Physiopathologie de l`autophagie

UE11 - Parcours 3 – Cours n° 3
28/10/2015
Dr. Patrick Gonzalez
[email protected]
RT : Salma Al Kahf
Agathe Ancel
RL : Adèle Triboulet
Physiopathologie des processus de mort cellulaire et
de l’autophagie :
« la mort et la destruction pour la vie »
Plan :
I.
Physiopathologie de l’autophagie
A- Introduction
B- Fonctions de l’autophagie
C- Mécanisme de l’autophagie
D- Régulation de l’autophagie
E- Méthodes d’étude de l’autophagie
F- Physiopathologie de l’autophagie :
1)
Autophagie et obésité
2)
Autophagie et immunité
3)
L’autophagie dans le développement embryonnaire
4)
L’autophagie : un processus anti-âge ?
5)
L’implication de l’autophagie dans les maladies
neurodégénératives
6)
La dualité de l’autophagie dans le cancer
Physiopathologie des processus de mort cellulaire
A- Apoptose
B- Nécrose
C- Implication pathologique de la mort cellulaire et stratégie
thérapeutique
II.
Abréviations :
TA = tissu adipeux
TTT = traitement NN = nouveau-né AA = acide aminé AG = acide gras
I.
Physiopathologie de l’autophagie
Objectifs :
- Définir le processus de l’autophagie
- Connaitre la voie principale de régulation de l’autophagie et les cibles thérapeutiques qui
modulent l’activité autophagie
- Connaitre les limites actuelles à l’exploitation thérapeutique de l’autophagie
- Comprendre les implications physiologiques et pathologiques de l’autophagie
A) Introduction

Définition
L’autophagie est un processus régulé d’autodégradation vésiculaire et de recyclage des
constituants intracellulaires (protéines, lipides, organelles) et exogènes (ex : bactéries, virus).
Caractéristiques :
-
Phénomène régulé
Machinerie moléculaire spécifique
Dans un compartiment délimité : l’autophagosome
On distingue plusieurs types d’autophagies :
- La microautophagie : dégradation par endocytose dans les lysosomes.
- L’autophagie réalisée par l’intermédiaire des chaperonnes : fixation des chaperonnes aux
protéines pour les envoyer vers les lysosomes pour être dégradés.
- La macroautophagie (=autophagie) : dégradation de matériel cellulaire ou exogène à
l’intérieur d’autophagosomes. C’est le type d’autophagie traité dans ce cours.
Il existe différents types d’autophagie, sélective et non sélective, en fonction du contenu à
dégrader dans l’autophagosome :
Type d’autophagie
Autophagie non
sélective
Mitophagie
Contenu vésiculaire à
dégrader
Cytoplasme
Mitochondries
Lipophagie
Vésicules lipidiques
Xénophagie
Bactéries
Virus
Autophagie basale = dégradation 1.5% des protéines cellulaires par heure.
B) Fonctions de l’autophagie
L’autophagie contribue au métabolisme et à l’homéostasie cellulaire.
Métabolisme  recyclage des produits de dégradation pour la synthèse de protéines et de
membrane et la production d’énergie
Homéostasie  préservation de l’intégrité de la cellule.

Adaptation au stress :
L’autophagie permet aux cellules de survivre dans des conditions de stress (nutritif ou
hypoxique).

Fonction métabolique chez le NN :
L’autophagie permet au NN de survivre à la carence nutritive, liée à l’arrêt de l’alimentation
ombilicale.
Expérience de Knock-Out : des souris capables ou non d’autophagie ne sont pas nourries (stress
nutritif). Les souris non capables d’autophagie meurent bien plus précocement que les souris qui
en sont capables, à cause de leur incapacité à recycler leur contenu cellulaire et en produire de
l’énergie.

Rôle dans l’homéostasie des tissus
L’autophagie permet de maintenir l’intégrité de la cellule.
Expérience : souris KO pour ATG7 (protéine impliquée dans l’autophagie) = génération d’une
hépatomégalie non proliférative, liée à une augmentation de la taille des cellules. Celles-ci sont
incapables de dégrader leur contenu cellulaire qui s’accumule et rompt l’homéostasie tissulaire.
