Février n°180

Février 2001 n°180
Concepts et Techniques ###
On trouvera dans Current Opinion in Genetics & Development 10 (DEC00), une série
de revues sur l'apport de l'analyse des génomes à la compréhension de l'évolution,
organisées et analysées par A Adoutte du CNRS à Gif et E Boncinelli du DIBIT de
Milano. Beaucoup de données, notamment sur le rythme de l'évolution, sont en train
d'apparaître (H Philippe et al.; 596-601). On trouve une revue sur le "silencing" post-
transcriptionnel dans les règnes animal et végétal avec C Cogoniu et al.; p.638-643, ainsi
que sur les solutions trouvées au dosage génique chez les organismes à chromosomes
sexuels hétéromorphes, avec A Pannuti et al.; p. 644-650. Les gènes canaux
intracellulaires de libération de C2+ ont subi des phénomènes de duplication et
divergence, que ce soit dans la famille des récepteurs de l'inositol trisphosphate ou du
récepteur ryanodine. Ceci a permis de construire une batterie de récepteurs spécialisés qui
proviennent d'une co-optation de composants au sein de cette collection. V Sorrentino et
al.; p.662-667. Une revue porte sur les modèles actuels d'évolution des séquences de
protéines et ce qu'ils permettent. JL Thomas ; p.602-605.
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On connaît de nombreux cas de répression de l'expression ("silencing") portant sur des
séquences de quelques kb, comme dans le cas de la séquence déterminant le type sexuel
de Saccharomyces cerevisiae, à un chromosome entier, comme dans le cas du
chromosome X des mammifères. On vient de montrer que la protéine Sir2p (Silent
Information Regulator) de la levure est une désacétylase de l'histone H3. KG Tanner et
al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97
(19DEC00) 14178-14182. On pensait que c'était une ADP-ribosyltransférase (JC Tanny
et al.; Cell 99 (23DEC99) 735-745). Le couplage de la désacétylation des histones avec
le clivage du NAD vient d'être démontré.C'est l'O-acétyl-ADP-ribose qui est le produit de
la transacétylation. JC Tanny et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America 98 (16JAN01) 415-420. ###
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On assiste durant les dernières années à une surenchère sur les techniques de
marquage moléculaire. Il s'agit de les rendre plus versatiles, notamment de pouvoir
suivre plusieurs marqueurs simultanément, et plus sensibles pour suivre des inductions
moins intenses de l'expression génique, par exemple. Une conférence sur le sujet a eu lieu
en juin l'an passé ("Advances in Molecular Labels, Signaling and Detection") et un
compte rendu figure dans PE Sheehan et al.; Trends in Biotechnology 18 (DEC00)
481-482.###
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L'US Patent 6 172 188 (09JAN01), de chercheurs danois, décrit de nouvelles variantes
de la GFP (Green Fluorescent Protein).
Il existe une variante bleue (Tyr66His-GFP avec un maximum d'émission à 448 nm,

bleue), mais qui doit être excitée violemment à 360 nm-390 nm, ce qui est toxique pour
les cellules. Les variantes danoises sont F64L-GFP, F64L-Y66H-GFP et F64L-S65T-GFP
qui sont très actives et fonctionnent au dessus de 30°, la première étant la meilleure.###
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Compte-tenu du nombre d'essais à effectuer, les méthodes de balayage de séquences
pour détecter les polymorphismes se devraient d'être efficaces, rapides et bon marché. Les
polymorphismes sont les variations individuelles qui viennent se superposer sur ce que l'on
appelle "la" séquence génomique de l'homme ou d'Arabidopsis par exemple. On les
étudient car, même si elles n'ont pas un effet phénotypique évident, elles pourraient en
avoir un dans certaines circonstances (sensibilité à un médicament, etc…).
