PCR nichée VNTR

Rapports de Laboratoires de référence de l’OIE
Activités de l’année 2011
Nom de la maladie (ou domaine) pour
laquelle vous avez été désigné comme
Laboratoire de référence de l’OIE :
Adresse du laboratoire :
UMR CMAEE (Contrôle des maladies Animales
Exotiques et Emergentes)
CIRAD, Domaine de Duclos, Prise d’Eau
97170 Petit Bourg,
GUADELOUPE, FRANCE
Tel. :
+33 (0)5 90 25 54 44
Fax :
+33 (0)5 90 94 03 96
e-mail :
site web :
Nom (titre et fonction) du responsable
du laboratoire:
Nom (titre et fonction) de l’expert de
l’OIE :
Nom (titre et fonction) de rédacteur de
ce rapport (si diffèrent de celui
mentionné ci-dessus):
Rapports annuels des Centres de référence de l’OIE, 2011
Cowdriose
[email protected]
http://antillesguyane.cirad.fr/recherche_en_partenariat/dispositifs_de_
recherche_en_partenariat/maladies_emergentes_sante_a
nimale/activites_de_recherche
Thierry Lefrançois
Dominique Martinez
Directeur de l’unité de recherche
CMAEE
Nathalie Vachiéry
1
Cowdriose (Heartwater)
Partie I : Résumé des activités générales liées à la maladie
1.
Test(s) employés ou disponibles pour cette maladie dans votre laboratoire
DIAGNOSTIC MOLECULAIRE :
* PCR nichée ciblant le gène pCS20 pour le diagnostic d’Ehrlichia ruminantium Les amorces utilisées contiennent
des nucléotides universels permettant d’augmenter l’éventail de souches détectées avec une sensibilité de 6 copies
de gènes par échantillon. (1) (2) Ce diagnostic est le plus fréquemment utilisé pour le diagnostic cowdriose sur
organes d’animaux morts (cerveau, poumon) et dans le sang d’animaux malades. Ce test moléculaire est sous
accréditation COFRAC ISO17025 depuis juin 2011.
* PCR nichées permettant l’amplification de 5 gènes de ménage (LipA, LipB, Sec Y, SodB, SucA). L’analyse des
séquences de ces gènes permet une caractérisation des souches par une approche MLST (Multi-locus sequence
typing) (3). La sensibilité de ces PCR varie entre 3 et 30 copies par échantillon.
* PCR nichées ciblant des zones contenant des séquences en tandem répété en nombre variable (VNTR) et
permettant ainsi de discriminer les souches entre elles par l’obtention d’un profil allélique, la caractérisation se
faisant sur 7 locus (MLVA) (4). Un large panel de souches d’origine géographique différente a pu être amplifié
par cette méthode. Le développement de cette méthode a été effectué par le laboratoire de référence en
collaboration avec un laboratoire partenaire de l’INRA (UMR BIPAR).
* PCR simples ou nichées ciblant des gènes ayant des insertions/délétions différentes suivant les souches ou des
gènes uniques de souches. (5) permettant un diagnostic différentiel de souches (brevet déposé).
Pour l’ensemble de ces tests, plusieurs types d’échantillons peuvent être utilisés : ADN extrait de souches isolées
en culture in vitro, de sang d’animaux en réaction clinique, d’organes (cerveaux, poumons) et de tiques. Les
échantillons sont conservés à -20°C ou en éthanol à température ambiante.
DIAGNOSTIQUE SEROLOGIQUE :
*ELISA MAP1-B
Le laboratoire dispose aussi d’un test sérologique ELISA indirect spécifique d’E. ruminantium. Il permet la
détection d’anticorps anti-MAP1 (Major Antigenic Protein) chez le bovin, le caprin et l’ovin. L’antigène utilisé est
un antigène recombinant de MAP1-B de la souche Gardel. Ce test sérologique est sous accréditation COFRAC
ISO17025 depuis juin 2011.
