République Algérienne Démocratique et Populaire DIPLÔME DE

République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE VEGETALE
Mémoire
Présenté par
BOUHADDI Karima
Pour l’Obtention
DU
DIPLÔME DE MAGISTER
Spécialité : Physiologie Végétale
Option : Ecolophysiologie Végétale
Intitulé
REPONSES PHYSIOLOGIQUES, BIOCHIMIQUES ET ANATOMIQUES
CHEZ LE HARICOT ( Phaseolus vulgaris L.)
AU STRESS DE LA SALINITE
Soutenue le :
2009 devant le jury composé de :
M. MAROUF A. Professeur
Université d’Oran
M.MEHDADI
Université de Sidi Belabes
Z. Professeur
Mme IGHILHARIZ Z. Maitre de Conférences, Université d’Oran
M. MEKHALDI A. Maitre de Conférences, Université de Mostaganem
M. BELKHODJA M. Professeur,
Université d’Oran
Président
Examinateur
Examinateur
Rapporteur
Co-rapporteur
REMERCIEMENTS
Au terme de ce travail, je voudrais remercier mon promoteur de mémoire le
Docteur Abdelkader MEKHALDI
Maître de Conférences à L’université de
Mostaganem et lui exprimer ma gratitude pour sa très grande disponibilité, son
soutien scientifique, moral, son excellent sens critique et sa rigueur scientifique.
Je tiens également à remercier le Professeur Moulay BELKHODJA de l’Université
d’Oran pour sa grande disponibilité et d’avoir aimablement accepté de diriger ce travail en
tant que co-promoteur ; qu’il me soit permis de lui témoigner mon sincère et profond respect.
Mon sentiment profond va à Madame Zohra IGHILHARIZ , Maître de Conférence à
l’institut de Biologie d’Oran, Université Es-Senia, qui a bien voulu faire part de ce jury et
examiner mon travail. Je lui exprime ici toute ma reconnaissance.
Je tiens à remercier M. MEHDADI Zoheir, Professeur à l’Université de Sidi Bel Abbès
pour avoir accepté d’examiner ce travail, qu’il trouve dans ces quelques mots l’expression de
ma sincère gratitude. Sa présence est d’une importance car il nous fait bénéficier par ses
pertinentes remarques sur tout ce qui concerne les stress environnementaux.
Je remercie vivement M. le Professeur Abderrezak MAAROUF de l’Université
d’Oran qui a eu l’amabilité en me faisant l’honneur de présider ce jury.
Je voudrais exprimer ma gratitude à Mlle ACHOUR Asma, Chargée de Cours
en Biologie Végétale à l’Université d’Oran qui m’a encouragé et aidé dans les
techniques d’analyses biochimiques.
Ma profonde reconnaissance va à M. Miloud TAHRI Ingénieur de Laboratoire
de Botanique, Université de Mostaganem pour avoir mis à ma disposition
Laboratoire. Qu’il en soit vivement remercié.
Enfin, qu’il me soit permis de remercier très sincèrement toutes les personnes
qui ont contribué de près ou de loin à l’élaboration de ce mémoire.
le
Au nom d’ALLAH tout puissant
A la mémoire
de mon cher
regretté père.
A ma mère qui m’a communiqué sa passion et son
savoir faire, pour ses sacrifices et son
dévouement.
A mes deux enfants Shemso et Chahinez
que
j’adore énormément.
A mon époux Rabah qui m’a tous le temps
soutenu dans les moments difficiles et supporté
jusqu’au bout de mon travail.
A ma belle famille CHADLI.
A mes frères et sœurs.
A ma promotion de Magister 2007-2008
A
tous ceux qui ont
fait de moi une scientifique…
Karima
RESUME
Afin de comprendre les mécanismes impliqués dans la tolérance des végétaux à la
salinité, nous avons étudiés les paramètres physiologiques et biochimiques et anatomiques
liés à l’adaptation du haricot (Phaseolus vulgaris L.) au stress salin.
Les impacts de la salinité sur le développement et le rendement de la plante sont
aussi nombreux que difficiles à hiérarchiser. Les ions chlorure et sodium entrent dans les
plantes par les racines et sont véhiculés par le xylème jusqu’aux tiges et aux feuilles. Là,
ils sont soit stockés, plantes de type «includer», soit peu retenus et revéhiculés par le
phloème jusqu’aux racines plantes de type «excluder».
Un stress salin au Na cl + Cacl2) à différentes concentrations 50,100 ; 150 et 200 meq.l1
a été appliqué aux plantes âgées de 30 et 60 jours.
La teneur en pigments chlorophylliens des tissus foliaires a été déterminé, les résultats
obtenues montrent que les plantes sous conditions de salinité croissante la teneur en
chlorophylle baisse nettement par rapport aux plantes témoins (non traitées).Cet effet
dépressif est plus accentué pour la chlorophylle a que la chlorophylle b.
La salinité provoque une accumulation accrue de la proline. Les teneurs de cet acide
aminé augmente au fur et à mesure que la concentration saline augmente et aussi selon
l’organe et le stade de croissance. Cette accumulation du composé azoté se manifeste
davantage dans les parties foliaires que dans les parties racinaires.
Les organes jeunes en croissance accumulent plus de proline que les organes
matures qui achèvent leur expansion cellulaire.
Ainsi la production de proline est d’autant plus marquée que l’intensité des
traitements est importante et les que feuilles sont jeunes c’est a dire en conditions de
multiplication cellulaire intense.
D’autre part, l’activité enzymatique du nitrate réductase diminue fortement avec
l’augmentation du traitement salin.
Les données obtenues montrent que l’exposition des plantules du Haricot (Phaseolus
vulgaris L.) à la salinité s’est traduite par une chute de la croissance surtout de la partie
aérienne. L’effet de la salinité n’est pas homogène pour tous les organes. Selon nos
résultats obtenus, il a été remarqué que la salinité provoque une accumulation accrue de la
proline .Les teneurs de cet acide aminé augmentent au fur et a mesure que la
concentration saline augmente, et selon l’organe.
Cet effet dépressif sur la croissance s’est accompagné d’une diminution plus accentuée
de l’activité du nitrate réductase dans les racines comparativement aux parties aériennes.
La réduction de la croissance peut être aussi liée à des perturbations dans la mise en
place des vaisseaux du xylème, parfois à une réduction dans le nombre et le diamètre de
ces éléments conducteurs caulinaires et radiculaires sous la contrainte saline. Néanmoins,
il faut signaler que les effets de la salinité sur la croissance et la productivité ne sont pas
toujours négatifs.
Selon nos conditions expérimentales, les résultats obtenus présument que le Haricot
(Phaseolus vulgaris L.) présente des caractères le distinguant des autres glycophytes
sensibles au stress de la salinité.
Mots clés : Salinité, Phaseolus vulgaris L., Chlorophylle, Proline, Nitrate réductase.
LISTE DES ABREVIATIONS
ABA: Acide Abscissique
ANR: Activité Nitrate Reductase
APX: Ascorbate Peroxydases
CaCl2: Calcium Chloride
CAT: Catalases
CE: Conductivité Electrique
CEC: Complexe d’Echange Cationique
Chl: Chlorophylle
CO2: Carbone bi Oxide
CV: Coefficient de Variation
ddl: degré de liberté
EOR: Endoplasmic Overload Response
EOR: Espèces Oxygénées Radicalaires
ESP: Echangeable Sodium Pourcentage
FAO: Food Alimentation Organisation
GPX: Glutathion Peroxydases
GST: Glutathion-S-Transférases
meq.l–1: milli équivalant/litre
NaCl : Sodium Chloride
NEDS :Naphthyl-Ethylène-Dichlorure Sulfanilamide
NH4 : Ammonium
NiR : Nitrite Réductase
NO2 – : Nitrite
NO3 – : Nitrate
NR : Nitrate Réductase
PEP-Case: Phospho Enol Pyruvate Carboxylase
PF : Poids Frais
PH: Poids Humide
PNUD: Programme des Nations Unies pour le Développement
ppds: plus petite différence significative
PS: Poids Sec
PS II: Photosystème II
RubisCo: Ribulose 1-5 bis phosphate carboxylase/oxygénase
U.N.E.S.C.O: United Nations Educational and cultural Organization
Vx: Vaisseaux
X : Xylème
LISTE DES FIGURES
Figure1:Echantillons de graines de la collection Phaseolus (Vanderboght et Baudoin,1998)
Figure 2 : Gousses de haricot
Figure 3 : Morphologie de Phaseolus vulgaris L. montrant les feuilles,les fleurs et les tiges
Figure 4 : Système racinaire de Phaseolus vulgaris L
Figure 5 : Les différentes parties de la graine de Phaseolus vulgaris L.
Figure 6 : Germination des graines de Phaseolus vulgaris Ldans des boîtes de Pétri
(phase semis)
Figure 7 : Teneurs en
chlorophylle des plantes de Phaseolus vulgaris L. témoins et
traitées par NaCl+CaCl2, au cours stade 30 jours de croissance
Figure 8 : Teneurs en chlorophylle des plantes de Phaseolus vulgaris L. témoins et traitées
par NaCl+CaCl2, au cours stade 60 jours de croissance
-1
Figure 9 : Teneurs de la proline endogène (µM.100mg ) dans les racines de
Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl +CaCl2
Figure10: Teneurs de la proline endogène (µM.100mg-1) dans les parties aériennes
de Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl +CaCl2
Figure11 : Variation de l’activité du nitrate réductase mesurée sur des plantules âgées de
30 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl + CaCl2
Figure12 : Variation de l’activité du nitrate réductase mesurée sur des plantules
âgées de 60 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl + CaCl2
Figure13: Anatomie des racines de Phaseolus vulgaris L. âgé de 30 jours
Figure14 : Anatomie des tiges de Phaseolus vulgaris L. âgé de 30 jours
Figure15 : Anatomie des racines de Phaseolus vulgaris L. âgé de 60jours
Figure16 : Anatomie des tiges de Phaseolus vulgaris L. âgé de 60jours
LISTE DES PHOTOS
Photo 1 : Graines de Phaseolus vulgaris L.
Photo 2 : Pot en plastique contenant des plantules de Phaseolus vulgaris L.
Photo 3 : Plantules en pot, cultivées en salle de culture à la température ambiante et à la
lumière du jour
Photo 4 : Centrifugeuse
Photo 5 : Spectrophotomètre moléculaire
Photo 6 : Technique d’extraction
Photo 7 : Technique de la double coloration
Photo 8 : Microscope photo ZEISS
Photo 9 : Plantes de Phaseolus vulgaris L. au 30ème et 60èmè jour de croissance sous stress
au NaCl+ CaCl2 (partie racinaire)
Photo10 : Plantes de Phaseolus vulgaris L. au 30ème jour de croissance sous stress au NaCl+
CaCl2 (partie aérienne)
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Composition de la solution nutritive de Hoagland (1938)
Tableau 2 : Composition de la solution saline
Tableau 3 : Teneurs en chlorophylle (mg. g-1 PF) de Phaseolus vulgaris L. à différentes
concentrations de NaCl+CaCl2 (meq.l-1) à 30 jours de croissance
Tableau 4 : Teneurs en chlorophylle (mg. g-1 PF) de Phaseolus vulgaris L. à différentes
concentrations de NaCl+CaCl2 (meq.l-1) à 60 jours.
Tableau 5 : Test statistique de signification de Fisher des teneurs en proline endogène
dans les racines stressées aux NaCl + CaCl2 au cours du développement des plantes
Tableau 6 : Test statistique de signification de Fisher des teneurs en proline endogène
dans les parties aériennes de la plante après 30 et 60 jours de croissance
Tableau 7 : Test statistique de signification de Fisher mesurant l’activité du nitrate
réductase mesurée sur des plantules âgées de 30 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées
aux NaCl + CaCl2
Tableau 8 : Test statistique de signification de Fisher mesurant l’activité du nitrate
réductase mesurée sur des plantules âgées de 60 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées
aux NaCl + CaCl
SOMMAIRE
INTRODUCTION……………………………………………………………………………………………………………………
CHAPITRE I- DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………………………………………………………
A- STRESS DE L’ENVIRONNEMENT…………………………………………………………………….
a – déformation élastique………………………………………………………………………………………
b- déformation plastique………………………………………………………………………………………
1-La sécheresse ……………………………………………………………………………………………………………..
1.1- Conséquences de la sécheresse sur le fonctionnement des plantes………………
1.2- Adaptation des plantes à la sécheresse……………………………………………………………
•
•
L’échappement……………………………………………………………………………
L’évitement et la tolérance………………………………………………………..
2- La salinité……………………………………………………………………………………………………..……………
2.1mpact de la salinité sur le développement des plantes…………………………………….
2.1.1-Germination……………………………………………………………………………………………
2.1.2- Développement et croissance………………………………………………………………
2.2 Réponses des plantes aux stress salin………………………………………………………………….
•
Halophytes et Glycophytes …………………………………………………………
2.2.1-Mécanisme de transport du sel vers les feuilles…………………………………..
a-Inclusion……………………………………………………………………………………………..
b-Exclusion…………………………………………………………………………………………
c- Sélectivité……………………………………………………………………………………….
3-Adaptation des plantes à la salinité…………………………………………………………………………….
3.1- Resistance aux stress hydrique………………………………………………………….……………
3.2- Stratégies adaptatives au stress salin………………………………………………………………
3.2.1- Ajustement osmotique…………………………………………………………………………….
3.2.2- Accumulation de la proline………………………………………………………..……………
3.2.3- Sucres solubles…………………………………………………………………………………………
3.2.4- Glycine betaine………………………………………………………………………….……………
4-Effets de la salinité sur le métabolisme des plantes…………………………………….…………….
4.1-Effet du sel sur la nutrition minérale……………………………………………………………….
4.2-Effet du sel sur la nutrition carbonée………………………………………………….………….
4.3-Effet du sel sur le métabolisme azotée……………………………………………..…………….
5-Présentation de l’espèce……………………………………………………………………………….…………….
•
•
Caesalpinioideae………………………………………………………………….…
Mimosoideae……………………………………………………………………………
5.1-Description botanique……………………………………………………………………………………..
5.1.1- Répartition……………………………………………………………………………………………
5.1.2- Importance économique………………………………………………………………………
5.1.3- Principaux ennemis de la culture et méthodes de lutte……….……………
1
5
5
5
5
5
5
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7
7
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9
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12
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26
26
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31
32
CHAPITRE II-MATERIEL ET METHODES…………………………………………………………………..……………
33
1. Dispositif expérimental………………………………………………………………….……………
1.1-Préparation de la culture des plantes…………………………………….……………
1.2-Germination…………………………………………………………………………….……………
33
33
36
A- MATERIEL VEGETAL……………………………………………………………………………….… 33
B- METHODES………………………………………………………………………………………………… 33
1.3-Repiquage…………………………………………………………………………………………..
2-Techniques…………………………………………………………………………………………………….
2.1-Extraction et dosage des chlorophylles……………………………………...
2.2- Extraction et dosage de la proline……………………………………………..
• Extraction…………………………………………………………………
• Dosage………………………………………………………………………
2.3-Détermination de l’activité de la nitrate réductase…………………...
2.4-Etude Anatomique des tiges et des racines………………………………...
CHAPITRE III RESULTATS…………………………………………………………………………………………...
A-VARIATIONS DES TENEURS EN CHLOROPHYLLES………………………………………..
1-Teneur en chlorophylle a……………………………………………………………......
2-Teneur en chlorophylle b…………………………………………………………………..
3-Teneur en chlorophylle totale………………………………………………………….
4-Discussion…………………………………………………………………………………………..
B- VARIATION DE LA PROLINE ENDOGENE……………………………………………………..
1-Dans les racines………………………………………………………………………………..
2 -Dans les parties aériennes……………………………………………………………..
3- Discussion……………………………………………………………………………………….
C- ACTIVITE DE LA NITRATE REDUCTASE……………………………………………………….
1- Plantes âgées de 30 jours……………………………………………………………….
2- Plantes âgées de 60 jours……………………………………………………………….
3-Discussion…………………………………………………………………………………………..
D-Etude anatomique des racines et des tiges……………………………………………..
1-Effet du stress salin sur le système vasculaire racinaire………………...
2-Effet du stress salin sur le système vasculaire caulinaire……………….
3-Discussion………………………………………………………………………………………...
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALES……………………………………………………..
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………………………………
ANNEXES
36
37
37
38
38
39
39
40
42
42
42
43
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53
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59
59
62
64
65
69
SUMMARY
To understand the mechanisms involved in plant tolerance to salinity, we
studied the physiological and biochemical parameters and related to the anatomical
adaptation of bean (Phaseolus vulgaris L.) to salt stress.
The impacts of salinity on development and performance of the plant are
numerous and difficult to prioritize. The sodium and chloride ions enter the plant
through the roots and are conveyed by the xylem to the stems and leaves. Here
they are either stored, plant type "include", or little used and reconducted by the
phloem to the roots of plants such as "excluder".
Salt stress on Na + cl CaCl2) at different concentrations 50.100, 150 and 200
meq.l-1 was applied to the plants aged 30 and 60 days.
The content of chlorophyll pigments in leaf tissues was determined, the results
obtained show that the plants under conditions of increasing salinity, chlorophyll
content significantly lower compared with control plants (untreated). This
depressive effect is more pronounced for the chlorophyll a as chlorophyll b.
Salinity causes an increased accumulation of proline. The levels of this amino
acid increases as the salt concentration increases and also the organ and the growth
stage. This accumulation of nitrogenous compounds is more evident in the leaf parts
in the root.
The young growing bodies accumulate more proline as organs mature who complete
their cell expansion.
The production of proline is stronger than the intensity of treatment is important
and that the leaves are young ie under conditions of intense cell multiplication.
On the other hand, the enzymatic activity of nitrate reductase strongly
decreases with increasing salt treatment.
The data obtained show that exposure of seedlings of bean (Phaseolus vulgaris
L.) to salinity resulted in a drop in growth especially in the aerial part. The effect
of salinity is not uniform for all organs. According to our results, it was noted that
salinity causes an increased accumulation of proline. The levels of this amino acid
to increase gradually as the salt concentration increases, and depending on the
organ.