C) Mécanismes de l’autophagie
L’autophagie se déroule en 3 étapes :
Machinerie moléculaire à 32 protéines, appelées ATG+n°, conservées à travers les espèces.
1) Induction du phagophore
Formation de l’autophagosome à partir d’un phagophore, un embryon de membrane (mb
cytoplasmique, du Golgi, du RE ou mitochondriale).
Modèle du « berceau » pour la mb du RE
2) Elongation et complétion (=fermeture) du phagophore
Le phagophore s’allonge et se referme sur le contenu à dégrader, pour former l’autophagosome.
LC3-II est une protéine indispensable à la fermeture du phagophore en recourbant la membrane
et constitue un marqueur de l’autophagie.
Cette protéine est présente à l’état basal dans le cytoplasme sous la forme LC3-I. Sous l’influence
de protéines ATG, LC3-I est clivée puis lipidée (liaison covalente avec la
phosphatidyléthanolamine (PE)). Ainsi formée, LC3-II est intégrée à la vésicule autophagique.
3)
Fusion avec le lysosome
L’autophagosome fusionne avec le lysosome pour former l’autophagolysosome qui dégrade et
recycle le contenu vésiculaire.
Les produits de dégradation sont recyclés :
AA = production d’ATP ou synthèse de protéines d’adaptation au stress.
AG = production d’ATP ou fabrication de membranes.
D) Régulation de l’autophagie
Inhibition de l’autophagie :
Les signaux de survie, tels que les nutriments ou les facteurs de croissance, inhibent
l’autophagie en agissant sur la voie des PI3Kinase de classe 1, Akt et mTOR. Ces derniers sont
des facteurs oncogènes qui inhibent la formation du complexe protéique responsable de
l’autophagie (ULK1/FIP200/ATG13 qui active Beclin-1/VPS34 = PIKinase de classe 3)
Activation de l’autophagie :
Les signaux de stress (ROS, AMPc…) activent l’autophagie en levant l’inhibition formée par
PI3Kinase de classe 1, Akt et mTOR.
Exploitation thérapeutique de l’autophagie :
Cet axe de régulation peut être modulé par des molécules pharmaceutiques :
1) Inhibition de PI3Kinase de classe 1 : GDC_0941, PI-103… qui bloquent le cycle cellulaire
et activent l’autophagie = thérapies anti-cancéreuses.
2) Inhibition de mTOR : Rapamycine et dérivés (= antibiotique issu d’un champignon de
l’île de Rapanui, le streptomyces hygroscopicus)
3) Action à l’étape terminale : la Chloroquine inhibe la fusion avec le lysosome. Cet
inhibiteur entraîne donc une accumulation d’autophagosomes dans la cellule.
Limite des thérapies de l’autophagie :
Ces molécules pharmaceutiques non spécifiques de l’autophagie : elles ont un effet sur le
métabolisme du glucose, la prolifération… Leur utilisation s’accompagne de nombreux effets
secondaires.
E) Méthodes d’étude de l’autophagie
-
Microscopie électronique = profil caractéristique de l’autophagie, correspondant à
l’accumulation de vésicules autophagiques dans la cellule. (+++ observé en présence d’un
activateur autophagique)
-
Immunomarquage de la protéine LC3 in situ par un AC fluorescent. Comme précisé
au-dessus, LC3-1 est présent dans le cytoplasme et se « transforme » en LC3-2 lorsque la
cellule autophagie, lorsqu’il se lie à la membrane de l’autophagosome.
DONC :
Cellule à l’état basal = LC3 homogène dans l’ensemble du cytoplasme.
Induction de l’autophagie = LC3 concentré au niveau des autophagosomes.
-
Western Blot : pour évaluer les taux de LC3-1 et LC3-2.
Cellule à l’état basal = LC3-1+++
Induction de l’autophage = LC3-2 +++
-
Modification transgénique des cellules souches ou in vivo chez les souris : introduction
d’un transgène synthétisant une protéine chimérique : GFP-LC3. Etant donné que la GFP
est fluorescente, la protéine chimérique permet de suivre la LC3 au sein de la cellule. Son
accumulation se fera au niveau des autophagosomes en cas d’induction d’autophagie
(par manque de nutriments notamment = stress nutritif).