Les tests à des fins de diagnostic de la maladie présentés ci-dessus sont inclus dans des plans de surveillance et de
prévention. Depuis juillet 2010, un système de surveillance passive de la cowdriose a été mis en place en
Guadeloupe auquel le laboratoire de référence participe activement. Il s’agit du réseau d’Epidémio-Surveillance
des PAthologies Nerveuses chez les ruminants de Guadeloupe: RESPANG. Ce réseau est basé sur la surveillance
de la cowdriose, due à E. ruminantium (ER) via des suspicions cliniques et des prélèvements sanguins ensuite
analysés par PCR nichée pCS20 au sein de notre laboratoire. Pour l’année 2011, 172 analyses PCR nichée pCS20
ont été réalisées dans le cadre de RESPANG. 289 et 73 analyses pCS20 sur tiques Amblyomma variegatum ont été
faites dans le cadre de la détermination de la prévalence d’E. ruminantium dans la zone Océan indien et au
Nigeria. Les tests sérologiques sont utilisés dans le cas d’importation d’animaux de Guadeloupe vers la Martinique
(31 analyses) ainsi que pour des mesures de prévalence de la maladie notamment à Madagascar (456 analyses).
Le tableau résume le nombre d’analyses effectuées en 2011
2
Test
Pour
Spécificité
Total
ELISA
Anticorps MAP-1
Sang bovin, caprin, ovin
487
PCR nichée pCS20
Gène pCS20
Tique Sang et organes d’ovin,
bovin et caprin
534
PCR nichée MLST
Gènes de ménage (LipA, LipB,
SecY, SodB, SucA)
Tique Sang et organes d’ovin,
bovin et caprin
210
PCR nichée VNTR
7 VNTRs
Tique Sang et organes d’ovin,
bovin et caprin
327
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
Cowdriose (Heartwater)
2.
Production, contrôle et distribution des réactifs diagnostiques
1/ Il a été produit de l’ADN de souches de référence Gardel, Sénégal comme contrôles positifs pour le diagnostic
moléculaire pCS20 et à des fins de recherche à partir de cultures infectées. De la même manière, 25 Souches
isolées en culture sont disponibles et peuvent être produites en fonction des besoins.
2/ Des témoins positifs, ADN d’E. ruminantium souche Gardel pour les PCR spécifiques ont été expédiés au
Centre de Recherche et de Veille de l’Océan indien (CRVOI) à la Réunion.
3/ 2 lots de protéine recombinante MAP1-B ont été produits en 2011 pour l’ELISA MAP1-B avec une pureté de
90% et une concentration de 245 et 277µg/ml (v=10ml par lot). L’un de ces lots est utilisé en routine pour l’essai
ELISA MAP1-B à une dilution suivant l’espèce de 1/600 ou 1/800 depuis octobre 2011. Un aliquot sera envoyée
au FOFIFA à Madagascar en 2012. Des cellules endothéliales bovines ont été envoyées aussi au FOFIFA de
manière à faire des isolements de souches d’E. ruminantium.
4/ Des témoins positifs, ADN d’E. ruminantium souche Gardel pour les PCR spécifiques ont été expédiés à
l’Université d’Owerri au Nigéria.
Partie II : Activités spécifiques découlant du mandat des
Laboratoires de référence
3.
Normalisation et harmonisation internationales des méthodes de diagnostic, ou de la production
et de l’évaluation de vaccins
a)
établir et animer un réseau avec les autres Laboratoires de référence de l’OIE désignés pour
le même agent pathogène ou la même maladie, et organiser régulièrement des essais inter
laboratoires pour assurer la comparabilité des résultats
–
b)
Organisation d’essais inter-laboratoires avec d’autres laboratoires que les Laboratoires de
référence de l’OIE pour les mêmes agents pathogènes ou maladie afin d’assurer
l’équivalence des résultats
Essai inter laboratoire et comparatifs concernant le diagnostic moléculaire pCS20 avec le CRVOI en
Décembre 2010 et Avril 2011 sur des échantillons de tiques de Mayotte, Réunion et Comores testés dans les
2 laboratoires, le laboratoire de référence et le laboratoire du CRVOI à la Réunion.
Essai inter laboratoire avec le FOFIFA de Madagascar en février 2011.
Les protocoles de diagnostic moléculaire de la cowdriose ainsi que les protocoles de caractérisation génétique
nouvellement développés ont été transmis au Département de Science Animale et Technologie du Nigeria et
un chercheur a été formé aux techniques de diagnostic moléculaire et de typage d’E. ruminantium pendant 3
mois au sein du laboratoire de référence.