This depressive effect on growth was accompanied by a more pronounced
decrease of the activity of nitrate reductase in the roots compared to aerial parts
The reduction in growth may also be linked to disturbances in the development
of xylem vessels, sometimes with a reduction in the number and diameter of these
conductive cauline and root under duress saline. Nevertheless, it should be noted that
the effects of salinity on growth and productivity are not always negative.
According to our experimental conditions, the results assume that the bean
(Phaseolus vulgaris L.) has the distinguishing characteristics of other glycophytes
sensitive to salinity stress.
Keywords: Salinity, Phaseolus vulgaris L., Chlorophyll, Proline, Nitrate reductase.
INTRODUCTION
Depuis le début du xx siècle, la superficie des terres agricoles touchées par
la salinité, c’est à dire une teneur excessive en sels minéraux, notamment NaCl
ne cesse d’augmenter.
La salinité est un stress abiotique
important
et un facteur limitant la
croissance et la productivité des plantes (Klan et Panda, 2008).
Aujourd’hui ,25% environ 20 millions d’ha des terres irriguées dans le monde
sont confrontées à ce problème, qui touche plus particulièrement les zones
arides semi arides, telles que les régions tropicales et méditerranéennes.
(Szabolcs, 1994 ; Keren, 2000 et FAO, 2005).
La salinisation des sols de ces régions souvent fertiles n’est seulement pas
liée aux conditions climatiques, mais également à l’activité de l’homme, qui
pour des raisons économiques a développé une agriculture intensive, souvent
mal contrôlée, en pratiquant des techniques culturales inadéquates. (Yeo 1998
et Flowers, 2004)
Le fort ensoleillement et la faible pluviométrie ont obligé les agriculteurs à
irriguer en quantité importante, et souvent avec une eau saumâtre .De plus, les
ressources en eau douce sont de plus en plus limitées ( Shalhev et Hsiao , 1986
et Handy, 1999).
Les sels se sont accumulés au cours des ans à la surface des sols sans pouvoir
être lessivés par les rares eaux de pluies, rendant ainsi peu à peu les terres
impropres à la culture (Levigneron et al., 1995).
Des régions de culture intensive sont devenues, en quelques décennies des
zones sensibles. Les sels présents dans le sol sont responsables de pertes
substantiels du rendement de la majorité des plantes cultivées (Lopez ,1996).
En effet, la présence du sel dans le sol, en affectant les mécanismes
physiologiques de la plante, est un facteur limitatif majeur de la productivité
agricole (Levigneron ,1995)
.
Des concentrations exogènes élevées en sel affecte la germination des
graines, et qui est le premier stade touché .Le taux de germination du cotonnier
chute de 70% en présence de 12g/l de NaCl et la germination des tubercules de
1
pomme de terre peut être retardée de 3à 7 jours selon le degré de la salinité du
sol. (Levy et Fogelman1993).
La croissance et la fructification sont également affectées aussi bien au
niveau quantitatif que qualitatif (Becheer,1993 ; Leland 1994 et Heuer et al. ,
1994,)
Ainsi les medicago, plantes fourragères telle la luzerne, ont une productivité
mesurée en biomasse qui peut être réduite de 40% en présence en sel de 12g/l.
En fait chez les légumineuses le stress salin, perturbe non seulement la
croissance du végétal mais également la fixation de l’azote. La nodulation par
les bactéries symbiotiques est très affectée par le stress salin, touche à la fois
la survie et la multiplication des populations rhizobiènnes (Poolman et Glaasker,
1998) menant à une rupture de l’association entre les légumineuses et les
bactéries fixatrices d’azote (Zahran ,1999).
Le
rendement des céréales telles que le riz, le blé, l’orge
base de
l’alimentation des pays en développement est également affecté par la salinité
(Epstein et Norley , 1980).
Le soja utilisé à la fois pour son huile et pour ses tourteaux, est
particulièrement sensible
.Son rendement en graines diminue de 50% en
présence seulement de 0,6g/l de NaCl (Becheer,1993). De même, la teneur en
huile des graines d’arachides est réduite de 12à 25 % selon l’intensité du stress
salin (Heller et al. , 1998).
Pour palier à cette contrainte environnementale agropédoclimatique qui est
la salinisation des sols deux solutions semblent se dessiner pour limiter le
problème de la salinité : D’une part, on peut agir sur le sol lui même en
modifiant sa texture par des amendements calcaires (Heller et al.,1998) et en
améliorant les techniques culturales, notamment par des campagnes de
fertilisation adéquate (Heuer et al., 1998 et Feigin, 1985) en désalinisant les
eaux d’irrigation et ceci demande des investissements importants que la plupart
des pays ne peuvent prendre en charge.
La salinité du milieu ne constitue pas une contrainte pour les plantes
halophytes dont certaines peuvent se développer à des concentrations salines
pouvant aller jusqu'à 1M NaCl.
2
Dans les sols salins, de nombreuses espèces disparaissent sinon déclenchent
des mécanismes de résistance ou de tolérance à ces contraintes. (Ungar, 1987,
Chamar ,1993). Cette capacité des plantes à s’adapter aux environnements
salins s’accompagne par des modifications morphologiques anatomiques, et
biochimiques (Ammouche, 2002, Parida et al., 2005 et Moinuddin et al.,2005) et
parfois par des modifications de l’expression des gènes spécifiques (Hasegawa et
al., 2000 ; Zhu, 2001).
Au niveau physiologique, de nombreux travaux rapportent que la salinité
affecte l’activité photosynthétique en réduisant la concentration intracellulaire
en CO2. Cette réduction est non seulement attribuée à la fermeture des
stomates ce qui conduit à une réduction du CO2 mais également à la
conductance stomatique.
Il a été démontré que le sel affecte les enzymes
photosynthétiques
chlorophylles et caroténoides (Stephen et Klobus, 2006).
La salinité réduit la capacité des feuilles à utiliser l’eau, ce qui conduit à
une réduction du taux de croissance, et des changements métaboliques des
feuilles. (Munns ,2002).
Les mécanismes d’adaptation à la salinité sont liés à l’action combinée de la
pression osmotique et la toxicité due à un excès d’ions et un déséquilibre
ionique (Yeo,1983) .Les effets osmotiques sont dus à la diminution du potentiel
causé par le sel dans l’eau. La salinité a pour conséquence une réduction du
contenu en K+ et Ca2+ (Mansour et al., 2005 et Chadli et Belkhodja,2007).
Les caractères comme le rendement, la survie, la vigueur sont des critères
les plus utilisées généralement pour identifier la tolérance à la salinité
(Shannon, 1984 ; Gamma ,2007). D’autres index de tolérance ont également été
proposés et qui sont basés sur des caractéristiques physiologiques spécifiques
dans l’accumulation des ions au niveau des feuilles.
Parmi les modifications du métabolisme biochimique, lors d’un stress salin,
les plantes synthétisent des osmolytes telle que la proline (Khalfaoui, 1990 ; HU
et al., 1992 ; et Mekhaldi,2007) et qui participe à l’ajustement osmotique dans
la cellule (Goldhirs et al., 1990).
La nitrate réductase est une enzyme primordiale dans la voie d’assimilation
de l’azote, elle catalyse la réduction des nitrates NO3- en nitrites NO23
(Campbell 1999).Le nitrite réduit en ammonium par la nitrite réductase et par la
suite est incorporé dans les acides aminées à travers l’action de la glutamine
synthétase et la glutamate synthase .
La salinité a un effet dépressif sur l’activité du nitrate réductase et ceci a
été démontré dans de nombreux travaux (Mekhaldi, 2007) sur Vigna et Marouf
,1986 sur la luzerne.
Nous avons retenu dans ce travail, Phaseolus vulgaris l. comme matériel
végétal de base pour étudier les effets de la salinité sur le comportement
physiologique, anatomique, et biochimique de cette espèce.
Afin de caractériser cette réponse dans nos conditions expérimentales :
- nous abordons cette étude par une analyse de la croissance et de la
teneur en pigments chlorophylliens chez des jeunes plantes, âgées de 30 et 60
jours, conduites sous régime salin ;
- nous poursuivrons notre travail par une étude des variations de la proline
chez ces plantes dans les mêmes conditions de stress.
- Dans une troisième étape, nous proposons une analyse de l’activité
enzymatique de la Nitrate Réductase dans les organes souterrains et aériens.
- Et enfin, nous achevons ce modeste travail par une investigation sur la
réponse anatomique des racines et des tiges chez des plantes stressées à la
salinité.
4
CHAPITRE I- DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES
A- STRESS DE L’ENVIRONNEMENT :
Le stress (du latin stringere : porter atteinte à l’équilibre) est une déviation
significative des conditions optimales pour la vie. Il implique des réponses à tous
les niveaux de l’organisme.
Selon Levitt (1980), Le stress est une contrainte qui peut se résumer à une
(ou plusieurs) force(s) de déformation appliquée(s) à un corps. Cette contrainte
modifie les dimensions et la forme du corps. Selon le même auteur, deux types de
déformation plastique existent ;
a) déformation elastique (« stress avoidance » en anglais) souvent réduit au
terme de résistance. L’organisme inhibe ou réduit la pénétration du stress
(e.g., substance toxique) dans ses tissus. L’organisme augmente ainsi le
niveau de stress nécessaire pour un même niveau de tension interne,
b) déformation plastique stress tolerance » en anglais) souvent réduit au
terme de tolérance. L’organisme absorbe l’agent stressant pour rétablir
l’équilibre thermodynamique avec son environnement sans subir de blessure
irréversible tout en poursuivant sa croissance.
Parmi les facteurs du stress il existe des facteurs de l’environnement biotiques
ou abiotiques qui stabilisent l’organisme parce qu’ils représentent une carence, un
excès, une action très rapide ou trop lente ou encore une atteinte à l’intégralité
du végétal. selon Hopkins (2003) on peut distinguer deux stress abiotiques, la
sécheresse et la salinité.
1 -La sécheresse
Une sécheresse est une longue période de temps pendant laquelle les
quantités des précipitations sont en dessous des statistiques dans une région,
La
sécheresse
peut
être
considérée
comme
un
catalyseur
de
la
désertification car elle affecte la structure du sol et provoque des changements
dans la végétation. Le passage contrasté d’épisodes de sécheresse et de pluies
diluviennes, fragilise la structure du sol, accélère l’érosion et le processus de
désertification (Requier-Des Jardins et Caron, 2005).
5
Le terme de sécheresse est toujours lié à un déficit de la pluviométrie
toutefois lorsque ce déficit est systématique on parle d’aridité
L'aridité traduit des conditions climatiques caractérisées par la faiblesse des
précipitations moyennes annuelles (moins de 250 mm d'eau par an) mais aussi par
leur irrégularité dans l’espace et dans le temps et par une forte évapotranspiration
(Aggoussine , 2003 )
La sécheresse se définira alors par l'intensité de sa déviation par rapport
aux valeurs moyennes ou normales de pluviométrie, avec des éléments quantitatifs
sur sa durée, sa période d’occurrence et son extension géographique (Amigues et
al., 2006).
La sécheresse affecte l'état des végétaux et se traduit par un ralentissement
de l'activité photosynthétique de la végétation entraînant une diminution de la
production, notamment pour les cultures et les fourrages (Seemann et
Critchley,1985).
Les plantes des adaptations spécifiques aux environnements arides sont
appelées xérophytes (PURVES et al. ,1994). Ce sont des plantes adaptées à la
sécheresse (du grec xêros=sec et phyton = plante. Nous avons des sclérophylles
qui sont fortement sclérotiques et des plantes succulentes ou plantes grasses (ou
charnues).
1.1-Conséquences de la sécheresse sur le fonctionnement des plantes
La diminution
de la
photosynthèse, liée à la diminution de la teneur
relative en eau et du potentiel hydrique foliaire est due essentiellement, à la
réduction de la pénétration du CO2, limité par une fermeture des stomates (Plaut
et al.,1989).Le contrôle de la régulation stomatique fait intervenir la turgescence
cellulaire
mais
également
des
messagers
racinaires
comme
l’acide
Abscissique‘ABA’ (Zhang et Davies, 1989; Davis et al., 1994). Dans une telle
situation, l’altération de l’état hydrique de la feuille peut conduire à augmenter la
sensibilité des stomates à l’ABA (Tardieu et al., 1993);
Le manque d'eau réduit aussi la production de matière sèche (Chenais et
al., 2003).
6
La sécheresse ralentit la synthèse protéique; en revanche la synthèse de
certains acides aminés (Asparagine, Proline.) est stimulée (Bonneau et Souchier,
1994).
1.2-Adaptation des plantes à la sécheresse
Les stratégies d’adaptations
généralement retenues sont l’échappement,
l’évitement et la tolérance:
•
L’échappement :
Les plantes « évitantes » peuvent subsister en période de sécheresse en
évitant une chute excessive de leur potentiel hydrique foliaire et de
leur teneur en eau relative, donc en gardant leur turgescence. Elles ne pratiquent
pas l’ajustement osmotique et ne tolèrent qu’une déshydratation limitée
(Vartanian et Lemee,1984 ;Premachandra et al.,1992 ; Meloni et al.,2001 et Hajer
et al.,2006).
•
L’évitement et la tolérance:
Les plantes tolérantes, qui sont surtout des plantes vivaces, sont capables de
supporter une déshydratation assez poussée de leurs tissus et sont capables
d’ajustement osmotique, ce qui permet le maintient de la turgescence. Elles
retardent la fermeture de leurs stomates, propriété dénommée ‘ ajustement
stomatique’ (Sultana et al.,1999).
2 -La Salinité
Un sol, une eau d’irrigation ou une solution nutritive sont salés lorsqu’ils
contiennent des concentrations anormalement élevées en chlorures, sulfates
carbonates ou bicarbonates de sodium, calcium ou magnésium.
Ce phénomène a inquiété les hommes qui ont longtemps cru que la terre
était une source infinie de richesse de toute nature. Depuis, il y a de cela quelques
décennies qu’il fallait se mettre à l’évidence que les ressources naturelles sont
limitées dans temps et dans l’espace.
7
Depuis le début du xx siècle la superficie des terres agricoles touchées par la
salinité c’est à dire une teneur excessive en sels minéraux notamment NaCl , ne
cesse d’augmenter.
La salinisation enregistrée dans les écosystèmes arides et semi arides
résulte de forte évaporation d’eau du sol (Munns et al., 2006) et d’une
pluviométrie insuffisante (Mezni et al ,2002). Cette salinisation provient aussi de
l’irrigation le plus souvent mal contrôlée (Bennaceur et al ; ,2001.
Chaque année les surfaces perdues à cause de la salinité des sols varient
autour de 20 millions d’ha dans le monde.
Ainsi ces surfaces sont passées de 48 millions à 265 millions d’ha de terres
agricoles touchées par la salinité et aujourd’hui les surfaces agricoles affectées
dans le monde seraient de 340 millions d’ha soit 23%des terres cultivées dans le
monde (Chevery, 1995)
Selon Szabols 1994, un milliard d’ha est menacé dont 3,2 millions d’ha en
Algérie Belkhodja et Bidai ,2004)
La salinité et la sécheresse représentent deux contraintes naturelles
majeures conditionnant le développement et la production des végétaux dans les
zones arides et semi aride (Vieira Dasilva et al .,1990).
La salinité a eu des effets sur l'agriculture depuis très longtemps. Depuis cinq
mille ans, les peuples de la Mésopotamie ont cultivé le Croissant fertile des rivières
du Tigre et de l'Euphrate (actuellement Turquie et Iraq), une des terres agricoles les
plus riches du monde de l'époque. Quand le sel a commencé à s’accumuler dans le
sol, résultat de lessivage et de drainage inadéquats de l’eau d’irrigation, la
principale culture pratiquée a changé du blé à l’orge qui est plus tolérante à la
salinité. Par la suite, les sels se sont accumulés au point que rien ne peut croître et
la terre a été abandonnée.
En Algérie, comme dans d’autres pays, le problème de la salinité demeure
une contrainte majeure pour la croissance et le développement de diverses espèces
cultivées et spontanées
Des effets dépressifs sur les plantes sont constatés en terres arables des régions
arides semi arides (Daoud 1993, Valentin 1994).
8
Dans ces régions, les sols sont perturbes à la fois dans leur activité
biologique, leur stabilité et leur fertilité .Ils sont sans cesse soumis à une grande
variabilité physico-chimique du notamment à la présence de NaCl (Vieira DaSilva
,1990)
De ce fait ces changements imposent la réflexion sur les stratégies à
entreprendre pour comprendre les mécanismes mis en jeu par les plantes afin de
s’adapter aux nouvelles conditions de l’environnement et de maintenir leur
croissance et leur productivité. (Belkhodja et Bidai 2004, Trunchant et al. ,2004).
La réponse au sel des espèces végétales dépend de l'espèce même, de sa variété,
de la concentration en sel, des conditions de culture et du stade de développement
de la plante (Mallek E., 1989 et Mallek-Maalej et al., 1998).
2.1-Impact de la salinité sur le développement des plantes
La présence de quantités importantes de sels dans la solution du sol abaisse
le potentiel hydrique et réduit fortement la disponibilité de l'eau pour les plantes.
On parle alors de milieu « physiologiquement sec », les plantes communes
(glycophytes) ne peuvent s'y développer. Seule une végétation halophile zonée
(essentiellement en fonction de la salinité) peut se développer dans ces conditions
(Tremblin, 2000).
2.1.1-Germination
L’excès de sel affecte la germination, la croissance des plantules et leur
vigueur, la phase végétative, floraison et la fructification à des degrés variables
(Delgado et al.,1994,Cordovilla et al,1995a,1995b ,1995c) conduisant à terme à
des baisses des rendements et de qualité de production.
Keiffer et Ungar (1995) et Ghoulam et
Fares (2001) ont observé qu’une
exposition prolongée aux solutions salines peut inhiber ou stimuler la germination
chez certaines espèces et que Le succès de la germination des graines et les
réponses à ces besoins sont reliés à la durée et à l’intensité de l’exposition à la
salinité dans leur milieu naturel.