Evaluation du statut du flux autophagique
But : déterminer si l’autophagie n’est pas bloquée à un stade donné
Principe : le LC3-2 lié à l’autophagosome va être dégradé par les enzymes protéolytiques au
moment où l’autophagosome fusionne avec le lysosome. Donc une accumulation de LC3-2
témoigne d’un blocage du flux au niveau de la fusion autophagosome / lysosome.
Donc une augmentation de LC3- 2 est liée soit à une induction de l’autophagie soit à un blocage
de l’autophagie dans les étapes tardives.
De la même façon, la protéine P62 (et son cargo), incorporée dans les autophagosomes et
détruite par les enzymes lysosomales, s’accumule lors du blocage de la fusion autophagosome /
lysosome.
Cette protéine P62 est un marqueur de l’autophagie.
Donc :
Diminution P62 = autophagie importante (protéine aussitôt dégradée par la fusion
autophagosome/lysosome).
Accumulation P62 = fusion autophagosome/lysosome bloquée.
F) Physiopathologie de l’autophagie
a) Autophagie et obésité
La lipophagie correspond à l’autophagie spécifique des vésicules lipidiques, dans le foie et le
tissu adipeux notamment.
-
Rôle dans le foie :
Expérience : on administre un régime riche en lipides à une souris incapable d’autophagie. Celleci développe un foie stéatosique (=foie riche en lipide), qui peut se développer en carcinome
hépatocellulaire (HCC).
NASH= stéato-hépatite non alcoolique
Le rôle de l’autophagie dans le risque de HCC est actuellement à l’étude.
-
Rôle dans le tissu adipeux :
Il existe 2 types de tissus adipeux :
. TA blanc = responsable du stockage de lipides dans des vésicules lipidiques (adipocytes
monovésiculés).
. TA brun = responsable de la thermogénèse (adipocytes multivésiculés).
Expérience de KO ATG : chez les souris capables d’autophagie, on observe beaucoup de TA blanc,
tandis qu’il y a plus de TA brun chez les souris incapables d’autophagie. ! contre-intuitif
Cela s’explique par le fait que l’autophagie favorise la différenciation des adipocytes en TA blanc,
responsable du stockage des graisses
Conclusion sur le double rôle de l’autophagie :
L’activité autophagique semble être augmentée chez les personnes obèses.
Il n’y a pas de relation simple entre autophagie et perte de poids : si on induit l’autophagie pour
diminuer la stéatose et donc renforcer la lipolyse hépatique, on entraîne un développement de
TA blanc.
= le traitement « simple » n’est pas satisfaisant.
b) Autophagie et immunité
La xénophagie correspond à la dégradation des éléments pathogènes par autophagie.
Déclenchement de l’immunité adaptative :
Les produits issus de cette dégradation vont ensuite être recyclés, chargés sur le complexe CMH
(complexe majeur d’histocompatibilité) et présentés à la surface de la cellule pour stimuler
l’immunité adaptative par la présentation de l’antigène.
Inhibition de l’immunité innée :
L’autophagie est capable d’inhiber l’immunité innée, responsable de l’inflammation.
En effet, lors d’une infection, la mitochondrie a pour rôle d’activer une cascade inflammatoire.
C’est ce qui correspond à l’immunité innée.
Or certains virus activent dans le même temps l’autophagie mitochondriale, ou mitophagie. La
mitochondrie est alors dégradée et la voie inflammatoire est inhibée.
Exemple du virus oncolytique (= qui induit la mort des cellules cancéreuses)de la rougeole : ce
mécanisme est particulièrement intéressant dans le sens où beaucoup de gens ont été
atteints/vaccinés contre ce virus, l’inhibition de l’immunité liée représente donc un atout
important pour l’efficacité oncolytique de la souche.
Manipulation de l’autophagie selon le pathogène :
Différents virus et bactéries ont des stratégies pour modifier l’autophagie :
- pour ne pas en être détruit
- pour l’utiliser en leur faveur.
