(JNRDM) 2001

Laboratoire sur puce intégrant préparation d’échantillon et détection de
biomarqueurs cancéreux dans le plasma sanguin
Rémi Malbec1, Pierre Joseph1, Thierry Leichlé1, Marie Brut1, Pierre Cordelier2 Aurélien Bancaud1
1Laboratoire LAAS CNRS
7 avenue du colonel Roche
31031 Toulouse cedex 4, France
2Laboratoire CRCT INSERM
2 avenue Hubert Curien
31037 Toulouse cedex 1, France
E-mail : [e-mail]
Résumé
L’ADN, support de l’information génétique, l’ARN, et les
microARNs (miARNs), une classe d’ARNs non codants, sont
des acides nucléiques (ANs) pouvant circuler dans le sang à
faible concentration suite à des mécanismes de sécrétion ou
de mort cellulaire. Leur lien direct avec l’expression génique
induit qu’une altération d’expression ou la présence d’une
mutation génique peut témoigner du développement de
cancers. Ils sont donc des biomarqueurs pertinents pour le
diagnostic et le suivi de la maladie. Dans cette étude nous
présentons un dispositif de laboratoire sur puce capable de
manipuler des ANs en très faibles concentrations (<1 pg/mL)
pour permettre leur analyse rapide (<5 min) et la détection de
marqueurs cancéreux. Une première étape de préparation
d’échantillon permet de concentrer (jusqu’à x1000/min) et de
séparer par taille les fragments d’ANs (20-50000
nucléotides). Après avoir contrôlé l’intégrité des ANs, une
seconde étape permet de détecter par fluorescence la
présence de mutations cancéreuses à l’aide de balises
moléculaires (BMs). Par ailleurs nous montrons que notre
technologie est compatible avec la manipulation de fluides
biologiques complexes tels que le plasma sanguin.
1. Introduction
L’ADN et l’ARN sont des biomarqueurs pertinents
pour le diagnostic et le suivi de l’évolution du cancer. La
présence de mutations cancéreuses spécifiques ou une
altération de l’expression génique peut permettre la
détection précoce de la maladie et le suivi de l’apparition
de résistances à une thérapie. Les ANs se retrouvent dans
les fluides biologiques par des mécanismes de sécrétion
cellulaire ou de mort cellulaire de type apoptose ou
nécrose. Ils sont alors dit circulants et peuvent être
extraits à partir de biopsies liquides non invasives
(prélèvements sanguins ou salivaires) [1]. Le myélome
multiple (MM) est la seconde hémopathie maligne la plus
répandue. Le suivi de sa réponse à la thérapie requiert
aujourd’hui la collecte de cellules de la moelle osseuse
afin d’en séquencer le matériel génétique par next-
generation sequencing (NGS) à la recherche de mutations
spécifiques [2]. Un problème majeur pour le suivi du
MM est qu’il nécessite des ponctions répétées et très
invasives de la moelle osseuse. Pour le confort du patient
il est donc difficile de proposer ces prélèvements plus
d’une fois par an ce qui n’est pas optimal pour la
détection précoce des rechutes. Par conséquent il existe
un besoin urgent de développer des stratégies de contrôle
basées sur les biopsies liquides. L’utilisation de l’ADN
tumoral circulant comme biomarqueur est une solution
séduisante. Un autre intérêt de la biopsie liquide réside
dans la détection précoce du cancer tel que le cancer du
pancréas. Pour 80% des patients, la détection du cancer
du pancréas à un état avancé alors que l’intervention
chirurgicale n’est plus possible explique le taux élevé de
mortalité (près de 100% de décès 5 ans après le
diagnostic). Par conséquent le traitement efficace du
cancer du pancréas nécessite des méthodes de détection
précoce qui permettent la prise en charge rapide du
patient avant l’apparition de métastases [3].
Plusieurs stratégies d’utilisation des ANs circulants
comme biomarqueurs sont possibles. Jahr et al. ont
montré que dans le cas d’un individu atteint de cancer la
concentration en ADN circulant pouvait être plus
importante que pour un individu sain (non détecté à

100ng/mL pour un individu sain contre non détecté à
1000ng/mL pour un patient malade) [4]. Par ailleurs il a
été avancé que le phénomène de mort cellulaire par
nécrose serait plus fréquent dans le cas de cellules
tumorales ayant pour résultat la présence d’ADN plus
fragmentés [5,6]. Ainsi l’analyse de la qualité de l’ADN
total circulant à travers sa concentration et le contrôle de
son intégrité est susceptible d’être utilisé comme
biomarqueur du cancer [7]. Une autre stratégie consiste à
cibler la surexpression de marqueurs spécifiques comme
le miARN21 dans le cas du cancer du pancréas. Les
miARNs sont une classe de courts nucléotides (19-25 nt)
simple brins de type ARN non codant jouant un rôle de
régulation dans divers mécanismes cellulaires à travers la
dégradation ou la répression des ARNs messagers
(ARNm) [8].
