1 - GEPV

Passé, présent et avenir (?)
Une brève histoire des
marqueurs moléculaires
utilisés en génétique des
populations
Jean-François Arnaud
UMR CNRS 8198
Laboratoire de Génétique et Évolution des Populations Végétales
Bât. SN2, Université de Lille 1, 59655 Villeneuve d’Ascq cedex
L’histoire de l’écologie moléculaire
vue par John C. Avise (2006)
Dans les années 60:
Quelques biologistes moléculaires de laboratoire et quelques
naturalistes de terrain se courtisent. Leur progéniture montre
une belle vigueur hybride: les populations naturelles sont
pleines de diversité !
Dans les années 70:
Ce nouveau-né chimérique se développe, avec parfois une belle
dose de naïveté: des conclusions issues d’une poignée de
marqueurs allozymiques peuvent-elles se généraliser à
l’ensemble du génome ?
Les années 80
Cet adolescent turbulent vit des idylles avec des partenaires
différents: RFLP, fingerprinting, RAPD, PCR, séquence
mitochondriales puis nucléaires, microsatellites, SNP,
expression de gènes…: chaque développement technique est
l’occasion d’un flirt parfois durable. Les méthodes d’analyse se
raffinent.
L’histoire de l’écologie moléculaire
vue par John C. Avise (2006)
Sortie de l’adolescence:
1992: naisance du journal Molecular Ecology, et
publication de plusieurs ouvrages dédiés à la discipline.
Le 21ème siècle:
La pleine maturité ? Ere génomique
•Investigation judiciaire
•Analyse de parenté
•Ecologie
comportementale
•Structure génétique des
populations
•Phylogéographie
•Spéciation-hybridation
•Génétique de la
conservation
•Ecologie microbienne
•Suivi des OGM
•Bases écologiques des
modulations de l’expression
•Le code-barre du vivant
•Bases génétiques de
l’adaptation
1992
2001
+ quelques ouvrages de références
Les marqueurs moléculaires utilisés en Génétique
des Populations : définition et quelques exemples
Définition :
Marqueur moléculaire = fragment d'ADN (information génétique)
ou sa représentation moléculaire (ARN, protéines)
Définition extrêmement large qui retient l'ensemble
de l'information génétique
Exclusion de l'ensemble des marqueurs phénotypiques
(couleur de la coquille chez les escargots, marqueurs
pigmentaires comme l'albinisme)
Universalité des marqueurs moléculaires : le marqueur est partagé
par tous les individus d'une même espèce, ou par toutes les espèces
Transmissibilité : les marqueurs moléculaires sont transmis de génération
en génération, il est préférable que cette transmission des allèles soit
mendélienne (transmission des allèles en proportion équiprobable)
= avantage sur marqueurs phénotypiques
L'échantillon dans lequel on peut choisir des marqueurs est de taille
considérable : ex. le génome humain = 3 milliards de paires de base, si
1000 sites informatifs présentant chacun 2 allèles on a 31000 génotypes
possibles… Contraste avec le nombre généralement faible de traits
phénotypiques utilisables en temps que marqueurs (en particulier chez
des espèces que l'on ne peut manipuler en laboratoire)
Variabilité des marqueurs moléculaires : généralement élevée, mais
dépend de l'échelle de temps considérée (temps de divergence)
Une autre qualité de cette diversité est son caractère discret : les
formes alléliques d'un marqueurs moléculaires ont une distribution
discrète et finie par opposition aux traits phénotypiques
Cette variabilité est par conséquent
quantifiable et peut être analysée à l'aide
de méthodes statistiques utilisant dans
certains cas des hypothèse nulles (ex. loi
de HW)
Processus évolutifs sous-jacents à cette variabilité :
- les mutations (créatrices de diversité génétique) ;
- les flux géniques (effet généralement homogénéisateur) ;
- la dérive génétique (action généralement érosive)
- la sélection naturelle (effet dépend de la forme de la sélection)
L'hypothèse de neutralité est généralement vérifiée pour les
marqueurs moléculaires au contraire des marqueurs phénotypiques
qui sont rarement neutres (pigmentation des pétales de fleurs,
polychromatisme de la coquille chez Cepaea nemoralis)
POURQUOI S’INTERESSER AUX VARIATIONS GENETIQUES ?
