2012

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Immunologie et maladies infectieuses
Présentée et soutenue par CARLIER Jérôme
Le 26 Avril 2012
Titre :
Effets de l'infection par le cytomégalovirus humain sur la différenciation des monocytes en
cellules dendritiques : mécanismes moléculaires et conséquences physiopathologiques
JURY
Eric TARTOUR Rapporteur
Franck HALARY Rapporteur
Audrey ESCLATINE Examinateur
Denis HUDRISIER Examinateur
Christian DAVRINCHE Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies
Unité de recherche : INSERM U1043
Directeur(s) de Thèse : Christian DAVRINCHE
Rapporteurs : Eric TARTOUR
Franck HALARY
UNIVERSITE PAUL SABATIER TOULOUSE III
ECOLE DOCTORALE BIOLOGIE-SANTE-BIOTECHNOLOGIE
2012
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE TOULOUSE III
Spécialité IMMUNOLOGIE ET MALADIES INFECTIEUSES
Jérôme CARLIER
Effets de l’infection par le cytomégalovirus humain sur la
différenciation des monocytes en cellules dendritiques :
mécanismes moléculaires et conséquences physiopathologiques
Directeur de thèse
Christian DAVRINCHE
Jury
Eric TARTOUR
Franck HALARY
Audrey ESCLATINE
Denis HUDRISIER
Christian DAVRINCHE
1
REMERCIEMENTS
J’adresse mes plus sincères remerciements
Au docteur Christian Davrinche
Pour m’avoir permis de réaliser cette thèse dans son laboratoire. Pour sa patience, son
calme, sa compréhension et sa gentillesse ainsi que pour les nombreuses heures d’écoutes
qu’il m’a accordé et qui m’ont permis de mener à bien ce projet.
Aux professeurs Dennis Hudrisier, Eric Tartour ainsi qu’aux docteurs Audrey Esclatine et
Franck Halary
Pour avoir accepté de faire partie de mon jury et pour avoir lu avec attention mon
manuscrit.
A Hélène Martin
Pour m’avoir formé depuis le commencement et m’avoir accompagné avec ses nombreux
conseils. Pour sa gentillesse et l’excellente ambiance qui a régné durant toutes ces années
dans le laboratoire et le bureau.
A Benjamin Rauwel
Pour tout le temps passé ensemble que ce soit pour le travail ou en dehors. Pour m’avoir
appris les bases et contribué à rendre cette période vraiment formidable.
A Aline Darmana
Pour toutes les petites attentions dont j’ai fait l’objet, sa gentillesse et sa générosité qui ne la
quittent jamais
A toute l’équipe CD/JI
Pour la très bonne ambiance de travail du laboratoire. Merci à Bernard, Stéphane, Eric,
jacques, El Mostapha, les deux Florence, Stéphanie, Sabine, Charlotte, Christophe ainsi
2
qu’aux étudiants : Adrien, Sébastien, Kaoutar, Rémi, Olfa, Mélinda, nawel, Julie, Emeline,
Aude, Charline.
Aux étudiants de l’INSERM
Merci à Jérôme pour les moments de détentes que ce soit autour d’un café ou au squash.
Merci aussi à Fanny, Lise, Maud, Hugo, Jodie, Caroline, Charlotte, Johan, Laurent, Gavin,
Nicolas pour les soirées passées ensemble.
A ma famille
Pour m’avoir soutenu durant toutes ces années quoi qu’il advienne et pour continuer à me
soutenir et à m’encourager dans mes projets futurs.
3
SOMMAIRE
Abstract
7
Résumé
8
Abréviations
9
INTRODUCTION
11
LES CELLULES DENDRITIQUES
12
A. Développement
13
1. Origines des cellules dendritiques
14
2. Différenciation des cellules dendritiques conventionnelles (cDC)
15
3. Différenciation des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC)
16
4. Différenciation des cellules de Langerhans (LC)
16
5. Différenciation des cellules dendritiques inflammatoires
16
a. TipDC
16
b. moDC
17
c. Signalisation de la différenciation des moDC
18
d. Rôle des SOCS : inhibition des signalisations cytokiniques
20
B. Fonctions
21
1. pDC
21
2. DC conventionnelles et moDC
22
a. Capture de l’antigène
23
b. Maturation
24
c. Présentation d’antigènes
25
d. « Priming », « priming » croisé et stimulation des lymphocytes T
28
e. Polarisation des lymphocytes T
31
LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN
33
A. Généralités
34
1. Historique
34
2. Classification
34
3. Souches virales et tropisme
35
4. Epidémiologie
35
4
a. Transmission horizontale
36
b. Transmission verticale
36
c. Transmission iatrogène
36
5. Clinique
37
a. Personnes immuno-compétentes
37
b. Infections congénitales
37
c. Personnes immuno-déficientes
37
6. Traitements
38
a. Molécules antivirales
38
b. Transfert adoptif de cellules T
39
7. Immunisation passive et vaccination
40
a. Immunisation passive
40
b. Vaccination
41
B. Biologie du CMV
1. Structure et composition du virion
43
43
a. Capside
43
b. Tégument
44
c. Enveloppe
44
d. Génome
45
2. Cycle viral
46
a. Attachement et entrée
46
b. Cycle productif
48
1. Phase IE
49
2. Phase E
49
3. Phase L
50
c. Latence et réactivation virale
51
IMMUNITE ANTI-CMV ET IMMUNOSSUPRESSION VIRALE
54
A. Immunité innée
55
1. Interféron de type 1 : signalisation et mode d’action
55
2. Réponse natural killer
58
3. Autophagie
59
B. Immunité adaptative
61
5
1. Réponse humorale
61
2. Réponse cellulaire
62
a. Lymphocytes T CD4+
62
b. Lymphocytes T CD8+
64
c. Lymphocyte T γδ
66
3. Immunosuppression des APC
66
RESULTATS (ARTICLE ET FIGURES SUPPLEMENTAIRES)
68
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES ET DISCUSSION
75
I. Résultats supplémentaires
76
II.Discussion
79
BIBLIOGRAPHIE
83
6
ABSTRACT
Impairment of monocytes to dendritic cells differentiation by human cytomegalovirus: molecular
mechanisms and physiopathological consequences
A primary HCMV infection or virus reactivation may cause severe disease in hosts with a deficient
immune system. The virus can disturb both innate and adaptive immunity by targeting dendritic cell
(DC) functions. Monocytes, which can be the precursors of DC in vivo (MoDC), are the primary
targets of HCMV; they can also harbor latent virus.
The dendritic cells generated from infected monocytes (CMV-MoDC) have an altered phenotype and
functional defects. We have shown that CMV-MoDC do not secrete IL-12 in response to LPS
stimulation, cannot ingest dead cells, induce TH1 differentiation, or the proliferation of naive
allogeneic CD4+ T cells. We found that the GM-CSF signaling in an entire population of CMV-MoDC
was impaired although only half of the cells were productively infected, and that IL-6 secretion and
SOCS3 induction contributed to this bystander effect. We also showed that MoDC derived ex vivo
from monocytes of viremic patients had the same altered phenotype as CMV-MoDC, including
decreased STAT5 phosphorylation, indicating defective GM-CSF signaling.
We have thus described a new mechanism of HCMV-induced immunosupression, indicated how
infection may disturb both GM-CSF-dependent physiological processes and proposed GM-CSF-based
therapeutic approaches.
7
RESUME
Effets de l’infection par le cytomégalovirus humain sur la différenciation des monocytes en cellule
dendritiques : mécanismes moléculaires et conséquences physiopathologiques
La primo-infection par le cytomegalovirus (CMV) ou sa réactivation sont les causes de nombreuses
pathologies chez des personnes ayant un système immunitaire déficient. Le virus est capable de
perturber la réponse immunitaire innée et adaptative en ciblant les fonctionnalités des cellules
dendritiques (DC). Les monocytes, précurseurs de sous population de DC in vivo (MoDC), sont des
cibles de l’infection par le CMV et peuvent contenir du virus latent.
Les DC différenciées à partir de monocytes infectés (CMV-MoDC) présentent un phénotype altéré
ainsi que des pertes de fonctionnalités. Nous avons montré que les CMV-MoDC ne sécrètent pas d’IL12 en réponse à une stimulation par le LPS, ne sont plus capable de phagocyter de cellules mortes,
d’induire une polarisation TH1 ou la prolifération de lymphocytes T CD4 allogéniques naïfs. Nous
avons démontré que la signalisation GM-CSF était altérée dans la population entière des CMV-MoDC
alors que seule la moitié des cellules étaient infectées, la sécrétion d’IL-6 et l’activation des
molécules SOCS3 (Suppressor Of Cytokines Signaling) étant en partie responsable de cet effet
paracrine. Nous avons aussi montré que les MoDC dérivés de monocytes de patients virémiques
présentent le même phénotype altéré que les CMV-MoDC notamment une inhibition de la
phosphorylation de STAT5 et donc une altération de la signalisation GM-CSF.
Nous avons décrit un nouveau mécanisme d’immunosuppression induite par le CMV, l’infection
pouvant perturber les processus physiologiques nécessitant l’action du GM-CSF ainsi que les
différentes approches thérapeutiques à base de GM-CSF.
8
ABREVIATIONS
CMV : Cytomégalovirus
DC : Cellule Dendritique
HSC : Cellule Souche Hématopoïétique
CMP : Progéniteur myéloïde commun
CLP : Progéniteur lymphoïde commun
Flt3 : Fms-like Tyrosine Kinase Receptor-3 (CD135)
pDC : Cellule Dendritique plasmacytoïde
cDC : Cellule Dendritique Conventionnelle
LC : Cellule de Langerhans
M-CSF : Marophage Colony-stimulating Factor
MDP : Progéniteur Macrophage Dendritique
CDP : Progéniteur Commun Dendritique
GM-CSF : Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor
BDCA : Blood Dendritic Cell Antigen
TCR : T Cell Receptor
RAG : Recombination Activating Gene
TGF-β : Transforming Growth Factor-β
TipDC : TNF/iNOS-Producing Dendritic Cell
TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α
LPS : Lipopolysaccharide
moDC : Cellule Dendritique dérivée de monocyte
CMH : Complexe Majeur d’Histocompatibilité
MLR : Réaction Mixte Lymphocytaire
STAT : Signal Transducer and Activator of Transcription
JAK : Janus Kinase
PPAR-γ : Peroxysome Proliferator-Activated Receptor-γ
TH : T Helper
MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinase
SOCS : Suppressor Of Cytokine Signaling
KIR : kinase inhibitory Region
TLR : Toll-Like Receptor
MyD88 : Myeloid Differentiation primary response gene 88
9
TRIF : TIR-domain containing adapter-Inducing Interferon
IRF : IFN-Regulatory Factor
NK : Natural Killer
HSV : Herpes Simplex Virus
CR : Complement Receptor
DC-SIGN : Dendritic Cell-Specific ICAM3-Grabbing nonintegrin
PAMP : pathogene Associated Molecular Pattern
NF-κB : Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell
MIP : Macrophage Inflammatory Protein
TAP : Transporter Associated with antigen Processing
CLIP : Class II-associated Invariant chain Peptide
HLA : human Leukocyte Antigen
CTLA-4 : Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
PGE2 : Prostaglandine E2
IE : Immediate Early
MIEP : Major IE promoter
m.o.i : Multiplicity of Infection
PBMC : Peripheral Blood mononuclear Cells
ISRE : Interferon-Stimulated Response Element
ISG : Interferon-Stimulated Genes
MIC : MHC Class I polypeptide-related sequence
APC : Cellule Présentatrice d’Antigène
10
INTRODUCTION
11
LES CELLULES DENDRITIQUES
12
A. Développement
L’étude du développement des cellules dendritiques (DC) est un champ de recherche récent. Depuis
la mise en évidence de cette population cellulaire chez la souris dans les années 19701, beaucoup
d’études ont été mises en place mais de nombreuses questions restent en suspens. L’existence de
plusieurs sous-types de DC possédant des voies de différenciations pouvant être communes ou
indépendantes2,3 rend difficile l’étude de ces cellules. De plus, on ne retrouve pas dans le modèle
murin les mêmes populations de DC que chez l’homme, compliquant d’autant plus les recherches2.
Nous allons donc résumer ici le développement des principales populations de cellules dendritiques
retrouvées chez la souris et chez l’homme. Lorsque rien ne sera précisé, les études auront été
réalisées chez l’homme.
1. Origine des cellules dendritiques
Les DC proviennent toutes d’un précurseur hématopoïétique commun présent dans la moelle
osseuse (HSC). Cette cellule progénitrice va se différencier en différentes populations souches dont
les progéniteurs communs myéloïdes (CMP) et lymphoïdes (CLP) qui donneront à leurs tours les
différentes populations hématopoïétiques4,5. Les premières études laissent à penser que les DC
proviennent du lignage myeloïde à cause d’un rapprochement avec les macrophages et la possibilité
de différencier in vitro des DC à partir de monocytes6. Cependant des résultats plus récents basés sur
des transferts de cellules souches montrent la possibilité de développement de tous les types de DC
à partir des CMP et des CLP7,8, même si la majorité des cellules seraient issues des CMP in vivo7.
Le principal facteur identifié chez les précurseurs de DC est l’expression du récepteur Flt39,10. En
effet, l’expression forcée de ce récepteur chez des précurseurs restreints érythrocyte-mégakaryocyte
permet la différenciation en DC11. De plus les souris délétées pour le gène codant la cytokine Flt3L
(Flt3 ligand) présentent une réduction du nombre de ces cellules12. A l’inverse l’administration de
Flt3L chez l’homme permet l’expansion du pool de DC13. Le modèle a été reproduit lors de culture de
cellules de moelle osseuse et permet la différenciation de DC conventionnelles (cDC) et de DC
plasmacytoïdes (pDC) qui sont retrouvées normalement à l’état basal (non inflammatoire). L’étude
de ces cDC à permis d’établir leur correspondance avec les DC CD8+ et CD8- spléniques retrouvées
chez la souris14.
13
Figure 1 : Développement des cellules dendritiques à partir de précurseurs hématopoïétiques. Les précurseurs
3
myéloïdes et lymphoïdes exprimant FLT3 sont capables de se différencier en cellules dendritiques .
En revanche, ce système ne permet pas la production d’une partie des DC dites inflammatoires ainsi
que de cellules de Langerhans (LC) issues de la différenciation de monocytes circulants2. Pour la
différenciation de ces cellules, le facteur primordial est la signalisation M-CSF. Ainsi des souris
invalidées pour le gène csf-1R (c-fms, M-CSFR, CD115) sont déficientes en monocytes et en cellules
de Langerhans15,16. Les deux ligands connus pour csf-1R que sont le M-CSF et l’IL-34 sont importants
pour le développement de ce lignage, les souris invalidées pour le M-CSF seul ayant un phénotype
moins sévère que les souris déficientes pour csf-1R15.
Nous avons vu que les CMP étaient capables de produire tout les types de DC mais il existe plusieurs
étapes intermédiaires entre ces progéniteurs et les cellules différenciées. L’un de ces précurseurs
intermédiaire est appelé MDP (macrophage/DC progenitor). C’est une cellule qui exprime à sa
surface csf-1R, Flt3 ainsi que le récepteur à la chimiokine CX3CR117 et qui a toujours la capacité de se
différencier en monocytes, macrophages ou en cDC (sans passer par un stade monocyte)18. Une
équipe a récemment mis en évidence le rôle de l’IL-2 dans le contrôle de la différenciation
dépendante de Flt3, l’IL-2 agissant au niveau des MDP en bloquant l’action de Flt3L et donc
l’engagement vers les lignages cDC et pDC19.
Il existe aussi des CDP (common DC precursor) possédant le même phénotype de surface que les
MDP mais n’étant capable de se différencier qu’en cDC et pDC20, même si la perte de capacité à
engendrer des monocytes n’est peut être due qu’à la méthode de purification de ces cellules21. Il est
possible que ces deux populations soient plus proches que ce qui a été proposé dans les premières
études qui ont été réalisées chez la souris.
14
Figure 2 : Origine des cellules dendritiques circulantes. Les DC peuvent provenir d’un précurseur direct ou de la
21
différenciation de monocytes .
2. Différenciation des cellules dendritiques conventionnelles (cDC)
Le développement des cDC a particulièrement été étudié dans le modèle murin au niveau des nœuds
lymphatiques et de la rate. Les DC de ces organes sont capables de subir un nombre limité de
divisions et peuvent être entièrement remplacées sous 10 à 14 jours22. Des précurseurs présents insitu (pre-DC) ont été identifiés, possédant un phénotype de surface CD11cintCD45RAloCD43intSirpαintCD4-CD8-. Ils représentent 0.05% des splénocytes et sont capables après transfert dans une souris
irradiée de reconstituer une population de cDC23. Ces cellules sont les plus proches précurseurs des
cDC mis en évidence à ce jour.
Les monocytes CCR2-GR-1lo (équivalent des CD14lowCD16+ chez l’homme) minoritaires dans le sang
périphérique pourraient aussi être une source de cDC non inflammatoire24 contrairement au
CCR2+GR-1hi (CD14+CD16- chez l’homme) qui ne peuvent se différencier en cDC que lors de conditions
inflammatoires et en présence de GM-CSF23.
Chez l’homme des analyses au niveau du sang par FACS permettent d’identifier les différentes
populations circulantes de cDC, notamment les DC BDCA-1+ (CD1c+) qui représentent 0.2% des
cellules et les DC BDCA-3+ (CD141+) qui représentent elles aussi 0.2%. Au total, 0.5% des cellules
circulantes nucléés sont des cDC25.
15
3. Différenciation des cellules dendritiques plamacytoïdes (pDC)
Les premières études suggéraient que les pDC étaient d’origine lymphoide car ces cellules expriment
de nombreux marqueurs lymphoides dont le pre-TCR26. De plus chez la souris ces cellules expriment
l’enzyme RAG et effectuent des réarrangements D-J IgH27 que l’on retrouve normalement chez les
lymphocytes B, pouvant laisser supposer une origine commune entre les deux populations.
Cependant, des études plus récentes montrent que les précurseurs CLP et CMP Flt3+ peuvent se
différencier en pDC que ce soit en culture ou in vivo 10,28. Dans l’un de ces travaux il est aussi montré
que malgré l’absence de réarrangement D-J chez les CMP contrairement aux CLP, les pDC issues de
CMP expriment RAG et effectuent ce réarrangement suggérant que l’engagement vers la voie pDC
induit une réactivation de l’expression de ce gène28. Toutes ces études ont été réalisées chez la
souris. Chez l’homme les pDC représentent près de 0.02% des cellules circulantes25.
4. Différenciation des cellules de Langerhans (LC)
Les cellules de Langerhans sont le modèle le plus étudié de DC migratoires. Leur espérance de vie
peut atteindre jusqu’à trois semaines dans l’épiderme de souris29. Les précurseurs et les LC
immatures retrouvés dans la peau peuvent être différenciés à partir de monocytes suite à la
déplétion des LC in vivo 16. Des expériences de transferts de monocytes Ly6C+ (CCR2+Gr-1hi) dans des
souris irradiées aux UV16 ont mis en évidence ce rôle. L’expression à la surface des monocytes du
récepteur CCR2 est aussi très importante puisqu’elle permet le recrutement de ces cellules au niveau
de la peau via l’expression de CCL2 depuis la moelle osseuse30. Ces études sur des modèles murins
sont en accord avec des modèles in vitro humains qui montrent la capacité des monocytes
CCR2+CD14hi à produire des LC31. Le modèle humain le plus couramment utilisé est l’ajout des
cytokines GM-CSF et TGF-β sur des précurseurs de type monocyte pour induire la différenciation en
LC in vitro, le TGF-β1 étant un facteur essentiel comme l’ont montré des expériences de
supplémentation32 ou chez des souris déficientes33.
5. Différenciation des cellules dendritiques inflammatoires
a. TipDC
De nombreuses études ont mis en évidence la capacité des monocytes à se différencier en DC lors de
différents modèles d’inflammations. Les plus récemment identifiées sont les DC produisant du TNF-α
et des oxydes nitriques (TipDC) qui sont essentielles pour la résolution d’infection bactériennes
16
notamment par L.monocytogenes. Ces cellules ne sont pas nécessaires au « priming » des
lymphocytes T mais leur production de molécules inflammatoires permet la mise en place de la
réponse immunitaire innée34. Des modèles d’infections par le virus influenza A mettent aussi en
évidence un rôle délétère des TipDC via une production trop importante de cytokines35.
b. moDC
Les seconds types de DC inflammatoires issues de monocytes (moDC) sont des cellules dont la
fonction est proche des DC conventionnelles. Ces cellules ont beaucoup été étudiées in vitro puisque
l’ajout des cytokines GM-CSF et IL-4 pendant cinq à six jours sur des cultures de monocytes sanguins
purifiés suffit à les différencier en DC36 possédant un phénotype proche des cDC (CD1a+CD14-). Ces
cellules peuvent ensuite être maturées grâce à l’ajout de cytokines pro-inflammatoires telles que le
TNF-α ou des produits issus de pathogènes tels que les lipopolysaccharides (LPS) bactériens pour
obtenir des cellules CD80+CD86+CD83+ et CMH-IIhi. Un modèle plus physiologique a été mis en place
pour la différenciation de ces moDC, il consiste en l’utilisation d’une couche de cellules endothéliales
disposées sur une matrice de collagène. Les monocytes qui migrent et traversent la barrière
endothéliales se différencient en DC et ce, en l’absence de cytokines exogènes, des facteurs tels que
le GM-CSF pouvant être sécrétés par les cellules endothéliales37. Pendant des années l’existence in
vivo de cette population cellulaire a été remise en question mais des publications récentes ont
depuis mis en évidence ce type de DC dans des modèles murins. Ainsi, le transfert de monocytes
Ly6C+ dans une souris en état inflammatoire conduit à l’apparition d’un type distinct de DC qui n’est
pas retrouvé dans un modèle non-inflammatoire38. Plus récemment, un travail a montré que des DC
peuvent être recrutées à partir de monocytes circulant via la présence de LPS ou de bactéries, migrer
dans les nœuds lymphatiques et être capable de présenter des antigènes conduisant à l’activation de
cellules T spécifiques39. La différenciation est également possible à partir de cellules souches
hématopoïétiques CD34+2.
L’absence de GM-CSF lors de la différenciation des monocytes conduit à des cellules
phénotypiquement et fonctionnellement différentes, ces cellules étant CD1adimCD83+, moins
efficaces pour produire de l’IL-12 après une stimulation par le LPS et induisant moins de cellules T
productrice d’IFN-γ lors d’une réaction lymphocytaire mixte (MLR)40.
L’IL-13 peut aussi être utilisée en remplacement de l’IL-4 lors de la différenciation des monocytes, les
deux cytokines partageant une sous-unité commune au niveau de leur récepteur (IL-4Rα) et la
signalisation étant elle aussi commune via l’activation de STAT6. Les moDC obtenues présentent les
mêmes caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles41 et sont capables d’induire une réponse
cytotoxique par les lymphocytes T similaire42.
17
L’ajout d’autres facteurs que les cytokines GM-CSF et IL-4/13 pendant la période de différenciation
conduit à des phénotypes de cellules dendritiques différents de celui des moDC. Ainsi l’ajout d’IL-6
dans les cultures de monocytes en différenciation va orienter les cellules vers un phénotype plus
macrophagique43 CD14+CD1a-. Cette cytokine induit des effets similaires quand les DC sont obtenues
à partir de cellules souches CD34+ et in vivo dans des cellules isolées de patients atteints de myélome
multiple44. L’environnement lipidique peut aussi jouer un rôle dans le phénomène puisque certains
lipides en induisant le facteur de transcription PPAR-γ (peroxysome proliferator-activated receptor
gamma) inhibent les capacités fonctionnelles des DC obtenues, notamment l’activation de cellules
T45. De plus, certains facteurs comme le TNF-α ou le TGF-β permettent d’induire d’autres types de DC
telles que des cellules de Langerhans.
Figure 3 : Modèles de culture utilisés pour l’étude des DC in vitro. Les modèles utilisant les cellules souches
+
2
CD34 ou les monocytes sont les plus courants . GM-CSF, granulocyte-macrophages colony-stimulating factor;
TNF-α, Tumor necrosis factor-α
c. Signalisation de la différenciation des moDC
Comme décrit précédemment la différenciation des monocytes en moDC nécessite la présence de
GM-CSF et d’IL-4/13 lors de la culture.
En plus de la différenciation de monocytes en DC le GM-CSF est une cytokine jouant de nombreux
rôle dans la réponse immunitaire, son absence chez l’homme entrainant notamment des protéinoses
dues à un manque de phagocytose par les neutrophiles pulmonaires46. Plus récemment, le GM-CSF à
été montré comme étant un facteur sécrété par les cellules T CD4+ TH1 et TH17 lors d’encéphalite
autoimmune expérimentale (EAE) responsable de la pathogénicité et de la neuro-inflammation et
18
donc de leur action délétère sur l’organisme47. La signalisation de cette cytokine passe par la fixation
à un récepteur de surface qui est constitué de deux sous-unités : la chaîne β (CD131) commune avec
les récepteurs à l’IL-3 et à l’IL-5 et la chaîne α (CD116) propre au GM-CSF. Lorsque la cytokine se fixe
au récepteur, il y a recrutement de JAK2 (Janus Kinase) qui est capable de phosphoryler la chaîne β
du récepteur et induire la voie de signalisation des MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) qui va
activer notamment le facteur de transcription c-fos. JAK2 est également capable de phosphoryler une
protéine nommé STAT5 (Signal Transducer and Activator of Transcription) qui va alors se dimériser et
transloquer au niveau du noyau ou elle pourra jouer son rôle de facteur de transcription induisant
notamment d’autres facteurs de transcriptions tels que PU-1 ou c-myc48.
48
Figure 4 : Récepteur et signalisation GM-CSF .
L’IL-4 possède aussi différentes fonctions en plus de son rôle lors de la différenciation des
monocytes. Elle est très importante dans l’induction de cellules T CD4 capables de produire des
cytokines dites TH2 telles que l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 ou l’IL-13. Nous reviendrons plus en détail par la
suite sur la polarisation des cellules T naïves dans le chapitre consacré à ce phénomène. L’IL-4 est
aussi capable de contrôler le changement de classe d’immunoglobulines produites par les
lymphocytes B en permettant la production d’IgE et d’IgG4, ces Ig étant essentielles pour la réponse
antiparasitaire49. Le récepteur de cette cytokine est constitué de deux sous-unités : une chaîne γ
partagée par de nombreuses cytokines et une chaîne α spécifique (CD124). La fixation de l’IL-4 à son
récepteur va induire le recrutement de JAK1 et JAK3 qui vont alors phosphoryler la chaine α du
récepteur conduisant à la signalisation MAPK ainsi qu’à l’homo-dimérisation de STAT6 qui peut être
transloquer dans le noyau et permet la transcription de gènes cibles49.
19
d. Rôle des SOCS : inhibition des signalisations cytokiniques
Il existe des mécanismes cellulaires intrinsèques capables d’inhiber les différentes signalisations
induites par les cytokines. Le plus connu de ces mécanismes passe par l’action des protéines SOCS
(Suppressor Of Cytokines Signaling) qui exercent un rétrocontrôle négatif sur l’activation des
molécules JAK et STAT en étant induites par les cytokines elles-mêmes
50
. Il existe 8 membres
appartenant à la famille des SOCS : SOCS1 à 7 et CIS qui possèdent tous une boîte SOCS nécessaire à
leurs activités notamment la dégradation via l’ubiquitinylation51. En plus de cette inhibition par
dégradation du complexe de signalisation, les SOCS, notamment SOCS1 et 3 qui ont été les plus
étudiés, agissent via leur domaine KIR (Kinase Inhibitory region) qui joue le rôle de substrat pour les
JAK et inhibe les phosphorylations du récepteur ou des STAT en aval. Pour cela SOCS à besoin de se
fixer soit directement au récepteur des cytokines soit aux JAK une fois celles-ci activées50.
Dernièrement, une étude a montré que la spécificité d’action de SOCS3 pour certaines cytokines était
due à la fixation de cette molécule à la fois sur JAK et sur le récepteur, SOCS3 pouvant ainsi inhiber la
signalisation IL-6 mais pas la signalisation IFN-γ malgré une similitude au niveau des JAK impliquées
dans ces deux voies52.
Figure 5 : Fonction des protéines SOCS. Les molécules SOCS se fixent sur le récepteur de cytokines ou aux
50
molécules JAK et inhibent les voies de signalisations induites par le ligand. D’après .
L’étude récente des SOCS a permis de mettre en évidence leur rôle à plusieurs niveaux de la réponse
immunitaire. SOCS1 est ainsi capable d’inhiber la signalisation IFN-γ in vivo en se fixant directement
sur le récepteur à l’IFN-γ dans les lymphocytes T CD4+ ou CD8+53. L’expression de ces molécules dans
les T CD4+ naïfs leurs confèrent la possibilité d’orienter la polarisation des lymphocytes en inhibant
les signalisations opposées à l’orientation initiale de ces cellules. Dans les DC, SOCS2 est capable
d’inhiber en partie la maturation induite par le LPS en inhibant les voies MyD88 dépendante et
20
indépendante lors de l’activation du TLR454, indiquant que les SOCS sont capables d’inhiber d’autres
voies que les signalisations JAK-STAT. Les capacités de polarisation vers la voie TH1 des DC inactivées
pour le gène SOCS1 sont augmentées, le rétrocontrôle négatif n’étant plus assuré55. Deux études ont
aussi mis en évidence l’implication de SOCS1 et SOCS3 lors de la différenciation des monocytes en
DC. L’ajout de CCL11 dans les cultures induit l’expression des SOCS qui en retour inhibent la
phosphorylation de STAT556. Des résultats similaires sont retrouvés lorsque du LPS est ajouté lors de
la différenciation, mais ne passant que par l’augmentation de l’expression de SOCS157. Aucun lien
n’est en revanche établi quand à l’implication de l’inhibition de la phosphorylation de STAT5 (donc
d’une partie de la signalisation induite par le GM-CSF) et le phénotype de surface ou fonctionnel des
moDC obtenues, celles-ci étant CD1a- et moins efficaces pour induire la prolifération de cellules T
allogéniques lors de MLR57.
B. Fonctions
Les différents types de DC ayant des rôles distincts dans la réponse immunitaire, nous nous
contenterons de décrire rapidement le rôle des pDC et, de façon plus approfondie, celui des DC dites
conventionnelles et des moDC.
1. pDC
Les pDC jouent un rôle particulier au sein de la réponse immune puisqu’elles sont très peu efficaces
pour la présentation d’antigène et l’activation de cellules T mais sont en revanche des médiateurs
importants pour la détection et le contrôle d’infections virales via notamment la sécrétion d’IFN de
type 158. Pour ce faire, les pDC disposent (tout comme les cDC) d’un grand nombre de récepteurs
capable de détecter la présence de molécules virales ou bactériennes et de déclencher une
signalisation aboutissant à la sécrétion de cytokines. Ces récepteurs sont appelés Toll Like Receptor
(TLR) et peuvent être membranaires de surface (TLR1, 2, 4, 5, 6, 10) ou situés au niveau des
endosomes (TLR3,7,8,9), les plus importants pour les pDC et la reconnaissance virales étant les TLR3,
7, 8 et 9 qui détectent des acides nucléiques58. La signalisation en aval est majoritairement MyD88
dépendante59 exceptée pour le TLR3 qui est exclusivement dépendant du facteur TRIF60. L’activation
de ces signalisations conduit à l’activation des facteurs de transcriptions IRF3/7, NF-κB, ainsi que des
MAPKs qui vont par la suite entrainer la transcription des gènes codants pour l’IFN-α/β, l’IL-6, le TNF
ainsi que certaines molécules de co-stimulation telles que CD80/8658.
Les pDC sont donc des cellules capables de produire une grande quantité d’IFN de type 1 très
rapidement suite à la reconnaissance de composés viraux. Elles sont même les plus importantes
21
cellules productrices parmi les cellules sanguines humaines61. En plus de leur action directe antivirale
via cette production d’IFN, ces cellules vont avoir un rôle dans l’activation de nombreuses cellules de
l’immunité innée et adaptative telles que les moDC, NK, T et B par leur production d’autres cytokines
pro-inflammatoires. Ainsi, elles sont capables de faire maturer des moDC via l’expression de CD40L
lors d’infection par HSV62 et permettent la mise en place d’une réponse T dirigée contre le virus.
Enfin même si leurs capacités de présentation sont réduites, des études ont montrées qu’elles
étaient capables de cross-présenter des antigènes viraux de façon efficace chez la souris63 et
« primer » des cellules T CD8+ naïves après avoir été activées par des ligands de TLR64.
Figure 6 : Famille des TLR humain. Les TLR 3,7,8 et 9 permettent la reconnaissance d’acide nucléique et sont
58
essentiels pour la réponse anti-virale .
2. DC conventionnelles et moDC
Les cDC ont un rôle pivot dans la réponse immunitaire puisqu’elles sont essentielles à la mise en
place de la réponse adaptative mais ont aussi un rôle dans la stimulation des cellules de la réponse
innée. La fonction principale des cDC est appelée la présentation d’antigène. Elle consiste en
l’internalisation (phagocytose, endocytose…) d’antigènes, leurs dégradations et leurs présentations
via les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) aux lymphocytes T (LT) CD4 et CD8
afin de les stimuler et de les orienter vers une réponse spécifique. Pour cela la DC a besoin d’être
activée via des signaux de dangers ou des cytokines pro-inflammatoires, processus appelé
maturation, qui leur permet de stimuler beaucoup plus efficacement les LT.
22
a. Capture de l’antigène
La capture des antigènes par les DC est particulièrement efficace lors de leur stade immature et peut
se faire par deux mécanismes distincts : l’endocytose et la phagocytose.
Pour ce qui est de l’endocytose, les DC expriment de nombreux récepteurs à leur surface capables
d’induire ce phénomène. Ces récepteurs sont différents selon l’espèce et le type de DC observées.
Chez l’homme, les moDC expriment les récepteurs pour la partie constante des immunoglobulines
(FcR) FcγRII (CD32) et FcαR (CD89)65. Les moDC expriment aussi les récepteurs aux compléments CR3
et CR4 qui permettent l’endocytose, l’activation de CR3 pouvant moduler la réponse des DC en les
rendant plus tolérogènes66. On retrouve aussi la présence d’au moins un récepteur scavenger (CD36)
qui reconnait les lipoprotéines de faibles densités (LDL) et permettent l’internalisation des corps
apoptotiques67. Un autre récepteur scavenger de type A (SRA) a été identifié (CD204) sur différents
types de DC68. En plus de leur rôle dans l’endocytose et la présentation d’antigènes classique, certain
de ces récepteurs ont un rôle dans l’activation des DC et peuvent induire de la présentation croisée
dans des modèles d’infections virales69.
La classe des Lectine de type C qui reconnait des résidus carbohydrates est présente sur les DC
humaines même si leur mode d’action est plus documenté dans le modèle murin. DEC-205 permet
ainsi l’internalisation et la présentation de protéines du VIH aux LT CD8+70. Plus récemment, un
nouveau récepteur (CLEC9A) a été identifié sur les DC CD8α+ murines. Il permet l’endocytose de
corps nécrotiques et il est intéressant de noter que son inhibition n’altère pas l’internalisation de ces
corps mais seulement la présentation croisée qui en résulte71, ce mécanisme s’effectue donc
préférentiellement via certain type de récepteurs. Chez l’homme CLEC9A est aussi responsable de
présentation croisée et on le retrouve exprimé par les DC circulantes BDCA3 positives72.