Le verrou principal de cette approche est la faible
concentration et la large répartition en taille des ADNs ou
ARNs circulants dans les fluides biologiques, notamment
le sang. Notre but est de développer un laboratoire sur
puce permettant l’analyse des ANs circulants. L’intérêt
des laboratoires sur puce réside dans le fait qu’ils
permettent la multiplication des étapes technologiques sur
un même dispositif. La miniaturisation des étapes permet
la consommation de faibles volumes d’échantillon dans le
cas de canaux microfluidiques. Idéalement ils permettent
la réduction du temps et des coûts d’analyse. De plus leur
taille facilite le transport et leur utilisation ne nécessite
pas la présence d’opérateur qualifié ce qui en fait de bons
candidats pour le diagnostic direct au chevet du patient
[9]. La technologie que nous avons développée repose sur
un brevet déposé par le LAAS-CNRS [10]. Elle permet la
manipulation des ANs chargés sous l’action combinée
d’une actuation hydrodynamique et d’un champ
électrique agissant dans des directions opposées [11].
Ainsi nous avons réalisé la concentration et la séparation
en taille de molécules de type ANs avec des
performances intéressantes en terme de facteur
d’enrichissement (x1000/min), de résolution en taille (20-
50000 nucléotides), de sensibilité (1pg/mL) et de temps
d’acquisition (quelques minutes). L’analyse de la qualité
de l’ADN est faite par comparaison avec un marqueur de
taille placé dans les mêmes conditions opératoires que
l’échantillon et servant de référence de taille et de
concentration. La détection de mutations spécifiques est
réalisée à l’aide de sondes de type balise moléculaires.
Les balises moléculaires sont des séquences
nucléotidiques simples brins (15-30 nt) capables de
s’hybrider avec une cible. En absence de cible sa
structure en forme de tête d’épingle maintient à proximité
un fluorochrome et un suppresseur de fluorescence,
placés à ses extrémités respectives. En présence de la
cible, l’hybridation provoque l’ouverture de la structure
et la restauration de la fluorescence [12].
Dans cette étude nous présentons une approche
intégrée de laboratoire sur puce compatible avec des
échantillons biologiques complexes tel que le plasma
sanguin. Notre système combine la préparation de
l’échantillon et la détection de biomarqueurs cancéreux
pour fournir aux médecins un outil de diagnostic fiable,
performant, à bas coût et prêt à l’emploi.
2. Matériels et méthodes
Les puces sont fabriquées en salle blanche par gravure
plasma après photolithographie. Un canal de 16µm de
profondeur permet d’acheminer rapidement la solution
vers une seconde partie de 2µm de profondeur où la
séparation à lieu. La constriction a une largeur de 2µm au
centre du canal. Un oxyde humide de 400nm est déposé
sur le silicium pour isoler électriquement les canaux. Les
canaux sont scellés par soudure anodique avec un wafer
en verre pour l’observation microscopique.
Les images sont réalisées avec un microscope à
épifluorescence (Zeiss) équipé d’une caméra ANDOR
iXon-885. La pression est délivrée par un contrôleur
MFCS (Fluigent) et le champ électrique par un délivreur
de tension DC.
Pour la préparation du marqueur de taille 100bp, 6µL
de 100bp ladder plus à 500ng/6µL (Ozyme) est incubé
avec 2µL de Yoyo-1 à 100µM (Thermofisher) dans
992µL de tampon Tris-Borate-EDTA (TBE) 1X dans
lequel on a dilué du Polyvinylpyrrolidone 1,3M Da
(Sigma) à 5% en masse et du Dithiothreitol (Sigma) à 2%
en masse. Toutes les solutions sont filtrées à 0,22µm.