En Biologie Évolutive et Génétique des Populations, on
en distingue généralement 5 domaines d’applications:
(1) Structure génétique des populations : distribution de la variabilité
génétique aux niveaux intra- et inter-populationnel (dérive, flux de
gènes, modèles spatiaux de structure)
(2) Étude de l'apparentement entre individus : analyse de paternité,
recherche de l'origine la plus probable d'individus (tests d'assignation).
Applications diverse (sélection sexuelle, médecine légale et judiciaire,
protection des stocks, sélection de parentèle...)
(3) Cartographie génétique, recherche de marqueurs liés à des QTL :
utilisation dans les programmes de sélection et amélioration
(4) Autour de l'espèce : systématique fine entre espèce proches
(quelquefois indifférenciées morphologiquement), dynamique des
zones hybrides (cas des hybrizymes), phylogéographie
(5) La phylogénie moléculaire : il s'agit ici du niveau temporel et
spatial le plus élevé d'intervention des marqueurs moléculaires :
relations et histoires évolutives entre espèces parfois séparées par des
centaines de millions d'années
(+) Etudes d’association en biologie médicale
Les marqueurs allozymiques ("marqueurs du pauvre")
Polymorphisme allozymique: les années 70, théorie neutraliste de
l’évolution (Motoo Kimura)
Il s'agit du seul marqueur d'utilisation courante analysant le
polymorphisme protéique :
Séparation de forme alléliques d'un même gène par électrophorèse dans
un support de type gel (gels d'amidon ou polyacrylamide), suivi d'une
coloration spécifique.
Enzymes de type
monomérique
AA
Aa
aa
Enzymes de type
dimérique
AA
Types de résultats : bandes colorées distinguant
(i) des allèles de mobilité différentes, et (ii) les
formes hétérozygotes des formes homozygotes
(espèces diploïdes)
Aa
aa
Modèle d'évolution : par mutation ponctuelle modifiant la
charge nette de la protéine
Modèle de mutation IAM plutôt que SMM (voir marqueurs
microsatellites)
(Génération d'homoplasie)
SMM
i-1
i-1
i-1
i-1
i+1
i+1
i+1
i+1
i
IAM
i+n
i
i+n
Avantages : marqueurs codominants, relativement fiables, faible coût,
utilisation courante
Inconvénients :
- extraction enzymatique souvent fastidieuse et nécessitant quelque fois
la destruction totale de l'individu (lorsque petits organismes);
- patrons de bandes parfois complexes (estérases par ex.) ;
- existence d'allèles nuls (voir aussi les microsatellites);
- neutralité non assurée ;
- et surtout un polymorphisme quelquefois très très faible (ex. : espèces
autofécondantes) cf distribution à l’équilibre des fréquences alléliques
(S. Wright) lorsque faible taux de mutation
- IAM : ne peut pas simplement accéder à l’info phylogénétique;
- pas d'ordonnancement possible des allèles (au contraire des
microsatellites
Un exemple frappant de déviation de la neutralité
pour un marqueur enzymatique classiquement
utilisé en génétique des populations…
Exemple de pressions sélectives agissant sur l’expression
enzymatique : l’adaptation thermale chez Alvinella pompejana
Alvinella : 1er colonisateur des diffuseurs + rencontré sur tous les
types de fumeurs (noirs + blancs)
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
La phosphoglucomutase PGM-1 : enzyme clé dans le
métabolisme énergétique
- 2 allèles équifréquent Pgm-1 (100) et Pgm-1 (90)
- 2 allèles rares (78) et (112)
18 populations furent échantillonnées : toutes sont à l’équilibre de HW,
pas d’excès ou de déficit en hétérozygotes (pas de sélection par
« overdominance »), FST moyen faible mais significatif (P = 0.031), pas
d’isolement par la distance…
Analyse hiérarchique fondée sur le type d’habitat : différenciation
significative
Sélection diversifiante au locus Pgm-1 ?
L’allele Pgm-1 (90) semblerait plus thermostable
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
90
100
0 mn
60 mn 90 mn 0 mn
100 µg
60 mn
90 mn
200 µg
Initial velocity (mol/L/s/ug of proteins)
4,00E-09
90/90
3,50E-09
100/100
3,00E-09
2,50E-09
2,00E-09
1,50E-09
1,00E-09
5,00E-10
0,00E+00
0
20
40
60
Temperature (°C)
80
Allele Pgm-1 (90) : mieux adapté aux fortes températures, i.e. dans
les diffuseurs
Allele Pgm-1 (100) plus fréquent dans les fumeurs noirs et blancs
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M.,
Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D.