Les méthodes les plus courantes de balayage sont basées sur les misappariements,
entre la séquence de référence et celle à étudier. La seule méthode qui permet, à la fois,
une détection et une localisation de tout misappariement est la méthode de séquençage de
Sanger. Mais elle est longue et coûteuse. On ne peut donc examiner qu'une dizaine de
gènes dans une région donnée du génome.
Une nouvelle technique vient d'être révélée par des chercheurs de Kyoto qui repèrent
spécifiquement le défaut d'appariement G-G par un marqueur que l'on fixe sur une surface
et qui capture le fragment porteur de ce défaut. L'avantage de la technique est qu'on
n'utilise pas d'hybridation, donc pas de sonde spécifique. Par ailleurs le ligand peut être
réutilisé de nombreuses fois, ce qui abaisse le coût de l'essai. K Nakatani et al.; Nature
Biotechnology 19 (JAN01) 51-55.
Il y a cependant plusieurs limitations à cette technique, pour l'instant. La première est
que seules les non-appariements G-G sont détectés, et ce sont les moins fréquents. Ensuite,
la technique permet de savoir qu'il y a quelque part un mauvais appariement. Il faut
ensuite séquencer pour le localiser. Enfin plusieurs G-G ne peuvent être distingués d'un
unique mauvais appariement, et surtout tous les autres misappariements ne sont pas
identifiables. PY Kwok; Nature Biotechnology 19 (JAN01) 18-19. ###
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L'activateur de transcription Gal4 de Saccharomyces cerevisiae agit normalement sur
un site de la séquence UAS (upstream activating sequence), environ 250 pb en amont du
site de début de transcription. Chez la levure, il devient inefficace à plus de 600 à 700 pb
en amont ou n'importe tout en aval, contrairement à ce qui se passe pour ses équivalents
chez les mammifères.
On vient de montrer qu'une séquence activatrice (enhancer) éloignée de 1-2 kb
devient utilisable si le gène qu'elle commande est lié à un télomère. Ceci est dû au fait
que les télomères font des boucles. D de Bruin et al.; Nature 409 (04JAN01) 109-113. ###
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On vient de combiner une technique d'immunoprécipitation de la chromatine (déjà
utilisée pour identifier des interactions protéines-ADN) et des microréseaux pour analyser
globalement tous les sites du génome qui fixent des protéines ayant une affinité pour
l'ADN (et qui ont donc des chances d'être des régulateurs de la transcription). B Ren et al.;
Science 290 (22DEC00) 2306-2309. La méthode a d'abord été vérifiée avec l'activateur
de transcription Gal4 de Saccharomyces cerevisiæ. Les auteurs ont révélé 10 sites, dont
7 étaient déjà connus. Ils ont ensuite entrepris une opération plus ambitieuse avec Ste12.
Celui-ci est également un activateur de transcription, intervenant dans la réponse des
cellules haploïdes de S.cerevisiæ aux phéromones sexuelles. On a identifié plus de 200
gènes répondant ainsi, mais on ne sait si cela correspond à une stimulation directe ou
indirecte. Avec la nouvelle technique on constate que seulement 29 d'entre eux lient
Ste12p.
On vient, encore plus récemment, d'effectuer la même opération sur les facteurs de
transcription BF et MBF. VR Iyer et al.; Nature 409 (28JAN01) 533-538. ###
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L'ADN polymérase de l'archée hyperthermophile Thermococcus litoralis est capable
d'allonger un génome au-delà de sa taille normale, car elle est capable de polymériser des
palindromes monobrins oligodésoxyribonucléiques jusqu'à des tailles de 20 kb, sans avoir

besoin d'un double brin amorce. Une fourchette de 25-50% de GC et une structure
palindromique sont exigées. Tout se passe comme si l'enzyme utilisait une structure
transitoire en épingle à cheveux qui se forme et de dissocie de façon répétitive. Selon les
chercheurs de Taiko Pharmaceutical Company, ceci doit refléter un des mécanisme
primordiaux de réplication de l'ADN. N Ogata et al.; Biochemistry 39 (14NOV00)
13993-4001.