Des concentrations exogènes élevées en sel affectent la germination des
graines de Phaseolus vulgaris L.(Khan et al., 2002 et Khan et panda 2008)
9
L’apport de Nacl a entraîné une baisse significative des teneurs en lipides et
du taux de germination chez cinq légumineuses. Cependant cet effet dépressif du
sel a été plus marquée chez les deux glycophytes (Phaseolus vulgaris,Glycine max),
tan disque chez Mucuna poggei (halophyte facultative) ,Phaseolus adenanthus
(halophyte) et Vigna unguiculata (glycophyte moyennement tolérante) il est moins
marqué ( Taffouo et al., 2008).
Le taux de germination et l’accumulation des protéines et de proline au
niveau des feuilles pourraient être utilisés comme critère précoces de sélection des
légumineuses tolérantes à la salinité (Taffouo et al., 2008).
Ungar (1987) rapporte que la germination des graines des halophytes en
milieu salin est variable et spécifique de l’espèce ?
Billard et Binet (1975) ont conclu que les graines d’Atriplex arenaria
germent jusqu'à 40% dans l’eau de mer placées sous un régime thermique quotidien
12h à 5°c et 12h à25°c .
Benrebiha (1987)a montré que la germination des Atriplex halimus et
nummularia est inhibée dés que la concentration en NaCl dépasse 4g/l à 20°c.
L’Atriplex canescens peut survivre à des salinités basses ou moyennes et
compléter en abscense de sel ( Khan et al 1985).
Belkhodja et Bidai (2003) ont mis en évidence l’effet de la salinité sur la
germination des graines de deux écotypes d’Atriplex halimus. A la salinité 20g/l
proche de l’eau de mer, la germination ralentit et l’effectif des graines germées
reste insuffisant alors qu’a la salinité
équivalente à l’eau de mer ( 35 g/l de
NaCl) la germination est inhibée.
2.1.2- développement et croissance
La salinité est un des plus important des stress abiotiques, qui limite la
croissance et la productivité des plantes.(Khan et Panda ,2008).On peut observer
les effets néfastes de la salinité élevée sur les plantes telle que la réduction
significative de la croissance , de la diminution de la productivité et même la mort
des plantes (Miller et al ,2006).
L’étude anatomique effectuée sur des tiges et des racines
de deux
génotypes de fève ( Vicia faba L. ) soumis à un stress salin montre une réduction
10
dans le nombre et la taille des vaisseaux conducteurs notamment le xylème ainsi
qu’une déformation de leur paroi ( Chadli,2007).
Dans une étude réalisé sur Phaseolus vulgaris , il a été démontré que la
variabilité de tolérance à la salinité au sein des espèces viendraient largement d’un
rapport PR/PA biomasse racinaire / biomasse aérienne élevé (Bayuelo- Jimerez et
al ,2002).En effet ,ces espèces maintiennent une croissance racinaire relativement
importante sous forte salinité , l’augmentation du rapport qui s’ensuit semble être
associée à une augmentation de leur tolérance au sel.
Mainassara-Zaman et al.,(2009) suggère que ,sous contrainte saline la plante
dépense plus d’énergie photosynthétique pour maintenir un statut hydrique élevé
et pour la production des racines en vue de la recherche d’eau et/ou la réduction
de la perte d’eau.
Par ailleurs, une étude a été faite sur trois cultivars de Phaseolus vulgaris
pour évaluer les paramètres biométriques .En effet, la salinité affecte la biomasse
des feuilles des trois cultivars. Cette réduction de la biomasse des haricots en
conditions saline limite la croissance. La salinité a eu aussi des effets nuisibles sur
les paramètres morphologiques tels que la taille et le nombre des feuilles ainsi que
le rapport pousse/racine (Kaymakanova et Stoeva,2008).
Les plantes de Pistacia vera L . cultivées avec 150mMde NaCl ont élaboré
moins de matière sèche et ont eu une teneur inférieure en chlorophylle par rapport
à celles développées sans NaCl.Seules les ajouts de CaSO4 aux concentrations (50 et
100mM) ont permis de pallier les effets négatifs de la salinité sur le contenu en
matière sèche et en chlorophylle de la plante (Tavallali et al .,2008).
Le calcium est connu pour avoir un effet améliorant vis à vis du stress salin
sur la croissance des plantes (La Haye et Epstein, 1971). De plus les effets du
calcium peuvent être plus important que ceux du sel de sodium (Aceves et al.,
1975).
L’accumulation de Na exerce une action toxique qui se manifeste par des
lésions sur les feuilles (Gouny et Brachet 1967, cité par el Mekkaoui ,1990).les
fortes concentrations en sel provoquent la diminution de la croissance des feuilles
qui résulte en partie d’une réduction de l’assimilation nette en CO2 (Akita et
Cabuslay ,1990)provoquée par la fermeture des stomates en réponse au faible
potentiel de l’eau du sol ou du substrat.
11
La diminution de la croissance est une réponse à la déshydratation ; elle
contribue à la conservation des ressources en eau, ce qui permet la survie de la
plante (Binzel et al., 1988 ; Sing et al., 1989).
2.2- Réponses des plantes aux stress salin
Quand les plantes sont exposées à la concentration élevée de sel, elles
peuvent développer divers mécanismes pour leur survie.
La réponse au sel des espèces végétales dépend de l’espèce même, de sa variété
,de la concentration en sel , des conditions de culture et du stade de
développement de la plante (Maalek-Maalej et al 1998).
Selon Brun (1980), certaines espèces peuvent supporter jusqu'à 30g/l soit à
peu prés la concentration de l’eau de mer.
Les végétaux capables de prospérer en milieu salin se rencontrent
essentiellement au contact de la mer (Bernard ,1972).
D’autres espèces voient leur croissance inhibée dés la plus faible teneur en sel
(Marouf ,1986) .Selon Brady et Weil (2002), les plantes peuvent être regroupées
dans des classes de tolérance ou niveau de tolérance et de salinité. C’est la
performance à stocker le sel dans les parties aériennes qui est déterminante dans
le niveau de tolérance au sel des espèces.
•
Halophytes et glycophytes
Les végétaux peuvent être classées en deux grands groupes suivant leur
comportement vis a vis du sel (Levigneron et al., 1995).
Les plantes qui croissent sur des sols très salins sont nommées halophytes
(Hopkins, 2003).
Le terme halophyte vient du grec halo (sel) et phyt (plante).on appelle
halophyte toute plante qui est en contact par une partie quelconque de son
organisme
avec
des
concentrations
fortes
en
sel.les
halophytes
sont
essentiellement des Angiospermes ,très peu de Bryophytes vivant en bord de mer
supportent le sel.
12
Certains
halophytes,
bien
que
pouvant
résister
à
d’importantes
accumulations de sel dans le milieu extérieur, peuvent se développer normalement
sur des sols non salées et sont appelées halophytes facultatives (Strogonov,1962)
tandis que d’autres ne peuvent se développer complètement qu’en présence de sel
et sont appelées halophytes obligatoires.
Les halophytes obligatoires sont encore plus rares ; citons deux mousses,
Pottia heimii, des prés salés, et Grimmia maritima, des fentes de rochers siliceux,
au dessus de la première ceinture d’algues (zone à Pelvetia canaliculata).
Quelques halophytes peuvent tolérer des niveaux extrêmement élevés en sel Taji
et al. ,2004).Les concentrations internes en sel peuvent atteindre des valeurs trois
fois supérieurs au milieu extérieur (Munns et al., 1983). Par conséquent la capacité
des cellules à maintenir de basses concentrations cytolosique en Na+ est un
processus essentiel pour les halophytes (Borsani ,et al 2003).
Les halophytes accumulent le sel dans des vésicules et glandes à sel et
l’excrètent ensuite à la surface de la feuille .Ces plantes possèdent en effet des
capacités pour maintenir un potentiel hydrique interne bas sous la contrainte saline
du milieu (Pugol et al., 2001) créant une pression de turgescence suffisante
(Rontein et al ,2002) pour leur croissance sans affecter leur métabolisme.
Dans
Les
écosystèmes
fortement
salés,
les
halophytes
évoluent
naturellement; néanmoins, au cours de leur développement diverses espèces
expriment des degrés différents dans
la tolérance à la salinité
(Belkhodja et
Bidai ,2004).
La croissance de quelques genres d’halophytes y compris Salicornia et
Atriplex est estimé par un niveau donné de salinité.
L’Atriplex halimus atteint la croissance optima à un niveau de salinité entre
1%et 2% de Nacl (Zid et al ,1977) avec un seuil maximum de tolérance de NaCl de
3%. La croissance de Halimus est stimulée par l’addition du NaCl au milieu , ceci
indique la capacité de cette espèce à accumuler des sels pour son osmorégulation
et croissance . (Hamdy et al.,1977) .
L’inhibition de la croissance
dans les conditions salines peut etre due à
l’effet osmotique de l’ion spécifique de toxicité . Les halophytes doivent résister à
la toxicité du chlorure de sodium et à la sécheresse. Elles vont y répondre par
quelques adaptations ( PURVES , et al., 1994) . Les chénopodiacées dont font
13
partie l’Atriplex , sont des plantes adaptées à la sécheresse ont souvent une tige
et parfois des feuilles qui leur permettent de stocker l’eau.(Brun, 1980).
Les glycophytes ne peuvent tolérer le stress salin , et sont sévèrement
troublés ou même tués par 100 à 200 mmole/l de NaCl.(Belkhodja, 1996). Les
glycophytes s’opposent aux halophytes venant du grec glycus= doux.
Citons les arbres fruitiers sont sensibles à quelques millimoles/l de NaCl .
Flowers définit les halophytes comme des plantes d’environnement salin
dont le rapport k/Na tend à être plus bas , et la concentration ionique globale plus
élevée que chez les glycophytes , plantes d’environnement doux ou non salin qui
ont normalement un rapport K+/Na+ élevé dans les feuilles.
2.2.1-Mécanismes de transport du sel dans les feuilles
A certaines doses, le sel (chlorure de sodium ) devient toxique (Levigneron
et al., 1995) . Les plantes développent plusieurs stratégies pour limiter le stress
salin. (Berthomieu et al. ,2003).En effet une plante cultivée sur un sol riche en sel
doit faire face à la pénétration du sel dans ces tissus .Ce dernier est rejeté ou
accumuler par les différents organes, tissus cellules et compartiments cellulaires
(Levigneron et al, 1995). Certaines tolèrent les concentrations élevées d’ions
toxiques par l’exclusion ou
par compartimentage d'ion dans la vacuole
et la
production de corps organique dissous dans le cytoplasme pour abaisser le potentiel
osmotique (Harinasut et al., 2000).
A l’échelle de la plante, les ions Nacl entrent par les racines, et sont
véhiculés par la sève xylémique jusqu’aux tiges et aux feuilles .La ,ils sont stockés
, ce sont des plantes dites includer , ou au contraire très peu retenus et
revehiculés par la sève phloémique jusqu’aux racines ce sont des plantes dites
excluder .
14
a) Inclusion
La plante capte le sel qui parvient aux feuilles au même titre que l’eau par
le mouvement ascendant de la sève dans les vaisseaux .A l’intérieur des cellules ,
le sel est alors stocké dans les vacuoles grâce à des systèmes de
pompes
moléculaires. Les vacuoles sont des compartiments fermés au sein de la cellule .Le
sel est ainsi isolé des constituants cellulaires vitaux (Berthomieu et al., 2003).
Les mécanismes impliqués dans le transport du Na au travers la membrane
vacuolaire, le tonoplaste ne sont pas encore complètement élucidés.
L’entrée de Na+ se fait contre son gradient électrochimique, l’énergie nécessaire
au transport de cet ion serait fournie par le gradient de protons engendré par la
pompe à protons du tonoplaste .
Na+ et le Cl- sont séquestrés dans la vacuole de la cellule, cela se produit
dans la plupart des espèces; il en ressort ainsi des concentrations élevées trouvées
dans des feuilles qui fonctionnent toujours normalement (Muns, 2002).
La vacuole se chargerait ainsi en Na+ grâce à l’action d’un antiport sodium –
proton Na+/H+ lequel serait entretenu par le fonctionnement accéléré des pompes
à protons.
L’existence d’un antiport a été démontré non seulement chez des plantes
halophytes comme Atriplex nummularia (Hassidin et al , 1990) , Beta vulgaris
(Blumwald et Poole , 1985) et Plantago
maritina
mais également chez les
glycophytes comme l’orge et le coton (Gabarinot et Dupont , 1988).
Un gène codant pour un antiport Na+/K+ a été cloné et séquencé chez la
levure Saccharomyces pombe .
Les plantes tolérantes au sel , ont en général des feuilles plus chargées en
Na+que les racines lorsqu’elles sont cultivées en présence de sel (Slama ,1986).
Sous des conditions accrus en NaCl , la séquestration de Na+ dans les
vacuoles des cellules permet de maintenir un niveau bas de Na+ dans le cytosol ,
réduit au minimum l’endommagement des enzymes présents dans le cytosol par cet
ion.( Flowwers et al, 2004).
a)
Exclusion
Chez les plantes dites excluder , le sel est véhiculé jusqu’aux feuilles ,faute
d’y être piégé est réexporté vers les racines par le phloème . Dans ce cas ce sont
15
les cellules racinaires qui assurent la protection des parties aériennes , en limitant
la quantité de Na+ transporté par le xylème et ou en l’excrétant dans le milieu
extérieur .
Les plantes excluder sont généralement sensibles à la salinité et sont
incapables de contrôler le niveau de Na+ cytoplasmique.
Un autre mécanisme d'exportation des feuilles est l’excrétion par des glandes ou
des réservoirs souples de sel. Ceux-ci peuvent aider à maintenir un équilibre
régulier de sel (Baall ,1988).Ces glandes de sel sont localisées sur ou dans
l’épiderme. Le NaCl est exclu du phloème, donc n’atteignant pas les fleurs et les
graines.
Les mesures des ions dans la sève de phloème ont indiqué que les espèces
tolérantes au sel excluent Na+ et Cl- du phloème afin de ne pas être réorientés vers
les tissus croissants de la pousse (Munns et al. ,1988).
L'exclusion de sel est également le dispositif adaptatif le plus important
réglant la charge interne de sel des halophytes, même dans les espèces qui ont des
glandes ou des réservoirs souples de sel.
L’exclusion semble être une évolution par
rapport à la tolérance
ou à
l’inclusion puisque ne pas réaliser l’équilibre thermodynamique (en réduisant la
tension interne) pour préserver les fonctions métaboliques à leur optimum favorise
une meilleure croissance (Levitt, 1980).
c) Sélectivité
L’antagonisme Na+, K+ est connu aussi bien chez les Halophytes que chez
les gLycophytes. Les espèces tolérantes ont tendance à absorber plus de
potassium que les espèces sensibles.
La sélectivité d’absorption de potassium (K+) par apport sodium (Na+) peut
être exprimée par la relation suivante :
Cette relation de sélectivité entre K+/Na+ qui détermine l’alimentation
potassique et la tolérance a été décrite par comparaison des rapports K+/Na+ des
plantes sensibles et tolérantes : les variétés qui présentent les rapports les plus
élevés sont tolérantes par contre les variétés sensibles présentent les rapports
K+/Na+ les plus faibles.
16
Les variétés de Surgho tolérantes ont été sélectionnées d’après ce critère
croissance et les teneurs en sodium et calcium dans les différents organes.
Le calcium (Ca+2) réduit l’absorption du sodium (Na+) dans le milieu et par
voie de conséquence favorise la sélectivité K+/Na+ au niveau du plasmalemme.
Ce dernier réduit l’envahissement des plantes par le sodium. Donc le
maintient de la sélectivité entre K+ et Na+ dans les racines nécessite la présence
de Ca++ (Chadli,2007) .
La majorité des végétaux doit maintenir un rapport K+/Na+ élevé dans les
parties aériennes, il semble donc qu’une sélectivité en faveur du K+ soit nécessaire
lors de la sécrétion (Benaldj,2007).
3-Adaptation des végétaux à la salinité
La réponse des plantes au stress salin est très complexe. L’adaptation
d’une plante au stress salin implique la mise en place de divers mécanismes qui
vont lui permettre de limiter l’envahissement de ces cellules par le sel , de limiter
la déshydratation de ces tissus , de lutter contre le dysfonctionnement de son
métabolisme carboné et minéral…
3.1-Resistance au stress hydrique
Un
stress hydrique se rapporte à l’état physiologique de la plante,
lorsque les conditions d’eau sont défavorables à la croissance optimum.
(Blum,1974)
Le stress hydrique perturbe la floraison et la fécondation, réduisant donc le
développement des épis (Chenais et al, 2003).
L’eau occupe une place importante dans les phénomènes métaboliques de part son
rôle dans la photosynthèse (Mazliak ,1995) le transport et l’accumulation ainsi que
dans la multiplication et le grandissement cellulaire (Heller ,et al 1998).
L’élévation du taux de la salinité dans le sol est perçue par la plante
comme une diminution de la disponibilité en eau. Ce stress hydrique résulte d'une
période de sécheresse plus ou moins prolongée et pendant laquelle le déficit
hydrique augmente progressivement.
La résistance à la sécheresse dépend de
l’aptitude de la plante à
développer un système radiculaire important et à limiter ses pertes d’eau
17
cuticulaires
ou stomatiques ( transpiration /ou évaporation).Cette résistance
dépend également du passé de chaque individu (Turner,1990).
Des modifications des caractéristiques hydriques, potentiel hydrique foliaire
et teneur relative en eau (TRE) d’une plante rendent compte du statut hydrique et
aussi de sa capacité à incorporer l’eau particulièrement en situation de contrainte
hydrique.(L. Redhouane,2008). En effet, la
teneur relative en eau(TRE) et le
potentiel hydrique foliaire utilisés pour deux écotypes de (Pennuselum, glaucum
L)montrent une diminution en présence de stress hydrique. Ces caractéristiques
sont très importantes, puisqu’elles conditionnent le rendement (L. Redhouane
,2008).
Afin d’éviter la déshydratation de ses tissus , la plante doit procéder à un
ajustement de son potentiel osmotique en accumulant des solutés ioniques et
organiques .
Cet ajustement osmotique sera adapté afin que le potentiel hydrique
cellulaire demeure inférieur à celui du milieu extracellulaire et à celui du
sol.(Greenway et Munns, 1980).Ce phénomène assure , d’une part la poursuite de
l’absorption de l’eau du sol ,et d’autre part la rétention de l’eau intracellulaire et
le maintient de la turgescence .