Pour la préparation du plasma, des échantillons sont
fournis par le CHU de Toulouse après centrifugation d’un
échantillon sanguin à 872g pendant 10 minutes et
congelés à -20°C. Après décongélation nous réalisons
une deuxième centrifugation à 16000g pendant 15
minutes pour enlever les restes de plaquettes et de débris
cellulaires. Le plasma est alors dilué à 10% dans du
TBE1X, PVP5%. Le marquage de l’ADN plasmatique
est réalisé avec du SybrGold 1X (Thermofisher).
Les plasmides linéarisés ont pour taille respectives
466bp, 799bp et 1512bp. Ils nous ont été fournis par
l’équipe de Vincent Dion de l’Université de Lausanne.
Leur concentration a été mesurée au Nanodrop à
80ng/µL.
Les balises moléculaires sont conçues à partir d’un
programme développé au sein du LAAS-CNRS par
Marie Brut. Les séquences des sondes et des cibles sont
synthétisées par Eurogentec. Les mesures de fluorescence
en température sont réalisées avec un spectrofluorimètre
d’Edinburgh Instruments.
3. Résultats
3.1. Concentration et séparation des acides
nucléiques
La séparation des acides nucléiques est une étape
récurrente pour la quasi-totalité des opérations de
biologie moléculaire liée à ces derniers. Si plusieurs
techniques de séparation existent en laboratoire, elle est
principalement effectuée en routine par électrophorèse
pour vérifier la distribution en taille des ANs à n’importe
quelle étape du processus opératoire. Traditionnellement
l’électrophorèse est réalisée sur gel d’agarose ou
d’acrylamide. L’application d’un courant permet la
migration des molécules chargées négativement. Le gel
sert de matrice rendant la mobilité des ANs dépendante
de leur taille et permet la séparation. [13]. La technique
d’électrophorèse est devenue plus performante avec son
application au format capillaire. Elle consiste à remplir
des capillaires d’environ 100 µm de diamètre avec des

solutions de polymères concentrés [14] et a joué un rôle
clé dans les technologies de séquençage [15].
L’enrichissement des ADNs est quant à lui
majoritairement réalisé par amplification par Polymerase
Chain Reaction (PCR). Dans ce procédé, les ADNs
servent de modèle pour la fabrication de Nx2n copies
avec N le nombre de copies initiales d’ADNs et n le
nombre de cycles de PCR [16]. Si des efforts ont été faits
pour intégrer ces opérations de concentration et de
séparation indépendamment sur des laboratoires sur puce
nous n’avons pas connaissance de technologie permettant
de réaliser ces deux étapes simultanément avec les
performances que nous affichons.
3.1.1. Principe
Ranchon et al. ont montré qu’il était possible de
séparer des particules ou molécules chargées en fonction
de leur taille sous l’action combinée d’une actuation
hydrodynamique et électrophorétique dans des sens
opposées (Fig. 1).
Figure 1. Transport d’ADN par actuation
hydrodynamique et électrophorétique.
Pour cela les molécules chargées sont mélangées dans
une solution viscoélastique obtenu par dissolution d’un
polymère de type PVP. Dans un microcanal confiné
rempli d’un fluide viscoélastique, la résultante des forces
appliquées à la molécule chargée est une force transverse
qui la pousse vers les parois. La vitesse d’une molécule
dans un écoulement laminaire est fonction de sa distance
à la paroi. Plus la molécule chargée est volumineuse, plus
la force transverse exercée sur elle sera importante. La
mobilité d’une molécule d’ADN chargée est alors
dépendante de sa taille. Pour une taille donnée il existe
une position dans le canal où les vitesses
hydrodynamiques et électrophorétiques vont se
compenser permettant l’arrêt de la molécule [11]. Par
conséquent pour un couple de force défini, chaque taille
d’ADN sera à l’équilibre dans une région différente du
microcanal rendant possible la séparation et la
concentration sans matrice (Fig. 2).
Figure 2. Vu de dessus du canal. Principe de
concentration sélective de l’ADN dans un fluide
viscoélastique sous l’action opposée d’une actuation
hydrodynamique et électrophorétique dans un microcanal
confiné.
3.1.2. Concentration et séparation 100-1500 bp ADN
Nous avons testé notre système avec un marqueur de
taille commercial composé de 9 tailles d’ADN entre 100
et 1500 paires de bases (bp). Le design de la puce est
identique à celui présenté figure 2. Les conditions
opératoires sont 2bar et 33V. Pour ces conditions nous
obtenons 3 bandes définies correspondant aux tailles
1500bp, 1000bp et 800bp au bout de 30 secondes
d’acquisition. Le reste des tailles est concentré au niveau
de la constriction en bandes non définies (Fig. 3).