4.
Préparation et fourniture des réactifs de référence internationaux pour les tests de diagnostic et
les vaccins
Les réactifs de référence internationaux non agréés sont fournis à la demande : antigène recombinant MAP1-B,
sera positifs et négatifs des 3 espèces (ovin, bovin et caprin) ainsi que les ADNs contrôles pour les tests
moléculaires. Les lignées cellulaires endothéliales bovines sont aussi à disposition pour faire des isolements de
souches. Des ADNs contrôles positifs et négatifs pour Ehrlichia ruminantium provenant de culture et de tiques ont
été fournis au FOFIFA (Madagascar) et au CRVOI (Réunion) ainsi qu’au Département de Science Animale et
Technologie du Nigeria pour la mise en œuvre du diagnostic moléculaire dans ces laboratoires.
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
3
Cowdriose (Heartwater)
5.
Recherche et développement de nouvelles méthodes de diagnostic et de contrôle des maladies
Le projet européen FEDER sur la gestion des risques en santé animale et végétale, 2007-2013, inclut les études de
génomique, transcriptomique et protéomique d’E. ruminantium de manière à identifier les mécanismes impliqués
dans le développement et l’atténuation des souches d’Ehrlichia. Au sein de ce projet est inclus la conception de
modèle de dynamique de population des tiques Amblyomma variegatum et des habitats favorables basée sur une
connaissance approfondie de la bio-écologie de cette tique, pour une prédiction de l’évolution possible des aires de
distribution et l’évaluation des méthodes de contrôle des vecteurs ainsi pour la prédiction de l’impact de la
cowdriose.
Dans ce projet, le développement de 2 méthodes de typage par une approche multi locus a été réalisé avec une
caractérisation possible d’un grand nombre de souches très différentes par MLST et MLVA. La méthode de typage
ciblant les séquences en tandem répétées en nombre variable (VNTRs, variable number of tandem repeat
sequences) a été développée en collaboration avec l’UMR INRA-BIPAR de Maison Alfort pour le modèle
Ehrlichia. Lors de la première tranche du projet, nous avions mis au point des PCR simples ciblant 17 VNTRs et
avions évaluer le pouvoir discriminant de ces VNTRs (4). Des PCR nichées ont été développées pour les 17
VNTRs sélectionnés, afin d’obtenir un outil de typage utilisable sur des échantillons collectés sur le terrain et
possédant une faible charge bactérienne. Des PCR nichées ont été développées avec succès pour 7 VNTRs
permettant de typer des souches à la fois dans des tiques et dans les organes d’animaux morts de cowdriose. Il est
important de noter que quelque soit l’origine des souches elles peuvent être typées par cette méthode. Le profil
allélique de chaque souche permet de faire un typage MLVA (Multi locus variable number of tandem repeat
analysis).
Ce projet contient aussi une partie sur le développement d’un vaccin inactivé contenant la bactérie totale tuée d’E.
ruminantium prêt à l’emploi en adjuvant huileux. Le test de différents adjuvants en association avec les antigènes
totaux d’ER (test de stabilité de l’émulsion dans le temps, évaluation de la dégradation des antigènes) constitue
l’étape ultime pour l’obtention d’un vaccin « prêt à l’emploi » et déjà émulsionné. Ce test a déjà été réalisé in vitro
à l’Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica (IBET, Portugal). La stabilité de l’émulsion après mélange
avec l’antigène ainsi que ses propriétés physico-chimiques ont été évaluées par SEPPIC (Société qui
commercialise l’adjuvant). Tous les animaux du groupe témoin ont du être euthanasiés ou traités aux antibiotiques,
démontrant ainsi la létalité de l’infection contrôlée. Tous les animaux vaccinés ont été malades avec la même
intensité. Il y a eu une protection totale pour les animaux vaccinés avec le vaccin émulsionné avec de l’antigène
d’E. ruminantium ISA70M et ISA50, et 80% de survie pour les animaux vaccinés avec le vaccin en ISA70 et le
vaccin ISA70M ayant subi une rupture de chaine du froid (conservation 3 jours à 38°C). Une étude de la réponse
sérologique des animaux est en cours.