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Les mécanismes d'exportation du noyau font intervenir un complexe de la molécule à
exporter avec un membre de la famille des importines-ß et la protéine RAN chargée par
du GTP. Après transport à travers le pore nucléaire, le GTP de Ran est hydrolysé par une
GTPase cytoplasmique activée par la protéine, également cytoplasmique, RanGAP
(GTPase-activating protein) puis le complexe est dissocié par RanBP1 (RAN Binding
Protein) qui stimule également RanGAP. Les messagers après épissage ne feraient pas
intervenir RAN, alors qu'elle est nécessaire à celle des tARNs, par exemple.K Nicole-
Clouse et al.; nature cell biology 3 (JAN01) 97-99.
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On trouvera dans J Pines et al.; nature cell biology 3 (JAN01) E3-E6, une réflexion
unificatrice intéressante sur les différentes étapes de la mitose, revues et corrigées à la
lumière des données moléculaires. Celles-ci soulignent les transitions entre les
différentes phases; il y en a cinq, qui ne sont pas strictement superposables avec les
données cytologiques. C'est surtout un schéma centré sur les rôles de kinase et de l'APC
(un complexe ubiquitine–ligase essentiellement actif durant la mitose).
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La méthylation de cytosines entraîne une compaction de la chromatine et un muselage
de l'expression génomique chez les Vertébrés. Cette méthylation constitue un des éléments
de régulations dites épigénétiques. Elle attire des protéines reconnaissant ce type de
séquences, dont des histones désacétylases. Les cellules les plus hypométhylées sont les
cellules totipotentes au cours du développement. Trois gènes sont indispensables pour
établir et maintenir cette méthylation du génome, Dnmt3a et Dnmt3b (pour De novo
methyltransferases) et celui de l'enzyme de maintenance, Dnmt1. L'inactivation de ce
dernier gène entraîne de nombreux dégâts très tôt au cours du développement, ce qui limite
l'analyse du phénomène. On a tourné cette difficulté avec la technique classique d'excision,
et donc d'inactivation, à la demande par le système Cre-loxP.
On constate alors que cela entraîne un mort généralisée de fibroblastes en culture, par
apoptose dépendant de p53. Environ 10% des gènes présentent un patron d'expression
anormal dans ces cellules au génome déméthylé. L Jackson-Grusby et al.; Nature Genetics
27 (JAN01) 31-39. Voir également le commentaire de EP Feinberg; Nature Genetics 27
(JAN01) 9-10.
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Les défenses des plantes, notamment dans le cas des infections virales, font intervenir
un mécanisme de "silencing" post-transcriptionnel, qui implique la destruction de toute
séquence ribonucléotidique présente, à un moment, sous forme d'ARN double-brin. Ce
type de défense existe également chez les animaux et il est à la base de l'action des
interférons par exemple.
Ce mécanisme a pour fonction naturelle l'élimination des acides nucléiques étrangers,
en particulier les virus. La démonstration du rôle des ARNs double-brin dans ce
mécanisme a surtout surtout été faite chez les animaux, chez qui ces acides nucléiques sont
une exception dans les conditions naturelles. Une première hydrolyse découpe les ARNs
double brin en fragments d'environ 22 nucléotides. Les produits de cette première
hydrolyse sont ensuite incorporés dans des complexes qui s'attaquent aux messagers
correspondants et que les courts ARNs (qu'il faudra dénommer, un de ces jours, pour
m'éviter des périphrases) guident vers les messagers à éliminer. Chaque étape permet une
amplification, et donc une accélération de la réaction.