D’autres lectines telles que DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM3-grabbing nonintegrin) sont
exprimées par les DC mais sont plus impliquées dans des phénomènes d’adhésions en plus de
l’internalisation. Certain pathogènes pouvant tirer profit de ces molécules pour être transportés par
les DC et être transmis à des cellules plus permissives. C’est le cas pour le VIH73 pour lequel gp120 se
lie à DC-SIGN et permet au virion d’être amené jusqu’aux nœuds lymphatiques secondaire mais aussi
pour le CMV74, auquel cas, en plus de faciliter l’infection de la DC, cela facilite l’infection d’autres
cellules. L’expression de DC-SIGN soluble est aussi un facilitateur de l’infection des DC par le CMV75.
La phagocytose par les DC permet l’internalisation de presque tous les types bactériens GRAM+ ou
GRAM-, des levures ainsi que certains parasites76. Elle permet aussi la capture des corps
apoptotiques et nécrotiques via notamment le récepteur scavenger CD36 et les intégrines αvβ5 et
αvβ3 ce qui permet par la suite la présentation classique et croisée des antigènes phagocytés77.
23
b. Maturation
Une fois les antigènes capturés par la cellule, celle-ci doit être capable de les présenter aux cellules
d’intérêts que sont les lymphocytes T. Pour cela la DC doit maturer suite à la reconnaissance de
différents signaux, ce qui a pour effet de diminuer ses capacités de phagocytose, permettre la
migration de la périphérie vers les organes lymphoïdes drainant et augmenter fortement les
capacités de présentation d’antigènes et de stimulation des cellules T. La capture d’antigènes en
absence de maturation conduit à un rôle tolérogène des DC qui vont alors induire une anergie de la
réponse T. Les antigènes capturés étant principalement du soi, ce mécanisme permet d’éviter les
activations auto-immunes.
Les signaux permettant la maturation des DC peuvent être de deux types : la reconnaissance directe
des pathogènes ou de composés produits par les pathogènes (PAMP pour pathogen-associated
molecular pattern) via les TLR ou indirecte de signaux infectieux tels que des cytokines proinflammatoires, des molécules émises par des cellules apoptotiques ou nécrotiques ainsi qu’une
réponse immunitaire déjà présente contre un pathogène78.
Les voies de signalisations qui permettent la maturation des DC sont assez classiques puisque
l’activation des TLR va induire les voies dépendantes et indépendantes de MyD88 conduisant aux
MAPK ou à NF-κB ainsi qu’aux IRF (Interferon Regulatory Factor) selon le TLR impliqué. Les autres
voies d’activation telles que le couple CD40/CD40L, le TNF-α ou encore certain récepteur Fc vont
aussi pour la plupart induire les MAPK et NF-κB76.
La maturation des DC induit plusieurs changements, notamment au niveau de leur comportement
migratoire régulé par l’expression à leur surface de récepteurs aux chimiokines. Ainsi les DC vont
perdre leur capacité à répondre à la chimiokine MIP-3α dont le gradient est présent sur le site
inflammatoire et acquérir l’expression du récepteur CCR7 à leur surface79, CCR7 permettant aux
cellules de répondre à MIP-3β dont le gradient permet leur recrutement au niveau des nœuds
lymphatiques80. Les cellules T naïves exprimant elles aussi CCR781 cela permet le rapprochement des
deux types cellulaires et ainsi favoriser la présentation d’antigènes.
L’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe 2 (CMH-II) est aussi modifiée par la
maturation. Dans les cellules immatures le CMH-II est accumulé dans des compartiments
intracellulaires. La maturation favorise la fixation des antigènes sur le CMH et ainsi l’export du
complexe CMH/peptide à la surface avec une demi-vie beaucoup plus importante82. En plus du CMH
la cellule mature va exprimer certaines molécules de co-stimulation des lymphocytes T telles que
CD80/86 ainsi que CD40 qui lui permet de recevoir un signal stimulateur en retour. Des cytokines
pro-inflammatoires ou polarisantes sont aussi sécrétées par les DC matures pour orienter la réponse
24
immunitaire T. Le type de cytokines produites étant dépendante du signal stimulateur reçu par la DC
lors de sa maturation82.
Figure 7 : Représentation schématique de la maturation des DC. Les DC immatures sont capables de
reconnaître des signaux de danger et de subir une maturation qui les rend plus efficaces pour présenter des
antigènes et activer les lymphocytes T. Les DC immatures conduisent à une voie tolérogénique et une anergie
83
des lymphocytes T, inhibant ainsi la réponse immunitaire contre les antigènes présentés .
c. Présentation d’antigènes
La cellule dendritique est capable de présenter des antigènes via son CMH-I et son CMH-II, les
premiers permettant l’activation des LT CD8+ et les seconds des LT CD4+. Les deux voies
d’apprêtements d’antigènes sont différentes, une étant issue d’antigènes intracellulaire (CMH-I) et
l’autre d’antigènes extracellulaire (CMH-II). Les DC ont par ailleurs la caractéristique de pouvoir
présenter des antigènes exogènes sur leur CMH-I, ce mécanisme est appelé présentation croisée et
est essentiel pour répondre efficacement aux différents pathogènes, en particulier intracellulaires.
25
Apprêtement de l’antigène et présentation par le CMH-I : lors de la présentation classique les
protéines destinées à la dégradation sont ubiquitinilées et sont orientées vers le protéasome dans
lequel elles seront clivées. L’IFN-γ induit un remplacement de certaines sous-unités du protéasome
devenant ainsi l’immuno-protéasome, plus efficace pour la formation de peptides de 8 à 10 acides
aminés84, facilement présentables par le CMH-I. Les peptides formés vont entrer en contact au
niveau du réticulum endoplasmique (RE) avec les complexes composés des chaînes lourdes du CMH-I
et des β2-microglobulines, le passage des peptides du cytosol vers le RE se faisant via les molécules
de transport TAP situées à la surface membranaire de celui-ci. Les peptides peuvent encore subir
d’autres dégradations par des amino-peptidases présentes dans la lumière du RE comme ERAP85
avant d’être chargés sur le complexe CMH-I avec l’aide des protéines chaperonnes calnexine,
calreticuline, tapasine et ERp57, certaines étant nécessaire à la bonne conformation du CMH. Une
fois le complexe CMH/β2-microglobuline/peptide formé il est disponible pour être présenté à la
surface cellulaire et être reconnu par le récepteur T (TCR) présent sur les lymphocytes T CD8+86.
Figure 8 : Voies de d’apprêtement et de présentation d’antigènes par les DC. En plus des voies classiques
(molécules endogènes : CMH-I ; molécules exogènes : CMH-II), la DC peut présenter des antigènes exogènes
sur son CMH-I. Ce mécanisme de présentation croisée peut être dépendant ou indépendant des transporteurs
87
TAP .
En plus de présenter des antigènes endogènes la DC peut effectuer de la présentation croisée
d’antigènes extracellulaires processus mis en évidence depuis de nombreuses années88. Ce
mécanisme exclusif aux DC permet, même si le pathogène ne cible pas les DC, de présenter après
26
phagocytose de cellules infectées les antigènes nécessaires à la mise en place de la réponse
immunitaire. De plus certains pathogènes capable d’infecter les DC inhibent principalement le
système de présentation par le CMH-I pour échapper à la reconnaissance. La présentation croisée
par des DC non-infectés passe outre ces restrictions et permet de monter une réponse immune
efficace89. Ce mécanisme est très étudié dans le modèle murin dans lequel on retrouve des souspopulations de DC exprimant CD8α ou CD103 qui sont particulièrement efficaces pour ce mode
présentation3. Chez l’homme les cellules équivalentes sont les DC CD141+ (BDCA-3) qui expriment
aussi à leur surface le récepteur aux chimiokines XCR190, ce marqueur étant aussi retrouvé sur les
cellules CD8α murines. Les moDC sont aussi capable de présentation croisée pour permettre la mise
en place d’une réponse dirigée contre de nombreux virus et notamment contre le cytomégalovirus
humain (HCMV)91. L’apprêtement des antigènes lors de cette présentation est encore mal connu
mais plusieurs voies ont été identifiées. Après phagocytose via les récepteurs de surfaces favorisant
la présentation croisée décrit dans la section capture de l’antigène (FcR, les récepteurs aux lectines
de type C tel que CLEC9A, CLEC7A, DC-SIGN, DEC-205 ou encore le récepteur au mannose 1), les
protéines sont dégradées par les lysosomes ou le protéasome et les peptides sont ensuite chargés
sur le CMH-I de façon TAP-dépendante ou TAP-indépendante92. La protéine sec22b semble
nécessaire au transfert des antigènes du RE ou de vacuoles vers les phagosomes ainsi qu’à l’export
des antigènes vers le cytosol. Ce mécanisme est essentiel pour la présentation croisée d’antigènes
dans un modèle d’infection par le parasite Toxoplasma Gondii dans lequel des DC phagocytent des
cellules infectées93. Récemment une étude à montré que des DC cultivées en présence d’IFN-α
avaient des capacités de présentation croisée augmentées94, la modulation de l’activité des DC étant
importante pour la mise au point de protocoles vaccinaux.
Apprêtement de l’antigène et présentation par le CMH-II : Contrairement au CMH-I où il a lieu au
niveau du RE, le chargement de l’antigène sur le CMH-II s’effectue dans le compartiment
endocytique. En effet même si le complexe CMH-II chaîne α/β transit par le RE il est alors associé à la
chaîne Ii qui empêche la fixation des peptides. Lorsque le CMH-II change de compartiment, la chaîne
Ii est dégradée par des enzymes de types cathepsines, puis le peptide CLIP restant est enlevé grâce à
la molécule HLA-DM. Le peptide peut alors se fixer sur le CMH-II et le complexe est exporté à la
surface cellulaire pour être reconnu par le TCR des lymphocytes T CD4+. Les antigènes associés au
CMH-II sont dégradés eux aussi dans le compartiment endocytique par des amino-peptidase de types
cathepsines pour donner des peptides d’une quinzaine d’acides-aminés capable de se fixer à la poche
du CMH-II. Ce mécanisme permet donc de présenter en majorité des antigènes exogènes76. Comme
décrit précédemment la maturation des DC va modifier l’expression du CMH-II à leur surface. Ce
mécanisme est principalement dû au comportement des protéases permettant la dégradation de la
27
chaîne Ii. Ainsi les cathepsines B ou S impliquées sont moins efficaces dans les DC immatures, cette
activité étant inverse à celle des cystatines C, l’inhibiteur des cathepsines S. la maturation va induire
une acidification de certains compartiments ce qui permet un changement d’activité des enzymes et
le clivage de la chaîne Ii pour ensuite favoriser la fixation des peptides sur le CMH95.
Une fois les complexe CMH/peptides présents à la surface des DC matures, les cellules T, via leur
reconnaissance par le TCR, vont s’activer et conduire à une réponse immunitaire adaptative.
d. « Priming », « priming » croisé et stimulation des lymphocytes T
Les DC sont quasiment les seules cellules du système immunitaire à pouvoir « primer » les cellules T
naïves CD4+ ou CD8+, c'est-à-dire activer ces cellules pour initier une réponse adaptative. Des
injections de DC chargées avec des antigènes spécifiques peuvent induire une réponse protectrice in
vivo chez la souris dans différents modèles notamment lors de l’immunité anti-tumorale96. De
nombreux protocoles sont par ailleurs mis en place utilisant des DC modifiées ou non pour induire
une réponse immune anti-infectieuse97 ou anti-tumorale98. Une étude très récente à mis évidence
que le ciblage de TLR et de lectine via des nanoparticules recouvertes de ligand TLR3/7/8 et des
anticorps dirigé contre DC-SIGN augmente de 100 fois la capacité de ces DC à stimuler des cellules T
CD8+99.
Figure 9 : Ciblage des DC par des nanoparticules contenant des antigènes dominant, des ligands de TLR et des
anticorps dirigés contre la molécule DC-SIGN. Ce processus permet d’augmenter considérablement l’efficacité
+
100
des DC pour la stimulation de lymphocytes T CD8 anti-tumoraux . PLGA, poly (lactic-poglycolic) acid.
Pour être « primée », la cellule T a besoin de recevoir différents signaux provenant de la DC ou de
son environnement. Le signal 1 est constitué par la liaison du TCR ainsi que des molécules CD4/CD8
au CMH correspondant qui présente l’antigène spécifique du lymphocyte. Le deuxième signal est
28
apporté par les molécules de co-stimulation (CD80/CD86…) à la surface des DC qui ont subie la
maturation. Ces molécules vont se lier à la fois à CD28 pour provoquer une activation de la cellule T
et à CTLA-4 pour induire son inhibition. L’expression de CD28 et CTLA-4 sur les LT est séquentielle
pour permettre une bonne régulation de la réponse immunitaire. Enfin le signal 3 est constitué par
les cytokines produites par la DC ou par d’autres cellules du micro-environnement. Certaines de ces
cytokines vont avoir un effet prolifératif sur les LT. Il est connu depuis longtemps que l’IL-2 est
capable d’induire cette prolifération mais ce n’est que plus récemment que le mécanisme à été
identifié. Durant la phase précoce du « priming », les LT ne possèdent par le récepteur de haute
affinité pour l’IL-2 (CD25, chaîne β et γ) et ne peuvent donc pas répondre efficacement à cette
cytokine. C’est en fait la sous-unité CD25 présente sur les DC qui via une action en trans,
complémente les autres sous-unités présente sur les LT et permet une signalisation IL-2 efficace101.
CD25 est ensuite exprimé par les LT pour maintenir la transmission du signal.
D’autres cytokines vont participer au phénomène de polarisation vers les différentes voies de
différenciations possibles pour les LT CD4+, c’est le cas de l’IL-12, IL-4, IL-6, IL-10, ou encore le TGFβ102.
Figure 10 : Signaux nécessaires pour l’activation de lymphocytes T naifs. La DC transmet trois signaux aux LT : le
signal 1 est envoyé lors de la liaison du TCR avec le CMH, le signal 2 est dû à la co-stimulation des lymphocytes
T par CD80/CD86 en se liant à CD28 et enfin le signal 3 est représenté par les cytokines sécrétées par la DC qui
102
orientent la réponse obtenue .
Au mécanisme de présentation croisée est associé celui de « priming » croisé qui consiste à stimuler
des LT CD8+ par des DC présentant des antigènes exogènes sur leur CMH-I, mécanisme décrit par
29
Bevan et al88. Depuis il a été mis en évidence que ce phénomène est présent dans de nombreuses
réponses immunitaires qu’elles soient anti-tumorales ou dirigées contre des pathogènes103. La
particularité de ce priming croisée est la nécessité d’avoir la présence de LT CD4+ helper (TH) pour
l’activation de LT CD8+104. La DC semble avoir besoin d’un contact avec un LTH pour être capable
d’une stimulation efficace. Ce mécanisme permet d’éviter les phénomènes d’auto-immunité puisqu’il
nécessite la reconnaissance d’un même antigène par deux types de cellules T qui ont été
sélectionnés négativement dans le thymus pour limiter l’auto-réactivité92. Les DC qui ont été mises
en contact avec des lymphocytes TH conservent toutefois leur capacité d’activation des T CD8+ une
fois transférées dans une souris naïve105. Cette capacité semblant être associée à l’activation de la DC
par la liaison CD40/CD40L106.
En plus de leur rôle dans la tolérance centrale (délétion des cellules T auto-réactives) les DC peuvent
induire une tolérance périphérique. En effet la présentation d’antigènes aux cellules T en absence de
signaux de maturation conduit à une inhibition de ces cellules107. Cela permet lors de la présentation
d’antigène du soi d’éviter la mise en place de réponses auto-réactives délétères pour l’organisme. De
la même façon des antigènes du soi peuvent être subir la présentation croisée et induire une
tolérance croisée108.
+
Figure 11 : Mécanismes moléculaires mis en jeu pour le priming croisé de lymphocyte T CD8 par les DC. Après
capture d’antigènes exogènes, ceux-ci sont présentés sur le CMH-I et reconnus par le TCR d’un lymphocyte T
+
+
CD8 spécifique. La présence au même moment d’un lymphocyte T CD4 spécifique du même antigène n’est
+
pas nécessaire, les DC conservant la capacité de stimuler des lymphocytes T CD8 après avoir rencontrées les
+
92
lymphocytes T CD4 « helper ». D’après .
30
e. Polarisation des lymphocytes T
Suite à leur rencontre avec leur antigène spécifique, les LT CD4+ naïfs vont subir un mécanisme dit de
polarisation. Ce mécanisme dépend essentiellement des cytokines produites par les DC qui sont elles
même dépendantes du types de signaux qui les aura fait maturer. Deux voies sont connues depuis
longtemps : TH1 et TH2102. D’autres ont été découvertes plus récemment telles que les Treg109, les
TH17110 ou encore les TH22111. Les différents types de polarisations permettant de répondre à
différents types de menaces. Les TH1 sont essentielles à la réponse anti-virale et bactérienne, les TH2
aux réponses anti-parasitaires, les Treg à réguler les mécanismes d’auto-immunité et contrôler les
autres réponses102. Les TH17, d’abord identifiés dans les phénomènes d’auto-immunité112, ont ensuite
été mis en évidence dans certaines réponses contre des pathogènes113. Enfin les TH22 présents au
niveau des épithéliums permettent de faciliter les réponses innées locales et la protection
tissulaire114.
Chaque population de TH est induite par des cytokines différentes, possède des voies de
signalisations, des facteurs de transcriptions ainsi que des profils de sécrétions de cytokines distincts.
De plus les voies sont exclusives et il existe des régulations négatives entre elles pour inhiber les
autres réponses115. Pour ce qui est des Treg, ils sont induits par des DC immatures ou matures
produisant de l’IL-10 ou du TGF-β. Ces cytokines permettent l’expression du facteur de transcription
FoxP3116, celui-ci étant caractéristique des Treg et nécessaire à leur activité régulatrice117. Les autres
voies sont détaillées dans le schéma suivant. La polarisation TH17 présentée dans le schéma est
valable pour les LT CD4+ murins. Chez l’homme la différenciation en TH17 peut être induite par les
cytokines IL-1β, IL-6 et IL-23118. Plus récemment la possibilité d’obtenir ces cellules par ajout d’IL-21
et de TGF-β a aussi été démontrée119.
31
Figure 12 : Polarisation des lymphocytes T naïfs en TH1, TH2 et TH17. La différenciation vers la voie TH1 se fait en
présence d’IL-12 qui augmente la sécrétion d’IFN-γ via STAT4. L’IFN-γ signalise par STAT1 et induit le facteur de
transcription T-bet, spécifique des lymphocytes TH1. La voie TH2 est activée par la présence d’IL-4 ou par la
liaison OX40/OX40L. L’IL-4 signalise par STAT6 qui induit le facteur de transcription GATA3 spécifique des
lymphocytes TH2. Enfin, la voie TH17 est induite par l’action conjointe de l’IL-6 qui active le facteur de
transcription RORγt et du TGF-β. Cette voie est inhibée par les différenciations TH1 et TH2. L’IL-23 est nécessaire
115
au maintient du lignage .
32
LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN
33
A. Généralités
1. Historique
Dès la fin du 19e siècle, des cellules cytomégaliques sont détectées au niveau des glandes salivaires,
du foie, des poumons, des reins et de la thyroide d’enfants morts-nés et décrites par Ribbert,
Jesionek et Kiolemenoglou. La maladie est alors appelée « maladie des inclusions cytomégaliques ».
Au début des années 1950 un premier diagnostic est mis en place avec la recherche d’inclusions
caractéristiques dans les urines des patients. L’étiologie virale est alors prédite basée sur la détection
de particules d’approximativement 100 nm dans les prélèvements. Le virus est isolé
indépendamment par Weller, Smith et Rowe en 1956-1957, Smith ayant auparavant déjà réussi à
isoler le virus murin dans les glandes salivaires de souris. Weller désigne alors cet agent infectieux
par le terme de « cytomégalovirus » dû à la morphologie caractéristique des cellules infectées. Au
début des années 1970, le lien entre l’infection trans-placentaire et les séquelles neurologiques chez
le nouveau-né est établi, de même que la relation entre immuno-suppression et réactivation virale. A
l’heure actuelle, le virus reste un problème de santé publique lors de la grossesse ou chez les
personnes ayant un système immunitaire déficient.
2. Classification
Le cytomégalovirus appartient à la famille des Herpesviridae qui est composée de 3 sous-familles : α-,
β- et γ-herpesvirinae. Le CMV est un β-herpesvirinae, sous-famille qui montre le plus grand degré
d’évolution et de divergence génétique. Ce sont des virus à ADN double brin enveloppés composés
d’une nucléocapside, d’un tégument et d’une enveloppe. Cette famille est capable d’infections
latentes incluant des épisodes de réactivation. Le tropisme du virus est large mais le spectre d’hôte
très restreint (une seule espèce). Il existe différentes souches selon les espèces, le virus de primate
étant le plus proche de la souche humaine même si des divergences rendent difficiles les
comparaisons directes pour l’étude de la pathogénicité ou du contrôle de la réponse immunitaire de
l’hôte120.
La taille du génome des Betaherpesvirus varie de 145 kilo base (Kb) pour le roséolovirus jusqu’à 241
kb pour le cytomégalovirus, ce génome pouvant coder plus de 166 gènes121. Au niveau de
l’homologie entre espèce, près de 100 gènes du virus primate codent les mêmes protéines que le
virus humain122.
34
123
Figure 13 : Classification de la famille des Herpesvirus humain .
3. Souches virales et tropisme
La propagation et l’amplification virale s’effectuent par passage sur des fibroblastes humains
conduisant à l’apparition de mutations voire de délétion d’une grande partie du génome121. Ces
mutations peuvent affecter le tropisme du virus notamment en limitant l’entrée dans certain types
cellulaires. Ainsi la souche de laboratoire AD169, suite à de nombreux passages pour produire un
virus atténué à but vaccinal, a perdu 19 gènes (UL133 à UL150) en plus de posséder différentes
mutations ponctuelles121 dans d’autres gènes. Certaines mutations notamment présentes sur les
séquences UL128-UL130-UL131A empêchent la bonne fonctionnalité des protéines nécessaires au
tropisme du virus pour les cellules endothéliales ou la lignée hématopoïétique124. Ces trois protéines
s’associent au complexe membranaire de glycoprotéines gH:gL nécessaires à l’attachement et à
l’entrée du virus dans la cellule.
4. Epidémiologie
L’infection par le CMV est répartie parmi la population mondiale avec une séroprévalence pouvant
varier selon les groupes étudiés entre 50% et presque 100%. Dans tous les cas, la prévalence
augmente avec l’âge et l’âge initial d’infection est dépendant du milieu observé. Ainsi dans les pays
sous-développés ou en voie de développement la prévalence est plus importante et l’acquisition du
35
CMV est plus précoce. Dans les pays développés tel que les Etats-Unis ou l’Europe, les conditions
socio-économiques jouent un rôle important avec une prévalence plus importante dans les couches
sociales plus défavorisées et dans les populations non caucasiennes dû à une exposition plus
fréquente au virus. La transmission du virus peut s’effectuer horizontalement, verticalement ou de
façon iatrogène.
a. Transmission horizontale
La transmission s’effectue via un contact direct avec des fluides corporels de personnes infectées
(salive, urine, larmes, sang, sperme, sécrétions cervicales) et ne peut avoir lieu par aérosol. Les deux
types d’expositions les plus importants sont l’activité sexuelle125 et le contact avec des enfants126.
L’infection est plus répandue chez les enfants mis en crèche ainsi qu’au début de la vie sexuelle des
adolescents, le nombre de partenaires sexuels augmentant sensiblement la probabilité d’infection.
b. Transmission verticale
Cette transmission est la plus répandue et permet le maintient de la population virale dans le monde.
Elle peut s’effectuer de façon trans-placentaire au cours de la gestation, lors du passage par les voies
génitales ou encore par le lait maternel. L’infection du fœtus implique une infection pré-existante
chez la mère ou une séroconversion durant la grossesse. De plus une ré-infection peut aussi être à
l’origine d’une transmission au fœtus127. Le taux d’infection lors de la grossesse varie de 0.7% à 4.1%
et le taux de transmission entre 20% et 40%128. Si le virus est présent dans le tractus génital lors de
l’accouchement (dans approximativement 10% des cas lors de séroconversion pendant la grossesse)
le taux de transmission à l’enfant est alors de 50%129. Enfin l’infection mère-enfant la plus fréquente
est due à l’allaitement puisque jusqu’à 39% des enfants allaités pendant plus d’un mois contractent
l’infection130. Environ 1% des nouveau-nés présentent une virurie à CMV dans les pays développés et
il est estimé que 10% des enfants acquièrent l’infection de source maternelle avant 1 an. Ce chiffre
atteint 50% dans les pays en voie de développement.
c. Transmission iatrogène
La dernière voie de transmission est due principalement à l’augmentation de l’activé de
transplantation dans les pays développés, l’organe transplanté pouvant provenir d’un donneur
séropositif. L’immuno-suppression nécessaire au maintien du transplant est aussi responsable de la
réactivation du virus latent. Les risques de réactivations virales et de maladies à CMV suite à la
transplantation sont encore plus importants lorsque le donneur est séropositif et le receveur
séronégatif (D+/R-)131.
36
5. Clinique
Les signes cliniques ainsi que les organes touchés lors de maladies à CMV sont variables et
dépendent en partie de l’état immunitaire du patient. L’infection chez les personnes
immunocompétentes est majoritairement asymptomatique (90% des cas) avec parfois quelques
syndromes fébriles mais, dans de rares cas, les maladies associées peuvent être beaucoup plus
sérieuses. Lors de la grossesse, le CMV est responsable de fausse couche ainsi que de complications
neurologiques chez le fœtus ou le nouveau-né. Enfin les risques les plus importants sont retrouvés
chez les personnes immunodéficientes, que cette immunodéficience soit induites par des
pathogènes (VIH) ou des traitements immuno-suppresseurs (cancer, transplantation).
a. Personnes immuno-compétentes
L’infection peut être responsable de mononucléoses. Environ 8% de ces pathologies sont induites par
le CMV dans le monde132. Des cas très rare présentent des atteintes généralisées multi-organes avec
des neuropathies, encéphalites myocardites, rétinites et des atteintes d’organes viscéraux133.
b. Infections congénitales
L’infection in utero peut être symptomatique (10% des cas) ou non. Les symptômes chez les
nouveau-nés sont principalement neurologiques suite à des atteintes développementales. On
retrouve des microcéphalies, atrophies corticales, lissencéphalies et une perte de l’audition. Celle-ci
peut aussi apparaître plus tard au cours la vie de l’enfant (15% des enfants asymptomatiques à la
naissance développent une surdité) ce qui rend difficile le suivi des maladies à CMV133.
c. Personnes immuno-déficientes
Le CMV est encore aujourd’hui un problème très important chez les personnes possédant un
système immunitaire déficient. On distingue les personnes ayant subie une transplantation des
personnes immuno-supprimés à cause d’une infection par le VIH. Dans le cas de transplantation,
l’infection cause principalement des syndromes fébriles aigues ainsi que des atteintes d’organes
telles que pneumopathies, hépatites, pancréatites, myocardites, rétinites, lésion gastro-intestinales
et plus rarement, des encéphalites. L’utilisation d’un greffon provenant d’une personne séropositive
chez un receveur séronégatif (D+/R-) est un facteur de risque supplémentaire. Des traitements ont
ainsi été mis en place qui peuvent être soit prophylaxiques131 pour empêcher la réactivation virale
soit préemptifs dès l’apparition d’une virémie chez le patient.
L’infection ou la réactivation chez les patients atteints du VIH est surtout symptomatique lorsque le
taux de CD4 chez le patient est diminué. Une étude montre que 21% des patients développent une
37
maladie à CMV dans les deux ans quand leur taux de CD4 est en dessous de 100/µl contrairement à
10% chez ceux qui ont un taux supérieur à 100/µl134. La majorité des atteintes sont des rétinites,
suivie par des oesophagites, des colites et dans de plus rares cas des encéphalites ou des
neuropathies périphériques.
En plus de ces maladies directement liées à la réplication virale, le CMV semble avoir un effet oncomodulateur. On retrouve une fréquence plus élevée de CMV dans les tissus de tumeurs malignes
telles que les cancers du colon, les gliomes malins, les maladies d’Hodgkin EBV négative135… Les
mécanismes d’immunosuppressions mis en place par le virus lors de l’infection peuvent profiter aux
cellules tumorales pour éviter la reconnaissance par le système immunitaire135. De plus, le virus
induit la sécrétion de molécules qui peuvent favoriser la prolifération de cellules tumorales comme
les protaglandines E2 (PGE2) ou l’IL-6. Dans le cas des medulloblastomes une étude montre que la
majorité des prélèvements sont positifs pour les protéines précoces et tardives du CMV à des degrés
divers. L’implantation de tumeur CMV+ dans des souris est inhibée lors de l’utilisation de Ganciclovir,
un inhibiteur de la réplication virale136.
Enfin le CMV peut aussi avoir un rôle dans l’athérosclérose et le rejet de greffe137 via notamment la
production de facteurs pro-inflammatoires.
6. Traitements
Quatre molécules antivirales sont disponibles actuellement pour lutter contre le CMV : le Ganciclovir,
le Valganciclovir, le Foscarnet et le Cidofovir. En plus de ces molécules, des techniques de transferts
de cellules T CD8+ dirigés contre un épitope viral sont efficaces pour inhiber la réplication du virus133.
a. Molécules antivirales
Le Ganciclovir (ou sa forme orale le Valganciclovir) est la première drogue approuvée pour le
traitement anti-CMV et reste dans la majorité des cas la drogue de première intention. Chez les
transplantés, en plus d’être utilisée de façon préemptive138 (à l’apparition de la virémie), elle peut
être utilisée en prophylaxie pendant 3 mois après la transplantation ou 6 mois dans le cas des D+/R139
. Les comparaisons entre les traitements préemptifs ou prophylaxiques sont toujours en cours
pour mesurer leur efficacité140. Le Ganciclovir est un analogue de guanosine qui à besoin d’être triphosphorylé pour être incorporer dans l’ADN et inhiber la réplication virale. La première
phosphorylation est faite par une kinase virale UL97 ce qui permet de cibler uniquement les cellules
infectées. Malheureusement, l’apparition fréquente de mutations sur la séquence codante UL97
rend le virus résistant à cette molécule141. On peut retrouver aussi des mutations sur UL54, la
polymérase virale, qui rendent également le virus résistant au traitement142.
38
Le Cidofovir est un analogue de cytosine qui à aussi besoin d’être di-phosphorylé pour être actif mais
n’utilise pas de kinase virale pour cela, ce qui lui permet d’être efficace contre les souches présentant
des mutations sur UL97 résistantes au Ganciclovir mais pas contre les souches mutantes UL54. La
spécificité de la molécule est en revanche moins grande133.
Figure 14 : Mécanisme d’action du Ganciclovir. La molécule est phosphorylée une première fois par l’enzyme
virale UL97 puis deux fois par des kinases cellulaires. L’incorporation dans l’ADN inhibe la polymérase virale
UL54. D’après le site internet « http://www.medscape.org/viewarticle/450236_2 »
Le foscarnet quand à lui est un inhibiteur non-nucléosidique. C’est un analogue de pyrophosphate
qui cible directement la polymérase virale en inhibant la libération du pyrophosphate issu de
l’assemblage de deux acides-aminés143. Il est moins sensible aux mutations même si certaines d’entre
elles au niveau de la polymérase virale induisent tout de même des résistances144.
D’autres molécules sont en phases d’essais cliniques avec pour certaines des résultats prometteurs
tel que l’AIC246145 et d’autre qui ne passeront malheureusement pas les phases III d’essais cliniques
tel que le Maribavir146.
b. Transfert adoptif de cellules T
Ce type de traitement très couteux est peu utilisé en France puisqu’il cible principalement les
souches multi-résistantes de virus qui sont peu nombreuses. Des travaux précurseurs ont montré
que le transfert d’un clone de cellules T CD8+ spécifique du virus permet la reconstitution de la
réponse immunitaire cellulaire anti-virale147. Les mécanismes de « priming » des cellules T sont
variables avec notamment l’utilisation de co-cultures de DC avec des lysats viraux148, ou des DC
« pulsées » avec les peptides viraux149. Ce type de traitement est très efficace avec une réduction
39
significative de la virémie CMV après une seule injection d’un mélange de cellule T CD4+ et CD8+
spécifiques150. Plus récemment la mise en place de ce type de thérapie pour les personnes
immunodéprimées s’est concentrée sur le « priming » de cellules T dirigées contre plusieurs
pathogènes simultanément et ainsi permettre à partir d’un seul transfert adoptif de cibler différents
virus151.
Figure 15 : Stratégies d’immunothérapies adoptives contre le CMV. Les LT spécifiques peuvent être enrichis à
l’aide de tétramers ou être stimulés in vitro par des APC exprimant les antigènes viraux (à partir de lysat viral,
123
vecteur recombinant ou peptide synthétique) .
7. Immunisation passive et vaccination
a. Immunisation passive
L’efficacité de l’utilisation d’un pool d’immunoglobulines dirigé contre des épitopes du CMV (CMV-Ig)
à été démontré il y a 25 ans152. Cette étude montre la prévention de l’apparition de maladies à CMV
suite à des transplantations de types D+/R-. D’autres types de transplantations sont aussi concernés
telles que les transplantations hépatiques153. Depuis, ce type de protocole à but prophylaxique est
utilisé en plus des autres molécules antivirales lors des transplantations à risque154. Toutefois les
40
recommandations sont d’utiliser les CMV-Ig toujours associés aux antiviraux même si l’utilisation
seule peut aussi être efficace155.
En plus de leurs utilisations dans des protocoles de transplantation, les CMV-Ig sont aussi employés
pour éviter les transmissions materno-fœtales du virus156. L’efficacité est probablement due à la
réduction de l’inflammation placentaire, la neutralisation du virus par les anticorps ainsi qu’une
inhibition de la production de cytokines induite par la réponse immunitaire157. Récemment,
l’immunisation passive de femmes enceintes primo-infectées a été démontrée comme réduisant les
conséquences pathologiques de l’infection158. L’absence de recherche systématique in utero du virus
dans de nombreux pays sauf en cas d’atteintes graves (visibles par échographie) empêche souvent la
bonne prise en charge de l’infection due à une détection trop tardive159.
b. Vaccination
Des recherches pour la mise au point de vaccin efficace pour limiter la transmission du virus sont en
cours depuis plus de 30 ans mais à ce jour aucun n’est disponible commercialement. La difficulté la
plus importante est la faculté du virus à échapper à la réponse immunitaire quelle soit cellulaire ou
humorale. Il a récemment été montré que le virus est par exemple capable d’échapper à un anticorps
neutralisant en l’incorporant dans le virion lors de l’assemblage160.