Le projet avec le CRVOI coordonné par le CIRAD sur la caractérisation génétique d’E. ruminantium dans l’Océan
indien par 2 analyses multi-locus MLST et VNTRs vient de se terminer. Il a permis une évaluation de la
prévalence d’Ehrlichia dans les tiques des différentes îles (Madagascar, Mayotte, Réunion et Comores) ainsi que
l’étude de la structuration de populations de souches d’E. ruminantium.
6.
Recueil, analyse et diffusion des données épizootiologiques significatives pour le contrôle
zoosanitaire au niveau international
Suite à la mise en place du réseau RESPANG, réseau d’Epidémio-Surveillance des PAthologies Nerveuses chez
les ruminants de Guadeloupe, des analyses ont été réalisés sur des cas de suspicion cowdriose par PCR nichée
pCS20. Au 19/10/2011, l’analyse des données du réseau depuis sa mise en place montre que 32% des animaux
suspects (75/235) sont positifs à la cowdriose. Les cas de cowdriose se répartissent sur l’ensemble de l’archipel
guadeloupéen sous surveillance (Grande-Terre, Basse-Terre et Marie Galante), tout au long de l’année de manière
assez homogène. L’influence des facteurs individuels (race, sexe, âge, …), liés aux pratiques (système d’élevage,
régularité des traitements contre les tiques etc.) ou à l’environnement sera recherché.
D’autre part, une étude de la prévalence d’E. ruminantium dans les tiques Amblyomma de différentes îles de
l’Océan indien a été réalisée en utilisant le diagnostic moléculaire. Pour l’ensemble de l’étude, le même principe
est adopté et consiste à tester au moins 2 tiques/animal et à avoir au moins 3 animaux par troupeau, quand cela est
possible. Pour Madagascar, 13 sites ont été visités. Globalement, 17 % (21/117) des tiques testées sont positives à
Ehrlichia.
4
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
Cowdriose (Heartwater)
7.
Maintenance d’un système d’assurance qualité et de biosécurité pertinent pour les agents
pathogènes et les maladies concernées
Le laboratoire est depuis juin 2011 accrédité COFRAC selon la norme ISO17025 pour l’essai sérologique de
détection des anticorps MAP1-B et l’essai de diagnostic moléculaire PCR nichée pCS20.
8.
Réalisation d’expertises pour l’OIE ou pour des Pays Membres de l’OIE




9.
Le CIRAD cordonne le comité technique du réseau caribéen de santé animale CaribVET au sein duquel il
réalise l'encadrement scientifique du groupe de travail sur les tiques et les maladies transmises. En tant que
membre du comité de pilotage de CaribVET qui inclut notamment également l'OIE, le CIRAD contribue à
définir les stratégies prioritaires pour le contrôle des maladies animales et en particulier de la cowdriose et de
ses vecteurs dans la région Caraïbe.
Une expertise a été apportée pour le montage du réseau de surveillance des pathologies nerveuses incluant la
cowdriose en Guadeloupe (RESPANG). La déclaration en ligne par les vétérinaires des cas de cowdriose et
d’autres maladies transmises par les tiques (Babesia et Anaplasma) est effectuée en Guadeloupe et pourrait
s’étendre à d’autres pays de la caraïbe.
Un encadrement de la lutte contre A. variegatum dans les Antilles françaises est réalisé par un chercheur du
laboratoire. Une étude sociologique sur la non adoption des systèmes de lutte contre les tiques à Marie
Galante a été réalisée.
Organisation du 2nd meeting du groupe de travail « tiques et maladies transmises » de CaribVET, Juin 2011,
Saint Vincent
Formation technique et scientifique du personnel d’autres Pays Membres de l’OIE
Formation d’une étudiante de master 1, Université Montpellier 2, sur la caractérisation génétique d’Ehrlichia pour
une durée de 6 mois
Formation d’une technicienne malgache pendant 4 mois en 2011/2012 sur les méthodes de diagnostic moléculaire.