2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded
populations of the thermotolerant vent
polychaete Alvinella pompejana.
Proceedings of the Royal Society of
London B 271, 2351-2359.
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le
Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the
thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana.
Proceedings of the Royal Society of London B 271,
2351-2359.
Accès direct à l’information du génome
Allozymes = protéines exprimées = phénotype
D’autres marqueurs donnent directement accès à l’information
génétique : c’est plus proche de ce qu’on souhaite…
Le « roi » des marqueurs : la séquence d’ADN. Contient toute
l’information.
Mais coûteux, fastidieux et pas toujours nécessaire
Le développement des marqueurs moléculaires est une longue
histoire d’inventivité pour obtenir le maximum d’information avec
le minimum d’effort.
Microsatellites
RAPD
Randomly Amplified Polymorphic DNAs
ADN polymorphes amplifiés aléatoirement
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Polymorphisme de longueur d’un fragment de restriction
AFLP
Amplified Fragment Lenght Polymorphism
Polymorphisme de longueur de fragments amplifiés
Mais d’abord… pour accéder à l’information génétique, il
faut une méthode d’amplification du signal : la Réaction en
Chaine de la Polymérase (RCP, PCR)
La "Polymerase Chain Reaction" (PCR)
Description d'un cycle :
1. Denaturation (T=95°C)
2. Fixation des amorces (40 < T < 60°C)
3. Elongation grâce à la Taq polymérase (T=72°C)
Conditions techniques de la PCR :
♦Deux éléments fondamentaux : spécificité des
amorces (taille, composition en G, A, T, C…)
et nature de la polymérase.
Plus…
♦Température d'annealing amorce/matrice (dépend de
la température de fusion ou Tm = T°C à laquelle 50%
de l'ADN est double brin).
♦Temps d'extension (dépend de la longueur de la
séquence à amplifier).
♦Concentration en MgCl2 (Mg++ est indispensable à
l'activité de laTaq polymérase) ; concentration
habituelle de 1,5mM.
Applications directes de la PCR :
Le produit d'amplification peut être directement utilisé pour :
- mettre en évidence la présence ou l'absence d'un site de restriction (analyse du polymorphisme de restriction ou RFLP) ;
- caractériser des mutations connues (méthodes utilisant des sondes spécifiques…) ;
- caractériser des mutations inconnues (RAPD : amplification de séquences au hasard à partir d'amorces synthétiques ;
AFLP : amplification de fragments de restriction au hasard à partir d'amorces synthétiques).
Applications indirectes de la PCR :
Le produit d'amplification peut également servir de base à l'application d'une seconde technique :
- le séquençage, méthode qui permet de connaître la séquence complète du produit amplifié donc de déceler toutes les
variations nucléotidiques ;
- la mise en évidence de mutations sans les identifier par (i) électrophorèse sur gel en gradient dénaturant (DGGE :
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), (ii) analyse du polymorphisme de conformation des simples brins (SSCP :
Single Strand Conformation Polymorphism).
Domaines d'application
Tests de diagnostic en génétique médicale, criminologie, contrôle de filiation, élaboration de cartes génétiques,
contrôle sanitaire, industrie agro-alimentaire…et biologie évolutive (génétique des populations, phylogénie, analyse de
parternité…)
Limites
Le coût élevé de la Taq polymérase, les inévitables contaminations… !!!
Les marqueurs microsatellites
Les microsatellites sont de courts segments d'ADN composés de
séquences répétées en tandem d'un motif de 2 à 6 paires de bases
(suivant les définitions) que l'on peut amplifier par PCR
AGTGTCAGTAGCTAG…….CACACACACACACACA……...CGTGATACATGCA
Séquence flanquante
8 répétitions
Séquence flanquante
Les amorces de PCR (régions soulignées) sont choisies dans les
séquences (uniques) flanquant la zone répétée.