Au début du cycle végétatif, la plante ajuste sa taille à l'eau disponible dans
le milieu en réduisant la surface et/ou le nombre de ses feuilles, et le nombre de
ses organes d'accumulation. Ainsi, ses besoins en eau sont plus faibles mais sa
biomasse réduite; elle reste capable de produire des semences, mais moins
nombreuses ( I.N.R.A , 2000).
Durant la seconde partie du cycle végétatif, c'est par une sénescence
accélérée des feuilles et l'avortement de graines que les réductions de taille
s'opèrent (Lelievre, 1999).
3.2-Stratégies adaptatives au stress salin
La présence
pression
osmotique
de fortes concentrations de sel dans le milieu crée une
élevée
dans
l’environnement
racinaire,
réduisant
la
disponibilité de l’eau du sol pour la plante. A ce déficit hydrique est associé un
stress ionique.
18
Ce type de stress est lié à la composition en éléments minéraux du sol et les
carences en certains ions. (Monneveux et This ,1997) .
En conséquence du stress salin ,un troisième type de stress peut résulter ,le
stress nutritionnel .En effet des concentrations salines trop fortes dans le milieu
provoquent une altération de la nutrition minérale.
Selon le degré de la salinité dans le milieu les glycophytes en particulier sont
exposées à des modifications de leur comportement morpho-physiologique
(Bennaceur et al. ,2001), biochimique (Mekhaldi,2007) et minéral (Martinez et al.
,2007) .
3.2.1-Ajustement osmotique
Les plantes réagissent à ces variations de la salinité dans le biotope, soit
pour disparaître ou déclencher des mécanismes de résistance .Parmi ces
mécanismes, l’ajustement osmotique joue un rôle primordial dans la résistance ou
la tolérance de la plante à la contrainte (Munns, 2002).
En effet la tolérance dans le cas d’un abaissement du potentiel hydrique ,
s’exprime par un maintien de la turgescence (Garg et al ,2002 ; Moinuddin et al
,2005) grâce au phénomène d’ajustement osmotique.
En conditions de salinité, l’ajustement osmotique est l’un des mécanismes
d’adaptation aux contraintes hydriques du milieu chez de nombreux halophytes et
glycophytes dont les plantes cultivées (Weiberg, 1987 ; Kingsbury et Epstein, 1984 ;
Yang et al.,1990)
Ce phénomène apparaît
aujourd’hui comme un mécanisme majeur
d’adaptation au stress ionique et osmotique qui s’exprime par la capacité d’un
végétal à accumuler au niveau symplasmique et de manière active des ions tel que
les K+ etNa+ (Parida et Das 2005,Navarro et Rubio ,2006) et CL- (Munns et al 2006,
Teakle et al 2007) ou de composés organiques tels que les sucres solubles (Ottow et
al 2005) et certains amino- acides comme la proline (Morant-Manceau et al ,2004).
Il
permet
le
maintien
de
nombreuses
fonctions
physiologiques
(photosynthèse, transpiration, croissance) (Grennan, 2006 ; martinez et al ,2007)
et il peut intervenir à tous les stades
du développement du végétal (Malasses,
1996).
L’osmorégulation permet une protection des membranes et des systèmes
enzymatiques surtout dans les organes jeunes et la proline semble jouer un rôle
19
dans le maintient des pressions cytosol- vacuole et de régulation du pH (Ottow et al
2005)
L’ajustement osmotique protège donc les structures cellulaires et réduit les
dommages oxydants provoqués par les radicaux libres, produits en réponse à la
salinité élevée (Waissel 1972 ; Bellinger al.,1991; Sennada et al.; 1995).
L’utilisation de la mesure de l’ajustement osmotique comme critère de
sélection en conditions de sécheresse ou de déficit en eau a été proposé par
Morgan, (1983). En effet, en conditions de déficit en eau les variétés de blé à
haute capacité d’ajustement osmotique donnent de meilleurs
rendements que
celles dont la capacité d’ajustement est réduite.
Il a été proposé des tests de sélection reposant sur ce caractère
physiologique.
3.2.2- Accumulation de la proline
Les plantes soumises aux contraintes engendrées par la salinité réagissent à
cette agression par une modification de leur teneur en certains composés
organiques. Ces réactions d'adaptation sont destinées à rétablir l'équilibre hydrique
dans la plante. Ces composés sont alors produits en quantité inhabituelle en
s'accumulant dans les cellules (Hubac et Vieira, 1980).
Les composés qui s'accumulent le plus sont généralement
la bétaïne, la
proline et la glycine bétaine, bien que d'autres molécules puissent s'accumuler aux
concentrations élevées dans certaines espèces (Briens et Larhier,1982;Gorham et
al.,1986; Belkhodja et Ait-Saadi,1992:Hasegawa et al.,2000; Belkhodja et
Bidai,2003).
Il a été démontré que certains composés notamment les sucres solubles et la
proline s’accumulent dans les tissus des plantes cultivées sous stress salin (Larher
et al., 1991 ; Irigoyen et al., 1992 ). Cependant, les éléments les plus souvent
associés à la tolérance des plantes à la salinité sont des molécules azotées comme
la glycine bétaine , 1991), les polyamines (Le Dily et al., 1991) ou des acides
aminés telle la proline (El Mekkaoui , 1990).
20
La proline est l’acide aminé le plus communément retrouvé dans les tissus
des halophytes poussant dans des environnements salés (Briens et Larher ,1982) ou
soumises à un stress salin ( Thomas
et al . ,1992).Elle représente 80% du pool
d’acides aminés dans les cellules du tabac (Nicotiana tabacum) adaptées à la
croissance sur un milieu 428 mM Na Cl (4% dans les cellules non adaptées.
Les
plantes exposées à de hautes concentrations de sel accumulent un
soluté organique qui est la proline afin d’ajuster le potentiel osmotique dans le
cytoplasme (Sannada et a.,l 1995; Belkhodja et Benkablia, 2000).
L’aptitude des plantes à la synthèse et à l’accumulation de la proline n’est
pas spécifique aux halophytes (Higazy et al ,1995), elle l’est aussi
pour de
nombreuses glycophytes , chez le pois (Barnun et al ,1979) , l’orge Hordeum
vulgare L. (Buhl et al 1983) , la fève (Belkhodja, 1986) , le tabac et le blé (Ould
Babana ,1999).
Chez Arabidopsis thaliana , une augmentation significative de la proline est
enregistrée lorsque la plante est soumise à une forte salinité.
La proline accumulée chez les plantes en réponse au stress hydrique ou à la
salinité est localisée en premier lieu dans le cytoplasme (Leigh et al., 1981).
Les lieux d’accumulation de la proline au niveau organique, varient d’une
espèce à une autre
La plupart des travaux signalent que la proline migre vers les feuilles pour
s’y localiser
en conditions de stress salin chez l’aubergine (Joshi, 1984), le coton
(Boutelier ,1986) et la fève (Belkhodja ,1996) .Par contre , chez l’espèce Retama
retam
stressée au NaCL , l’accumulation de la proline dans les tiges est plus
importantes que les racines (Ighil Hariz ,1990)
L'accumulation de la proline est considérée actuellement comme l'une des
manifestations les plus remarquables des stress salin et hydrique. La teneur en
proline vient renforcer les mécanismes impliqués dans le maintien et l'amélioration
de la stabilité des membranes cellulaires en réponse au stress salin. (Alem et Amri,
2005).
Dans une étude l’’analyse des résultats biochimiques, montre que
l’accumulation de la proline chez Vigna radiata L. Wilczek a réagi à la salinité
(Mekhaldi , 2007)
21
De nombreux travaux mettent en évidence une richesse en proline des
parties aériennes et en particulier les feuilles chez plusieurs espèces telle quel’
Atriplex halimus L. (Bidai, 2001), tomate (Pérez-Alfocea et Larher, 1995).
E n conditions salines, l’accumulation de la proline est souvent liée à celle
des ions Na+ et K+ (Weiberg, 1987).
Le rôle osmoprotecteur de la proline a été signalé par de nombreux auteurs
La proline a un rôle osmorégulateur dont le pouvoir protège le système
membranaire lors de la déshydratation des différents tissus (BELLINGER et
al. ,1991).
Dans l’étude menée par Belkhodja et Bidai (2003) sur les marqueurs de la
résistance de l’Atriplex halimus L. à la salinité montre que l’accumulation de la
proline varie selon l’organe de la plante, la concentration et la nature du
traitement salin.
Parmi les rôles de la proline, elle pourrait également avoir un effet
stabilisateur sur certaines enzymes comme chez le mais (Zea mays), ou des
analogues chimiques de la proline protègent la pyruvate kinase de l’inhibition
induite par le Na Cl.
L’utilisation de la proline comme critère de discrimination variétale pour la
tolérance à divers stress dont la salinité est largement citée, mais la sélection par
rapport à ce critère dépend des différences
de tolérance entre les variétés
étudiées (Quarrie, 1980)
Le Saint (1969) signale que les précurseurs de la proline sont l’acide
glutamique et les amides. L’accumulation des composés d’osmolytes telle que la
proline lors du stress salin implique la synthèse ou l’activation des enzymes de leur
voie de biosynthèse et par conséquent l’induction des gènes correspondants en
réponse à la contrainte( Lopez, 1996)
Toutefois, il semble que la stimulation de la synthèse de la proline soit
parallèle à une activation globale d’une voie métabolique partant du glutamate
semi aldéhyde et conduisant à la proline. La première enzyme impliquée dans la
voie de biosynthèse
de la proline à partir du glutamate est la pyrroline 5
carboxylate synthétase (P5CS) (Lopez, 1996).
D’après Boggess et al (1976) le déficit hydrique intervient plus dans la
formation de l’acide pyrroline 5 carboxylate (P5C), que dans la réduction de ce
22
dernier en proline. Selon le même auteur, le taux de synthèse de la proline chez le
blé en conditions de stress hydrique est sous le contrôle du taux de la synthèse de
la P5C.
L’ADN codant pour la P5CS
a été isolé chez Vigna aconitifolia et
caractérisée par Hu et al. (1992).La surexpression des gènes codants pour les voies
de biosynthèses de la proline pourraient être une solution à l’amélioration
des
variétés sensibles aux stress osmotiques.
3.2.3-Sucres solubles
D’autres
espèces s’adaptent à la salinité en accumulant
des sucres
solubles, produits par (blocage de la glycolyse) ou le saccharose (provenant de
l’hydrolyse de l’amidon).Ces sucres sont abondants dans le cas de concentrations
fortement salines (Binet ,1980) et déshydratantes ( Hubac et al ,1972).
L’accumulation
des sucres solubles est très prononcée chez les plantes
soumises à la contrainte saline , ces sucres ont pour rôle l’établissement de
l’équilibre osmotique (Balibrea et al ,2000 ; Munns, 2002 ). Des études ont été
menées par Akitas et Cabuslay (1990) sur plusieurs espèces végétales telle que
l’haricot (très sensible) le riz (sensible), le soja (moyennement résistant et le
cotonnier (tolérant) en but d’évaluer les teneurs en saccharose et en amidon des
feuilles et des racines, en condition de salinité.
Des jeunes plants de pois chiches, Cicer arietinum, cultivés en présence de
NaCl , présentent de fortes quantités de saccharose et d’un sucre alcool, le pinitol.
3.2.4-Glycine bétaine
La betterave est à l’origine du nom
bétaine , car elle en contient des
quantités importantes. D’autres plantes cultivées accumulent aussi ces composés
lorsqu’elles sont soumises à un stress salin ; c’est le cas de l’épinard, du tournesol,
du blé et du maïs.
La glycine betaine est issue de deux oxydations successives de la choline.
La glycine bétaïne, un composé quaternaire d'ammonium est un osmolyte
stabilisant aidant à préserver des macromolécules de la déshydratation d’où son
nom d’osmoprotectant (Hare et al., 1998).
23
4-Effet de la salinité sur les métabolismes des végétaux
4.1- Effet du sel sur la nutrition minérale
La baisse de la productivité observée pour la plupart des plantes cultivées
sur des terrains riches en sels est souvent associée au déficit hydrique mais
également à une mauvaise nutrition minérale et carbonée.
Lors d’un stress salin, les plantes déclenchent un transport excessif de Na+
et Cl- des racines vers les feuilles qui s’accompagne également d’une réduction de
l’absorption et du transport de cations et d’anions comme les P042-, K+, Ca2+, Mg2+,
Mn2+, NO3- et S042-
(Termaat et Munns,1986 et Romero et al.,1994). Le Na+ peut
déplacer le Ca2+ lié à la surface externe de la membrane des cellules racinaires en
déstabilisant la membrane ; la perméabilité membranaire aux ions sodium
augmente (Cramer et al.,1985). Cependant, Zidan et al.,(1990) montrent qu’il n’y
a pas d’interaction entre Ca2+ et Na+ chez les cellules de racines de maïs. D’autre
part, en condition saline, l’addition de Ca2+ dans le milieu peut rétablir
l’absorption et le transport dans la plante du N03- (Aslam et al.,1984), du P042(Martinez et Lauchli,1991), augmenter la sélectivité K+/Na+ (Cramer et al., 1985;
Cramer et al.,1990) et réduire l’accumulation de Na+(Belkhodja et al.,1996).
4.2- Effet du NaCl sur la nutrition carbonée
Les effets du NaCl sur la nutrition carbonée et par conséquent la croissance
se fonts ressentir au niveau de ces deux étapes clés qui sont la production de
pouvoir réducteur et la synthèse de glucose.
Les effets du NaCl sur la phase claire de la photosynthèse peuvent être
indirects, c’est le cas de la déficience en certains éléments comme le Mn2+ ou le
Mg2+ indispensable à l’absorption de l’énergie lumineuse et au transfert d’électrons
de H20 vers le NADP+. Les effets peuvent être également directs. En agissant sur la
structure protéinique et phospholipidique des thylakoides, le Na+ peut perturber le
24
transfert des électrons au niveau du PS I et PS II (Wignarajah et Baker,1981; Smillie
et Nott,1982) et ceux-ci, au lieu d’être transférés au NADP+, vont se fixer alors sur
l’oxygène et former des radicaux toxiques (O2-) pour le chloroplaste et la cellule.
Chez certaines glycophytes tolérantes au NaCl, une accumulation de
chlorophylles et des protéines liées aux chlorophylles a été observée (Winicov et
Button,1991), ainsi qu’une augmentation de l’activité des complexes PS I et PS II
comme dans les feuilles de Beta vulgaris (Smillie et Nott,1982).
Les effets du NaCl sur la nutrition carbonée sont liés aussi à une réduction de
la capacité photosynthétique durant la phase obscure (Plaut et al.,1990). Certaines
études démontrent que le stress salin provoque une diminution de la conductance
stomatique (Seemann et Critchley,1985). Chez Prunus salicina, il a été montré que
la réduction de l’assimilation du C02 est corrélée non à la diminution de la
conductance stomatique mais à l’augmentation de la concentration en Cl- des
feuilles (Ziska et al.,1990). De même, chez l’épinard, glycophyte halotolérante, le
NaCl provoque une diminution de la conductance stomatique mais ne modifie pas
l’activité photosynthétique des chloroplastes (Robinson et al.,1983). La réduction
de l’activité photosynthétique ne serait pas liée à la disponibilité en C02 mais
plutôt à une inhibition des processus biochimiques impliqués dans la fixation du C02
(Seemann et Critchley,1985 et Plaut et al.,1989). Ainsi, une part de cette
inhibition revient à une diminution de la teneur en RuBisCo (ribulose-1-5 bi
phosphate carboxylase), et à une baisse de l’activité de cette enzyme lors du stress
salin (Miteva et al.,1992)
Sous les conditions de salinité croissante, les quantités d’oxygène échangées
durant la respiration et la photosynthèse sont significativement influencées chez
une légumineuse le Mung bean (Vigna radiata L. )(Mekhaldi et Belkhodja ;2006)
4.3-Effet du sel sur Le métabolisme azoté
Dans les zones arides et semi-arides, la contrainte saline s’associe souvent
au déficit hydrique pour limiter la production des espèces végétales. Chez les
légumineuses, cet effet est d’autant plus perceptible que la fixation symbiotique
de l’azote atmosphérique est très sensible à la contrainte saline (Lauter et al.,
1981). Le métabolisme azoté et la synthèse protéique sont sévèrement affectés par
le stress salin, il en résulte un développement anormal des plantes et une
25
diminution du rendement (Pessarakli et al., 1989). Ce stress provoque aussi la
diminution de l’activité de la nitrogénase (Delgado et al., 1993),
Dans la salinité des cultures, il a été rapporté une réduction de la
minéralisation de l’azote à travers l’activité biologique du sol et une inhibition du
transport des nitrate des racines vers les tiges (Van Hoorn et al., 2001).
5-Présentation de l’espèce
Parmi toutes les plantes utilisées par l'homme, les légumineuses sont
employées comme fourrage pour les bétails, et leur culture alternée avec des
céréales ou d'autres plantes améliorent la fertilité du sol. Elles contribuent à 70%
environ des besoins humains en protéine, dont les graines ( Fig.1)
apportent 19%
de cette quantité (Peoples et Herridge, 1990). Avec approximativement 750 genres
et presque 20000 espèces, les légumineuses sont la troisième famille la plus
nombreuse des plantes terrestres (Allen, 1981). Ces espèces se trouvent dans le
monde entier et la plus grande diversité se trouve dans les régions tropicales et
subtropicales. Considérant que les légumineuses sont des plantes herbacées,
communes dans les régions tempérées, la plupart d’entre elles sont des arbres et
des buissons dans les tropiques. Toutes les légumineuses portent des gousses, la
caractéristique par laquelle elles peuvent être plus facilement identifiées (NAS,
1979).
Selon Allen, 1981, les taxonomistes ont divisé traditionnellement la famille
de Légumineuses en trois sous-familles :
•
Caesalpinioideae contient approximativement 2500 - 2800 espèces,
qui sont principalement des arbres de Savannah et des forêts tropicaux de
l'Afrique, de l'Amérique du Sud et de Sud-est asiatique.
