléatoire41.
Dans le modèle du rat, des marquages par un fluorochrome ont montré que les lymphocytes T
activés spécifiques ou non-spécifiques de l’AgS pénètrent dans l’œil avec la même fréquence.
Les cellules non spécifiques disparaissent rapidement et l’œil redevient normal. Par contre les
cellules T spécifiques de l’AgS restent dans les tissus oculaires et plusieurs jours plus tard, l’œil
développe une uvéite destructrice. L’induction de l’UAE implique donc la reconnaissance de l’Ag
in situ. Dans un œil sain le trafic libre de cellules et molécules est rendu difficile par la présence
de la BHR. Comment les premières cellules T spécifiques de l’Ag rétinien traversent-elles les
barrières ? Il est important de garder à l’esprit que les cellules T activées sont collantes,
23
Central tolerance
spleen
IRBP+mTEC
s
nTreg induction
nTreg
Peripheral tolerance
iTreg
« Escapes »
APC
IL‐12, IL‐23, IL‐6, TGFβ
Th1
Innate stimuli: PTX,LPS ..
IS
E IT
UV
Migration and infiltration Chemokines, adhesion molecules
Th17
Figure 7 : Autoimmunité oculaire. L’élimination incomplète des lymphocytes T effecteurs dans le thymus, combinée au défaut des mécanismes de tolérance périphérique conduit à la circulation d’un pool de cellules T autoréactive non tolérisées. Les cellules T régulatrices naturelles (nTreg) sont exportées du thymus en même temps que les cellules T autoréactives (Th1/Th17) permettant ainsi le contrôle de ces dernières. Les cellules T effectrices activées migrent au niveau tissulaire après avoir traversée l’endothélium des vaisseaux, y compris dans l’oeil. La reconnaissance spécifique de leur antigène dans le tissu est suivie par la rupture de la BHR, l’amplification du recrutement de lymphocytes et du processus inflammatoire au niveau oculaire aboutisant à l’uvéite clinique. Les antigènes rétiniens libérés à partir des tissus lésés induisent au niveau splénique la génération de Treg qui permettent de retrouver un nouvel état de tolérance.
envahissantes et partagent des propriétés avec les cellules métastasiques tumorales. En effet,
elles produisent de nombreuses molécules d’adhésion et des enzymes dégradant la matrice. Ces
caractéristiques leur permettent d’adhérer aux cellules endothéliales des vaisseaux sanguins et
de s’extravaser au sein de l’œil (figure 7). Nous allons voir dans la section suivante l’importance
de l’activation des cellules de la BHR par les lymphocytes T autoréactifs dans le développement
d’UAE.
5. Rôle de l’activation des cellules rétiniennes
développement d’uvéite non infectieuse
dans
le
5.1 Introduction
De nombreux arguments démontrent que lors d’uvéites expérimentales, les cellules résidentes
de l’œil ne sont pas des victimes innocentes mais participent au contraire activement au
développement de la maladie. En effet, les cellules de la BHR qui normalement empêchent les
cellules inflammatoires de pénétrer dans l’œil vont être activées par les médiateurs libérés par
les lymphocytes T autoréactifs et voir leurs propriétés profondément modifiées. Ainsi, sous
l’influence principale des cytokines sécrétées par les lymphocytes Th1 /Th17, ces cellules vont se
mettre à exprimer des molécules d’adhésion, des molécules du CMH et produire des cytokines
proinflammatoires. La BHR sera ainsi rompue et les lymphocytes T autoréactifs pourront
pénétrer à l’intérieur de l’œil et y déclencher l’inflammation. Les principales cytokines libérées
par les lymphocytes Th1 et Th17 et responsables de l’activation des cellules de la BHR, sont
l’IFNγ, le TNFα, l’IL-1β, l’IL-17 et l’IL-22. Si ces cytokines sont capables d’activer les différents
types cellulaires de la BHR, la majorité des travaux ont été effectués sur l’EPR qui sera donc
traité séparément (figure 8).
5.2 Effet des cytokines sur les cellules de l’EPR
5.2.1 Effets de l’IFNγ
L’IFNγ joue un rôle important dans la physiopathologie des uvéites, puisqu’on a détecté de l’IFNγ
dans les yeux d’UAE et chez les patients atteints d’uvéite88, 89. De plus, C Egwuagu et al ont
démontré que l’expression transgénique intra-oculaire d’IFNγ augmente la sévérité et accélère le
développement d’UAE chez le rat90.
24
Blood vessel
N
E
U
R
O
R
E
T
I
N
A
E
P
R
Müller cell
Th1
Th17
Innate stimuli: PTX,LPS ..
Figure 8: Rupture de la BHR et activation des cellules de l’EPR.
Des modèles d’UAE ont démontré qu’une inflammation oculaire survient lorsque des lymphocytes TCD4+ sont activés par des antigènes oculaires en présence de signaux de danger. Ces lymphocytes, de sous‐types Th1 et Th17, vont migrer dans l’œil et sécréter des cytokines pro‐inflammatoires ayant la capacité d’activer les cellules de l’EPR. Sous l’effet de ces cytokines les cellules de l’EPR vont exprimer des molécules d’adhésion et de co‐stimulation et sécréter des cytokines,
L’IFNγ est intimement impliqué dans la régulation de l’immunité innée et adaptative. C’est une
cytokine proinflammatoire sécrétée essentiellement par les lymphocytes TCD4 du sous-type Th1,
mais aussi par les lymphocytes TCD8, les cellules NK et par les macrophages activés. L’activation
de son récepteur qui est composé de deux sous-unités distinctes IFNGR1 et IFNGR2 est couplée à
la voie dite de JAK-STAT qui est bien connue et a été caractérisée au niveau des cellules de l’EPR
par l’équipe de C Egwuagu91. Après liaison de l’IFNγ à son récepteur, les protéines JAK1 et JAK2
(Janus Kinase) sont activées, et vont stimuler la phosphorylation de STAT1 (Signal Transducer
and Activator of Transcription). Cette phosphorylation induit la formation d’homodimères de
STAT1 qui vont migrer dans le noyau et promouvoir en se liant au niveau de sites GAS (Gamma
Activated Sequences) l’expression de gènes précoces (early genes) nommés IRF (IFN Regulatory
Factor). Les IRF vont collaborer avec STAT1 pour assurer la transcription des gènes induits par
l’IFNγ. Il s’agit principalement de cytokines, de molécules d’adhésion, de la NO synthase, et des
molécules du CMH de classe I et II. Par ailleurs, les gènes SOCS (Suppressors Of Cytokines
Signalling) sont également transcrits. Ceux-ci codent pour des protéines qui vont inhiber la
phosphorylation de STAT1 et sont donc les éléments d’une boucle de rétro-contrôle négatif de la
stimulation par l’IFNγ (figure 9).
Une des conséquences majeure de l’activation des EPR lors de l’inflammation et l’induction
membranaire de molécules du CMH II qui a été retrouvée à la surface des cellules de l’EPR chez
des patients atteints d’uvéites et dans le modèle d’UAE92-94. Les cellules de l’EPR exprimant du
CMHII lors de l’inflammation pourraient ainsi servir localement de cellules présentatrices
d’antigènes et activer les lymphocytes T autoréactifs95. La stimulation de l’EPR par l’IFNγ a
également d’autres conséquences. On retrouve en particulier une augmentation du CD54 (ICAM1), du CD4096, des protéines du complément97, du VEGF98 et une diminution de ZO-199. Les effets
de l’IFNγ sur la production de cytokines sont plus difficiles à analyser car la plupart des études
ont été faites sur l’EPR stimulé par un cocktail de cytokines.
5.2.2 Régulateur négatif de la signalisation : SOCS
Les membres de la famille SOCS sont impliqués dans une boucle de rétrocontrôle négatif de la
signalisation induite par de nombreuses cytokines, hormones, facteurs de croissance dont l’IFNγ,
25
IFNγ
RPE
P
P
STAT1
STAT1
JAK
JAK
P
P
P
P
P P
STAT1
STAT1
-
P P
STAT1
GAS
GAS
P
P P
P
STAT1
SOCS1
Cytokines
Adhesion molecules
CMH‐II
Figure 9 : Cascade de signalisation intracellulaire de l’IFNγ
La liaison de l’IFNγ à son récepteur entraîne une succession de phosphorylations initiées par la famille Janus Kinases (JAK) conduisant à la dimérisation du facteur de transcription STAT‐1 (Signal Transducer and Activator of Transcription 1) et à sa migration dans le noyau. Il s’ensuit la transcription de différentes cytokines pro‐inflammatoires (CMHII, VCAM1…), mais également d’une protéine nommée Suppressor of cytokines Signaling‐1 (SOCS‐1) impliquée dans la régulation négative de la transduction du signal. En effet, SOCS1 va se lier aux protéines JAK, inhiber leur activités catalytique et ainsi bloquer l’activation par l’IFNγ.
les ligands des TLRs et plusieurs interleukines qui activent les voies JAK/STAT100. Des membres
de la famille de SOCS peuvent être induits par d’autres stimuli qui n’activent pas JAK/STAT tels le
LPS, l’insuline et l’EGF101. Par contre, à l’état basal, les protéines SOCS ne sont pas ou peu
exprimées dans la cellule. On compte à l’heure actuelle 8 membres dans cette famille : SOCS 1 à
7 et la protéine CIS102. Ils sont caractérisés par une structure commune très conservée avec deux
domaines fonctionnels importants. Le domaine SH2 permet aux protéines SOCS1 de rentrer en
compétition avec STAT pour le site de fixation sur le récepteur et parvient ainsi à inhiber le
signal. Un autre moyen utilisé par SOCS1 est de se lier directement à JAK et ainsi d’inhiber leur
phosphorylation et leur activation subséquente103. Les protéines de la famille SOCS se
caractérisent aussi par la présence d’un motif caractéristique en C-terminal. Ce domaine très
conservé est appelé « SOCS–BOX ». Il a été démontré que ce motif est un adaptateur qui permet
la liaison de SOCS au complexe de l’ubiquitine ligase E3. Ce complexe permet la liaison de
molécules d’ubiquitine aux protéines qui pourront être reconnues par le protéasome et être
dégradés104, 105.
Les protéines SOCS sont donc impliquées dans la boucle de contrôle négative de nombreuses
cytokines. Leur importance à ce niveau est bien illustrée par les souris SOCS1-KO, qui meurent
rapidement des suites d’une infiltration de leurs organes par des cellules inflammatoires 105.
5.2.3 Effets du TNFα et de l’IL-1β sur l’EPR
De nombreux travaux attestent de l’importance du TNFα dans le développement des UAE. Tout
d’abord, plusieurs auteurs ont noté l’augmentation de l’expression du TNFα intra-oculaire lors
d’UAE. De plus, l’administration de TNFα recombinant à des animaux atteints d’UAE aggrave
significativement la maladie. Inversement, la maladie peut être supprimée par administration
d'anticorps anti-TNFα106. Le TNFα possède de nombreuses propriétés pro-inflammatoires. Il est
produit principalement par les macrophages, les lymphocytes mais aussi par les cellules
endothéliales et épithéliales. Les réponses biologiques au TNFα sont médiées par deux
récepteurs distincts : le TNFR1 ou p55 et le TNFR2 ou p75. Le TNFR1 contient des domaines de
mort cellulaire sur sa partie intracellulaire107, domaines qui sont absents du TNFR2. Après liaison
au TNFR1, la partie intracellulaire du récepteur se lie au TNF Receptor Death Domain (TRADD)
qui dans le cas du TNFR1 peut activer l’apoptose cellulaire via le Fas Associated Death Domain
26
IL-1β
TNFα
IκB
Pr
IκB
NFκB
NFκB
Cytokines
Adhesion molecules
MHC II
Figure 10
Schéma simplifié de la voie de signalisation du TNFα et de l’IL‐1β. La transduction du signal induit par le TNFα et l’IL‐1β converge vers l’activation d’un facteur de transcription le NF‐Κb. Le NF‐Κb se trouve dans le cytoplasme où il est maintenu par une liaison à l’IκB. Après fixation du TNFα et de l’IL‐1β à leur récepteur, il y a une activation du complexe kinase qui va phosphoryler l’IκB lequel va se détacher du NF‐Κb, être ubiquitiné puis dégradé dans le protéasome tandis que le NF‐Κb libéré va pouvoir migrer dans le noyau où il va activer la transcription de gènes pro‐inflammatoires.
(FADD). Dans le cas du TNFR1 et TNFR2, une voie proinflammatoire est également stimulée via le
TNF Receptor Associated Factor 2 (TRAF2) et le Receptor-Interacting Kinase (RIP)108.
L’IL-1 est principalement produite par les macrophages et possède des propriétés activatrices
sur de nombreux types cellulaires dont les lymphocytes T, les cellules endothéliales et
épithéliales. L’IL-1 existe sous deux formes : l’IL-1α qui est membranaire et l’IL-1β qui est
sécrétée. Elles agissent sur le même récepteur. Après leur liaison au récepteur du type I (IL-1R),
celui-ci interagit avec l’IL-1Racp (IL-1R accessory protein) et après une série de changement
conformationnels, MyD88 est recruté. Il s’ensuivra le recrutement et l’activation de plusieurs
autres protéines (IRAK, TRAF6, TAK1) et finalement l’activation du complexe des IκB kinases109.
La stimulation des récepteurs au TNFα et à l’IL-1β converge vers l’activation du complexe de
l’IκB kinase. Celui-ci, constitué de 3 sous-unités (α, β, γ) va phosphoryler l’IκB. Une fois
phosphorylé, il va se détacher du NF-κB, être ubiquitiné puis dégradé dans le protéasome tandis
que le NF-κB libéré va pouvoir migrer dans le noyau ou il va activer la transcription des gènes
dont les promoteurs possèdent un site κb tels que les gènes de certaines cytokines, de
molécules d’adhésion, et celui de l’IκB110(figure 10).Le TNFα et l’IL-1β sont des médiateurs
fondamentaux de l’activation des cellules de la BHR. Les cellules de l’EPR sont en effet très
sensibles à l’IL-1β et au TNFα auxquels elles répondent par l’induction de molécules d’adhésion
et la sécrétion de cytokines proinflammatoires. En effet, in vitro, lorsqu’ elles sont stimulées par
du TNFα et l’IL-1β, les cellules de l’EPR vont exprimer de l’ICAM-1, de la NO synthase et du ZO-1
et sécréter différentes cytokines telles que l’IL-8, du Rantes et du MCP1111.
5.2.4 Effet de l’IL-17 et de l’IL-22
Depuis la description par Luger.D et al du rôle des lymphocytes Th17 dans les uvéites noninfectieuses, de nombreux auteurs sont venus confirmer que ce sous-type lymphocytaire était
fortement impliqué dans la maladie112-115.
Les lymphocytes Th17 ont été décrits comme des cellules TCD4+ productrices d’IL-17A et d’IL17F mais aussi d’IL-21 et d’IL-22116. L’IL-17A et l’IL-17F appartiennent à une famille de 6 cytokines
(IL-17A à IL-17F), dont les effets se caractérisent par des propriétés proinflammatoires telles que
la sécrétion de facteurs granulopoïétiques, le G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor) l’IL27
6 , de MIP et par la sécrétion de chimiokines (CXCL-1,-2, -5,-6, -8, -9 etc) par les cellules cibles117.
Par ailleurs, comme beaucoup d’autres cytokines, l’IL-17 a aussi une activité anti-inflammatoire.
Cette dualité de fonction a été rapportée au cours de l’UAE118. L’IL-17 agit sur les cellules cibles
via deux récepteurs : l’IL-17 RA et l’IL-17 RC. Bien que la cascade de signalisation de l’IL-17 soit
loin d’être complètement élucidée, il a été démontré que la transduction du signal implique la
PI3K/AKT, le NF-κB, et la MAPK 119, 120.
L’IL-22 est une cytokine qui appartient à la famille de l’IL-10. Elle exerce ses fonctions
biologiques par le biais de 2 récepteurs, l’IL-22R1 et l’IL-10R2 qui sont essentiellement situés sur
les cellules résidentes des tissus d’origine épithéliales. Ses propriétés anti et pro-inflammatoires
dépendent du tissu impliqué121-123. IL-22 est produite par les lymphocytes de sous-type Th1,
Th17 et Th22. Une étude par microarray, a montré que les PBMC isolés de patients atteints
d’uvéite, exprimaient fortement le gène de l’IL-22124. Au niveau intracellulaire, il est connu que
l’IL-22 active STAT3 et régule l’expression de molécules proinflammatoires et antimicrobiennes
et est ainsi impliqué dans les défenses de l’hôte, l’inflammation et la réparation tissulaire 116, 125.
Les effets de l’IL-17 et de l’IL-22 sur les cellules résidentes de l’œil ne sont pas encore clairs et
font l’objet de nombreuses études. Cependant, il a été démontré in vitro que les EPR humaines
expriment constitutivement de l’IL-17RC et de l’IL-22R mais pas de l’IL-17RA. L’IL-17A et l’IL-17F
stimulent sensiblement la sécrétion de médiateurs inflammatoires tels que le CXCL8, CCL2,
CCL20, MIP-2, G-CSF et l’IL-6 par les EPR. De plus, l’IL-17A et l’IL-17F compromettent
significativement la fonction de la BHR externe (monocouche de l’EPR) en modifiant la
distribution de ZO-1 et des occludines124. Ces données sont à mettre en perspective avec celles
de Ke Y et al qui ont montré sur l’EPR de souris que l’IL-17 induisait une réponse plutôt antiinflammatoire sur ce type cellulaire, en comparaison à une réponse fortement inflammatoire
retrouvée sur les astrocytes rétiniens. De manière intéressante ces auteurs liaient cet effet
« anti-inflammatoire » de l’IL-17 à une induction de SOCS1 et SOCS3 dans l’EPR et aussi dans les
astrocytes rétiniens126.
En ce qui concerne les effets de l’IL-22 sur l’EPR, si Liz et al retrouvent un effet sur la résistance
transépitheliale, celui-ci n’est pas retrouvé par Chen Y et al qui, s’ils mettent bien en évidence le
28
récepteur, ne retrouvent aucun effet de cette cytokine ni sur la résistance transepithéliale, ni sur
l’expression de ZO-1, ni sur la production de cytokines124, 127.
5.2.5 Effet des cytokines proinflammatoires sur les cellules gliales
En dehors des effets sur l’EPR, les cytokines proinflammatoires modifient aussi le phénotype
d’autres types cellulaires rétiniens (les cellules de Müller, les astrocytes, et les cellules
microgliales) au cours de l’inflammation.
Les cellules de Müller sont les cellules gliales principales de la rétine et sont des constituants
importants de la BHR interne. Elles jouent un rôle important dans la physiopathologie de
l'inflammation intra-oculaire en exprimant des molécules du CMH de classe II. Elles peuvent
ainsi, soit activer les lymphocytes T en jouant le rôle de cellules présentatrices d’antigènes, soit
inhiber leur prolifération et leur production d’IL-2. Elles produisent de l’IL-1β et du TNFα au
cours de l’inflammation oculaire ou après stimulation par le lipopolysaccharide (LPS) 128. De
manière intéressante, il a été bien démontré que le niveau de production de TNFα par les
cellules de Müller est corrélé à la susceptibilité de la souche de laquelle sont issues les cellules
de Müller. Les cellules de Müller et la microglie du rat Lewis, espèce particulièrement sensible à
l’inflammation oculaire, produisent du TNFα et du monoxyde d’azote (NO) lorsqu’elles sont
stimulées in vitro129, 130. In vivo, des études récentes ont montré que l’activation des cellules de
Müller par l’IFNγ altère l’intégrité de la BHR qui est maintenue grâce aux cellules astrocytaires131133
.
Les rôles exacts des astrocytaires dans l’inflammation intraoculaire n’ont jamais été entièrement
identifiés. Comme pour les cellules de l’EPR et les Müller dans des contextes proinflammatoires,
les astrocytes expriment des molécules du CMHII et des molécules de costimulation et sécrètent
différentes cytokines proinflammatoires (TNFα, IL-6, IL-12 et IL-23). Jiang et al ont démontré in
vitro que ces astrocytes peuvent activer des lymphocytes T autoréactifs134, 135. Le même groupe a
aussi montré que les astrocytes expriment de l’IL-6 du TNFα et du CCL2 en réponse à l’IL-17 et
que l’IFNγ et l’IL-17 ont un effet synergique sur la migration ces cellules in vitro126.
29
Les cellules microgliales de la rétine dérivent de précurseurs hématopoïétiques et se
renouvellent au cours du temps. Chez les souris, leur remplacement total prend 6 mois136, 137.