Les séquences répétées présentes des structures variées :
- Parfaites (pures)
CAGCAGCAGCAG
- Imparfaites (impures)
CAGCAGTCAGCAGGGCAG
- Juxtaposées
CAGCAGCAGTCTCTCTCTC
Importance de ces structures dans le taux de mutation et le mode
d'évolution de ces séquences répétées
Problème de l'homoplasie de taille : peut être détectée en utilisant des
structures imparfaites (voir Estoup et al. 1995, Viard et al. 1998)
Le polymorphisme détecté est un polymorphisme de longueur :
Un allèle donné correspondra le plus souvent à un nombre de répétition
(en théorie) déduit de la taille d'amplification (en pratique)
Nombre
de répétitions
Longueur
du fragment
14
112
12
106
11
103
9
97
6
88
3 pb
Sur l'exemple théorique ci-dessus, les séquences flanquantes
(comprenant l'amorce de PCR) font 70 pb
Il s'agit donc d'un polymorphisme aisément identifiable, une fois que les
locus microsatellites ont été identifiés et les amorces définies…
(acquisition d'une banque de données microsat., GenBank ou clonage)
Exemple d'un locus
microsatellite révélé sur gel de
polyacrylamide
Exemple de 3 locus
microsatellites amplifiés en
multiplex et visualisé par
électrophorèse capillaire
Marquage d'une des deux amorces au moyen de fluorochromes
(nucléotides marqués à la dioxygénine)
En s'arrangeant pour combiner différentes couleurs de
fluorochromes et en jouant sur la taille des allèles, plusieurs locus
peuvent être révélés simultanément en une seule migration
Mécanismes moléculaires de mutation : 2 hypothèses
(1) Glissement de la polymérase (slippage)
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
1
2
4
5
6
7
8
9
10
Initiation
5
6
7
8
9
10
4
4
Dissociation
4
5
6
7
8
9
10
3
1
2
1
2
4
3
4
5
6
7
8
9
10
Re-hybridation :
Mauvais appariement
3
3
1
2
1
2
4
3
5
4
6
5
7
6
8
7
9
8
10
9
11
10
Le nouveau brin
possède une longueur
différente du brin
initial
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
4
5
6
7
8
9
10
3
Accroissement en longueur
Diminution du nombre
de motifs répétés
Il s'agit du modèle de mutation le plus couramment admis
(2) Crossing-over inégaux (plutôt pour les minisatellites)
Mutations impliquant des changements de plus grande
amplitude dans le nombre de motifs répétés
Avantages :
Taux de mutation très élevé (de l'ordre de 10-2 à 10-5), il
n'est pas rare qu'un locus possède plus de 20 allèles (71
chez l’omble de fontaine !)
0.2
0.18
0.16
Fréquence
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
Distribution des tailles
alléliques pour le locus Ha11
chez l'escargot des jardins
0
207 209 211 213 221 223 225 227 229 231 233 235 237 239 241 243 245 247 249 305 307 309
Allèle (pb)
Relative abondance dans la plupart des génomes (de l'ordre de
100000 locus de motif (CA)n dans le génome humain par ex.),
Quelques exceptions, ex. : les papillons
Marqueurs neutres dans la plupart des cas (localisation dans des
régions non codantes)
Exceptions : (1) maladies héréditaires liées à l'expansion anarchique
de motifs trinucléotidiques de type CAGn
(2) Quelques rares études (Li et al. 2000) montrant
certaines corrélations entre variabilité des microsatellites et facteurs
écologiques (édaphiques)
Conservation de locus microsatellites d'une espèce à l'autre :
Utilisation possible en phylogénie (sous certaines réserves), notion
d'"ascertainment bias" (Ellegren et al. 1995) et d'évolution
directionnelle (mutations biaisées, Rubinstztein et al. 1995)
INCONVENIENTS :
Certains génomes sont pauvres en certains motifs
microsatellites, ce qui remet en cause leur universalité
(cf. papillons, éléphants)
Études inter-spécifiques : phylogénies douteuses car mode
d'évolution trop rapide : homoplasie brouille l’information
phylogénétique, et contraintes évolutives dans la taille allélique
des locus microsatellites (les mutations joueraient ici un rôle
homogénéisateur, cf. Nauta & Weissing 1996)
Présence d'allèles nuls (cf. aussi enzymes) :
Un allèle nul ne peut être visualisé sur un gel d'électrophorèse en raison
d'une insuffisance ou d'une absence totale d'amplification par PCR :
ceci résulte d'une mutation ponctuelle ou/et d'une insertion/délétion
dans les régions flanquantes complémentaires de l'une des amorces
nucléotidiques. Ceci pose des problèmes quant à l'estimation des
fréquences alléliques, les homozygotes seuls étant visibles...