Par exemple, l’Helicobacter Pylori, normalement dégradé par autophagie dans les cellules
épithéliales de l’estomac, va au contraire dans les cellules souches de l’estomac profiter de
l’autophagie pour induire un cancer.
Donc : la manipulation de l’autophagie pour contrer les pathogènes se fait au cas par cas.
c) L’autophagie dans le développement embryonnaire
Lors de la fécondation, l’autophagie est responsable de la dégradation du spermatozoïde,
appelée allophagie. Cet effet est observé par l’accumulation de LC3 au niveau du flagelle du
spermatozoïde, indiquant une activité autophagique.
L’autophagie est responsable du développement des glandes salivaires chez la drosophile.
d) L’autophagie : un processus anti-âge ?
Le vieillissement est un processus continu à plusieurs causes :
-
Diminution du renouvellement cellulaire (raccourcissement des télomères).
-
Diminution du renouvellement des organelles (ex : vieillissement des
mitochondries).
-
Réduction de la protéostase (accumulation des agrégats protéiques)
-
Oxydation des biomolécules (qui peut entraîner une perte de fonction des protéines,
une augmentation de leur toxicité ou un endommagement de l’ADN, nucléaire et
mitochondrial).
-
Inflammation
Rôle de l’autophagie dans le vieillissement :
Expérience : les souris à régime sous restriction calorique ont une durée de vie plus longue que
les souris à régime normal.
Rappel : les nutriments activent la voie mTOR
On a donc supposé qu’une inhibition de mTOR (=l’effet d’une restriction calorique) et donc
l’activation de l’autophagie augmente la durée de vie.
Observations lors de l’utilisation d’inhibiteurs de mTOR / activation de l’autophagie :
-
La durée de vie des organelles est augmentée.
-
L’autophagie diminue avec l’âge, ce qui contribue à l’accumulation d’agrégats
protéiques et donc au vieillissement des tissus.
L’autophagie augmente la durée de vie.
Pharmacologie de l’augmentation de la durée de vie :
-
La spermidine permet l’augmentation de la durée de vie chez les levures
-
La rapamycine, un inhibiteur de mTOR contribue à l’augmentation de la durée de vie de
façon significative chez la souris.
Tous les mécanismes ciblent l’effet antioxydant pour ralentir le vieillissement :
-
Elimination d’agrégats protéiques toxiques
-
Elimination de la lipofuschine au niveau de la peau, des reins, de la rétine, des muscles et
du cœur.
-
mitophagie (dégradation des mitochondries endommagées).
e) Autophagies et maladies neurodégénératives :
Les protéinopathies neurodégénératives correspondent à une accumulation d’agrégats
protéiques cytotoxiques qui contribuent à la mort des neurones.
Par exemple, la maladie d’Alzheimer correspond à l’accumulation du peptide béta-amyloïde.
La maladie de Parkinson correspond à l’accumulation de l’alpha-synucléine.
Altérations génétiques de l’autophagie dans les maladies neurodégénératives : Beclin-1 ou
mTOR et Huntington, P62 et ALS (Sclérose Latérale Amyotrophique), mitophagie et Parkinson
Aussi preuves histologiques : Alzheimer et accumulation d’autophagosomes
Le rôle de l’autophagie dépend du stade de la maladie.
Une autophagie FAVORABLE à l’inhibition des maladies dégénératives :
Observation : dans la maladie de Parkinson, les autophagosomes s’accumulent dans les
neurones, le flux autophagique est inhibé (les autophagosomes n’allant pas jusqu’à fusionner
avec les lysosomes pour dégrader les agrégats protéiques).
On en déduit que l’autophagie contribue à la dégradation d’agrégats protéiques des maladies
neurodégénératives. Un traitement serait donc de « débloquer » le flux autophagique.
Expérience 1 : chez les souris capables de reproduire la maladie d’Huntington, si on induit une
autophagie en utilisant un analogue de la rapamycine (CCI-779), on observe une diminution
d’agrégats protéiques.