Comme on pouvait s'y attendre, deux RNases différentes sont impliquées. On vient

d'identifier la RNAse de la première hydrolyse chez Drosophila intervenant au cours du
"silencing" post-transcriptionnel ou "RNA interference" (RNAi). (E Bernstein et al.;
Nature 409 (18JAN01) 363-366). Elle a été appelée Dicer et découverte par homologie
avec d'autres RNases s'attaquant aux ARNs double-brin (RNase III). Une des astuces de la
caractérisation a été d'utiliser des ARNs double-brin correspondant au gène Dicer, lui-
même, car on ne dispose pas de mutants de ce gène, et les auteurs ont donc utilisé la
fonction du gène pour réprimer son expression!!!!!.
Dicer possède donc des motifs caractéristiques des RNase III, mais aussi un motif dit
PAZ (voir L Cerutti et al.; Trends in Biochemical Sciences. 25 (OCT00) 481-482) qui
existe dans la protéine de Drosophila ARGONAUTE et dans des protéines homologues
d'Arabidopsis, Caenorhabditis elegans et Neurospora crassa (voir les numéros de Janvier
et Juin 2000 du bulletin). Celles-ci interviennent dans le "silencing", mais n'ont, cependant
pas, pas de motifs faisant penser à une RNase III. Il semblerait que la seconde RNase
contienne une protéine qui possède effectivement un domaine apparenté à ARGONAUTE
(D Baulcombe; Nature 409 (18JAN01) 295-296, et l'interaction des domaines PAZ de
Dicer et de cette protéine permettrait l'assemblage.
Un fait curieux, relevé dans cette dernière publication, est le fait que silencing et
croissance ont souvent des interactions. Ainsi un des gènes codant une protéine à domain
PAZ, CARPEL FACTORY est apparenté à dicer et sa mutation peut donner des fleurs
anormales. On retrouve ce phénomène chez les animaux où elles affectent, également, les
cellules reproductrices.
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Les Productions Végétales
Les gènes et les génomes ###
On trouvera dans S Santoni et al.; Cahiers Agricultures 9 (JUL-AUG00) 311-327, une
revue bien faite (et en français) sur l'utilisation des marqueurs génétiques en sélection
végétale, et notamment un glossaire bien utile des multiples sigles utilisés.
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Le Kazusa DNA Research Institute japonais a séquencé la bactérie fixatrice d'azote
Mesorhizobium loti, et va se lancer dans le séquençage du génome de son hôte, Lotus
japonicus. D Cyranovski; Nature 409 (18JAN01) 272.
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Le Torrey Mesa Research Institute (TMRI, ancien Novartis Agricultural Discovery
Institute), centre de génomique de Syngenta, vient d'annoncer l'achèvement d'une carte
complète du riz, en association avec Myriad Genetics. La localisation de la plupart des
gènes ainsi que de leurs séquences régulatrices aurait été obtenue. Certains des résultats
ont été présentés au Keystone Symposium de Big Sky, Montana, les 26-31 Janvier 2001.
Elles seront disponibles, pour la recherche académique, dans le cadre d'accords. Syngenta
Press Release (26JAN01).
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La protéine coiffant de façon covalente un plasmide linéaire mitochondrial de
Pleurotus ostreatus n'est autre qu'un fragment N-terminal de la DNA polymérase du
champignon. EK Kim et al.; Current Genetics (30NOV00) 283-290
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L'expression génique ###
Utilisant le système Cre-loxP de recombinaison site-spécifique, des chercheurs
d'Albany ont inséré un même gène gus (ß-glucuronidase) en divers sites préétablis du
génome, et ont suivi le patron d'expression. L'intensité de l'expression varie de dix fois
entre les divers sites. Plus curieux, plus de la moitié des sites ainsi explorés donnent lieu à
une expression sans patron spatial complet d'expression. Dans les autres il y a un effet
prédictible.
Il se trouve qu'on observe une bonne corrélation avec une méthylation qui semble
spécifique des transgènes, mais c'est un événement aléatoire au moment de la

transformation. CD Day et al.; Genes & Development 22 (15NOV00) 2869-2880. Ceci
n'est qu'une illustration d'un phénomène que l'on décrit sous toutes ses formes, mais dont
on n'arrive pas à cerner le mécanisme de base.