Réduction drastique du niveau d'hétérozygotie,
apparente incompatibilité des génotypes au
sein d'une famille (hérédité non mendélienne)
du simple fait d'un mauvais appariement des
amorces de PCR
Exemple: structure de la diversité génétique
Région 2
Temps de divergence
Barrière à la dispersion
Région 1
Géographie
Dérive indépendante de populations isolées : divergence des fréquences
alléliques (et son cas extrême = fixation d’allèles différents)
HS
FST = 1 −
HT
Fondé sur l’identité des allèles
Analyse de données microsatellites :
Modèles de mutation de type SMM versus IAM
SMM : "Stepwise mutation model", suppose qu'a chaque mutation est
associée une diminution ou une augmentation de charge nette d'une
unité (cf. allozymes), ceci déplaçant les allèles d'une classe de mobilité
à une autre (Kimura & Ohta, 1975). Ce modèle de mutation perdit
néanmoins de l'intérêt car des électromorphes adjacent ne diffèrent pas
toujours d'une seule charge nette.
i-1
i-1
i-1
i-1
SMM
i+1
i+1
i+1
i+1
i
IAM
i+n
i+n
i
0.30
0.25
Découverte des microsatellites :
regain d'intérêt pour ce modèle, le
SMM suppose ainsi qu'un allèle
muterait à travers le gain ou la
perte d'un motif de base
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
Intérêt : un état allélique conserve
la « mémoire » de son état
antérieur
100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120
Allèles (pb)
Milieu des années 90 : développement foudroyant de tous un panel
de nouvelles statistiques incorporant l'information contenue dans
les différences de tailles alléliques, statistiques fondées sur un SMM
strict (Slatkin 1995, Goldstein et al. 1995) ou des modèles dérivés
acceptant de rares mutations de plus grandes amplitudes (ex. TPM,
Di Rienzo et al. 1994)
Indices de différentiation dérivés des F-Statistiques
RST
S − Sw
=
S
RST = fraction de la variance totale des
tailles alléliques entre populations
SW et S barre étant
proportionnels à la
variance intrapopulationnelle et à la
variance totale
La distance Δμ2 (Goldstein et al. 1995), se définissant en terme de carré de
la moyenne des différences dans les tailles alléliques entre deux populations
Δμ
2
= (μ a − μ B ) 2
μA et μB sont les moyennes
des tailles alléliques
observées dans les
populations A et B
Idée sous-jacente : les différences dans le nombre de répétition
donnent des informations sur le temps écoulé depuis un
hypothétique allèle ancestral commun. Les différences de
longueurs en allèles contiennent des informations phylogénétiques
qui ne sont pas pris en compte par les méthodes fondées sur les
identités alléliques (fréquences) et fondés sur le IAM.
On ne raisonnera ici non plus en terme d'identité allélique (caractère
qualitatif), mais en terme de taille allélique (caractère quantitatif)
Région 2
Temps de divergence
Barrière à la dispersion
Région 1
Géographie
27
10
1
25
9
6
8
3
12
18
28
26
16
17
11
7
4
14
5
13
19
22
30
Arbre de populations fondés,
non plus sur les fréquences
alléliques, mais sur les
différences dans les longueurs
de tailles alléliques entre
populations
2
20
21
24
32
23
0.1
29
15
31
MAIS
La dynamique d'évolution des microsatellites apparaît maintenant
beaucoup plus complexe qu'un simple SMM :
- Mutations de plus grandes amplitude impliquant de larges
insertions/délétions entraînant une très forte variance des distances
fondées sur le SMM ;
- Différences de mutabilité des allèles créant des lignées alléliques
divergeant indépendamment les unes des autres ;
- Les mutations ponctuelles au sein de la séquence répétée stabiliseraient
celle-ci (interruption des répétitions) ;
- Différences de mutabilité selon le motif répété, sa composition en base
ainsi que la longueur de la séquence (les allèles les plus grands auraient
un degré de mutabilité + élevé) ;
- Microsatellites juxtaposés ou impurs : déviations nettes envers un IAM ;
- Contraintes de tailles : plafonnement des distances génétiques au cours
du temps (non-linéarité de ces distances) et pb d'homoplasie.
Cycle de vie d'un microsatellite :
(1) La naissance d’un microsatellite dans une région où des variants de séquences
répétitives simples d’ADN sont présents en nombre important (régions de "cryptic
simplicity").
(2) L’augmentation progressive d’un même type de motif qui, au-delà d’un certain
nombre de répétitions, verra son taux de mutation augmenter et s’accroîtra en
longueur, le taux d’erreur de la polymérase étant alors accru.