• Mimosoideae contient approximativement 3000 espèces, la plupart ce
sont de petits arbres et arbustes des régions tropicales et subtropicales de
l'Afrique, nord et Sud de l'Amérique, l'Asie et l'Australie.
• Papilionoideae contient 12000 à 13500 espèces, sont principalement
des herbes distribuées dans le monde entier (Doyle, 1994 et Sprent, 2001). La
formation des nodules est commune dans les Mimosoideae et les Papilionoideae
26
tandis que dans les Caesalpinioideae, seulement quelques espèces ou genres
peuvent les former (Sprent, 2001).
Fig.1- Echantillons de graines de la collection Phaseolus (Vanderboght et Baudoin,1998)
5.1. Description botanique :
Le haricot, ou haricot commun (Phaseolus vulgaris), est une espèce de plante
annuelle de la famille des Fabaceae (Papilionacées), du genre Phaseolus, couramment
cultivée comme légume. Le terme « haricot » désigne aussi ces parties consommées,
les graines (haricots secs) ou les gousses (Fig. 2).
Fig. 2- Gousses de haricot
Cette plante, originaire d'Amérique centrale et d'Amérique du Sud (Andes),
joue un
rôle important dans l'alimentation humaine comme source d'amidon
(féculent) et de protéines. Elle fait l'objet de culture vivrière dans certaines régions
d'Afrique et d'Amérique latine, tandis que dans les pays développés, à côté d'une
production limitée dans les jardins familiaux, s'est développée une culture en plein
champ produisant soit des haricots secs pour la conserverie, soit des haricots verts.
Ces derniers, dont la consommation s'est développée depuis le début du XXe siècle,
s'intègrent mieux dans la recherche d'une alimentation plus légère. Haricots secs
27
comme haricots verts peuvent soit être nains (et c'est la forme privilégiée en grande
culture), soit être à rames donc grimpants avec nécessité de tuteurs.
Fig. 3 : Morphologie de Phaseolus vulgaris L. montrant les feuilles,les fleurs
et les tiges
Le haricot est une plante herbacée, annuelle, qui peut prendre plusieurs
types de port selon les variétés. On distingue deux grands groupes, les haricots
grimpants (dits haricots à rames), au port volubile, qui sont proches du type
original, et les haricots nains à port érigé et plus ramifié. Le port de la plante est
principalement déterminé par son génome, mais les conditions écologiques aux
différents stades phénologiques peuvent l'influencer. Ainsi, une température
chaude (30 °C) au stade de la première feuille trifoliolée déclenche toujours le
port volubile. On peut également obtenir des plantes à port intermédiaire
(Bayuelo-Jimirez,et al.,2002).
Fig. 4 : Système racinaire de Phaseolus vulgaris L.
28
Le haricot a une racine principale non dominante qui est très rapidement
complétée de racines latérales. Les racines peuvent atteindre un mètre de
profondeur si le sol s'y prête (Fig.4).
Elles sont le siège du phénomène de « nodulation », les nodules étant des
excroissances provoquées par l'infestation par des bactéries du genre Rhizobium.
Ces bactéries vivent en symbiose avec la plante : elles reçoivent par la sève des
hydrates de carbone et lui fournissent de l'ammonium synthétisé à partir de l'azote
atmosphérique. Les principales espèces nodulant le haricot sont Rhizobium etli et
Rhizobium phaseoli. Les conditions optimales pour le développement des nodosités
sont une température de 25 à 30 °C et un pH de 6 à 7. La quantité d'azote fixée
peut atteindre 200 kg à l'hectare.
Les tiges grimpantes sont peu ramifiées et s'enroulent autour de leur
support dans le sens inverse des aiguilles d'une montre (tiges volubiles « sinistrorses
»). Elles peuvent atteindre deux à trois mètres de haut. Les types nains sont plus
ramifiés, prenant un port buissonnant ou dressé, de 40 à 60 cm de haut. Ils se
prêtent mieux à la mécanisation des cultures. La graine est de type sans albumen,
avec deux cotylédons qui dominent l’embryon situé dans la partie supérieure du
corps de la graine (Fig.5).
Fig.5 : Les différentes parties de la graine de Phaseolus vulgaris L.
Les feuilles adultes sont pétiolées, alternes et composées trifoliées, de
couleur verte ou pourpre. Les folioles ont une forme ovale-acuminée, presque
losangée et ont de 6 à 15 cm de long sur 3 à 11 cm de large (Fig.3). Les pétioles,
renflés à la base (pulvinus) sont munis de stipules, et de petites stipules ou
29
stipelles se trouvent à la base des pétiolules supportant les folioles. Les deux
feuilles primordiales qui apparaissent immédiatement au dessus des cotylédons
sont entières et opposées (Bray et Reid,2003).
5.1.1. Répartition :
La domestication du haricot commun serait intervenue dans deux centres
distincts, d'une part en Amérique centrale (variété vulgaris) et d'autre part en
Amérique du Sud dans la région andine (variété aborigineus). Les variétés mésoaméricaines se distinguent de celles des Andes, notamment par la taille des grains,
plus gros chez ces dernières. Sa première apparition dans des sites archéologiques
est datée de 7000 ans av. J.-C. au Pérou, de 4000 ans av. J.-C. au Tamaulipas
(nord-est du Mexique) et de 3000 ans av. J.-C. au Tehuacan (sud-est de Mexico). Le
centre mésoaméricain, zone où la quasi-totalité des espèces de haricots ont été
retrouvée à l'état sauvage, semble le centre principal de diffusion des haricots et le
centre où s'est formé le complexe haricot-maïs-courge (les "trois sœurs" des
peuples amérindiens), qui s'est ensuite diffusé vers le Nord.
La première introduction du haricot en Europe serait due à Christophe
Colomb qui le découvrit à Nuevitas (Cuba) lors de son premier voyage en octobre
1492 . Par la suite d'autres explorateurs le découvrirent en divers points d'Amérique
du Nord et du Sud. La diffusion de la plante en Europe se serait faite par le
Vatican. C'est Catherine de Médicis qui l'aurait introduite en France à l'occasion de
son mariage avec le roi Henri II en 1533. Dès le XVIe siècle, des navigateurs
portugais l'ont introduit en Afrique et en Asie.
Le haricot, facile à cultiver et produisant des graines de bonne taille et de
longue conservation, a connu rapidement un grand succès en Europe, où il s'est
diversifié en d'innombrables variétés locales, se substituant partiellement ou
totalement à d'autres légumineuses anciennes (pois chiches, lentilles, dolique
mongette). Il s'est également bien implanté en Afrique orientale, notamment dans
la région des Grands Lacs (Kenya, Ouganda, Tanzanie) où il retrouvait des
conditions écologiques proches de celles des montagnes andines. Cette région est
aussi devenue un centre de diversification et le haricot y est encore de nos jours un
aliment de base des populations rurales. La plante ne s'est par contre pas imposée
30
en Asie tropicale, face à des légumineuses mieux adaptées au climat telles le
haricot mungo et le lablab (appelé « pois antaque » à la Réunion).
C’est une plante tropicale, originaire de l’Inde, elle est répartie surtout en
Asie du Sud-est et de façon sporadique en Afrique. Elle est cultivée dans les zones
subtropicales ou tempérées. Sa présence est signalée aussi à des altitudes qui
peuvent atteindre (800 -2000 m).
Phaseolus vulgaris pousse mieux dans les sols bien drainés, sablo-limoneux,
limoneux ou argilo-limoneux, riche en matière organique à Ph neutre.
Cette plante étant assez résistante à la sécheresse, elle peut être cultivée
dans les zones semi-arides où il y a 600 à 1000mm de précipitation annuelle
(Kaymakanova et Stoeva, 2009).
Les températures mensuelles optimales préférées pour la croissance
de
Phaseolus vulgaris L. sont de l’ordre de 15 à 21°C. Les températures basses sont
nuisibles à la germination à la floraison et à la fructification.
5.1.2. - Importance économique
En 2006, la production mondiale de haricots, selon les statistiques publiées par
la FAO, s'est élevée à 28,6 millions de tonnes, dont 19,6 de haricots secs (68 %), 6,4
de haricots frais (22 %) et 2,6 de haricots verts (9 %) . En 2002, ces chiffres étaient
respectivement de 25,7, 18,3, 5,7 et 1,7 millions de tonnes. Entre 1961 et 2006, la
production totale de haricots a doublé passant de 14,4 à 28,6 millions de tonnes,
progressant assez régulièrement au taux de 1,5 % par an.
L’Haricot est une espèce est très appréciée des consommateurs dans le
monde entier. Cette plante peut s’utiliser en graines et en fourrages. Elle joue un
rôle important, non seulement dans l’alimentation humaine, mais aussi dans
l’amélioration de la fertilité du sol par sa contribution dans la fixation symbiotique
de l'azote atmosphérique (Ashraf et al., 2003).
Elle représente une source importante de protéines (24%), glucides (63 %),
lipides (1%) et fibres (16 %) (US Department of Agriculture, 2001). Les teneurs en
phosphore, calcium et fer sont de 381 à 528, de 128 à 143 et 5.14 à 5.76 mg.100 g–1
PS, respectivement (Amarteifio et Moholo, 1998). Cette espèce est une excellente
31
source d’amidon de haute qualité (Liu et Shen, 2007), de vitamines, de minéraux
et de protéines avec un profil en acides aminés indispensables comparable à celui
des graines de soja et d’haricot rouge (Mubarak, 2005). On y trouve surtout la
lysine (5.85 à 8.24 g. 100 g–1 protéine) et la méthionine (0.96 à 1.48 g. 100 g–1
protéine) (Adel et al., 1980 ; khader et Rao, 1996).
Il a été aussi rapporté que certaines protéines du Haricot
exercent une
activité antifungique et antibactérienne (Wang et al., 2004). Le haricot présente
aussi des effets hypoglycémiants et une haute activité antioxydante, due
principalement
à
son
contenu
polyphénolique
(Mohanty
et
al.,
2000).
L’identification et l’utilisation de plantes anti diabétiques qui contiennent des
substances phénoliques et des inhibiteurs de l’α-amylase sont donc d’une grande
importance (Alarcon-Aguilar et al., 2005). La recherche médicale confirme que le
stress oxydatif est à l’origine de la plupart des complications diabétiques (Mohanty
et al., 2000).
5.1.3-Principaux ennemis de la culture et méthodes de lutte :
Il y a toute une gamme d'ennemis de la culture: insectes (pucerons, mouche
blanche, mineuse, araignée) , nématodes, maladies (graisse, rouille, oïdium et
différentes pourritures) et virus. La meilleure lutte est la lutte intégrée, utilisant à
la fois des méthodes culturales (rotation, variétés tolérantes ou résistantes,
destruction des mauvaises herbes...) et biologiques (prédateurs d'insectes). Parfois
la lutte chimique s'impose; il est conseillé de se conformer aux doses prescrites par
le fournisseur afin d'éviter l'utilisation abusive des produits phytosanitaires et de
sauvegarder l'environnement.
32
CHAPITRE II – MATERIEL ET METHODES
A. MATERIEL VEGETAL
Les expérimentations sont menées sur des graines du haricot (Phaseolus
vulgaris L.), (variété fournie par le Laboratoire d’Ecophysiologie végétale d’Es-Senia
Oran). Les graines d’une taille moyenne (Photo1) ont séjourné dans un réfrigérateur à
7°C pendant longtemps en prévision de la levée de dormance. Ce travail a été réalisé
dans le Laboratoire de Botanique à l’Université de Mostaganem dont les conditions de
culture sont gardées semi-contrôlées.
Photo 1 : Graines de Phaseolus vulgaris L.
B. METHODES
1. Dispositif expérimental
1.1– Préparation de la culture des plantes
La culture est réalisée dans des pots en plastique d’une capacité de 2 kg,
d'un diamètre de 15 cm et d'une hauteur de 20 cm (Photo2), dont le fond est
tapissé avec du gravier afin d’assurer un bon drainage. Le sable utilisé constitue un
support inerte et évite à la plante la fixation des ions (Demelon, 1968).
Photo2- Pot en plastique contenant des plantules de Phaseolus vulgaris L.
33
Le sable prélevé au bord de la mer a subi plusieurs opérations successives
avant l’empotage:
•
Un tamisage approprié afin de supprimer les différents débris et
déchets dans le but d’obtenir un sable fin;
•
Des lavages successifs à l’eau ordinaire puis à l’esprit de sel pour
éliminer les carbonates, les chlorures, etc.…
•
Des rinçages répétés à l’eau distillée sont appliqués
afin d’essayer
d’éliminer toute trace de chlore ; enfin, le sable est séché à l’air libre.
Un test au nitrate d’argent a été utilisé pour vérifier la pureté du
substrat concluant la limpidité de la solution ;
•
À la fin de ces préparations, le sable est mélangé à la tourbe (2V/V) et
mis dans les différents pots. Ce poids est nécessaire car il permet de
calculer la capacité de rétention et donc de prévoir la dose d’arrosage
à employer durant la culture des plantes.
Des pots en plastique sont remplis par du sable mélangé au terreau (2V :1V).
Cette proportion est retenue pour déterminer la capacité de rétention de ce
substrat. Cette caractéristique hydrique est nécessaire car elle permet le calcul
des quantités de solution nutritive à apporter lors des arrosages et en fonction de
la nature du substrat, de son poids dans le pot et de l'âge de la plante.
Les graines de Phaseolus vulgaris L. ont subi un premier bain dans une
solution d’hypochlorite de sodium à 8% pendant trois minutes afin de les désinfecter
et éliminer les impuretés. Elles sont ensuite rincées plusieurs fois à l’eau distillée
pour éliminer toutes traces de chlore. Les graines, une fois séchées en conditions
ambiantes, sont déposées en boîte de Pétri pour la germination. Dès les premières
germinations, les plantules sont soigneusement repiquées dans des pots remplis
d’un mélange de sable et de tourbe pour leur élevage en attendant l’application de
la solution saline. Dans un premier temps, un arrosage est apporté aux plantules
tous les deux jours à la solution nutritive de Hoagland (1938), diluée à 1/1000
(tableau 1) à 30% de la capacité de rétention jusqu'à l'application de la solution
saline (tableau 2).
34
Tableau 1 : Composition de la solution nutritive de Hoagland (1938)
Composants
Nitrate de potassium (KNO3)
Nítrate de calcium (NO3)2Ca 4H2O)
Nitrate d'ammonium (NO3NH4)
Sulfate de magnesium (SO4Mg 7H2O)
Phosphate mono potassique (PO4H2K)
Di-potassium hydrogénophosphate(PO4K2H 3H2O)
Chlorure de manganèse (Cl2Mn 4H2O)
Sulfate de cuivre (CuSO4 5H2O)
Sulfate de zinc (ZnSO4 7H2O)
Acide borique (H3BO3)
Molybdate d'ammonium (MO7O24(NH4) 7H2O)
Complexe ferrique EDTA (C10H12FeN2NaO8)
Poids (g.l-1)
191.90
129.80
210.00
61.50
54.40
34.23
1.00
0.17
0.22
2.86
0.28
0.05
Les solutions salines sont obtenues par l’addition de NaCl (Chlorure de sodium)
et de CaCl2 (Chlorure de calcium) à la solution nutritive, dont les proportions sont
indiquées au tableau 2.
Tableau 2 - Composition de la solution saline
NaCl g.l-1
CaCl2 g.l-1
50meq.l–1
2.92
3.67
100meq.l–1
5,85
7,35
150meq.l–1
8.77
11.02
200meq.l–1
11,7
14,7
Le dispositif expérimental repose sur l’application de la solution saline à
quatre concentrations 50,100,150 et 200 meq.l–1 de NaCl + CaCl2. Les plantes
témoins sont arrosées à la solution nutritive de Hoagland. Pour chaque traitement,
un effectif de 5 plantes est suivi.
Les prélèvements des échantillons en vue des dosages sont effectués après
une semaine de l’application du stress.
35
1.2. -Germination
Les graines sont mises à germer dans des boîtes de Pétri en verre d’un
diamètre de 19cm. Les boîtes sont garnies de 4 -5 rondelles de papier-filtre
humidifié de 20 ml d’eau distillée (Fig.6).
Fig. 6- Germination des graines de Phaseolus vulgaris L.
dans des boîtes de Pétri (phase semis)
Une dizaine de graines au maximum sont déposées sur les filtres, espacées
de manière à éviter un chevauchement des racines pouvant aboutir à une cassure
au moment du repiquage. Les boîtes étiquetées, sont ensuite placées à la lumière à
une température ambiante de 20C° environ. Nous avons considéré une graine
germée lorsque l’émergence et la croissance de la radicule se manifestent
(DUSSERT et al., 2002).
1.3- Repiquage
Le repiquage a eu lieu après une semaine de germination. Les plantules sont
transférées soigneusement à raison de 4 plantules par pot, puis déposées en salle
de culture à la température ambiante et à la lumière du jour (photo 3).
36
Photo 3 : Plantules en pot, cultivées en salle de culture à la température
ambiante et à la lumière du jour
2. TECHNIQUES
2.1. Extraction et dosage des chlorophylles
L’extraction des pigments a été réalisée sur des feuilles fraiches dans
l’acétone (80%). Les teneurs en chlorophylles a, b et totale ont été déterminées
d’après la technique de Metzner et al. (1965) modifiée par Inskeep et Bloom
(1985).
Photo4 - centrifugeuse
L'extrait a été analysé par spectrophotométrie d’absorption moléculaire à
647 et 664 nm (Photo5).
37
Photo5 -Spectrophotomètre moléculaire
Les concentrations en Chlorophylle a, chlorophylle b, et chlorophylle totale
(Chl a, Chl b, Chl t) ont été calculées en utilisant les équations suivantes:
Chl a = 12.70 A664 – 2.79 A647
Chl b = 20.70 A647 – 4.62 A664
Chl t = 17.90 A647 + 8.08 A664
A = absorption dans une cuvette de 1cm
2.2. Extraction et dosage de la proline
Le dosage de la proline est effectué sur les tiges, les feuilles et les racines,
séparément. Les racines sont rincées à l'eau de robinet puis séchées rapidement à
l'aide du papier filtre. La partie aérienne est isolée de la partie souterraine, puis
les poids frais des racines, des tiges et des feuilles sont aussitôt mesurés à l’aide
d'une balance de précision.