Expérience 2 : on utilise des drogues qui restaurent le flux autophagique dans la maladie de
Parkinson. La fusion entre l'autophagosome et le lysosome est inhibée par l'oxyde nitrique
produit au cours de la maladie, on utilise donc un inhibiteur, le L-NAME, qui diminue la quantité
d'agrégats d'alpha-synucléine par restauration du flux autophagique.
Une autophagie DEFAVORABLE à l’inhibition des maladies dégénératives :
Dans la maladie d’Alzheimer le peptide bêta-amyloïde se développe dans les autophagosomes et
est également capable de bloquer la fusion lysosome/autophagosome, ce qui conduit à
l’accumulation des autophagosomes.
Expérience 1 : inhibition de l’autophagie par la 3 méthyl adénine = diminution de la production
du peptide bêta-amyloïde.
Expérience 2 : activation de l’autophagie par la rapamycine = augmentation de la production du
peptide bêta-amyloïde.
Donc : dans ce cas-là, l’activation de l’activité autophagique est délétère.
f) La dualité de l’autophagie dans le cancer :
Rôle double et contraire de l’autophagie : promotion et inhibition du cancer.
Autophagie pro-tumorale :
Lors d’un marquage au GFP-LC3 d’une tumeur, on observe que les bords de celle-ci sont
dépourvus d’autophagie (LC3 diffuse dans le cytoplasme) alors que des autophagosomes se
forment en son centre (LC3 concentré au niveau des autophagosomes).
Ceci s’explique par le fait que le centre de la tumeur n’a pas accès aux nutriments :
l’autophagosome va lui permettre de survire au stress nutritif. L’autophagie a donc un effet antiapoptotique, donc oncogène.
Autophagie anti-tumorale :
Observation 1 : dans 40 à 75% des cancers chez l’homme (sein, ovaires, prostate), il existe une
délétion mono-allélique de Beclin-1, gène essentiel à la formation des autophagosomes.
Observation 2 : beaucoup de protéines oncogènes (PI3K classe 1, mTOR, Bcl-2) inhibent
l’autophagie et beaucoup de gènes suppresseurs de tumeur (P53, PTEN) activent l’autophagie.
Observation 3 : l’autophagie peut contribuer à la mort cellulaire, par blocage des étapes tardives
du flux autophagique ou mitophagique.
Observation 4 : la délétion des gènes ATG5 ou ATG7, gènes nécessaires à la formation des
autophagosomes favorise le développement de multiples tumeurs.
Observation 5 : les espèces oxydantes, ROS (radicaux oxygénés) provoquent des mutations dans
l’ADN qui entraînent l’apparition de cancer. L’autophagie joue un rôle d’inhibition (via P62)des
mécanismes de stress métabolique qui produisent les ROS.
On peut donc penser que l’absence d’autophagie favorise le développement de cancers.
Explication de l’action double de l’autophagie
Dans les étapes précoces de l’oncogenèse, il y a une inhibition de l’autophagie.
Donc : augmentation des ROS = instabilité génomique = progression tumorale.
Dans les étapes tardives de l’oncogenèse, les cellules au centre de la tumeur sont en stress
nutritif et en hypoxie, donc réactivent l’autophagie.
= dichotomie temporelle
Mais l’inverse est également possible, cela dépend de la nature de la tumeur.
Exemple de cancers très prolifératifs, comme les leucémies :
Du fait de cette prolifération, la
tumeur atteint rapidement une taille
qui la soumet au stress nutritif ->
activation de l’autophagie dans une
premier temps.
Dans un second temps, comme il faut
acquérir des mutations pour
progresser dans l’oncogenèse, il y a
une sélection des cellules capables
d’inhiber l’autophagie.
Mécanisme d’action de l’autophagie controversé dans la mort cellulaire induite par les
chimiothérapies
- Le rôle de l’autophagie (pro-survival or pro-death) dépend du cancer et de la molécule utilisée.
- Résistance au stress métabolique chimio-induit :
Les anti-angiogéniques, comme l’avastin, en diminuant la vascularisation, diminuent les apports
en nutriments et en oxygène.
L’autophagie, en résistant au stress nutritif et à l’hypoxie, résiste donc aux effets de l’avastin.