Elles expriment de nombreux marqueurs inflammatoires comme les molécules du CMH II, du
CD45 et du CD68 et peuvent présenter des antigènes aux lymphocytes138. Elles sont
principalement situées dans la rétine périphérique et autour de la tête du nerf optique mais sont
plus particulièrement trouvées dans la couche des cellules ganglionnaires et photoréceptrices.
Ces cellules produisent du TNFα et du NO et migrent au sein de la rétine lors de l’inflammation.
Cette migration vers le site inflammatoire dépend de l’expression d’un récepteur membranaire
CD200. Il a été démontré que bloquer la cascade de signalisation induite par l’interaction
CD200/CD200R augmenterait la production de NOS2 dans la rétine et la sévérité de la maladie
tandis que l‘utilisation d’anticorps anti-CD200R protègerait de la maladie139.
6. Traitements des uvéites non-infectieuses
Malgré leurs effets secondaires bien connus, les corticostéroïdes demeurent les agents
principalement utilisés dans le traitement des uvéites non-infectieuses du segment
postérieur140.Toutefois, au cours des 30 dernières années, l’utilisation croissante d’agents
immunosuppressif et plus récemment d’agents biologiques s’est accélérée afin d’atteindre deux
principaux objectifs 1) minimiser les effets secondaires dû à l’utilisation à long terme des
stéroïdes 2) introduire une approche thérapeutique plus ciblée.
6.1 Les corticostéroïdes
Les corticostéroïdes sont le traitement de première ligne des uvéites. Leur utilisation est
néanmoins limitée par les effets secondaires inévitables que l’on rencontre après un usage
chronique. Classiquement, le traitement d’attaque consiste en de la methylprednisolone à 1
mg/Kg. Après maximum un mois, les corticostéroïdes sont diminués progressivement puis
stoppés. Si la maladie n’est pas contrôlée de cette manière, on ajoute au traitement un
immunosuppresseur141.
30
6.2 Les immunosuppresseurs
Les immunosuppresseurs forment un groupe de médicaments bien connus et particulièrement
utiles chez les patients corticodépendants. Ils peuvent être classés en antimétabolites, en
inhibiteur des lymphocytes T en agents alkylants et en agents biologiques.
6.2.1 Les antimétabolites
Les antimétabolites agissent en inhibant une enzyme, la dihydrofolate réductase qui freine la
production de la tétrahydrofolate, un métabolite nécessaire à la synthèse des nucléotides. Par
conséquent, les antimétabolites entravent la synthèse de l’ADN et de l’ARN, il en résulte ainsi
une inhibition non sélective de la prolifération des cellules T et B. Ces traitements sont donc des
immunosuppresseurs puissants peu spécifiques et de ce fait associés à des effets secondaires
parfois sévères. Les plus utilisés sont le ledertrexate et l’azathioprine.
6.2.2 Les inhibiteurs des cellules T
L’implication centrale des lymphocytes T dans la physiopathologie des uvéites non infectieuses
en fait une cible thérapeutique naturelle. La cyclosporine (CsA) et le tacrolimus, membres de la
famille des macrolides agissent principalement en bloquant la cascade de signalisation initiée par
l’IL-2 en inhibant la calcineurin. L’équipe de R Nussenblatt est la première à avoir démontré
l’efficacité de la CsA tant dans le modèle animal d’UAE que chez l’homme142. Plus récemment,
des anticorps neutralisant le récepteur à l’IL-2 (daclizumab) ont été mis au point et semblent
montrer une certaine efficacité dans les essais cliniques143,
144
. Néanmoins, les mécanismes
d’action de ces traitements restent peu clairs. Ils pourraient aggraver certaines pathologies
autoimmunes à médiation cellulaire, par inhibition des lymphocytes T reg car l’IL-2 est
nécessaire à leur maintien et à leur prolifération145.
6.2.3 Les agents alkylants
Le cyclophosphamide et le chlorambucil sont généralement utilisés en oncologie et dans des cas
sévères de maladies rhumatismales. Leurs effets secondaires sont très nombreux et
potentiellement gravissimes. Ils sont peu utilisés dans la prise en charge des uvéites non
infectieuses146.
31
6.2.4 Les agents biologiques
Bien que les médicaments décrits précédemment exercent une activité immunosuppressive
efficace, ils demeurent associés à des complications systémiques et ne sont pas spécifiques des
uvéites non infectieuses. Les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes
immunitaires impliqués dans la physiopathologie des uvéites ont permis le développement de
nouveaux agents biologiques plus ciblés. Ces agents biologiques sont pour la plupart des
anticorps recombinants ou des antagonistes de cytokines et de récepteurs de surface cellulaire.
Ils peuvent également inclure des cytokines recombinantes comme l’IFNα. Un des premiers
exemples de réussite, est la neutralisation de l’activité du TNFα par une protéine de fusion le
TNFR-IS/IgG147,
148
. L’efficacité des anticorps anti-TNF (l’infliximab) chez l’homme n’est plus à
prouver car ils sont utilisés couramment comme traitement thérapeutique dans plusieurs
maladies autoimmunes dont les uvéites149. Les agents biologiques ont d’autres cibles comme les
signaux de costimulation, le CTLA-4 (abatacept), la réponse B par l’intermédiaire des anticorps
anti-CD20 (Rituximab) ou les cytokines proinflammatoires par l’utilisation d’anticorps anti-IL-1
(anakirna) ou anti-Il-6 (tocilizumab)150-152. Enfin, plusieurs agents biologiques ont également
comme cibles des molécules d’adhésions (Natalizumab, ou la prévention de l’efflux des
lymphocytes T des ganglions lymphatiques vers l’organe cible par inhibition du sphingosine-1phosphate récepteur (FTY 720)153. Ces deux stratégies ont montré des effets bénéfiques dans les
essais cliniques de la sclérose en plaque et dans le modèle de l’UAE153. L’implication des
macrophages dans la phase effectrice de l’inflammation par leur production d’IL-6, de TNFα et
de NO, en fait une cible thérapeutique intéressante. Copland A et al ont montré qu’une
inhibition du clivage du facteur C5 du complément et la stimulation du récepteur inhibiteur
CD200 réduit la sévérité de la maladie lors de l’UAE154.
6.3 Thérapeutique expérimentale
6.3.1 Inhibition de l’activation des cellules rétiniennes par transfert de gènes
codant pour des cytokines anti-inflammatoires
Parmi les nouvelles approches possibles, la thérapie par transfert de gène occupe une place de
choix. Cette thérapie vise à transférer des gènes directement dans les tissus malades afin de
32
corriger une expression défectueuse ou d’apporter l’expression de nouveaux gènes. Dans le cas
des maladies immunitaires, l’apport d’un gène codant pour une protéine immunosuppressive
permettrait un traitement local de la maladie. Le transfert de gène se fait via des vecteurs viraux,
cellulaires ou chimiques. Le choix de ces vecteurs est une des étapes clefs dans la stratégie de
thérapie génique. Pour le traitement des maladies rétiniennes (dégénératives ou immunitaires),
les vecteurs recombinants basés sur les virus adéno-associés (AVV) semblent des candidats
idéaux155. En effets, les AAVs possèdent une série de propriétés biologiques qui en font un outil
de choix pour infecter un tissu aussi particulier que la rétine : 1) les virus AVVs ne sont pas
pathogènes 2) les vecteurs AVVs sont capables de transduire des cellules post mitotiques,
d’origines diverses et de façon stable156. Ainsi plusieurs travaux ont montré la faisabilité de
l’utilisation clinique de tels vecteurs pour délivrer des gènes thérapeutiques, notamment dans
un type de dégénérescence rétinienne157. Dans le contexte des uvéites non infectieuses, si les
projets n’ont pas encore atteint les essais cliniques, plusieurs groupes ont utilisé ces vecteurs
pour faire produire des molécules immunosuppressives telles que l’IL-10 virale, l’IFNα et l’IL-1RA
par les cellules rétiniennes158-161.
33
Objectifs du travail
Le but de ce travail est dans un premier volet de mieux caractériser l’activation des cellules de la
BHR lors d’uvéite autoimmune.
Pour ce faire, nous avons d’une part analysé l’expression rétinienne de la molécule d’adhésion
VCAM-1, in vivo, dans un modèle d’UAE classique ou par transfert adoptif de lymphocytes
autoréactifs.
Nous avons ensuite étudié in vitro, la régulation de l’expression du CMHII sur les cellules de l’EPR
par l’IFNγ et le TNFα.
Enfin, dans une autre partie du travail, nous avons testé s’il était possible d’inhiber le
développement d’une uvéite autoimmune en bloquant l’activation des cellules de la BHR. Nous
avons ainsi surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression
in vivo et in vitro sur le développement de la maladie.
34
Résultats
1. Caractérisation de l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien lors
d’uvéite autoimmune expérimentale
Characterization of retinal expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) during
experimental autoimmune uveitis
M Makhoul*, R Dewispelaere*, LJ Relvas, V Elmaleh, L Caspers , C Bruyns and F Willermain
Accepté pour publication (Experimental Eye Research)
Contexte
L’activation des cellules rétiniennes de l’œil est un élément clef dans le développement d’UAE.
Une des composantes majeures de cette activation est l’induction de l’expression de molécules
d’adhésion permettant le passage des lymphocytes autoréactifs au travers de la BHR. Ainsi,
l’uprégulation des molécules d’adhésion VCAM-1, ICAM-1 et PECAM1 au niveau de
l’endothélium rétinien a été montré comme un prérequis pour la migration leucocytaire lors
d’UAE. Néanmoins, il n’y a pas dans la littérature de description complète de l’expression de ces
molécules d’adhésion sur les autres types cellulaires de la BHR lors d’UAE. Nous avons donc
entrepris une série de marquages afin de caractériser l’expression de VCAM-1 sur les cellules
rétiniennes dans deux modèles d’uvéites non infectieuses : l’UAE classique et l’UAE induite par
transfert de lymphocytes T autoréactifs.
Résultats et conclusions
Nos résultats montrent que VCAM-1 n’est pas exprimé dans la rétine d’un animal sain mais est
induit dès la deuxième semaine post transfert adoptif. Dans la rétine d’un animal atteint d’uvéite
de faible sévérité, l’expression de VCAM-1 est uniquement induite au niveau de certaines zones
de vasculite et au niveau du corps ciliaire. Dans les yeux plus malades, ces lésions de vasculite
s’étendent et toute la limitante est alors marquée. En parallèle, la limitante externe devient
également faiblement positive comme l’EPR. Dans les uvéites sévères, l’expression de VCAM-1
est nettement plus marquée tant au niveau de la limitante interne que de la limitante externe.
L’EPR et le corps ciliaire demeurent aussi positifs dans ces yeux forts malades. Nous avons
35
ensuite voulu déterminer quel type de cellules rétiniennes exprimait VCAM-1 par des
expériences de triple marquage à l’aide d’anticorps marquant les cellules endothéliales
(endogline), les cellules gliales (GFAP) et VCAM-1. Nos résultats montrent qu’au niveau des
zones de vasculite, l’expression de VCAM-1 colocalise soit avec l’endogline soit avec la GFAP. Au
niveau de la membrane de la limitante interne, l’expression de VCAM-1 colocalise également
avec la GFAP. Le même pattern (EPR, cellules de Müller, astrocytes et cellules endothéliales)
d’expression de VCAM-1 au niveau rétinien a été retrouvé dans le modèle d’UAE classique. En
conclusion, nos résultats mettent en évidence que l’ensemble des cellules de la BHR (EPR,
cellules de Müller, astrocytes et cellules endothéliales) expriment progressivement VCAM-1 lors
d’UAE, et que l’étendue et l’intensité de cette expression est corrélée à la sévérité de la maladie.
36
Characterization of retinal expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM‐1) during experimental autoimmune uveitis M Makhoul *(1), R Dewispelaere*(1,2), LJ Relvas (1,2), V Elmaleh (1,2), L Caspers (2), C Bruyns (1) and F Willermain (1,2). (1) I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary Research), Université Libre de Bruxelles Campus Erasme, Brussels, Belgium. (2) Department of Ophthalmology, CHU St‐Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium. *MM and RD contributed equally to this work. Corresponding author: Makhoul Maya. Address: Route de Lennick 808‐ B 1070 Brussels, Belgium Tel: 0032/5554104 FAX: 0032/5554655 E‐mail address: [email protected] Keywords: Uveitis, Retina, VCAM‐1, BHR, Cytokines ABSTRACT Leukocyte adhesion to the blood retinal barrier is a critical step in the pathogenesis of non‐
infectious uveitis and is mediated in part through the induction of adhesion molecules on retinal cells. Here, we have investigated the retinal expression of Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM‐1) in mouse experimental models of non‐infectious uveitis. For each eyes, a histological score was given, and the expression of VCAM‐1 analysed by immunohistology. Co‐labellings for GFAP, endoglin, aquaporin 4 and recoverin were also performed in order to determine which cell type expressed VCAM‐1. In low grade uveitis, obtained after adoptive transfer of semi‐purified autoreactive lymphocytes, VCAM‐1 was only punctually expressed in the internal limiting membrane and epithelial cells of the ciliary body. Using the same adoptive transfer protocol, we found that, in correlation with disease severity, the staining extended to all internal limiting membranes, vasculitis lesions, Müller cell extensions, outer limiting membranes and RPE cells. VCAM‐1 expression in the inner limiting membrane and Müller cell extensions co‐stained with GFAP expression. In vasculitis lesions, VCAM‐1 co‐localized with either GFAP and endoglin expression. The labeling in the outer limiting membrane, did not exactly co‐stained with AQ4 (Müller cells marker) or recoverin (photoreceptor marker) and the nature of this expression remained unexplained. Finally, VCAM‐1 expression was also analysed in classical experimental autoimmune uveitis eyes, and a similar pattern of expression was found. In conclusion VCAM‐1 is expressed on all blood retinal barrier cells during experimental non‐infectious uveitis and might thus play an important role in inflammatory cell recruitment during disease development. 1. INTRODUCTION Uveitis is an important cause of human visual disability and blindness, which can have an infectious or autoimmune etiology. Experimental models of uveitis (EAU) have been generated in vivo in different animal species, by immunization with a number of antigens including interphotoreceptor retinoid‐binding protein (IRBP) (Avichezer et al., 2003;Donoso et al., 1988). Disease can also be induced by the adoptive transfer of retinal autoreactive antigen‐specific lymphocytes (Shao et al., 2006). Clinical and histopathological studies have shown high similarities between those models and human non infectious uveitis (Pennesi et al., 2003). In EAU, eye damage is caused by infiltrating lymphocytes, macrophages and polymorphonuclear cells, recruited from the circulation. The lymphocytes that migrate to the eye are constituted by both retinal antigen‐specific and nonspecific cells (Caspi et al., 1993;Chan et al., 1990). Elucidating the mechanisms by which activated T cells cross the blood‐retinal barrier (BRR) and gain entry to the retina is of significant importance to understand and eventually control the pathogenesis of EAU. The BRB was reported to be severely affected during EAU (Xu et al., 2005). This barrier is composed by an inner part which relies on the tight junctions of retinal vascular endothelial cells and by extensions of Müller cells surrounding retinal blood vessels. The outer BRB relies on the tight junctions of retinal pigment epithelial cells (RPE) (Bringmann et al., 2004;Bringmann et al., 2005). In general, lymphocyte extravasation is governed by a variety of factors, such as the state of cell activation and the repertoire of adhesion molecules expressed by the local vascular endothelial cells (Martin et al., 2005). In this context, upregulating the expression of endothelial adhesion molecules VCAM‐1, ICAM‐1, PECAM1 in retinal microvascular endothelium appeared to promote leucocyte migration during EAU (Xu et al., 2003). Many authors have investigated in vitro the migration of ocular antigen‐specific T cells across RPE monolayers. They observed that VCAM‐1 expression which was not constitutive on untreated RPE was induced by IFNγ stimulation and that the addition of antibodies to either VCAM‐1 or VLA‐4 (very late antigen‐4) the VCAM‐1 ligand, caused a significant reduction in transepithelial migration (Devine et al., 1996). Importantly, two groups have also demonstrated that blocking the interaction of VCAM‐1 and VLA‐4 significantly reduced clinical signs of EAU and EIU (endotoxin‐induced uveitis) (Martin et al., 2005; Hafezi‐
Moghadam et al., 2007). Such data strongly suggest that the expression of VCAM‐1 on BRB cells could be critical in uveitis development. Accordingly, Xu et al have reported that alongside other adhesion molecules, the expression of VCAM‐1 increases progressively as EAU developed (Xu et al., 2003). However, a detailed analysis of the different retinal cell type expressing VCAM‐1 during EAU has not yet been extensively performed. The aim of this study was to investigate in vivo, during uveitis, the modification of VCAM‐1 expression pattern on several types of ocular resident cells. 2. MATERIAL AND METHODS 2.1 Reagents and animals IRBP peptide 1‐20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD), representing residues 1‐20 of human IRBP, was synthesized by New England Peptide (Gardner, MA.USA). Pertussis toxin (PTX) and complete Freund’s adjuvant (CFA) were purchased from Sigma‐Aldrich (Bornem, Belgium). Pathogen‐free female C57BL/6 mice (6‐to‐8 weeks old), purchased from Janvier (Genest St Isle, France) were housed and maintained at the animal facilities in accordance with European guidelines. Animal treatment conformed to the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. All T cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 25 Mm HEPES, 10% foetal bovine serum, 1% L‐glutamine, 1% sodium‐
pyruvate, 100 IU/ml penicillin, and 100g/ml streptomycin and 5.10‐5M β‐mercaptoethanol in a 5% CO2 and 95% humidity incubator. 2.2 EAU induction EAU was induced by injecting subcutaneously 100µl of a mixture of 500µg IRBP peptide 1‐20 emulsified in CFA and supplemented with 2.5mg/ml killed Mycobacterium Tuberculosis. All animals received at the same time an intraperitoneal injection of a single dose of 1.5µg PTX. 2.3 Adoptive transfer model of experimental autoimmune uveitis EAU was induced by adoptive transfer of autoreactive lymphocytes following the protocol of Shao H et al., 2006. Briefly, naïve C57BL/6 mice were immunized as for EAU induction. Twelve days later, mice were killed and their spleen and draining lymph nodes collected. Splenic T cells were semi‐purified by passage on nylon wool fiber columns, pooled with total lymph node cells and cultured with 10 µg/ml IRBP1‐20 for 2 days before being injected i.p into naïve C57BL/6 mice (3x10 6 cells/mouse). 2.4 Histological grading For histological grading, eyes were collected, prefixed for 6 h at 4°C in PFA (paraformaldehyde) 4%, sucrose 3% and then put in three successive baths of 5%, 10% and 20% sucrose in PBS, respectively, for 24h each. Entire eyes were embedded in OCT (Sakura) and cut in 10 µm frozen sections using a cryostat (CM3050S Leica). A classical hematoxylin‐
eosin staining was then realized. The severity of EAU was evaluated on six sections, cut at different levels in each eye, and scored on a scale from 0 (no disease) to 4 (maximum disease) with half points increments, according to lesion type, size, and number by using the R. Caspi’s histological grading system (Caspi et al., 1993). In brief, the minimal criterion to score an eye as positive by histopathology was an inflammatory cell infiltration of the ciliary body, choroid, or retina (EAU grade 0.5). Progressively higher grades were assigned for the presence of discrete lesions in the tissue, such as vasculitis, granuloma formation, retinal folding or detachment, and photoreceptor damage. 2.5 Immunohistology Frozen sections were fixed with PAF 4% for 15 min and blocked in TBS (Tris 10 mM, NaCl 0.9%, pH 7.6) supplemented with 5% horse serum and Triton 0.3% for 2 hours. Then, sections were incubated overnight with the following primary antibodies, alone or in mixture as indicated in data: anti‐VCAM‐1 (rat 1/200; BD Pharmingen Erembodegen, Belgium), anti‐