Chaque échantillon pesé est enveloppé dans du papier aluminium puis le tout
déposé dans une étuve réglée à 80°C durant 48 h. Ensuite les échantillons sont
pesés de nouveau pour calculer le poids sec.
Chaque échantillon est remis dans un pilulier et fermé hermétiquement à
l’aide d’un bouchon plasma et déposé dans un congélateur en attendant les
analyses.
•
Extraction
Le matériel végétal (100 mg), constitué des racines, des tiges ou des feuilles,
est broyé dans 2 ml de méthanol (40%) (Photo 6) et chauffé au bain marie à 85°C
38
pendant 60mn. Les tubes sont ensuite recouverts de papier aluminium pour éviter
l’évaporation du méthanol.
a-Broyage des feuilles
b-Tubes contenant les extraits
Photo 6 –Technique d’extraction
•
Dosage
La proline est dosée par la méthode (Dreier et Goring, 1978). L'extrait de
plante (1 ml) est versé dans un tube à essai auquel on ajoute 2 ml d'acide acétique
et 25 mg de ninhydrine plus 1 ml du mélange (100 ml d'eau distillée + 300 ml
d'acide acétique + 80 ml d'acide orthophosphorique).
La solution est portée à ébullition pendant 30 mn jusqu'à l'apparition de la
couleur rouge ; le tout est laissé à refroidir puis 5 ml de toluène sont ajoutés.
Après agitation, les deux phases se séparent: la phase supérieure contient la
proline et la phase inférieure, les acides gras et les glucides. La phase supérieure
est récupérée et déshydratée par l'ajout de Na2SO4 anhydre. Enfin, la densité
optique des échantillons est lue au moyen d'un spectrophotomètre à la longueur
d'onde 528nm (Photo 5). Une courbe d’étalonnage est préparée dans les mêmes
conditions, en remplaçant l’extrait par des quantités équivalentes en proline à
concentrations croissantes.
2.3. Détermination de l’activité du nitrate réductase (ANR)
La mesure de l'activité de nitrate réductase (ANR) in situ, mise au point par
Robin et al. (1983) et améliorée par Obaton (1993), consiste à doser le nitrite
produit par réduction du NO–3 dans un échantillon intact de végétal. La partie
végétale excisée au niveau du collet ou la plante entière après pesée est introduite
dans un tube de 13 ml (Venoject Térumo) contenant 1 ml de KNO3 dans le cas
39
d'organes excisés ou dans un pilulier de 25 ml dans le cas de plantes entières. Le
tube est fermé hermétiquement avec un bouchon en caoutchouc traversé par deux
aiguilles de seringues creuses. L'anoxie est réalisée en injectant par une des
aiguilles de l'azote gazeux sous pression (1.5 à 2 bars) réglée à l'aide d'un
manomètre à la sortie de bouteille, la deuxième aiguille permet la sortie de l'air.
Le balayage d'azote est interrompu après une minute par retrait simultané des
deux aiguilles. Après l'incubation dans l'azote gazeux et à l'obscurité pendant 20
minutes, l'extraction du nitrite est réalisée par addition de 5 ml d'eau
déminéralisée bouillante et passage au bain-marie à 100° C pendant 10 minutes
dans le cas des parties excisées. Dans le cas des plantules entières, après rupture
du vide, on fait rapidement une excision au niveau du collet; la partie aérienne est
mise dans un tube avec 4 ml d'eau bouillant, et les racines sont gardées dans le
tube avec 1 ml d'eau bouillante pour éviter une trop forte dilution.
Le nitrate produit est alors révélé en ajoutant 2 ml de sulfanilamide (10g.l–1
dans HCl 1.5N) et 2 ml de N-Naphtyl – Ethylène Diamine Dichlorure (0.2g.l–1). Après
20 minutes de réaction, la lecture de l'absorbance est effectuée à 540 nm. Un
blanc constitué par un échantillon laissé à l'air et à la lumière est traité de la
même façon. Il permet de soustraire l'absorbance due aux pigments des tissus. La
quantité de nitrite formé est exprimée en micromoles par gramme de matière
fraîche (µM-1.g-1. PF).
2.4. Etude anatomique des tiges et des racines
Après chaque traitement, les plantules sont déterrées et débarrassées du
substrat après un rinçage à l’eau distillée. Les organes (tiges et racines) sont
soigneusement séparés au moyen d’une lame de rasoir puis sectionnés en pièces de
1 à 2 cm de long. Seuls les échantillons des
parties médianes sont pris en
considération.
Les coupes transversales sont effectuées à « mains levée » sur des tiges et
des racines au moyen d’une lame de rasoir. Des coupes fines d’une épaisseur
moyennant les 20 µm d’épaisseur sont colorées par la technique de double
coloration (vert de méthyle/rouge Congo). Les coupes sont d’abord traitées à
40
l’hypochlorite de sodium à 8% pendant 15 mn. Après un rinçage soigneux à l’eau
distillée, elles sont mordancées par l’acide acétique à 70% dilué, pendant 2 mn,
puis colorées au vert de méthyle à 1% pendant 5 mn ; ce dernier colore en vert les
parois lignifiées. Les pièces sont ensuite lavées à l’eau distillée et colorées au
rouge Congo à 2% pendant 15 mn. Ce colorant met en évidence la cellulose qui
apparaît en rose ou en rouge (Photo7).
Photo 7-Technique de la double coloration
Les coupes sont ensuite lavées à l’eau distillée et montées dans une goutte
d’eau entre lame et lamelle avant d’être observées d’abord au microscope
ordinaire, ensuite au microscope menu d’un dispositif permettant la prise de
photos.
Photo 8- Microscope photo ZEISS
Les coupes sont conservées soit dans des piluliers contenant de l’eau
distillée soit dans une goutte de baume de Canada placée entre lame et lamelle.
Une fois les coupes colorées, elles sont observées par un microscope de type ZEISS
surmonté d’un phototube ayant servi pour la prise des micrographies (Photo 8).
41
CHAPITRE III : RESULTATS OBTENUS
A-VARIATIONS DES TENEURS EN CHLOROPHYLLES
1. Teneur en chlorophylle a
Les résultats obtenus sur le dosage de la variation de la teneur en
chlorophylle montrent que ce pigment diminue fortement (en moyenne 74 %) par
rapport au témoin pour la Chl a (Tab. 3) et relativement moins (en moyenne 56 %)
pour la Chl b en fonction de l’augmentation de la salinité dans le milieu chez les
deux stades de croissance 30 et 60 jours.
Tableau 3- Teneurs en chlorophylle (mg. g-1 PF) de Phaseolus vulgaris L. à différentes
concentrations de NaCl+CaCl2 (meq.l-1) à 30 jours de croissance.
Chl totale
Témoin
3.16±0.02*
50meq
100 meq
1.66±0.02* 1.51±0.04*
150 meq
1.40±0.01*
200 meq
1.29±0.03*
Chla
4.36±0.01*
2.01±0.04* 1.89±0.02*
1.36±0.04*
1.16±0.04*
Chlb
3.72±0.01*
2.26±0.01* 1.99±0.03*
1.87±0.01*
1.67±0.08*
Ratio a/b
1.17±0.01
0.88±0.02
0.72±0.03
1.26±0.05
0.94±0.02
ppds = 0,002 à P = 5% (ddl résiduelle = 32)
Le tableau 3 montre que la teneur en chlorophylle a baisse remarquablement
sous la contrainte saline. Cette dernière s’accumule davantage lorsque les plantes
sont arrosées à la solution nutritive. En effet, sa teneur passe significativement de
4,36mg.g-1PF dans les feuilles des plantes témoins à 2.01mg.g-1de PFet 1,16 mg.g-1PF
respectivement dans les feuilles des plantes nourries à 50 et à 200 meq.l-1 de
NaCl+CaCl2 (fig.7).
Les résultats montrent aussi que les plantes stressées à 200 meq.l-1 de
NaCl+CaCl2, comparés aux témoins, réduisent les pigments assimilateurs de leurs
feuilles à des teneurs allant jusqu’à 25%.
42
Fig.7- Teneurs en chlorophylle des plantes de Phaseolus vulgaris L. témoins et traitées par
NaCl+CaCl2, au cours stade 30 jours de croissance
Dans ces conditions, l’analyse statistique révèle chez les plantes stressées à
100 , 150 et 200 meq.l-1 un résultat moins significatif par rapport aux feuilles
témoins (4.36mg.g-1 de PF pour 1.89 ; 1.36 et 1.16 mg.g-1 de PF); de même pour
les valeurs des ratios restent significativement basses (1.17mg-1 de PF pour les
témoins contre 1,26 mg-1 de PF pour les plantes traitées à 200 meq.l-1 (Fig.7).
2. Teneur en chlorophylle b
Pour ce qui est de la chlorophylle b, l’analyse statistique révèle
des valeurs
significativement inférieures enregistrées chez les feuilles témoins les racines comparées
aux feuilles stressées (Fig.7).
Le tableau 3 illustre que la teneur en chlorophylle b baisse significativement
sous la contrainte saline. Ce pigment se concentre davantage lorsque les plantes
sont arrosées à la solution nutritive. La teneur en chlorophylle b passe d’une
teneur de 3,72 mg-1PF dans les feuilles des plantes témoins à 2.26 mg-1 de PF et
1,67 mg.g-1PF respectivement dans les feuilles des plantes nourries à 50 et à 200
meq.l-1 de NaCl+CaCl2 (Tableau3).
43
Tableau 4- Teneurs en chlorophylle (mg. g-1 PF) de Phaseolus vulgaris L. à différentes
concentrations de NaCl+CaCl2 (meq.l-1) à 60 jours .
Chl totale
Témoin
2.11±0.02*
50meq
100 meq
1.30±0.01* 1.27±0.02*
150 meq
1.16±0.01*
200 meq
1.08±0.04*
Chla
3.17±0.04*
1.91±0.02* 1.56±0.01*
1.41±0.02*
1.29±0.02*
Chlb
2.09±0.01*
2.01±0.04* 1.70±0.02*
1.42±0.02*
1.34±0.03*
Ratio a/b
1.51±0.03
0.95±0.02 0.91±0.01
0.99±0.01
0.96±0.02
ppds = 0,002 à P = 5% (ddl résiduelle = 32)
Pour les deux types de chlorophylle, l’effet des différents traitements (100,
–1
150 et 200 meq.l ) sur les teneurs en chlorophylle ne semble pas très différents
comme le montre la figure 7 et 8, quelque soit le stade de développement 30 ou 60
jours.
Chez les plantes âgées de 60 jours, les résultats montrent que la
chlorophylle a a baissé significativement chez les feuilles traitées par rapport aux
témoins. Les teneurs diminuent en moyenne de 50% à 100 et 150meq et de 60% à
200 meq.l-1 de NaCl+CaCl2. Par contre, la chlorophylle b diminue respectivement
que de 4%,9% et de36% pour le même traitement
que chez la chlorophylle a
(Tableau8).
Fig.8- Teneurs en chlorophylle des plantes de Phaseolus vulgaris L. témoins et traitées par
NaCl+CaCl2, au cours stade 60 jours de croissance
44
L’analyse statistique (tableau 3 et 4, montre un effet significatif des deux
types de chlorophylle a et b pour tous les différents traitements par rapport aux
feuilles témoins et aux deux stades de croissance (30 et 60 jours).
3. Teneur en chlorophylle totale
La chlorophylle totale (Fig.7 et 8), présente une allure similaire à celle de la
chlorophylle a.
A travers ces résultats nous pouvons retenir que la salinité est le principal
facteur qui perturbe la teneur en chlorophylle de la plante durant toute la période
de sa croissance.
Le traitement à 200 meq.l-1de NaCl+CaCl2 crée un appauvrissement important
de teneur en chlorophylle totale où la teneur en ce pigment passe de 3,16 chez les
plantes témoins à 1,29 mg.g-1 PF chez les plantes recevant 200 meq.l-1de NaCl+
CaCl2 (tableau 3 et 4).
Pour les plantes nourries à 50, 100,150 et 200 meq.l-1de NaCl+ CaCl2, les
teneurs de la chlorophylle restent à des valeurs très rapprochées comparativement
aux témoins (tableau 3 et 4). Le ratio chez les plantes traitées diminue lentement
à 50 ,100 et 150. En revanche, pour les feuilles témoins et stressées à 200 meq.l1
de NaCl+ CaCl2 la valeur affichée est analogues (Tab.3 et4 ).
L’analyse statistique montre un effet significatif sur la teneur en
Chlorophylle totale sous le traitement à 200 meq.l-1 de NaCl+ CaCl2.
Pour expliquer la cette diminution du pigment Chla / Chlb a été analysé en
fonction de chaque traitement. Ce rapport a chuté en présence de sel mais à 200
meq.l-1de NaCl+ CaCl2 le rapport est le même que pour les témoins.
La figure 7 et 8 montre que les plantes stressées durant une semaine pour
les deux stades de croissance 30 jours, la valeur obtenue avoisine celle des plantes
âgées de 60 jours.
Comparativement aux autres métabolismes, la teneur en chlorophylle
semble elle aussi perturbé en fonction de la salinité du milieu et par le stade de
croissance mais à des degrés moins. Après deux mois de croissance, la chlorophylle
dans les feuilles des plantes stressées est sérieusement affectée par l’action du sel.
45
46
4. Discussion
Cependant, les résultats ont montré que l’effet de la salinité entraîne une
diminution de la teneur en chlorophylle a et b chez les plantes traitées par rapport
au témoin. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Younis et al.
(2003) sur Vigna sinensis et le Zea mays. Strogonov (1962) a proposé que la
réduction des teneurs en pigments en réponse au stress salin est due probablement
à l'effet inhibiteur des ions accumulés sur la biosynthèse des différentes fractions
de pigments. Par ailleurs, il a été rapporté que la salinité diminue la teneur en
pigments photosynthétiques chez plusieurs plantes (Sultana et al., 1999 et
Mekhaldi,2007).
Downton et al., 1985, ont obtenu des résultats analogues en étudiant
certaines cultures telles que l’épinard. Ils ont démontrés que la capacité
photosynthétique est maintenue quand ce dernier est stressé à 200 mM de NaCl,
alors que la conductance stomatique et la chlorophylle sont diminuées. Par contre,
Tourneux et Peltier (1995) n'ont pas noté de changements significatifs dans la
chlorophylle chez les épinards (Spinacia oleracea L.) exposées au stress salin
pendant 20 jours. Ceci permet de dire que la diminution des teneurs en
chlorophylle de cultures soumises au stress salin est un phénomène souvent discuté
du fait de ses effets inverses sur la stabilité de la membrane cellulaire (Ashraf et
Bhatti, 2000).
Cependant, il faut noter que la plante selon qu’elle soit stressée par
seulement le NaCl ou à l’aide d’une combinaison de NaCl + CaCl2, réagit
différemment. C’est pourquoi, les résultats de ces caractéristiques telles que la
teneur en chlorophylle ou même d’autres paramètres paraissent contradictoires. En
effet, le CaCl2 associé au NaCl, présente un caractère d’atténuation de l’effet de
la salinité sur l’activité photosynthétique. Un autre facteur de variabilité dans les
résultats réside dans le fait que la fluorescence de la chlorophylle, par exemple,
est souvent mesurée sur des feuilles détachées, des disques foliaires, des cultures
cellulaires, ou des chloroplastes isolés mais rarement sur des feuilles intactes sous
les conditions réelles du champ. Cet aspect est étudié pour la chlorophylle a chez
l'orge (Hordum vulgare L., Larcher et al., 1990; chez le sorgho (Sharma et Hall 1991,
1992) ; chez l’Atriplex, Belkhodja et al.,1994), chez le Mung bean (Mekhaldi,2007).
47
B- VARIATIONS DE LA PROLINE ENDOGENE
Les résultats obtenus sur la variation de la teneur en proline dans les
différents organes (feuilles et racines), montrent que les plantules de Phaseolus
vulgaris L. soumises au stress de la salinité présentent une capacité de synthèse
de la proline. Cette synthèse varie en fonction de la concentration en sels et le
stade de développement.
1- Dans les racines
Les variations de la teneur en proline évoluent dans des proportions plus
faibles. De même, l’accumulation de cet acide aminé diminue au fur et à mesure
avec l’âge de la plante (Tab.5). Dans les racines (fig.9), on remarque des teneurs
faibles en proline (0,23 µM.100mg–1 PS) chez le témoin au stade de 30jours. Pour le
stade (60jours), la proline diminue lentement dans les racines des plantes cultivées
sans sels (0,18 µM.100mg–1 PS) (fig.9). Lorsque les plantes reçoivent la solution
saline, la proline s’accumule sensiblement dans les racines au stade de 30 jours par
rapport au témoin (0,68 µM.100mg–1 PS à 200 meq.l–1 contre 0,23 µM.100mg–1 PS pour
le témoin) (Tableau 5).
Tableau 5 -Test statistique de signification de Fisher des teneurs en proline endogène dans
les racines de Phaseolus vulgaris L. Stressées aux NaCl + CaCl2 au cours du
développement des plantes.
Stade de
développement
(jours)
–1
Témoin 50 meq.l 100 meq.l–1
150 meq.l–1
200 meq.l–1
0.68±0.03*
30
0.23±0.01*
0.32±0.04 *
0.43±0.01*
0.51±0.04 *
60
0.18±0.02*
0.29±0.01*
0.31±0.05*
0.43±0.02 *
0.47±0.04*
ppds = 0,003 à P = 5% (ddl résiduelle = 32)
Cette accumulation régresse progressivement au cours du temps avec
l’augmentation de la salinité. Les données de l’analyse statistique montrent que
l’effet de la salinité est significatif pour les deux stades de développement
(tableau 5).
47
Fig.9 –Teneurs de la proline endogène (µM.100mg-1) dans les racines de
Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl +CaCl2
La figure 9 montre que la proline est produite en quantité très faible dans
les racines chez témoins en absence de sels et qu’elle augmente au fur et à mesure
que la salinité augmente. Ceci montre que la plante accumule de plus en plus de la
proline sous l’effet de la contrainte saline (50, 100,150 et 200 meq.l–1de NaCl
+CaCl2 .