Les stratégies anti-angiogéniques ne sont donc vraiment efficaces que si elles sont combinées
avec un inhibiteur de l’autophagie.
- La mort avec autophagie :
L’autophagie contribue à la mort cellulaire mais n’est pas un mécanisme de mort cellulaire en
tant que tel. Plutôt à considérer comme un mécanisme de survie en conditions de stress.
- Stimulation de la mort cellulaire par les inhibiteurs du flux autophagique
(colchicine, chloroquine, acide bétullinique…) :
Si on bloque l’autophagie à des étapes tardives, on a un effet cytotoxique.
En effet, on pense que l’absence de digestion des autophagosomes, qui grossissent alors, finit par
conduire à leur perméabilisation et donc au relargage de protéines lysosomales dans le
cytoplasme, entrainant apoptose ou nécrose.
L’inhibition du flux autophagique est donc plutôt favorable aux chimiothérapies. Beaucoup
d’études actuelles utilisent la chloroquine (ou son dérivé l’hydroxychloroquine) en combinaison
avec des agents chimiothérapeutiques classiques. Les premiers résultats suggèrent l’effet
potentialisateur de la chloroquine.
Attention : la chloroquine a 2 types d’effets : le blocage du flux autophagique et la
perméabilisation des lysosomes. Son effet cytotoxique est donc possiblement lié à ces deux
actions.
- Exemple du rôle de la mitophagie dans la mort cellulaire :
Une mitophagie modérée conduit plutôt à une
résistance à l’apoptose tout en permettant une
production d’énergie suffisante.
Une mitophagie trop importante va elle aussi
permettre une résistance à l’apoptose mais la
production d’énergie sera insuffisante et
provoquera une mort cellulaire nécrotique.
La mitophagie, selon son intensité, peut donc déplacer une mort cellulaire par apoptose en
nécrose. Cela peut donc avoir des conséquences délétères lors d’un traitement, la mort
nécrotique étant plus inflammatoire que la mort apoptotique.
II.
PHYSIOPATHOLOGIE DES PROCESSUS DE MORT
CELLULAIRE
Objectifs :
- définir les différents types de mort cellulaire
- connaitre les cibles thérapeutiques qui modulent l’apoptose
- se familiariser avec les stratégies thérapeutiques exploitant la mort cellulaire
Définition : La mort cellulaire correspond à l’ensemble des processus régulés
d’autodestruction cellulaire.
- « Ensemble » de processus puisqu’il existe plusieurs types de morts cellulaires que nous allons
détailler.
-« régulés » puisqu’ils obéissent à des voies de signalisation (=programme moléculaire)
- « d’autodestruction cellulaire » puisque ce sont des morts induites de manière intrinsèques
(=«suicide »)
Deux obstacles majeurs ont ralenti au fil du XXème siècle les recherches effectuées sur le sujet :
- obstacle de type technologique (techniques, marqueurs, tests)
- obstacle conceptuel (« mort cellulaire nécessaire à la vie »).
Carl Vogt avait remarqué que certaines structures disparaissaient de manière systématique
pendant l’embryogénèse du crapaud. On a retrouvé ce phénomène chez l’humain lors de la
formation des mains avec perte des cellules composant les membranes interdigitales par
apoptose. Aussi dans la différenciation sexuelle. On peut qualifier ce processus de résorption
d’ « échafaudages » nécessaires à la mise en place de structures spécifiques.
La mort cellulaire programmée joue donc un rôle dans le développement des organismes.
Elle est aussi impliquée dans tout un tas de processus : concept de « contrôle social » des
cellules, sauvegarde de l’espèce ou de l’organisme au-delà de la cellule unique (on parle de «
mort altruiste »).
Exemple de contrôle des ressources : le dictyostelium (organisme unicellulaire) qui, en
condition de stress nutritif, se met à coopérer avec une tige de cellules mortes et unspore de
cellules vivantes pour former un arbre de fructification, on a donc une partie des cellules qui
meurent pour permettre la propagation de l'espèce.
Exemples du contrôle du territoire :
-par le module poison/antidote bactérien: certaines bactéries peuvent produire un poison qui
va leur permettre d’éliminer les autres bactéries sur le territoire favorisant ainsi leur propre
prolifération.