GFAP (mouse 1/500; Millipore Rakestraat, Belgium), anti‐recoverin (goat 1/500; SantaCruz Biotech Heidelberg, Germany) anti‐endoglin (goat 1/500; BD Pharmingen), anti‐aquaporin 4 (rabbit 1/100; Millipore) diluted in TBS supplemented with 5% horse serum and 0.1%Triton. After three washings in TBS, the sections were incubated in the dark for 1h30 either with species specific secondary antibodies coupled to different fluorochromes, as indicated in results or with Hoechst to stain the nuclei (Invitrogen Gent, Belgium). After several washings, sections were mounted in Glycergel (Dako) supplemented with 2.5% Dabco (Sigma‐Aldrich). Pictures of immunostainings were acquired using an Axio Observer Z1 microscope (Carl Zeiss, Inc.). The MOM (mouse‐on‐mouse) Basic Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK) was used to prevent high background staining when using mouse‐derived primary monoclonal antibodies. Eye sections were in that case incubated for 1h with MOM IgG blocking reagent, washed, incubated overnight with the primary antibody in MOM diluent (600µl protein concentrate in 7.5 ml PBS) and then for 1h30 with the secondary antibody in MOM diluent. The negative control sections were incubated with secondary antibodies alone. 3. RESULTS 3.1 VCAM‐1 expression in the retina during non‐infectious uveitis To investigate the possible role of VCAM‐1 in the development of experimental non‐
infectious uveitis, we first analyzed the ocular expression of VCAM‐1 by immunohistochemistry, 3 weeks after the adoptive transfer of semi‐purified IRBP‐specific autoreactive lymphocytes. In the normal retina, VCAM‐1 expression was totally absent (data not shown). Figure 1 shows that VCAM‐1 was expressed in all eyes with uveitis. Moreover, the extension and intensity of its expression were correlated with the severity of the disease. Indeed, in low grade animals, VCAM‐1 expression was restricted to certain locations of the internal limiting membrane (ILM) and ciliary body (CB) (Figure 1A and 1B). In severely inflamed eyes, the expression of VCAM‐1 extended to all the internal limiting membrane and to the outer retinal layers including the outer limiting membrane (OLM) (Figure 1C and 1D). To determine the kinetics of appearance of VCAM‐1 expression, we performed an adoptive transfer of autoreactive lymphocytes as previously reported, and analyzed the eyes after 1, 2, and 3 weeks. VCAM‐1 expression appeared between day 7 and day 14 in the ILM, the ciliary body (CB) and retinal vasculitis lesions (V) as shown in figure 2B. At day 21, VCAM‐1 staining was stronger and extended to some area of the external retina (OLM) (Figure 2C). 3.2 Expression of VCAM‐1 by RPE and epithelial cells of the ciliary body After such a global investigation of VCAM‐1 retinal expression, we focused more on a cell‐ specific expression. A careful analysis of previous stainings demonstrated that in the adoptive transfer model of EAU, both epithelial cells of CB (ECB) and RPE cells expressed VCAM‐1‐.(Figure 3). 3.3 Characterization of VCAM‐1 expression in the internal limiting membrane (ILM) Normal mouse retina consists in ten well‐identified histological layers (Figure 4A). As shown before, VCAM‐1 is expressed in the ILM during uveitis (Figure 4B). To better analyze the cell‐
type expression of VCAM‐1 in ILM, we have performed co‐staining experiments using GFAP, a classical marker of glial cells and Müller cells. In control animals, GFAP was mainly located in the ganglion cell layer (data not shown) while in eyes developing intraocular inflammation, GFAP expression extended from the ILM to the OLM (Figure 4C). These patterns of expression correspond to Müller cells (Motulsky et al., 2010). As shown in the merged picture (Figure 4D), VCAM‐1 co‐stained with GFAP at the ILM and some radial extension of Müller cells. 3.4 Characterization of VCAM‐1 expression in vasculitis lesions Vasculitis is an important feature of non‐infectious uveitis. We found that vasculitis lesions strongly expressed VCAM‐1 (Figure 5A). To better analyze VCAM‐1 expression in vasculitis lesions co‐immunostainings were performed with endoglin, an highly specific marker of endothelial cells from the superfamily of TGF‐beta (Figure 5B) and the glial markers GFAP (Figure 5D). As shown in figures 5C, 5E and 5F, in vasculitis lesions, VCAM‐1 is expressed by both endoglin positive cells and GFAP positive cells. Further confirmation of these data was obtained by confocal immunofluorescence microscopy (Figure 6). 3.5 Characterization of VCAM‐1 expression in the outer limiting membrane (OLM) In order to better analyze the expression of VCAM‐1 in the OLM, which is made of intercellular links between Müller cells and photoreceptors (Figure 7B and 7F), co‐stainings with aquaporin‐4 antibody (AQ4) (Müller cell marker) (Figure 7C) and recoverin (photoreceptor marker) (Figure 7G) were performed in dedicated areas of the OLM (Figure 7A and 7E respectively). After having carefully examined the co‐stainings VCAM‐1/AQ4 or VCAM‐1/recoverin the nature of this expression remained unexplained (Figure 7D, Figure 7H). 3.6 VCAM‐1 expression in the retina during classical EAU In parallel, we have also investigated the VCAM‐1 retinal cell expression within the classical model of EAU. EAU was thus induced in C57BL/6 mice by immunization with IRBP peptide 1‐
20. After 3 weeks, a histological score was given for each eye (n= 16), and the expression of VCAM‐1 analysed by immunohistology. Co‐labellings for GFAP and endoglin, were also performed. As expected, VCAM‐1 was no found under normal conditions (data not shown), but strongly induced in inflamed eyes. The pattern of expression was similar as the one described in the adoptive transfer model, with a pronounced expression in vasculitis lesions (on both endoglin and GFAP positive cells) (figure 8A, 8B and 8C), ciliary body (figure 8G), internal limiting membrane (figure 8H, 8I et 8J), Müller cell extensions (figure 8A, 8D et 8E), outer limiting membrane (arrow) and RPE cells (arrow) (figure 8H). 4. DISCUSSION Lymphocyte recruitment to the eye is a critical step in the pathogenesis of ocular inflammation. This process is governed by factors such as the state of activation of inflammatory cells and the repertoire of adhesion molecules expressed locally by retinal cells. In this context, it has been suggested that VCAM‐1 might play an important role in inflammatory cell recruitment during autoimmune ocular disease. Indeed, Xu et al have shown that the expression of VCAM‐1 increased progressively in retinal arteries and arterioles during EAU development (Xu et al., 2003). However, the precise cell retinal expression of VCAM‐1 in experimental models of non‐infectious uveitis has never been clearly defined. Our studies bring new data on this particular point. We found that in uninflamed eyes, VCAM‐1 was not expressed constitutively in the retina. During EAU, the expression of VCAM‐1 appeared between day 7 and day 14, matching precisely uveitis development. Interestingly, VCAM‐1 expression correlated with the clinical grade of ocular inflammation at day 21. In eyes with minimal signs of inflammation, VCAM‐1 expression was weak. In contrast, in eyes with severe grades of ocular inflammation, VCAM‐
1 was strongly expressed across the BRB. It was most pronounced in the vascular endothelium of blood vessels in the retina and ciliary body but also occurred in the internal limiting membrane, Müller cell extensions, outer limiting membrane and RPE cells in eyes with severe inflammation. A similar upregulation of VCAM‐1 expression has been described during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) (Theien et al., 2001). In addition, an increased VCAM‐1 expression has also been observed in experimental model of colitis and arthritis (Koch et al., 1991;Sans et al., 1999). Importantly, and in accordance with our data, VCAM‐1 expression during those diseases was not restricted to endothelial cells. In EAE, for example, alongside its expression on endothelial cells, VCAM‐1 was also expressed on astrocytes and microglia (Lee and Benveniste, 1999). Moreover, proinflammatory conditions can also drive in vitro the expression of VCAM‐1 on renal, lung and retinal epithelial cells (Clarke et al., 2007; Ho et al., 2008; Platts et al., 1995). Altogether, with our data, this suggests that VCAM‐1 expression is involved in inflammatory cell recruitment during various inflammatory diseases. Those experimental findings have led to the development of specific antibodies to alpha 4 integrins which are currently used in patients with MS and colitis but have not yet been tested in uveitis patients (Rivier and Rine, 1992). Preliminary experimental studies in mice suggest that blocking the interaction of VCAM‐1 and its ligand VLA‐4 protects from disease development. Hence, blocking experimentations with anti‐VLA‐4 or peptide inhibitor of VLA‐
4 resulted in a less severe endotoxin‐induced uveitis (EIU) and EAU, respectively (Martin et al., 2006; Hafezi‐ Moghadam et al., 2007). In conclusion, we found that VCAM‐1 is induced on all BRB cell types during experimental non‐infectious uveitis. Moreover, in the adoptive model, the intensity and extension of its expression correlates with the severity of the disease. This suggests that VCAM‐1 might play an important role in inflammatory cell recruitment during autoimmune uveitis. REFERENCE LIST Abu el‐Asrar,A.M., Geboes,K., al‐Kharashi,S., Tabbara,K.F., Missotten,L., Desmet,V., 1997. Adhesion molecules in vernal keratoconjunctivitis. Br. J. Ophthalmol. 81, 1099‐1106. Avichezer,D., Liou,G.I., Chan,C.C., Lewis,G.M., Wiggert,B., Donoso,L.A., Nickerson,J.M., Crawford,M.A., Caspi,R.R., 2003. Interphotoreceptor retinoid‐binding protein (IRBP)‐
deficient C57BL/6 mice have enhanced immunological and immunopathogenic responses to IRBP and an altered recognition of IRBP epitopes. J. Autoimmun. 21, 185‐194. Bringmann,A., Reichenbach,A., Wiedemann,P., 2004. Pathomechanisms of cystoid macular edema. Ophthalmic Res. 36, 241‐249. Bringmann,A., Uckermann,O., Pannicke,T., Iandiev,I., Reichenbach,A., Wiedemann,P., 2005. Neuronal versus glial cell swelling in the ischaemic retina. Acta Ophthalmol. Scand. 83, 528‐538. Caspi,R.R., Chan,C.C., Fujino,Y., Najafian,F., Grover,S., Hansen,C.T., Wilder,R.L., 1993. Recruitment of antigen‐nonspecific cells plays a pivotal role in the pathogenesis of a T cell‐mediated organ‐specific autoimmune disease, experimental autoimmune uveoretinitis. J. Neuroimmunol. 47, 177‐188. Chan,C.C., Caspi,R.R., Ni,M., Leake,W.C., Wiggert,B., Chader,G.J., Nussenblatt,R.B., 1990. Pathology of experimental autoimmune uveoretinitis in mice. J. Autoimmun. 3, 247‐255. Clarke,C.J., Truong,T.G., Hannun,Y.A., 2007. Role for neutral sphingomyelinase‐2 in tumor necrosis factor alpha‐stimulated expression of vascular cell adhesion molecule‐1 (VCAM) and intercellular adhesion molecule‐1 (ICAM) in lung epithelial cells: p38 MAPK is an upstream regulator of nSMase2. J. Biol. Chem. 282, 1384‐1396. Devine,L., Lightman,S.L., Greenwood,J., 1996. Role of LFA‐1, ICAM‐1, VLA‐4 and VCAM‐1 in lymphocyte migration across retinal pigment epithelial monolayers in vitro. Immunology 88, 456‐462. Donoso,L.A., Merryman,C.F., Sery,T.W., Vrabec,T., Arbizo,V., Fong,S.L., 1988. Human IRBP: characterization of uveitopathogenic sites. Curr. Eye Res. 7, 1087‐1095. Ho,A.W., Wong,C.K., Lam,C.W., 2008. Tumor necrosis factor‐alpha up‐regulates the expression of CCL2 and adhesion molecules of human proximal tubular epithelial cells through MAPK signaling pathways. Immunobiology 213, 533‐544. Koch,A.E., Burrows,J.C., Haines,G.K., Carlos,T.M., Harlan,J.M., Leibovich,S.J., 1991. Immunolocalization of endothelial and leukocyte adhesion molecules in human rheumatoid and osteoarthritic synovial tissues. Lab Invest 64, 313‐320. La,H.E., Kuijpers,R.W., Baarsma,S.G., Kijlstra,A., van der Weiden,M., Mooy,C.M., 1998. Adhesion molecules in iris biopsy specimens from patients with uveitis. Br. J. Ophthalmol. 82, 432‐437. Lee,S.J., Benveniste,E.N., 1999. Adhesion molecule expression and regulation on cells of the central nervous system. J. Neuroimmunol. 98, 77‐88. Martin,A.P., de Moraes,L.V., Tadokoro,C.E., Commodaro,A.G., Urrets‐Zavalia,E., Rabinovich,G.A., Urrets‐Zavalia,J., Rizzo,L.V., Serra,H.M., 2005. Administration of a peptide inhibitor of alpha4‐integrin inhibits the development of experimental autoimmune uveitis. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 2056‐2063. Motulsky,E., Koch,P., Janssens,S., Lienart,M., Vanbellinghen,A.M., Bolaky,N., Chan,C.C., Caspers,L., Martin‐Martinez,M.D., Xu,H., Delporte,C., Willermain,F., 2010. Aquaporin expression in blood‐retinal barrier cells during experimental autoimmune uveitis. Mol. Vis. 16, 602‐610. Pennesi,G., Mattapallil,M.J., Sun,S.H., Avichezer,D., Silver,P.B., Karabekian,Z., David,C.S., Hargrave,P.A., McDowell,J.H., Smith,W.C., Wiggert,B., Donoso,L.A., Chan,C.C., Caspi,R.R., 2003. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. J. Clin. Invest 111, 1171‐1180. Platts,K.E., Benson,M.T., Rennie,I.G., Sharrard,R.M., Rees,R.C., 1995. Cytokine modulation of adhesion molecule expression on human retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 2262‐2269. Rivier,D.H., Rine,J., 1992. An origin of DNA replication and a transcription silencer require a common element. Science 256, 659‐663. Sans,M., Panes,J., Ardite,E., Elizalde,J.I., Arce,Y., Elena,M., Palacin,A., Fernandez‐Checa,J.C., Anderson,D.C., Lobb,R., Pique,J.M., 1999. VCAM‐1 and ICAM‐1 mediate leukocyte‐
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Autoreactive T lymphocytes were adoptively transferred in naïve mice. Three weeks after,
eye cryosections were prepared, hematoxylin-eosin staining was used to grade the disease
severity and immunofluorescent staining to detect VCAM-1 expression (in bright green A, B,
C and D). Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ILM indentifies the inner limiting
membrane, OLM the outer limiting membrane and CB the ciliary body. The figures 1A, B, C
and D are a photomontage of 36 pictures of complete section of the retina. H&E sections
representation of histological grades are shown below.
Figure 2: VCAM-1 is progressively induced in the retina in the adoptive transfer model of
EAU
Kinetics of VCAM-1 expression after adoptive transfer of autoreactive lymphocytes. Eyes
were analyzed after 1, 2 and 3 weeks. Tissues were labeled using an anti-VCAM-1 antibody
(in bright green A, B and C). Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ILM identifies the
inner limiting membrane, OLM the outer limiting membrane, CB the ciliary body and V the
vasculitis. The figures 2A, B and C are a photomontage of 36 pictures of complete section of
the retina.
Figure 3: VCAM-1 is expressed on RPE and epithelial cells of the ciliary body.
After EAU induction, retina was submitted to immunofluorescent staining for VCAM-1 by
using anti-VCAM-1 antibody. Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ECB represents the
epithelial cell of ciliary body and RPE retinal pigment epithelial cell.
Figure 4: Analysis of VCAM-1 expression on the internal limiting membranes in the
adoptive transfer model of EAU
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to
hematoxilin and eosin staining (A).
After EAU induction, the retina was submitted to
immunofluorescent co-stainings by using anti-VCAM-1 (B) and anti-GFAP (C). D
corresponds to merged image. The following secondary antibodies were used: anti-rat
conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes) and Rhodamine Red X (Jackson Immuno
research). ILM identifies the inner limiting membrane, GCL the ganglion cell layer, IPL the
inner plexiform layer, INL the inner nuclear layer, OPL the outer plexiform layer, ONL the
outer nuclear layer, OLM the outer limiting membrane, IS the inner segments of the
photoreceptors, OS the outer segments of the photoreceptors and RPE the retinal pigmented
epithelium. Pictures were taken at 20X magnification.
Figure 5: VCAM-1 expression on glial and endothelial cells in retinal vasculitis lesions in the
adoptive transfer model of EAU
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to
immunofluorescent co-staining by using antibodies anti-VCAM-1 (A), anti-endoglin (B) and
anti-GFAP (D). C, E and F correspond to merged images. The following secondary
antibodies were used: anti-rat conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes), Rhodamine
Red X (Jackson Immuno research) and Cyn5 (Jackson Immuno Research). Cell nuclei were
stained with DAPI (blue). ILM identifies the inner limiting membrane, OLM the outer
limiting membrane, RPE the retinal pigmented epithelium. Pictures were taken at 20X
magnification.
Figure 6: Confocal analysis of VCAM-1 expression in vasculitis lesions in the adoptive
transfer model of EAU.
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to
immunofluorescent co-staining by using antibodies against-VCAM-1, endoglin and Glial
Fibrillary Acidic Protein and the image analyse by confocal microscopy. Grey images
correspond to merged VCAM-1/ endoglin or VCAM-1/GFAP.
Figure 7: Analysis of VCAM-1 expression in the external limiting membrane in the adoptive
transfer model of EAU.
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to
immunofluorescent co-staining by using antibodies against-VCAM-1 (B and F), aquaporin 4
(AQ4; C) and recoverin (G) in dedicated areas of the OLM (A and E). D and H correspond
to merged images. The following secondary antibodies were used: anti-rat conjugated to
Alexa Fluor 488 (Molecular probes) and Rhodamine Red X (Jackson Immuno research). Cell
nuclei were stained with DAPI (blue). ILM represents the inner limiting membrane and OLM
the outer limiting membrane. Pictures were taken at 20X magnification. B, C,D, F, G and H
were magnified using photoshop.
Figure 8: VCAM-1 expression in the retina during classical EAU
Immunofluorescence staining of cryostat section from mice immunized with retinal extract
(IRBP 1-20) and CFA at 21 days after immunization. Section stained with antibodies against
anti-VCAM-1 (A, H and G), anti-endoglin (B) and anti-GFAP (D and I). C, E, F and J
correspond to merged images. The following secondary antibodies were used: anti-rabbit
conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes), rhodamine Red X (Jackson Immuno
research) and Cyn5 (Jackson Immuno research). Dapi nuclear staining is represented in blue.
Pictures were taken at 20X magnification.
Supplementary figures:
Negative control:
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to
immunofluorescent co-staining by using only secondary antibodies. Image A correspond to
merged image. B, C and D represent respectively staining with anti-Rat secondary antibody,
coupled to Alexa 488, anti-goat secondary antibody coupled to cyanin 5 and anti-mouse
secondary antibody coupled to Rhodamine Red X. Dapi nuclear staining is represented in
blue.
Optic Nerve
After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina sections with the optic
nerve were selected and submitted to immunofluorescent co-staining by using antibodies antiVCAM-1 (D), anti-endoglin (B) and anti-GFAP (C). A, E, F and G correspond to merged
images. The following secondary antibodies were used: anti-rat conjugated to Alexa Fluor
488, Rhodamine Red X and Cyn5. Cell nuclei were stained with DAPI (blue).
Figure 1
VCAM1
DAPI
Grade 1
Grade 0.5
CB
ILM
A
ILM
A
B
Grade 2
Grade 3
CB
CB
ILM
ILM
V
OLM
OLM
C
ECB
D
Figure 2
VCAM1
DAPI
DAY 7
DAY 14
DAY 21
CB
CB
OLM
ILM
V
ILM
V
A
B
C
Figure3.
VCAM1
DAPI
ECB
RPE
Figure3.
Figure 4.
GL
ILM
VCAM1
GFAP
B
CC
Merged
IPL
INL
OPL
ONL
OLM
IS
OS
RPE
A
D
Figure5.
VCAM1
ILM
OLM
RPE
A
Endoglin
GFAP
B
Double Merged D
Double
Merged
C
E
Triple
Merged
F
Figure 6.
VCAM1
GFAP
Merged
Merged
VCAM1
Endoglin
Merged
Figure 7.
ILM
VCAM1
OLM
OLM
A
ILM
OLM
ILM
B
VCAM1
VCAM1
OLM
OLM
E
OLMF
F
E
I
AQ 4
Merged
OLM
OLM
C
D
Recoverin
Merged
OLM
G
OLM
H
Figure 8.
ECB
ECB
ILM
G
V
Merged Endoglin
ILM
OLM
C
Merged C
B
GFAP
Triple
Merged F
ILM
H
I
OLM
OLM
J
E
RPE
VCAM1
GFAP
VCAM1
A
D
Supplementary figure:
Negative control
Triple
Merged
Alexa 488
A
B
Cya 5
RRx
C
D
Supplementary figure:
Optic nerve
Triple Merged
A
Endoglin
GFAP
B
C
VCAM1
D
Double Merged
Endoglin
VCAM1
Double Merged
E
GFAP
VCAM1
F
Triple Merged
G
2. Le TNFα inhibe l’expression du CMH II induite par l’IFNγ au niveau
des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien
TNFα suppresses IFNγ-induced MHC class II expression on retinal pigmented epithelial cells
cultures
M Makhoul, C Bruyns, P Koch, LJ Relvas, M Bazewicz, L Caspers, F Willermain.