La première approche utilisée fut d’atténuer une souche virale Towne en effectuant plus de 125
passages sur des fibroblastes avant de l’injecter à des femmes enceintes pour éviter la transmission
au foetus161. Des essais ont ensuite été réalisés dans le cadre de transplantations notamment
rénales. Ces études montrent que le vaccin induit une immunité via des cellules T CD4+ et CD8+
corrélée avec une réduction du risque de maladies à CMV. En revanche l’infection n’est pas inhibée
et le virus peut toujours entrer en phase de latence162. Des protocoles à base de souches
recombinantes Towne et Toledo ont ensuite été mis au point. Ces études en sont toujours en phase 1
d’essai clinique163 et ne semblent pas induire de toxicité. D’autres stratégies à base de vaccins sousunitaire ont aussi été développées. Il s’agit dans ce cas d’induire une réponse immunitaire en
injectant uniquement un ou plusieurs antigènes donnés comme très immunogènes. Le principal
antigène est la protéine gB (UL55) qui déclenche une forte réponse lors de l’infection naturelle164.
Différentes études sont disponibles soit avec un adjuvant (MF59) soit en co-injection gB/pp65165 pour
améliorer l’immunogénicité. L’injection avec MF59 provoque l’apparition d’anticorps neutralisants
retrouvés lors de l’infection naturelle mais en quantité beaucoup plus faible166. L’étude la plus
récente utilisant ce protocole rapporte un taux de protection de 50% dans une cohorte de 234
patientes comparé au placebo167. L’utilisation d’un vecteur Canary-Pox viral pour permettre
l’expression rapide de plusieurs antigènes (gB/pp65) à aussi été testé. Ces essais montrent une
induction de CTL spécifiques de pp65168 mais très peu d’immunogénicité induite contre l’antigène
41
gB169. Les corps denses (particules virales défectives) du CMV peuvent aussi servir à immuniser des
souris pour induire une réponse cellulaire170. Des études pré-cliniques récentes montrent l’induction
de CTL et d’anticorps neutralisants et ce en l’absence d’adjuvant171, les corps denses pouvant être
modifiés pour exprimer les protéines souhaitées grâce à des techniques de recombinaison en
chromosome bactérien (BAC). De nombreuses autres études sont en cours avec l’utilisation
d’adénovirus ou d’immunisation contre d’autres antigènes mais elles sont toujours en phase précliniques et les résultats ne sont pas probants ou trop préliminaires.
Figure 16 : Stratégies de développement vaccinal dirigées contre le CMV. Les vaccins à base de virus vivant
atténués, sous-unitaire ou recombinant sont les trois branches principales de la vaccination anti-CMV. Des
approches plus récentes comme l’utilisation de corps dense ou de polyépitopes sont aussi en
172
développement .
42
B. Biologie du CMV
1. Structure et composition du virion
Le CMV présente une structure qui est partagée avec les autres Herpesvirus bien que de taille plus
importante puisqu’il mesure entre 200 et 300 nm. Il est constitué d’une nucléocapside (125 nm)
comprenant le génome viral, d’un tégument et d’une enveloppe qui contient diverses protéines
virales.
a. Capside
La capside virale est de forme icosaédrique. Elle est composée essentiellement de la protéine MCP
(Major Capside Protein) codée par le gène UL86. Les faces triangulaires (150) sont constituées par six
MCP qui forment des héxons séparés par des pentons (12) constitués par 5 MCP. Un des penton est
formé uniquement avec des protéines PORT (Portal Protein codé par UL104). Ce penton spécifique
sert à l’encapsidation de l’ADN viral173. De plus on retrouve associées aux MCP des SCP (Smallest
Capsid Protein codé par UL48A) dans un ratio de 1 pour 1. Sur la face interne de la capside, des
triplexes composés de protéines TR1 (Minor Capsid Protein) codé par UL46 et de protéines TR2
(Minor Capsid Protein Binding Protein) codé par UL85 dans un ratio de 1 pour 2, permettent la liaison
entre les héxons et les pentons. En plus de ces cinq protéines virales, une protéine codée par le gène
UL80.5 permet la bonne conformation de la capside lors de l’assemblage et est perdue lors de
l’encapsidation de l’ADN133.
-8
Figure 17 : Virion du CMV. A, Représentation de surface et de la capside de la particule (18.10 m). B, Modèle
3D.
43
b. Tégument
Le tégument est la région intermédiaire située entre la capside et l’enveloppe. Il représente 40% de
la masse totale du virion. Ce compartiment est composé en majorité de protéines virales mais on
peut aussi retrouver des protéines ainsi que des ARN cellulaires. Les protéines qui constituent le
tégument sont majoritairement phosphorylées et très souvent immunogènes173, la phosphorylation
semblant favoriser l’incorporation des protéines dans ce compartiment174. La protéine la plus
présente est pp65 qui est codée par le gène UL83 et qui représente 15% de la masse virale, suivi par
pp71 et pp150. Même si la structure du tégument semble aléatoire, elle est en fait beaucoup plus
construite ce que laisse à penser les images de microscopies électroniques. Des protéines comme
pp150 entrent en contact avec la capside pour établir des liaisons133. pp28, codée par UL99, est elle
en contact avec l’enveloppe par un domaine myristylé et permet la formation des virions enveloppés
à partir des capsides tégumentées133. Globalement les protéines tégumentaires sont séparées en
deux catégories : l’une comprend les protéines nécessaires à l’assemblage ou au désassemblage du
virion et l’autre comprend les protéines de régulation, que ce soit pour contrôler la réponse
immunitaire, favoriser la réplication virale ou perturber le cycle cellulaire133, les deux catégories
n’étant pas mutuellement exclusives.
c. Enveloppe
L’enveloppe virale est constituée d’une bi-couche lipidique, originaire du réticulum endoplasmique
(RE) ou du compartiment intermédiaire RE/Golgi (ERGIC), qui entoure la nucléocapside et le
tégument. De nombreuses protéines du CMV ont potentiellement un domaine transmembranaire
leurs permettant d’être exprimées à la surface du virion. En pratique on ne retrouve que quelques
protéines qui sont essentielles pour la réplication du virus : gB, gH : gL, gM : gN. La protéine gB est
présente sous forme d’homodimère et est essentielle à l’interaction avec les héparan-sulfate lors de
la phase d’adhésion du virus175. L’utilisation d’anticorps neutralisant dirigés contre gB peut inhiber
l’attachement et la fusion virus/cellules176. La protéine gB seule peut aussi induire des signalisations
intra-cellulaires mimant l’activation de TLR177.
Le complexe gM : gN permet aussi une interaction initiale aux héparan-sulfates. La protéine gM est la
protéine de surface la plus abondante à la surface virale, elle représente 10% de la masse du virion.
La protéine gN est quant à elle moins présente ce qui laisse à penser que gM existe sous forme non
complexé.
Le complexe gH : gL est commun à tous les Herpesvirus et peut être modifié par d’autres glycoprotéines. La protéine gH assure les fonctions de fusion des enveloppes virales et cellulaires alors que
44
gL sert principalement de chaperonne pour la bonne localisation de gH. Plus récemment gH à été
identifiée comme se liant à l’intégrine αVβ3 qui est un co-récepteur pour l’entrée du virus178. En plus
du complexe classique on en retrouve deux autres types. Un est constitué par gH : gL associés à la
protéine gO qui semble augmenter les capacités de fusion du complexe179. Plus récemment gO à été
montrée comme étant une protéine chaperonne permettant l’incorporation de gH : gL dans
l’enveloppe180. Un autre complexe joue un rôle dans le tropisme viral ; il s’agit de l’ajout des
protéines codées par UL128, UL130 et UL131 à gH : gL. Lorsque ce complexe est absent ou muté les
virions peuvent toujours entrer dans les cellules endothéliales mais n’expriment pas les gènes
immediate early (IE) nécessaire au bon déroulement du cycle viral181.
En plus de ces principales glycoprotéines essentielles, l’enveloppe contient des glycoprotéines
mineures notamment des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) codés par le virus. La protéine
codée par le gène US28 à été la plus étudiée. Elle mime un récepteur aux chimiokines CXCR3 et
permet la migration cellulaire182, l’apoptose183 et a été plus récemment impliquée dans la promotion
de la néoplasie intestinale184.
d. Génome
Le génome du CMV mesure jusqu’à 240 kb et est le plus long génome des Herpesvirus. Il est
constitué d’une région longue unique (UL) et courte unique (US) flanquées par des séquences
répétées externes et internes. Ces régions se nomment TRL et IRL lorsqu’elles entourent UL et TRS et
IRS lorsqu’elles entourent US. En plus de ces séquences, une région est présente aux extrémités
permettant l’encapsidation du génome via des éléments conservés pac-1 et pac-2. On trouve aussi
près du centre de la région UL une séquence oriLyt nécessaire à la réplication de l’ADN viral. Enfin
tout au long des séquences UL et US se trouvent des régions promotrices de la transcription. La plus
étudiée est la séquence MIEP qui mesure plus d’1 kb et qui est responsable de la régulation de
l’expression des gènes très précoces IE1 et IE2 nécessaires au déclenchement du cycle viral. On
trouve sur cette séquence des sites de fixations à de nombreux facteurs de transcriptions cellulaires
ainsi qu’un site de fixation pour IE2 permettant la répression du promoteur en phase plus tardive du
cycle.
Suite à des recombinaisons pendant la réplication, quatre formes isomériques du génome sont
présentes selon les sens de lecture des séquences UL et US. Il existe plus de 200 cadres ouverts de
lecture (ORF) qui peuvent potentiellement coder une protéine. Il est actuellement admis qu’une
souche sauvage de CMV peut exprimer au moins 166 gènes133.
45
Figure 18 : Comparaison de l’organisation génomique de différents Herpesvirus humain. HCMV :
cytomégalovirus humain, VZV : virus de la varicelle, HSV : virus de l’herpès, EBV : virus Epstein Barr
2. Cycle viral
L’étude du cycle viral a principalement été effectuée dans des fibroblastes primaires ou immortalisés,
à l’aide de la souche de laboratoire AD169, l’infection de certains types cellulaires nécessitant
l’utilisation de souches cliniques plus difficiles à amplifier en laboratoire. Après entrée dans la cellule
se produit l’expression séquentielle des gènes viraux immédiats précoces (IE), précoces (E) et enfin
tardifs (L). Les gènes IE ne dépendent par de l’expression de gènes viraux et lancent l’expression des
gènes E qui permettent la réplication de l’ADN viral. Les gènes L sont nécessaires à l’encapsidation et
au relargage des virions produits. Le cycle viral dure entre 48 et 72 heures avec une production
maximale de virion à partir de 72 heures après infection (pi). Les protéines du tégument comme
pp71 vont influencer les phases très précoces de l’infection.
En plus du cycle productif classique dans des cellules permissives, certains types cellulaires vont être
le site d’une latence virale. C’est le cas des progéniteurs hématopoïétiques CD34+, des cellules
endothéliales ainsi que des monocytes. Le virus peut ensuite se réactiver suite à des facteurs
extérieurs ou à la différenciation des cellules.
a. Attachement et entrée
Le mécanisme d’entrée varie selon le type cellulaire observé. Dans les fibroblastes, le virus va
d’abord s’attacher à des récepteurs membranaires avant la fusion des membranes virales et
cellulaires puis relarguer la capside viral dans le cytoplasme. Ensuite, via le cytosquelette, elle sera
transportée jusqu’au noyau pour permettre à l’ADN viral d’y pénétrer. En revanche, dans les cellules
endothéliales, le virus utilise une voie endocytique dépendante du pH, ce qui semble être dû aux
46
différences que l’on retrouve au niveau du complexe gH : gL/UL128/UL130/UL131185. Au vu de la
taille de la particule virale, le mécanisme le plus probable est la macropinocytose186. Un autre article
laisse supposer que le type de récepteur à la surface des cellules pourrait être différent selon le type
cellulaire puisque l’expression ectopique de la séquence gH : gL/UL128/UL130/UL131 bloque l’entrée
du virus dans les cellules épithéliales mais pas dans les fibroblastes187. L’entrée dans les cellules
endothéliales et épithéliales étant moins bien connue, nous allons nous concentrer sur le modèle de
fusion.
Avant l’entrée dans la cellule, le virus doit s’attacher à la membrane. Ce mécanisme requiert une
interaction entre une protéine d’enveloppe du virus et des héparan sulfate à la surface cellulaire. La
protéine virale qui interagit le plus avec ces molécules de surfaces est la protéine gB. Il a été montré
que le virion est capable de se lier à la β2-microglobuline mais celle-ci est en fait incorporée dans le
tégument lors de la formation du virion. L’annexin II facilite aussi l’entrée du virus et se lie à la
protéine gB mais les cellules qui ne l’expriment pas sont quand même permissives à l’infection188. Le
récepteur le plus probable pour l’entrée après la phase d’attachement est le récepteur au facteur de
croissance épidermal (EGFR). Il se lie à gB189 mais n’est pas présent à la surface de toutes les cellules
permissives ce qui pose la question d’autres molécules impliquées. La liaison de la protéine gB à
l’EGFR conduit à une signalisation cellulaire : l’EGFR est phosphorylé, ce qui active la voie des
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et le relargage du stock de calcium intracellulaire189. De plus il a
été récemment montré que l’activation de l’EGFR est nécessaire pour l’infection des monocytes190.
La molécule DC-SIGN soluble peut aussi se lier à gB et semble favoriser l’infection des DC par le
virus73. Récemment, un nouveau récepteur a été découvert, il s’agit du récepteur au facteur de
croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) dont le blocage dans certains types cellulaires inhibe
totalement l’infection191.
La protéine gH est capable de se lier aux héparan sulfate mais aussi à une intégrine cellulaire : αvβ3.
Cette liaison sert de co-récepteur et semble aider au recrutement de gB au niveau des rafts lipidiques
pour favoriser l’interaction avec l’EGFR178. Cette interaction conduit au réarrangement du
cytosquelette de la cellule et joue un rôle dans le processus de fusion entre les membranes virales et
cellulaires192.
En plus de leur rôle dans l’attachement et la fusion membranaire, les protéines d’enveloppe,
notamment gB, jouent un rôle dans l’activation du système immunitaire inné. Même si la mise en
place de la réponse immune dirigée contre le CMV fera l’objet d’une partie spécifique par la suite,
nous allons quand même détailler quelques éléments dans ce chapitre. Tout d’abord la protéine gB
peut se lier au TLR2 et induire la production de cytokines pro-inflammatoires193, gH semblant aussi
nécessaire pour cette réponse via TLR2194. gB soluble est aussi capable d’induire une réponse IFN de
type 1 avec l’activation des ISG (Interferon Stimulated Genes) et de IRF3 (Interferon Regulatory
47
Transcription Factor)195. Tout cela laisse à penser que la fixation du virus suffit à déclencher ce signal.
Le récepteur cellulaire nécessaire à cette induction n’est pas encore identifié et l’utilisation de
mutant dominant négatif pour TLR2 montre que le virus est toujours capable d’induire de l’IFN-α/β.
De même le processus de fusion fait apparaître des structures nouvelles qui peuvent être reconnues
par des PRR cellulaires et déclencher la production de cytokines196. Cette induction très précoce de la
réponse immunitaire (quelques minutes ou quelques heures) est un avantage pour l’hôte qui peut
rapidement mettre en place une réponse efficace pour contrôler l’infection.
Figure 19 : Représentation de l’attachement et de l’entrée du CMV par fusion membranaire. Le virus s’attache
aux héparan sulfate à la surface des cellules avant de se lier à l’EGFR via ses protéines d’enveloppes gB. La
protéine virale gH se lie aux intégrines et semble jouer un rôle dans l’entrée du virus. Après fusion des
197
membranes cellulaires et virales, la nucléocapside est libérée dans le cytoplasme et acheminée au noyau .
b. Cycle productif
Immédiatement après la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane plasmique, la nucléocapside
virale pénètre dans le cytoplasme où, via les microtubules, elle est transportée jusqu’au noyau dans
lequel l’ADN viral sera relâché198. Une étude utilisant des mutants pour UL47 (Large tegument
binding protein) montre que celle-ci, en plus de UL48 (Large tegument protein), est nécessaire à
cette étape du cycle199. Suite à cette étape les gènes viraux vont être exprimés de façon séquentielle
IE, E puis L pour permettre la complétion du cycle viral avant l’encapsidation de l’ADN et le relargage
des virions.
48
1. Phase IE
Lorsque le génome viral entre dans le noyau, il y a transcription des gènes IE. Il existe quatre régions
comprenant des gènes IE : UL36 et UL37, IE1 et IE2 (UL122/UL123), TRS1 et IRS1 ainsi que US3. Ces
régions sont contrôlées par des promoteurs distincts. Le Major Immediate Early Promotor (MIEP) est
le plus étudié car il contrôle l’expression d’IE1 et IE2 (ainsi que des produits de splicing alternatifs) qui
jouent des rôles essentiels pour la synthèse des protéines E et L et pour le contrôle de la cellule cible.
Ce promoteur est par ailleurs capable de transcrire des gènes lors de la latence133. IE1 n’est pas
essentiel lors du cycle viral, en tout cas à forte m.o.i (multiplicity of infection)200, au contraire d’IE2
dont la délétion bloque complètement la réplication201. IE2 est aussi impliqué dans le contrôle du
cycle cellulaire. Il active les cyclines E, ce qui force l’entrée en phase S des cellules pour faciliter la
réplication virale, et ce même si la cellule est en phase G0202. IE1 peut inhiber la signalisation STAT1
utilisé par l’IFN203. UL36 et UL37 codent toutes les deux des molécules impliquées dans l’inhibition de
l’apoptose dépendante des mitochondries : vMIA (viral Mitochondrital Inhibitor of Apoptosis) et vICA
(viral Inhibitor of Caspase 8)204. Les produits de IRS1 et TRS1 sont capable de bloquer la protéine
kinase R (PKR) qui est un des mécanismes induit par l’IFN205. US3 est connu pour empêcher
l’expression à la surface des cellules du CMH I et ainsi bloquer la présentation d’antigènes du CMV206.
2. Phase E
Les protéines E commencent à être transcrites à partir de 6 heures pi et jusqu’à 24h pi, à peu près au
début de la réplication de l’ADN viral qui est le but final de cette étape du cycle. Des études utilisant
des virus mutants mettent en évidence au moins 23 gènes E essentiels à la réplication, d’autres
pouvant jouer un rôle dans le contrôle de la cellule hôte. Des sites de fixations pour IE2 sur certains
de leurs promoteurs indiquent une dépendance à ce facteur pour initier leur transcription. UL112113 codent quatre protéines permettant l’initiation de la réplication133, UL54 est la polymérase virale
qui sera responsable de la réplication. C’est aussi à ce moment que sont transcrits de nombreux
gènes tégumentaires (pp65, pp71, pp150…) qui pourront avoir des fonctions plus tardives au niveau
de la maturation de la capside ou lors de l’entrée du virion dans la cellule.
Pour favoriser une réplication de l’ADN viral optimale, et même si l’ADN polymérase est d’origine
virale, le virus a besoin d’utiliser la machinerie de réplication cellulaire, notamment les nucléotides.
Le virus est capable de forcer l’entrée de la cellule en phase S, qui permet la réplication de l’ADN, par
de nombreux moyens et principalement en ciblant les CDK (Cycline Dependant Kinase) et les
Cyclines mais aussi p53. Des études ont montré le blocage des cyclines A et D responsables
respectivement des phases G1 et S/G2 et l’activation des cyclines E responsables de l’entrée en phase
49
S207. Dans le même temps, les premières études montrent que la réplication de l’ADN cellulaire
semble interrompue et donc que le virus bloque l’entrée en phase S208. Le virus est en fait capable
d’induire une phase intermédiaire entre G1 et S en mobilisant les enzymes nécessaires à la
réplication tout en empêchant la cellule de les utiliser pour sa propre réplication207.
On trouve sur la séquence du génome viral une région orilyt qui est l’origine de réplication
responsable de l’initiation de cette réplication. Le complexe de réplication composé de la polymérase
UL54/UL44 associée à l’hélicase virale se fixe à la séquence orilyt et débute le processus207. A la suite
de ces étapes se déroulent l’encapsidation de l’ADN et l’export hors de la cellule.
3. Phase L
Les gènes L peuvent être exprimés avant ou après 24 heures pi ce qui les rend parfois difficiles à
distinguer des gènes E au niveau de la cinétique d’expression. Les fonctions essentielles de la plupart
des gènes L sont la formation de la capside (MCP et SCP), sa maturation, l’encapsidation de l’ADN
viral et l’export du virion hors de la cellule. On retrouve à cette étape de larges inclusions
cytoplasmiques dans les cellules qui serviront à l’enveloppement final des virions.
Il y a formation d’une pro-capside à l’intérieur du noyau (les protéines de capsides sont ré-importées
dans le noyau après traduction). La protéine PORT, composante de la capside, est absolument
essentielle à l’encapsidation de l’ADN209 ainsi qu’une dizaine d’autre protéines jouant un rôle dans le
mécanisme. Les séquences pac présentes sur le génome viral sont reconnues par le complexe et
permettent l’entrée dans la capside. Une fois l’ADN incorporé, la capside subit un enveloppement
initial au niveau de la membrane interne du noyau133. Le modèle le plus communément admis est
ensuite un dé-enveloppement de la nucléocapside avant un enveloppement final au niveau du RE ou
du ERGIC. Le virion est ensuite exocyté hors de la cellule. Un autre modèle possible est la
conservation de la membrane nucléaire comme enveloppe jusqu’à l’exocytose finale.
Les virions sont relargués hors de la cellule à partir de 24 heures pi dans des cellules de types
fibroblastes très permissives, la longueur du cycle variant en fonction du type cellulaire. La moitié des
virions produits sont retrouvés dans le milieu alors que l’autre moitié reste associée aux cellules
productrices. On retrouve par ailleurs dans les cellules de très nombreuses structures virales
incomplètes non infectieuses telles que les corps denses qui sont des structures enveloppées
défective pour la réplication133.
50
Figure 20 : Cycle viral lytique du CMV. Après libération de la nucléocapside dans le cytoplasme, celle-ci est
acheminée jusqu’au noyau où l’ADN viral sera répliqué suite à l’expression préalable des gènes IE1 et IE2. Lors
des phases tardives du cycle, l’ADN viral est encapsidé avant d’être enveloppé une première fois par la
membrane nucléaire puis une seconde fois par la membrane du RE. Les virions sont ensuite libérés par
123
exocytose .
c. Latence et réactivation virale
Le CMV est un virus persistant tout au long de la vie de l’individu. Dans certains compartiments,
comme les glandes salivaires, le virus peut rester productif à bas bruit pendant une très longue
période. En revanche dans d’autres compartiments on retrouve une infection latente. L’ADN viral est
alors sous forme épisomale et l’expression de ses gènes est réduite à quelques transcrits spécifiques.
Les principales cellules dans lesquelles on retrouve du virus latent sont les cellules souches
hématopoïétiques, les monocytes, les cellules endothéliales et, plus récemment, les progéniteurs de
DC myéloides210. Suite à des stimuli extérieurs, conduisant par exemple à la différenciation des
cellules, le virus peut entrer dans une phase productive qui conduira à la synthèse de nouveaux
virions211.
Le modèle le plus étudié est celui des cellules souches CD34+ qui peuvent être infectées par les
souches cliniques du virus. Après 48 heures les gènes IE ne sont plus exprimés, et l’ADN passe sous
forme épisomale212. Les premières évidences de la latence sont venues du fait que le virus ne pouvait
être isolé dans le sang des donneurs mais que la transfusion sanguine permettait le transfert de
l’infection au receveur213. De plus la déplétion des leukocytes avant la transfusion permettait de
51
réduire considérablement le risque infectieux214. La présence de l’ADN viral dans les PBMC a ensuite
été détectée par PCR215 même si la détection est rendue difficile par le faible nombre de PBMC
portant le génome viral, ce nombre étant estimé entre 1 cellule pour 104 ou 105 PBMC.
Figure 21 : Mécanismes épigénétiques associés à la réactivation virale suite à la différenciation cellulaire. Lors
des phases de latence, le promoteur des gènes précoces (MIEP) est associé à des enzymes qui répriment la
transcription telles que les HDAC (histone deacetylase). Au cours de la différenciation des cellules souches
+
CD34 en DC, ce promoteur est associé à des enzymes qui remodèlent la chromatine et permettent la
211
transcription telles que les HAT (histone acétyl tranferases) .
La mise en place de la latence est due à un contrôle de l’expression des gènes du CMV et
particulièrement des gènes sous contrôle du MIEP, IE1 et IE2. Le génome viral est retrouvé proche de
structures nucléaires connues sous le nom de nuclear Domain-10 (ND10), ces structures contenant
des protéines responsables de modifications épigénétiques au niveau de la chromatine. La protéine
hDaxx a ainsi été associée à la répression des gènes IE en phases tardives d’infections permissives211.
Dans les types cellulaires non-permissifs le MIEP est souvent associé à des facteurs permettant la
méthylation de l’ADN ce qui empêche la transcription des gènes sous son contrôle. Ces facteurs
permettant la méthylation/déméthylation/acétylation sont associés à des états de différenciation de
la cellule, ce qui explique en partie la réactivation virale possible lors de la différenciation
cellulaire210,216.
Lors de la latence, des gènes spécifiques sont tout de même exprimés, on les appelle les Latency
Associated Genes. Ces gènes ne sont pas tous identifiés mais on peut citer LUNA dont l’ARN
messager est retrouvé dans les cellules infectés in vivo217. Le rôle supposé de cet ARN est d’agir
comme anti-sens avec celui d’UL82 (pp71) et ainsi bloquer sa traduction. pp71 étant un activateur
des gènes IE, cela bloque leur expression217. Un autre ARN messager exprimé est celui de
52
l’homologue viral à l’IL-10 (vIL10, UL111a), cette expression pouvant être corrélée avec la diminution
du CMH-II sur les cellules infectées de façon latente218. Le dernier ARN régulièrement détecté est
celui du gène UL138, le niveau d’expression diminuant lorsque les cellules CD34+ se différencient en
DC. La protéine UL138 est connue pour sensibiliser la cellule infectée au TNF-α via l’augmentation de
l’expression de son récepteur de surface219.
Les facteurs intervenant lors de la réactivation virale ne sont pas encore clairement identifiés. L’ajout
de Granulocyte Colony-stimulating factor (G-CSF) et d’hydrocortisone sur des cultures de PBMC
infectés in vivo conduit à l’expression des gènes IE et E220. De même la stimulation de PBMC et de
monocytes portant le virus latent par des cellules T allogéniques permet la production de virions
infectieux, les cytokines et les facteurs sécrétés par les cellules T n’étant pas identifiés221. Une étude
plus récente utilisant des protocoles de différenciation de DC à partir de cellules CD34+ infectées de
façon latente montre elle aussi la production de virions infectieux par ces DC210. Les dernières études
sur ce sujet mettent en évidence le rôle des cytokines et en particulier celui de l’IL-6 dans ce
mécanisme. Une équipe a montré que l’infection de monocytes par une souche clinique du virus
conduit à la mise en place de latence et qu’il n’y a pas besoin de passer par le stade de progéniteur.
De plus l’IL-6 seule est capable d’induire la réactivation virale et la production de virions infectieux à
partir de ces cellules222. Enfin, une autre équipe a montré que le blocage de l’IL-6 via une interruption
de sa signalisation MAPK inhibe la réactivation virale dans les DC223.
53
IMMUNITE ANTI-CMV ET
IMMUNOSUPPRESSION VIRALE
54
Le CMV, malgré un nombre considérable de protéines dédiées à l’échappement immunitaire, est un
virus qui induit une réponse immune spécifique de l’hôte très importante. Cette réponse est une des
plus fortes dirigées contre un pathogène et comprend une mobilisation très importante du
compartiment T CD4+ et CD8+. Le système immunitaire (SI) est capable de contrôler l’infection et
d’inhiber la réplication virale lors de réactivations qui se produisent de manière régulière, les
réponses innée et adaptative (humorale et cellulaire) étant misent en jeu lors du processus. En
revanche, le SI n’est pas capable d’empêcher les phases précoces d’infection virale et la mise en
place de la latence, le virus pouvant ainsi persister tout au long de la vie de l’individu.
A. Immunité innée
L’immunité antivirale innée est mise en place très rapidement, dès les phases d’attachement et de
fusion du virus au niveau des membranes cellulaires. Comme décrit dans le chapitre correspondant,
les protéines gB et gH du virus sont capables de se lier respectivement au TLR2194 et aux intégrines
αvβ3178, ce qui conduit à différentes signalisations et l’activation des MAPK ou de NF-κB. L’IFN de
type 1 est aussi produit dès l’interaction entre le virus et la cellule via l’activation du facteur IRF3224.
Les TLR3 et TLR9 situés sur les membranes endosomales sont activés plus tardivement et conduisent
à des signalisations similaires225. L’IFN de type 1 est essentiel pour développer une réponse antivirale
efficace, les mutations chez l’homme de la signalisation induite par l’IFN de type 1 ou la perte de son
récepteur de surface induisant une létalité suite aux infections virales226,227.
1. Interféron de type 1 : signalisation et mode d’action
L’IFN de type 1 comprend de nombreux membres dont l’IFN-α, l’IFN-β ainsi que cinq autres soustypes. Il agit via une signalisation cytokinique classique. Le récepteur de surface (IFNAR) est un
complexe composé de deux sous-unités : IFNAR1 et IFNAR2 exprimées de façon ubiquitaire et
utilisées par tous les membres de cette famille. La fixation de l’IFN à son récepteur conduit à la
phosphorylation des molécules TYK2 et JAK1 qui à leur tour pourront phosphoryler STAT1 et STAT2.
Ces molécules vont alors se complexer en trimère (STAT1, STAT2 et IRF9), transloquer dans le noyau
et jouer leur rôle de facteur de transcription en se liant aux séquences ISRE (IFN-Stimulated Response
Element)228 pour induire l’expression de plus de 300 ISG (IFN-Stimulated Genes)229. L’IFN de type 3,
identifié plus récemment, stimule les mêmes voies de signalisation en utilisant un récepteur de
surface spécifique. Cette famille constitue probablement le système antiviral le plus ancien retrouvé
chez les vertébrés230
55
Figure 22 : Récepteurs et signalisations associés à l’IFN de type 1 et de type 3. D’après
228
.
Le CMV est capable de bloquer la signalisation IFN de type 1 à plusieurs niveaux. L’infection conduit à
une dégradation de la protéine JAK1 par un mécanisme dépendant du protéasome231. Le virus est
également capable via sa protéine IE1 d’inhiber la formation du complexe STAT1/STAT2/IRF9 et ainsi
inhiber l’expression des gènes sous son contrôle203.
De nombreux ISG exprimés jouent un rôle dans l’amplification du signal IFN, la signalisation des PRR
mais peu ont une activité antivirale directe. C’est le cas entre autres de ISG15, des protéines Mx, de
la PKR et de la 2’,5’-oligoadenylate synthetase (OAS).
ISG15 : C’est une des protéines les plus exprimées lors de la réponse IFN. Elle a été identifiée comme
une molécule homologue des ubiquitines. Pour agir elle a besoin d’être transférée sur un résidu
sérine d’une protéine et pour cela elle passe par les étapes classiques de l’ubiquitinylation :
activation par une enzyme E1 (ubiquitin-activating enzyme), conjugaison par E2 (ubiquitinconjugating enzyme) et enfin liaison à la cible par E3 (ubiquitin-ligase enzyme). De nombreuses
études montrent qu’ISG15 est capable d’interagir avec ces trois types d’enzymes dans la cellule228.
Les cibles d’ISG15 sont variées mais jouent principalement un rôle dans la réponse IFN de type 1 ellemême232. Cela est dû au fait que contrairement à l’ubiquitine, ISG15 ne promeut pas la dégradation
des protéines mais au contraire module la fonction des enzymes. Ainsi il a été montré que des
56
phosphatases peuvent être inhibées par ce biais233. De plus la fixation de cette molécule peut
empêcher l’ubiquitinylation classique et bloquer des processus nécessitant ce mécanisme234. En plus
de son action intracellulaire, ISG15 peut être sécrétée et avoir une action immuno-modulatrice
proche d’une cytokine235.
Protéines Mx : Les protéines Mx (MxA et MxB chez l’homme) font parties de la famille des GTPases.
Ce sont les premières protéines antivirales identifiées grâce à la mutation du locus Mx qui conduit à
une sensibilité plus forte aux othomyxomavirus236. Chez l’homme, seule la protéine MxA possède une
activité antivirale. Cette protéine inhibe toute la famille des Bunyaviridae ainsi que les coxsackie virus
et le virus de l’hépatite B228. Elle cible les structures de type nucléocapsides en permettant de les
piéger dans des structures membranaires avant leurs dégradations237.
PKR : la protéine PKR est exprimée de façon basale dans les différents tissus mais peut être
surexprimée par les IFN de types 1 et 3238. C’est une protéine kinase qui phosphoryle principalement
EIF2α pour l’inhiber, celui-ci étant un facteur nécessaire à l’initiation de la traduction en permettant
le recrutement des ARN de transfert aux ribosomes de façon dépendante des guanines di-phosphate
(GDP)239. En conditions physiologiques, la PKR est présente sous forme monomérique inactive. Des
ligands tels que l’ARN viral ou certains facteurs cellulaires induisent une dimérisation ainsi qu’une
autophosphorylation de celle-ci. La protéine est alors active et peut phosphoryler ses propres
substrats228. La PKR est capable de reconnaitre principalement l’ARN double brin (db) ainsi que l’ARN
simple brin (sb) contenant un tri-phosphate à son extrémité 5’, qui est essentiellement retrouvé chez
les ARN viraux240. Ces caractéristiques lui permettent d’être active de façon spécifique dans les
cellules infectées par des virus. Des expériences utilisant des souris déficientes pour la PKR révèlent
une susceptibilité accrue aux infections virales dans ces modèles. Le CMV est ciblé par cette voie
mais certaines protéines virales sont capables d’inhiber son activation. Ainsi l’infection par une
souche murine déficiente pour les protéines m142 et m143 conduit à une phosphorylation beaucoup
plus importante de EIF2α et donc à son inhibition241. Chez l’homme, la protéine TRS1 virale induit une
relocalisation de la PKR dans le noyau et ainsi empêche le contact avec son substrat242. Des
polymorphismes chez l’homme pour le gène codant la PKR corrèlent avec le développement
d’infection par le virus de l’hépatite C (HCV)243.
OAS et RNaseL : De même que les protéines PKR, la protéine OAS est exprimée de façon basale dans
les tissus. Elle peut jouer le rôle de PRR puisqu’elle reconnait l’ARN db cytoplasmique. La présence
d’IFN de type 1 entraine la surexpression de cette molécule sous forme inactive jusqu’à la
reconnaissance de l’ARN viral. Elle peut alors se tétrameriser dans le cas d’OAS1. OAS est capable de
57
polymériser l’ATP en oligomères d’adénosine phosphodiester en 2’, 5’. Cette molécule active une
RNaseL responsable de la dégradation de l’ARN. Il existe quatre OAS identifiées chez l’homme qui
possèdent chacune des particularités pour les oligomères qu’elles peuvent synthétiser, certains étant
plus efficaces que d’autres pour activer la RNaseL228. Suite à la reconnaissance des 2’,5’oligomères, la
RNaseL s’homo-dimérise et dégrade l’ARN sb, la spécificité anti-virale étant obtenue par l’activation
des OAS via la présence d’ARN viral. Ce mécanisme est particulièrement efficace contre les virus à
ARN mais peut être utilisé aussi contre des virus à ADN tel que le CMV. Celui-ci exprime une protéine
codée par l’ORF94 capable de diminuer non seulement l’expression des OAS mais aussi leur activité
lors de leur stimulation par l’IFN de type 1244. De même que pour les protéines Mx, le polymorphisme
chez l’homme des OAS est associé au développement de l’hépatite C243. De plus, un autre
polymorphisme au niveau d’OAS1 est corrélé avec le niveau d’activation de la réponse anti-virale lors
des essais cliniques d’un vaccin contre la fièvre jaune245.