(3) L’importance des pressions évolutives que sont la mutation, la dérive génétique, la
sélection ou la migration peut alors être estimée par le nombre d’allèles, le spectre des
fréquences alléliques illustrant alors le portrait d’un locus microsatellite "mature".
(4) Cet accroissement en longueur du microsatellite diminuera à partir d’une valeur
maximale de répétitions, des processus de sélection encore mal définis étant, semble-til, impliqués dans cette contrainte de taille.
Taux de mutation
(5) Des délétions et des mutations ponctuelles interrompant les répétitions entraîneront
finalement la dégénérescence du microsatellite qui reviendra à son stade initial où
différents motifs seront mélangés, interrompus et présents en surnombre. La croissance
d’un nouveau microsatellite dérivé interviendra à la suite de mutations favorables ayant
supprimé ces interruptions.
Mutations "contractives"
D'après Xu et al. (2000)
Distribution
d'équilibre
résultant d'une
balance entre
mutations
ponctuelles et
évènements
de slippage
Mutations "expansives"
Longueur Critique
Longueur du microsatellite
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP)
"Restriction fragments length polymorphism"
Principales modifications d'une séquence
nucléotidique à l'origne d'un polymorphisme de
restriction. (A) fragments d'ADN (a-h) produits
par digestion enzymatique* (B) et séparés selon
leur taille sur gel d'électrophorèse.
* Les enzymes utilisées sont produites par des
bactéries, et chacune d'elle est capable de
reconnaître et de couper une séquence spécifique
de 4 à 6 nucléotides.
Principe :
Le principe de base de cette méthode consiste :
(1) extraction de l'ADN;
(2) digestion de l'ADN au moyen d'enzymes de restriction (endonucléases);
(3) séparation (selon la taille) et visualisation des fragments ainsi obtenus par électrophorèse;
(4) transfert et hybridation des fragments séparés avec des sondes marquées (southern blot).
On aboutit ainsi à des profils de restriction caractéristiques, variant selon la position et/ou le
nombre des bandes marquées. Cette technique permet de dresser la carte des sites de
restriction et de localiser les mutations (cf figure) à l'origine du polymorphisme de restriction.
Individu 2
Individu 1
Fragment inséré
Site perdu
Région
reconnue
par la sonde
Site de
coupure
d’enzyme de
restriction
Pas de
polymorphisme
1
-
+
2
Polymorphisme
de site de
restriction
2
1
Polymorphisme
d’insertiondélétion
2
1
Individu 2
Individu 1
1
Enzyme avec un site
interne polymorphe et
des sites externes
polymorphes
2
-
Région
reconnue
par la sonde
Site de
coupure
d’enzyme de
restriction
+
Individu 2
Individu 1
1
Enzyme avec un site
interne monomorphe et
un site externe
polymorphe
+
2
Le polymorphisme RFLP est donc lu comme un polymorphisme de
longueur de fragments d'ADN ou de présence de sites.
La technique de PCR-RFLP présentent des avantages par rapport à la
technique de RFLP simple : possibilité de détecter hétérozygotes et
homozygotes (codominance) et d'étudier des organisme pour lesquels
la quantité de matériel biologique est faible, + manips moins
contraignantes.
Limites
Des fragments de tailles identiques peuvent être générés par des sites
de restriction différents. Patrons de bandes parfois très complexes à
analyser. La variation de ces fragments de restriction est souvent
insuffisante au niveau populationnel (deux états uniquement par site
de restriction). La grande quantité d'ADN requise, le coût et la
difficulté d'emploi de sondes marquées, limitent l'utilisation de cette
technique en biologie des populations. L'amplification (PCR)
préalable du fragment à analyser permet toutefois de s'affranchir de
l'étape d'hybridation.
PRINCIPE
La PCR-RFLP
M
+
Taille des
fragments
_
Appliquée avec huit couples
(région ; enzyme)
: site de restriction
: enzyme
: indel
APPLICATIONS
Exemple de tableau
des haplotypes
Polymorphisme chloroplastique et structure de la diversité
génétique chez une espèce tolérante au zinc:
Arabidopsis halleri (Brassicaceae)
Le réseau des haplotypes
Distribution spatiale des haplotypes
Les RAPDs ("Randomly Amplified Polymorphic DNAs)
Principe : réaction PCR en utilisant une amorce de séquence arbitraire. Si
l'amorce n'est pas trop longue (9-10 pb), et/ou si l'hybridation se fait en
conditions peu stringeantes, l'amorce va s'hybrider chaque fois que se
trouvera dans l'ADN une séquence qui lui est complémentaire. Si 2 sites
d'hybridation sont proches l'un de l'autre et en opposition (i.e. configuration
permettant la PCR), l'amplification aura lieu. Si un de ces 2 sites est absent
dans un autre individus, il n'y aura pas d'amplification et un polymorphisme
de présence/absence de bandes sera observé.