Acta Ophtalmol. 2011 Sep; 90(1):38-42
Contexte
Un autre effet majeur de l’activation des cellules de la BHR lors d’UAE est l’induction des
molécules du CMHII à la surface de l’EPR. En effet, lors de l’inflammation, les cellules de l’EPR
expriment du CMHII et peuvent ainsi servir localement de cellules présentatrices d’antigènes et
activer les lymphocytes T autoréactifs. In vitro, l’IFNγ est la seule cytokine capable d’induire
cette expression. Néanmoins, l’EPR est également sensible à d’autres cytokines, telles que le
TNFα qui stimulent notamment la sécrétion d’autres cytokines (IL-8, IL-6…) et l’expression
d’ICAM-1111. In vivo, il est probable que ces différentes cytokines coagissent sur l’EPR. Nous
avons donc voulu tester l’effet du TNFα sur l’induction de molécules du CMH II par l’IFNγ. L’effet
du TNFα nous intéressait particulièrement puisque plusieurs des traitements par anti-TNFα sont
utilisés chez les patients atteints d’uvéite ou d’autres maladies autoimmunes.
Résultat et conclusions
Pour étudier l’effet du TNFα sur l’induction du CMH de classe II médiée par l’IFNγ, une lignée
humaine de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (ARPE-19) a été cultivée in vitro et
stimulée par du TNFα ou de l’IFNγ ou par les deux cytokines simultanément. Nos résultats
montrent que le TNFα inhibe l’induction de l’expression de molécules du CMH II à la surface de
l’EPR obtenue après traitement par l’IFNγ. L’infliximab, un anticorps anti-TNFα utilisé en clinique
humaine, annihile l’effet inhibiteur du TNFα sur l’induction de CMH II. Par contre, le TNFα
augmente l’expression d’ICAM-1 obtenue après stimulation par l’IFNγ. Par ailleurs, le TNFα n’a
pas d’effet sur l’induction d’IRF1 et la phosphorylation de STAT-1 après traitement par l’IFNγ.
Toutes ces données suggèrent que le TNFα n’agit pas en diminuant globalement la voie de
signalisation de l’IFNγ, mais agit spécifiquement sur l’induction du CMH II. L’expression de CMH
37
II est régulée au niveau transcriptionnel et fait notamment intervenir le facteur de transcription
Class II transactivator (CIITA). Nous avons donc mesuré par RT-PCR quantitative et IP
(immunoprécipitation) l’expression du CIITA dans les différentes conditions de stimulation. Nos
résultats montrent que l’IFNγ induit bien la transcription de CIITA et que cette induction est
inhibée par le TNFα.
En conclusion, nous avons établi que le TNFα inhibe l’induction de l’expression de molécules du
CMHII induite par l’IFNγ sur les cellules de l’EPR. Cet effet inhibiteur est annihilé par l’infliximab
et n’est pas dû à une inhibition globale de la voie de l’IFNγ mais à une inhibition spécifique du
CIITA. Nos résultats appuient avec l’importance du rôle du TNFα dans la résolution de
l’inflammation.
38
Acta Ophthalmologica 2012
TNFa suppresses IFNc-induced
MHC class II expression on
retinal pigmented epithelial cells
cultures
Maya Makhoul,1 Catherine Bruyns,1 William’s Elong Edimo,1
Lia Judice Relvas,1,2 Magdalena Bazewicz,1,2 Philippe Koch,1,2
Laure Caspers2 and François Willermain1,2
1
I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary Research), Université Libre De
Bruxelles-Campus Erasme, Brussels, Belgium
2
Department of Ophthalmology, CHU St-Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium
ABSTRACT.
Purpose: One major consequence of retinal pigment epithelium (RPE) cell
activation during autoimmune uveitis is the induction of MHC II molecules
expression at their surface. IFNc is regarded as the main cytokine involved in
this induction. As TNFa plays a central role in autoimmune uveitis, we investigated its effects on IFNc-mediated MHC II induction on RPE cells.
Methods: Retinal pigment epithelium cells (ARPE-19) were stimulated with
IFNc, TNFa and the anti-TNFa antibody infliximab. The expression of
MHCII and ICAM-1 was analysed by flow cytometry. The activation and
expression of IRF-1 and STAT-1, two proteins involved in IFNc-signalling
pathway, were analysed by WB. Class II transactivator (CIITA) expression
was monitored by qRT-PCR and immunoprecipitation.
Results: TNFa inhibits IFNc-induced MHC II expression on ARPE cells in a
dose-dependent manner. Infliximab completely reverses the inhibitory effect of
TNFa. We did not observe an inhibitory effect of TNFa on the expression of
ICAM-1 induced by IFNc. Similarly, IFNc-induced STAT1 phosphorylation
and IRF1 expression were not affected by TNFa. On the contrary, we found
that TNFa suppresses IFNc-induced CIITA mRNA accumulation and protein
expression.
Conclusion: TNFa inhibits IFNc-induced MHC II expression in RPE cells.
This inhibitory effect was reversed by infliximab and was not because of a global inhibition of IFNc -mediated RPE cell activation but rather to a specific
down-regulation of CIITA expression. Those findings are consistent with the
role of TNFa in the resolution of inflammation and might help to elucidate the
complex development of autoimmune uveitis.
Key words: class II transactivator – cytokines – MHCII – retinal pigment epithelium – uveitis
Acta Ophthalmol. 2012: 90: e38–e42
ª 2011 The Authors
Acta Ophthalmologica ª 2011 Acta Ophthalmologica Scandinavica Foundation
doi: 10.1111/j.1755-3768.2011.02241.x
e38
Introduction
Retinal pigment epithelial (RPE) cells
are located between the choroid and
the neuroretina and constitute the
external blood retinal barrier (BRB)
(Willermain et al. 2000). One of their
functions is to down-regulate inflammatory reactions in the posterior part
of the eye. Accordingly, the immunosuppressive properties of RPE have
been extensively described. Many
authors have reported that RPE cells
can inhibit T-lymphocyte activation
and secrete immunosuppressive cytokines such as transforming growth
factor beta (TGFb) (Willermain et al.
2002; Kaestel et al. 2005; Zamiri et al.
2005). On the other hand, in intraocular inflammation, RPE cells are the
target of a cytokine network in which
IFNc and TNFa play central roles
(Holtkamp et al. 2001). Their specific
contribution to RPE cell activation is
still unknown, and it is frequently
believed that those cytokines act in
synergy. In this setting, Shi et al.
(2008) have recently demonstrated
that stimulation of RPE cells with a
combination of IFNc, TNFa and
interleukin 1-beta (IL-1b) is far more
potent than with a single mediator in
chemokine production. However, the
effects of those cytokines on RPE cell
activation are not always additive,
and it has been shown that IFNc
Acta Ophthalmologica 2012
inhibits the TNFa- and IL-1b-induced
increase in TGFb2 production (Nagineni et al. 2007).
One of the major consequences of
RPE cell activation during inflammation is the induction of MHC class II
membrane expression. Indeed, in
marked contrast to the normal physiological situation, MHC class II
expression has been reported in
human patients with various intraocular pathologies, including uveitis. Similarly, MHC class II expression has
been found on RPE cells in the model
of experimental autoimmune uveitis
and can be induced in vitro with IFNc
stimulation (Chan et al. 1986; Liversidge et al. 1988). It has been then postulated that RPE cells can act as
antigen-presenting cells and stimulate
autoreactive lymphocytes during uveitis. Importantly, Sun et al. (2003)
have demonstrated that the level of
expression was crucial and that RPE
cells activate uveitogenic T cells when
they express a high level of MHC
class II molecules, but inhibit T cells
when they express a low level. It is
thus important to study the effects of
other common cytokines on the IFNcmediated MHC class II induction on
RPE cells.
In this work, we found that TNFa
dramatically inhibits IFNc-mediated
MHC class II induction. This inhibitory effect is reversed by infliximab, a
fact that is not owing to a global inhibition of IFNc-mediated RPE cell
activation but rather to a specific
down-regulation of class II transactivator (CIITA) expression. Those findings are consistent with the role of
TNFa in the resolution of inflammation and might help elucidate the
complex development of autoimmune
uveitis.
Materials and Methods
serum (FBS), 100 IU ⁄ ml penicillin and
100 g ⁄ ml streptomycin in a 5% CO2
and 95% humidity incubator at 37 C.
Recombinant human IFNc and TNFa
were purchased from Invitrogen.
Cell death measurements: propidium
iodide and annexin V staining
Double staining with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin V
and propidium iodide (PI; Sigma) was
performed for the quantification of
necrosis and apoptosis. Cells were harvested, washed once with ice-cold PBS
and resuspended in 100 ll calciumbinding buffer (10 mm HEPES, Ph 7.4,
140 mm NaCl, 2.5 mm CaCl2) containing annexin V-FITC (1 lg ⁄ ml) (BD
Biosciences) and PI (2 lg ⁄ ml) solution.
After 15-min incubation in the dark at
room temperature, the cells were
diluted with 400 ll binding buffer
before flow cytometric analysis (BD
FACScan and Cell Quest software,
Erembodegem-Drop, Belgium).
Flow cytometry
Cells were plated into 60-mm dishes at
5 · 105 cells ⁄ dish in complete medium
and allowed to adhere overnight. Before
stimulation, the culture medium was
replaced with fresh DMEM ⁄ HAM’S
F-12 medium supplemented with 10%
FBS. Cells were stimulated with IFNc
(150 ng ⁄ ml = 300 U ⁄ ml based on datasheet
information)
or
TNFa
(30 ng ⁄ ml) alone or with both cytokines
for 48 hr. The cells were then recovered
and washed. Expression of MHCII
molecules and ICAM-1 was quantified
by flow cytometry using a mouse antihuman specific antibody comparatively
to control isotype (Becton-Dickinson,
Erembodegem, Belgium). Labelled cells
were analysed with a FACS Calibur
flow cytometer and the Cell Quest Software (Becton-Dickinson).
Cell culture and treatment
American retinal pigment epithelium
type 19 (ARPE-19) is a spontaneously
arising human RPE cell line obtained
from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).
These cells were cultured in a 1:1 mixture of Dulbecco’s modified Eagle’s
medium (DMEM; Invitrogen, Merelbeke, Belgium) and Ham’s F12 with
2.5 mm l-glutamine (Invitrogen), supplemented with 10% fetal bovine
Western blot analysis
American retinal pigment epithelium–
type cells were cultured and stimulated
with IFNc, TNFa or both as described
previously. STAT1 phosphorylation
and IRF1 induction were analysed by
the Western blot, 30 min and 24 hr
after stimulation. Cells were lysed in a
buffer containing Tris–HCl 50 mm (pH
7.5), 100 mm NaCl, 200 mm NaF, 5 mm
Na4P2O7, 4 mm Na3VO4, 2 mm pefa-
block, 10 lg ⁄ ml aprotinine and
10 lg ⁄ ml leupeptine. Briefly, cells were
scrapped off and lysates collected. Protein concentrations were determined
using the Bradford assay. Equal
amounts of proteins (100 lg) were separated by sodium dodecyl sulphate–
polyacrylamide gel electrophoresis and
transferred to nitrocellulose membranes. Non-specific binding was
blocked by incubation with 5% fat-free
milk powder. Immunodetection was
performed by incubating the membrane with specific primary antibodies:
anti-phospho-STAT and total antiSTAT (cell signalling) and anti-IRF1
antibody (Santa Cruz) for 2 hrs at
room temperature. Blots were then
washed and incubated for 1 hr with a
secondary horseradish peroxidase–conjugated antibody before being developed using a chemoluminescent
detection kit (ECL system; Perkin
Elmer, Imperiastraat Zaventem, Belgium). For immunoprecipitation, cell
lysates were incubated overnight with
antibodies to CIITA (Santa Cruz) and
subsequently with protein G-Sepharose
for 2 hr. The beads were washed three
times in PBS and collected by centrifugation. After boiling, samples were
loaded onto 10% gel polyacrylamide,
and membranes were probed with an
anti-CIITA antibody. Immunodetection was then carried out as described
in the previous section, using chemoluminescent detection kit.
Real-time PCR
American retinal pigment epithelium–
type-19
cells
were
seeded
at
5 · 105 cells ⁄ well in 6-well plates. One
day later, IFNc (150 ng ⁄ ml), TNFa
(30 ng ⁄ ml) or both were added to the
cultures for 24 hrs. Cells were collected for quantitative reverse transcription PCR analysis of CIITA gene
expression. b-Actin was used as a
nonmodulated reference gene. The
mRNA extraction and isolation were
carried out using the automated
MagNA Pure LC Instrument system
and the MagNAPure LC mRNA
Isolation Kit II following manufacturer’s instructions (Roche Applied
Science, Vilvoorde, Belgium). A one
step real-time quantitative RT-PCR
technique using the RNA Master
Hybridization Probes Kit (Roche
Applied Science) was used to quantify
mRNA expression using specific
e39
Acta Ophthalmologica 2012
primes and fluorescent probes for
human CIITA and b-actin purchased
from Applied Biosystems (Lennik,
Belgium). Data are presented as normalized expression of CIITA versus
b-actin (2)DCIITA ⁄ bactin).
MHCII posiƟve cells (%)
80
Statistical analysis
60
50
40
30
***
20
10
0
Results
TNFa inhibits IFNc-mediated MHC class
II expression on ARPE cells
We first tested the effects of TNFa on
the IFNc-mediated MHC class II
induction on ARPE cells. American
retinal pigment epithelium–type cells
were stimulated with IFNc, TNFa or
a mixture of both cytokines. Two
days later, MHC class II expression
was analysed by flow cytometry.
Figure 1 shows that the IFNc-mediated MHC class II expression was
strongly decreased by TNFa, in dosedependent manner (Fig. 2). TNFa
alone had no effect (data not shown).
In addition, we compared the viability
of IFNc- and ⁄ or TNFa-treated and
untreated ARPE cells by performing
Annexin V-PI flow cytometry staining.
We found no significant differences in
apoptosis or necrosis between the dif-
15
30
IFNγ
Levels of significance for comparisons
between samples were determined
using Student’s test distribution.
ferent culture conditions (2–6% apoptosis ⁄ necrosis) (data not shown).
Because the anti-TNFa antibody infliximab is commonly employed to
treat patients with autoimmune uveitis, we wanted to study its effect on
the TNFa inhibition of IFNc-mediated MHC class II expression. American retinal pigment epithelium–type
cells were thus incubated with infliximab alone, IFNc and infliximab,
IFNc and TNFa or IFNc and TNFa
and infliximab before MHC class II
expression analysis. We found that
infliximab completely reversed the
inhibitory effect of TNFa on the
IFNc-mediated MHC class II expression (Fig. 3).
Cell number
2
3 4
2
0
0
100
101
102
103
MHC class II expression
Fig. 1. TNFa inhibits IFNc-induced MHC
class II membrane expression in American
retinal pigment epithelium–type (ARPE) cells.
American retinal pigment epithelium–type
cells were incubated with IFNc (150 ng ⁄ ml)
alone (profile 3) or with IFNc and TNFa
(30 ng ⁄ ml) (profile 2) for 48 hr. HLA-DR
expression was monitored by flow cytometry.
Profile 1 represents untreated cells. Data are
representative of three independent experiments.
e40
5
TNFα dose
(ng/ml)
Fig. 2. IFNc-induced MHC class II was strongly decreased by TNFa, in dose-dependent manner. American retinal pigment epithelium–type cells were incubated for 48 hr with IFNc
(150 ng ⁄ ml) alone or with IFNc and decreasing concentrations of TNFa (30–5 ng ⁄ ml). MHCII
expression was monitored by flow cytometry. Data are representative of three independent
experiments. ***p < 0.001 (compared with IFNc treatment).
2
3
7.5
IFNγ+TNFα
1
Cell number
1
70
100
101
102
103
The inhibitory effect of TNFa on IFNcmediated RPE cell activation is restricted
to MHC II induction
We next wanted to assess whether
TNFa could globally dampen the
effects of IFNc on ARPE cells. We
thus analysed the effects of TNFa on
the regulation of ICAM-1 by IFNc.
American retinal pigment epithelium–
type cells were stimulated with different combinations of IFNc and TNFa,
and 2 days later, the expression of
ICAM-1 was analysed by flow cytometry. In accordance with other reports,
we found that ICAM-1 is constitutively expressed by RPE cells and upregulated by IFNc or TNFa treatment
(Fig. 4). Figure 4 also demonstrates
that TNFa has an additive effect on
the up-regulation of ICAM-1 expression by IFNc. We also found that
TNFa had no effect on the IFNcmediated induction of indoleamine
2,3-dioxygenase
(IDO),
another
important IFNc target gene (data not
shown). Altogether, those data indicate that the inhibitory effect of
TNFa on the IFNc-mediated RPE cell
activation is not owing to a global
inhibition of the IFNc pathway.
1
MHC class II expression
Fig. 3. Infliximab restores IFNc-mediated
MHC II expression on TNFa- treated American retinal pigment epithelium–type (ARPE)
cells. American retinal pigment epithelium–
type cells were incubated with IFNc
(150 ng ⁄ ml) alone (profile 3) or with IFNc
and TNFa (30 ng ⁄ ml) (profile 2) or with
IFNc ⁄ TNFa ⁄ infliximab (5 lg) (profile 4) for
48 hr. MHC II expression was monitored by
flow cytometry. Profile 1 represents untreated
cells. Data are representative of three independent experiments.
TNFa specifically inhibits IFNc-mediated
class II transactivator expression in RPE
cells
We also investigated the effect of
TNFa on two key elements of the
IFNc signalling cascade: the phosphorylation of STAT1 and the induction of IRF1. American retinal
pigment epithelium–type cells were
stimulated with IFNc, TNFa or a
mixture of both cytokines, and cell
Acta Ophthalmologica 2012
3
Normalized CIITA mRNA
expression
4
2
101
103
104
ICAM1- expression
lysates were analysed by western blots
using specific antibodies. Figure 5
shows that IFNc stimulation induced
STAT1 phosphorylation and that
TNFa did not modulate this activation. Similarly, TNFa stimulation did
not change the level of IRF1 induction obtained after 1 day of IFNc
stimulation. These data suggest that
the inhibitory effect of TNFa on the
IFNc-mediated MHC class II induction is because of a specific inhibition
of the pathway leading to MHC class
II expression. It has been widely
described that MHC class II expression is exquisitely controlled at the
transcription level, mainly by the CIITA. We thus analysed the effects of
TNFa and IFNc on CIITA expression. American retinal pigment epithe+
–
–
TNFα
+
+
–
IFNγ
IRF-1
P-STAT
STAT-T
Fig. 5. TNFa does not modulate IFNc-mediated STAT1 activation and IRF1 induction
in American retinal pigment epithelium–type
(ARPE) cells. American retinal pigment epithelium–type cells were incubated with medium alone, with IFNc (150 ng ⁄ ml) alone or
with TNFc (30 ng ⁄ ml) and IFNc. STAT1
phosphorylation and IRF1 induction were
analysed by western blot 30 min or 24 hr
after stimulation, respectively.
TNFα
IFNγ
–
–
+
+
TNFα
–
+
–
+
IFNγ
CIITA
(B)
Fig. 4. TNFa and IFNc up-regulate ICAM-1
expression on American retinal pigment
epithelium–type (ARPE) cells. American retinal pigment epithelium–type cells were incubated with IFNc (150 ng ⁄ ml) alone (profile 3)
or with TNFa (30 ng ⁄ ml) alone (profile 2) or
with IFNc ⁄ TNFa (profile 4) for 48 hr.
ICAM-1 expression was monitored by flow
cytometry. Profile 1 represents untreated.
Data are representative of three independent
experiments.
IFNγ/TNFα
(A)
102
1
0.5
0
1
100
2
1.5
Untreated
Cell number
3
***
**
2.5
STAT-T
Fig. 6. TNFa inhibits IFNc-induced class II
transactivator expression in American retinal
pigment epithelium–type (ARPE) cells. American retinal pigment epithelium–type cells
were incubated with medium alone or with
IFNc (150 ng ⁄ ml) or with TNFa (30 ng ⁄ ml)
or with both cytokines for 24 hr. Class II
transactivator (CIITA) mRNA expression
was analysed by quantitative RT-PCR comparatively to b-actin mRNA expression (A).
CIITA protein expression was analysed after
immunoprecipitation by western blot (B).
**p < 0.01; ***p < 0.001(compared with
IFNc treatment).
lium–type cells were stimulated by
IFNc and ⁄ or TNFa and quantitative
RT-PCR, using specific primers for
CIITA, and b-actin was performed on
RNA extracts. We found that unstimulated ARPE cells did not express CIITA mRNA that was induced after
IFNc stimulation (Fig. 6A). Of note,
TNFa co-treatment inhibits the IFNcmediated mRNA CIITA expression in
ARPE cells (Fig. 6A). We further confirmed these data at the protein level
by performing immunoprecipitation
assays (Fig. 6B).