2. Réponse Natural killer (NK)
Les cellules NK sont capables d’une réponse immunitaire innée non-spécifique conduisant à la lyse
des cellules infectées ou tumorales mais aussi d’aider à la mise en place d’une réponse immunitaire
adaptative par la sécrétion de nombreuses cytokines. Les NK sont caractérisés par une absence
d’expression des molécules CD3 (T) et CD19 (B) mais possèdent de très nombreux récepteurs de
surfaces inhibiteurs ou activateurs capables de reconnaitre différents types de signaux. C’est la
somme des signaux reçus par les récepteurs qui conduit à la lyse ou non de la cellule cible, cette lyse
pouvant s’effectuer via la sécrétion des molécules perforines et granzymes ou l’expression de ligands
pour les récepteurs de mort. L’importance de cette réponse est suggérée par le nombre de
mécanismes mis en place par le virus pour l’inhiber.
Des études sur le modèle murin montrent l’impact d’une délétion des cellules NK sur la réponse antiCMV. Les souris déficientes sont hautement susceptibles à l’infection par le MCMV mais le transfert
de NK confère une protection246. Les différentes souches de souris ont des résistances variables au
MCMV qui sont en parties liées à l’expression du récepteur Ly49 à la surface des cellules NK247. Une
étude plus récente met en évidence la reconnaissance du virus par les cellules NK dépendante des
différents CMH-I exprimés et des différents Ly49248. Chez l’homme les exemples sont moins évidents
puisque les déficiences en cellules NK sont peu fréquentes. Toutefois cette déficience peut entrainer
des épisodes sérieux et récurrents d’infection à CMV249. Les études incluant des patients transplantés
montrent une corrélation entre la restauration de la réponse NK et une protection contre des
maladies à CMV250. De plus la réactivation virale après une transplantation allogénique est associée à
58
l’apparition d’une population particulière de cellules NK exprimant le récepteur NKGC2 et plus
efficace pour la synthèse d’IFN et la protection contre le CMV251.
Le virus possède de nombreux mécanismes d’échappement aux NK. L’activation de ces cellules étant
dépendante de signaux activateurs et inhibiteurs, il peut moduler cette réponse en favorisant les
signaux négatifs ou en diminuant les signaux positifs. La perte d’expression des molécules de CMH-I
lors de l’infection à CMV252 est en partie responsable de la susceptibilité de ces cellules à la lyse par
les NK, le CMH-I envoyant un signal inhibiteur via les récepteurs LIR253. Cette perte d’expression est
compensée par l’expression d’une protéine virale homologue (UL18)254 qui est capable de se lier au
récepteur inhibiteur LIR-1 et inhiber l’activation des cellules NK. De plus, le virus code la protéine
UL40 qui contient un peptide capable de se fixer sur les molécules HLA-E et favoriser leur expression
à la surface de cellules infectées255, HLA-E étant un ligand des récepteurs inhibiteurs CD94/NKG2 des
cellules NK256.
Le virus inhibe aussi de nombreux signaux activateurs : UL141 est capable de séquestrer les
molécules CD112257 et CD155258 et ainsi bloquer l’activation des récepteurs CD226 et CD96 des NK.
pp65 est aussi responsable de la dissociation des chaînes CD3ζ lors de la signalisation par NKp30259.
Une des voies majeures de l’activation NK est liée au récepteur NKG2D260 qui reconnait plusieurs
ligands induits lors de stress cellulaire et notamment lors de l’infection par le CMV. La protéine UL16
est capable de maintenir dans le cytoplasme les molécules MICB, ULBP1, 2 et 6 qui sont des ligands
de NKG2D261. MICA, un autre ligand, est aussi inhibé, son expression est plus faible due à une
séquestration au niveau de l’appareil de Golgi médiée par la protéine UL142262. Enfin, UL112-1, un
microRNA viral permet la dégradation de l’ARNm de la molécule MICB263. Une étude récente à mis en
évidence une coopération possible entre ce microRNA viral et un microRNA cellulaire pour inhiber
plus efficacement l’expression de MICB264.
3. Autophagie
L’autophagie est un mécanisme par lequel du matériel intracellulaire est capturé dans une vacuole à
double membranes qui fusionne avec la voie lysosomale pour induire la dégradation de son contenu.
Ce mécanisme, permettant le recyclage d’organites et l’adaptation des cellules, à tout d’abord été
montré dans des cellules soumises à une privation de nutriments ou un stress important265. La
formation des auto-phagosomes se déroule en trois étapes séquentielles : initiation, élongation et
maturation, dépendantes chacune de protéines spécifiques. Il existe différents types d’autophagies
mais nous allons seulement nous intéresser à la macro-autophagie qui permet la dégradation
d’organites. Une trentaine de protéines atg jouant un rôle dans ce mécanisme ont été répertoriées
59
chez la levure, certaines ayant des orthologues chez l’homme266. D’autres protéines comme la PI3K,
VSP34 ou la Beclin-1 sont nécessaires à la régulation et à l’initiation de l’autophagie267.
Figure 23 : Rôles de l’autophagie dans l’immunité innée et adaptative lors de l’infection par un pathogène
intracellulaire. Le pathogène peut être directement dégradé dans les autophagosomes (a). L’autophagie
permet aussi de mettre en contact des composants viraux avec les récepteurs de l’immunité innée (b) ou
encore de favoriser la formation de peptides présentables par les molécules du CMH et ainsi faciliter la réponse
267
adaptative contre le pathogène (c) .
L’autophagie peut être induite par différents signaux notamment l’activation des TLR ou certaines
cytokines268. Elle joue un rôle dans la capture de pathogènes pour permettre leur dégradation et
peut aussi servir de source d’antigène pour favoriser la présentation via les molécules du CMH et la
reconnaissance par les cellules T spécifiques267. L’autophagie a été impliquée dans la réponse
antivirale notamment dans le cas d’HSV-1 où les virions néo-formés sont capturés dans les
phagosomes avant d’être dégradés269. Certains virus peuvent profiter de la formation de ces
60
complexes pour favoriser leurs réplications, c’est le cas du polyovirus270. Enfin de nombreux virus
inhibent l’initiation de l’autophagie en ciblant les mécanismes d’inductions comme HSV-1 qui bloque
la protéine beclin-1271.
Dans le cas du CMV l’induction précoce de l’autophagie lors de l’infection a été montrée dans les
fibroblastes272. Le virus est capable d’inhiber cette induction273, c’est la protéine TRS1 qui en se liant à
la beclin-1 bloque la formation d’auto-phagosomes274.
B. Immunité adaptative
1. Réponse humorale
Dans les modèles animaux, notamment cochon d’inde, la réponse anticorps qui se développe lors
d’une immunisation permet de protéger d’une transmission materno-fœtale275. Chez l’homme la
présence d’anticorps suite à une primo-infection avant la grossesse joue un rôle important pour
limiter cette transmission au foetus276. Récemment, l’équipe de L.Peirera a montré que
l’immunisation passive (transfert d’immunoglobulines spécifiques du CMV) de femmes enceintes
infectées lors de la grossesse permet de réduire les effets de l’infection, notamment en limitant la
réplication virale au niveau placentaire158. Chez les patients transplantés le transfert d’anticorps peut
aussi être bénéfique et limiter les maladies à CMV associées à l’infection152.
La réponse humorale est dirigée contre différentes protéines. Les principales cibles sont les protéines
d’enveloppes gB et gH qui induisent des anticorps neutralisants277,278, mais des protéines du
tégument comme pp65 ou pp50 ainsi que des protéines non structurales telles qu’IE1 peuvent
induire la production d’anticorps279. Le complexe d’entrée nécessaire à l’infection des cellules
endothéliales (gH/gL/UL128-131A) permet aussi la production d’anticorps spécifiques neutralisants
et ce de façon encore plus efficace que les protéines gB et gH seules280. En plus de leur fonction
neutralisante les anticorps peuvent contribuer à la reconnaissance des cellules infectées par d’autres
types cellulaires tels que les cellules NK et les T γδ. Ainsi la fixation d’IgG anti-CMV sur les récepteurs
CD16 des T γδ permet, au moins in vitro, la sécrétion d’IFN-γ par ces cellules, ce qui limite la
réplication virale281. Le virus est capable d’incorporer dans son virion en formation des anticorps
ciblant la molécule gH et utiliser la partie Fc de ces anticorps pour infecter de nouvelles cellules en
utilisant le FcR comme mécanisme d’entrée160.
61
2. Réponse cellulaire
a. Lymphocytes T CD4+
L’importance des LT CD4+ a tout d’abord été montrée chez la souris. La déplétion de ce
compartiment cellulaire à long terme induit une réplication virale persistante282. La réponse est
principalement orientée TH1, on retrouve dans le sang des personnes infectés des LT CD4+
producteurs d’IFN-γ et de TNF-α mais pas de cellules productrices d’IL-4283. Ces résultats sont en
corrélation avec la très forte réponse LT CD8+ induite par l’infection qui a besoin de l’aide des LT CD4+
TH1 pour se mettre en place et se maintenir. Chez les patients transplantés rénaux l’apparition des LT
CD4+ précède toujours l’apparition des LT CD8+ lorsque l’infection est asymptomatique. Si
l’émergence de cette réponse est retardée, des maladies à CMV sont possibles284. Chez des patients
ayant subi une transplantation de moelle osseuse les LT CD4+ sont aussi nécessaires pour maintenir
une réponse LT CD8+ efficace147.
En plus de son rôle dans la réponse LT CD8+, le compartiment CD4+ peut aussi être directement
cytotoxique et induire l’apoptose des cellules infectées. In vitro des LT CD4+ dirigés contre les
antigènes gB, gH, pp65 ou IE sont capables de cytotoxicité médiée par la reconnaissance via le CMHII285. Les LT CD4+ dirigés contre la protéine gB expriment presque tous la molécule granzyme B ex vivo
et peuvent lyser des cellules présentant des antigènes spécifiques286.
Les LT CD4+ spécifiques des antigènes du CMV ont été identifiés par leurs capacités à sécréter des
cytokines suite à la stimulation par ces mêmes antigènes. Les protéines ciblées par la réponse CD4+
sont proches de celles ciblées par la réponse CD8+ : pp65, pp50 et IE1 sont fortement immunodominants287,288 mais il existe aussi des réponses dirigées contre des séquences présentes sur les
protéines pp50, gB, gH, IE2…172. Une étude détaillée utilisant des peptides de tout le protéome du
CMV a mis en évidence que 10% des LT CD4+ mémoires d’un individu d’âge moyen sont dirigés
contre le CMV et qu’en moyenne une personne possède des LT CD4+ répondant contre 12 protéines
virales289.
Les LT CD4+ mémoires spécifiques du CMV sont enrichis en une population exprimant les marqueurs
de surfaces CD45RO+CD27-CD62L-CCR7-283. Des cellules n’exprimant pas CD28 sont retrouvées chez
les patients dans de fortes proportions. En plus de sécréter de grandes quantités d’IFN-γ, elles
expriment les molécules perforines et granzymes B et peuvent donc médier une cytotoxicité
dépendante du CMH-II. Ces cellules peuvent apparaître dans le sang circulant lorsque la charge virale
circulante a été négativée290. Certains clones LT CD4+, notamment dirigés contre la protéine IE1,
sécrètent de l’IFN-γ, du TNF-α ainsi que de l’IL-6, certaines de ces molécules pouvant inhiber
directement la réplication virale291.
62
+
+
Figure 24 : Représentation schématique des antigènes reconnus par les réponses T CD4 et CD8 .
De nombreux mécanismes mis en place par le CMV sont capables d’inhiber les effets d’une réponse
par les LT CD4+. Une étude montre une diminution des LT CD4+ produisant plusieurs cytokines
simultanément, les cellules produisant de l’IFN-γ et de l’IL-2 étant une composante importante de la
réponse immune et ont une fréquence moins forte chez les patients virémiques292. Le virus inhibe la
protéine JAK1 nécessaire à la signalisation de l’IFN-γ qui permet une augmentation de l’expression
des molécules du CMH-II à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APC). La protéine virale
US2 empêche le bon adressage des molécules HLA-DR et HLA-DM et entraine leur dégradation293,
inhibant ainsi la présentation par le CMH-II. Enfin une protéine homologue à l’IL-10 codée par
UL111a possède les mêmes caractéristiques que l’IL-10 cellulaire et inhibe notamment l’expression
des molécules de CMH-I et II à la surface des APC, la sécrétion de cytokines et la prolifération des
lymphocytes294. Cette protéine est également exprimée pendant la phase de latence virale295 et
semble inhiber la reconnaissance par les LT CD4+ durant cette période, permettant au virus de
maintenir cette latence296.
63
b. Lymphocytes T CD8+
La réponse antivirale par les LT CD8+ est essentielle pour le contrôle de l’infection et la baisse de la
charge virale chez les personnes infectées. Chez la souris, le transfert de LT CD8+ spécifiques des
antigènes
du
CMV
empêche
la
mortalité
induite
par
l’infection
dans
un
modèle
d’immunosuppression et ce, même en absence de LT CD4+297,298. Chez l’homme la reconstitution du
compartiment LT CD8+ après transplantation de moelle osseuse est associée à la protection contre
les maladies à CMV299. Dans une étude incluant des patients transplantés pulmonaires et cardiaques,
une forte fréquence de LT CD8+ spécifiques d’IE1 corrèle aussi avec une protection contre les
maladies à CMV300. Le transfert de LT CD8+ chez les patients transplantés permet de prévenir la
réactivation virale ainsi que les maladies associées147,301.
Les protéines contenant des antigènes spécifiques pour les LT CD8+ sont les mêmes que pour les LT
CD4+. Les premières identifiées ont été IE1302 et pp65303 mais de nombreuses autres protéines
peuvent être ciblées par cette réponse172. Comme pour la réponse LT CD4, la proportion de LT CD8+
mémoires chez les individus infectés est très importante, représentant en moyenne 10% du
compartiment, et pouvant atteindre 40% chez certains individus304. La réponse individuelle est très
variable avec en moyenne une reconnaissance de 8 ORF par personne. Dans cette même étude la
population étudiée comportait des LT CD8+ dirigés contre plus de 150 ORF du CMV289. Lors des
phases de latences certains ORF comme UL138 ou UL111a sont reconnus mais chez un petit nombre
de personnes et cette reconnaissance semble être associée à l’expression des molécules de CMH
HLA-B3501305.
Le phénotype des LT CD8+ spécifiques varie selon le stade de l’infection. Lors de la phase aigue, la
population effectrice mémoire est associée aux marqueurs CD45RA-CD45RO+CD27+ et CD28+/-. En
revanche lors de la phase chronique, des cellules ré-exprimant CD45RA apparaissent306, elles
expriment toujours les perforines et granzymes et sont fonctionnelles. Le transfert de ces cellules est
par ailleurs plus efficace pour contrôler la réactivation virale que celles n’exprimant pas CD45307. La
population la plus importante n’exprime ni CD28 ni CCR7 mais exprime le récepteur à la chimiokine
CCR5308, ce qui lui permet d’être recrutée sur le site d’inflammation. La perte d’expression de CD28
est compensée par d’autres molécules de co-stimulation comme 41BB dont l’activation entraine la
prolifération de ces cellules309. En plus de leurs capacités cytotoxiques les LT CD8+ expriment de
nombreuses cytokines. Les cellules les plus efficaces pour la protection anti-virale sont celles
exprimant de multiples cytokines telles que l’IFN-γ le TNF-α et MIP1β310.
Les TCR des LT CD8+ anti-CMV lors de la phase chronique sont oligo-clonaux avec la sélection d’un
petit nombre d’entre eux et l’expansion de cette population311, les TCR sélectionnés étant ceux
présentant la plus forte affinité pour le complexe CMH/peptide correspondant.
64
La proportion de LT CD8+ mémoires anti-CMV subit une expansion corrélée avec l’âge des individus,
cette population occupe donc une part de plus en plus importante dans le répertoire T avec des
conséquences encore mal étudiées312. Ce mécanisme est appelé « inflation mémoire » et existe aussi
pour les LT CD4+313. L’accumulation de ces clones spécifiques du CMV laisse penser que cette réponse
trop importante participe à l’immuno-sénescence qui est caractérisée par une réduction de la
population naïve, une augmentation du nombre de cellules CD28- et une moins bonne réponse
globale contre les pathogènes314,315. La séropositivité pour le CMV est associée à une baisse du taux
de réussite pour la vaccination contre le virus de la grippe chez les personnes agées316.
Figure 25 : Gènes viraux codant des protéines d’échappement à la réponse immunitaire. Le CMV code de
nombreux gènes qui inhibent les réponses immunitaires innées et adaptatives (humorale et cellulaire).
Le CMV inhibe la réponse T CD8+ par différents mécanismes. En plus de coder l’IL-10 viral qui a une
action immunosuppressive et antiproliférative sur les LT CD8+, le virus code des protéines, dont les
gènes se situent au niveau du segment US, qui peuvent inhiber la présentation d’antigènes viraux sur
le CMH-I par les APC. Les mécanismes inhibiteurs de cette présentation sont divers et ne sont pas
tous actifs au même moment de l’infection. US3 est exprimée précocément (phase IE) et séquestre le
65
complexe CMH/peptide au niveau du RE206. US2 et US11 sont exprimées plus tardivement (phase E)
et dégradent le complexe CMH/peptide317,318. Enfin US6 (phase E) bloque la translocation des
peptides via le transporteur TAP dans le RE319. Tous ces mécanismes ne semblent pas nécessaires au
virus lors de la primo-infection puisque leur délétion dans le modèle macaque n’empêche pas
l’établissement de la latence virale. En revanche la sur-infection par une autre souche ne peut se
faire sans cette immuno-évasion320. Un dernier mécanisme est retrouvé lors de la phase IE du cycle
viral ; la protéine pp65 incorporée dans le virion est capable de phosphoryler IE nouvellement traduit
dans la cellule et ainsi empêcher sa présentation par le CMH-I321,322.
c. Lymphocytes T γδ
Ces cellules représentent un faible pourcentage des lymphocytes circulant (moins de 6%) mais sont
présentes en grand nombre dans les muqueuses323. Chez la souris, la déplétion de ce compartiment
augmente sensiblement le titre viral lors d’infection par le MCMV324. Une étude chez des patients
transplantés rénaux montre une augmentation du pourcentage de LT γδ non δ2 avec jusqu’à 40% de
T γδ circulants325 lors de l’infection par le CMV, ces T γδ ayant par ailleurs la capacité de lyser des
cellules infectées par le virus326. Le même phénomène est retrouvé chez tous les receveurs d’organes
solides, dans lesquels l’expansion des T γδ est corrélée avec la réactivation virale327. In utero,
l’infection par le CMV induit également une réponse T γδ328. La cible reconnue par ces cellules n’est
pas encore identifiée mais toutes ces études indiquent un rôle pour ces lymphocytes dans le contrôle
de l’infection par le CMV329. Dernièrement, il a été montré que des anticorps IgG dirigés contre un
épitope du CMV pouvaient induire l’activation des LT γδ par un phénomène de lyse cellulaire
dépendante d’anticorps (ADCC)281.
3. Immunosuppression des APC
La DC est un élément essentiel pour la mise en place de la réponse immunitaire adaptative. C’est une
cellule permissive pour les souches cliniques du virus et donc soumise aux différents mécanismes
d’immunosuppression. En plus d’inhiber les voies de présentation d’antigènes en bloquant
l’expression des molécules du CMH-I et II, le virus peut agir directement sur la capacité des DC à
stimuler les cellules T. Plusieurs équipes ont ainsi raporté la perte de capacité des cellules infectées à
acquérir un phénotype mature, notamment les marqueurs de co-stimulation CD80/CD86 ainsi que la
sécrétion de cytokines nécessaires à l’activation des cellules T tels que l’IL-12, l’IFN-γ ou le TNFα330,331. L’infection de DC déjà matures par le virus inhibe la capacité de ces cellules à stimuler des
lymphocytes T, probablement par le relargage de CD83 soluble plutôt que par la production d’IL-10
66
viral dont les effets immunosuppresseurs sont démontrés332. L’infection de monocytes (précurseurs
de DC inflammatoires) par le virus augmente la diapédèse et permet une migration transendothéliale ce qui facilite la dissémination virale333. En revanche, la même infection inhibe
l’expression des récepteurs aux chimiokines CCR1, CCR2, CCR5 et CXCR4 nécessaire pour se rendre
sur le site de l’inflammation et donc inhibe la réponse de ces cellules lors de l’infection334. Le virus est
aussi capable d’inhiber la différenciation des monocytes en DC conduisant à des cellules
phénotypiquement différentes (CD1a-), moins efficaces pour phagocyter des billes de dextran, migrer
en réponse à des chimiokines et induire la prolifération de lymphocytes T335. Un phénotype similaire
est retrouvé (marqueurs de surface modifiés et stimulation plus faible des lymphocytes T) lorsque les
DC sont différenciées ex vivo à partir de monocytes provenant de patients transplantés cardiaques
virémiques336. Les mécanismes mis en jeu lors de cette inhibition de la différenciation ne sont
toutefois pas élucidés.
Pour passer outre ces mécanismes d’immunosuppression, la DC est capable de présentation croisée.
Elle peut ainsi phagocyter des cellules apoptotiques infectées et présenter des antigènes viraux aux
lymphocytes T CD8+ sans être elle-même infectée. Pour cela, notre équipe a montré que les DC, via la
sécrétion de TNF-α, sont capables d’induire l’apoptose de fibroblastes infectés, de les phagocyter, de
présenter des antigènes viraux (pp65) et d’effectuer la présentation croisée aux lymphocytes T
CD8+337. Ces mécanismes de présentation croisée sont une explication à la très forte réponse
antivirale dirigée contre des protéines du tégument (pp65), très précoces (IE1) ainsi que tardives (gB)
malgré les nombreux mécanismes inhibant la présentation dans les cellules infectées338.
67
RESULTATS (ARTICLE et
FIGURES SUPPLEMENTAIRES)
68
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
2011 118: 6783-6792
Prepublished online October 26, 2011;
doi:10.1182/blood-2011-02-337956
Paracrine inhibition of GM-CSF signaling by human cytomegalovirus in
monocytes differentiating to dendritic cells
Jérome Carlier, Hélène Martin, Bernard Mariamé, Benjamin Rauwel, Catherine Mengelle, Hugo
Weclawiak, Alain Coaquette, Charline Vauchy, Pierre Rohrlich, Nassim Kamar, Lionel Rostaing,
Georges Herbein and Christian Davrinche
Updated information and services can be found at:
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/content/118/26/6783.full.html
Articles on similar topics can be found in the following Blood collections
Immunobiology (4699 articles)
Information about reproducing this article in parts or in its entirety may be found online at:
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/site/misc/rights.xhtml#repub_requests
Information about ordering reprints may be found online at:
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/site/misc/rights.xhtml#reprints
Information about subscriptions and ASH membership may be found online at:
http://bloodjournal.hematologylibrary.org/site/subscriptions/index.xhtml
Blood (print ISSN 0006-4971, online ISSN 1528-0020), is published weekly
by the American Society of Hematology, 2021 L St, NW, Suite 900,
Washington DC 20036.
Copyright 2011 by The American Society of Hematology; all rights reserved.
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
IMMUNOBIOLOGY
Paracrine inhibition of GM-CSF signaling by human cytomegalovirus in
monocytes differentiating to dendritic cells
Jérome Carlier,1-3 Hélène Martin,1-3 Bernard Mariamé,1-3 Benjamin Rauwel,1-3 Catherine Mengelle,4 Hugo Weclawiak,1-3
Alain Coaquette,5 Charline Vauchy,6 Pierre Rohrlich,6 Nassim Kamar,1-3,7 Lionel Rostaing,1-3,7 Georges Herbein,5 and
Christian Davrinche1-3
1Inserm U1043, Toulouse, France; 2Centre National de la Recherche Scientifique U5282, Toulouse, France; 3Université de Toulouse, UPS, Centre de
Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France; 4Centre Hospitalo-University (CHU) Toulouse, Hôpital Purpan, Service de Virologie, Toulouse, France;
5Département de Virologie, IFR133, EA3186, Université de Franche Comté, CHU Besançon, Besançon, France; 6Service d’Hématologie Clinique, CHU
Besancon, Inserm U-645/IFR 133, Besançon, France; and 7CHU Toulouse, Hôpital Rangueil, Service de Néphrologie, Toulouse, France
A primary HCMV infection or virus reactivation may cause severe disease in hosts
with a deficient immune system. The virus can disturb both innate and adaptive
immunity by targeting dendritic cell (DC)
functions. Monocytes, the precursors of
DCs in vivo (MoDCs), are the primary
targets of HCMV; they can also harbor
latent virus. The DCs generated from infected monocytes (CMV-MoDCs) have an
altered phenotype and functional defects.
We have shown that CMV-MoDCs do not
secrete IL-12 in response to lipopolysaccharide stimulation, cannot ingest dead
cells, induce TH1 differentiation, or the
proliferation of naive allogeneic CD4ⴙ
T cells. We found that the GM-CSF signaling in an entire population of CMV-MoDCs
was impaired, although only half of the
cells were productively infected, and that
IL-6 secretion and suppressors of cytokine signaling 3 induction contributed to
this bystander effect. We also showed
that MoDCs derived ex vivo from mono-
cytes of viremic patients had the same
altered phenotype as CMV-MoDCs, including decreased STAT5 phosphorylation,
indicating defective GM-CSF signaling.
We have thus described a new mechanism of HCMV-induced immunosupression, indicated how infection may disturb
both GM-CSF–dependent physiologic
processes and proposed GM-CSF–based
therapeutic approaches. (Blood. 2011;
118(26):6783-6792)
Introduction
Human CMV (HCMV) is a ␤-herpesvirus that infects most of the
human population during their lifetime. HCMV opportunistically
exploits its host immune defects to replicate and spread, so causing
severe disease. Transplant recipients, fetuses, and newborns are all
at risk of disease or death because of primary infections or virus
reactivation. HCMV also encodes a variety of proteins that disrupt
TCD4⫹ and TCD8⫹ antiviral responses; the latter are critical for
controlling the spread of virus and preventing associated diseases
(for a review see Crough and Khanna1). Dendritic cells (DCs) are
the sites of primary infection and are essential for capturing the
virus Ags needed to mould an appropriate CD8⫹ T-cell repertoire
against the virus. Thus, DCs are main targets of virus subversion.
DCs infected with HCMV have defects in all stages of Ag
presentation, migration to secondary lymphoid organs, and T-cell
activation (reviewed in Varani et al2). We have developed a
working hypothesis that these virus-induced changes can be
overcome by uninfected DC cross-presenting Ags to CD8⫹ T cells.3
Monocytes are primary targets of HCMV, can harbor latent virus,
and are a source of inflammatory DCs in vivo.4-6 We therefore
assumed that DC dysfunction was because of abnormalities arising
during the differentiation of their monocyte precursors. DCs
derived from infected monocytes in vitro and in patients who
received a transplant experiencing an active infection7,8 all have
abnormal phenotypes and function that may contribute to immunosuppression. However, the molecular and cellular mechanisms
underlying these defects are poorly documented. We have obtained
evidence that the infection of monocytes with HCMV results in
defective GM-CSF signaling, with inhibition of STAT5 phosphorylation that leads to dysfunctional derived DCs. These DCs had lost
critical features such as the ability to potentiate TH1 differentiation and proliferation because of secreted factors such as IL-6
that is essential for suppressors of cytokine signaling 3 (SOCS3)
synthesis. We have therefore provided new insights into the way
HCMV infections cause immunosuppressive damage and the
ensuing side effects.
Submitted February 17, 2011; accepted October 11, 2011. Prepublished online
as Blood First Edition paper, October 26, 2011; DOI 10.1182/blood-2011-02337956.
The publication costs of this article were defrayed in part by page charge
payment. Therefore, and solely to indicate this fact, this article is hereby
marked ‘‘advertisement’’ in accordance with 18 USC section 1734.
The online version of this article contains a data supplement.
© 2011 by The American Society of Hematology
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 䡠 VOLUME 118, NUMBER 26
Methods
Generation and culture of monocyte-derived DCs
DCs were generated from monocytes, and cell cultures were phenotyped as
described in supplemental Methods (available on the Blood Web site; see
the Supplemental Materials link at the top of the online article).
Viruses
The endothelial cell–adapted strain HCMVTB40/E GFP was provided by
M. Messerle (Hanover, Germany) and HCMVVHLE was provided by C.
Sinzger (Tubingen, Germany). HCMV BACTB40/E GFP (green fluorescent
protein) was designed and generated by E. Borst (Hanover, Germany) from
6783
6784
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 26
䡠
CARLIER et al
a HCMV BACTB40/E genome9 in which the US1 to US7 genomic fragment
was replaced by a GFP cassette under the control of mouse MIEP.
Viruses were amplified on MRC5 fibroblasts and collected by centrifugation at 100 000g for 35 minutes. Virus titers (PFU/mL) were determined
on MRC5 cells. Viruses were inactivated by UV irradiation for 20 minutes
at 0.17 Amp with the use of a Spectroline device.
Monocyte infection and treatment
Monocytes in differentiation medium were either mock-infected (medium)
or infected with live or UV-inactivated virus at a MOI of 5. Alternatively,
culture medium was supplemented with human recombinant IL-6 (25-50 ng/
mL; Ozyme), anti–IL-6 or anti–IL-6R blocking Abs, or IgG isotype control
(15 ␮g/mL; Gen-Probe Diaclone), and phosphonoacetic acid (PAA; 250 ␮g/
mL; Sigma-Aldrich). CMV-MoDC defines cells produced by the differentiation of infected monocytes and IL-6-MoDC defines cell supplemented with
IL-6. In experiments with conditioned medium, the culture medium was a
mixture of fresh differentiation medium and the medium to be tested (1/1;
vol/vol). When applicable, culture media were cleared of infectious virus by
centrifugation (100 000g for 35 minutes).
medium, and cocultured for 5 days in 96-well plates with T cells (95%-98%
purity) at a ratio of 1:10 (1 ⫻ 104 allogeneic stimulators for 1 ⫻ 105
T cells/well in 200 ␮L). IL-2 (50 U/mL; PeproTech) was then added to each
well, and culture was continued for a further 3 days. For TH2 polarization
experiments, IL-4 (5 ng/mL; PeproTech) and anti–IFN-␥ Ab (10 ␮g/mL;
BD Biosciences) were added to cocultures. Intracellular cytokines were
assayed on day 8 (see supplemental Methods). In CFSE experiments, naive
T cells were stained with CFSE (Invitrogen), cocultured for 5 days at a ratio
of 1 stimulator to 10 T cells as above, and T-cell proliferation was analyzed.
Patients
Flow cytometric analysis
The project was approved by the ethics committees of the Rangueil
Hospital (Toulouse) and Besançon Hospital (Besançon), and all patients
who provided samples gave their written informed consent in accordance
with the Declaration of Helsinki. PBMCs were isolated from patients’ blood
samples with the use of a Ficoll density gradient, and CD14⫹ cells were
sorted as described in supplemental Methods: “Generation and culture of
monocytes derived DCs.” Cells were differentiated to MoDCs for 5 days,
and their CD1a and pSTAT5 contents were determined. Secreted IL-6 in
blood plasma and MoDC supernatants were assayed with CBA. HCMV
DNA in patients’ blood was quantified by real-time PCR.10
Cells were treated, stained, and analyzed by flow cytometry on a FACSCalibur cytometer (BD Biosciences; supplemental Methods).
Statistical analysis
Western blot analysis
Electrophoresis of cell lysates and protein analysis by immunoblotting was
performed with standard procedures (supplemental Methods).
Values are expressed as the means ⫾ SDs of ⱖ 3 independent experiments.
Data were analyzed for significance with the Mann-Whitney U test or
Student t test, and a P value ⱕ .05 was considered significant. All data were
analyzed with Prism Version 5 (GraphPad) and FlowJo Version 7.6.5
(TreeStar) software.
RT-PCR analysis
PCRs were performed on reverse-transcribed total RNA as detailed in
supplemental Methods.
Phagocytosis assays
MRC5 cells were stained with PKH26 (Sigma-Aldrich) and cultured with
TNF-␣ (1 ␮g/mL) and cycloheximide (25 ␮g/mL; Sigma-Aldrich) in
complete DMEM medium for 24 hours to obtain apoptotic bodies. Apoptotic MRC5 cells were cocultured with DCs (1 DC for 2 MRC5 cells). Cells
were harvested and stained with an FITC-conjugated anti–HLA-DR Ab,
and double-positive cells were quantified on a FACSCalibur device. The
percentage of PKH26⫹/HLA-DR⫹ MoDCs was considered as 100% of
phagocytic activity. Alternatively, the Vybrant phagocytosis assay kit
(Escherichia coli bioparticles; Invitrogen) was used.
Cytokine quantification
Secreted inflammatory cytokines were detected with a dedicated Ab array
from Raybiotech. TNF-␣, IL-6, and IL-12p70 were measured with a
cytometric bead array assay (CBA; BD Biosciences) and the soluble form
of GM-CSF receptor (sGMR␣) by ELISA (Gen-Probe Diaclone).
Small interfering RNA transfection
Purified monocytes were treated with Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) and 50nM RNAi was directed against SOCS1 (3⬘-UCGAAGAGGCAGUCGAAGCUCUCGC-5⬘) or SOCS3 (3⬘-AGUAGAUGUAAUAGGCUCUUCUGGG-5⬘) mRNA (Invitrogen) or control RNAi (Invitrogen).
Corresponding protein expressions were checked by Western blot analysis
with the use of anti-SOCS3 or anti-SOCS1 Abs (Abcam).