En revanche ces mêmes bactéries vont en parallèle synthétiser l’antidote pour les immuniser (et
donc ne pas risquer de se tuer elles-mêmes).
-par l’intermédiaire des récepteurs à dépendance, (ex des récepteurs DCC) qui sont capables
d'induire la survie des cellules lorsque leur ligand (Netrin-1 pour les RDCC) est présent.
Au contraire, l’apoptose est induite en l’absence du ligand, par association entre DCC et la
caspase 9.
Ce récepteur contrôle non seulement la taille de la population cellulaire (induction survie ou
apoptose) mais aussi la spécificité cellulaire car le ligand est spécifique à certains tissus et
permet donc de diriger l'expansion tissulaire (ex axones neuronaux).
Il existe différents types de mort cellulaire que l'on reconnaît par la morphologie cellulaire qui
leur est associée :
- l'apoptose est une mort qualifiée de ''propre'' : la cellule reste arrondie avec la formation de
corps apoptotiques et conservation de l’intégrité membranaire mais en revanche dégradation
de l’ADN par compaction et fragmentation (ATTENTION : faute sur le schéma). La cellule morte
sera ensuite dégradée par les macrophages.
- la nécrose se caractérise par une cellule « explosée » car la membrane cytoplasmique se
perméabilise, d'où un rejet du contenu dans le milieu extracellulaire, ce qui induit une
inflammation.
On rappelle que l’autophagie ne constitue pas en soi une mort cellulaire.
Il est important de noter que toutes ces morts cellulaires interagissent entre elles du fait que
leurs voies de signalisation et de régulation se « croisent ».
Attention : on a longtemps considéré que l’apoptose correspondait à une mort anti
inflammatoire contrairement à la nécrose mais aujourd’hui ce consensus est controversé.
QUESTIONS :
a) La mort cellulaire contribue au développement des organismes pluricellulaires
b) La mort cellulaire est observable chez les organismes unicellulaires
c) Il existe des connections entre les différents types de mort cellulaires
d) L’apoptose se caractérise par une perméabilisation de la membrane cytoplasmique :
a)Vrai b)Vrai c)Vrai d)Faux
A) Apoptose
La mort par apoptose repose sur une balance entre signaux de survie et de mort.
Cinétique de l’apoptose :
1/ phase d’intégration : il existe dans la cellule des signaux de survie et des signaux de mort. Il
y a une balance qui s’établit et si les signaux de mort sont plus nombreux, alors il y a exécution
de l’apoptose.
2/ Les acteurs de l’apoptose sont les caspases, des protéases qui dégradent un ensemble de
substrats dans la cellule. On distingue les caspases initiatrices (caspases 2,8, 9 et 10) des
exécutrices (3 et 7) qui permettent le démantèlement cellulaire. Par ailleurs leur activation
nécessite le clivage des procaspases.
En bonus une vidéo psyché sur l’apoptose :
www.wehi.edu.au/education/wehitv/apoptosis_and_signal_transduction/
Il existe trois voies d’activation :
→la voie extrinsèque via un récepteur de mort cellulaire(R FAS) avec le signal FASL (son
ligand), qui forme un complexe multi-protéique que l'on appelle le DISC et qui suite à une
cascade de signalisation aboutit au recrutement de la caspase 8.
→ la voie intrinsèque via la perméabilisation de la membrane mitochondriale avec relargage de
molécules pro apoptotiques telle que le cytochrome c qui va induire la formation de
l'apoptosome et le recrutement des procaspases 9 qui vont activer les caspases 3 à 7
→à partir du noyau par le piddosome (intervention de la caspase 2)
La mitochondrie joue un rôle central dans l'apoptose, puisqu’elle contient des facteurs proapoptotiques dans son espace inter-membranaire, dont :
→ Le cytochrome C qui participe à la formation de l'apoptosome, servant à activer les caspases
→ Des protéines telles que Smac/diablo et Omi/Htra, qui sont des inhibiteurs des IAP(Inhibitor
of ApoptosisProtein), eux-mêmes inhibiteurs des caspases.