Discussion
Cytokine-mediated activation of RPE
cells has been proposed to play an
important role in inflammatory cell
recruitment and tissue damage in uveitis. In this regard, TNFa is generally
considered to be a proinflammatory
cytokine because of its stimulatory
effect on the expression of inflammatory mediators such as nitrous oxide,
adhesion molecules and cytokines by
RPE cells. However, TNFa also plays
an important role in the resolution of
the immune response (Holtkamp et al.
2001; Dick et al. 2004). Indeed, TNFa
is capable of significant immunomodulatory actions. In vivo, TNFa
prevents type 1 diabetes in non-obese
diabetic mice and delays the development of lupus in NZB ⁄ NZW F1 mice
(Jacob & McDevitt 1988; Grewal
et al.1996). In vitro, chronic exposure
to TNFa suppresses the responses of
T cells, by attenuating T-cell receptor
signalling (Jacob & McDevitt 1988;
Dick et al. 2004).
Herein, we demonstrate that TNFa
inhibits IFNc-induced MHC class II
expression in ARPE cells, by down-regulating CIITA. As lymphocyte activation by RPE cells depends on their level
of MHC class II expression, our study
supports the notion that TNFa also
possesses immunomodulatory properties on those cells (Sun et al. 2003).
The effect of TNFa on MHC class
II expression is cell type dependent.
Different groups have shown that
TNFa enhances IFNc-mediated MHC
class II expression on astrocytes,
whereas mostly no effects were found
in microglial cells (Vidovic et al. 1990;
Panek & Benveniste 1995; Luder et al.
2003). Importantly, it appears that the
additive effect of TNFa on the IFNcmediated MHC class II expression on
astrocytes is CIITA independent
(Dong et al.1999). On the contrary,
Mueller et al. have demonstrated that
TNFa inhibits up-regulation of MHC
class II expression on myeloid cells by
inhibiting CIITA expression. Interestingly, the same group found that
MHC class II expression was significantly reduced on myeloid cells from
rheumatoid arthritis patients with
active disease, but was increased to
normal levels after anti-TNFa antibody treatment. Those findings are
consistent with our data and clearly
emphasize the role that TNFa plays in
the resolution phase of inflammation.
In the context of autoimmune uveitis, the role of TNFa seems to be
dependent on the experimental model.
Studies in TNFR ⁄ p55 ⁄ p75) ⁄ ) receptor-deficient mice have demonstrated
that TNFa is not essential in endotoxin-induced uveitis and that deficient mice develop the disease
similarly to controls (Rosenbaum
et al. 1998). On the contrary, full
expression of experimental autoimmune uveitis is prevented in single
TNFRp55) ⁄ ) mice (Calder et al.
2005). Consequently, TNFa blockade
minimizes experimental autoimmune
uveitis but has no effect on and may
even exacerbate endotoxin uveitis
(Kasner et al. 1993; Rosenbaum &
e41
Acta Ophthalmologica 2012
Boney 1993; Dick et al. 1996). This
may partially explain the fact that
while TNFa blockade often appears
effective against refractory noninfectious uveitis, its efficacy is not universal. For example, complete remission
has been described in 31–75% of
Behçet patients with uveitis after
continuous
infliximab
infusion
(Theodossiadis et al. 2007). Moreover,
anti-TNFa treatment efficacy seems to
wane over time, at least in certain specific uveitis subgroups (Simonini et al.
2008). In the light of our data, we
speculate that an interference with the
regulation of MHC class II expression
on RPE cells might partially explain
those variations of clinical response
during infliximab therapy in noninfectious uveitic patients.
In conclusion, we found that TNFa
dramatically inhibited IFNc-mediated
MHC class II induction. This inhibitory effect was reversed by infliximab
and was not owing to a global
inhibition of IFNc -mediated RPE cell
activation but rather to a specific
down-regulation of CIITA expression.
These findings are consistent with the
role of TNFa in the resolution of
inflammation and might help us
understand the complex pathogenesis
of autoimmune uveitis.
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Received on October 25th, 2010.
Accepted on June 18th, 2011.
Correspondence:
Makhoul Maya
I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary
Research)
Université Libre de Bruxelles-Campus
Erasme
Brussels
Belgium
Tel: + 32 555 4104
Fax: + 32 555 4655
Email: [email protected]
3. Etude de la surexpression rétinienne du gène SOCS1 dans un
modèle murin d’uvéite autoimmune expérimentale
Retinal AAV2-mediated SOCS1 over-expression in experimental autoimmune uveoretinitis
Koch P*, Makhoul M*, Elmaleh V, Lau-Kilby A, Caspers L, Bruyns C, Tenenbaum L, Willermain F
Données non publiées
Contexte
L’activation des cellules rétiniennes par des cytokines proinflammatoires telles que l’IFNγ est une
étape clé dans le recrutement de lymphocytes T autoréactifs lors du développement d’UAE. En
effet, l’IFNγ est massivement sécrété par les lymphocytes de sous-type Th1 lors de
l’inflammation et modifie profondément la fonction des cellules rétiniennes, en particulier de la
BHR. En accord avec ces données, de l’IFNγ a été détecté dans les yeux d’UEA et chez les
patients atteints d’uvéite88,
89
. De plus, C Egwuagu et al ont démontré que l’expression
transgénique intra-oculaire d’IFNγ augmente la sévérité et accélère le développement d’UAE
chez le rat162.
L’IFNγ active la transcription de gènes pro-inflammatoires mais aussi l’induction de gènes tels
que SOCS1 qui sont impliqués dans la régulation négative de cette voie. De plus en plus d’études
montrent qu’en plus de son action sur la voie JAK/STAT, SOCS1 peut inhiber d’autres voies de
signalisation comme la voie du NF-κB163. Dans ce travail, nous avons émis l’hypothèse que le
blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ pouvait moduler le développement
d’UAE. Nous avons donc étudié l’effet de la surexpression du gène SOCS1 au niveau rétinien sur
le développement de la maladie.
Résultats et discussion
Les choix du sérotype du virus ainsi que de la voie d’injection utilisée ont été faits pour
transduire un grand nombre de cellules en traumatisant le moins possible la rétine. Dans un
premier temps, en utilisant des AAV2 exprimant la GFP, nous avons pu montrer que la technique
d’injection sous rétinienne était plus traumatique et nous avons donc décidé d’utiliser la voie
intra-vitréenne pour injecter des AVV2 contenant le gène SOCS1, dans l’œil droit des souris
uniquement. Nous avons vérifié par RT-PCR quantitative que le gène SOCS1 était bien exprimé
39
dans l’œil après injection du vecteur AAV2-CAG-SOCS1. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la
surexpression de SOCS1 sur le développement d’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas
montré de différence significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP
contrôle. Afin de normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous
avons calculé pour chaque souris un ratio grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non injecté.
L’analyse de la moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le
groupe SOCS1 et le groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre
significative lorsque l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Une analyse
plus détaillée de ces ratios histologiques montre que l’effet est plus marqué dans les zones
infectées par l’AAV2. En conclusion, nos données montrent que suite à l’injection intravitréenne
d’AAV2-CAG-SOCS1, la surexpression de SOCS1 dans l’œil ne protège globalement pas les
animaux du développement d’UAE. Cependant, elle pourrait réduire localement l’inflammation.
40
Retinal AAV2‐mediated SOCS1 over‐expression in Experimental Autoimmune Uveoretinitis Koch P*(1, 2), Makhoul M*(1), Elmaleh V(1,2), Lau‐Kilby A (2), Caspers L(2), Bruyns C (1) , Willermain F(1,2), Tenenbaum L(1). *KP and MM contributed equally to this work. (1) I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary Research), Université Libre de Bruxelles‐Campus Erasme, Brussels, Belgium. (2) Department of Ophthalmology, CHU St‐Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium. Key words: SOCS1, AAV2, EAU, clinical grading, intravitreal injection. Abstract Introduction: Activation of retinal cells by IFNγ is required for inflammatory cell recruitment during experimental autoimmune uveitis (EAU) development. IFNγ activates the transcription of many pro‐inflammatory genes but also induces suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins, which act as negative regulators of IFNγ signalling. Purpose: To study the effects of retinal SOCS1 overexpression on EAU development. Methods: Adeno‐associated vectors AAV2‐ CAG‐GFP or AAV2‐CAG‐hSOCS1 were injected intravitreally in the right eye solely. Four weeks after AAV injection, EAU was induced in C57Bl6 mice by sc immunization with IRBP peptide 1‐20. Disease severity was measured by clinical and histological grading. GFP and MHC II expression were analyzed by immunofluorescence and SOCS1 expression by quantitative RT‐PCR. Results: Intravitreal injection of AAV2‐CAG‐SOCS1 resulted in ocular SOCS1 overexpression. No statistical difference was observed between EAU grading of eyes injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 or AAV2‐CAG‐GFP recombinant viruses. However, a high inter‐animal variability of disease induction was observed, possibly masking the effect of SOCS1. In order to normalize for disease severity, the means of ratios of the clinical scores of the AAV injected eyes over the contralateral non‐injected eyes (I/NI) were calculated and found to be not quite significant between SOCS1 and EGFP group. In contrast, this difference becomes significant when the mean of ratio analysis was performed in histological grades. Moreover when the different constituents of the histological grading where independently analysed the protective effect was more pronounced in the compartments targeted by the intravitreal AAV injection. Conclusion: Following AAV2 intravitreal injection, SOCS1 retinal expression does not globally protect against EAU development. However, our data suggest that it may reduce inflammation locally at the site of infection. Introduction Uveitis is an important cause of blindness worldwide and affects predominantly patients in the working age group (Wakefield and Chang, 2005). The inflammatory process can affect different parts of the eye and is often of autoimmune origin. Autoimmune uveitis can also be induced in susceptible animals by injections of retinal antigens or their derived peptides. Experimental autoimmune uveitis (EAU) possesses many characteristics of human autoimmune posterior uveitis with the formation of vitritis, retinal vasculitis and chorioretinitis (de Smet and Chan, 2001). Human and experimental data have helped to characterize some important aspects of the disease. Autoimmune lymphocytes of the Th1 and Th17 subtypes have been found both during EAU and in patients affected of autoimmune uveitis (Amadi‐Obi et al., 2007; Nussenblatt et al., 1980). Those lymphocytes are stimulated in the periphery and at the eye level, activate the cells of the blood retinal barrier (BRB), promoting thereby intraocular inflammation and uveitis development. Hence, retinal pigment epithelium (RPE), microglial cells, Müller cells and astrocytes have been proposed to account for the penetration of inflammatory cells into the eye (de Kozak et al., 1994; Jiang et al., 2008; Willermain et al., 2000). The role of pro‐inflammatory cytokines such as IFNγ and TNFα in their activation has also been widely described (Holtkamp et al., 2001; Xu et al., 2003). IFNγ, a type II family cytokine, is massively secreted by Th1 lymphocytes and has been detected in the eyes of patients with uveitis (Hooks et al., 1988). IFNγ has pro‐inflammatory effects on all retinal cell types involved in pathological inflammatory cell recruitment. Studies have mostly focused on RPE cells in which IFNγ induces MHC class II, ICAM1, CD40, and cytokine expression (Liversidge et al., 1988; Milikan et al., 2009; Willermain et al., 2000). In vitro, IFNγ also stimulates retinal astrocytes and Müller cells to produce proinflammatory cytokines (de Kozak et al., 1994; Ke et al., 2009). Accordingly, intraocular expression of IFNγ increases the severity and accelerates the onset of EAU in transgenic rats (Egwuagu et al., 1999). IFNγ activates the JAK/STAT signaling pathways leading, through a series of phosphorylations, to the activation of the STAT transcription factor which will promote the transcription of IFNγ‐regulated genes (Baker et al., 2009). Most of them are pro‐
inflammatory, but IFNγ also induces suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins, which act as negative regulators. Interestingly, it has been demonstrated that SOCS1 is induced in retina during EAU and suggested that this gene could be implicated in the negative regulation of the disease (Liu et al., 2008; Takase et al., 2005). Moreover, SOCS1 overexpression has been demonstrated to block IFNγ activation in vitro and to protect organ damage in experimental models of autoimmune diabetes and lung inflammation (Federici et al., 2002; Flodstrom‐Tullberg et al., 2003; Nakashima et al., 2008). It is thus possible that retinal overexpression of SOCS1 could block the activation of resident cells by IFNγ and protect eyes from EAU development. Different groups have demonstrated that adeno‐associated viruses (AAV) are excellent tools for gene transfer into the retina, without inflammatory reaction. Different cellular tropisms have been described, depending on the serotype and route of administration (Ali et al., 1998). Intravitreal injection of AAV2 vectors leads to infection of ciliary body, Müller cells and ganglion cells (Dudus et al., 1999; Harvey et al., 2002; Klimczak et al., 2009; Smith et al., 2005). In contrast, AAV2 subretinal injection results mainly in RPE and photoreceptor infection (Ali et al., 1998; Ali et al., 1996). In the context of EAU, two groups have shown, using either the intravitreal or the subretinal route, that AAV2 driven viral interleukin‐10 (vIL‐10) expression protects animals from EAU development (Broderick et al., 2005; Smith et al., 2005). Therefore, based on the down‐regulating role of SOCS1 in the IFNγ cascade and the usefulness of AAV vectors for retinal gene transfer, we herein investigated an AAV2‐
mediated SOCS1 intraretinal overexpression to prevent EAU development. Material and Methods Animal care 8 weeks old female C57BL/6J mice were purchased from Charles River (Brussels, Belgium) and were bred in accordance to the ARVO statement for the use of animals in ophthalmic and vision research. Adeno‐associated viruses AAV vector plasmids, harbouring ITRs from serotype 2 and the human SOCS1 or eGFP genes under the control of the CAG promoter were constructed at the Gene Vector Production Network (GVPN; Laboratoire de Thérapie Génique, Nantes, France). Recombinant viruses were produced using a transencapsidation production method (Weber et al., 2003). The injected titers, expressed in viral particles per ml, were of 4.7.1010p/ml for AAV2‐CAG‐
hSOCS1 and titer‐matched for AAV2‐CAG‐eGFP. Ocular injections Animals were anesthetized by a 100µL intramuscular injection in the leg of Rompun 0.2% and Ketalar 20mg/mL mixture. Eyes were dilated using tropicamide 0.5% (Tropical, Thea Pharma, France) drops and a cover slip was positioned on the cornea using a viscoelastic gel (Vidisic®, Tramedico, Belgium). Intravitreal delivery of 3µL of PBS, AAV2‐CAG‐eGFP or AAV2‐
CAG‐hSOCS1 recombinant viruses was performed in the right eye only using a 33Ga Hamilton needle (7803‐05, Hamilton, Reno, USA) under microscopic control (Zeiss, Göttingen, Germany). Subretinal injection of AAV2‐CAG‐eGFP was similarly done with a puncture realized from the vitreous cavity through the retina. Real time RT‐PCR Total RNA was isolated from normal eyes or eyes injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 by using Trizol (Invitrogen, Merelbeke, Belgium) combined with a purification step with the RNeasy mini kit (Quiagen, Venlo, Netherlands). SOCS1 mRNA quantification has been performed by using a one step quantitative RT‐PCR assay with the RNA Master Hybridization Probe Kit (Roche Applied Science). The primes and fluorescent probes used to detect human SOCS‐1 and β‐actin were purchased from Applied Biosystems (Lennik, Belgium). EAU induction Four weeks after intraocular vector delivery, EAU was induced by injecting subcutaneously 500µg of IRBP peptide 1‐20 (GPTHLFQPSLVLDMAKVLD, Sigma Genosys, UK) v/v CFA with 2.5mg/mL Mycobacterium Tuberculosis (Sigma, UK) and intraperitoneally 1.5µg Pertussis Toxin (Sigma) per mouse. Clinical grading Mice eyes were examined every week, from one day after surgery to 4 weeks after EAU induction. A full clinical grading system was performed at 28 days post‐immunisation. For this purpose, eyes were dilated and examined under the slit‐lamp of a surgical microscope (Zeiss, Göttingen, Germany) using a coverslip and viscoelastic material (Vidisic®, Tramedico, Belgium). Clinical grade has been optimised by P. Koch, accordingly to a previously described system (Xu et al., 2008). Briefly, vitritis as well as optic neuropathy were examined as separate scores and vasculitis and retinitis were graded as either active or inactive inflammation in term of percentage of lesions and the most severe injury found in the fundus. Clinical score was a mean of 10 different grades on a maximum score of 4 (Koch P., PhD thesis). Histology and immunofluorescence staining For histology and immunohistochemistry, animals were sacrificed at 28 days post‐
immunisation. Injected and non‐injected eyes were removed, and fixed in 4% paraformaldehyde and 3% sucrose at 4°C for 6 hours. Eyes were then put in three successive baths of respectively 5, 10 and 20% of sucrose for 24 hours each before being embedded in OCT (TissueTek®, Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Nederlands) and stored at ‐80°C. 10 micron sections were obtained at ‐23°C using a cryostat (Leica CM 3050S), with 5 samples of sections at each level (serial cuttings) in order to correlate histology and immunofluorescence. A classical haematoxylin‐eosin (H&E) staining was then realized. In order to get comparable results with our clinical grading system, all sections of all eyes (between 12 and 28 sections per eye) were analysed following the AD Dick's histological grading system, by two independent observers (Dick et al., 1994). For immunofluorescence, conventional techniques were used with the following different primary and secondary antibodies: anti‐GFP rabbit polyclonal antibody (1:1000, Abcam, UK); anti‐MHCII rat polyclonal antibody (1:100, BD Pharmingen, Belgium); anti‐GFAP mouse monoclonal antibody (1:500, Sigma‐Aldrich, Belgium); anti‐vimentin rabbit polyclonal antibody (1:100, Sigma‐Aldrich, Belgium); anti‐chicken FITC‐conjugated secondary antibody (1:400, Jackson Immunolabs, USA); anti‐rat Cyanine 2 (1:1000, Invitrogen, Merelbeke, Belgium); anti‐rabbit coupled to Cyanine 5 (1:600 Jackson Immunolabs, USA) and anti‐rat coupled to Cyanine 3 (1:600,Jackson Immunolabs, USA). Different anti‐SOCS1 primary antibodies (i.e. H‐93, SantaCruz) were tested without strong repetitive evidence of a specific labeling. Nuclei were counterstained with Dapi. Slides were mounted with fluorsave® (Darmstad, Germany). A laser scanning Axiocam MR2 fluorescent microscope equipped with the Axiovision v4.7 sotware (Zeiss, Göttingen, Germany) and a confocal microscope (Axiovert100, Carl Zeiss, Germany) equipped with automated analysing system (Lasersharp version 3,2 biorad) were used to analyse the labelled slides. Pictures have been optimised and assembled when necessary using Photoshop CS4 software. Statistical analysis Data are presented as means ± standard error (SD) of mean. Severity of EAU was examined by non‐parametric Mann‐Whitney U test using SPSS v12 software. A statistically significant difference was obtained with p value equal or less than 0.05. Results 1. Comparative effects of subretinal or intravitreal injections of AAV2 vectors on retina transduction. As a prerequisite to the study of SOCS1 retinal overexpression on the EAU development, we first investigated, with a control AAV2 vector expressing the marker gene GFP (AAV2‐CAG‐
eGFP), the influence of different routes of administration on retina transduction. Subretinal injections of AAV2‐CAG‐eGFP vectors were done through the vitreous cavity, following a clinical‐based injection technique, and compared to common intravitreal injections. As illustrated in figure 1a, subretinal injections led to a strong transduction of the outer retina, including RPE cells, in the area of the bullous retinal detachment (figure 1b) but also of the inner retina (figure 1c). However, by using this technique, a retinal scar was observed at the injection site (figure 1b). This remodelling was frequently limited but some retinal changes were always observed by fundus examination and histology. In some selected cases, this scarring process was important with folds of the whole retina and the emergence of retinal folds, as shown in figure 1d. In contrast, intravitreal vector delivery was an efficient technique to widely infect the inner retina up to the outer plexiform layer, without retinal destructions (figure 1e). As demonstrated in figure 1f, epithelial cells of the ciliary body were also transduced. Thereby, we decided to use classical intravitreal injections for later SOCS1 gene transfer experiments in EAU. Careful analysis of the GFP green staining suggests that intravitreal injections of AAV2‐CAG‐