Isolation of naive CD4ⴙ T cells and polarization experiments
Naive CD4⫹CD45RA⫹ T cells were isolated from PBMCs with the use of a
magnetic bead separation system (naive CD4⫹ T-cell isolation kit; Miltenyi
Biotec). Allogeneic stimulators were infected with HCMV or were treated
with anti–IL-6 or isotypic Abs during differentiation and then with ultrapure
lipopolysaccharide (LPS; Invivogen) for 24 hours, washed with culture
Results
Phenotype of DCs differentiated from HCMV-infected
monocytes
Adherent monocytes obtained from the peripheral blood of healthy
donors were either mock-infected or infected with HCMV (VHLE;
MOI of 5). The resulting MoDCs and CMV-MoDCs were obtained
by differentiation in a culture medium containing GM-CSF and
IL-13 for 5 days. IL-4 treatment always generated the same
phenotype as IL-13 (not shown). The MoDCs had the phenotype of
immature DCs bearing CD1a (95%) and CD1c (98%), CD80 (52%)
and CD86 (53%), but no CD14 (0%) or CD83 (3%). Only 10% of
infected MoDCs expressed CD1a, and only 19% had CD1c,
whereas most of them had the maturation marker CD83 (83%) and
had increased CD80 (85%) and CD86 (97%; Figure 1A). Identical
results were obtained when monocytes were positively selected
from PBMCs with the use of CD14 magnetic beads (data not
shown). Alternatively, the HCMV inoculum was UV-inactivated
before adding it to monocytes to determine whether the phenotype
modifications required live virus. UVCMV-MoDCs had the regular
MoDC phenotype (not shown), indicating that de novo synthesis of
virus proteins was necessary for production of the modified
phenotype. Surprisingly, monocytes are poorly permissive to
HCMV, but most CMV-MoDCs were modified. We therefore
measured the percentage of infected cells with an HCMV BAC
construct encoding a GFP. Approximately 50% of CMV-MoDCs
contained GFP-labeled fluorescence, whereas 82% of them were
positive for CD83 and 6% were positive for CD1a compared with
11% (CD83) and 90% (CD1a) of MoDCs (Figure 1B). These data
suggest that infected cells inhibited their uninfected counterparts
by secreting soluble factors. We therefore cultured monocytes for
5 days in standard medium (GM-CSF, IL-13) supplemented with
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
HCMV IMPAIRS GM-CSF SIGNALING AND DC FUNCTIONS
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 䡠 VOLUME 118, NUMBER 26
6785
Figure 1. Abnormal phenotype of DCs derived from
HCMV-infected monocytes results from a paracrine
effect. Monocytes (Mo) were differentiated into DCs
after mock-infection (MoDC) or infection with HCMVVHLE (CMV-MoDC) by culture for 5 days with GM-CSF
and IL-13. (A) Surface markers (CD1a, CD1c, CD14,
CD83, CD80, and CD86) were analyzed by flow cytometry, and the percentages of positive cells was determined as indicated. (B) Monocytes were infected with
BAC-TB40E/GFP and checked for GFP fluorescence
and by flow cytometry after labeling with anti-CD1a and
anti-CD83 Abs. (C) Monocytes were differentiated by
culture for 5 days with GM-CSF and IL-13 standard
medium supplemented with supernatants recovered from
MoDC (SN-MoDC), MoDC infected with live CMV
(SN-CMV-MoDC) or UV-inactivated CMV (SN-UVCMVMoDC). Cells were labeled with PE-anti-CD1a Abs, and
the percentage of CD1a⫹ cells was determined as
indicated. Representative of ⱖ 3 independent experiments.
supernatants recovered from 5-day cultures of MoDCs, CMVMoDCs, and UVCMV-MoDC. Most of the cells generated from
monocytes that had been exposed to medium conditioned by
CMV-MoDCs expressed no CD1a (11% of CD1a⫹ cells), whereas
those exposed to supernatants from UVCMV-MoDCs were unchanged (Figure 1C). Thus, monocytes infected with live HCMV
secrete soluble factors that alter their differentiation into standard
immature DCs.
Paracrine inhibition of STAT5 phosphorylation in CMV-MoDCs
We checked that monocytes that differentiated in the absence of
GM-CSF gave rise to DCs bearing no CD1a, as previously
reported11 (Figure 2A). We then investigated whether CMV-MoDC
phenotype could be because of, at least in part, a defect in GM-CSF
signaling. Because GM-CSF triggers STAT5 activation,12 which
requires the phosphorylation of tyrosine at position 694, we
measured the phosphorylated STAT5 (pSTAT5) in CMV-MoDCs
by Western blot analysis. The pSTAT5/total STAT5 ratio in DCs
generated in the absence of GM-CSF (⌬GM-MoDCs) was lower
than that of standard MoDCs (Figure 2B). This was also true for
CMV-MoDCs and monocytes differentiated in the presence of
CMV-MoDC supernatants. The altered phenotype of CMVMoDCs could therefore be because of a blockage of GM-CSF
signaling, perhaps by soluble factors secreted by infected monocytes during their differentiation. STAT5 phosphorylation was not
inhibited in cells treated with UVCMV, confirming that blocking
STAT5 activation requires live CMV. We substantiated the impairment of STAT5 activation in CMV-MoDCs by flow cytometry to
detect pSTAT5 in cells infected with BAC-GFP (Figure 2C). This
again pointed to HCMV impairing monocyte differentiation via a
paracrine effect. Inhibiting virus replication with PAA, which
inhibits late viral protein synthesis (supplemental Figure 1), did not
reverse the inhibition of STAT5 phosphorylation by HCMV,
suggesting that immediate early (IE) or early (E) virus products are
involved (Figure 2D).
Paracrine effect of IL-6 on differentiating monocytes
Cytometric analysis showed that there was more GM-CSF receptors on the cell surface of CMV-MoDCs than on MoDCs at day 2 of
differentiation (supplemental Figure 2A). Hence, impaired surface
6786
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 26
CARLIER et al
䡠
Figure 2. Paracrine inhibition of STAT5 phosphorylation in CMV-MoDCs. Monocytes were differentiated into
DCs by culture with (MoDC) or without GM-CSF (⌬GMMoDC) and IL-13. (A) The percentage of MoDCs (Med)
and ⌬GM-MoDC (⌬GM) cells bearing CD1a and CD83
was determined by flow cytometry with PE-Abs. (B) Total
and phosphorylated STAT5 (pSTAT5) analyzed by Western blotting of cell lysates recovered from MoDCs (Med),
⌬GM-MoDCs (⌬GM), cells issued from monocytes infected with live CMV (CMV), or UV-inactivated CMV
(UVCMV), or monocytes incubated with supernatants
from MoDC (SN-MoDC), CMV-MoDC (SN-CMV-MoDC),
and UVCMV-MoDC (SN-UVCMV-MoDC). ␤-actin was
used as control. The histograms below represent the
quantification of 3 independent experiments. (C) The
percentage of cells containing pSTAT5 after infection
with BAC-TB40E/GFP was determined by flow cytometry after sequential labeling with a mouse monoclonal
Ab specific for pSTAT5 (P-Y694) and PE-labeled anti–
mouse Ab. (D) Total and phosphorylated STAT5 proteins
were assayed by Western blotting of MoDCs (Med) and
CMV-MoDCs (CMV) treated (⫹) or not (⫺) with PAA
(250 ␮g/mL) during differentiation. The histogram (right)
represents the quantification of 3 independent experiments. Representative of ⱖ 3 independent experiments
(A,C).
expression of the GM-CSF receptor could not cause the defective
STAT5 signaling in CMV-MoDCs.
The secretion of a sGMR␣ by monocytes can be stimulated by
an inflammatory stimulation.13 We therefore measured the sGMR␣
in the culture media of MoDCs, CMV-MoDCs, and UVCMVMoDCs by ELISA. The medium from CMV-MoDCs contained
much more sGMR␣ than that from MoDCs. Inactivation of CMV
by UV irradiation resulted in the concentration of sGMR being
similar to that of controls, again indicating that live virus is
required for the modified phenotype of CMV-MoDCs (supplemental Figure 2B). However, the concentration of sGMR␣ in the
supernatants of MoDCs was as high as those of CMV-MoDCs in
some experiments, although the phenotype of the cells was
unchanged (data not shown), indicating that other factors were
involved.
We assayed the inflammatory cytokines in culture supernatants
of MoDCs and CMV-MoDCs with the use of an Ab array to
investigate the soluble factors responsible for the defective STAT5
activation. Infected monocytes secreted higher concentrations of
IL-6 and IL-8 than did MoDCs after 2 days in culture (Figure 3A).
Infected monocytes also secreted more MIP-1␤, sTNFRII, and
MCP-1, although to a lesser extent. The IL-6 in the culture medium
of cells allowed to differentiate for 1-5 days was also assayed by
CBA. IL-6 was undetectable in supernatant from MoDCs throughout the 5 days and increased slightly in supernatant from UVCMVMoDCs from day 1 (1.8 ng/mL) to day 4 (2.9 ng/mL). In contrast,
the IL-6 in the supernatant from CMV-MoDCs increased dramatically from 5.7 ng/mL (day 1) to 37 ng/mL (day 5). Because IL-6
influences monocyte differentiation and DC function,14,15 we
examined its influence on the CMV-MoDC phenotype and function. Monocytes differentiated in standard medium supplemented
with IL-6 (IL-6-MoDC) had no CD1a or CD1c on their surfaces
(Figure 3B). STAT5 phosphorylation was inhibited in cells cultured
in medium containing IL-6 concentrations similar to those in the
supernatants of CMV-MoDCs (Figure 3C). We monitored STAT5
phosphorylation in CMV-MoDCs differentiated in medium containing anti–IL-6 Ab to confirm that IL-6 influenced the acquisition of
the CMV-MoDC phenotype (Figure 3D). STAT5 was phosphorylated in cells when IL-6 was blocked, indicating that IL-6 is
important in the paracrine inhibition of STAT5 signaling in
CMV-MoDCs.
Influence of SOCS3 on GM-CSF–mediated STAT5 signaling in
CMV-MoDCs
SOCS plays a key role in inhibiting the Jak/Stat pathways.16 We
therefore monitored SOCS1 and SOCS3 synthesis in MoDCs,
CMV-MoDCs, and IL6-MoDCs. The concentrations of mRNAs
encoding SOCS1 and SOCS3 were higher in CMV-MoDCs and in
IL-6-MoDCs than in MoDCs (Figure 4A). We then blocked IL-6
signaling with Abs directed against the IL-6 receptor to determine
how IL-6 inhibited the GM-CSF–mediated activation of STAT5 in
CMV-MoDCs. Secreted IL-6 stimulated the synthesis of SOCS3
but not SOCS1 (Figure 4B). Moreover, treating CMV-MoDCs with
SOCS3 small interfering RNA restored the phosphorylation of
STAT5, whereas siSOCS1 did not (Figure 4C-D; supplemental
Figure 3). These data strongly suggest that the IL-6–induced
synthesis of SOCS3 is at least partially responsible for blocking
GM-CSF–mediated STAT5 signaling in CMV-MoDCs.
IL-6 and the inhibition of phagocytosis in CMV-MoDCs
Abnormal GM-CSF activity had been reported to decrease the
phagocytic activity of neutrophils17 and MoDCs.18 We have
previously shown that the phagocytosis of infected dead cells by
MoDCs is crucial for Ag cross-presentation to CD8⫹ T cells.19 We
have now investigated the phagocytic function of CMV-MoDCs by
adding PKH26-labeled dead cells to MoDCs, CMV-MoDCs,
⌬GM-MoDCs, IL-6–MoDCs, (SN-MoDC)–MoDCs, and (SNCMVMoDC)–MoDCs. The phagocytic activity of CMV-MoDCs and
⌬GM-MoDCs was only 20% that of MoDCs, suggesting that
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
HCMV IMPAIRS GM-CSF SIGNALING AND DC FUNCTIONS
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 䡠 VOLUME 118, NUMBER 26
6787
Figure 3. Increased IL-6 secretion by CMV-MoDCs
and inhibition of STAT5 phosphorylation by IL-6.
Monocytes were differentiated into DCs by culture for
5 days with GM-CSF and IL-13 after mock-infection
(Med), infection with live (CMV-MoDC), or UV-inactivated
CMV (UVCMV). (A) MoDCs (Med) and CMV-MoDCs
(CMV) were differentiated by culture for 5 days; their
inflammatory cytokines were assayed with a dedicated
Ab array (Raybiotech), and IL-6 was quantified by CBA.
(B) Monocytes were also differentiated in the presence
of recombinant IL-6. The percentages of cells expressing
CD1a, CD1c, and CD83 were determined by flow cytometry. (C-D) Total and phosphorylated STAT5 (pSTAT5)
were analyzed by Western blotting of cell lysates of
IL-6–MoDCs (IL-6) and CMV-MoDCs (CMV) or CMVMoDCs treated with anti–IL-6 neutralizing Abs (␣IL-6;
15 ␮g/mL). The histograms below their respective Western blots represent the quantification of 3 independent
experiments. Error bars indicate the SD. Representative
of ⱖ 3 independent experiments.
GM-CSF signaling also plays a role in this process (Figure 5A).
The CMV-induced IL-6–mediated inhibition of STAT5 accounted
at least in part for this defect in CMV-MoDCs because the
phagocytic capacity of IL-6–MoDCs was ⬃ 50% that of MoDCs.
However, although adding conditioned medium from CMVMoDCs to MoDCs mimicked the effect of IL-6 (50% reduction;
Figure 5B), neutralization of IL-6 with anti–IL-6 Abs did not
restore phagocytosis. Thus, IL-6 may not be the only secreted
factor involved in this effect. Assays of phagocytosis which used
E coli bioparticles gave similar results (data not shown). Thus, the
defective phagocytosis of dead cells by CMV-MoDCs probably
involves both autocrine and paracrine inhibition of STAT5 signaling, some of which involves IL-6.
IL-6 secretion and blockage of allogeneic T-cell proliferation
and TH1 polarization by CMV-MoDCs
DCs and their environment help determine the programming of
T cells toward TH1 or TH2 subsets. We have examined how the
polarization of naive CD4⫹ T cells is influenced by CMV-MoDCs.
One of the mechanisms by which DCs drive TH1 differentiation
involves IL-12p70. It is generally agreed that the secretion of
IFN-␥ by differentiated T cells correlates with the amount of IL-12
secreted by stimulated MoDCs2 in mixed lymphocyte reactions
(MLRs),20 whereas IL-4 production promotes TH2 differentiation.
We measured the amount of IL-12p70 secreted by MoDCs,
CMV-MoDCs, and IL-6–MoDCs that had been stimulated with
LPS, a known activator of IL-12 secretion. CMV-MoDCs were
much less responsive (67 pg/mL) than MoDCs (380 pg/mL),
whereas IL-6–MoDCs produced almost no detectable IL-12p70
(Figure 6A). No DC population secreted any IL-12p70 without
LPS stimulation. The production of IL-12p70 by stimulated
MoDCs was inhibited by adding CMV-MoDC supernatants. However, neutralization of IL-6 did not restore IL-12p70 production,
suggesting that IL-6 is not the only factor involved (Figure 6B). We
used MLR experiments to study TH polarization by DCs. Unactivated and LPS-activated MoDCs, CMV-MoDCs, and IL-6-MoDCs
were washed and cocultured for 8 days with allogeneic naive
T cells. The TH1 and TH2 responses were assessed by flow
cytometry by measuring the IL-4 and IFN-␥ produced by T cells.
MoDCs promoted the production of IFN-␥ in 19.6% and LPSstimulated MoDCs in 33.0% of T cells (Figure 6C), correlating the
ability of MoDCs to potentiate the TH1 response with IL-12p70
secretion. In contrast, LPS-stimulated CMV-MoDCs induced IFN-␥
secretion in very few T cells (6.56%). Few T cells secreted IFN-␥
when incubated with LPS-unstimulated CMV-MoDCs, suggesting
that CMV-MoDCs are intrinsically unable to prime a TH1 response
(data not shown). IL-6–MoDCs treated with LPS also showed a
reduced capacity to prime TH1 (Figure 6C), suggesting that IL-6
alters the ability of MoDCs to polarize T cells toward TH1. T cells
stimulated with MoDCs that had been treated with CMV-MoDC
conditioned medium (SN-CMV-MoDCs) and LPS formed fewer
IFN-␥–producing T cells (18%) than did those stimulated with
supernatants from MoDCs (28.0%). The rate of TH1 formation was
restored (33.9%) by blocking the IL-6 in these supernatants (Figure
6D). The IL-6 secreted by CMV-MoDCs during differentiation
therefore prevents them from stimulating T cells to form TH1. None
of the DC populations induced detectable IL-4– (Figure 6) or
IL-17– (data not shown) secreting cells after stimulation with LPS.
This indicates that CMV-MoDCs do not stimulate naive T cells to
form either TH2 or TH17, although they were able to differentiate
toward TH2 when stimulated with MoDCs treated with IL-4 and
anti–IFN-␥ Abs (supplemental Figure 4). Besides impaired TH1
commitment, incubation of naive T cells with LPS-stimulated
CMV-MoDCs or MoDCs conditioned with SN-CMV-MoDCs
blocked their proliferation (Figure 6E). Thus, the infection of
monocytes with CMV causes profound changes in the ability of
CMV-MoDCs to promote TH1 proliferation and activation, partly
because of secreted IL-6.
6788
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 26
䡠
CARLIER et al
(Figure 7A). Furthermore, the MoDCs derived from all the viremic
patients lost their ability to phosphorylate STAT5 on differentiation
(Figure 7E). These data reinforce the in vitro findings of the role of
IL-6 and the subsequently defective GM-CSF signaling in DCs
derived from infected monocytes.
Discussion
Figure 4. Increased SOCS3 and inhibition of STAT5 phosphorylation in CMVMoDCs. (A-B) Mock-infected (Med), HCMV-infected (CMV), or IL-6–treated (50 ng/
mL) monocytes were differentiated by culture with GM-CSF and IL-13 for 5 days.
Alternatively, medium (NT), or neutralizing Ab against IL-6 receptor (␣IL-6R; 15 ␮g/
mL) or isotype Ab (iso; 15 ␮g/mL) was added to infected cells during differentiation.
SOCS1, SOCS3, and ␤-actin mRNAs were analyzed by RT-PCR. (C-D) Total and
phosphorylated STAT5 protein (pSTAT5) were assessed by Western blotting of
mock-infected (Med) and HCMV-infected (CMV) cells. Cells were transfected with
SOCS1, SOCS3, and control small interfering RNA (siRNA; Ctrl) as indicated. ␤-actin
was used as control. The histograms below RT-PCR (A-B) and Western blots (C-D)
represent the quantification of 3 independent experiments.
Infection by HCMV is known to disturb both innate and adaptive
immune responses. DCs are main virus targets to prevent the
stimulation of antiviral T cells. However, this is always incomplete
because the virus immune evasion functions are circumvented by
the host.3 Because monocytes are the precursors of DCs in vivo and
HCMV may infect them to further establish latency, we examined
the effects of infection on monocyte differentiation and DC
dysfunction.
Monocytes were differentiated into DCs by the coordinated
action of GM-CSF and IL-13, which models the phenotype and
function of inflammatory and migratory DCs in vivo.21 MoDCs
infected by HCMV lost their standard CD1a⫹ immature phenotype
and acquired the maturation marker CD83, probably because of the
bystander effect of TNF-␣, a known inducer of DC maturation,
secreted by infected cells in the early phase of differentiation.
Discrepancies with published data7 about both cell maturation and
the requirement for live virus could be partly because of the use by
others of the laboratory strain AD169 that has a 19-kbp genome
deletion not found in clinical strains. CD1a and CD1c bind and
present lipid Ags to T cells,22 in addition to being DC phenotype
markers. Their expressions are subnormal in CMV-MoDCs and in
infected DCs,23 but their role in controlling HCMV infection
remains to be studied. We have found evidence for a powerful
paracrine mechanism that leads to modification of the phenotype of
the whole population of CMV-MoDCs. Even though only a fraction
of the cells contained the IE/E virus proteins, this viral protein
expression seems to be critical for initiating this process. We
considered the possibility that there was a failure of GM-CSF
signaling in CMV-MoDCs because GM-CSF is needed to generate
inflammatory DCs from monocytes in vivo21 and because there are
functional and phenotypic defects (CD1a⫺) in MoDCs generated in
the absence of GM-CSF.11 We showed that STAT5 activation was
Correlation of the phenotype of cells from patients with HCMV
viremia and CMV-MoDCs
We investigated the relevance of these observations in vivo with
the use of monocytes from patients who received a transplant
experiencing CMV viremia (Table 1). The monocytes were differentiated into DCs (MoDCs). The MoDCs from viremic patients
formed cell clusters (Figure 7A), a feature indicating cell activation
as observed in cultured CMV-MoDCs. The medium recovered after
5 days of differentiation contained no detectable viral genome,
suggesting the absence of virus replication. Significantly fewer
MoDCs from CMV-positive patients bore CD1a than those from
CMV-negative patients (Figure 7B). IL-6 was quantified in the
growth medium and blood plasma, and the phosphorylation of
STAT5 in MoDCs was analyzed. Patients 7 and 8 had very high
virus loads (480 000 and 340 000 copies/mL, respectively); these
were correlated with large amounts of IL-6 secreted by their
MoDCs and in their plasma (Figure 7C-D) and few CD1a⫹ cells
Figure 5. IL-6 is not crucial for inhibition of phagocytosis in CMV-MoDCs.
Monocytes differentiated for 5 days as described below were cocultured with
PKH-26–labeled apoptotic fibroblasts for 24 hours. Phagocytic activity was determined as described in “Phagocytosis assays.” (A) Monocytes were differentiated in
standard medium (Med), after infection (CMV), with added IL-6 (50 ng/mL), or without
GM-CSF (⌬GM). (B) Monocytes were differentiated in the presence of supernatant
from MoDCs (SN-MoDC) or CMV-MoDCs (SN-CMV-MoDC) supplemented with
medium (NT), IL-6 neutralizing Ab (␣IL-6; 15 ␮g/mL), or isotype control Ab (iso;
15 ␮g/mL). Results are expressed as the percentage of phagocytic activity relative to
MoDCs (100%). Error bars indicate the SD. Representative of ⱖ 3 independent
experiments.
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
HCMV IMPAIRS GM-CSF SIGNALING AND DC FUNCTIONS
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 䡠 VOLUME 118, NUMBER 26
Figure 6. Blockage of allogenic T-cell proliferation and TH1 polarization by
CMV-MoDCs is partially because of IL-6 secretion. (A,C) Monocytes were either
mock-infected (Med) or infected with CMV (CMV) or supplemented with IL-6
(50 ng/mL), differentiated in the presence of GM-CSF and IL-13 for 5 days and
treated (or not) with ultrapure LPS (200 ng/mL) for 24 hours. (B,D) Supernatant from
MoDCs (SN-MoDC) or CMV-MoDCs (SN-CMV-MoDC) were added to monocytes
before differentiation in the presence (␣IL-6; 15 ␮g/mL) or not (NT) of anti–IL-6
neutralizing Abs or isotypic Ab as control (iso; 15 ␮g/mL). (A-B) IL-12 was quantified
by CBA on day 6 of culture. (C-D) DCs derived from monocytes as described above
were cocultured with naive allogenic T cells for 8 days after adding IL-2 (50 U/mL) on
day 5. Cells were fixed, permeabilized, double-labeled with anti–IL-4 and anti–IFN-␥
Abs, and analyzed by flow cytometry. (E) Monocytes were either mock-infected
(Med), or infected with CMV (CMV), or treated with supernatant (SN) as indicated
before differentiation. Naive allogenic T cells were stained with CFSE and cocultured
for 5 days with monocyte-derived DCs as indicated. The proliferation of T cells was
analyzed by flow cytometry. Error bars represent SD. Representative of ⱖ 3 independent experiments. P values were obtained with Student t test.
inhibited in the whole population of CMV-MoDCs, which may
block GM-CSF signaling, and that this was because of soluble
factors secreted by a fraction of infected monocytes.
Our first hypothesis was that the soluble GM-CSF receptor
sGMR␣ blocked the binding of GM-CSF to its receptor. The
significantly increased sGMR␣ concentration in some preparations
of CMV-MoDCs pointed to its implication in impairing STAT5
signaling. However, individual variations in the concentrations of
constitutive sGMR␣ in monocytes and our inability to neutralize
sGMR␣ in culture supernatants have made it impossible to decide
6789
on the effect of sGMR␣ at this stage. One of the inflammatory
cytokines induced by HCMV, IL-6, is suspected to be a key factor
in the failure of organ and BM transplantations.24 IL-6 has also
been identified in the HCMV secretome of endothelial cells as a
mediator of angiogenesis and cell survival25 and in tumor cells as a
paracrine factor in tumor progression and vascularization through
activation of the STAT3 cascade.26 We find that DCs derived from
the differentiation of monocytes supplemented with IL-6 bore no
CD1a or CD1c. Moreover, neutralizing IL-6 during the differentiation of infected monocytes restored phosphorylation of STAT5,
suggesting that IL-6 blocks GM-CSF receptor signaling. Previous
data have shown that IE1 increases the activity of the IL-6
promoter,27 which may explain why UV-inactivated virus barely
increased IL-6 secretion and had no effect on STAT5 phosphorylation. Thus, the secretion of IL-6 by UVCMV is initiated by the
activation of NF-␬B but cannot be maintained because of blockade
of IE1 transcription after UV irradiation.
The inhibition of STAT5 phosphorylation in DCs generated
from monocytes involves SOCS3 and SOCS1,18 and SOCS1 can
abolish GM-CSF signal transduction in DC precursors28 but not in
conditions of viral infection. Furthermore, induction of SOCS3 by
IL-6 is crucial for the regulation of the inflammatory response,
whereas the IL-6–mediated induction of SOCS3 could inhibit
insulin receptor signaling.16,29 We have now obtained evidence that
IL-6 secreted by CMV-MoDCs is crucial for the induction of
SOCS3, which in turn leads to the inhibition of STAT5 phosphorylation that may reflect blockage of the GM-CSF receptor signaling
by SOCS3 but not SOCS1.
The influence of STAT5 blockage by SOCS on the phagocytic
activity of MoDCs was deduced18 from the inability of cells to
internalize dextran. Defects in the phagocytosis of dextran and
yeast particles by CMV-MoDCs have been reported,7 but they have
little physiologic relevance. The sequestration of tumor and viral
Ags through phagocytosis of dead cells by DCs is a key step in
T-cell activation.30,31 We examined the capacity of CMV-MoDCs to
ingest apoptotic and necrotic bodies prepared from infected
fibroblasts because this phagocytosis is a critical step in the
cross-presentation of HCMV Ags to CD8⫹ T cells.19 The inhibition
of this process involved soluble factors secreted by CMV-MoDCs,
but IL-6 was not the only factor involved. It has been reported that
IL-6 can cause monocytes to differentiate to macrophages rather
than DCs,15 but no information was provided about their phagocytic capacities. IL-6 can also reactivate latent HCMV in a model
of primary monocytes infected in vitro,32 which makes our findings
also relevant to the differentiation of latently infected monocytes.
Giving GM-CSF to patients with carcinoma improved their clearance of apoptotic cells,33 suggesting a link between the activation
of STAT5 and the expression of genes promoting phagocytosis.
Because PU.1, a transcription factor induced by pSTAT5, drives
such genes,34 we looked for PU.1 mRNA and protein in CMVMoDCs, but their expressions were similar to those in MoDCs
(data not shown). CD36 and ␣v␤5 integrin could be involved in the
uptake of apoptotic cells by DCs,31 but we observed no alteration in
CD36 in DCs (data not shown). The ␣v␤5 integrin remains to be
explored. Because inhibition of phagocytosis could provide the
virus with a new way of escaping the host immune response, it
might be worth exploring the capacity of CMV-MoDCs to crosspresent viral Ag to CD8⫹ T cells.
We performed MLRs with CMV-MoDCs as stimulators because
IL-6 influences T-cell activation and the commitment of naive
T cells to form TH1 or TH2. Cells were treated with LPS, which
induces APCs to secrete IL-12 and is usually a prerequisite for
6790
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 26
䡠
CARLIER et al
Table 1. Demographic, immunosuppressive regimen, and virologic data from organ recipients
Patients
Transplanted
organ
Time from
transplantation, mo
Immunossupressive
regimen
CMV serologic status
before transplantation
Heart
156
CsA/MPA/CS
R⫹
ND
Kidney
168
Tac/MPA
R⫹
ND
1
Tac/MPA/CS
R⫹
ND
Kidney
6
Tac/MPA/CS
R⫹
ND
Kidney
26
Tac/MPA/CS
R⫺
ND
Sex
Age, y
1
M
58
2
M
45
3
M
63
Liver
4
F
63
5
M
67
CMV viremia,
copies/mL
CMVⴚ
CMVⴙ
6
M
50
Kidney
240
7
M
56
Kidney
8
8
M
49
Kidney
2
9
M
20
Kidney
12
MPA/CS
R⫹
36 000
Tac/MPA/CS
R⫺
480 000
Jak3i/MPA/CS
R⫹
341 000
Tac/MPA/CS
R⫹
67 000
CsA indicates cyclosporin A; MPA, mycophenolic acid; CS, corticosteroid; R, recipient; ND, not detectable; Tac, tacrolimus; and JAK3i, JAK3 inhibitor.
naive cells to produce IFN-␥. Our data showing that HCMV
inhibited IL-12p70 secretion by LPS-activated CMV-MoDCs extend previous reports that used infected DCs from adults35 and
neonates.36 The defect in IL-12p70 secretion by CMV-MoDCs was
not because of IL-6, even though SOCS1, a negative regulator of
both IL-12 synthesis37,38 and TH1 promotion,39 was induced.
Nevertheless, the secretion of IFN-␥ by T cells was restored when
the IL-6 in supernatants of CMV-MoDCs was neutralized before
adding it to T cells, suggesting the dissociation of IL-12p70
secretion from TH1 commitment as reported in experiments that
implicated Notch signaling.40 We have demonstrated the capacity
of HCMV to impair the commitment of T cells to form TH1, by a
mechanism that may disturb the overall host response. Protein
array studies have reported that CMV-MoDCs secreted more
Figure 7. Reduced CD1a and pSTAT5 in MoDCs from viremic patients
who had received a transplant. Monocytes were isolated from the blood
of patients who had received a transplant with the use of Ficoll gradients
followed by sorting with anti-CD14 magnetic separation beads. Cells were
differentiated into MoDCs in culture medium containing GM-CSF and
IL-13 for 5 days. (A) Light microscopy of monocytes after 3 days in culture
(⫻200; Zeiss, Telaval 31). Images were acquired with a Nikon Eclipse TE
2000_v; 20⫻/0.35 objective; culture medium 37°C; camera: Nikon
DX71200C; Adobe Photo-shop 9.02. (B) The percentage of MoDCs
expressing CD1a was determined by flow cytometry. (C-D) Amounts of
IL-6 secreted by MoDCs (C) and in plasma of patients who received a
transplant (D) were determined by CBA. (E) Total and phosphorylated
STAT5 (pSTAT5) was assessed by Western blotting of MoDC extracts with
␤-actin as control. The histogram below the Western blots represents
quantification of proteins from all the patients. Lines represent median
values. Mann-Whitney U tests were used to determine statistical
significance.
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
HCMV IMPAIRS GM-CSF SIGNALING AND DC FUNCTIONS
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 䡠 VOLUME 118, NUMBER 26
MIP-1␤ and IL-6 than did MoDCs. The chemokine MIP-1␤
reduces the polarization of T cells to TH1 when added to LPSstimulated MoDCs in MLRs.20 Thus, HCMV may interfere with
the polarization of naive T cells via MIP-1␤ and the resulting ERK
activation, but this needs further investigation. The negative
regulation of GM-CSF receptor signaling by a Src-like adaptor41
and the disruption of DC metabolism because of SOCS3 blocking
M2 pyruvate kinase42 have yet to be investigated. PPAR␥ activation may be involved in the alterations in DC phenotype and
function43; this is being investigated because we have shown that
HCMV activates PPAR␥.44
The relevance of our in vitro observations is supported by data
obtained from naturally infected MoDCs derived from viremic patients
whose high virus loads were correlated with the absence of CD1a,
confirming previous observations.8 The blockage of STAT5 phosphorylation in MoDCs and the high IL-6 contents of both MoDC supernatants
and patients’blood plasma further suggest abnormal GM-CSF signaling
because of HCMV. Because MoDCs from patients produced no virus
suggests that the ability of monocytes infected in vivo to differentiate
into standard DCs was modified. HCMV may enhance the host’s
susceptibility to secondary bacterial infections, because GM-CSF is
essential for neutrophil function and proliferation. These findings
provide new insights into how HCMV infection impairs the overall
innate and adaptive responses, and these should be taken into account
when using immunomodulatory therapies that are based on GM-CSF to
treat infectious diseases in solid-organ transplant recipients,45 as in
prophylaxis against sepsis in preterm neonates46 and in fighting cancer.47
6791
Acknowledgments
The authors thank all the patients who donated blood, S. Chavanas,
E. Champagne, and K. Leghmari for critically reading the manuscript, and F. L’faqihi and V. Duplan for technical assistance in flow
cytometry. The English text was edited by Dr Owen Parkes.
This work was supported by institutional grants from Inserm.
J.C. is supported by a Fondation pour la Recherche Médicale
fellowship.
Authorship
Contribution: J.C. designed and performed experiments, analyzed
data, and wrote the manuscript; H.M. designed experiments; B.M.
prepared HCMV-BAC; B.R. analyzed data; C.M. performed virologic diagnosis; H.W. collected patients and analyzed data; A.C.,
C.V., P.R., N.K., L.R., and G.H. collected patients; C.D. designed
experiments, analyzed data, and wrote the manuscript; and all the
authors approved the final manuscript.
Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing financial interests.
Correspondence: Christian Davrinche, Inserm 1043, CPTP Bat
B, CHU Purpan, Toulouse, 31024 France; e-mail: christian.
[email protected].
References
1. Crough T, Khanna R. Immunobiology of human
cytomegalovirus: from bench to bedside. Clin Microbiol Rev. 2009;22(1):76-98.
2. Varani S, Frascaroli G, Landini MP, SoderbergNaucler C. Human cytomegalovirus targets different subsets of antigen-presenting cells with
pathological consequences for host immunity:
implications for immunosuppression, chronic inflammation and autoimmunity. Rev Med Virol.
2009;19(3):131-145.
3. Martin H, Mandron M, Davrinche C. Interplay between human cytomegalovirus and dendritic cells
in T cell activation. Med Microbiol Immunol. 2008;
197(2):179-184.
4. Reeves MB, Sinclair JH. Analysis of latent viral
gene expression in natural and experimental latency models of human cytomegalovirus and its
correlation with histone modifications at a latent
promoter. J Gen Virol. 2010;91(Pt 3):599-604.
5. Geissmann F, Manz MG, Jung S, Sieweke MH,
Merad M, Ley K. Development of monocytes,
macrophages, and dendritic cells. Science. 2010;
327(5966):656-661.
6. Cheong C, Matos I, Choi JH, et al. Microbial
stimulation fully differentiates monocytes to
DC-SIGN/CD209(⫹) dendritic cells for immune
T cell areas. Cell. 2010;143(3):416-429.
7. Gredmark S, Soderberg-Naucler C. Human cytomegalovirus inhibits differentiation of monocytes
into dendritic cells with the consequence of depressed immunological functions. J Virol. 2003;
77(20):10943-10956.
8. Varani S, Frascaroli G, Gibellini D, et al. Impaired
dendritic cell immunophenotype and function in
heart transplant patients undergoing active cytomegalovirus infection. Transplantation. 2005;
79(2):219-227.
9. Sinzger C, Hahn G, Digel M, et al. Cloning and
sequencing of a highly productive, endotheliotropic virus strain derived from human cytomegalovirus TB40/E. J Gen Virol. 2008;89(Pt 2):359-368.
10. Mengelle C, Mansuy JM, Da Silva I, Davrinche C,
Izopet J. Comparison of 2 highly automated
nucleic acid extraction systems for quantitation of
human cytomegalovirus in whole blood. Diagn
Microbiol Infect Dis. 2011;69(2):161-166.
11. Roy KC, Bandyopadhyay G, Rakshit S, Ray M,
Bandyopadhyay S. IL-4 alone without the involvement of GM-CSF transforms human peripheral
blood monocytes to a CD1a(dim), CD83(⫹) myeloid dendritic cell subset. J Cell Sci. 2004;117(Pt
16):3435-3445.
12. Lehtonen A, Matikainen S, Miettinen M, Julkunen I.
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)-induced STAT5 activation and target-gene expression during human monocyte/
macrophage differentiation. J Leukoc Biol. 2002;
71(3):511-519.
13. Prevost JM, Pelley JL, Zhu W, et al. Granulocytemacrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)
and inflammatory stimuli up-regulate secretion of
the soluble GM-CSF receptor in human monocytes: evidence for ectodomain shedding of the
cell surface GM-CSF receptor alpha subunit.
J Immunol. 2002;169(10):5679-5688.