Les membres du laboratoire de référence participent à la formation sur maladies transmises par les tiques au sein
du Master ECOTROP (Ecosystèmes Tropicaux Naturels et Exploités) (Université Antilles Guyane).
10. Réalisation d’analyses biologiques (test de diagnostic) pour le compte d’autres Pays Membres
de l’OIE
Nous avons réalisé, pour le FOFIFA, Madagascar, 456 analyses sérologiques, pour la DSV Guadeloupe
172 analyses moléculaires. Le Directeur des services vétérinaires de Guadeloupe fournit un rapport annuel à l'OIE
indiquant que la cowdriose est endémique
11. Organisation de réunions scientifiques internationales au nom de l’OIE ou d’autres
organisations internationales
Pas d’activité.
12. Participation à des études scientifiques internationales effectuées en collaboration
Le CIRAD a coordonné le projet du Centre de Recherche et de Veille de l’Océan Indien (CRVOI) sur « les tiques
et les maladies transmises dans l’Océan Indien » qui s’est terminé en décembre 2011. L’objectif était de
déterminer la diversité génétique des tiques Amblyomma variegatum ainsi que celle des souches d’E. ruminantium
dans l’Océan Indien afin de mieux en comprendre les dynamiques de distribution et d’évolution, et in fine de
définir des méthodes de contrôle adaptées. Le projet regroupait des partenaires des Comores, de Mayotte, de La
Réunion, de Madagascar. Il a permis d’identifier une proximité phylogénétique des souches de l’Océan Indien
avec celles d’Afrique de l’Est et un lien phylogéographique entre les A. variegatum de ces deux régions. Ces
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
5
Cowdriose (Heartwater)
groupes sont plus éloignés génétiquement des groupes d’Afrique de l’Ouest et Centrale et des Caraïbes, ce qui
corrobore les connaissances historiques sur les mouvements de populations humaines et animales. L’impact
majeur de la diversité génétique d’E. ruminantium sur la protection vaccinale est connu et ces études contribuent à
tenter d’identifier des groupes de souches conférant des protections croisées pour la formulation de vaccins
efficaces régionalement.
Projet FEDER 2007-2013 coordonné par le laboratoire inclus les thématiques suivantes sur la cowdriose:
Evaluation de la prévalence en Guadeloupe chez les hôtes et vecteurs, développement de méthodes de lutte
innovantes et adaptées aux contextes insulaires tropicaux (outils diagnostics, résistance génétique et approche
vaccinale).
Projet de caractérisation génétique de la résistance à la cowdriose en collaboration avec le Département de
Génétique de l’Université de Bern grâce à des puces SNP chèvres.
Projet de caractérisation des souches au Mozambique en collaboration avec l’Université de Maputo à partir de
2012.
Projet en collaboration avec un partenaire portugais IBET (Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica) sur
l’étude comparative du protéome des souches virulentes et atténuées d’E. ruminantium.
13. Publication et diffusion des informations relatives au travail de l’OIE (notamment liste des
publications scientifiques, activités de publication sur internet, présentations à des conférences
internationales)

Présentations à l’occasion de conférences ou de réunions internationales
Réunion de fin de projet CRVOI, Madagascar, 8 novembre 2011, Huber K, Jacquet S, Stachurski F, Vachiery,
Aprelon R, Martinez D. Amblyomma variegatum, cas d’une tique colonisatrice: phylogéographie au niveau
mondial et structuration dans un territoire colonisé, Madagascar.
Tick and tick borne pathogens seventh international conference, Zaragoza, Spain, 28th august-2nd of
september 2011:
Vachiéry N, Pruneau L., Meyer D F, Haddad N, Adakal H, Stachurski F, Pilet H, Carasco-Lacombe C, Pinarello
V, Raliniaina M, Martinez D and Lefrançois T. Genetic characterization of the Ricketssiales Ehrlichia
ruminantium at mondial scale using new multi-locus approaches.