eGFP permit the infection of retinal ganglion cells and other neurons, as well as epithelial cells of the ciliary body and Müller cells. We further realised co‐staining experiments with antibodies against vimentine (Cy3, red, detection of Müller cells) and GFAP (Cy5, pink, detection of astrocytes and activated Müller cells) to better analyse retinal glial cell infection. As shown in figure 2, superior panel, AAV2‐CAG‐eGFP intravitreal delivery allows the transduction of retinal cells that are vimentine and GFAP negative, representing most probably retinal ganglion cells but not astrocytes. In the inferior panel, some Müller cells were infected. By comparing superior and inferior panels (arrowhead), we identified in some areas activated Müller cells that were GFAP positive. By using the intravitreal route, we were not able to transduce RPE cells. 2. SOCS1 expression after intravitreal injections of AAV2‐CAG‐hSOCS1 vector In a second set of experiments, we examined if the intravitreal delivery of AAV2‐CAG‐
hSOCS1 vector was effective to obtain a human SOCS1 overexpression in the mouse retina. We have chosen to use human SOCS1 because of potential usefulness in human cells; moreover, it has been reported to be functional in mice (Cottet et al., 2001), we have ourselves tested the efficacy of the human SOCS1 on mouse RPE cells (supplementary data 1). Adult C57BL/6J mice were thus injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 recombinant viruses (4.7.1010 particles/mL) in the vitreous cavity of the right eye, the non‐injected left eye serving as control. Four weeks later, the animals were killed and their eyes recovered. Unfortunately, none of the four different antibodies we have tested for human SOCS1 histological detection gave a suitable and reproducible fluorescent signal on eye cryosections. We thus extracted the RNA from the whole eyes and performed real time RT‐
PCR assays for the human SOCS1 mRNA expression referred to the house keeping gene ‐
actin mRNA expression. As observed in figure 3, we obtained a strong expression of SOCS1 in the injected eyes, as compared to normal eyes (p<0.05) or contralateral non‐injected eyes (p<0.05). 3. Effects of SOCS1 retinal overexpression on EAU development After having demonstrated that AAV2‐CAG‐hSOCS1 injections lead to ocular SOCS1 expression, we have next evaluated the effects of this expression on EAU development. We thus performed intravitreal injections in the right eye of C57BL/6J mice with PBS or AAV2‐
CAG‐hSOCS1 or AAV2‐CAG‐eGFP recombinant viruses. Four weeks later, an EAU was induced by systemic immunisation with IRBP 1‐20. The animals were followed weekly by fundus examination. At day 28, a final clinical grading was performed in both eyes (right injected ones and left non‐injected ones) of all mice. Animals were then killed and their eyes processed for histology. Two independent experiments were conducted for the SOCS1 (n=9) and GFP (n=9) groups. The figures 4a, illustrate the clinical scores of all injected (I) and non‐
injected (NI) eyes in the PBS, GFP and SOCS1 groups respectively. As a whole, the data did not show any statistical difference in the clinical grading of EAU between the AAV2‐CAG‐
hSOCS1 and the AAV2‐CAG‐eGFP injected eyes. However, as illustrated in figure 4a, there exists a high individual variability in the severity of the disease from one animal to another. We thereby decided to calculate for each mouse the ratio of the clinical scores of the injected eye on the non‐injected one. The mean of the ratios were 1.14+/‐0.48, 1.26+/‐0.46, 0.98+/‐0.30 in the PBS, GFP and SOCS group respectively. The difference between eGFP and SOCS mean were not quite significant (p=0.078) and non‐significant between PBS and SOCS (p=0.172) (Figure 4b). In contrast, this difference becomes significant when the mean of ratio analysis was performed in histological grades (Figure 4c). Moreover when the different constituents of the histological grading where independently analysed the protective effect was more pronounced in the compartments targeted by an intravitreal AAV injection. As illustrated in figure 4d, we found the highest significant difference in the mean of ratios between the GFP and SOCS1 groups when analysing the ciliary body, the vasculitis and perivascular cuffing (p=0.008, p=0.009 and p=0.008 respectively). No significant differences were observed for vitritis (p=0.366) nor rod outer segment (p=0.534). 4. MHC class II expression during EAU and after GFP/SOCS1 gene transfer MHCII is thought to play a major role in the activation of lymphocytes within the retina during EAU (Jiang et al., 2008) and is strongly up‐regulated by IFNγ. We thus decided to examine if SOCS1 over‐expression could have any effect on retinal MHCII expression. We therefore analysed the expression of MHC class II in EAU eyes injected with the AAV2‐CAG‐
eGFP vectors and interestingly, we never observed GFP expressing cells that expressed MHCII even when MHC class II expressing cells were very close to the GFP positive cells (figures 5a and 5b). Moreover, in some areas with very severe inflammation, the GFP‐
expressing retinal cells seemed to be destroyed by MHCII expressing cells (figure 5c). Unfortunately, we were not able to correlate MHCII and SOCS1 expression, since we could not find good quality antibodies for human SOCS1 detection. Discussion Immunosuppressive gene transfer into retinal cells represents a promising strategy for the management of autoimmune uveitis. Until now, such approach has been based on retinal cell transduction for secreted immunosuppressive cytokines such as IL‐10, IL‐1 RA and hIFN‐
α (Broderick et al., 2005; Smith et al., 2005; Trittibach et al., 2008; Lichun T et al 2011). However, targeting intracellular pathways implicated in retinal cell activation seems more specific and might be more advantageous (Ke et al., 2009). We have thus tested in this work if retinal SOCS1 overexpression could protect from EAU development. Actually, AAV2 has emerged as an excellent candidate to infect the retina, depending on the route of administration, without inducing inflammatory response in healthy animals (Bainbridge et al., 2003). With AAV2‐CAG‐eGFP vectors, we have experienced two routes of delivery, the intravitreal one and the subretinal one which was more comparable to human surgery. Subretinal injection through the vitreous cavity allowed us to combine subretinal and intravitreal delivery, probably due to an expulsion of viruses from the retinal bubble to the vitreous cavity. However, it led to a traumatic remodelling of the retina, leading us to choose classical intravitreal injections for later gene transfer experiments in EAU. In line with published reports, we found that intravitreal injection of AAV2‐CAG‐eGFP leads to infect Müller cells and epithelial cells of the ciliary body, both cell types being implicated in inflammatory cell recruitment and EAU development (Harvey et al., 2002; Hauck et al., 2007; Smith et al., 2005). Interestingly, it has been demonstrated that, even if only 15% of total Müller cells were infected after intravitreal AAV2 injection, intravitreal delivery of vectors to the inner retina could be enhanced by digestion of the inner limiting membrane or by the use of an AAV6 vector variant (Dalkara et al., 2009; Klimczak et al., 2009). Those two strategies should be investigated in EAU to enhance infection‐related limitations. After having demonstrated, by real time PCR, an ocular SOCS1 expression following intravitreal AAV2‐mediated gene transfer, we next investigated the effects of SOCS1 overexpression on EAU, by comparing the effects of intravitreal injections of either AAV2‐
CAG‐hSOCS1 or AAV2‐CAG‐eGFP vectors versus PBS, in the right eyes of C57BL/6J mice, four weeks before immunisation with IRBP 1‐20 retinal antigen. Overall, our data did not show any statistical difference in the clinical grading of EAU between the SOCS1, injected eye and the contralateral non‐injected control eye. It is common to observe an important variability in the severity of EAU between different animals but each frequently develops a comparable inflammation in both eyes. We therefore decided to compare for each animal, the clinical and histological scores of the right injected on the left uninjected eyes and calculated a mean of those ratios for the SOCS1 and GFP groups to further examine the effect of SOCS1 overexpression in EAU. The mean of the ratios of the clinical scores was non significantly reduced in the SOCS1 group as compared to the EGFP group. In contrast, the difference in mean of ratio of histological score between SOCS1 group and the GFP group was significant. Interestingly, when we independently analysed the different constituents of the histological grading, the decreased inflammation was definitely more pronounced within the ocular compartments targeted by an intravitreal AAV2 infection. Concerning the MHCII expression by the retina, we never detected in the inner retina and ciliary body GFP expressing cells that were MHCII positive. Unfortunately, since none of the different antibodies we have tested for human SOCS1 histological detection gave a suitable and reproducible signal on eye cryosections, we could not investigate MHCII expression in SOCS1 infected retinal cells. The global retinal expression of MHCII did not seem to be significantly different between the AAV2‐CAG‐hSOCS1 injected eyes and non‐injected controls. Our results do not allow concluding that SOCS1 expression, mediated by intravitreal injection of AAV2 protects the eyes from EAU development. Those data are in contrast with the established role of local tissue SOCS1 expression in the control of inflammation in organ specific autoimmune damage including EAU (ref SOCS1/EAU) which has been shown to protect organ from tissue damage (Balabanov R et al., 2009; Yu CR et al 2011). This can be explained by several hypotheses. First, intravitreal AAV2 injections lead to a relatively limited infection of retinal cells implicated in EAU development. Hence, our data are in agreement with other studies demonstrating that intravitreal injection of AAV2 mostly infecting ganglion cells rather than BRB cells. Second, it is also possible that SOCS1 overexpression only affects retinal cell activation by IFNγ but not by other cytokines also playing an important role in EAU development, such as IL‐17 or TNFα. However, the recent description by Yu CR et al, that transgenic mice and rats expressing SOCS1 under the control of the opsin promoter are protectived from EAU development, suggest that a strong SOCS1 expression in none BRB cells is sufficient to block EAU development (Yu CR and al., 2011). A third explanation might be that the level of protein expression was too low to obtain a significant protective effect. In conclusion, immunosuppressive gene transfer is an interesting approach for treatment of uveitis. Among all potentialities, blocking the activation of retinal cell by proinflammatory cytokines appears as a very elegant way to protect the eye from inflammatory development. However, following AAV2 intravitreal injection, SOCS1 retinal expression does not globally protect against EAU development. However, our data suggest that it may reduce inflammation locally at the site of infection. REFERENCE LIST: Ali, R.R., Reichel, M.B., De Alwis, M., Kanuga, N., Kinnon, C., Levinsky, R.J., Hunt, D.M., Bhattacharya, S.S., and Thrasher, A.J. (1998). Adeno‐associated virus gene transfer to mouse retina. Hum Gene Ther 9, 81‐86. Ali, R.R., Reichel, M.B., Thrasher, A.J., Levinsky, R.J., Kinnon, C., Kanuga, N., Hunt, D.M., and Bhattacharya, S.S. (1996). Gene transfer into the mouse retina mediated by an adeno‐
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eGFP vectors. Figure 2: AAV2 intravitreal injection leads to inner retina transduction Another set of slides from the GFP expressing eyes (as shown in figure 1) were co‐stained with DAPI, with an anti‐vimentine antibody (Cy3, red) for a specific detection of Müller cells and with an anti‐GFAP antibody (Cy5, pink) for a detection of astrocytes and activated Müller cells (figure 2, superior and inferior panels, left, merge pictures). Superior panel: GFP expression by retinal cells that are vimentine (middle) and GFAP (right) negative, most probably retinal ganglion cells, but not astrocytes (asterisk). Inferior panel: GFP transduced Müller cells. The arrowhead in the superior panel shows GFAP positive astrocytes whereas in the inferior panel it identifies also activated Müller cells that were GFAP positive. Figure 3: Detection of SOCS1 overexpression by real time PCR C57BL/6J mice were injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 recombinant viruses (4.7.1010 particles/mL) in the vitreous cavity of the right eye, the non‐injected left eye serving as control. Four weeks later, the animals were killed and their eyes recovered. Human SOCS1 expression was tested by quantitative RT‐PCR on whole SOCS1 injected or contralateral non‐
injected eyes comparatively to normal eyes. Mean +/‐ SD. ** p= 0.02 and *** p=0.006. Figure 4: Effects of SOCS1 delivery on EAU development C57BL/6J mice were injected intravitreally, in the right eye only, with either PBS (n=6), AAV2‐
CAG‐eGFP (n=9) or AAV2‐CAG‐hSOCS1 (n=9) vectors, four weeks prior to immunisation with IRBP 1‐20. 28 days later, a full clinical grading of all eyes was performed, scoring inflammation. Mice were then sacrificed, their eyes processed and analysed for a clinical and histological grading. Figures 4a: represent clinical scores of all injected (I) and non‐injected (NI) eyes in the PBS, GFP and SOCS1 groups (pooled data from two independent experiments). Figure 4b: represent the mean of the ratios of the injected (I) versus non‐
injected (NI) eye of each individual mouse in the PBS, GFP and SOCS1 groups, for the clinical (PBS/SOCS: p=0.172, GFP/SOCS p=0.078 respectively). Figure 4c: illustrate the difference in the mean of histological ratios between SOCS group and the EGFP group (p=0.032). Figure 4d: similar calculations of mean of ratios for different elements representative of the histological score: ciliary body p=0.008, vasculitis p=0.009 and vascular cuffing p=0.008. Mean+/‐SD. Figure 5: MHCII expression after eGFP or SOCS1 overexpression in EAU Intravitreal administration of AAV2‐CAG‐eGFP or ‐SOCS1 vectors was performed in right eyes of 8 weeks old C57BL/6J mice, four weeks prior to their immunisation. 4 weeks later, EAU animals were killed and eyes were processed for immunohistology. Figures 5a, 5b, and 5c illustrate GFP (Cy2, green), MHCII (Cy3, red) and DAPI (blue, for nucleus) co‐labelling.. Pictures were taken at x20 magnification. Figure 5a: GFP expression within the epithelium from the ciliary body (arrow). No correlation was found with the red expressing MHCII cells (arrowhead). Figure 5b, asterisk: positive MHCII expression in small vasculitis associated with a fine cuffing leading to an invasion of cells in the subretinal space (figure 5b, arrowhead) and inflammatory cells within a granuloma (figure 5c, asterisk). None expressed GFP. Supplementary data 1: Effects of human SOCS1 stable overexpression in RPE mice cells activation by IFNγ. We constructed a plasmid containing hSOCS1 gene (plasmid SOCS1). As control, we used the same plasmid without SOCS1 gene (plasmid CTRL). Subsequently, we performed stable transfection in RPE mice cells in order to obtain 2 cells lines; clone SOCS1 and clone CTRL. The effect of IFNγ stimulation on STAT1 and P‐STAT1 expression was then analysed by western blot. Figure 1
Figure 2
Figure 3
Normalized SOCS1 mRNA expression
**
Normal eyes
***
Non injected eyes
AVV‐SOCS1 injected eyes
Figure 4
NS
NS
a.
eGFP n=9
SOCS1 n=9
Clinical gradinf (/4)
PBS n=6
I
NI
b.
I
NI
I
NI
NS
Mean of ratio I/NI Grading Clinic
NS
PBS n=6
eGFP n=9
SOCS1 n=9
Figure 4
**
Mean of ratio I/NI Grading Histology
c.
d.
Mean of ratio I/NI Grading Histology
eGFP n=6
***
Ciliary body
SOCS1 n=6
***
Vasculitis
***
Vasc Cuffing
Figure 5
Supplementary data 1
RPE Clone CRTL Clone SOCS1
/‐/ IFNγ
91kDA
100kDA
STAT1
P‐STAT1
4. Effet de la surexpression stable du gène SOCS1 dans l’activation in
vitro d’épithélium pigmentaire rétinien par des cytokines proinflammatoires
Effect of SOCS1 overexpression on RPE cells activated by cytokines
Bazewicz M*, Makhoul M*, Draganova D, Chartro A, Tenebaum L, Elmaleh V, Bruyns C,
Willermain F
Données non publiés
Introduction
Une des hypothèses permettant d’expliquer la relative absence d’effet in vivo de la
surexpression de SOCS1 au niveau rétinien sur le développement de l’UAE est que SOCS1 bloque
principalement la voie de l’IFNγ et n’affecte pas les autres voies d’activation des cellules
rétiniennes impliquées dans le développement d’UAE. Néanmoins, plusieurs travaux réalisés sur
d’autres types cellulaires suggèrent que l’expression de SOCS1 est transitoirement induite par
une grande variété de cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires et peut interférer avec
leur activation (1,2). Brand et al ont par exemple démontré que, dans les cellules hépatiques,
l’IL-22 active la voie STAT1 et induit ainsi l’expression de SOCS1 qui bloque la prolifération
hépatique (3). De plus, SOCS1 par sa liaison à la sous-unité p65 de la protéine NF-κB, renforce
son ubiquitylation et sa dégradation et par conséquent régule négativement la signalisation
induite par le NF-κB (4). De même, Ke Y et al ont montré, sur une lignée de cellules d’EPR de
souris, que l’IL-17 induisait l’expression de SOCS1 et que cette expression limitait l’activation de
ces cellules par l’IL-17 (5).
En accord avec ces données, les résultats de Yu CR et al ont démontré qu’une surexpression de
SOCS1 par les photorécepteurs permet de bloquer le développement d’UAE, suggérant que
SOCS1 pourrait bloquer l’activation des cellules rétiniennes par plusieurs cytokines (6). Nous
avons décidé d’investiguer cette hypothèse. Pour ce faire, nous avons surexprimé le gène SOCS1
par transfection stable dans une lignée humaine de cellules ARPE-19. Nous avons ensuite
investigué les effets de cette surexpression sur l’activation des cellules de l’EPR par différentes
cytokines : IFNγ, TNFα et IL-22.
41
Résultats
1. EFFET DE L’IFNγ SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.
1.1 Etude de l’expression stable de SOCS1 par les clones cellulaires et effet de l’IFNγ sur
l’expression de SOCS1 par les ARPE.
Nous avons commencé ce travail en quantifiant par qRT-PCR l’expression de SOCS1 dans les
clones SOCS1 et CTRL et dans les cellules ARPE natives ou stimulées par l’IFNγ. Les données de la
fig.1 montrent que la stimulation des ARPE par l’IFNγ pendant 24h entraine une augmentation
dose-dépendante de l’expression de l’ARNm SOCS1. Cette figure montre également que le clone
SOCS exprime des taux d’ARNm SOCS1 largement supérieurs à ceux exprimés par les cellules
ARPE non-stimulées. Par contre, le clone CTRL présente une expression de SOCS1 identique à
celle des ARPE non stimulées.
1.2. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la transduction du signal intracellulaire induit
par l’IFNγ.
Une stimulation par l’IFNγ entraine la phosphorylation du facteur de transcription STAT1. Nous
avons donc testé par WB la présence de la forme phosphorylée de STAT1 (P-STAT1) dans les
ARPE et les clones stimulées ou non par de l’IFNγ. La fig.2 montre qu’en absence de stimulation
par l’IFNγ, P-STAT1 n’est détecté ni dans les ARPE, ni dans les clones. Après stimulation par l’IFNγ
pendant 5 ou 30 minutes, P-STAT1 est présent aussi bien dans les ARPE que dans le clone CTRL.
En revanche, dans le clone SOCS1, P-STAT1 n’est que très faiblement détecté. Dès lors, dans ces
conditions expérimentales, seule la surexpression stable de SOCS1 empêche la phosphorylation
de STAT1 en réponse à une stimulation par l’IFNγ.
1.3. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54
et CMH II induite par l’IFNγ.
Nous avons ensuite étudié par cytométrie de flux l’effet de la surexpression de SOCS1 sur
l’expression membranaire de CD54 et de CMH II (fig.3). Les résultats montrent que les clones
SOCS1 et CTRL expriment constitutivement, et de manière égale, du CD54 pas du CMH II. Une
42
stimulation par IFNγ augmente de l’expression du CD54 et induit celle du CMH II sur le clone
CTRL mais pas sur le clone SOCS1.
1.4. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL-8 induite par l’IFNγ.
Nous avons quantifié comparativement par ELISA la sécrétion d’IL-8 par les clones SOCS1 et
CTRL. La fig.4 indique que le clone CTRL secrète constitutivement de l’IL-8 et que le clone SOCS1
en secrète quatre fois moins. La stimulation par l’IFNγ inhibe la sécrétion d’IL-8 par le clone CTRL
et cet effet inhibiteur n’est pas retrouvé dans le clone SOCS1.
2. EFFECT DU TNFα SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.
2.1. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la transduction du signal intracellulaire induit
par le TNFα.
Une stimulation par le TNFα entraine la phosphorylation et la dégradation d’IκB dans le
cytoplasme ce qui permet la libération du facteur de transcription NFκB et sa translocation au
noyau. Les données de WB de la fig.5 montrent la présence d’IκBα dans les ARPE et dans les
clones au repos. Après stimulation par le TNFα, l’IκBα est dégradée dans les ARPE ainsi que dans
les clones CTRL et SOCS1. Ces résultats indiquent que la surexpression de SOCS1 n’a pas d’effet
sur la phosphorylation et la dégradation de l’IκBα.
2.2. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54
et CMH II induite par le TNFα.
La modulation de l’expression membranaire de CD54 et de CMH II par les clones sous l’effet du
TNFα a été étudiée comparativement par cytométrie de flux. La fig.6 montre que le TNFα
n’induit pas l’expression du CMH II sur les clones SOCS1 et CTRL. En revanche, le TNFα induit
l’expression du CD54 par le clone CTRL. Cette induction est très faiblement inhibée dans le clone
SOCS1.