Néanmoins, cette accumulation en proline semble diminuer légèrement
avec l’âge de la plante. En effet, nous observons que la proline est beaucoup moins
présente dans les racines traitées à 200 meq.l–1de NaCl +CaCl2
au cours du stade
60 jours de croissance.
Par exemple, au stade juvénile (30jours), la teneur en proline est de 0,23
µM.100mg–1 PS pour les racines témoins contre 0,32 , 0,43, 0.51 et 0.68 µM.100 mg–1
PS pour les plantes traitées à 50 ,100, 150 et 200 meq.l–1de NaCl+CaCl2
respectivement (tableau 5).
Cette diminution progressive de l’acide aminé dans le temps et en fonction
de la concentration en sel est appuyée par une analyse statistique (tableau 5).
Cette dernière montre que les traitements à la salinité sont hautement significatifs
sur la teneur en proline.
2- Dans les feuilles
Pour les plantes témoins (fig.10, tableau 6), la proline s’accumule
rapidement dans les feuilles. Cette augmentation évolue significativement et
progressivement dans les mêmes organes sous les traitements 50, 100, 150 et 200
48
meq.l–1. Les teneurs en proline dans les parties aériennes sont significativement
supérieures à celles des racines.
Tableau 6-Test statistique de signification de Fisher des teneurs en proline endogène dans
les feuilles après 30 et 60 jours de croissance.
Stade de
développement
(jours)
Témoin 50 meq.l–1 100 meq.l–1
150 meq.l–1
200 meq.l–1
0.92±0.03*
30
0.43±0.07* 0.52±0.04 *
0.72±0.01*
0.84±0.04 *
60
0.31±0.03* 0.42±0.05*
0.56±0.04*
0.68±0.03 *
0.71±0.08*
ppds = 0,003 à P = 5% (ddl résiduelle = 32)
Les feuilles atteignent une teneur en proline de 0,43 µM.100 mg–1 PS au stade 30
jours contre 0.31 µM.100 mg–1 PS au stade 60 jours chez les témoins (fig.10,
tableau 6). L’apport de sels augmente légèrement la teneur en proline dans les
feuilles des plantes traitées à 100 meq.l–1 pour le stade de 30 jours, alors que pour
les traitées à 200 meq.l–1 la proline double sa teneur pour atteindre une valeur de
0.92 µM. 100mg–1 PS comparativement au plantes témoins.
Fig. 10 –Teneurs de la proline endogène (µM.100mg-1) dans les feuilles de
Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl +CaCl2
Au contraire, une diminution de la proline est observée dans les feuilles au
stade 60 jours
chez les témoins et même chez les traitées à différentes
concentrations de sel (tableau 6). A ce stade les teneurs en proline progressent
49
légèrement pour doubler à 200 meq.l–1 (0.31 µM.100 mg–1 PS pour les témoins
contre 0.71 µM. 100mg–1 PS pour les traitées à 200 meq.l–1 (Fig.10).
Enfin il faut noter que dans les parties aériennes (feuilles), la proline
s’accumule progressivement et parallèlement en présence de sels (tableau 6).
Aussi bien chez les témoins que pour les plantes traitées aux stades 30 et 60
jours, les parties aériennes sont plus enrichies en proline que les racines (Fig.10,
tableau 6).
3- Discussion
La variation de la teneur
en proline
dans les organes végétales a été
démontré chez de nombreuses espèces et dans différentes situations de stress
(osmotiques, hydriques, thermiques) ( Hubac et Viera Da Silva, 1980 ; Bellinger et
al., 1989). Certains auteurs (Singh et al., 1973) pensent que les quantités
accumulées pourraient être liées au niveau de la tolérance aux stress. Par contre,
d’autres pensent que l'augmentation de la concentration de cet acide aminé sous
stress est un produit et non une réponse adaptative au stress ( Ashraf et Harris,
2004; Ashraf et Foolad, 2007). La proline accumulée pourrait jouer un rôle
d’osmoticum pour contrer l’excès de sel dans la plante (Stewart et Lee, 1974). La
proline pourrait, également, intervenir dans la régulation du pH cytoplasmique ou
constituer une réserve d’azote utilisée par la plante postérieurement à la période
du stress (Tal et Rosenthal, 1979).
Parallèlement à cette augmentation de la teneur en proline foliaire sous
l’effet du stress, une baisse dans les teneurs en pigments chlorophylliens totaux
(Chlorophylles a et b) a été, en revanche, enregistrée ( Mekhaldi,2007).
Il existe une certaine proportionnalité inverse, entre les teneurs en proline
accumulées et la baisse des teneurs en pigments chlorophylliens chez le riz. La
variété qui accumule plus de proline est aussi celle qui connaît la plus forte
diminution de ses teneurs en pigments chlorophylliens et inversement. Ces
résultats suggèrent l’existence d’une relation vraisemblable entre les voies de
biosynthèse des pigments chlorophylliens et de la proline. Une compétition entre
50
ces deux composés vis-à-vis de leur précurseur commun, le glutamate, peut être à
l’origine de cette évolution (Reddy et al., 2004).
En effet, dans les milieux salés, les plantes ajustent osmotiquement
(Goldhirs et al., 1990) leur contenu cellulaire en synthétisant des acides aminés
comme la proline (Ashraf et McNeilly, 2004). L’accumulation de la proline est une
des stratégies adaptatives déclenchées par la plante face aux contraintes de
l’environnement. Chez les halophytes, la proline est un marqueur intéressant pour
évaluer leur résistance au stress salin (Heyser et al., 1989). Ces plantes possèdent
en effet des capacités pour maintenir un potentiel hydrique interne bas sous la
contrainte saline du milieu (Pujol et al., 2001) créant une pression de turgescence
suffisante (Rontein et al., 2002) pour leur croissance sans affecter leur
métabolisme (Quian et al., 2001).
De nombreux travaux rapportent que la proline s’accumule dans la plante
lorsqu’elle se trouve en conditions défavorables (Sivaramakrishnan et al., 1988) ce
qui traduit le caractère de la résistance aux stress (Greenway et Munns, 1980).
Chez les plantes sensibles, la présence de cet acide aminé est par contre amoindrie
(Chen et al., 1995). Selon Meloni et al. (2004), le rôle attribué à la proline dans la
réponse des plantes aux stress reste parfois controversé. Pour Quien et al. (2001),
son accumulation contribue à l’acquisition de cette résistance grâce au maintien de
la turgescence cellulaire chez de nombreuses espèces, créée par l’ajustement
osmotique dont la proline est responsable. Le mécanisme de l’accumulation de la
proline permet de penser à la présence de sites de résistance de la plante à la
contrainte. En effet, le transport de la proline de la source (lieu de synthèse) au
site de la résistance est admis depuis longtemps comme un paramètre important
dans l’acquisition de cette résistance (Bellinger et al., 1991). Mekhaldi (2007)
signale que la proline serait synthétisée dans les feuilles et transportée vers ces
sites, tandis que d’autres rapportent que l’acide aminé migre chez diverses plantes
glycophytes vers les feuilles et s’y localise chez le sorgho (Weimberg, 1987), le
coton (Boutelier, 1986), le trèfle d’Alexandrie (Benkhaled et al., 2003), l’Atriplex
halimus L. (Belkhodja et Bidai, 2004).
Cette compartimentation foliaire du composé aminé présume que la
résistance de cette halophyte à ces niveaux de salinité de l’eau de mer est acquise
51
dans ces organes. Ces résultats sont en accord avec de nombreux travaux sur
d’autres halophytes vivants dans des milieux salins (Cress et Johnson, 1987; Rhodes
et Hanson, 1993). En revanche, pour d’autres espèces, la proline se localiserait
dans les racines chez le Retam (Ighil Hariz, 1990) ; le mais (Rodriguez et al.,
1997 ;et l’Atriplex (Achour,2005).
Des résultats obtenus sur Atriplex halimus L. montrent aussi que
l’accumulation de la proline libre est ralentie fortement dans les tiges et les
racines des plantes nourries à l’eau de mer non diluée additionnée de proline
exogène à 50mM alors que le phénomène inverse se produit sous le même milieu
salin enrichi à 25mM de proline exogène (Bidai,2001). Le ralentissement de
l’accumulation de la proline libre dans ces organes présume une inhibition de son
précurseur (Rhodes et Handa, 1989 ;Mekhaldi,2007) ou une rapide activité de la
proline déshydrogénase, impliquée dans la dégradation de l’acide aminé (Peng et
Verma, 1996) vraisemblablement liée à l’apport de la proline à ce seuil de
concentration (50mM) créant un effet antagoniste à la salinité comme le suggèrent
Heyser et al. (1989a).
52
C- ACTIVITE DE LA NITRATE REDUCTASE
1- Plantes âgées de 30jours
Les résultats obtenus et illustrés dans le tableau 7 montrent que l’activité du
nitrate réductase est beaucoup plus élevée dans les parties aériennes que dans les
racines et ceci après 30 jours de croissance. Dans les deux cas, cette activité est
fortement inhibée par la présence de sels dans le milieu.
Cette régression dans la teneur du nitrate réductase semble plus importante
dans les racines comparativement aux parties aériennes (Tableau 7).
Tableau 7 -Test statistique de signification de Fisher mesurant l’activité du nitrate
réductase mesurée sur des plantules âgées de 30 jours de Phaseolus vulgaris
L. stressées aux NaCl + CaCl2
Témoin
50meq.l-1
100meq.l-1
150 meq.l-1
200 meq.l-1
Parties aériennes
14,23±0,31*
6,31±0,18*
3,36±0,23*
2,16±0,16*
1,02±0,02*
Racines
4,18±0,23*
3,60±0,02*
1,13±0,15*
1,02±0,03*
0,16±0,51*
Pour la Partie aérienne, l’activité du nitrate réductase chute nettement pour
passer de 14,23 µM NO2.h-1. g-1 PF chez les plantules témoins à 1,02 µM NO2.h-1.g-1
PF chez les traitées à 200 meq.l–1 de NaCl +CaCl2 ; soit un taux de réduction de
85,84 %.
Pour les plantes stressées seulement à 50 meq.l–1 de NaCl +CaCl2 , l’activité
du nitrate réductase dans les feuilles baisse de moitié, comparées à celles des
plantes témoins (Fig.11).
Les données de l’analyse statistique montrent que l’effet de la salinité après
30 jours de croissance est significatif pour les différents organes de la plante
(tableau 7).
Les valeurs de la teneur en NR passent des parties aériennes des jeunes
plantes avec 14,23 µM NO2.h-1. g-1 PF à 4,18 chez les témoins ; soit plus de 30%.
53
Figure 11-Variation de l’activité du nitrate réductase mesurée sur des plantules
âgées de 30 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl + CaCl2
A 50 meq.l–1 de NaCl +CaCl2 ,la teneur en NR est réduite de moitié dans les racines
comparativement aux parties aériennes . Pour des concentrations élevées de sel
(200 meq.l–1 de NaCl +CaCl2 ),les teneurs en NR sont réduites de 25% dans les
racines (Fig.11) .
2- Plantes âgées de 60jours
L’inhibition de l'activité du Nitrite réductase par la salinité croissante a été
observée dans les différents organes après 60 jours de croissance.
L’activité du nitrate réductase diminue dans les racines chez les plantes
témoins par rapport aux parties aériennes mais elle baisse beaucoup plus en
fonction de l’âge de la plante ainsi que la concentration en sel apporté (tableau 8).
Le nitrate réductase diminue davantage lorsque le milieu de culture s’enrichit
en NaCl+CaCl2 ; son taux passe significativement de 08.16 µM NO2.h-1. g-1 PF chez
-1
-1
les témoins à 0,01 µM NO2.h . g
PF chez les plantules arrosées à 200 meq.l–1 de NaCl
+CaCl2 dans les parties aériennes des plantes âgées de 60 jours (Fig.12).
Dans les racines, la teneur de l’enzyme NR chute brusquement, en particulier,
chez les plantes recevant seulement de la solution nutritive.
54
Dans ces conditions, l’analyse statistique révèle chez les plantes stressées
un résultat significatif pour les différents organes. Par contre chez les racines
recevant à 200 meq.l–1 de NaCl +CaCl2, les valeurs obtenues sont significativement
supérieures comparées aux parties aériennes (respectivement 0.07 contre 0.01 µM
NO2.h-1. g-1 PF)( Tableau 8).
Tableau 8 -Test statistique de signification de Fisher mesurant l’activité du nitrate
réductase mesurée sur des plantules âgées de 60 jours de Phaseolus vulgaris
L. stressées aux NaCl + CaCl
Témoin
50meq.l-1
100meq.l-1
150 meq.l-1
200 meq.l-1
Parties aériennes
8,16±0,21*
0,41±0,03*
0,37±0,38*
0,22±0,18*
0,01±0,21*
Racines
1,01±0,15*
0,91±0,18*
0,42±0,01*
0,18±0,31*
0,07±0,02*
A 50 meq.l–1 les taux obtenus dans les racines présentent des valeurs
significatives comparativement aux mêmes organes aériens témoins (feuilles) (0.91
contre respectivement 0.41 µM NO2.h-1. g-1 PF).
Au contraire, l’effet de la salinité à 150 meq n’entraîne aucune différence
significative dans la teneur du NR enregistrés dans les racines et les parties aériennes
(0.18 pour 0.22 µM NO2.h-1. g-1 PF).
Dès que les plantes reçoivent de la solution saline, il faut noter que sous le
traitement à 50 meq.l-1 NaCl+CaCl2 pour les parties aériennes et à 100 meq pour les
racines, les teneurs en nitrate réductase sont à peu près identiques (respectivement
0.41 pour 0.42 µM NO2.h-1. g-1 PF) ces teneurs demeurent toutefois significativement
inférieurs à ceux signalés dans organes témoins.
55
Figure 12-Variation de l’activité du nitrate réductase mesurée sur des plantules âgées de
60 jours de Phaseolus vulgaris L. stressées aux NaCl + CaCl2
Lorsque nous tenons compte de l’effet traitement sur la
teneur
enzymatique, l’analyse statistique du tableau 8 montre que cet enzyme baisse
toujours des organes aériens vers les racines en restant significativement plus bas
soit sous le milieu à 50 meq de NaCl+CaCl2 ou à 200 meq.l-1 de NaCl + CaCl2
(Fig.12).
Les résultats montrent que la teneur en NR diminue lorsque la concentration
en sel dans le traitement augmente. D’autre part, l’enzyme s’accumule beaucoup
plus dans la partie aérienne contrairement aux racines qui sont considérées comme
des organes de transition.
Pour les plantes témoins arrosées par une solution nutritive, il en ressort des
valeurs significativement inférieures concernant la NR accumulée par les racines
par rapport aux organes aériens.
56
3- Discussion
La réduction de l’activité de la NR dans les feuilles est due essentiellement à
l’élévation de la concentration en ions Cl– et Na+ qui conduit à une baisse de
l’absorption du NO3– et en conséquence, à une diminution de la concentration en
NO3– dans les feuilles (Le Flores et al., 2000 ; Silveira et al., 2001). Par conséquent,
une baisse dans l’activité de la NR et de la teneur en nitrate sous des conditions de
salinité élevées peut être responsable de la réduction de la croissance et de la
production de la biomasse par la plante dans ces conditions.
La nitrate réductase est l'enzyme clé régulatrice de l'assimilation du nitrate
(Obaton 1993) et sa synthèse de même que son activité sont influencées par divers
facteurs de l'environnement, y compris le stress hydrique (Munjal et al., 1997;
Ramanjulu et Sudhakar, 1997).
Nos résultats sont en accord avec ceux de nombreux auteurs qui trouvent
que l’absorption du nitrate et l’activité de la nitrate réductase diminuent dans les
feuilles chez de nombreuses plantes sous stress salin (Meloni et al., 2004). Deboba
et al. (2007) constate aussi que l’activité du nitrate réductase est au moins 8 fois
plus importante dans les feuilles que dans les racines de tomates non traitées. Sous
les différents traitements salins, l’ANR racinaire n'a pas excédé 10-14% de la
réduction du nitrate totale, tandis que l’ANR foliaire a diminué de 30 et 37%, à 50
et 100 mM de NaCl, respectivement (Deboba et al., 2007,Mekhaldi,2007).
L'épuisement d'éléments nutritifs essentiels, et en particulier le nitrate, peut
causer des changements dans l’expression du gène et l’activité de l'enzyme sous les
conditions de stress (WalWang et al., 2004). L’absorption du nitrate et son
transport paraissent sensibles à la salinité (Peuke et al., 1996; Flores et al., 2000),
et cela peut avoir des conséquences sévères pour l’assimilation du nitrate dans les
plantes. La nitrate réductase (NR) et la nitrite réductase (NiR) exigent le nitrate
pour leur induction (Ogawa et al., 2000). Les assimilats (sucres, acides aminés)
sont aussi impliqués dans la régulation de l'expression de la NR (Matt et al., 1999).
Les plantes désactivent rapidement la NR en réponse à plusieurs signaux, y compris
le manque de lumière, une baisse en CO2 foliaire ou à la fermeture des stomates
(Kaiser et Foster, 1989 ; Mainassara-Zaman et al.,2009).
57
Selon Deboba et al. (2007), sous stress salin, la diminution de la NiR dans les
feuilles est concomitante à celle de l’ANR qui fournit le nitrite pour l’ANiR dans ce
tissu. Cependant, dans les racines, l’ANR et l’ANiR n’évoluent pas de la même
manière sous le stress salin. Chez le témoin, le taux de la réduction du nitrite est
beaucoup plus élevé que celui de la réduction du nitrate. Cela assure un
métabolisme du nitrite rapide, protégeant les cellules de la toxicité de cet ion.
Sous l’effet de la salinité, l’ANiR par rapport à l’ANR est très réduite dans les
racines. Dans le même sens, Malek-Maalej et al.1998) ont trouvés que la salinité
diminue l’azote total dans les racines et les parties aériennes de deux cultivars de
blé. L’inhibition de l'activité du Nitrite réductase par la salinité croissante a
également été observée chez la tomate (Bourgeais et al., 1992), et le soja (Khan,
et al.,2002). Par ailleurs, il a été montré que la salinité diminue le taux d'azote et
la teneur en protéines chez le blé (Nesiem et Ghallab 1999), la tomate (PerezAlfocea et al. 1993) et le soja (Chen et al., 1995 ;Kayamakanova et Stoeva,2009 ).