Meyer D F, Lefrançois T, Marcelino I, Carasco-Lacombe C, Gros O, Piquemal R, Sheikboudou C, Vieira HLA,
Martinez D and Vachiery N. Close encounters of the 4th kind: fine-tuning of Type IV Secretion System defines
virulence of Ehrlichia ruminantium
International Meeting on Rickettsiae and Rickettsial diseases, Héraklion, Crete, Greece, 5-7 June 2011, Meyer
D F, Carasco-Lacombe C, Piquemal R, Pruneau L, Emboulé L, Pinarello V, Martinez D, Vachiery N and
Lefrançois T. Close encounters of the 4th kind: fine-tuning of Type IV Secretion System defines virulence of
Ehrlichia ruminantium
47th Caribbean Food crop Society annual meeting – Barbados – 5th July 2011
L Bournez, J. Pradel, CaribVET Ticks and Tick-borne diseases Working group members, K. Herbert Hackshaw, T
Lefrançois. Tropical Bont Tick surveillance and control in the Caribbean: how research outputs can help decision
makers.

Publications scientifiques
L Pruneau, L Emboulé, P Gely, I Marcelino, B Mari, V Pinarello, C Sheikboudou, D Martinez, F Daigle, T
Lefrançois, DF Meyer, N Vachiéry. Global gene expression profiling of Ehrlichia ruminantium at different
stages of development. FEMS Immunology and Medical Microbiology, DOI: 10.1111/j.1574-695X.2011.00901.x
6
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
Cowdriose (Heartwater)
Marcelino I, de Almeida AM, Brito C, Meyer DF, Barreto M, Sheikboudou C, Franco CF, Martinez D,
Lefrancois T, Vachiéry N, Carrondo MJT Varela Coelho AV, Alves P. Proteomic analyses of Ehrlichia
ruminantium highlight differential expression of MAP1-family proteins. Vet. Microbiol., accepted.
Pilet H, Vachiéry N, Berrich M, Bouchouicha R, Durand B, Pruneau L, Pinarello V,Saldana A, CarascoLacombe C, Lefrançois T, Meyer DF, Martinez D, Boulouis HJ, Haddad N. A new typing technique for the
Rickettsiales Ehrlichia ruminantium: Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis. J. Microbiol.
Methods, accepted.
Vachiéry N, Martinez D, Lefrançois T. La cowdriose dans la Caraïbe. Bulletin Epidémiologique, Santé animalealimentation, Anses, 43, Juin 2011, p44-48.

Autres communications
_______________
(1) Nested PCR for detection and genotyping of Ehrlichia ruminantium: use in genetic diversity analysis. 2004 Martinez D, Vachiéry
N, Stachurski F, Kandassamy Y, Raliniaina M, Aprelon R, Gueye A. Annals New York Academy of Science, 1026: 106-113.
(2) Amblyomma variegatum in cattle in Marie Galante, French Antilles : Prevalence, control measures, and infection by Ehrlichia
ruminantium. Molia S., Frebling M., Vachiery N., Pinarello V., Petitclerc F., Rousteau A., Martinez D., Lefrançois T. 2008.
Veterinary parasitology, 153 (3-4): 338-346.
(3) Raliniaina M, Meyer D, Pinarello V, Sheikboudou C, Kandassamy Y, Emboulé L, Adakal H, Stachurski F, Martinez D,
Lefrançois T, Vachiéry N. Mining the genetic diversity of Ehrlichia ruminantium using map gene family: a key for efficient vaccine
against heartwater. Veterinary Parasitology. 2009. Sep 23. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 19819629.
(4) Pilet H, Vachiéry N, Berrich M, Bouchouicha R, Durand B, Pruneau L, Pinarello V,Saldana A, Carasco-Lacombe C, Lefrançois
T, Meyer DF, Martinez D, Boulouis HJ, Haddad N. A new typing technique for the Rickettsiales Ehrlichia ruminantium: MultipleLocus Variable Number Tandem Repeat Analysis. J. Microbiol. Methods, accepted.
(5) Differential strain-specific diagnosis of the heartwater agent. Vachiery N., Maganga G., Lefrançois T., Kandassamy Y.,
Stachurski F., Adakal H., Ferraz C., Morgat A., Bensaïd A., Coissac E., Boyer F., Demaille J., Viari A., Martinez D., Frutos R.
2008.: Ehrlichia ruminantium. Infection, genetics and evolution, 8 (4): 459-466.
Rapports annuels des Laboratoires de référence de l’OIE, 2011
7