43
2.3. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL-8 induite par le TNFα.
Les résultats de la fig.7 indiquent que la stimulation par TNFα augmente très fortement, et de
façon similaire, la sécrétion basale d’IL-8 par les clones SOCS1 et CTRL. La surexpression de
SOCS1 n’empêche donc pas l’induction de la sécrétion d’IL-8 par le TNFα. Néanmoins, lorsque
nous combinons une stimulation par TNFα et IFNγ, nous observons un effet inhibiteur de l’IFNγ
sur l’induction d’IL-8 par le TNFα dans le clone CTRL mais pas dans le clone SOCS1.
3. EFFET DE L’IL-22 SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.
3.1. Mise en évidence du récepteur à l’IL-22.
L’IL-22, une cytokine produite par les lymphocytes Th17, est impliquée dans une série de
maladies inflammatoires. Nous avons décidé d’étudier son rôle dans l’activation de l’EPR. Nous
avons commencé cette étude par la mise en évidence du récepteur IL-22Rα1 dans les ARPE par
WB. Le récepteur à l’IL-22 est un hétérodimère composé de l’IL-10R2, ubiquitaire, et de l’IL22Rα1, la présence duquel détermine si une cellule est la cible de l’IL-22. La fig.8 montre que ce
récepteur est exprimé de manière constitutive par les ARPE.
3.2. Transduction du signal intracellulaire induit par l’IL-22.
Des études ont montrés que l’IL-22 entraine la phosphorylation des protéines STAT1, 3 et 5 dans
quelles cellules (fig. 9)(3). Nos résultats de WB n’ont pas démontré de tels effets de l’IL-22 sur les
ARPE (Fig 9).
Discussion et perspectives
L’EPR joue un rôle essentiel dans l’induction et le maintien du privilège immun oculaire.
Paradoxalement, il peut également participer activement à la physiopathologie des uvéites
quand il est exposé à des cytokines pro-inflammatoires. Dans ce travail nous avons étudié in
vitro le rôle de la surexpression stable du gène SOCS1 sur l’activation de l’EPR par des cytokines
pro-inflammatoires IFNγ, TNFα, et IL-22. Notre intérêt pour SOCS1 est motivé par une série de
données : i) l’expression de SOCS1 dans la rétine augmente lors de la phase active d’UAE et
44
diminue pendant sa résolution, suggérant que SOCS1 joue un rôle de modulateur de
l’inflammation au niveau rétinien (7), ii) la surexpression de SOCS1 au niveau local permet de
protéger les organes cibles dans des modèles de diabète auto-immun (8) et d’inflammation
pulmonaire (9) et iii) SOCS1 peut, en plus de réguler négativement la transduction du signal
intracellulaire induit par l’IFNγ, inhiber d’autres voies de signalisation, notamment celle du
NFκB(10).
Nous avons réalisé nos expériences avec une lignée humaine de cellules d’EPR, les ARPE-19, et
deux clones obtenus par transfection stable : un clone SOCS1 et un clone CTRL. Nous avons
confirmé que le clone SOCS1 a une expression de SOCS1 largement supérieure à celle du clone
CTRL et des ARPE non-stimulées et qu’une stimulation des ARPE par l’IFNγ induit l’expression de
SOCS1 de façon dose-dépendante. Ces résultats sont en accord avec une autre étude qui montre
que l’expression de SOCS1 est augmentée dans les cellules humaines d’EPR stimulées par IFNγ
(11).
Nous avons également établi que la surexpression stable de SOCS1 empêche la phosphorylation
de STAT1 sur tyrosine 701 en réponse à une stimulation par l’IFNγ. Ce même effet a été retrouvé
dans des kératinocytes transfectés par le gène SOCS1 (12). En revanche, nous n’avons pas mis en
évidence un effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la dégradation de l’IκB, un marqueur
de l’activation de la voie NFκB. A l’inverse, des études ont démontré un effet inhibiteur de SOCS1
sur la voie NFκB dans des hépatocytes murins et des macrophages (4, 13). Un des mécanismes
proposés est l’induction de l’ubiquitination de la sous-unité p65 de l’NFκB par SOCS1 (4). Dès
lors, il est possible que nous n’ayons pas pu mettre en évidence une inhibition de la voie NFκB
car notre cible de détection, l’Iκb, se trouve en amont de l’activité inhibitrice potentielle de
SOCS1. Afin d’avoir plus de certitude quant au rôle de SOCS1 sur la voie NFκB dans l’EPR nous
devrions étudier son effet sur l’ubiquitination de p65.
Notre travail a continué par l’étude de l’effet de la surexpression stable de SOCS1 sur des
marqueurs de l’activation de l’EPR induits par les cytokines pro-inflammatoires IFNγ et TNFα.
L’expression membranaire du CMH II par les cellules de l’EPR est un des marqueurs de son
activation. L’EPR n’exprime pas de CMH II en situation physiologique mais bien lors d’uvéite (14).
45
De plus, il existe une relation entre le taux d’expression de CMH II et le niveau d’activation des
lymphocytes T uvéitogènes (15). Nos résultats confirment que le CMH II n’est pas exprimé sur les
clones SOCS et CTRL au repos. Il est induit sur le clone CTRL suite à une stimulation par l’IFNγ
mais pas par le TNFα. Cette induction n’est pas surprenante car il a été établi que l’IFNγ active
l’expression de CIITA, un co-activateur transcriptionnel du gène du CMH II, via la voie JAK/STAT.
En accord, nous avons démontré une très forte inhibition de l’induction du CMH II par l’IFNγ
dans le clone SOCS1. Un effet identique a été mis en évidence dans des kératinocytes
surexprimant SOCS1 (12).
La molécule d’adhésion CD54 est un autre marqueur de l’activation des cellules de l’EPR. Cette
protéine est impliquée dans l’extravasation des lymphocytes au niveau de l’EPR et leur
infiltration de la neurorétine (16). De plus, l’administration d’anticorps anti-CD54 peut diminuer
la sévérité de l’UAE (17). Nos données montrent que le CD54 est exprimé constitutivement, et
de manière égale par les deux clones et que son expression est augmentée par l’IFNγ et par le
TNFα dans le clone CTRL. Ce même effet sur les cellules de l’EPR a été démontré par une autre
équipe (19). Par contre, la surexpression de SOCS1 inhibe très fortement l’expression du CD54
induite par l’IFNγ et très faiblement celle induite par le TNFα. Comme les deux cytokines
participent à l’activation du promoteur du CD54, via les facteurs de transcription IRE et NF-κB
respectivement (18), la surexpression stable de SOCS1 semble inhiber efficacement l’IRE mais
pas l’NFκB au niveau du promoteur du CD54.
La sécrétion d’IL-8 par les cellules de l’EPR est un autre marqueur de leur activation. L’IL-8 est
chimioattractive pour les neutrophiles et son importance dans les uvéites est illustrée par une
efficacité thérapeutique des anticorps anti-IL-8 dans l’uvéite induite par endotoxine (20). Nous
avons montré que le clone CTRL sécrète l’IL-8 de manière constitutive, ce qui est a déjà été
décrit pour les ARPE (21). En accord avec la littérature, nous avons observé une augmentation
importante des taux d’IL-8 après stimulation par le TNFα, le gène de cette chimiokine étant sous
contrôle de l’NFκB (22). Nos données concernant l’effet inhibiteur de l’IFNγ (seul ou en
combinaison avec le TNFα) sur la sécrétion endogène d’IL-8 s’inscrivent dans notre hypothèse
que cet effet est variable dans différents types cellulaires. En effet, selon le type cellulaire
46
étudié, l’IFNγ peut avoir un effet inhibiteur ou pro-sécrétoire sur l’IL-8 (23, 12). Concernant le
clone SOCS1, la surexpression stable de SOCS1 a un effet sur la sécrétion basale d’IL-8 qui est
moindre. Cependant, lors de la stimulation par TNFα cette sécrétion atteint les mêmes taux que
dans le clone CTRL. L’effet activateur du TNFα de la voie NFκB est donc prédominant sur une
éventuelle inhibition exercée par SOCS1. En opposition avec nos résultats qui indiquent un effet
inhibiteur de l’IFNγ sur la sécrétion d’IL-8, une équipe a montré un effet pro-sécrétoire de SOCS1
sur l’IL-8 dans des kératinocytes, via une activation de la voie Extracellular Signal Regulated
Kinase (ERK) 1/ 2 par SOCS1 (24). Actuellement, nos données ne permettent pas d’expliquer
cette différence. Des investigations complémentaires sur les mécanismes intracellulaires
d’interaction entre SOCS1, ERK, NFκB et la sécrétion d’IL-8 mériteraient d’être réalisées.
La dernière partie de ce travail a consisté en l’étude du rôle de l’IL-22 dans l’activation de l’EPR.
Cette cytokine est sécrétée par les lymphocytes Th 17 (25) et son gène est fortement exprimé
dans les lymphocytes de patients atteints d’uvéite. De plus, l’IL-22 peut interrompre les jonctions
serrées des cellules de l’EPR et induire leur apoptose (26). Nous avons tout d’abord démontré
que l’IL-22Rα1 est exprimé par les ARPE. Des études sur des hépatocytes ont montré que la
transduction du signal intracellulaire de l’IL-22 entraine la phosphorylation des protéines STAT1,
3 et 5 (3). Nos résultats de WB n’ont pas confirmé de tels effets de l’IL-22 sur les ARPE. A notre
connaissance, aucune autre équipe n’a étudié la phosphorylation de STAT après stimulation des
cellules d’EPR par l’IL-22. Dès lors, il est possible que l’IL-22 agisse sur l’EPR via d’autres voies de
signalisation telles que JNK, ERK et p38 (27). Ces voies restent à être explorées dans les ARPE.
Par ailleurs, nous disposons de résultats préliminaires d’ELISA qui indiquent une absence d’effet
de l’IL-22 sur la sécrétion d’IL-8 par les ARPE. Ces résultats sont en accord avec une étude
récente qui a montré que la stimulation des ARPE-19 par de l’IL-22 n’augmente pas leur
sécrétion d’IL-8 (28).
A l’issue de ce travail, nous avons établi que la surexpression stable du gène SOCS1 dans les
cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.
Afin de conclure à une absence d’effet de SOCS1 sur la voie NFκB empruntée par le TNFα nous
devrions néanmoins effectuer des investigations complémentaires. Nous devrions également
47
compéter notre étude de l’IL-22 en tant qu’activateur potentiel des cellules de l’EPR et explorer
les rôles de l’IL-17, une autre cytokine Th 17 impliquée dans la physiopathologie des uvéites.
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50
Tableau 1: Tableau récapitulatif des conditions de stimulation pour les différentes expériences de WB
IFNγ/ dose de stimulation (ng/ml)
Figure 1 : Expression de SOCS1 par les clones cellulaires et effet de l’IFNγ sur l’expression de SOCS1 par les ARPE. Un nombre identique de cellules est cultivé pour chaque condition. Les ARPE sont stimulés pendant 24h par de l’IFNγ à des concentrations croissantes. Les clones ne sont pas stimulés. L’ARNm est extrait par MagNa Pure. La transcription inverse et la PCR sont réalisées en une étape en utilisant des primers et sondes TaqMan et l’instrument LightCycler. La quantification de SOCS1 est normalisée par la quantité de β actine dont les taux d’expression sont invariants. Les résultats présentés sont issues de trois expériences réalisées en triplicat, indépendantes et statistiquement comparées par un test t pour échantillons non‐pairés.
Figure 2 : Effet de la surexpression stable de SOCS 1 sur la transduction du signal intracellulaire induit par l’IFNγ. Les ARPE et les deux clones sont stimulés par 150ng/mL d’IFNγ pendant 5 ou 30 min. Une quantité identique de protéines pour chaque condition est soumise à une électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est incubée avec des anticorps spécifiques. La lecture est réalisée par l’Odyssey Infrared Imaging System. Cette figure est représentative de deux expériences indépendantes.
CD54
CMH II
Figure 3 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54 et CMH II induite par l’IFNγ. Un nombre identique de cellules est cultivé
pour chaque condition. Les cellules sont stimulées par 150ng/mL d’IFNγ pendant 48h. Elles sont ensuite suspendues dans du PBS‐azide en présence d’anticorps spécifiques conjugués à
la phycoérythine. L’analyse est faite au FACSCalibur. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes et réalisées en duplicat.
Figure 4 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL‐8 induite par l’IFNγ. Un nombre identique de cellules est cultivé pour chaque condition et stimulé par 150ng/mL d’IFNγ
pendant 24h. Le surnageant cellulaire est analysée par une ELISA en sandwich. Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes réalisées en triplicat. Un test t pour échantillons non‐pairés est utilisé pour la comparaison statistique.
Figure 5 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la transduction du signal intracellulaire induit par le TNFα. Les ARPE et les deux clones sont stimulés par 30ng/mL de TNFα pendant 30 min. Une quantité identique de protéines pour chaque condition est soumise à une électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est incubée avec des anticorps spécifiques. La lecture est réalisée par l’Odyssey Infrared Imaging System. Cette figure représente une expérience réalisée.
Figure 6 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54 et CMH II induite par le TNFα. Un nombre identique de cellules est cultivé
pour chaque condition. Les cellules sont stimulées par 30ng/mL de TNFα pendant 48h. Elles sont ensuite suspendues dans du PBS‐azide en présence d’anticorps spécifiques conjugués à la phycoérythine. L’analyse est faite au FACSCalibur. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes et réalisées en duplicat.
Figure 7 : Effet de la surexpression stable de SOCS 1 sur la sécrétion d’IL‐8 induite par le TNFα. Un nombre identique de cellules est cultivé pour chaque condition et stimulé par 30ng/mL de TNFα ou par une combinaison de TNFα et de l’IFNγ, 150ng/mL, pendant 24h. Le surnageant cellulaire est analysée par une ELISA en sandwich. Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes réalisées en triplicat. Un test t pour échantillons non‐pairés est utilisé pour la comparaison statistique.
Figure 8 : Mise en évidence du récepteur à l’Il‐22. Les ARPE non‐stimulés sont utilisées pour cette expérience. Le load control est le Stat1 total. Après incubation avec des anticorps spécifiques, la lecture de la membrane est réalisée par l’Odyssey Infrared Imaging System. Cette figure représente une expérience réalisée.
Figure 9 : Transduction du signal intracellulaire induit par l’IL‐22. Les ARPE sont stimulés par 100ng/mL d’IL‐22 avec ou sans ajout de 150ng/mL d’IFNγ pendant 5 ou 30 min. Une quantité identique de protéines pour chaque condition est soumise à une électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose qui est incubée avec des anticorps spécifiques. La lecture est réalisée par l’Odyssey Infrared Imaging System. Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes.
Discussion et perspectives
Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes
cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Par ailleurs, jusqu'il y a peu
sa prévalence au sein de la population vieillissante a été grossièrement sous-estimée164. Elles
affectent jusqu'à 115 personnes sur 100 000 dans la population occidentale et un peu moins
d’un quart d’entre elles nécessitent un traitement immunosuppressif systémique65.
Les uvéites non infectieuses sont généralement considérées comme autoimmunes et initiées par
la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes. Elles sont orchestrées d’une part,
systémiquement par deux sous populations lymphocytaires dont la signature cytokinique est
l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par l’activation du tissu rétinien.
Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait intervenir une activation
pathologique de l’immunité innée, donnant une composante d’auto-inflammation aux uvéites
non infectieuses. En effet, pour générer la maladie, il faut une activation concomitante de
l’immunité innée (auto-inflammation) et la génération d’une réponse lymphocytaire spécifique
dirigée contre des antigènes rétiniens (réponse spécifique à médiation cellulaire). Dans cette
vision plus récente, les uvéites non infectieuses représentent un ensemble hétérogène de
maladies ayant chacune une composante auto-inflammatoire et autoimmune aux proportions
variables. Certaines pathologies font figure d’exception à l’instar du syndrome de Blau où la
seule composante auto-inflammatoire est suffisante pour générer une uvéite clinique 165,
166
.
Etant donné que l’autoimmunité et l’auto-inflammation empruntent différentes voies
moléculaires, une meilleure compréhension de leurs rôles respectifs dans le développement des
uvéites pourra aider à mieux diagnostiquer les patients et aussi à les traiter plus spécifiquement.
Les syndromes auto-inflammatoires type CAPS (caractérisé par une hypersécrétion de l’IL-1β)
sont à ce titre un bel exemple de traitement spécifique puisque plusieurs cas d’uvéites
s’améliorant spectaculairement suite à un traitement bloquant l’IL-1β ont été décrits17, 167, 168.
En plus de ce volet systémique, de nombreux travaux attestent de l’importance de l’activation
des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle
51
passif durant la maladie, elles vont être stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires
et ainsi permettre le recrutement et l’activation de cellules immunocompétentes.
Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules
rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato-rétinienne dans le
développement d’uvéite non infectieuses. Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé
in vivo, dans deux modèles expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 sur
les cellules de la BHR. Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR qui forment la
partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des molécules de CMH
de classe II par l’IFNγ. Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules
rétiniennes par l’IFNγ en surexprimant le gène SOCS1 in vivo et in vitro.
Dans la première partie du travail, nous avons étudié l’expression de VCAM-1 par les cellules de
la BHR lors de l’inflammation intraoculaire. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite
l’extravasation des leucocytes du sang vers les tissus 169, 170. Elle a pour ligand une intégrine α4β1
(VLA-4) qui est exprimée sur les leucocytes inflammatoires. L’équipe de John Forrester avait déjà
mis en évidence une induction progressive de VCAM-1, ainsi que d’autres molécules d’adhésion,
lors d’UAE171. Le rôle de VCAM-1 dans la migration intraoculaire de leucocytes avait déjà été
suggéré à l’époque par des études in vitro sur l’EPR 172. Néanmoins, jusqu’à présent, on pensait
que VCAM-1 était uniquement exprimé par les cellules endothéliales et l’EPR lors d’UAE. Il
manquait donc une analyse complète de l’expression de cette molécule d’adhésion sur
l’ensemble des types cellulaires de la BHR lors d’UAE, in vivo. Nous avons donc entrepris une
série de marquages afin de caractériser l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien dans deux
modèles d’uvéites non infectieuses : UAE classique et par transfert de lymphocytes T
autoréactifs. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil sain mais est induit
progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son expression étaient
dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que VCAM-1 pouvait
être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR.
52
Ces données rejoignent les résultats de plusieurs travaux ayant montré le rôle central de VCAM1 dans le développement des pathologies autoimmunes telles que les encéphalites
autoimmunes expérimentales, les colites et les arthrites. Il est important de noter que, en accord
avec nos données, dans l’ensemble de ces modèles, l’expression de VCAM-1 n’est pas limitée
aux cellules endothéliales. Dans l’EAE, par exemple, VCAM-1 est également exprimé par les
astrocytes et les cellules de la microglie173. Par ailleurs, il a aussi été montré que des stimulations
pro-inflammatoires sont capables d’induire l’expression de VCAM-1 à la surface de cellules
rénales, pulmonaires et rétiniennes, in vitro174-176. Ces données expérimentales ont mené au
développement d’anticorps bloquant la liaison de VCAM-1 avec le VLA-4. Un tel anticorps a été
utilisé en clinique dans le traitement de la sclérose en plaque177, 178.
Par contre, il y a curieusement peu de travaux ayant étudié le blocage de l’interaction de VLA-4
avec VCAM-1 lors d’uvéite non infectieuse. Le groupe de Gragoudas a montré, en utilisant un
anticorps monoclonal que ce blocage supprimait le développement d’uvéite induite par injection
d’endotoxine177. Un autre groupe a utilisé un peptide inhibiteur et a ainsi montré une
amélioration significative sur le développement d’UAE dans le modèle B10RIII 178. Lors de notre
travail de thèse, nous avons aussi analysé les effets du blocage de cette interaction en utilisant
un anticorps bloquant dans le modèle de transfert adoptif. L’analyse des grades cliniques n’a pas
montré de différence significative entre le groupe traité par l’anticorps bloquant en comparaison
avec celui ayant reçu l’isotype contrôle (annexe 1). Ces résultats suggèrent que d’autres
molécules d’adhésion jouent un rôle important pour le recrutement intraoculaire de cellules
inflammatoires. Cette hypothèse est en accord avec plusieurs travaux qui montrent que le
blocage de l’interaction entre ICAM-1 et LFA-1 diminuait fortement l’incidence et la sévérité
d’UAE179,
180
. Ces données suggèrent par ailleurs que l’interaction ICAM-1/LFA-1 joue un rôle
prépondérant par rapport à VCAM-1/VLA-4, ce qui est en partie corroboré par nos analyses de
cytométrie de flux montrant clairement que les cellules inflammatoires expriment bien plus de
LFA-1 que de VLA-4 (annexe 2). Nous n’avons malheureusement pas poussé plus avant cette
analyse de l’expression de molécules d’adhésion sur les cellules inflammatoires et en particulier
sur les lymphocytes T autoréactifs rétine-spécifique. Ce champ d’études est pourtant très
prometteur puisqu’il a été montré récemment, dans un modèle d’EAE, que les lymphocytes
53
autoréactifs Th1 et Th17 utilisent des intégrines différentes pour pénétrer à l’intérieur du
système nerveux181.