Amplifié
(1)
(2)
Non amplifié
(1) (2)
= amorce nucléotidique arbitraire
Les bandes obtenues sont couramment séparées en gel d'agarose
puis visualisées au BET
Révélation de plusieurs locus à la fois + marqueur dominant
= sérieuses limites
Mais…technique rapide, simple et relativement peu onéreuse
Après un engouement net successif à leur découverte (début
années 90), ces marqueurs sont actuellement en perte de vitesse
-
+
AFLP
Avantages :
nombre élevé de bande
Stabilité des profils
qualité des profils
Inconvénients :
Gourmant en ADN
Relative difficulté technique
année
Utilisations :
études de génétique des pop
cartographie
diversité génétique (clone ou pas, mode de reproduction plutôt clonale…)
recherche de marqueurs liés à un gène (résistance à un herbicide…)
Table 1 Usefulness of AFLP for some typical research questions in molecular ecology compared with some
common alternative methods (5 excellent, 1 poor). The scoring is an attempt to judge both the quality and
quantity of data that can be generated within a standard research program on a wild nonmodel organism for
which no genetic markers are yet available
Research question
AFLP
Allozymes
Microsatellites
Multigene sequencing
SNPs
Parentage analyses
3
2
5
1
3
Genome-wide genetic diversity
4
2
4
3
3
Population genetic structure
5
3
4
3
3
Identification of hybrids and
backcrosses
5
1
4
3
3
QTLs
Phylogenetic reconstructions
(shallow)
4
4
1
1
4
3
2
3
3
3
Phylogenetic reconstructions (deep)
1
1
1
5
1
LES SEQUENCES D'ADN :
Détermination de la séquence nucléotidique d'un fragment d'ADN
dont la taille ne dépasse généralement pas quelques kilobases.
Séquençage après amplification par PCR ou clonage, les séquences
sont ensuite comparées par alignement : calcul de divergence
nucléotidique et reconstruction de phylogénie au niveau supraspécifique, mais aussi pour retracer des relations généalogiques en
génétique des populations (surtout avec l'ADNmt dans le dernier cas).
Avantages :
- Accès direct à la totalité de l'information génétique, ce qui en fait
le marqueur actuel le plus précis quant à la reconnaissance de
l'identité par descendance d'allèles (même allèle ancêtre)
- Accès à un grand nombre de sites informatifs
Adéquation entre niveau de variabilité
désiré et temps évolutif séparant les
taxons à comparer : pour des espèces
séparées par des centaines de millions
d'années, on choisira plutôt des
séquences à évolution lente (séquences
conservées)
Variante : la technique SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
Différentiation d'allèles ne différant que par une seule paire de bases : les
formes simples brin de l'ADN prennent des conformations secondaires
dépendant de la composition en bases de la séquence, et migreront donc de
manière différentielle sur un support approprié
Avantage : pallie la lourdeur d'un séquençage systématique de tous les
individus dans une étude de structure de population.
Cependant : dépendance forte des conditions d'expérimentations, chaque
migration nécessitant la présence d'un témoin connu.
Séquençage traditionnel :
Méthode classique = séquençage ‘SANGER’
• Développé dans les années 1970 par Walter Gilbert, aux États-Unis,
par Frederick Sanger, en Grande-Bretagne (prix Nobel en 1980)
• Fondée sur l’utilisation de didésoxyribonucléotide (ddNTP) lors
d’une réaction de séquence
• Du fait de la méthode utilisée, la longueur de séquence maximale est
de l’ordre de 1000 nucléotides
Migration verticale sur gel : séquenceur de type LICOR
tail
amorce FM13
Fragment à
séquencer
-
Sens de lecture
Sens de migration
+
amorce
RM13
La réaction va se dérouler
de façon cyclique et va
comporter les mêmes
phases que la PCR. A la
différence près que les
désoxynucléotides sont
remplacés, en partie, par
des didésoxynucléotides
(ddNTP ou "nucléotides
stops"). L'incorporation,
au hasard, de ces ddNTP
va provoquer l'arrêt de
l'élongation du brin
néoformé. D'un point de
vue technique, il s'agit de
réaliser 4 mélanges
réactionnels, chacun avec
l'un de ces 4 ddNTP.