Figure 3. Time lapse montrant la formation des bandes de
taille d’ADN au cours du temps pour des conditions définies
de pression et de voltage.
L’augmentation du couple pression-voltage permet
d’améliorer la résolution des bandes du marqueur de
taille. Ainsi pour un couple pression-voltage de 7bar et
75V nous avons pu isoler 8 des 9 bandes du marqueur de
taille entre 1500bp et 200bp (Fig. 4).
Figure 4. Les quatre photographies correspondent au
résultat de la concentration après 30 secondes pour
différentes conditions de pression et de voltage.
En corrélant l’intensité de la fluorescence observée
avec la concentration en ADN, il est possible d’intégrer le
signal obtenu pour chaque bande et de définir les
performances de concentration de notre système. On
s’aperçoit que la vitesse de concentration dépend de la
taille de l’ADN pour un couple pression-voltage donné.
Ce résultat est cohérent avec le fait que les molécules
d’ADN ont des mobilités différentes en fonction de leur
taille. Les petites tailles d’ADN qui circulent plus vite
dans le microcanal présentent des facteurs de
concentration plus importants. Les facteurs de
concentration des bandes à 1500bp, 1000bp et 800bp sont
respectivement 12, 30 et 42 par minute (Fig. 5). Par
ailleurs pour une taille d’ADN donnée, il est possible
d’augmenter le facteur de concentration en choisissant un
couple pression-voltage qui stoppe les molécules d’ADN
le plus près possible de la constriction (Fig. 5). En suivant
ce raisonnement nous avons pu obtenir des facteurs de
concentration de l’ordre de 1000 par minute.

Figure 5. Les graphes représentent l’augmentation de
l’intensité en fonction du temps pour différentes tailles est
des paramètres d’actuation identiques à gauche, ou pour
une même taille et des paramètres d’actuation différents à
droite.
Enfin, nous avons exploré la limite de détection de
notre système. Des fragments d’ADN de 300bp sont
marqués au YOYO-1 et plusieurs dilutions sont réalisées.
En appliquant une pression de 5bar et 70V pendant 5
minutes, nous avons détecté des concentrations
minimales de 1pg/mL (Fig. 6).
Figure 6. Concentration de 300bp. La détection est faite
proche de la constriction où l’ADN est regroupé au milieu.
3.1.3. Concentration et séparation dans du plasma
Pour démontrer que notre étape de concentration
sélective est compatible avec des échantillons complexes,
un marqueur de taille est spiké dans du plasma à 10%
dans notre solution viscoélastique. Les résultats montrent
que cette concentration du plasma ne perturbe pas notre
séparation des bandes du marqueur de taille (Fig. 7).
Figure 7. Concentration et séparation d’un marqueur de taille
(100bp à 1500bp) dans du plasma sanguin à 10% en
concentration.
Enfin, nous avons montré qu’il était possible de
concentrer directement l’ADN circulant dans le plasma
sanguin sans purification préalable. Pour une pression
fixée à 6,43bars, différentes tension permettent d’arrêter
et concentrer différentes tailles d’ADN circulant à la
constriction (Fig. 8).
Figure 8. Concentration à la constriction de différentes
tailles d’ADN circulant dans le plasma sanguin. Pour une
pression de 6.43 bar, l’ADN circulant largement distribué en
taille est en partie arrêté à 50V, 100V et 150V.
3.1.4. Multiplication des canaux
Pour vérifier la reproductibilité de notre système, nous
avons fabriqué des puces présentant deux canaux
microfluidiques indépendants en parallèle. En travaillant
avec des paramètres identiques dans les deux
microcanaux nous avons évalué la réponse d’un même
marqueur de taille introduit dans les deux canaux. Nous
avons ainsi pu montrer que la concentration et la
séparation est identique et simultanée dans les deux
canaux (Fig. 9).
Figure 9. Concentration et séparation simultanée du
marqueur de taille dans deux microcanaux indépendants
pour des conditions d’actionnement identiques.
Pour affiner notre approche, nous avons alors cherché
à caractériser trois plasmides linéarisés de tailles
respectives 466bp, 798bp et 1512bp (Fig.10).