58
D- Etude anatomiques des racines et des tiges
1– Effet du stress salin sur le système vasculaire racinaire
L’analyse des photographies montre l’existence d’une influence de la salinité
sur les variations de la longueur des racines. En effet, lorsqu’il s’agit des plantes
témoins, les observations relevées au 30ème jour de croissance (Photo 9a), montrent
que la biomasse du système racinaire est considérablement importante
chez les
plantes témoins comparativement aux plantes traitées au sel.
a
Témoin
50
100
150
b
200
22200200
Photo 9 – Plantes de Phaseolus vulgaris L. aux différents stades
Sous stress au NaCl+ CaCl2 (partie racinaire).
(a : 30ème et b : 60ème jour de croissance)
Après un mois de croissance, chaque plante des différents lots a développé un
système racinaire en fonction de son milieu où elle se trouve. Les résultats montrent
que la masse des racines diminue nettement à chaque fois que la salinité augmente
(Photo 9a).
L’action du sel est prévisible comparée au témoin (solution nutritive), les
plantules traitées présentent une croissance très faible au niveau des racines, surtout
pour des concentrations élevées 150 et 200 meq.l-1 (NaCl+CaCl2).
L’action du sel sur le développement du système racinaire a été appuyé par une
étude anatomique pour apporter plus de précision notamment sur le comportement
des éléments du xylème vis-à-vis de la concentration en sel.
59
A ce sujet, des coupes
transversales ont été obtenues et utilisées comme
matériel expérimental .Les observation sous microscope ont permis de suivre les
effets du sel sur les vaisseaux du xylème et spécifiquement celui de la partie
racinaire.
Lorsque les plantes reçoivent de la solution saline de NaCl+CaCl2 à 100 meq.l-1,
le diamètre se réduit comparativement aux diamètres du xylème des plantes arrosées
à la solution nutritive (Fig.13b).
Après 30 jours de croissance, le diamètre diminue fortement après seulement
une semaine de stress, ce diamètre diminue lentement chez plantes traitées à 150 et
200 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 (Fig.13 c et d).
Les plantes traitées à 200 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 présentent, après une semaine
de stress, un diamètre très réduit comparativement aux plantes témoins (Fig.13). Au
60 ème jour de croissance, ce diamètre enregistre une nette régression et atteindre des
diamètres plus réduits(Fig.14). Cette variation, comparée à celle obtenue chez les
plantes témoins et au même stade de croissance, représente 50%.
A huit
semaines de croissance, les racines sont bien développées mais
beaucoup moins pour les traitées à 150 et 200 meq.l-1 de NaCl+CaCl2 (Photo 9b).
Cet effet réducteur des racines sous le stress de la salinité se traduit au niveau
cellulaire. Chez les plantes témoins, le diamètre des vaisseaux du xylème racinaire
des jeunes plantes se présente très important. Par contre la salinité a influé sur le
diamètre puisque une réduction significative est enregistrée par rapport aux racines
des plantes témoins arrosées à la solution nutritive.
Chez les plantes traitées à 200 meq.l-1 de NaCl+ CaCl2 et après 7 jours de stress,
les vaisseaux du xylème affichent des diamètres légèrement réduites par rapport à
celles des témoins. Après deux mois, ce diamètre continue sa régression pour contrer
l’agression du sel.
Cette régression du diamètre des vaisseaux s’accompagne avec une réduction
dans le nombre des vaisseaux du xylème racinaire et ce quelque soit le traitement en
sel apporté (Fig.13 et 14).
60
Fig.13- Anatomie des racines de Phaseolus vulgaris L. âgé de 30 jours
Fig.14- Anatomie des racines de Phaseolus vulgaris L. âgé de 60 jours
10µm
61
2-Effet du stress salin sur le système vasculaire caulinaire
Le stress de la salinité semble affecter les caractéristiques morphologiques des
tiges. Les résultats obtenus montrent que la croissance de la tige n’est pas affectée
par la solution nutritive, par contre à des fortes concentrations de sel (100 à
200meq.l-1, la tige présente une nette régression dans son développement, tandis que
les
plantes
traitées
aux
concentrations
50
meq.l-1
présentent
moins
de
caractéristiques de sensibilité au stress (Photo.10).
T
50
100
150
200
Photo 10-Plantes de Phaseolus vulgaris L. au 30ème jour de croissance
sous stress au NaCl+ CaCl2 (partie aérienne).
Comparativement aux racines, les tiges présentent eux aussi des perturbations
dans leur croissance mais à des degrés moins. Après un mois de croissance, le système
caulinaire des plantes stressées est sérieusement affecté par l’action du sel (photo
10). Les plantules témoins présentent un système aérien moins marqué par rapport
aux traitées. L’action du sel sur le développement du système caulinaire révèle des
dommages considérables à des concentrations plus élevées (200 meq.l-1).
Cette réaction des tiges aux effets dépressifs du sel a été elle aussi suivi sur
des coupes transversales colorées au vert de Méthyle -Rouge congo.
Les résultats semblent très proches avec ceux obtenus chez des racines pour les
deux stades de développement (30 et 60 jours de croissance) (Fig.15 et 16).
62
Fig.15 -Anatomie des tiges de Phaseolus vulgaris L. âgé de 30 jours
Fig.16 -Anatomie des tiges de Phaseolus vulgaris L. âgé de 60jours
10µm
63
3-Discussion
L’exposition du Haricot (Phaseolus vulgaris L.) à la salinité s’est traduite par
une chute de la croissance surtout de la partie aérienne. L’effet de la salinité n’est
pas homogène pour toutes les concentrations. Les réponses morphologiques,
physiologiques
et
métaboliques
des
organes
sont
différentes
(Akhtar
et
al.,2001. ;Kayamakanova et Stoeva,2009) et parfois même opposées entre les stades
juvéniles et adultes (BRAY et al.,2003).
L’examen microscopique des coupes transversales réalisées dans la région
médiane des racines et des tiges, après coloration par la technique de double
coloration (Vert de méthyle/rouge Congo, montre que les modifications structurales
des vaisseaux du xylème varient selon le mode de traitement apporté aux plantules de
Phaseolus vulgaris L.
Les racines représentent de légères modifications structurales au niveau du tissu
du xylème. Aux fortes concentrations de sels (200 meq.l-1) de (NaCl+CaCl2), les
cellules du xylème présentent une légère réduction dans leur diamètre, ainsi que les
épaississements de leur paroi.
Au niveau des tiges, les résultats montrent bien l’action du sel sur le tissu
conducteur comparés aux témoins.
Au fort grossissement, les mêmes tiges illustrent nettement un relâchement dans
l’ajoncement de leur tissu conducteur et notamment le xylème. Cette réaction se
traduit par une réduction dans le nombre des gros vaisseaux et l’épaississement de
leurs parois et ceci suivant le traitement apporté.
Les résultats obtenus montrent que quelque soit le traitement apporté, la racine
présente de gros vaisseaux comparativement à la tige. Ce comportement de la racine
peut s’expliquer comme un mode d’adaptation vis à vis de la salinité.
La plupart des plantes sont capables de s'adapter aux environnements salins,
cette adaptation s’accompagne par des changements morphologiques, anatomiques et
biochimiques (Kylin,1975; Poljakoof,1975; Brugnoli et Lauteri,1991 ;Chadli,2007).
Chez les non-halophytes, il y a une grande variabilité des réponses, classée des
espèces sensibles aux tolérantes (Greenway,1980 ;Mekhaldi,2007). L'effet de la
salinité sur la composition lipidique des racines a aussi été étudié chez des espèces
différentes, y compris le raisin, la fève et le plantago (Erdie et al.,1980).
64
DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE
La réponse des plantes aux stress est très complexe. L’adaptation d’une
plante au stress salin implique la mise en place de divers mécanismes qui vont lui
permettre de limiter l’envahissement de ses cellules par le sel et limiter la teneur
en certains ions toxiques notamment le Na+ et le CI-, de limiter la déshydratation
de ses tissus et de lutter contre le déséquilibre de son métabolisme.
Dans le présent travail, nous avons cherché à étudier le comportement
physiologique
et anatomique d’une légumineuse, Haricot (Phaseolus vulgaris L.
stressée avec des concentrations en sels croissantes en vue de tester son degré de
tolérance à la salinité. A cet effet, une solution de chlorure de sodium associé au
chlorure de calcium a été utilisée pour stresser l’espèce étudiée à différents stades
de développement : 30 et 60 jours.
Cette étude a été réalisée à l’échelle de l’organe et de la plante entière afin
de déterminer les sites d’action du sel et les principaux mécanismes intervenant
dans la résistance à la salinité. Par ailleurs, la durée du traitement
a été
considérée étant un facteur déterminant dans l’expression des résultats .Pour
compléter ce travail, il a été indispensable de descendre à l’échelle de la cellule.
Les stress de la salinité (100,150 et 200 meq.l-1 de Na Cl +CaCl2) engendrent
dans un premier temps des perturbations physiologiques. Mais très rapidement se
déclenchent des mécanismes qui vont établir un équilibre. Les conséquences sont
ensuite de l’ordre morphologique ; car le développement racinaire et la faible
croissance de la partie aérienne du Haricot se font ressentir comme une réponse à
ces contraintes.
A l’inverse des plantes naturellement tolérantes aux sels (halophytes), la
plupart des espèces d’intérêt agronomique sont rangées dans le groupe des
glycophytes, dont la croissance est diminuée en présence de sel. Pour parvenir à
définir des pratiques culturales permettant de surmonter un stress salin et pour
créer des variétés tolérantes au sel, des études physiologiques, biochimiques,
moléculaires et génétiques sont nécessaires. Il est bien connu que les végétaux
présentent un très large spectre de comportement vis-à-vis de la salinité. Certaines
65
espèces peuvent supporter jusqu’à 30 g.l-1 de NaCl (0.5 M, soit à peu près la
concentration de l’eau de mer) tandis que d’autres voient leur croissance réduite
ou inhibée à de plus faibles teneurs en sels du milieu (Lopez,2002).
Les principaux résultats obtenus dans les précédents chapitres apportent
brièvement quelques éléments de réponse de cette Légumineuse vis-à-vis du stress
de l’environnement.
Les effets de la salinité sur photosynthèse entraîne une diminution de la
teneur en chlorophylles a et b chez les plantes traitées par rapport au témoin. Le
NaCl associé au CaCl2, présente un caractère d’atténuation de l’effet de la salinité
sur l’activité photosynthétique. L’effet des différents traitements, 100, 150 et 200
meq.l–1, sur les teneurs en chlorophylle ne semble pas significatif pour les deux
types de chlorophylle a et b. Par contre, la comparaison des variations des
pigments chlorophylliens montre que la chlorophylle a est plus affectée par la
salinité. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par Younis et al. (2003)
sur Vigna sinensis et Zea mays ;par Mekhaldi (2007) sur Vigna radiata L.. Il a été
rapporté que la salinité diminue la teneur en
pigments photosynthétiques de
plusieurs plantes telles que le riz (Pandey et Saxena, 1987), le blé (Salma et al.,
1994) et la tomate (Sinel'nikova et al., 1998). De plus, Strogonov (1962) a proposé
que la réduction des teneurs en pigments en réponse au stress salin soit due
probablement à l'effet inhibiteur des ions accumulés dans la biosynthèse des
différentes fractions de pigments.
La diminution de la teneur en chlorophylles chez les plantes traitées au NaCl
pourrait être due également aux interférences des ions Na+ et Cl– sur les enzymes
qui interviennent dans la voie de la biosynthèse des chlorophylles, ou à un trouble
dans l'intégration des molécules de la chlorophylle dans les complexes stables. La
baisse de la teneur en chlorophylle peut être corrélée aux effets indirects des ions
Na+ de Cl– sur les nutriments essentiels (Arshi et al., 2006). La perte en chlorophylle
peut être une cause de baisse de la photosynthèse chez les plantes halophytes
(Arshi et al., 2004). Pour mettre en évidence l’importance de l’association NaCl +
CaCl2, Arshi et al. (2006), montrent que la teneur en chlorophylle totale augmente
dans les feuilles de Cichorium intybus L. avec l’âge de la plante jusqu'au stade de
floraison. Ensuite, ce paramètre diminue au stade de post-floraison à 160mM de
66
NaCl avec une réduction de 56% par rapport au témoin. En revanche, il diminue
significativement quand il s’agit d’une solution de CaCl2. Les traitements de
l’association NaCl + CaCl2 ont également causé des diminutions significatives des
teneurs en chlorophylle.
L’analyse des résultats biochimiques, montre que l’accumulation de la
proline chez Phaseolus vulgaris L.a réagi à la salinité. Cette réaction met en
évidence une certaine variation de la teneur en cet acide aminé selon l’organe et
le stade de développement de la plante considérés ainsi que la concentration
saline. En effet, la capacité des espèces à accumuler la proline sous des
contraintes abiotiques environnementales a déjà été rapportée par de nombreux
auteurs (Rains, 1989; Ali et al., 1999; Ozturk et Demir, 2002; Belkhodja et Bidaï,
2004 ; Kavi Kishore et al., 2005 ;Mekhaldi,2007 ;Kaymakanova et Stoeva,2009).
Il faut noter que la proline s’est accumulé beaucoup plus dans les feuilles de
l’espèce étudiée que dans ses autres organes. De nombreux travaux mettent en
évidence une richesse en proline des parties aériennes et en particulier les feuilles
chez plusieurs espèces telle que la tomate (Perez-Alfocea et Larher, 1995 ; Vicia
faba L. (Belkhodja, 1996) et Atriplex halimus L.,Bidai, 2001),). Le parcours de cet
acide aminé a été également suivi par des travaux qui ont montré qu’elle est
synthétisée dans les feuilles puis transportée vers les sites de résistance aux
agressions en l’occurrence les collets et les racines ( Greennam, 2006). Il n’en
demeure pas moins que d’autres travaux concluent que l'accumulation de la proline
contribue à l'acquisition d’une certaine forme de résistance due au maintien de la
turgescence cellulaire. Cet état hydrique provient d'un ajustement osmotique dont
la proline est responsable (Chen et Wang, 1991). Les mêmes chercheurs signalent
que la proline migre vers les feuilles et s'y localise en réponse à la contrainte
saline. Par ailleurs, Hu et al. (1992) affirment l’existence d’un gène codant
l’enzyme « pyrroline 5 carboxylate synthétase (P5CS) » qui s’affirme fortement au
niveau des feuilles et des racines de Vigna aconitifolia soumise au stress salin. Cet
enzyme constitue un catalyseur de l’étape finale de la biosynthèse de la proline
(Yoshiba et al., 1997). Bien que la synthèse de proline soit un indicateur pertinent
de réponse d’une plante soumise au stress salin, elle ne fait pas l’unanimité étant
donné que certains auteurs, tels que Tal et al. (1979) ayant travaillé sur la tomate,
affirment que cet acide aminé ne joue pas un rôle essentiel dans la résistance au
67
sel. Bellinger et al. (1989) concluent aussi que l’accumulation de la proline ne
pourrait constituer un indicateur de sensibilité ou de résistance intrinsèque d’une
plante sous conditions salines mais seulement un indicateur d'acquisition de la
tolérance aux agressions abiotiques.
Les résultats obtenus sur l’activité enzymatique révèlent que la nitrate
réductase varie aussi selon l’organe de la plante considéré. Cette activité parait
toujours supérieure dans les parties aériennes par rapport à la racine quand la
plante est soumise à l’effet de la salinité (Mekhaldi,2007). Les mécanismes
susceptibles d’intervenir dans l’inhibition de l'activité de la nitrate réductase par le
NaCl impliquent très souvent, un effet direct aussi bien sur l'activité enzymatique
elle-même que sur le taux de synthèse des enzymes (Ramanjulu et al., 1994).
Les observations anatomiques obtenues montrent que quelque soit le
traitement apporté, la racine présente de gros vaisseaux comparativement à la
tige. Ce comportement de la racine peut s’expliquer comme un mode d’adaptation
vis à vis de la salinité.
En revanche, la plupart des plantes sont capables de s'adapter aux
environnements salins, cette adaptation s’accompagne par des changements
morphologiques, anatomiques et biochimiques (Kylin,1975; Poljakoff,1975; Brugnoli
et Lauteri,1991).
Aucun des éléments de réponse à l’application d’un stress salin étudiés à ce
jour ne pouvant à lui seul servir de base de sélection pour la résistance au champ,
il est difficile d’établir des schémas de sélection de variétés tolérantes au sel, d’où
la nécessité de développer des approches génétiques. L’analyse des mutants et
l’étude des gènes correspondants pourront, d’une part, fournir des marqueurs et,
d’autre part, permettre de définir des critères corrects pour la sélection de
variétés tolérantes.
La compréhension de ces phénomènes sera d’une grande utilité dans la
perspective de mise en place de programmes de sélection et d’amélioration
d’espèces utiles, ensuite pour une meilleure conduite des espèces végétales
naturelles, enfin pour définir les caractéristiques idéales des espèces à intérêt
agricole pour faire face aux différents stress environnementaux.
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86
Description de la Méthode e mesure de l’ANR « in situ » Maarouf,1986
Principe de la mesure de l’ANR « in situ »
La mesure de l’ANR « in situ » consiste à provoquer une accumulation de nitrite
(NO2-) dans un échantillon intact de végétal en le plaçant en anoxie et à
l’obscurité. La lumière est indispensable à la réduction des nitrates qui utilise la
ferrodoxine réduite (Neyra Hageman, 1974) régénérée à la lumière dans les
chloroplastes. L’anoxie, en inhibant la respiration mitochondriale, laisse le pouvoir
réducteur (NADH) disponible pour le nitrate réductase.
(
Témoin
;
50meq
;
100meq
;
150meq
Extraits des plantes contenant le nitrite après ajout de N-Naphtyl-E.D.S.
;
Courbe d’étalonnage de la proline
Tubes contenant de la proline dans les extraits des différents organes
T
50
100
150
Tubes contenant de la chlorophylle extraite des feuilles témoin et traitées
Aux différentes concentrations de sel (NaCl+CaCl2)
Coupes anatomiques et observation
Technique de la double coloration