Ainsi, par exemple, en
présence du ddATP, on va
obtenir des fragments de
différentes tailles
correspondants au
différentes positions des
"A" dans la séquence.
1er fragment :
2ème
3ème
4ème
etc…
C
CA
CAT
CATT
Migration à l’intérieur de capillaires : séquenceur de type ABI
Lecture des électrophénogrammes…
ANALYSE DE FRAGMENTS
Détection de mutation : SNaPshot™
Le screening de SNP peut être réalisé en
utilisant la technique « single nucleotide
extension » ou miniséquençage.
X25 Cycles
La couleur du pic
indique la base au
point de polymorphisme
Séquençage de nouvelle génération : NGS
• Séquençage haut-débit = toute technologie capable de générer un ‘grand nombre’ de
séquence en un temps réduit. Cela englobe aussi bien les plateformes de séquençage
(Sanger) à capillaires les plus performantes que les nouvelles technologies de
séquençage
• Nouvelles technologies de séquençage = Next Generation Sequencing (NGS)
• Ces nouvelles plateformes de séquençage utilisent des techniques
différentes du séquençage traditionnel (Sanger) et permettent de générer des
quantités de donnés impossibles à égaler au moyen des techniques traditionnelles.
Hudson M.E. (2008) Sequencing breakthroughs for genomic ecology and evolutionary biology.
Molecular Ecology Resources 8, 3–17.
Principe général du pyroséquençage :
• Fondé sur un principe de séquençage par synthèse, par
opposition au séquençage par ‘termination’ (méthode Sanger)
• Cette méthode consiste a séquencer un ADN monobrin par
synthèse du brin complémentaire, base par base, en détectant à
chaque étape le nucléotide qui a été ajouté
Les nucléotides ne sont pas ajoutés tous
ensembles comme dans une réaction de
séquençage normale mais l’un après
l’autre ;
Si le nucléotide ajouté dans le milieu
réactionnel correspond à celui attendu par
la polymérase, il est incorporé dans le brin
en cours de synthèse (d’élongation) et
libère un Pyrophosphate ;
Une ATPsulfurylase vient alors transformer
ce Pyrophosphate (PPi) en ATP qui est
alors utilisé, couplé à une Luciférine, par
une Luciférase. On a alors production
d’Oxyluciférine et d’un signal lumineux
Une Apyrase dégrade les nucléotides en
surplus.
Principe général du pyroséquençage :
Principe général du pyroséquençage :
• Préparation de la librairie = collection de fragments
d’ADN à séquencer ;
• Amplification de l’ADN à séquencer: PCR en
émulsion ;
• Un brin d’ADN par bille ;
• Une bille par goutte d’émulsion ;
• Séquençage dans une plaque à micropuits (400 000
par plaque) ;
• Une bille par puit
Le TILLING en écologie moléculaire
(Targeting Induced Local Lesions in Genomes)
Criblage du polymorphisme
Le TILLING en écologie moléculaire
Targeting Induced Local Lesions in Genomes),
1.
PCR sur locus d’intérêt. (amorces marquées)
2.
Mélange produit PCR testé avec allèle de référence connu
3.
Dénaturation-renaturation par chauffage
Æ formation d’hétéroduplex
4.
Digestion avec enzyme spécifique de l’ADN simple-brin (Cel.1)
5.
Dénaturation et migration sur gel dénaturant
6.
Visualisation et estimation de la taille de la bande
Æ position des « mismatchs »
Analyse de l’expression des gènes
Puce à ADN = DNA chip = DNA microarray
Quels gènes sont différentiellement
exprimés chez des individus vivant dans
des environnements différents ? Ayant des
traits d’histoire de vie différents ?
La séquence d’un gène, d’une
portion d’un gène, d’un ADNc…
Un grand
nombre de
gènes d’une
espèce
(parfois, tous).
Connus ou
anonymes.
Deux utilisations:
1.
Hybridation peu stringente
avec ADNc marqué à la
fluorescence
--> intensité fluorescente =
quantité ADNc = quantité
ARNm
2. Hybridation très stringente
avec ADNg marqué à la
fluorescence
--> intensité fluorescente =
affinité homologues =
similarité de séquence :
repérage SNP