Figure 10. Concentration et séparation simultanée dans
deux canaux du marqueur de taille (en haut) et de 3
échantillons ADN de 466bp, 798bp et 1512bp (en bas) pour
des conditions d’actionnement identiques.
La comparaison de la distance des bandes à la
constriction nous permet de déterminer la taille de nos
échantillons avec le marqueur de taille servant comme
référence (Fig. 11).
Figure 11. Identification des tailles de 3 échantillons
plasmidiques linéarisés (courbe rouge) contre la distribution
en taille d’un marqueur de taille (courbe bleue).
De plus nous avons montré que notre procédé permet
d’évaluer de manière semi-quantitative la concentration
des échantillons. Pour le marqueur de taille les quantités
d’ADN introduites par bandes sont 40ng, 80ng et 150ng

pour les bandes de 400bp, 800bp et 1500bp
respectivement. Pour les échantillons plasmidiques
linéarisés 80ng d’ADN sont utilisés pour chaque taille.
La comparaison de l’intensité du signal de chaque bande
est cohérente avec les quantités introduites (Fig.12).
Figure 12. Evaluation de la concentration des plasmides
linéarisés de 466bp, 799bp et 1512bp par comparaison de
l’intensité du signal des bandes contre celle du marqueur de
taille.
3.2. Détection de mutations spécifiques par
balises moléculaires
Pour la détection de mutations spécifiques nous avons
utilisé des sondes de type balises moléculaires. Ces
sondes sont connues pour présenter une sélectivité à une
paire de base près. Une bonne sélectivité est pertinente
pour la détection de polymorphismes nucléotidique
cancéreux souvent au sein d’une même famille de gênes.
3.2.1. Caractérisation des balises moléculaires
Une première série d’expériences nous a permis de
caractériser une balise moléculaire contre une séquence
microARN21 (miR-21), un des biomarqueurs du cancer
du pancréas, et une forme mutée sur une paire de base. La
sonde et sa cible sont incubées pour différentes
conditions de concentration et de température et la
fluorescence résiduelle est mesurée par
spectrofluorométrie.
Figure 13. Caractérisation d’une sonde de type balise
moléculaire contre le microARN21 et sa forme mutée.
Evaluation de la sélectivité en fonction de la température.
A 55°C, nous avons relevé une intensité de signal 6,2
fois plus importante pour la sonde associée à la cible
mi21 que pour l’association avec une cible présentant une
mutation (Fig. 13).
3.2.2. Intégration sur puce des balises moléculaires
Nous avons montré la compatibilité du système de
détection avec l’étape de concentration sans perturber la
fonctionnalité des sondes. Après incubation avec leur
cible, les sondes sont injectées dans le microcanal. Pour
une pression de 2,34 bars et un voltage de 237 V il est
possible de concentrer le duplex sonde-cible au niveau de
la constriction. Ce résultat démontre la possibilité
d’intégrer le système de détection choisi avec une étape
de concentration sélective de la cible (Fig. 14).
Figure 14. Concentration de la balise moléculaire en
hybridée à la cible miR-21.
4. Conclusions
Dans cette étude, nous avons montré la possibilité de
réaliser la concentration et la séparation simultanée
d’acides nucléiques sans matrice dans un microcanal avec
des performances très compétitives en particulier pour
des tailles d’ADN dans la gamme 100-1500bp. Les
facteurs de concentration obtenus permettent d’enrichir
jusqu’à 1000 fois l’échantillon en une minute. Pour
certaines applications en laboratoire nécessitant des
amplifications de type PCR, l’enrichissement est
intéressant dans la mesure où l’on cherche à s’affranchir
des erreurs liées à la polymérase ou que l’on dispose
d’une quantité limitée de matériel à analyser. En termes
de sensibilité, nous avons démontré des limites de
détection pour des concentrations de 1pg/mL. Pour des
temps d’acquisition identiques, les systèmes
d’électrophorèses capillaires commerciaux les plus
sensibles sur le marché affichent des performances de
détection de 1ng/mL (Fig. 15).
Figure 15. Comparaison des performances de sensibilité de
notre laboratoire sur puce (Lab on chip) avec les systèmes
commerciaux dont celui transposé industriellement sur
capillaire chez Picometrics S.A.
La rapidité des temps de séparation et de
concentration, le faible coût en volume d’échantillon et la
facilité de mise en œuvre sont d’autant plus de critères
qui font de notre dispositif un candidat idéal de
laboratoire sur puce.