14. Mitani H, Katayama N, Araki H, et al. Activity of
interleukin 6 in the differentiation of monocytes to
macrophages and dendritic cells. Br J Haematol.
2000;109(2):288-295.
15. Chomarat P, Banchereau J, Davoust J, Palucka AK.
IL-6 switches the differentiation of monocytes
from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol. 2000;1(6):510-514.
16. Yoshimura A, Naka T, Kubo M. SOCS proteins,
cytokine signaling and immune regulation. Nat
Rev Immunol. 2007;7(6):454-465.
17. Uchida K, Beck DC, Yamamoto T, et al. GM-CSF
autoantibodies and neutrophil dysfunction in pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 2007;
356(6):567-579.
18. Stevenson NJ, Addley MR, Ryan EJ, et al. CCL11
blocks IL-4 and GM-CSF signaling in hematopoietic cells and hinders dendritic cell differentiation
via suppressor of cytokine signaling expression.
J Leukoc Biol. 2009;85(2):289-297.
19. Mandron M, Martin H, Bonjean B, Lule J, Tartour E,
Davrinche C. Dendritic cell-induced apoptosis of
human cytomegalovirus-infected fibroblasts promotes cross-presentation of pp65 to CD8⫹
T cells. J Gen Virol. 2008;89(Pt 1):78-86.
20. Perrin-Cocon L, Agaugue S, Diaz O, et al. Th1
disabled function in response to TLR4 stimulation
of monocyte-derived DC from patients chronically-infected by hepatitis C virus. PLoS One.
2008;3(5):e2260.
21. Shortman K, Naik SH. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 2007;7(1):19-30.
22. Salio M, Silk JD, Cerundolo V. Recent advances
in processing and presentation of CD1 bound
lipid antigens. Curr Opin Immunol. 2010;22(1):8188.
23. Raftery MJ, Hitzler M, Winau F, et al. Inhibition of
CD1 antigen presentation by human cytomegalovirus. J Virol. 2008;82(9):4308-4319.
24. Humbert M, Delattre RM, Fattal S, et al. In situ
production of interleukin-6 within human lung allografts displaying rejection or cytomegalovirus
pneumonia. Transplantation. 1993;56(3):623627.
25. Botto S, Streblow DN, Defilippis V, et al. IL-6 in
human cytomegalovirus secretome promotes angiogenesis and survival of endothelial cells
through the stimulation of survivin. Blood. 2011;
117(1):352-361.
26. Slinger E, Maussang D, Schreiber A, et al.
HCMV-encoded chemokine receptor US28 mediates proliferative signaling through the IL-6STAT3 axis. Sci Signal. 2010;3(133):ra58.
27. Geist LJ, Dai LY. Cytomegalovirus modulates interleukin-6 gene expression. Transplantation.
1996;62(5):653-658.
28. Bartz H, Avalos NM, Baetz A, Heeg K, Dalpke AH.
Involvement of suppressors of cytokine signaling
in toll-like receptor-mediated block of dendritic
cell differentiation. Blood. 2006;108(13):41024108.
6792
From bloodjournal.hematologylibrary.org at UNIVERSITE PAUL SABATIER - SCD on February 3, 2012. For
personal use only.
BLOOD, 22 DECEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 26
䡠
CARLIER et al
29. Emanuelli B, Peraldi P, Filloux C, Sawka-Verhelle D,
Hilton D, Van Obberghen E. SOCS-3 is an insulin-induced negative regulator of insulin signaling.
J Biol Chem. 2000;275(21):15985-15991.
30. Arrode G, Boccaccio C, Lule J, et al. Incoming
human cytomegalovirus pp65 (UL83) contained
in apoptotic infected fibroblasts is cross-presented to CD8(⫹) T cells by dendritic cells. J Virol. 2000;74(21):10018-10024.
31. Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, et al. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells
via alphavbeta5 and CD36, and cross-present
antigens to cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med.
1998;188(7):1359-1368.
32. Hargett D, Shenk TE. Experimental human cytomegalovirus latency in CD14⫹ monocytes. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2010;107(46):20039-20044.
33. Galati G, Rovere P, Citterio G, et al. In vivo administration of GM-CSF promotes the clearance
of apoptotic cells: effects on monocytes and polymorphonuclear leukocytes. J Leukoc Biol. 2000;
67(2):174-182.
34. Berclaz PY, Shibata Y, Whitsett JA, Trapnell BC.
GM-CSF, via PU. 1, regulates alveolar macrophage Fcgamma R-mediated phagocytosis and
the IL-18/IFN-gamma-mediated molecular connection between innate and adaptive immunity in
the lung. Blood. 2002;100(12):4193-4200.
35. Moutaftsi M, Mehl AM, Borysiewicz LK, Tabi Z.
Human cytomegalovirus inhibits maturation and
impairs function of monocyte-derived dendritic
cells. Blood. 2002;99(8):2913-2921.
36. Renneson J, Dutta B, Goriely S, et al. IL-12 and
type I IFN response of neonatal myeloid DC to
human CMV infection. Eur J Immunol. 2009;
39(10):2789-2799.
37. Eyles JL, Metcalf D, Grusby MJ, Hilton DJ, Starr R.
Negative regulation of interleukin-12 signaling by
suppressor of cytokine signaling-1. J Biol Chem.
2002;277(46):43735-43740.
38. Hong B, Ren W, Song XT, Evel-Kabler K, Chen SY,
Huang XF. Human suppressor of cytokine signaling 1 controls immunostimulatory activity of
monocyte-derived dendritic cells. Cancer Res.
2009;69(20):8076-8084.
39. Hanada T, Tanaka K, Matsumura Y, et al. Induction of hyper Th1 cell-type immune responses by
dendritic cells lacking the suppressor of cytokine
signaling-1 gene. J Immunol. 2005;174(7):43254332.
40. Radtke F, Fasnacht N, Macdonald HR. Notch signaling in the immune system. Immunity. 2010;
32(1):14-27.
41. Liontos LM, Dissanayake D, Ohashi PS, Weiss A,
Dragone LL, McGlade CJ. The Src-like adaptor
protein regulates GM-CSFR signaling and monocytic dendritic cell maturation. J Immunol. 2011;
186(4):1923-1933.
42. Zhang Z, Liu Q, Che Y, et al. Antigen presentation
by dendritic cells in tumors is disrupted by altered
metabolism that involves pyruvate kinase M2 and
its interaction with SOCS3. Cancer Res. 2010;
70(1):89-98.
43. Gogolak P, Rethi B, Szatmari I, et al. Differentiation of CD1a- and CD1a⫹ monocyte-derived dendritic cells is biased by lipid environment and
PPARgamma. Blood. 2007;109(2):643-652.
44. Rauwel B, Mariame B, Martin H, et al. Activation
of peroxisome proliferator-activated receptor
gamma by human cytomegalovirus for de novo
replication impairs migration and invasiveness of
cytotrophoblasts from early placentas. J Virol.
2010;84(6):2946-2954.
45. Page AV, Liles WC. Granulocyte colony-stimulating
factor, granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor, and other immunomodulatory therapies for
the treatment of infectious diseases in solid organ
transplant recipients. Curr Opin Organ Transplant.
2008;13(6):575-580.
46. Carr R, Brocklehurst P, Dore CJ, Modi N.
Granulocyte-macrophage colony stimulating factor administered as prophylaxis for reduction of
sepsis in extremely preterm, small for gestational
age neonates (the PROGRAMS trial): a singleblind, multicentre, randomised controlled trial.
Lancet. 2009;373(9659):226-233.
47. Burke JM. GM-CSF-armed, replication-competent
viruses for cancer. Cytokine Growth Factor Rev.
2010;21(2-3):149-151.
SUPPLEMENTAL DATA
I.
Methods
Generation and culture of monocyte-derived DCs
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficoll separation (PAA) from buffy
coats (blood donors from EFS, Toulouse). The adherent fraction of PBMCs (mainly CD14+ blood
monocytes (Mo)) was obtained after 2 hours of culture in 6-well plate (8.106 PBMCs per well) (BD
biosciences), washed and maintained for 5 days in RPMI medium (Invitrogen) complemented with
10% FCS (Invitrogen), 1% penicilline-streptomycine (PAA), recombinant granulocyte macrophagecolony-stimulating factor (GM-CSF, 10 ng/ml) from Abcys and interleukin-13 (IL-13, 50 ng/ml) gifted
by Sanofi-Aventis (Dr A. Minty, Toulouse). More than 90% of cells exhibited the standard phenotype
of immature dendritic cells (MoDC) : CD1a+, CD14-, CD80+, CD86+, CD83-, HLA-DR+. Identical
phenotype was observed when IL-4 was used instead of IL-13. Alternatively, monocytes were
selected with myltenyi MACS beads (CD14+ isolation kit, Myltenyi biotec). Cells differentiated as
above at 1x106 cells/well exhibited MoDC phenotype at 95-98%.
Western blot analysis
Cells lysates in NuPage buffer (Invitrogen) were sonicated for 1 min (Fisher scientific bioblock). Equal
amounts of each protein sample were separated on SDS-PAGE and blotted onto Hybond C-Extra (GEhealthcare). Blots were incubated with antibodies (BD bioscience) raised against the following
proteins: total STAT5 (1/250), PSTAT5 (1/500), β-actin (1/2000). Antibodies directed against SOCS3
and SOCS1 (1/500) were from Abcam. Membranes were incubated with rabbit HRP-conjugated anti
mouse immunoglobulin (1/2000), (Dako) and revealed with ECL detection system (Sigma).
Flow cytometry analysis
For cell surface staining, cells were washed with PBS-EDTA 5 mM, PBS-SVF 5% and stained with
monoclonal antibodies from BeckmanCoulter directed against CD1a, CD83, CD86 (PE-labeled), CD1c,
CD14, HLA-DR (FITC-labeled) and CD3 (APC-labeled). FITC-labeled anti-CD116 (GMRα) was from
69
eBiosciences. For intracellular staining, cells were fixed and permeabilized with invitrogen kit.
Monocyte-derived cells were stained with mouse monoclonal antibody specific for Phosphorylated
STAT5 (P-Y694) and then with PE-labeled anti-mouse antibody. In polarisation assays, CD4+ T cells
were stimulated for 5h with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) plus ionomycin (Sigma-Aldrich),
treated with Brefeldin A (10 μg/ml, Sigma-Aldrich) for the last 3 hours, fixed, permeabilized and
stained with (FITC)-anti-IFN-γ and (PE)-anti-IL-4 antibodies (BD Bioscience). For CFSE analysis, T cells
were stained with CelltraceTM CFSE cell proliferation kit (Invitrogen). Flow cytometry analyses were
performed with a FACSCalibur cytometer (BD Biosciences).
RT-PCR analysis
Total RNA was isolated with Trizol (Invitrogen). RT-PCR with 1 µg of total cell RNA (Invitrogen) was
performed using primer pairs specific for SOCS1 (forward 5’-GAGAGCTTCGACTGCCTCTT-3’; Reverse
5’-AGGTAGGAGGTGCGAGTTCA-3’), SOCS3 (forward 5’-CTCAAGACCT TCAGCTCCAA-3’; reverse 5’TTCTCATAGGAGTCCAGGTG-3’) and β-actin (forward 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’; reverse 5’AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’).
70
II.
Figures
A
B
Figure S1
(A) MRC5 Fibroblast were mock infected (Med) or infected (CMV) for 3 days, treated (PAA) or not
(NT) with Phosphonoacetic acid (PAA) (250µg/ml). Expression of viral protein UL44 (early) and UL99
(late) was assessed by Western blot. (B) Monocytes were differentiated into dendritic cells infected
(CMV) or not (Med) and treated (PAA) or not (NT) with PAA (250µg/ml). Expression of viral protein
was analysed at day 5 of differentiation using Western blot. Representative of at least 3 independent
experiments.
71
A
B
Figure S2
Monocytes (Mo) were differentiated into dendritic cells by 5 days of culture in the presence of GMCSF and IL-13 following mock-infection (Med), infection with live (CMV) or UV-inactivated CMV
(UVCMV). (A) Expression of GM-CSF receptor at the surface of MoDC and CMV-MoDC was analysed
by flow cytometry with FITC-anti-GM-CSFR. Percent of positive cells are indicated. (B) Quantification
of soluble GM-CSF receptor (sGMRα) in culture supernatants was done by ELISA (pg/ml).
Representative of at least 3 independent experiments.
72
Figure S3
(A) Mock-infected (Med), HCMV-infected (CMV) or IL-6 (50 ng/ml) treated monocytes were
differentiated in presence of GM-CSF and IL-13 for 5 days. Transfection with SOCS1, SOCS3 or control
siRNA was done as indicated. Expression of SOCS1, SOCS3 and β-actin proteins was analysed by
western blotting. Representative of at least 3 independent experiments.
73
Figure S4
Differentiated dendritic cells from monocytes (GM-CSF, IL-13 for 5 days) were co-cultured in 96 wells
plate with allogenic CD4+ T cells (104 DC for 105 T cells) in 200µL RPMI medium for 8 days. At day 5,
20U of IL-2 were added. At day 8 cells were stimulated (PMA-Iono for 5 hours, Brefeldine A for last 3
hours) and stained with antibody against IL-4. To induce TH2 differentiation, IL-4 (5ng/ml) and IFN-γ
blocking antibody (10µg/ml) were added to the polarisation experiments. Representative of at least 3
independent experiments.
74
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES
ET DISCUSSION
75
I.
RESULTATS SUPPLEMENTAIRES
Les travaux de l’équipe effectués par Rauwel et al ont permis de mettre en évidence l’activation du
facteur de transcription PPAR-γ lors de l’infection par le CMV et l’utilisation de ce facteur par le virus
pour sa propre réplication339. Mon premier objectif était d’exploiter ces constatations en les adaptant
au modèle de différenciation des monocytes en cellules dendritiques pour, dans un premier temps,
mettre en évidence l’activation de PPAR-γ par le virus lors de la différenciation et, dans un deuxième
temps, analyser les conséquences de cette activation sur le phénotype et les fonctionnalités des DC
obtenues. Une équipe a montré que les lipides présents lors de la différenciation des monocytes en
DC peuvent inhiber des capacités fonctionnelles des DC et ce, via l’activation de PPAR-γ340,
l’expression de surface de la molécule CD1a pouvant être variable en fonction de la composition
lipidique45. En revanche, l’activation de PPAR-γ par des ligands agonistes pourrait augmenter la
faculté des DC à phagocyter des neutrophiles apoptotiques341.
Activation de PPAR-γ lors de la différenciation de monocytes infectés en DC
Les premières expériences pour analyser l’activation de PPAR-γ par le CMV ont été effectuées par la
technique du Red-Oil O qui consiste à marquer les gouttelettes lipidiques formées lors de l’activation
de PPAR-γ.
Figure 26 : L’infection par le CMV active le facteur de transcription PPAR-γ. Les monocytes infectés (CMVMoDC) ou non (MoDC) sont différenciés en DC pendant 5 jours en présence de GM-CSF et d’IL-13. A J5, les
cellules sont fixées par du paraformaldéhyde (5%) avant d’être incubées 10 min avec 0,3% de Red oil O dans de
l’isopropanol. Les cellules sont ensuite lavées 30 sec avec de l’isopropanol 60% puis avec de l’eau pour éliminer
l’excédent de Red Oil O. Les noyaux sont marqués par hématoxyline. (X1200)
Les marquages (figure 26) effectués montrent clairement l’accumulation de gouttelettes lipidiques
dans les cellules différenciées en présence de virus (CMV-MoDC), ces cellules ayant aussi un
phénotype cytomégalique marqué. L’accumulation de ces gouttelettes est directement dépendante
de l’activité de PPAR-γ, un acteur majeur de la signalisation lipidique et de l’adipogénèse342. Ces
76
données indiquent que l’infection par le CMV active le facteur de transcription PPAR-γ dans les
monocytes.
Nous avons par la suite utilisé la microscopie confocale pour localiser PPAR-γ. En effet cette molécule
est majoritairement cytoplasmique lorsqu’elle n’est pas activée mais subi une translocation nucléaire
lors de son activation et de la liaison avec son ligand.
Figure 27 : Translocation nucléaire du facteur PPAR-γ lors de l’infection par le CMV. Les DC sont différenciées à
partir de monocytes (infectés ou non) pendant 5 jours avec du GM-CSF et de l’IL-13. A J5, les cellules sont fixées
par du paraformaldéhyde (4%) pendant 20 min puis perméabilisées avec de la saponine 0,1% pendant 20 min.
Les DC sont ensuite incubées avec un anticorps primaire dirigé contre IE ou PPAR-γ et un anticorps secondaire
couplé FITC ou rhodamine avant lecture par microscopie confocale. (X670)
Les marquages (figure 27) indiquent que lorsque les cellules ne sont pas infectées (MoDC), PPAR-γ
est retrouvé essentiellement dans le cytoplasme. En revanche lorsque les cellules sont positives pour
la protéine virale IE, PPAR-γ est retrouvé de façon majoritaire dans le noyau. Ces résultats, combinés
avec les marquages Red oil O permettent de dire que l’infection des monocytes lors de leur
différenciation en DC conduit à une activation du facteur de transcription PPAR-γ.
L’activation de PPAR-γ n’est pas responsable du phénotype observé chez les CMV-MoDC
Suite aux preuves de l’activation de PPAR-γ dans les DC par le CMV nous avons voulu étudier le rôle
de ce mécanisme dans les changements de phénotypes induits par l’infection, tels que la perte
d’expression du marqueur CD1a dont la modulation a été associée à l’activation de PPAR-γ45. Pour
cela nous avons réalisé les expériences de différenciation en présence d’un inhibiteur irréversible de
PPAR-γ : le GW9662
77
Figure 28 : L’inhibition de PPAR-γ par le GW9662 ne réverse pas le phénotype obtenu lors de l’infection. Les
cellules sont différenciées (infectées ou non) classiquement en présence ou non d’un inhibiteur irréversible de
PPAR-γ le GW9662 (1 µM). L’expression de surface des différents marqueurs est analysée après marquages par
des anticorps spécifiques directement couplés FITC ou PE.
Les MoDC et les CMV-MoDC présentent un phénotype classique avec la perte d’expression de CD1a
lors de l’infection et l’acquisition du marqueur de maturation CD83. L’ajout de GW9662 pendant la
différenciation des cellules ne semble pas avoir d’impact sur l’expression des différents marqueurs
de surfaces. Ainsi l’expression de CD1a, marqueur de perturbation de la différenciation des
monocytes en DC, n’est pas restaurée en présence de l’inhibiteur. Ces résultats indiquent que PPAR-γ
n’est pas le responsable de la perte d’expression de CD1a chez les CMV-MoDC lors de la
différenciation des cellules.
78
II.
DISCUSSION
Le CMV est capable de perturber les réponses innées et adaptatives misent en place par l’hôte. Pour
cela, il développe de très nombreuses stratégies d’échappement immunitaire. L’inhibition des
cellules présentatrices d’antigènes fait partie des mécanismes disponibles pour bloquer la réponse
adaptative et le fait que les monocytes, cellules précurseurs des DC inflammatoires, soit un site de
latence virale suggère un rôle de l’infection de ces cellules dans la perturbation du développement
des DC. Ces monocytes peuvent aussi être la cible de différents virus tels que les virus de la grippe ou
de la vaccine. L’infection par ces virus conduit à leur différenciation rapide (moins de 24h) en DC
ayant des caractéristiques proches de DC BDCA3+, particulièrement efficace pour la présentation
croisée. Cela semble être une évolution du SI pour pouvoir présenter les antigènes viraux lorsque les
cellules sont infectées, ce type de différenciation semblant même être dépendante de la présence de
virus infectieux343. Le cas du CMV est un peu particulier puisque l’infection des monocytes entraine
une mise en latence virale et c’est la différenciation de ceux-ci par certaines cytokines qui permet la
réactivation et le cycle lytique du virus210. La plupart des études se sont concentrées sur l’infection
des DC et l’impact sur leurs capacités fonctionnelles331 mais peu d’équipes se sont intéressées aux
effets de l’infection lors de la différenciation des monocytes en DC ainsi que des mécanismes
moléculaires mis en jeu dans ce phénomène.
Nous avons confirmé dans un premier temps la perturbation de la différenciation des monocytes en
DC par le CMV au niveau phénotypique avec une diminution de l’expression du marqueur CD1a
induite par un facteur soluble sécrété par les cellules infectées, un mécanisme proche ayant déjà été
décrit dans plusieurs études335,336,344. CD1a a ici été exploité comme un marqueur de différenciation,
l’impact fonctionnel de sa perte d’expression par les cellules infectées n’étant pas étudié. Son rôle
physiologique est de présenter des lipides ou des lipopeptides reconnus par des TCR spécifiques345
mais son impact sur l’efficacité de la réponse immune n’est pas connu malgré des démonstrations de
présentation dépendante de CD1a par certaines cellules de Langerhans346.
Les CMV-MoDC ayant un phénotype proche de celui de cellules différenciées en absence de la
cytokine GM-CSF40, nous avons mis en évidence la perte de signalisation en aval de la fixation du GMCSF à son récepteur avec une inhibition de la phosphorylation de STAT5. Pour expliquer ce
phénomène nous avons tout d’abord pensé à une inhibition de l’expression du récepteur de surface
au GM-CSF (sous-unité α, CD116) mais celle-ci n’est pas diminuée par l’infection. On retrouve en
revanche une augmentation dans le surnageant de la molécule CD116 soluble capable d’inhiber la
fixation du GM-CSF à son récepteur. L’augmentation peut provenir du clivage du récepteur de
surface par des protéases ou d’un épissage alternatif de l’ARN messager qui produit alors une forme
soluble347. L’ajout d’inhibiteur de protéases ne bloquant pas l’augmentation de la quantité de CD116
79
soluble chez les CMV-MoDC nous avons donc analysé l’expression des différents ARN messager de
CD116 présents dans les cellules infectées. La quantité d’ARN messager ayant subi un épissage et
codant la forme soluble de CD116 est augmentée chez les CMV-MoDC indiquant que l’épissage
alternatif est en partie responsable de l’augmentation de la concentration de CD116 soluble lors de
l’infection (résultats non montrés).
Ces expériences ont aussi été réalisées en utilisant un virus inactivé par les ultra-violet, ce qui a pour
conséquence d’inhiber la néo-synthèse virale mais pas la pénétration du virion dans la cellule. Les
résultats montrent que l’inactivation permet d’obtenir des cellules qui présentent le même
phénotype de surface que les cellules non-infectées. De plus, la phosphorylation de STAT5 perdue
lors de l’infection n’est pas perturbée par le virus inactivé. Les observations faites chez les CMVMoDC sont donc dépendantes de la présence de la réplication virale ou au moins des étapes
précoces du cycle viral puisque l’utilisation de PAA (acide phosphono-acétique), qui bloque la
polymérase virale et la phase L, ne restaure par la phosphorylation de STAT5 dans les cellules
infectées.
Nous avons montré que les CMV-MoDC sécrètent de fortes quantités d’IL-6, cette cytokine étant
capable d’inhiber l’expression de CD1a ainsi que la phosphorylation de STAT5 lors de différenciations
de DC en présence de virus. D’autres facteurs sont sécrétés, principalement des chimiokines, tels que
MIP-1β, l’IL-8 ou MCP-1. Des études montrent l’implication de SOCS1 dans l’inhibition de la
différenciation des monocytes en DC57 et l’IL-6 est capable d’induire l’expression de certaines
molécules SOCS qui agissent alors comme contrôles négatifs de ces voies de signalisations348. Nous
avons mis en évidence l’augmentation de l’expression des molécules SOCS1 et SOCS3 via la sécrétion
d’IL-6 lors de la différenciation et l’implication de SOCS3 dans l’inhibition de la phosphorylation de
STAT5.
L’IL-6 est aussi capable d’inhiber la phagocytose de corps nécrotiques par les DC ce qui est aussi
retrouvé lors de l’infection par le CMV. En revanche le blocage de l’IL-6 chez les CMV-MoDC ne
restaure pas la phagocytose ce qui indique que d’autres molécules sécrétées sont responsables de ce
phénomène. Il serait intéressant de tester l’effet des autres facteurs produits (cytokines ou lipides)
présents dans le surnageant lors de la culture. De même, il serait utile de mettre en évidence les
mécanismes responsables de cette inhibition lors de l’infection.
De nombreux récepteurs de surfaces peuvent induire la phagocytose de cellules apoptotiques. Nous
avons vérifié l’expression de la molécule CD36 mais celle-ci ne varie par en fonction de l’infection
(résultat non montré). L’expression de PU-1 n’est pas non plus modifiée, ce facteur étant impliqué
dans la phagocytose par les macrophages alvéolaires dépendante du GM-CSF et de STAT5349. Les
autres molécules impliquées dans la phagocytose doivent aussi être analysées, notamment les
différentes intégrines comme αvβ5 dont le rôle a été décrit chez les DC immatures77.
80
La phagocytose par les DC est essentielle pour la présentation croisée d’antigènes viraux. Ce
mécanisme permettrait d’expliquer la présentation d’antigènes tardifs malgré les très nombreux
mécanismes d’immunosuppressions mis en place par le virus337,338. Le mécanisme que nous avons
décrit met en jeu un facteur soluble qui pourrait donc inhiber la différenciation des DC non infectées
et ainsi diminuer les capacités de présentation de ces cellules pour permettre au virus d’échapper à
la présentation croisée.
Nous avons par la suite étudié d’autres fonctions effectuées par les DC telles que la sécrétion de
cytokines polarisantes, la polarisation de cellules T ainsi que leur prolifération. Les CMV-MoDC ne
sont plus capables de sécréter l’IL-12 nécessaire à la polarisation TH1 des lymphocytes T CD4+. De
même, ces cellules ne sont plus capables de polariser les LT naïfs en cellules TH1 et ceci, de façon
dépendant de la sécrétion d’IL-6 durant leur différenciation. En revanche le blocage de l’IL-6 pendant
la différenciation ne restaure pas la production d’IL-12. Il serait donc intéressant d’étudier les autres
mécanismes capables d’induire la polarisation en TH1 tels que la signalisation NOTCH350. L’utilisation
des siRNA dirigés contre SOCS3 serait aussi intéressante pour étudier leur implication puisque des
études ont mis évidence le rôle de SOCS1 dans la polarisation des cellules T par les DC dérivées de
monocytes55,351. Ces expériences ont été réalisées, malheureusement, la trop forte mortalité des
cellules après transfection et différenciation n’a pas permis d’effectuer toutes les manipulations
fonctionnelles. Les CMV-MoDC produisent aussi la chimiokine MIP-1β en forte quantité. Une équipe
a montré que cette molécule pouvait perturber la génération des MoDC in vitro et empêcher ces
cellules de stimuler des lymphocytes T pour leur faire sécréter de l’IFN-γ352. L’IL-6 ne pouvant
expliquer à elle seule le phénotype observé, nous avons effectué des travaux préliminaires sur
l’action de MIP1-β. Les différentes expériences n’ont pas permis de retrouver les résultats similaires à
cette étude puisque l’ajout de MIP-1β n’inhibe par la différenciation ni la capacité des cellules à
polariser les lymphocytes T vers la voie TH1, en tous cas avec les concentrations utilisées (200ng/ml).
L’infection par le CMV inhibe la faculté des DC à faire proliférer les cellules T et ce mécanisme passe
par la sécrétion d’un facteur soluble. Les différentes expériences indiquent que l’IL-6 est en partie
responsable de ce phénomène mais les résultats sont difficilement reproductibles (résultats non
montrés).
Pour finir, nous avons analysé des prélèvements provenant de patients transplantés virémiques.
Nous avons retrouvé un phénotype similaire à celui observé in vitro avec une perte d’acquisition du
marqueur CD1a et une inhibition de la phosphorylation de STAT5. Ces observations sont retrouvées
en absence de réinfection in vitro et de production de virion par les cellules lors de la différenciation
(non montré). Cela laisse penser que l’infection chez le patient est directement responsable du
phénotype observé, la virémie étant corrélé avec la perte de CD1a et la sécrétion d’IL-6 lors de la
différenciation ex vivo.
81
Le lien entre les observations montrant l’inhibition de la signalisation GM-CSF et leurs conséquences
sur les fonctionnalités des DC différenciées n’est pas encore clairement établi. Des expériences
utilisant des lentivirus codant une molécule STAT5 constitutive353 (dimérisation ou tétramérisation et
translocation nucléaire en absence de phosphorylation) ont été réalisées. La transduction par ce
lentivirus de cellules souches hématopoïétiques murines induit la transformation maligne de ces
cellules en mastocytes et ce via les voies de signalisation dépendante de STAT5 et de la PI3K354. La
restauration de l’activité STAT5 en présence du virus est un des moyens pour mettre en évidence son
rôle direct dans les mécanismes observés. Malheureusement, la double infection par le lentivirus
codant STAT5 constitutif et le CMV ainsi que l’étape de différenciation des monocytes en DC
induisent une mortalité cellulaire trop importante pour effectuer des analyses satisfaisantes par la
suite. La même expérience réalisée avec un lentivirus codant la molécule GFP (green fluorescent
protein) induit une mortalité moins importante ce qui laisse penser que la surexpression de STAT5
dans ce modèle peut être délétère pour les cellules. Ces expériences sont toutefois poursuivies pour
tenter d’améliorer la survie cellulaire.
Nous avons donc mis en évidence un mécanisme d’immunosuppression par le CMV jusqu’alors
inconnu qui consiste à inhiber la signalisation GM-CSF pour perturber la différenciation des
monocytes en DC. Le GM-CSF est une cytokine nécessaire à de très nombreuses fonctions au sein de
l’organisme puisqu’en plus d’être utile au développement du lignage hématopoïétique, il joue un rôle
dans la phagocytose par certaines cellules (neutrophiles, macrophages) et leur différenciation
terminale355 ainsi que dans la régulation du développement embryonnaire356. L’infection congénitale
par le CMV étant une des plus fréquentes, il serait utile d’étudier les conséquences de cette
perturbation sur le développement embryonnaire. En plus de son rôle physiologique, le GM-CSF est
utilisé dans un grand nombre de thérapies anti-cancéreuses357 ou antivirales chez des patients
transplantés358 pour stimuler le SI ou accélérer la reconstitution des populations issues de la lignée
hématopoïétique. Ces patients étant particulièrement exposés aux risques de réactivations virales
dues à leur situation d’immunosuppression, il conviendrait d’étudier les perturbations induites par le
virus sur les traitements proposés.
82
BIBLIOGRAPHIE
83
1.
Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of
mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 1973;137(5):1142-1162.
2.
Shortman K, Liu YJ. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol.
2002;2(3):151-161.
3.
Shortman K, Naik SH. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev
Immunol. 2007;7(1):19-30.
4.
Kondo M, Weissman IL, Akashi K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors
in mouse bone marrow. Cell. 1997;91(5):661-672.
5.
Akashi K, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL. A clonogenic common myeloid progenitor that
gives rise to all myeloid lineages. Nature. 2000;404(6774):193-197.
6.
Inaba K, Inaba M, Deguchi M, et al. Granulocytes, macrophages, and dendritic cells arise from
a common major histocompatibility complex class II-negative progenitor in mouse bone marrow.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90(7):3038-3042.
7.
Manz MG, Traver D, Miyamoto T, Weissman IL, Akashi K. Dendritic cell potentials of early
lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 2001;97(11):3333-3341.
8.
Chicha L, Jarrossay D, Manz MG. Clonal type I interferon-producing and dendritic cell
precursors are contained in both human lymphoid and myeloid progenitor populations. J Exp Med.
2004;200(11):1519-1524.
9.
Karsunky H, Merad M, Cozzio A, Weissman IL, Manz MG. Flt3 ligand regulates dendritic cell
development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.
J Exp Med. 2003;198(2):305-313.
10.
D'Amico A, Wu L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid
predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J Exp Med.
2003;198(2):293-303.
11.
Onai N, Obata-Onai A, Tussiwand R, Lanzavecchia A, Manz MG. Activation of the Flt3 signal
transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell
development. J Exp Med. 2006;203(1):227-238.
12.
McKenna HJ, Stocking KL, Miller RE, et al. Mice lacking flt3 ligand have deficient
hematopoiesis affecting hematopoietic progenitor cells, dendritic cells, and natural killer cells. Blood.
2000;95(11):3489-3497.
13.
Maraskovsky E, Daro E, Roux E, et al. In vivo generation of human dendritic cell subsets by
Flt3 ligand. Blood. 2000;96(3):878-884.
14.
Naik SH, Proietto AI, Wilson NS, et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol.
2005;174(11):6592-6597.
15.
Dai XM, Ryan GR, Hapel AJ, et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor
1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive
progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 2002;99(1):111-120.
16.
Ginhoux F, Tacke F, Angeli V, et al. Langerhans cells arise from monocytes in vivo. Nat
Immunol. 2006;7(3):265-273.
17.
Varol C, Landsman L, Fogg DK, et al. Monocytes give rise to mucosal, but not splenic,
conventional dendritic cells. J Exp Med. 2007;204(1):171-180.
18.
Fogg DK, Sibon C, Miled C, et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for
macrophages and dendritic cells. Science. 2006;311(5757):83-87.
19.
Lau-Kilby AW, Kretz CC, Pechhold S, et al. Interleukin-2 inhibits FMS-like tyrosine kinase 3
receptor ligand (flt3L)-dependent development and function of conventional and plasmacytoid
dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011.
20.
Onai N, Obata-Onai A, Schmid MA, Ohteki T, Jarrossay D, Manz MG. Identification of
clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in
mouse bone marrow. Nat Immunol. 2007;8(11):1207-1216.
21.
Auffray C, Sieweke MH, Geissmann F. Blood monocytes: development, heterogeneity, and
relationship with dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2009;27:669-692.
84
22.
Liu K, Waskow C, Liu X, Yao K, Hoh J, Nussenzweig M. Origin of dendritic cells in peripheral
lymphoid organs of mice. Nat Immunol. 2007;8(6):578-583.
23.
Naik SH, Metcalf D, van Nieuwenhuijze A, et al. Intrasplenic steady-state dendritic cell
precursors that are distinct from monocytes. Nat Immunol. 2006;7(6):663-671.
24.
Tacke F, Randolph GJ. Migratory fate and differentiation of blood monocyte subsets.
Immunobiology. 2006;211(6-8):609-618.
25.
Rovati B, Mariucci S, Manzoni M, Bencardino K, Danova M. Flow cytometric detection of
circulating dendritic cells in healthy subjects. Eur J Histochem. 2008;52(1):45-52.
26.
Rissoan MC, Soumelis V, Kadowaki N, et al. Reciprocal control of T helper cell and dendritic
cell differentiation. Science. 1999;283(5405):1183-1186.
27.
Corcoran L, Ferrero I, Vremec D, et al. The lymphoid past of mouse plasmacytoid cells and
thymic dendritic cells. J Immunol. 2003;170(10):4926-4932.
28.
Shigematsu H, Reizis B, Iwasaki H, et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoidspecific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 2004;21(1):43-53.
29.
Kamath AT, Henri S, Battye F, Tough DF, Shortman K. Developmental kinetics and lifespan of
dendritic cells in mouse lymphoid organs. Blood. 2002;100(5):1734-1741.
30.
Serbina NV, Pamer EG. Monocyte emigration from bone marrow during bacterial infection
requires signals mediated by chemokine receptor CCR2. Nat Immunol. 2006;7(3):311-317.
31.