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La Reproduction
L'US Patent 6 172 279 (09JAN01) octroyé à Zeneca couvre une stérilisation contrôlée
par un inducteur chimique (un "safener", substance ajoutée aux herbicides pour protéger
les récoltes contre leurs effets). Le système comporte un premier promoteur inductible par
cette substance commandant un répresseur, une séquence opérateur répondant à ce
répresseur, un promoteur ne fonctionnant que dans les étamines, et commandant un
inhibiteur protéique d'une fonction essentielle.
Le brevet cite le promoteur du gène de la sous-unité de 27 kDa de la glutathione-S-
transférase II (GSTII) qui est induit spécifiquement, notamment dans les anthères, par des
"safeners" dont la N,N-diallyl-2,2- dichloroacétamide, plus d'autres qui diffusent quand
même mieux dans la plante
Le brevet cite, à côté d'opérateurs classiques, les pseudo-opérateurs qui ont été
modifiés et reconnaissent des répresseurs eux-mêmes mutants, ce qui complète la
panoplie.
Les gènes inhibiteurs préconisés sont ceux qui codent des inhibiteurs du métabolisme
mitochondrial du fait de la sensibilité du tube pollinique à une perturbation énergétique.
La réversion de la stérilité serait obtenue en traitant la plante par l'inducteur, ce qui
entraîne le blocage de la production de la protéine inhibitrice.
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Le Développement ###
Le maintien de la fonction d'un méristème implique un équilibre entre le rythme des
divisions et la déplétion du stock de cellules méristématiques par différenciation. Comme,
chez les plantes, ce sont usuellement les positions respectives des cellules qui gouvernent
le devenir des cellules, on peut se demander comment les cellules perçoivent leur
voisinage. Dans le cas précis, deux voies de signalisation interviennent dans la
détermination des cellules caulinaires. L'une est assurée par la protéine à homéobox WUS
(wuschel = tousle = ébouriffé), qui émane des régions profondes pour agir sur les cellules
apicales du méristème, pour leur dire de se développer en cellules de tiges. WUSCHEL est
un facteur de transcription qui induit cette différenciation caulinaire. Il est lui-même
soumis à une régulation négative par les produits des gènes CLAVATA (CLV). Les
cellules de la région apicale secrètent en effet le ligand CLV3 qui active les récepteurs
CLV1/CLV2 des cellules situées plus profondément dans le méristème.
La surexpression ectopique de CLV3 cause, par contre, une répression de l'effet de
WUS, ce qui réduit la population des cellules indifférenciées. Cet effet est lié à un signal
émis par les cellules souches et perçu par un complexe récepteur-kinase
Ce système intervient probablement dans le mécanisme d'arrêt de la floraison par une
action du facteur de transcription AGAMOUS (AG) sur la production de WUS. On ne sait
cependant pas si les deux régulations de WUS agissent de concert ou indépendamment.
R Waites et al.; Cell 103 (08DEC00) 835-838.
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Le cas des méristèmes des organes latéraux est un peu plus compliqué, car il y a
besoin d'une dissymétrie dorso-ventrale (en réalité proximo-distale, dorso-ventrale et
médio-latérale). Ces orientations sont perturbées chez les mutants asymmetric leaves1
(as1). Le gène AS1 code une protéine à domaine Myb (encore une structure se liant à
l'ADN) très apparentée à PHANTASTICA d'Antirrhinum (PHAN) et ROUGH SHEATH2
(RS2) du maïs. Tous ces gènes sont des gènes de protéines à homéobox du groupe
KNOTTED.
AS1 régule négativement d'autres gènes à "homeobox" (des séquences de 180 pb
codant un domaine fixant l'ADN de 60 aminoacides ou homéodomaine) comme KNAT1 et
KNAT2. le gène AS1 est, à son tour, régulé négativement par le gène du même type