3R Maintient et remodelage de l`information génétique. Cours du

3R
Maintient et remodelage de l’information génétique.
Cours du Lundi 15 Septembre 2008 : PN1
Comment les organismes vivants perpétuent leurs potentiels génétiques ? Pour affronter les attaques
sur leurs génomes ? Pour générer de la diversité ?
Importance de check points sur les mécanismes 3R de l’ADN.
Documents accessibles sur http://www.snv.jussieu.fr/cse65
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Qu’est ce qu’une ADN polymérase ?
Enzyme qui rajoute des trinucléotides en utilisant une matrice (exception pour la terminale polymérase
qui n’en utilise pas). Copie dans le sens 5’-3’. Pour initier le phénomène, il faut une amorce en bout de
chaine d’ADN.
Si la polymérase rajoute de nombreux trinucléotides, on l’appelle une polymérase processive, dans le
cas contraire, il s’agit d’une polymérase peu processive. Une polymérase qui respectera correctement
les complémentarités A-T et C-G sera une polymérase fidèle. Mais des fois, la polymérase peut mettre
un C en face d’un A etc. Il existe des tests de fidélité. Mais beaucoup de ces enzymes sont également
capable de défaire ce qu’elles ont fait : il s’agit d’une relecture avec une activité exonucléasique de 3’-5’.
Lorsque les polymérases arrivent face a des dimères de thymines (induits sous rayonnement UV), elles
s’arrêtent, incapables de reconnaitre ces dimères. Mais certaines peuvent baille-passer le problème : ce
sont des polymérases translésionelles (elles sont peu fidèles).
Une ADN polymérase est un complexe enzymatique intervenant dans la réplication de l’ADN au cours du cycle
cellulaire, mais aussi dans des processus de réparation et de recombinaison de l'ADN. Il existe différentes familles
de polymérases qui diffèrent selon leurs séquences en acide aminé et leurs propriétés catalytiques.
Toutes les ADN polymérases synthétisent l’ADN dans le sens 5'-3' et aucune n’est capable de commencer une
nouvelle chaîne sans amorces. Elles ne peuvent que rajouter des nucléotides à partir d’une amorce préexistante à
l’extrémité 3’-OH. Pour cette raison l’ADN polymérase a besoin d’une amorce (ou primer), sur laquelle elle pourra
ajouter de nouveaux oligonucléotides. L’amorce peut être formée d’ADN ou d’ARN et est synthétisée par une autre
enzyme, appelée primase. Une enzyme, hélicase, est ensuite requise pour délier le double brin de l’ADN et ainsi
faciliter l’accès des ADN polymérases sur les brins d’ADN, devenu simple brin, et permettre ainsi la réplication.
Les ADN polymérases possèdent une structure très conservée. Elles sont considérées comme étant des
holoenzymes puisqu’elles ont besoin d’un ion magnésium comme cofacteur pour fonctionner correctement. En
absence d’ions magnésium, elles sont appelées apoenzymes.
Les ADN polymérase ont la capacité de corriger les erreurs dans la formation de brin néoformé. Lorsqu'une paire
de base incorrecte est reconnue, l’ADN polymérase va revenir en arrière grâce à son activité 3’-5’ exonucléase, va
réinsérer la base correcte, et reprendre la réplication.
Expériences de mutagénèse chez E. coli.
Le mutant Pol I a une activité polymérase amoindri mais la bactérie vit très bien => paradoxe.
On a ainsi découvert les différents types de polymérases chez la bactérie.
Cinq ADN polymérases ont été identifiées chez les bactéries:
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Pol I : impliquée dans la réparation de l’ADN. Elle possède les deux activités polymérase 5'→3' et
exonucléase 3'→5' (fragment de Klenow), et participe à la synthèse des fragments d’Okazaki. Elle
intervient aussi en fin de réplication pour éliminer les amorces d'ARN (activité exonucléase 5'-3').
Pol II : impliquée dans la réplication de l'ADN endommagée et possède activité 5'→3' et une activité a
3'→5' exonucléase.
Pol III : c’est la principale polymérase bactérienne qui intervient dans l'élongation de la chaîne d'ADN lors
de la réplication au niveau du brin avancé et de la synthèse des fragments d’Okazaki. Elle est constituée
de dix sous-unités. On définit une structure minimale (core enzyme αεθ) comprenant une sous-unité α
(activité polymérase), une sous-unité ε (exonucléase 3'→ 5') et une sous-unité θ de fonction inconnue.
Deux cores (αεθ) et un complexe γ (facteur de chargement) sont maintenus ensemble par l'intermédiaire
d'un connecteur, la protéine t.
Pol IV : ADN polymérase de la famille Y.
Pol V : ADN polymérase de la famille Y.
Pour chacun des brins, il existe une synthèse continue pour l’un, et une discontinue pour l’autre (avec
utilisation des fragments d’Okazaki).
Chez un mutant Pol.1-, comment peut-on obtenir des mutants spécifiques de la réplication ?
On va utiliser des mutants conditionnels (thermosensibles…).
On a ainsi observé 2 types de mutants :
-les mutants Quick Stop (QS) : arrêt immédiat de la réplication de l’ADN avec une modification
de la température.
-les mutants Slow Stop (SS) : arrêt lent de la réplication de l’ADN avec une modification de la
température.
Chez les QS : identification d’un certain nombre de gènes intervenant dans la réplication tels que Pol III
(avec plusieurs sous unités), Pol II… ; et pour les SS, on a identifié des gènes codant pour des protéines
impliquées dans le cycle de réplication.
La polymérase I (Pol I).
Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 5’-3’ (la seule qui fait ca) et donc
naturellement aussi exonucléasique dans le sens 3’-5’. Peu processive. % d’erreur très faible.
La polymérase III (Pol III).
Activité polymérasique dans le sens 5’-3’, exonucléasique dans le sens 3’-5’. Processivité importante,
très dépendante de la sous unité ξ. % d’erreur très faible.
La vitesse de réplication chez E. coli est d’environ 1000 nucléotides/seconde. Le génome d’E. coli
comporte 4Mbases.
Les cœurs de la polymérase sont essentiels au phénomène de polymérisation : sous unités α, ξ, θ.
Si ξ est inactive, le % d’erreur est multiplié par 1000, mais la vitesse reste inchangée.
La primase est importante pour les fragments d’Okazaki. Tandis que l’hélicase sépare les deux brins
d’ADN. La polymérase agit sous forme d’homodimère, chaque dimère étant associée à l’un des brins. La
sous unité β, structure en anneau, homodimère, fait gagner en processivité. Le trou laissé dans l’anneau
du dimère permet le passage du brin d’ADN.
Fragment d’Okasaki est un terme utilisé en biologie, dans l'étude des chromosomes. Il fut découvert en 1968 par
Reiji et Tsuneko Okazaki ainsi que leurs collègues en étudiant la réplication de la bactérie Escherichia Coli.
Le brin « retardé » est synthétisé par petits fragments (d’environ 10 paires de bases) : les fragments d’Okasaki.
L’ADN polymérase pour effectuer la synthèse d’ADN nécessite une amorce (petit fragment d’ADN ou d’ARN).
Cette amorce ARN est amenée par l'enzyme ARN Primase qui est une enzyme ARN polymérase ADN dépendante.
Description: Depiction of DNA replication with replication fork, strands and okazaki-fragments. a: template strands, b: leading
strand, c: lagging strand, d: replication fork, e: primer, f: Okazaki fragment
Entre les deux, il existe un gros complexe important : le clamp-loader qui pose l’anneau β au bon endroit
(clamp-loader = complexe θ-γ). Codage : le même gène donne deux produits protéiques différents : τ et
τ1. C’est un régulateur de la progression de la fourche. Ce complexe τ est important pour la fourche de
réplication en agissant avec l’hélicase, qui est poussée en amont de la fourche de réplication.
Le clamp-loader va déplacer une des deux sous unités β qui va, sur le brin simple laissé (car une des
deux polymérases ne peut pas synthétiser de façon continue), synthétiser le fragment d’Okazaki, puis
qui sautera de quelques milliers de bases pour de nouveau synthétiser un fragment d’Okazaki etc.
La primase est une ARN polymérase qui fabrique de petites amorces de ribonucléotides. La Pol I prend le
relais de la Pol III pour combler le trou entre les fragments d’Okazaki. Pol I prends la suite de la
polymérisation de Pol III, puis avec son activité exonucléasique détruit l’ARN pour faire de l’ADN. Il faut
ensuite rétablir la continuité des brins avec la ligase.
La primase est une enzyme permettant la synthèse de l'amorce d'ARN nécessaire à la synthèse du brin d'ADN au
cours de la réplication de l'ADN. Les ADN polymérases permettant la réplication de l'ADN ont besoin en effet
d'une petite région double-brin pour commencer la synthèse d'ADN, et cela dans les trois domaines du vivant
(Archaea, eucaryotes, Bacteria).
La primase des bactéries est DnaG. Chez les eucaryotes, elle est portée par le complexe ADN Polymérase αprimase. Chez les Archaea, il existe un homologue à la primase eucaryote, mais sans équivalent à la sous-unité
polymérase α. Il est surprenant de noter que les primases d'Archaea peuvent également synthétiser de l'ADN in
vitro. Il existe également chez les Archaea un homologue à la protéine DnaG des bactéries.
Initiation de la réplication chez E. coli.
Il existe des séquences de 13 ou 9 paires de bases à l’origine de l’oriC (origine de réplication). Rentrée en
jeu d’une hélicase fabriquant une petite amorce. Phénomène de méthylation pour synthétiser les brins
et éviter une autre réplication successive (la méthylation prend environ 20-30min, déterminant ainsi le
temps de réplication de l’ADN et donc la division bactérienne).
Les séquences Ter recrutent des protéines tus. Lorsque l’hélicase arrive dans ces séquences Ter, la
protéine tus est absente, et cela permet la transcription. Fixation spécifique de tus. Ces protéines tus
permettent le passage de la Pol qui arrive dans un sens, mais pas dans l’autre (utile dans le cas ou la
fourche de réplication n’arrive pas à la même vitesse [car la réplication du chromosome bactérien est
bidirectionnelle, et la fin de la réplication est variable sur le chromosome, en fonction de la vitesse des
polymérases de chacun des deux cotés]) [La protéine tus agit comme une véritable diode moléculaire,
permettant le passage des Pol dans un sens, mais pas dans l’autre].
Chez les eucaryotes :
On retrouve des équivalents des mêmes structures (PCNA = équivalent des anneaux β) [homotrimère de
taille identique que l’anneau β qui lui est un dimère]
La polymérase est une ARN-ADN polymérase dépendante. Synthèse de quelques nucléotides et le reste
du complexe prends en charge de l’ADN. Les fragments d’Okazaki sont plus courts que chez les
bactéries. Il existe des centaines d’origine de réplication.
Pour diminuer le petit fragment d’ARN entre les fragments d’Okazaki, on a les RNAses I qui coupent le
petit bout de l’amorce et FEN1 qui dégrade le bout d’ADN par activité endonucléasique.