Schaerli P, Willimann K, Ebert LM, Walz A, Moser B. Cutaneous CXCL14 targets blood
precursors to epidermal niches for Langerhans cell differentiation. Immunity. 2005;23(3):331-342.
32.
Caux C, Massacrier C, Dubois B, et al. Respective involvement of TGF-beta and IL-4 in the
development of Langerhans cells and non-Langerhans dendritic cells from CD34+ progenitors. J
Leukoc Biol. 1999;66(5):781-791.
33.
Borkowski TA, Letterio JJ, Farr AG, Udey MC. A role for endogenous transforming growth
factor beta 1 in Langerhans cell biology: the skin of transforming growth factor beta 1 null mice is
devoid of epidermal Langerhans cells. J Exp Med. 1996;184(6):2417-2422.
34.
Serbina NV, Salazar-Mather TP, Biron CA, Kuziel WA, Pamer EG. TNF/iNOS-producing
dendritic cells mediate innate immune defense against bacterial infection. Immunity. 2003;19(1):5970.
35.
Aldridge JR, Jr., Moseley CE, Boltz DA, et al. TNF/iNOS-producing dendritic cells are the
necessary evil of lethal influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(13):5306-5311.
36.
Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human
dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4
and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 1994;179(4):1109-1118.
37.
Randolph GJ, Beaulieu S, Lebecque S, Steinman RM, Muller WA. Differentiation of monocytes
into dendritic cells in a model of transendothelial trafficking. Science. 1998;282(5388):480-483.
38.
Geissmann F, Jung S, Littman DR. Blood monocytes consist of two principal subsets with
distinct migratory properties. Immunity. 2003;19(1):71-82.
39.
Cheong C, Matos I, Choi JH, et al. Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DCSIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas. Cell. 2011;143(3):416-429.
40.
Roy KC, Bandyopadhyay G, Rakshit S, Ray M, Bandyopadhyay S. IL-4 alone without the
involvement of GM-CSF transforms human peripheral blood monocytes to a CD1a(dim), CD83(+)
myeloid dendritic cell subset. J Cell Sci. 2004;117(Pt 16):3435-3445.
41.
Piemonti L, Bernasconi S, Luini W, et al. IL-13 supports differentiation of dendritic cells from
circulating precursors in concert with GM-CSF. Eur Cytokine Netw. 1995;6(4):245-252.
42.
Alters SE, Gadea JR, Holm B, Lebkowski J, Philip R. IL-13 can substitute for IL-4 in the
generation of dendritic cells for the induction of cytotoxic T lymphocytes and gene therapy. J
Immunother. 1999;22(3):229-236.
43.
Chomarat P, Banchereau J, Davoust J, Palucka AK. IL-6 switches the differentiation of
monocytes from dendritic cells to macrophages. Nat Immunol. 2000;1(6):510-514.
44.
Ratta M, Fagnoni F, Curti A, et al. Dendritic cells are functionally defective in multiple
myeloma: the role of interleukin-6. Blood. 2002;100(1):230-237.
85
45.
Gogolak P, Rethi B, Szatmari I, et al. Differentiation of CD1a- and CD1a+ monocyte-derived
dendritic cells is biased by lipid environment and PPARgamma. Blood. 2007;109(2):643-652.
46.
Uchida K, Beck DC, Yamamoto T, et al. GM-CSF autoantibodies and neutrophil dysfunction in
pulmonary alveolar proteinosis. N Engl J Med. 2007;356(6):567-579.
47.
Codarri L, Gyulveszi G, Tosevski V, et al. RORgammat drives production of the cytokine GMCSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.
Nat Immunol. 2011;12(6):560-567.
48.
Leake R. Molecular aspects of the GM-CSF receptor: an example of the cell signalling
mechanisms used by type 1 cytokine receptors. Eur J Cancer. 1999;35 Suppl 3:S2-3.
49.
Nelms K, Keegan AD, Zamorano J, Ryan JJ, Paul WE. The IL-4 receptor: signaling mechanisms
and biologic functions. Annu Rev Immunol. 1999;17:701-738.
50.
Yoshimura A, Naka T, Kubo M. SOCS proteins, cytokine signalling and immune regulation. Nat
Rev Immunol. 2007;7(6):454-465.
51.
Kamura T, Maenaka K, Kotoshiba S, et al. VHL-box and SOCS-box domains determine binding
specificity for Cul2-Rbx1 and Cul5-Rbx2 modules of ubiquitin ligases. Genes Dev. 2004;18(24):30553065.
52.
Babon JJ, Kershaw NJ, Murphy JM, et al. Suppression of Cytokine Signaling by SOCS3:
Characterization of the Mode of Inhibition and the Basis of Its Specificity. Immunity. 2012.
53.
Starr R, Fuchsberger M, Lau LS, et al. SOCS-1 binding to tyrosine 441 of IFN-gamma receptor
subunit 1 contributes to the attenuation of IFN-gamma signaling in vivo. J Immunol.
2009;183(7):4537-4544.
54.
Hu J, Winqvist O, Flores-Morales A, Wikstrom AC, Norstedt G. SOCS2 influences LPS induced
human monocyte-derived dendritic cell maturation. PLoS One. 2009;4(9):e7178.
55.
Hanada T, Tanaka K, Matsumura Y, et al. Induction of hyper Th1 cell-type immune responses
by dendritic cells lacking the suppressor of cytokine signaling-1 gene. J Immunol. 2005;174(7):43254332.
56.
Stevenson NJ, Addley MR, Ryan EJ, et al. CCL11 blocks IL-4 and GM-CSF signaling in
hematopoietic cells and hinders dendritic cell differentiation via suppressor of cytokine signaling
expression. J Leukoc Biol. 2009;85(2):289-297.
57.
Bartz H, Avalos NM, Baetz A, Heeg K, Dalpke AH. Involvement of suppressors of cytokine
signaling in toll-like receptor-mediated block of dendritic cell differentiation. Blood.
2006;108(13):4102-4108.
58.
Gilliet M, Cao W, Liu YJ. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection
and autoimmune diseases. Nat Rev Immunol. 2008;8(8):594-606.
59.
Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol. 2004;4(7):499-511.
60.
Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, et al. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent tolllike receptor signaling pathway. Science. 2003;301(5633):640-643.
61.
Siegal FP, Kadowaki N, Shodell M, et al. The nature of the principal type 1 interferonproducing cells in human blood. Science. 1999;284(5421):1835-1837.
62.
Yoneyama H, Matsuno K, Toda E, et al. Plasmacytoid DCs help lymph node DCs to induce antiHSV CTLs. J Exp Med. 2005;202(3):425-435.
63.
Di Pucchio T, Chatterjee B, Smed-Sorensen A, et al. Direct proteasome-independent crosspresentation of viral antigen by plasmacytoid dendritic cells on major histocompatibility complex
class I. Nat Immunol. 2008;9(5):551-557.
64.
Mouries J, Moron G, Schlecht G, Escriou N, Dadaglio G, Leclerc C. Plasmacytoid dendritic cells
efficiently cross-prime naive T cells in vivo after TLR activation. Blood. 2008;112(9):3713-3722.
65.
Geissmann F, Launay P, Pasquier B, et al. A subset of human dendritic cells expresses IgA Fc
receptor (CD89), which mediates internalization and activation upon cross-linking by IgA complexes. J
Immunol. 2001;166(1):346-352.
66.
Skoberne M, Somersan S, Almodovar W, et al. The apoptotic-cell receptor CR3, but not
alphavbeta5, is a regulator of human dendritic-cell immunostimulatory function. Blood.
2006;108(3):947-955.
86
67.
Platt N, da Silva RP, Gordon S. Recognizing death: the phagocytosis of apoptotic cells. Trends
Cell Biol. 1998;8(9):365-372.
68.
Yi H, Yu X, Gao P, et al. Pattern recognition scavenger receptor SRA/CD204 down-regulates
Toll-like receptor 4 signaling-dependent CD8 T-cell activation. Blood. 2009;113(23):5819-5828.
69.
Barth H, Schnober EK, Neumann-Haefelin C, et al. Scavenger receptor class B is required for
hepatitis C virus uptake and cross-presentation by human dendritic cells. J Virol. 2008;82(7):34663479.
70.
Bozzacco L, Trumpfheller C, Siegal FP, et al. DEC-205 receptor on dendritic cells mediates
presentation of HIV gag protein to CD8+ T cells in a spectrum of human MHC I haplotypes. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2007;104(4):1289-1294.
71.
Sancho D, Joffre OP, Keller AM, et al. Identification of a dendritic cell receptor that couples
sensing of necrosis to immunity. Nature. 2009;458(7240):899-903.
72.
Schreibelt G, Klinkenberg LJ, Cruz LJ, et al. The C type lectin receptor CLEC9A mediates
antigen uptake and (cross-)presentation by human blood BDCA3+ myeloid dendritic cells. Blood.
2012.
73.
Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding
protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 2000;100(5):587-597.
74.
Halary F, Amara A, Lortat-Jacob H, et al. Human cytomegalovirus binding to DC-SIGN is
required for dendritic cell infection and target cell trans-infection. Immunity. 2002;17(5):653-664.
75.
Plazolles N, Humbert JM, Vachot L, Verrier B, Hocke C, Halary F. Pivotal advance: The
promotion of soluble DC-SIGN release by inflammatory signals and its enhancement of
cytomegalovirus-mediated cis-infection of myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 2011;89(3):329-342.
76.
Guermonprez P, Valladeau J, Zitvogel L, Thery C, Amigorena S. Antigen presentation and T
cell stimulation by dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2002;20:621-667.
77.
Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, et al. Immature dendritic cells phagocytose apoptotic
cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med.
1998;188(7):1359-1368.
78.
Gallucci S, Matzinger P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol.
2001;13(1):114-119.
79.
Sallusto F, Schaerli P, Loetscher P, et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor
expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol. 1998;28(9):2760-2769.
80.
Saeki H, Moore AM, Brown MJ, Hwang ST. Cutting edge: secondary lymphoid-tissue
chemokine (SLC) and CC chemokine receptor 7 (CCR7) participate in the emigration pathway of
mature dendritic cells from the skin to regional lymph nodes. J Immunol. 1999;162(5):2472-2475.
81.
Campbell JJ, Hedrick J, Zlotnik A, Siani MA, Thompson DA, Butcher EC. Chemokines and the
arrest of lymphocytes rolling under flow conditions. Science. 1998;279(5349):381-384.
82.
Banchereau J, Briere F, Caux C, et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol.
2000;18:767-811.
83.
Sioud M. Does the understanding of immune activation by RNA predict the design of safe
siRNAs? Front Biosci. 2008;13:4379-4392.
84.
Aki M, Shimbara N, Takashina M, et al. Interferon-gamma induces different subunit
organizations and functional diversity of proteasomes. J Biochem. 1994;115(2):257-269.
85.
Kloetzel PM, Ossendorp F. Proteasome and peptidase function in MHC-class-I-mediated
antigen presentation. Curr Opin Immunol. 2004;16(1):76-81.
86.
Vyas JM, Van der Veen AG, Ploegh HL. The known unknowns of antigen processing and
presentation. Nat Rev Immunol. 2008;8(8):607-618.
87.
Villadangos JA, Schnorrer P. Intrinsic and cooperative antigen-presenting functions of
dendritic-cell subsets in vivo. Nat Rev Immunol. 2007;7(7):543-555.
88.
Bevan MJ. Cross-priming for a secondary cytotoxic response to minor H antigens with H-2
congenic cells which do not cross-react in the cytotoxic assay. J Exp Med. 1976;143(5):1283-1288.
89.
Kurts C, Robinson BW, Knolle PA. Cross-priming in health and disease. Nat Rev
Immunol;10(6):403-414.
87
90.
Ueno H, Palucka AK, Banchereau J. The expanding family of dendritic cell subsets. Nat
Biotechnol. 2010;28(8):813-815.
91.
Arrode G, Boccaccio C, Lule J, et al. Incoming human cytomegalovirus pp65 (UL83) contained
in apoptotic infected fibroblasts is cross-presented to CD8(+) T cells by dendritic cells. J Virol.
2000;74(21):10018-10024.
92.
Kurts C, Robinson BW, Knolle PA. Cross-priming in health and disease. Nat Rev Immunol.
2011;10(6):403-414.
93.
Cebrian I, Visentin G, Blanchard N, et al. Sec22b regulates phagosomal maturation and
antigen crosspresentation by dendritic cells. Cell. 2011;147(6):1355-1368.
94.
Spadaro F, Lapenta C, Donati S, et al. Interferon-alpha enhances cross-presentation in human
dendritic cells by modulating antigen survival, endocytic routing and processing. Blood.2011
95.
Bryant P, Ploegh H. Class II MHC peptide loading by the professionals. Curr Opin Immunol.
2004;16(1):96-102.
96.
Mayordomo JI, Zorina T, Storkus WJ, et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with
synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med.
1995;1(12):1297-1302.
97.
Park JS, Park SY, Cho HI, Sohn HJ, Kim TG. Enhanced Induction of T Cell Immunity Using
Dendritic Cells Pulsed with HIV Tat and HCMV-pp65 Fusion Protein In Vitro. Immune Netw.
2011;11(3):182-189.
98.
Ferguson AR, Nichols LA, Zarling AL, et al. Strategies and challenges in eliciting immunity to
melanoma. Immunol Rev. 2008;222:28-42.
99.
Tacken PJ, Zeelenberg IS, Cruz LJ, et al. Targeted delivery of TLR ligands to human and mouse
dendritic cells strongly enhances adjuvanticity. Blood. 2011;118(26):6836-6844.
100. Zitvogel L, Palucka K. Antibody co-targeting of DCs. Blood. 2011;118(26):6726-6727.
101. Wuest SC, Edwan JH, Martin JF, et al. A role for interleukin-2 trans-presentation in dendritic
cell-mediated T cell activation in humans, as revealed by daclizumab therapy. Nat Med.
2011;17(5):604-609.
102. Kapsenberg ML. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev
Immunol. 2003;3(12):984-993.
103. Sigal LJ, Crotty S, Andino R, Rock KL. Cytotoxic T-cell immunity to virus-infected nonhaematopoietic cells requires presentation of exogenous antigen. Nature. 1999;398(6722):77-80.
104. Hamilton-Williams EE, Lang A, Benke D, Davey GM, Wiesmuller KH, Kurts C. Cutting edge: TLR
ligands are not sufficient to break cross-tolerance to self-antigens. J Immunol. 2005;174(3):11591163.
105. Smith CM, Wilson NS, Waithman J, et al. Cognate CD4(+) T cell licensing of dendritic cells in
CD8(+) T cell immunity. Nat Immunol. 2004;5(11):1143-1148.
106. Carbone FR, Kurts C, Bennett SR, Miller JF, Heath WR. Cross-presentation: a general
mechanism for CTL immunity and tolerance. Immunol Today. 1998;19(8):368-373.
107. Dhodapkar MV, Steinman RM, Krasovsky J, Munz C, Bhardwaj N. Antigen-specific inhibition of
effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med.
2001;193(2):233-238.
108. Kurts C, Kosaka H, Carbone FR, Miller JF, Heath WR. Class I-restricted cross-presentation of
exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells. J Exp Med. 1997;186(2):239245.
109. Sakaguchi S, Fukuma K, Kuribayashi K, Masuda T. Organ-specific autoimmune diseases
induced in mice by elimination of T cell subset. I. Evidence for the active participation of T cells in
natural self-tolerance; deficit of a T cell subset as a possible cause of autoimmune disease. J Exp Med.
1985;161(1):72-87.
110. Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells
develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 2005;6(11):11231132.
88
111. Eyerich S, Eyerich K, Pennino D, et al. Th22 cells represent a distinct human T cell subset
involved in epidermal immunity and remodeling. J Clin Invest. 2009;119(12):3573-3585.
112. Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that
induces autoimmune inflammation. J Exp Med. 2005;201(2):233-240.
113. Happel KI, Dubin PJ, Zheng M, et al. Divergent roles of IL-23 and IL-12 in host defense against
Klebsiella pneumoniae. J Exp Med. 2005;202(6):761-769.
114. Witte E, Witte K, Warszawska K, Sabat R, Wolk K. Interleukin-22: a cytokine produced by T,
NK and NKT cell subsets, with importance in the innate immune defense and tissue protection.
Cytokine Growth Factor Rev. 2010;21(5):365-379.
115. Stockinger B, Veldhoen M. Differentiation and function of Th17 T cells. Curr Opin Immunol.
2007;19(3):281-286.
116. Chen W, Jin W, Hardegen N, et al. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to
CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. J Exp Med.
2003;198(12):1875-1886.
117. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3 programs the development and function of
CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Immunol. 2003;4(4):330-336.
118. Laurence A, O'Shea JJ. T(H)-17 differentiation: of mice and men. Nat Immunol. 2007;8(9):903905.
119. Yang L, Anderson DE, Baecher-Allan C, et al. IL-21 and TGF-beta are required for
differentiation of human T(H)17 cells. Nature. 2008;454(7202):350-352.
120. Britt W. Primate models : pros and cons. in : Reddehase, MJ Editor Cytomegaloviruses,
Molecular biology, and infection control. 2006:561-606.
121. Dolan A, Cunningham C, Hector RD, et al. Genetic content of wild-type human
cytomegalovirus. J Gen Virol. 2004;85(Pt 5):1301-1312.
122. Davison AJ, Dolan A, Akter P, et al. The human cytomegalovirus genome revisited:
comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J Gen Virol. 2003;84(Pt 1):17-28.
123. Crough T, Khanna R. Immunobiology of human cytomegalovirus: from bench to bedside. Clin
Microbiol Rev. 2009;22(1):76-98, Table of Contents.
124. Hahn G, Revello MG, Patrone M, et al. Human cytomegalovirus UL131-128 genes are
indispensable for virus growth in endothelial cells and virus transfer to leukocytes. J Virol.
2004;78(18):10023-10033.
125. Coonrod D, Collier AC, Ashley R, DeRouen T, Corey L. Association between cytomegalovirus
seroconversion and upper genital tract infection among women attending a sexually transmitted
disease clinic: a prospective study. J Infect Dis. 1998;177(5):1188-1193.
126. Murph JR, Bale JF, Jr., Murray JC, Stinski MF, Perlman S. Cytomegalovirus transmission in a
Midwest day care center: possible relationship to child care practices. J Pediatr. 1986;109(1):35-39.
127. Boppana SB, Rivera LB, Fowler KB, Mach M, Britt WJ. Intrauterine transmission of
cytomegalovirus to infants of women with preconceptional immunity. N Engl J Med.
2001;344(18):1366-1371.
128. Stagno S, Pass RF, Dworsky ME, Alford CA, Jr. Maternal cytomegalovirus infection and
perinatal transmission. Clin Obstet Gynecol. 1982;25(3):563-576.
129. Reynolds DW, Stagno S, Hosty TS, Tiller M, Alford CA, Jr. Maternal cytomegalovirus excretion
and perinatal infection. N Engl J Med. 1973;289(1):1-5.
130. Dworsky M, Yow M, Stagno S, Pass RF, Alford C. Cytomegalovirus infection of breast milk and
transmission in infancy. Pediatrics. 1983;72(3):295-299.
131. Lowance D, Neumayer HH, Legendre CM, et al. Valacyclovir for the prevention of
cytomegalovirus disease after renal transplantation. International Valacyclovir Cytomegalovirus
Prophylaxis Transplantation Study Group. N Engl J Med. 1999;340(19):1462-1470.
132. Klemola E, Von Essen R, Henle G, Henle W. Infectious-mononucleosis-like disease with
negative heterophil agglutination test. Clinical features in relation to Epstein-Barr virus and
cytomegalovirus antibodies. J Infect Dis. 1970;121(6):608-614.
133. Mocarski S, Pass. Virology. FIELDS. 2007;2:2702-2772.
89
134. Gallant JE, Moore RD, Richman DD, Keruly J, Chaisson RE. Incidence and natural history of
cytomegalovirus disease in patients with advanced human immunodeficiency virus disease treated
with zidovudine. The Zidovudine Epidemiology Study Group. J Infect Dis. 1992;166(6):1223-1227.
135. Cinatl J, Jr., Scholz M, Doerr HW. Role of tumor cell immune escape mechanisms in
cytomegalovirus-mediated oncomodulation. Med Res Rev. 2005;25(2):167-185.
136. Baryawno N, Rahbar A, Wolmer-Solberg N, et al. Detection of human cytomegalovirus in
medulloblastomas reveals a potential therapeutic target. J Clin Invest. 2011;121(10):4043-4055.
137. Grattan MT, Moreno-Cabral CE, Starnes VA, Oyer PE, Stinson EB, Shumway NE.
Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and atherosclerosis. Jama.
1989;261(24):3561-3566.
138. The CARI guidelines. CMV disease and kidney transplant: prophylaxis for cytomegalovirus
infection in patients following renal transplantation. Nephrology (Carlton). 2004;9 Suppl 3:S27-31.
139. Luan FL, Kommareddi M, Ojo AO. Impact of cytomegalovirus disease in D+/R- kidney
transplant patients receiving 6 months low-dose valganciclovir prophylaxis. Am J Transplant.
2011;11(9):1936-1942.
140. Weclawiak H, Kamar N, Mengelle C, et al. Pre-emptive intravenous ganciclovir versus
valganciclovir prophylaxis for de novo cytomegalovirus-seropositive kidney-transplant recipients.
Transpl Int. 2010;23(10):1056-1064.
141. Biron KK, Fyfe JA, Stanat SC, et al. A human cytomegalovirus mutant resistant to the
nucleoside analog 9-([2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethoxy]methyl)guanine (BW B759U) induces
reduced levels of BW B759U triphosphate. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(22):8769-8773.
142. Smith IL, Cherrington JM, Jiles RE, Fuller MD, Freeman WR, Spector SA. High-level resistance
of cytomegalovirus to ganciclovir is associated with alterations in both the UL97 and DNA polymerase
genes. J Infect Dis. 1997;176(1):69-77.
143. Eriksson B, Oberg B, Wahren B. Pyrophosphate analogues as inhibitors of DNA polymerases
of cytomegalovirus, herpes simplex virus and cellular origin. Biochim Biophys Acta. 1982;696(2):115123.
144. Eriksson B, Oberg B. Characteristics of herpesvirus mutants resistant to phosphonoformate
and phosphonoacetate. Antimicrob Agents Chemother. 1979;15(6):758-762.
145. Kaul DR, Stoelben S, Cober E, et al. First report of successful treatment of multidrug-resistant
cytomegalovirus disease with the novel anti-CMV compound AIC246. Am J Transplant.
2011;11(5):1079-1084.
146. Marty FM, Ljungman P, Papanicolaou GA, et al. Maribavir prophylaxis for prevention of
cytomegalovirus disease in recipients of allogeneic stem-cell transplants: a phase 3, double-blind,
placebo-controlled, randomised trial. Lancet Infect Dis. 2011;11(4):284-292.
147. Walter EA, Greenberg PD, Gilbert MJ, et al. Reconstitution of cellular immunity against
cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.
N Engl J Med. 1995;333(16):1038-1044.
148. Peggs K, Verfuerth S, Mackinnon S. Induction of cytomegalovirus (CMV)-specific T-cell
responses using dendritic cells pulsed with CMV antigen: a novel culture system free of live CMV
virions. Blood. 2001;97(4):994-1000.
149. Kleihauer A, Grigoleit U, Hebart H, et al. Ex vivo generation of human cytomegalovirusspecific cytotoxic T cells by peptide-pulsed dendritic cells. Br J Haematol. 2001;113(1):231-239.
150. Peggs KS, Verfuerth S, Pizzey A, et al. Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus
infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines. Lancet.
2003;362(9393):1375-1377.
151. Gerdemann U, Vera JF, Rooney CM, Leen AM. Generation of multivirus-specific T cells to
prevent/treat viral infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. J Vis Exp(51). 2011
152. Snydman DR, Werner BG, Heinze-Lacey B, et al. Use of cytomegalovirus immune globulin to
prevent cytomegalovirus disease in renal-transplant recipients. N Engl J Med. 1987;317(17):10491054.
90
153. Snydman DR, Werner BG, Dougherty NN, et al. Cytomegalovirus immune globulin prophylaxis
in liver transplantation. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Ann Intern Med.
1993;119(10):984-991.
154. Snydman DR. Historical overview of the use of cytomegalovirus hyperimmune globulin in
organ transplantation. Transpl Infect Dis. 2001;3 Suppl 2:6-13.
155. Preiksaitis JK, Brennan DC, Fishman J, Allen U. Canadian society of transplantation consensus
workshop on cytomegalovirus management in solid organ transplantation final report. Am J
Transplant. 2005;5(2):218-227.
156. Nigro G, Adler SP, La Torre R, Best AM. Passive immunization during pregnancy for congenital
cytomegalovirus infection. N Engl J Med. 2005;353(13):1350-1362.
157. Adler SP, Nigro G. Findings and conclusions from CMV hyperimmune globulin treatment
trials. J Clin Virol. 2009;46 Suppl 4:S54-57.
158. Maidji E, Nigro G, Tabata T, et al. Antibody treatment promotes compensation for human
cytomegalovirus-induced pathogenesis and a hypoxia-like condition in placentas with congenital
infection. Am J Pathol. 2010;177(3):1298-1310.
159. Coll O, Benoist G, Ville Y, et al. Guidelines on CMV congenital infection. J Perinat Med.
2009;37(5):433-445.
160. Manley K, Anderson J, Yang F, et al. Human cytomegalovirus escapes a naturally occurring
neutralizing antibody by incorporating it into assembling virions. Cell Host Microbe. 2011;10(3):197209.
161. Elek SD, Stern H. Development of a vaccine against mental retardation caused by
cytomegalovirus infection in utero. Lancet. 1974;1(7845):1-5.
162. Plotkin SA, Smiley ML, Friedman HM, et al. Towne-vaccine-induced prevention of
cytomegalovirus disease after renal transplants. Lancet. 1984;1(8376):528-530.
163. Heineman TC, Schleiss M, Bernstein DI, et al. A phase 1 study of 4 live, recombinant human
cytomegalovirus Towne/Toledo chimeric vaccines. J Infect Dis. 2006;193(10):1350-1360.
164. Elkington R, Walker S, Crough T, et al. Ex vivo profiling of CD8+-T-cell responses to human
cytomegalovirus reveals broad and multispecific reactivities in healthy virus carriers. J Virol.
2003;77(9):5226-5240.
165. Endresz V, Kari L, Berencsi K, et al. Induction of human cytomegalovirus (HCMV)-glycoprotein
B (gB)-specific neutralizing antibody and phosphoprotein 65 (pp65)-specific cytotoxic T lymphocyte
responses by naked DNA immunization. Vaccine. 1999;17(1):50-58.
166. Cui X, Meza BP, Adler SP, McVoy MA. Cytomegalovirus vaccines fail to induce epithelial entry
neutralizing antibodies comparable to natural infection. Vaccine. 2008;26(45):5760-5766.
167. Pass RF, Zhang C, Evans A, et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. N
Engl J Med. 2009;360(12):1191-1199.
168. Berencsi K, Gyulai Z, Gonczol E, et al. A canarypox vector-expressing cytomegalovirus (CMV)
phosphoprotein 65 induces long-lasting cytotoxic T cell responses in human CMV-seronegative
subjects. J Infect Dis. 2001;183(8):1171-1179.
169. Bernstein DI, Schleiss MR, Berencsi K, et al. Effect of previous or simultaneous immunization
with canarypox expressing cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B (gB) on response to subunit gB
vaccine plus MF59 in healthy CMV-seronegative adults. J Infect Dis. 2002;185(5):686-690.
170. Pepperl S, Munster J, Mach M, Harris JR, Plachter B. Dense bodies of human cytomegalovirus
induce both humoral and cellular immune responses in the absence of viral gene expression. J Virol.
2000;74(13):6132-6146.
171. Becke S, Aue S, Thomas D, et al. Optimized recombinant dense bodies of human
cytomegalovirus efficiently prime virus specific lymphocytes and neutralizing antibodies without the
addition of adjuvant. Vaccine. 2010;28(38):6191-6198.
172. Gandhi MK, Khanna R. Human cytomegalovirus: clinical aspects, immune regulation, and
emerging treatments. Lancet Infect Dis. 2004;4(12):725-738.
173. Britt WJ, Boppana S. Human cytomegalovirus virion proteins. Hum Immunol. 2004;65(5):395402.
91
174. Munger J, Yu D, Shenk T. UL26-deficient human cytomegalovirus produces virions with
hypophosphorylated pp28 tegument protein that is unstable within newly infected cells. J Virol.
2006;80(7):3541-3548.
175. Compton T, Nowlin DM, Cooper NR. Initiation of human cytomegalovirus infection requires
initial interaction with cell surface heparan sulfate. Virology. 1993;193(2):834-841.
176. Gicklhorn D, Eickmann M, Meyer G, Ohlin M, Radsak K. Differential effects of glycoprotein B
epitope-specific antibodies on human cytomegalovirus-induced cell-cell fusion. J Gen Virol.
2003;84(Pt 7):1859-1862.
177. Compton T. Receptors and immune sensors: the complex entry path of human
cytomegalovirus. Trends Cell Biol. 2004;14(1):5-8.
178. Wang X, Huang DY, Huong SM, Huang ES. Integrin alphavbeta3 is a coreceptor for human
cytomegalovirus. Nat Med. 2005;11(5):515-521.
179. Paterson DA, Dyer AP, Milne RS, Sevilla-Reyes E, Gompels UA. A role for human
cytomegalovirus glycoprotein O (gO) in cell fusion and a new hypervariable locus. Virology.
2002;293(2):281-294.
180. Wille PT, Knoche AJ, Nelson JA, Jarvis MA, Johnson DC. A human cytomegalovirus gO-null
mutant fails to incorporate gH/gL into the virion envelope and is unable to enter fibroblasts and
epithelial and endothelial cells. J Virol. 2010;84(5):2585-2596.
181. Sinzger C, Kahl M, Laib K, et al. Tropism of human cytomegalovirus for endothelial cells is
determined by a post-entry step dependent on efficient translocation to the nucleus. J Gen Virol.
2000;81(Pt 12):3021-3035.
182. Melnychuk RM, Streblow DN, Smith PP, Hirsch AJ, Pancheva D, Nelson JA. Human
cytomegalovirus-encoded G protein-coupled receptor US28 mediates smooth muscle cell migration
through Galpha12. J Virol. 2004;78(15):8382-8391.
183. Pleskoff O, Casarosa P, Verneuil L, et al. The human cytomegalovirus-encoded chemokine
receptor US28 induces caspase-dependent apoptosis. Febs J. 2005;272(16):4163-4177.
184. Bongers G, Maussang D, Muniz LR, et al. The cytomegalovirus-encoded chemokine receptor
US28 promotes intestinal neoplasia in transgenic mice. J Clin Invest. 2010;120(11):3969-3978.
185. Ryckman BJ, Jarvis MA, Drummond DD, Nelson JA, Johnson DC. Human cytomegalovirus
entry into epithelial and endothelial cells depends on genes UL128 to UL150 and occurs by
endocytosis and low-pH fusion. J Virol. 2006;80(2):710-722.
186. Sinzger C. Entry route of HCMV into endothelial cells. J Clin Virol. 2008;41(3):174-179.
187. Ryckman BJ, Chase MC, Johnson DC. HCMV gH/gL/UL128-131 interferes with virus entry into
epithelial cells: evidence for cell type-specific receptors. Proc Natl Acad Sci U S A.
2008;105(37):14118-14123.
188. Pietropaolo R, Compton T. Interference with annexin II has no effect on entry of human
cytomegalovirus into fibroblast cells. J Gen Virol. 1999;80 ( Pt 7):1807-1816.
189. Wang X, Huong SM, Chiu ML, Raab-Traub N, Huang ES. Epidermal growth factor receptor is a
cellular receptor for human cytomegalovirus. Nature. 2003;424(6947):456-461.
190. Chan G, Nogalski MT, Yurochko AD. Activation of EGFR on monocytes is required for human
cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(52):2236922374.
191. Soroceanu L, Akhavan A, Cobbs CS. Platelet-derived growth factor-alpha receptor activation
is required for human cytomegalovirus infection. Nature. 2008;455(7211):391-395.
192. Kinzler ER, Compton T. Characterization of human cytomegalovirus glycoprotein-induced cellcell fusion. J Virol. 2005;79(12):7827-7837.
193. Compton T, Kurt-Jones EA, Boehme KW, et al. Human cytomegalovirus activates
inflammatory cytokine responses via CD14 and Toll-like receptor 2. J Virol. 2003;77(8):4588-4596.
194. Boehme KW, Guerrero M, Compton T. Human cytomegalovirus envelope glycoproteins B and
H are necessary for TLR2 activation in permissive cells. J Immunol. 2006;177(10):7094-7102.
195. Boehme KW, Compton T. Innate sensing of viruses by toll-like receptors. J Virol.
2004;78(15):7867-7873.
92
196. Boehme KW, Singh J, Perry ST, Compton T. Human cytomegalovirus elicits a coordinated
cellular antiviral response via envelope glycoprotein B. J Virol. 2004;78(3):1202-1211.
197. Boehme KW, compton T. Virus entry and activation of innate immunity. Cytomegaloviruses,
molecular biology and immunology. 2008;1:111-130.
198. Dohner K, Sodeik B. The role of the cytoskeleton during viral infection. Curr Top Microbiol
Immunol. 2005;285:67-108.
199. Bechtel JT, Shenk T. Human cytomegalovirus UL47 tegument protein functions after entry
and before immediate-early gene expression. J Virol. 2002;76(3):1043-1050.
200. Mocarski ES, Kemble GW, Lyle JM, Greaves RF. A deletion mutant in the human
cytomegalovirus gene encoding IE1(491aa) is replication defective due to a failure in autoregulation.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(21):11321-11326.
201. Marchini A, Liu H, Zhu H. Human cytomegalovirus with IE-2 (UL122) deleted fails to express
early lytic genes. J Virol. 2001;75(4):1870-1878.
202. Wiebusch L, Asmar J, Uecker R, Hagemeier C. Human cytomegalovirus immediate-early
protein 2 (IE2)-mediated activation of cyclin E is cell-cycle-independent and forces S-phase entry in
IE2-arrested cells. J Gen Virol. 2003;84(Pt 1):51-60.
203. Paulus C, Krauss S, Nevels M. A human cytomegalovirus antagonist of type I IFN-dependent
signal transducer and activator of transcription signaling. Proc Natl Acad Sci U S A.
2006;103(10):3840-3845.
204. Goldmacher VS. Cell death suppression by cytomegaloviruses. Apoptosis. 2005;10(2):251265.
205. Child SJ, Hakki M, De Niro KL, Geballe AP. Evasion of cellular antiviral responses by human
cytomegalovirus TRS1 and IRS1. J Virol. 2004;78(1):197-205.
206. Jones TR, Wiertz EJ, Sun L, Fish KN, Nelson JA, Ploegh HL. Human cytomegalovirus US3
impairs transport and maturation of major histocompatibility complex class I heavy chains. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1996;93(21):11327-11333.
207. Sanchez V SD. Exploitation of host cell cycle regulatory pathways by HCMV. Cytomegalovirus,
Molecular biology and immunology. 2006;1:205-230.
208. Dittmer D, Mocarski ES. Human cytomegalovirus infection inhibits G1/S transition. J Virol.
1997;71(2):1629-1634.
209. Singer GP, Newcomb WW, Thomsen DR, Homa FL, Brown JC. Identification of a region in the
herpes simplex virus scaffolding protein required for interaction with the portal. J Virol.