Après avoir étudié in vivo l’expression de VCAM-1 par les cellules rétiniennes lors d’UAE nous
nous sommes intéressés à la régulation par le TNFα de l’expression du CMHII induit par l’IFNγ sur
les cellules de l’EPR. L’EPR joue un rôle majeur dans le maintien du statut du privilège immun de
l’œil en formant la barrière hémato-rétinienne externe, et en exprimant des facteurs
immunosuppressifs. Paradoxalement, ces cellules, après stimulation par des cytokines
proinflammatoires, peuvent également activer les lymphocytes autoréactifs et ainsi participer au
développement des uvéites non infectieuses.
Chan CC et son équipe ont les premiers montré l’expression de molécules du CMHII par les
cellules de l’EPR chez les patients atteints d’uvéite93. Par la suite, des travaux in vitro ont
confirmé que l’EPR pouvait exprimer des molécules du CMHII, après stimulation par l’IFNγ94, 182.
Dès lors, d’autres groupes se sont penchés sur la fonctionnalité de cette induction de CMHII par
les cellules de l’EPR. Il est aujourd’hui bien démontré que le niveau d’expression du CMHII sur les
cellules d’EPR par l’IFNγ est dose-dépendante et que lorsque ces cellules expriment un niveau
élevé de molécules du CMHII, elles peuvent servir de cellules présentatrices d’antigène et activer
les lymphocytes T autoréactifs95. A contrario, les cellules qui expriment le CMHII de façon
restreinte transmettent plutôt un signal suppresseur. Le niveau d’expression des molécules du
CMH II pourrait donc jouer un rôle clef dans le développement d’uvéites non infectieuses. Il est
donc important de mieux comprendre les mécanismes qui régulent cette expression. A ce titre,
un élément capital de l’activation des cellules de la BHR lors d’uvéite non infectieuse est le
contexte multi-cytokinique de la stimulation. En effet, durant le processus inflammatoire, l’EPR
va être la cible d’un ensemble de cytokines sécrétées par les cellules inflammatoires. Il serait
donc intéressant d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur
l’induction du CMHII par l’IFNγ au niveau des EPR.
54
Dans ce travail nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMHII induit par l’IFNγ
sur les ARPE par régulation négative du CIITA. Comme l’activation des lymphocytes T par les
cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du CMHII, notre étude soutient l’idée que le
TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur l’activation de ces cellules 95. L’effet du
TNFα sur l’expression des molécules du CMH II semble tributaire du type cellulaire. En effet,
différents groupes ont montré que le TNFα augmente l’expression du CMHII sur les astrocytes,
alors qu’aucun effet n’a été retrouvé sur les cellules microgliales 183-185. Cet effet additif du TNFα
sur les astrocytes est CIITA indépendant186. Au contraire, Mueller et al ont démontré que le TNFα
inhibe la régulation positive du CMH II sur les cellules myéloïdes par inhibition du CIITA. Le
même groupe a constaté que le CMH II était significativement réduit chez les patients atteints de
polyarthrite rhumatoïde, mais était porté à des niveaux normaux après traitement par de l’antiTNFα 187. Ces constatations sont compatibles avec nos données et soulignent clairement le rôle
que joue le TNFα dans la phase de résolution de l’inflammation.
En effet, si en général, le TNFα est considéré comme une cytokine pro-inflammatoire en raison
de son effet stimulateur prononcé sur l’expression d’une variété de molécules proinflammatoires, beaucoup de données ont également montré que le TNFα joue un rôle
important dans la résolution de la réponse immune106, 188. Cette dualité d’effet se retrouve dans
les différents modèles animaux. En effet, si de nombreuses souches de souris surexprimant le
TNFα développent des maladies autoimmunes, un rôle protecteur du TNFα a pu être montré
dans d’autres modèles expérimentaux. Par exemple, d’une part, les souris NOD surexprimant le
TNFα au niveau du pancréas sont protégées du développement du diabète et d’autre part, des
injections répétées de TNFα inhibent le développement du diabète expérimental et de la
néphrite lupique189,
190
. De la même manière, les souris TNFα/KO développent une EAE
exacerbée191. Au niveau des uvéites expérimentales, le rôle du TNFα semble aussi dépendre du
modèle. Une étude sur les souris TNFR p55/p75 KO démontre que le TNFα n’est pas essentiel
pour le développement d’UIE192. Par contre, dans le modèle d’UAE, l’expression de la maladie
est incomplète chez les souris TNFR p55 KO193.
55
Ces effets contrastés du TNFα sur le développement de maladies autoimmunes sont reflétés par
certains résultats « paradoxaux » obtenus avec les thérapies anti-TNFα qui améliorent l’état de
la majorité des patients atteints d’arthrite rhumatoïde ou de maladie inflammatoire du tube
digestif. Cependant, certains d’entre eux vont développer un syndrome lupique ou une maladie
neuroinflammatoire194, 195. De la même manière, la maladie des patients atteint de sclérose en
plaque va être exacerbée par les thérapies anti-TNFα196. Les effets immunomodulateurs du
TNFα pourraient aussi en partie expliquer le fait que les thérapies anti-TNF n’améliorent qu’une
partie des patients atteints d’uvéite non infectieuse197, 198 .
Nos deux premiers travaux illustrent l’importance et la complexité de l’activation des cellules
rétiniennes par des cytokines pro-inflammatoires dans le développement d’uvéites. Nous avons
ensuite étudié la possibilité de bloquer le développement de la maladie en inhibant cette
activation par la surexpression d’un gène immunosuppressif SOCS1.
Le transfert de gène immunosuppressif au niveau des cellules rétiniennes représente une
stratégie thérapeutique prometteuse qui permet d’éviter les effets secondaires liés au
traitement immunosuppressif classique. De par sa petite taille, sa structure fermée, sa
transparence et sa facilité d’accès par diverses voies d’injections aux différentes couches
rétiniennes, l’œil semble être un organe unique pour une approche thérapeutique via transfert
de gène. De plus, de nombreuses méthodes d’examen des yeux sont actuellement disponibles
pour surveiller l’efficacité des traitements. Jusqu'à présent, plusieurs groupes ont obtenu des
résultats intéressants en faisant produire (après transfert de gène) par les cellules rétiniennes
des molécules immunosuppressives sécrétées telles que l’IL-10 virale, l’IFNα etc159,
160, 199
.
Cependant, cette stratégie n’aide pas à disséquer l’implication spécifique des cellules résidentes
de l’œil dans le développement de l’UAE. En revanche, cibler les voies intracellulaires semble
plus spécifique et pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement
d’UAE.
56
Nous avons donc décidé de surexprimer le gène SOCS1 au niveau rétinien et d’étudier l’effet de
cette surexpression sur le développement de l’UAE. Les choix du virus et du sérotype du virus
ainsi que de la voie d’injection utilisée ont été faits pour transduire un grand nombre de cellules
en traumatisant le moins possible la rétine. Dans un premier temps, en utilisant des AAV2
exprimant l’EGFP, nous avons pu montrer que la technique d’injection sous-rétinienne était plus
traumatique et nous avons donc décidé d’utiliser la voie intra-vitréenne pour injecter des AAV2
contenant le gène SOCS1, dans l’œil droit des souris uniquement. Nous avons vérifié par RT-PCR
quantitative que le gène SOCS1 était bien exprimé dans l’œil après injection du vecteur AAV2CAG-SOCS1. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la surexpression de SOCS1 sur le
développement d’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence significative
entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de normaliser par
rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour chaque souris un
ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non injecté. L’analyse de la moyenne de ces
ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le groupe EGFP en
terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque l’analyse de ces
ratios est faite sur les grades histologiques. Une analyse plus détaillée de ces ratios histologiques
montre que l’effet est plus marqué dans les cellules infectées par l’AAV2.
Nos expériences mènent plutôt à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection
intravitréenne de l’AAV2 ne protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.
Nos données sont en contradiction avec des travaux montrant un rôle positif de SOCS1 dans le
contrôle de dommages causés aux tissus lors de certaines pathologies autoimmunes. Balabanov
r et al ont ainsi montré que la surexpression locale de SOCS1 protégeait les oligodendrocytes des
effets délétères de l’IFNγ dans un le modèle d’EAE200. De la même manière, il a été démontré,
dans un modèle de fibrose pulmonaire, que la surexpression de SOCS1 obtenue par injection
d’adénovirus, diminuait l’infiltration lymphocytaire, la fibrose et la mortalité 201.
L’absence d’effet que nous avons eu dans notre modèle peut avoir plusieurs explications.
Premièrement, l’injection intravitréenne conduit à une infection relativement limitée des
cellules rétiniennes impliquées dans le développement de l’UAE. En effet, nos données sont en
57
accord avec d’autres études qui démontrent que l’injection intravitréenne d’AAV2 cible
principalement les cellules ganglionnaires et moins les cellules qui forment les BHR. Toutefois, la
description récente par Yu R et al, que les souris et rats transgéniques exprimant SOCS1 sous le
contrôle d’un promoteur de l’opsine (spécifique des photorécepteurs) sont protégés du
développement de l’UAE, suggère qu’une absence d’expression par les cellules des BHR, n’est
pas indispensable pour bloquer le développement de l’UAE. Néanmoins, comme souligné plus
haut les cellules exprimant SOCS1 dans le travail de Yu R et al sont les photorécepteurs et non
les cellules ganglionnaires202. Si les deux ne sont pas des cellules de la BHR plusieurs travaux
suggèrent toutefois que les photorécepteurs, en plus de leurs rôles de photoréception et de
transmission du signal pourraient être impliqués directement dans la régulation de
l’inflammation intraoculaire. Cette hypothèse a pour la première fois été avancée par le groupe
de Nussenblatt lorsqu’ils avaient mis en évidence que les photorécepteurs expriment du
GITRL203. Même si nous n’avons pu identifier le type cellulaire impliqué, nos données montrent
également une expression importante de VCAM-1 au niveau de la limitante externe, constituée
en partie des photorécepteurs. L’ensemble de ces données indiquent donc que les
photorécepteurs pourraient être impliqués dans la régulation de la réponse immune
intraoculaire et qu’à ce titre, ils sont peut-être de meilleurs candidats pour une surexpression de
SOCS1. Il a d’ailleurs été montré que la stimulation du récepteur à l’IL-27 à la surface des
photorécepteurs induisait l’expression de SOCS1 et la sécrétion d’IL-10 par ces cellules204.
Cependant, il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop
faible pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement
l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette
dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro dans ce travail de thèse.
Afin d’explorer cette dernière hypothèse, nous avons généré des clones stables d’EPR exprimant
SOCS1 et nous avons étudié l’effet de cette surexpression sur l’activation des cellules par
d’autres cytokines.
58
Dans un premier temps, nous avons validé notre système cellulaire en montrant que l’activation
par l’IFNγ était bien bloquée dans le clone SOCS1 et pas dans le clone contrôle. Cet effet
inhibiteur était attendu et rejoint les données de la littérature en général et du travail séminal
de Federici et al sur des clones de kératinocytes, en particulier205, 206. Nous avons ensuite voulu
explorer les effets de la surexpression de SOCS1 sur l’activation de l’EPR par d’autres cytokines
importantes dans les uvéites non infectieuses. Etant donné son rôle capital à cet égard, nous
avons commencé par étudier le TNFα, et n’avons pas observé d’effet inhibiteur de SOCS1 sur
l’induction d’IL-8 ou de CD54 par cette cytokine. SOCS1 est pourtant induit par le TNFα dans
plusieurs types cellulaires et été démontré comme un régulateur négatif de l’inflammation
induite par le TNFα sur les cellules endothéliales 207.
Il a également été démontré que SOCS1 bloque l’activation de la voie JAK-STAT par l’IL-22 dans
les cellules hépatiques208. Comme un rôle potentiel de l’IL-22 dans le développement d’uvéite
non infectieuse a été suggéré, nous avons analysé l’effet de la surexpression de SOCS1 sur
l’activation des cellules de l’EPR par l’IL-22. Comme prérequis, nous avons établi l’expression du
récepteur à l’IL-22 par les cellules de l’EPR, mais nous n’avons pas pu mettre en évidence un
effet de l’IL-22 sur l’EPR. Nos données sont en accord avec celles de Chen Y et al qui ont
également mis le récepteur en évidence, sans toutefois trouver d’effets de la cytokine sur la
production d’autres cytokines ou sur la résistance transépithéliale 127. Li Z et al avaient pourtant
montré un effet de l’IL-22 sur la résistance transépithéliale et la mort cellulaire par apoptose124.
Ces différences de résultats entre études pourraient s’expliquer par le fait que dans cette
dernière étude les auteurs ont travaillé sur des cellules d’EPR primaires et que des différences
significatives entre ces dernières et le clone d’ARPE-19 ont été rapportées209.
Récemment, plusieurs travaux sont venus étayer le rôle capital qu’avait l’IL-17 dans le
développement des uvéites non infectieuses. Nous avons donc investigué les effets potentiels de
SOCS1 sur l’activation de l’EPR par l’IL-17. Jusqu'à présent nous avons uniquement pu montrer
que SOCS1 ne bloquait pas l’induction d’IL-8 induite par l’IL-17. Cette absence d’effet peut
s’expliquer dès lors que Chen Y et al ont récemment montré qu’au niveau des ARPE, l’induction
d’IL-8 obtenue après stimulation par l’IL-17 impliquait les voies des MAPK, du NF-κB et d’AKT210.
59
Toutefois Ke et al ont mis en évidence au niveau d’EPR de souris que l’IL-17 induisait l’expression
de SOCS1 qui limitait la production d’IL-6 et augmentait celle de LIF126. Même si nous n’avons
pas retrouvé une induction de SOCS1 par l’IL-17, nous comptons investiguer son effet sur la
production de ces autres cytokines.
Conclusion
L’importance de l’activation des cellules cibles dans le développement des maladies
autoimmunes spécifiques est en train d’émerger. Que ce soit le système nerveux central, le rein
ou l’œil, de nombreux travaux attestent du rôle joué par l’activation des cellules résidentes dans
leur propre destruction. Ce type d’approche s’est pour l’instant surtout limité à une vision
analytique de la physiopathologie et a permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes
des maladies autoimmunes tissues spécifiques. En disséquant le rôle de VCAM-1 lors d’uvéite
non infectieuse, ou en analysant la régulation de l’expression des molécules du CMH de classe II
par l’EPR, notre travail de thèse s’inscrit dans cet aspect de l’étude de l’autoimmunité. De plus
en plus de travaux s’appliquent à investiguer cette dimension en bloquant localement l’une ou
l’autre voie d’activation cellulaire. Si cette approche a bien été validée dans des travaux utilisant
des animaux transgéniques, elle reste encore peu développée dans un contexte de transfert de
gène. C’est pourtant de cette manière que pourraient s’ouvrir des perspectives de thérapies
ciblées. Le but de la deuxième partie de notre thèse était très ambitieux puisqu’il visait
précisément à tester la faisabilité du transfert d’un gène codant pour une protéine intracellulaire
bloquant la voie de l’IFNγ. Nous étions donc en marge à la fois des travaux transgéniques (ou
l’expression du transgène est plus facilement contrôlée) et des transferts de gènes codants pour
des protéines immunosuppressives sécrétées qui dominent pour l’instant la littérature. Si, dans
le cadre de notre approche, nous n’avons pas pu démontrer d’effet protecteur global, nous
pensons en avoir compris les raisons et commencer à investiguer les principales pistes. Ainsi
nous espérons surmonter les défis techniques afin de tenter d’atteindre des objectifs plus
thérapeutiques.
60
Supplementary data
Annexe 1: Rôle du VLA-4 dans le recrutement des cellules inflammatoires lors de l’UAE. Des souris
C57BL6 ont été immunisés par injection sous-cutanée dans la patte, du peptide immunodominant 120 de l’IRBP émulsionné avec du adjuvant complet de Freund et injection intra-péritonéale de PTX.
Pour bloquer le VLA-4, les animaux ont reçu 10 mg/kg d’anticorps monoclonal anti-VLA4 par voie
intrapéritonéale tous les 2 jours pendant les 21 jours nécessaires au développement de
l’inflammation intra-oculaire. Les animaux contrôles ont reçu des quantités égales d’un anticorps
IgG1 (clone 15H6). Un fond d’œil est réalisé à j 21 post-injection, sous contrôle microscopique après
dilatation des yeux. Un score clinique est attribué à chaque œil selon le système de H Xu et al, 2008.
L’expérience à été réalisé deux fois de manière indépendante (8 souris par groupe au total). Chaque
point représente le score clinique d’un œil de souris. Il n’ y a pas de différence significative entre les
deux groupes.
Annexe 2: Analyse de l’expression des molécules VLA-4 et LFA-1 par les lymphocytes T
autoréactifs impliqués dans le développement de l’UAE. Des souris C57BL6 ont été immunisés
par injection sous-cutanée dans la patte, du peptide immunodominant 1-20 de l’IRBP
émulsionné avec du adjuvant complet de Freund et injection intra-péritonéale de PTX. Douze
jours après l’immunisation, les rates et ganglions de chaque souris sont prélevés et enrichis en LT
par passage sur colonne de nylon et enfin restimulé par l’IRBP 48h in vitro. Une analyse par
cytométrie de flux à l’aide d’anticorps anti-CD4, anti-VLA4 et anti-LFA1 a été réalisée sur ces
cellules.
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RÉSUMÉ
Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes
cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Les uvéites non infectieuses
sont des atteintes inflammatoires de la rétine et de l’uvée et sont généralement considérées
comme autoimmunes et initiées par la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes.
Elles sont orchestrées d’une part, systémiquement par deux sous populations lymphocytaires
dont la signature cytokinique est l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par
l’activation du tissu rétinien. Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait
intervenir une activation pathologique de l’immunité innée, donnant une composante
d’autoinflammation aux uvéites non infectieuses. En plus de ce volet systémique, de nombreux
travaux attestent de l’importance de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement
d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle passif durant la maladie, elles vont être
stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires et ainsi permettre le recrutement et
l’activation de cellules immunocompétentes.
Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules
rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato rétinienne (BHR) dans le
développement d’uvéite non infectieuses.
Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé in vivo, dans deux modèles
expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule)
sur les cellules de la BHR. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite l’extravasation des
leucocytes du sang vers les tissus. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil
sain mais est induit progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son
expression étaient dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que
VCAM-1 pouvait être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR.
Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR (Epithélium Pigmentaire Rétinien)
qui forment la partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des
molécules de CMH de classe II par l’IFNγ. Durant le processus inflammatoire, l’EPR est la cible
d’un ensemble de cytokines secrétées par les cellules inflammatoires. Il a été donc intéressant
d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur l’induction du CMHII
par l’IFNγ au niveau de l’EPR. Nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMH II
induit par l’IFNγ sur les ARPE par régulation négative du CIITA (Class II Transactivator). Comme
l’activation des lymphocytes T par les cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du
CMH II, notre étude soutient l’idée que le TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur
l’activation de ces cellules, et participe ainsi à la phase de résolution de l’inflammation.
Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ
en surexprimant le gène SOCS1 (Suppressor Of Cytokine Signaling) in vivo et in vitro.
Nous avons surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression
sur le développement de l’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence
significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de
normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour
chaque souris un ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non-injecté. L’analyse de la
moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le
groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque
l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Nos expériences mènent donc plutôt
à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection intravitréenne de l’AAV2 ne
protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.
Cette absence d’effet peut avoir comme explication que l’injection intravitréenne conduit à une
infection relativement limitée des cellules rétiniennes impliquées dans le développement de
l’UAE. Il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop faible
pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement
l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette
dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro. Nos résultats montrent que la
surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur
activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.
Ce travail met tout d’abord en évidence l’importante expression, in vivo, de VCAM1 par les
cellules de la BHR lors d’UAE et in vitro les effets antagonistes du TNFα et de l’IFNγ sur la
régulation de l’expression de molécules du CMHII à la surface de l’EPR. Nos expériences
démontrent que la surexpression du gène SOCS1 après injection intravitréenne du vecteur AAVCAG-SOCS1 n’a que peu d’effet sur le développement de la maladie. Par ailleurs, la surexpression
de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ
mais pas par le TNFα et l’IL-17.