2005;79(1):132-139.
210. Reeves MB, MacAry PA, Lehner PJ, Sissons JG, Sinclair JH. Latency, chromatin remodeling,
and reactivation of human cytomegalovirus in the dendritic cells of healthy carriers. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2005;102(11):4140-4145.
211. Sinclair J. Chromatin structure regulates human cytomegalovirus gene expression during
latency, reactivation and lytic infection. Biochim Biophys Acta. 2010;1799(3-4):286-295.
212. Bolovan-Fritts CA, Mocarski ES, Wiedeman JA. Peripheral blood CD14(+) cells from healthy
subjects carry a circular conformation of latent cytomegalovirus genome. Blood. 1999;93(1):394-398.
213. Jordan MC. Latent infection and the elusive cytomegalovirus. Rev Infect Dis. 1983;5(2):205215.
214. de Graan-Hentzen YC, Gratama JW, Mudde GC, et al. Prevention of primary cytomegalovirus
infection in patients with hematologic malignancies by intensive white cell depletion of blood
products. Transfusion. 1989;29(9):757-760.
215. Stanier P, Taylor DL, Kitchen AD, Wales N, Tryhorn Y, Tyms AS. Persistence of
cytomegalovirus in mononuclear cells in peripheral blood from blood donors. Bmj.
1989;299(6704):897-898.
216. Sinclair J. Human cytomegalovirus: Latency and reactivation in the myeloid lineage. J Clin
Virol. 2008;41(3):180-185.
217. Bego M, Maciejewski J, Khaiboullina S, Pari G, St Jeor S. Characterization of an antisense
transcript spanning the UL81-82 locus of human cytomegalovirus. J Virol. 2005;79(17):11022-11034.
93
218. Slobedman B, Mocarski ES, Arvin AM, Mellins ED, Abendroth A. Latent cytomegalovirus
down-regulates major histocompatibility complex class II expression on myeloid progenitors. Blood.
2002;100(8):2867-2873.
219. Montag C, Wagner JA, Gruska I, Vetter B, Wiebusch L, Hagemeier C. The latency-associated
UL138 gene product of human cytomegalovirus sensitizes cells to tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) signaling by upregulating TNF-alpha receptor 1 cell surface expression. J Virol.
2011;85(21):11409-11421.
220. Taylor-Wiedeman J, Sissons P, Sinclair J. Induction of endogenous human cytomegalovirus
gene expression after differentiation of monocytes from healthy carriers. J Virol. 1994;68(3):15971604.
221. Soderberg-Naucler C, Fish KN, Nelson JA. Reactivation of latent human cytomegalovirus by
allogeneic stimulation of blood cells from healthy donors. Cell. 1997;91(1):119-126.
222. Hargett D, Shenk TE. Experimental human cytomegalovirus latency in CD14+ monocytes. Proc
Natl Acad Sci U S A. 2010;107(46):20039-20044.
223. Reeves MB, Compton T. Inhibition of inflammatory interleukin-6 activity via extracellular
signal-regulated kinase-mitogen-activated protein kinase signaling antagonizes human
cytomegalovirus reactivation from dendritic cells. J Virol. 2011;85(23):12750-12758.
224. Isaacson MK, Juckem LK, Compton T. Virus entry and innate immune activation. Curr Top
Microbiol Immunol. 2008;325:85-100.
225. Tabeta K, Georgel P, Janssen E, et al. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of
innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci U S A.
2004;101(10):3516-3521.
226. Dupuis S, Jouanguy E, Al-Hajjar S, et al. Impaired response to interferon-alpha/beta and lethal
viral disease in human STAT1 deficiency. Nat Genet. 2003;33(3):388-391.
227. Jouanguy E, Zhang SY, Chapgier A, et al. Human primary immunodeficiencies of type I
interferons. Biochimie. 2007;89(6-7):878-883.
228. Sadler AJ, Williams BR. Interferon-inducible antiviral effectors. Nat Rev Immunol.
2008;8(7):559-568.
229. Der SD, Zhou A, Williams BR, Silverman RH. Identification of genes differentially regulated by
interferon alpha, beta, or gamma using oligonucleotide arrays. Proc Natl Acad Sci U S A.
1998;95(26):15623-15628.
230. Levraud JP, Boudinot P, Colin I, et al. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications
for the origin of the vertebrate IFN system. J Immunol. 2007;178(7):4385-4394.
231. Miller DM, Rahill BM, Boss JM, et al. Human cytomegalovirus inhibits major
histocompatibility complex class II expression by disruption of the Jak/Stat pathway. J Exp Med.
1998;187(5):675-683.
232. Zhao C, Denison C, Huibregtse JM, Gygi S, Krug RM. Human ISG15 conjugation targets both
IFN-induced and constitutively expressed proteins functioning in diverse cellular pathways. Proc Natl
Acad Sci U S A. 2005;102(29):10200-10205.
233. Takeuchi T, Kobayashi T, Tamura S, Yokosawa H. Negative regulation of protein phosphatase
2Cbeta by ISG15 conjugation. FEBS Lett. 2006;580(18):4521-4526.
234. Kuang Z, Seo EJ, Leis J. Mechanism of inhibition of retrovirus release from cells by interferoninduced gene ISG15. J Virol. 2011;85(14):7153-7161.
235. D'Cunha J, Ramanujam S, Wagner RJ, Witt PL, Knight E, Jr., Borden EC. In vitro and in vivo
secretion of human ISG15, an IFN-induced immunomodulatory cytokine. J Immunol.
1996;157(9):4100-4108.
236. Haller O, Arnheiter H, Gresser I, Lindenmann J. Genetically determined, interferondependent resistance to influenza virus in mice. J Exp Med. 1979;149(3):601-612.
237. Kochs G, Haller O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto
virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(5):2082-2086.
94
238. Ank N, West H, Bartholdy C, Eriksson K, Thomsen AR, Paludan SR. Lambda interferon (IFNlambda), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against
select virus infections in vivo. J Virol. 2006;80(9):4501-4509.
239. Roberts WK, Hovanessian A, Brown RE, Clemens MJ, Kerr IM. Interferon-mediated protein
kinase and low-molecular-weight inhibitor of protein synthesis. Nature. 1976;264(5585):477-480.
240. Nallagatla SR, Hwang J, Toroney R, Zheng X, Cameron CE, Bevilacqua PC. 5'-triphosphatedependent activation of PKR by RNAs with short stem-loops. Science. 2007;318(5855):1455-1458.
241. Budt M, Niederstadt L, Valchanova RS, Jonjic S, Brune W. Specific inhibition of the PKRmediated antiviral response by the murine cytomegalovirus proteins m142 and m143. J Virol.
2009;83(3):1260-1270.
242. Hakki M, Marshall EE, De Niro KL, Geballe AP. Binding and nuclear relocalization of protein
kinase R by human cytomegalovirus TRS1. J Virol. 2006;80(23):11817-11826.
243. Knapp S, Yee LJ, Frodsham AJ, et al. Polymorphisms in interferon-induced genes and the
outcome of hepatitis C virus infection: roles of MxA, OAS-1 and PKR. Genes Immun. 2003;4(6):411419.
244. Tan JC, Avdic S, Cao JZ, et al. Inhibition of 2',5'-oligoadenylate synthetase expression and
function by the human cytomegalovirus ORF94 gene product. J Virol. 2011;85(11):5696-5700.
245. Bonnevie-Nielsen V, Field LL, Lu S, et al. Variation in antiviral 2',5'-oligoadenylate synthetase
(2'5'AS) enzyme activity is controlled by a single-nucleotide polymorphism at a splice-acceptor site in
the OAS1 gene. Am J Hum Genet. 2005;76(4):623-633.
246. Tay CH, Szomolanyi-Tsuda E, Welsh RM. Control of infections by NK cells. Curr Top Microbiol
Immunol. 1998;230:193-220.
247. Brown MG, Dokun AO, Heusel JW, et al. Vital involvement of a natural killer cell activation
receptor in resistance to viral infection. Science. 2001;292(5518):934-937.
248. Pyzik M, Charbonneau B, Gendron-Pontbriand EM, et al. Distinct MHC class I-dependent NK
cell-activating receptors control cytomegalovirus infection in different mouse strains. J Exp Med.
2011;208(5):1105-1117.
249. Biron CA, Byron KS, Sullivan JL. Severe herpesvirus infections in an adolescent without natural
killer cells. N Engl J Med. 1989;320(26):1731-1735.
250. Quinnan GV, Jr., Kirmani N, Rook AH, et al. Cytotoxic t cells in cytomegalovirus infection: HLArestricted T-lymphocyte and non-T-lymphocyte cytotoxic responses correlate with recovery from
cytomegalovirus infection in bone-marrow-transplant recipients. N Engl J Med. 1982;307(1):7-13.
251. Foley B, Cooley S, Verneris MR, et al. Cytomegalovirus reactivation after allogeneic
transplantation promotes a lasting increase in educated NKG2C+ natural killer cells with potent
function. Blood. 2011.
252. Reddehase MJ. Antigens and immunoevasins: opponents in cytomegalovirus immune
surveillance. Nat Rev Immunol. 2002;2(11):831-844.
253. Ravetch JV, Lanier LL. Immune inhibitory receptors. Science. 2000;290(5489):84-89.
254. Beck S, Barrell BG. Human cytomegalovirus encodes a glycoprotein homologous to MHC
class-I antigens. Nature. 1988;331(6153):269-272.
255. Tomasec P, Braud VM, Rickards C, et al. Surface expression of HLA-E, an inhibitor of natural
killer cells, enhanced by human cytomegalovirus gpUL40. Science. 2000;287(5455):1031.
256. Braud VM, Allan DS, O'Callaghan CA, et al. HLA-E binds to natural killer cell receptors
CD94/NKG2A, B and C. Nature. 1998;391(6669):795-799.
257. Prod'homme V, Sugrue DM, Stanton RJ, et al. Human cytomegalovirus UL141 promotes
efficient downregulation of the natural killer cell activating ligand CD112. J Gen Virol. 2010;91(Pt
8):2034-2039.
258. Tomasec P, Wang EC, Davison AJ, et al. Downregulation of natural killer cell-activating ligand
CD155 by human cytomegalovirus UL141. Nat Immunol. 2005;6(2):181-188.
259. Arnon TI, Achdout H, Levi O, et al. Inhibition of the NKp30 activating receptor by pp65 of
human cytomegalovirus. Nat Immunol. 2005;6(5):515-523.
95
260. Bauer S, Groh V, Wu J, et al. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stressinducible MICA. Science. 1999;285(5428):727-729.
261. Dunn C, Chalupny NJ, Sutherland CL, et al. Human cytomegalovirus glycoprotein UL16 causes
intracellular sequestration of NKG2D ligands, protecting against natural killer cell cytotoxicity. J Exp
Med. 2003;197(11):1427-1439.
262. Ashiru O, Bennett NJ, Boyle LH, Thomas M, Trowsdale J, Wills MR. NKG2D ligand MICA is
retained in the cis-Golgi apparatus by human cytomegalovirus protein UL142. J Virol.
2009;83(23):12345-12354.
263. Stern-Ginossar N, Elefant N, Zimmermann A, et al. Host immune system gene targeting by a
viral miRNA. Science. 2007;317(5836):376-381.
264. Nachmani D, Lankry D, Wolf DG, Mandelboim O. The human cytomegalovirus microRNA miRUL112 acts synergistically with a cellular microRNA to escape immune elimination. Nat Immunol.
2010;11(9):806-813.
265. Kovacs AL, Seglen PO. Inhibition of hepatocytic protein degradation by inducers of
autophagosome accumulation. Acta Biol Med Ger. 1982;41(1):125-130.
266. Meijer WH, van der Klei IJ, Veenhuis M, Kiel JA. ATG genes involved in non-selective
autophagy are conserved from yeast to man, but the selective Cvt and pexophagy pathways also
require organism-specific genes. Autophagy. 2007;3(2):106-116.
267. Levine B, Deretic V. Unveiling the roles of autophagy in innate and adaptive immunity. Nat
Rev Immunol. 2007;7(10):767-777.
268. Hussey S, Travassos LH, Jones NL. Autophagy as an emerging dimension to adaptive and
innate immunity. Semin Immunol. 2009;21(4):233-241.
269. Talloczy Z, Virgin HWt, Levine B. PKR-dependent autophagic degradation of herpes simplex
virus type 1. Autophagy. 2006;2(1):24-29.
270. Jackson WT, Giddings TH, Jr., Taylor MP, et al. Subversion of cellular autophagosomal
machinery by RNA viruses. PLoS Biol. 2005;3(5):e156.
271. Orvedahl A, Alexander D, Talloczy Z, et al. HSV-1 ICP34.5 confers neurovirulence by targeting
the Beclin 1 autophagy protein. Cell Host Microbe. 2007;1(1):23-35.
272. McFarlane S, Aitken J, Sutherland JS, Nicholl MJ, Preston VG, Preston CM. Early induction of
autophagy in human fibroblasts after infection with human cytomegalovirus or herpes simplex virus
1. J Virol. 2011;85(9):4212-4221.
273. Chaumorcel M, Souquere S, Pierron G, Codogno P, Esclatine A. Human cytomegalovirus
controls a new autophagy-dependent cellular antiviral defense mechanism. Autophagy.
2008;4(1):46-53.
274. Chaumorcel M, Lussignol M, Mouna L, et al. The Human Cytomegalovirus Protein TRS1
Inhibits Autophagy via Its Interaction with Beclin 1. J Virol. 2011.
275. Harrison CJ, Britt WJ, Chapman NM, Mullican J, Tracy S. Reduced congenital cytomegalovirus
(CMV) infection after maternal immunization with a guinea pig CMV glycoprotein before gestational
primary CMV infection in the guinea pig model. J Infect Dis. 1995;172(5):1212-1220.
276. Fowler KB, Stagno S, Pass RF, Britt WJ, Boll TJ, Alford CA. The outcome of congenital
cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med. 1992;326(10):663667.
277. Urban M, Klein M, Britt WJ, Hassfurther E, Mach M. Glycoprotein H of human
cytomegalovirus is a major antigen for the neutralizing humoral immune response. J Gen Virol.
1996;77 ( Pt 7):1537-1547.
278. Britt WJ, Vugler L, Stephens EB. Induction of complement-dependent and -independent
neutralizing antibodies by recombinant-derived human cytomegalovirus gp55-116 (gB). J Virol.
1988;62(9):3309-3318.
279. Britt WJ. Recent advances in the identification of significant human cytomegalovirus-encoded
proteins. Transplant Proc. 1991;23(3 Suppl 3):64-69, discussion 69.
96
280. Macagno A, Bernasconi NL, Vanzetta F, et al. Isolation of human monoclonal antibodies that
potently neutralize human cytomegalovirus infection by targeting different epitopes on the
gH/gL/UL128-131A complex. J Virol. 2010;84(2):1005-1013.
281. Couzi L, Pitard V, Sicard X, et al. Antibody-dependent anti-cytomegalovirus activity of human
gamma-delta T cells expressing CD16 (FcgammaRIIIa). Blood. 2011.
282. Jonjic S, Mutter W, Weiland F, Reddehase MJ, Koszinowski UH. Site-restricted persistent
cytomegalovirus infection after selective long-term depletion of CD4+ T lymphocytes. J Exp Med.
1989;169(4):1199-1212.
283. Rentenaar RJ, Gamadia LE, van DerHoek N, et al. Development of virus-specific CD4(+) T cells
during primary cytomegalovirus infection. J Clin Invest. 2000;105(4):541-548.
284. Gamadia LE, Rentenaar RJ, van Lier RA, ten Berge IJ. Properties of CD4(+) T cells in human
cytomegalovirus infection. Hum Immunol. 2004;65(5):486-492.
285. Elkington R, Shoukry NH, Walker S, et al. Cross-reactive recognition of human and primate
cytomegalovirus sequences by human CD4 cytotoxic T lymphocytes specific for glycoprotein B and H.
Eur J Immunol. 2004;34(11):3216-3226.
286. Hegde NR, Dunn C, Lewinsohn DM, Jarvis MA, Nelson JA, Johnson DC. Endogenous human
cytomegalovirus gB is presented efficiently by MHC class II molecules to CD4+ CTL. J Exp Med.
2005;202(8):1109-1119.
287. Davignon JL, Clement D, Alriquet J, Michelson S, Davrinche C. Analysis of the proliferative T
cell response to human cytomegalovirus major immediate-early protein (IE1): phenotype, frequency
and variability. Scand J Immunol. 1995;41(3):247-255.
288. Kern F, Bunde T, Faulhaber N, et al. Cytomegalovirus (CMV) phosphoprotein 65 makes a large
contribution to shaping the T cell repertoire in CMV-exposed individuals. J Infect Dis.
2002;185(12):1709-1716.
289. Sylwester AW, Mitchell BL, Edgar JB, et al. Broadly targeted human cytomegalovirus-specific
CD4+ and CD8+ T cells dominate the memory compartments of exposed subjects. J Exp Med.
2005;202(5):673-685.
290. van Leeuwen EM, Remmerswaal EB, Vossen MT, et al. Emergence of a CD4+CD28- granzyme
B+, cytomegalovirus-specific T cell subset after recovery of primary cytomegalovirus infection. J
Immunol. 2004;173(3):1834-1841.
291. Davignon JL, Castanie P, Yorke JA, Gautier N, Clement D, Davrinche C. Anti-human
cytomegalovirus activity of cytokines produced by CD4+ T-cell clones specifically activated by IE1
peptides in vitro. J Virol. 1996;70(4):2162-2169.
292. Nebbia G, Mattes FM, Smith C, et al. Polyfunctional cytomegalovirus-specific CD4+ and pp65
CD8+ T cells protect against high-level replication after liver transplantation. Am J Transplant.
2008;8(12):2590-2599.
293. Miller DM, Cebulla CM, Rahill BM, Sedmak DD. Cytomegalovirus and transcriptional downregulation of major histocompatibility complex class II expression. Semin Immunol. 2001;13(1):11-18.
294. Jenkins C, Garcia W, Godwin MJ, et al. Immunomodulatory properties of a viral homolog of
human interleukin-10 expressed by human cytomegalovirus during the latent phase of infection. J
Virol. 2008;82(7):3736-3750.
295. Jenkins C, Abendroth A, Slobedman B. A novel viral transcript with homology to human
interleukin-10 is expressed during latent human cytomegalovirus infection. J Virol. 2004;78(3):14401447.
296. Cheung AK, Gottlieb DJ, Plachter B, et al. The role of the human cytomegalovirus UL111A
gene in down-regulating CD4+ T-cell recognition of latently infected cells: implications for virus
elimination during latency. Blood. 2009;114(19):4128-4137.
297. Reddehase MJ, Mutter W, Munch K, Buhring HJ, Koszinowski UH. CD8-positive T lymphocytes
specific for murine cytomegalovirus immediate-early antigens mediate protective immunity. J Virol.
1987;61(10):3102-3108.
298. Reddehase MJ, Jonjic S, Weiland F, Mutter W, Koszinowski UH. Adoptive immunotherapy of
murine cytomegalovirus adrenalitis in the immunocompromised host: CD4-helper-independent
97
antiviral function of CD8-positive memory T lymphocytes derived from latently infected donors. J
Virol. 1988;62(3):1061-1065.
299. Cwynarski K, Ainsworth J, Cobbold M, et al. Direct visualization of cytomegalovirus-specific Tcell reconstitution after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 2001;97(5):1232-1240.
300. Bunde T, Kirchner A, Hoffmeister B, et al. Protection from cytomegalovirus after
transplantation is correlated with immediate early 1-specific CD8 T cells. J Exp Med.
2005;201(7):1031-1036.
301. Riddell SR, Watanabe KS, Goodrich JM, Li CR, Agha ME, Greenberg PD. Restoration of viral
immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science.
1992;257(5067):238-241.
302. Borysiewicz LK, Hickling JK, Graham S, et al. Human cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells.
Relative frequency of stage-specific CTL recognizing the 72-kD immediate early protein and
glycoprotein B expressed by recombinant vaccinia viruses. J Exp Med. 1988;168(3):919-931.
303. McLaughlin-Taylor E, Pande H, Forman SJ, et al. Identification of the major late human
cytomegalovirus matrix protein pp65 as a target antigen for CD8+ virus-specific cytotoxic T
lymphocytes. J Med Virol. 1994;43(1):103-110.
304. Crough T, Burrows JM, Fazou C, Walker S, Davenport MP, Khanna R. Contemporaneous
fluctuations in T cell responses to persistent herpes virus infections. Eur J Immunol. 2005;35(1):139149.
305. Tey SK, Goodrum F, Khanna R. CD8+ T-cell recognition of human cytomegalovirus latencyassociated determinant pUL138. J Gen Virol. 2010;91(Pt 8):2040-2048.
306. Appay V, Dunbar PR, Callan M, et al. Memory CD8+ T cells vary in differentiation phenotype
in different persistent virus infections. Nat Med. 2002;8(4):379-385.
307. Luo XH, Huang XJ, Liu KY, Xu LP, Liu DH. Protective immunity transferred by infusion of
cytomegalovirus-specific CD8(+) T cells within donor grafts: its associations with cytomegalovirus
reactivation following unmanipulated allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Biol Blood
Marrow Transplant. 2010;16(7):994-1004.
308. Gillespie GM, Wills MR, Appay V, et al. Functional heterogeneity and high frequencies of
cytomegalovirus-specific CD8(+) T lymphocytes in healthy seropositive donors. J Virol.
2000;74(17):8140-8150.
309. Waller EC, McKinney N, Hicks R, Carmichael AJ, Sissons JG, Wills MR. Differential
costimulation through CD137 (4-1BB) restores proliferation of human virus-specific "effector
memory" (CD28(-) CD45RA(HI)) CD8(+) T cells. Blood. 2007;110(13):4360-4366.
310. Zhou W, Longmate J, Lacey SF, et al. Impact of donor CMV status on viral infection and
reconstitution of multifunction CMV-specific T cells in CMV-positive transplant recipients. Blood.
2009;113(25):6465-6476.
311. Day EK, Carmichael AJ, ten Berge IJ, Waller EC, Sissons JG, Wills MR. Rapid CD8+ T cell
repertoire focusing and selection of high-affinity clones into memory following primary infection with
a persistent human virus: human cytomegalovirus. J Immunol. 2007;179(5):3203-3213.
312. Khan N, Hislop A, Gudgeon N, et al. Herpesvirus-specific CD8 T cell immunity in old age:
cytomegalovirus impairs the response to a coresident EBV infection. J Immunol. 2004;173(12):74817489.
313. Pourgheysari B, Khan N, Best D, Bruton R, Nayak L, Moss PA. The cytomegalovirus-specific
CD4+ T-cell response expands with age and markedly alters the CD4+ T-cell repertoire. J Virol.
2007;81(14):7759-7765.
314. Pawelec G, Akbar A, Caruso C, Solana R, Grubeck-Loebenstein B, Wikby A. Human
immunosenescence: is it infectious? Immunol Rev. 2005;205:257-268.
315. Pawelec G, Derhovanessian E. Role of CMV in immune senescence. Virus Res.
2011;157(2):175-179.
316. Trzonkowski P, Mysliwska J, Szmit E, et al. Association between cytomegalovirus infection,
enhanced proinflammatory response and low level of anti-hemagglutinins during the anti-influenza
vaccination--an impact of immunosenescence. Vaccine. 2003;21(25-26):3826-3836.
98
317. Wiertz EJ, Jones TR, Sun L, Bogyo M, Geuze HJ, Ploegh HL. The human cytomegalovirus US11
gene product dislocates MHC class I heavy chains from the endoplasmic reticulum to the cytosol.
Cell. 1996;84(5):769-779.
318. Jones TR, Sun L. Human cytomegalovirus US2 destabilizes major histocompatibility complex
class I heavy chains. J Virol. 1997;71(4):2970-2979.
319. Ahn K, Gruhler A, Galocha B, et al. The ER-luminal domain of the HCMV glycoprotein US6
inhibits peptide translocation by TAP. Immunity. 1997;6(5):613-621.
320. Hansen SG, Powers CJ, Richards R, et al. Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection
by cytomegalovirus. Science. 2010;328(5974):102-106.
321. Gilbert MJ, Riddell SR, Li CR, Greenberg PD. Selective interference with class I major
histocompatibility complex presentation of the major immediate-early protein following infection
with human cytomegalovirus. J Virol. 1993;67(6):3461-3469.
322. Gilbert MJ, Riddell SR, Plachter B, Greenberg PD. Cytomegalovirus selectively blocks antigen
processing and presentation of its immediate-early gene product. Nature. 1996;383(6602):720-722.
323. Dechanet J, Merville P, Lim A, et al. Implication of gammadelta T cells in the human immune
response to cytomegalovirus. J Clin Invest. 1999;103(10):1437-1449.
324. Ninomiya T, Takimoto H, Matsuzaki G, et al. Vgamma1+ gammadelta T cells play protective
roles at an early phase of murine cytomegalovirus infection through production of interferongamma. Immunology. 2000;99(2):187-194.
325. Dechanet J, Merville P, Berge F, et al. Major expansion of gammadelta T lymphocytes
following cytomegalovirus infection in kidney allograft recipients. J Infect Dis. 1999;179(1):1-8.
326. Halary F, Pitard V, Dlubek D, et al. Shared reactivity of V{delta}2(neg) {gamma}{delta} T cells
against cytomegalovirus-infected cells and tumor intestinal epithelial cells. J Exp Med.
2005;201(10):1567-1578.
327. Couzi L, Lafarge X, Pitard V, et al. Gamma-delta T cell expansion is closely associated with
cytomegalovirus infection in all solid organ transplant recipients. Transpl Int. 2011;24(5):e40-42.
328. Vermijlen D, Brouwer M, Donner C, et al. Human cytomegalovirus elicits fetal gammadelta T
cell responses in utero. J Exp Med. 2010;207(4):807-821.
329. Knight A, Madrigal AJ, Grace S, et al. The role of Vdelta2-negative gammadelta T cells during
cytomegalovirus reactivation in recipients of allogeneic stem cell transplantation. Blood.
2010;116(12):2164-2172.
330. Arrode G, Boccaccio C, Abastado JP, Davrinche C. Cross-presentation of human
cytomegalovirus pp65 (UL83) to CD8+ T cells is regulated by virus-induced, soluble-mediatordependent maturation of dendritic cells. J Virol. 2002;76(1):142-150.
331. Moutaftsi M, Mehl AM, Borysiewicz LK, Tabi Z. Human cytomegalovirus inhibits maturation
and impairs function of monocyte-derived dendritic cells. Blood. 2002;99(8):2913-2921.
332. Senechal B, Boruchov AM, Reagan JL, Hart DN, Young JW. Infection of mature monocytederived dendritic cells with human cytomegalovirus inhibits stimulation of T-cell proliferation via the
release of soluble CD83. Blood. 2004;103(11):4207-4215.
333. Smith MS, Bentz GL, Alexander JS, Yurochko AD. Human cytomegalovirus induces monocyte
differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J Virol.
2004;78(9):4444-4453.
334. Frascaroli G, Varani S, Moepps B, Sinzger C, Landini MP, Mertens T. Human cytomegalovirus
subverts the functions of monocytes, impairing chemokine-mediated migration and leukocyte
recruitment. J Virol. 2006;80(15):7578-7589.
335. Gredmark S, Soderberg-Naucler C. Human cytomegalovirus inhibits differentiation of
monocytes into dendritic cells with the consequence of depressed immunological functions. J Virol.
2003;77(20):10943-10956.
336. Varani S, Frascaroli G, Gibellini D, et al. Impaired dendritic cell immunophenotype and
function in heart transplant patients undergoing active cytomegalovirus infection. Transplantation.
2005;79(2):219-227.
99
337. Mandron M, Martin H, Bonjean B, Lule J, Tartour E, Davrinche C. Dendritic cell-induced
apoptosis of human cytomegalovirus-infected fibroblasts promotes cross-presentation of pp65 to
CD8+ T cells. J Gen Virol. 2008;89(Pt 1):78-86.
338. Martin H, Mandron M, Davrinche C. Interplay between human cytomegalovirus and dendritic
cells in T cell activation. Med Microbiol Immunol. 2008;197(2):179-184.
339. Rauwel B, Mariame B, Martin H, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated
receptor gamma by human cytomegalovirus for de novo replication impairs migration and
invasiveness of cytotrophoblasts from early placentas. J Virol. 2010;84(6):2946-2954.
340. Szatmari I, Torocsik D, Agostini M, et al. PPARgamma regulates the function of human
dendritic cells primarily by altering lipid metabolism. Blood. 2007;110(9):3271-3280.
341. Majai G, Gogolak P, Ambrus C, et al. PPARgamma modulated inflammatory response of
human dendritic cell subsets to engulfed apoptotic neutrophils. J Leukoc Biol. 2010;88(5):981-991.
342. Schoonjans K, Martin G, Staels B, Auwerx J. Peroxisome proliferator-activated receptors,
orphans with ligands and functions. Curr Opin Lipidol. 1997;8(3):159-166.
343. Hou W, Gibbs JS, Lu X, et al. Viral infection triggers rapid differentiation of human blood
monocytes into dendritic cells. Blood. 2012.
344. Raftery MJ, Hitzler M, Winau F, et al. Inhibition of CD1 antigen presentation by human
cytomegalovirus. J Virol. 2008;82(9):4308-4319.
345. Zajonc DM, Crispin MD, Bowden TA, et al. Molecular mechanism of lipopeptide presentation
by CD1a. Immunity. 2005;22(2):209-219.
346. Pena-Cruz V, Ito S, Dascher CC, Brenner MB, Sugita M. Epidermal Langerhans cells efficiently
mediate CD1a-dependent presentation of microbial lipid antigens to T cells. J Invest Dermatol.
2003;121(3):517-521.
347. Prevost JM, Pelley JL, Zhu W, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GMCSF) and inflammatory stimuli up-regulate secretion of the soluble GM-CSF receptor in human
monocytes: evidence for ectodomain shedding of the cell surface GM-CSF receptor alpha subunit. J
Immunol. 2002;169(10):5679-5688.
348. Alexander WS, Starr R, Metcalf D, et al. Suppressors of cytokine signaling (SOCS): negative
regulators of signal transduction. J Leukoc Biol. 1999;66(4):588-592.
349. Berclaz PY, Shibata Y, Whitsett JA, Trapnell BC. GM-CSF, via PU.1, regulates alveolar
macrophage Fcgamma R-mediated phagocytosis and the IL-18/IFN-gamma -mediated molecular
connection between innate and adaptive immunity in the lung. Blood. 2002;100(12):4193-4200.
350. Radtke F, Fasnacht N, Macdonald HR. Notch signaling in the immune system. Immunity.
2010;32(1):14-27.
351. Hong B, Ren W, Song XT, Evel-Kabler K, Chen SY, Huang XF. Human suppressor of cytokine
signaling 1 controls immunostimulatory activity of monocyte-derived dendritic cells. Cancer Res.
2009;69(20):8076-8084.
352. Perrin-Cocon L, Agaugue S, Diaz O, et al. Th1 disabled function in response to TLR4
stimulation of monocyte-derived DC from patients chronically-infected by hepatitis C virus. PLoS One.
2008;3(5):e2260.
353. Moriggl R, Sexl V, Kenner L, et al. Stat5 tetramer formation is associated with
leukemogenesis. Cancer Cell. 2005;7(1):87-99.
354. Harir N, Boudot C, Friedbichler K, et al. Oncogenic Kit controls neoplastic mast cell growth
through a Stat5/PI3-kinase signaling cascade. Blood. 2008;112(6):2463-2473.
355. Carey B, Trapnell BC. The molecular basis of pulmonary alveolar proteinosis. Clin Immunol.
2010;135(2):223-235.
356. Robertson SA. GM-CSF regulation of embryo development and pregnancy. Cytokine Growth
Factor Rev. 2007;18(3-4):287-298.
357. Burke JM. GM-CSF-armed, replication-competent viruses for cancer. Cytokine Growth Factor
Rev. 2010;21(2-3):149-151.
100
358. Page AV, Liles WC. Granulocyte colony-stimulating factor, granulocyte-macrophage colonystimulating factor, and other immunomodulatory therapies for the treatment of infectious diseases
in solid organ transplant recipients. Curr Opin Organ Transplant. 2008;13(6):575-580.
101
Résumés : Effets de l’infection par le cytomégalovirus humain sur la différenciation des monocytes en cellule dendritiques : mécanismes moléculaires et conséquences physiopathologiques La primo‐infection par le cytomegalovirus (CMV) ou sa réactivation sont les causes de nombreuses pathologies chez des personnes ayant un système immunitaire déficient. Le virus est capable de perturber la réponse immunitaire innée et adaptative en ciblant les fonctionnalités des cellules dendritiques (DC). Les monocytes, précurseurs de sous population de DC in vivo (MoDC), sont des cibles de l’infection par le CMV et peuvent contenir du virus latent. Les DC différenciées à partir de monocytes infectés (CMV‐MoDC) présentent un phénotype altéré ainsi que des pertes de fonctionnalités. Nous avons montré que les CMV‐MoDC ne sécrètent pas d’IL‐
12 en réponse à une stimulation par le LPS, ne sont plus capable de phagocyter de cellules mortes, d’induire une polarisation TH1 ou la prolifération de lymphocytes T CD4 allogéniques naïfs. Nous avons démontré que la signalisation GM‐CSF était altérée dans la population entière des CMV‐MoDC alors que seule la moitié des cellules étaient infectées, la sécrétion d’IL‐6 et l’activation des molécules SOCS3 (Suppressor Of Cytokines Signaling) étant en partie responsable de cet effet paracrine. Nous avons aussi montré que les MoDC dérivés de monocytes de patients virémiques présentent le même phénotype altéré que les CMV‐MoDC notamment une inhibition de la phosphorylation de STAT5 et donc une altération de la signalisation GM‐CSF. Nous avons décrit un nouveau mécanisme d’immunosuppression induite par le CMV, l’infection pouvant perturber les processus physiologiques nécessitant l’action du GM‐CSF ainsi que les différentes approches thérapeutiques à base de GM‐CSF. Impairment of monocytes to dendritic cells differentiation by human cytomegalovirus: molecular mechanisms and physiopathological consequences A primary HCMV infection or virus reactivation may cause severe disease in hosts with a deficient immune system. The virus can disturb both innate and adaptive immunity by targeting dendritic cell (DC) functions. Monocytes, which can be the precursors of DC in vivo (MoDC), are the primary targets of HCMV; they can also harbor latent virus. The dendritic cells generated from infected monocytes (CMV‐MoDC) have an altered phenotype and functional defects. We have shown that CMV‐MoDC do not secrete IL‐12 in response to LPS stimulation, cannot ingest dead cells, induce TH1 differentiation, or the proliferation of naive allogeneic CD4+ T cells. We found that the GM‐CSF signaling in an entire population of CMV‐MoDC was impaired although only half of the cells were productively infected, and that IL‐6 secretion and SOCS3 induction contributed to this bystander effect. We also showed that MoDC derived ex vivo from monocytes of viremic patients had the same altered phenotype as CMV‐MoDC, including decreased STAT5 phosphorylation, indicating defective GM‐CSF signaling. We have thus described a new mechanism of HCMV‐induced immunosupression, indicated how infection may disturb both GM‐CSF‐dependent physiological processes and proposed GM‐CSF‐based therapeutic approaches.
Mots‐clés : Cytomégalovirus / Cellules dendritiques / GM‐CSF / Différenciation / STAT5