→ Les nucléases EndoG et AIF.
La mitochondrie possède donc un rôle pro-apoptotique.
La régulation de la mitochondrie est soumise aux protéines de la famille Bcl-2, dans laquelle on
trouve des membres anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-XL,Mcl-1 qui bloquent Bax et Bak, et
des membres pro-apoptotiques, soumis à la régulation de BH3, tels que Bax et Bak, qui vont
perméabiliser la membrane mitochondriale ou encore des protéines telles que Bad, Puma,
Noxa, Bid et Bim, qui inhibent des protéines anti-apoptotiques.
Bax et Bak vont permettre la perméabilisation mitochondriales par perforation de cette
membrane ou par l’induction de l’ouverture du pore de perméabilité transitoire (mPTP).
Techniques d’étude :
- En MO : morphologiquement, on peut observer un « bouillonnement » de la membrane et la
formation de corps apoptotiques.
- Microscopie à fluorescence : on observe les noyaux grâce au HOESCHT, un intercalant de l’ADN
fluorescent sous UV. Le noyau d’une cellule apoptotique est PICNOTIQUE, on peut observer
des clusters bleus. A distinguer de l‘aspect condensé de celui de la cellule nécrotique.
- Immuno-marquage : on observe s’il y a présence du cytochrome c au sein du cytoplasme ou
encore si BAX est activé (Ac spécifique).
- WB : détection de l’activation des caspases
B) Nécrose
On pensait que ce processus était non régulé, inflammatoire et accidentel.
Cependant on sait aujourd’hui qu’il existe non seulement plusieurs types de nécroses mais qu’en
plus certains d’entre eux sont régulés (on parle alors de nécroptose).
La nécroptose peut être induite au niveau de la membrane cytoplasmique par des récepteurs
de mort cellulaire, capables d'induire l'apoptose aussi.
En absence de caspase 8, c’est le complexe protéique du nécrosome qui tend à se former. On
peut donc avoir les deux types de mort cellulaire à partir du même récepteur. Mais la
nécroptose se produit lorsque les voies de l'apoptose sont réprimées et de la même façon
l'apoptose inhibe la nécroptose.
C) Implication pathologique de la mort cellulaire et stratégie
thérapeutique
La mort cellulaire est impliquée dans le développement embryonnaire et l’homéostasie (taille
des tissus, renouvellement cellulaire et spécificité tissulaire).
Tout excès ou défaut de mort cellulaire est cause de pathologie.
On trouve un excès dans le SIDA ou les maladies neurodégénératives, et un défaut dans des
maladies auto-immunes ou le cancer.
Aujourd'hui, il existe un grand nombre de molécules chimiques qui permettent de réguler,
induire ou réprimer l'apoptose à différents endroits.
Pour faire un traitement ciblé, on utilise une fenêtre thérapeutique qui est guidée par la balance
entre les protéines pro et anti apoptotiques.
Si on augmente la charge de protéines pro-apoptotiques ou si on diminue la charge des
protéines anti-apoptotiques, on va se retrouver avec un état sensibilisé que l'on observe dans
les leucémies par exemple. Et il existe un seuil que si l’on franchit mène à l’induction de
l’apoptose.
Questions :
a) L’apoptose peut être induite de façon extrinsèque ou intrinsèque à la cellule.
b) La mitochondrie contient des facteurs anti-apoptotiques dans son espace intermembranaire.
c) La nécrose est une mort cellulaire toujours accidentelle.
d) Les voies apoptotiques ne sont pas « droguables » .
e) La balance entre les protéines de la famille BCL2 détermine les fenêtres thérapeutiques
exploitant l’apoptose.
a)Vrai b) Faux c)Faux d) Faux e)Vrai
Maladies neurodégénératives et mort cellulaire
Le rôle de l'apoptose est très controversé dans ces maladies, car on a des résultats post-mortem
qui indiquent que dans certains cas, on a des cellules apoptotiques, alors que dans d'autres non.
Cela s’explique notamment par le fait que les cellules mortes sont rapidement phagocytées par
les macrophages. On se trouve aussi face à des limitations techniques : en effet, les marquages
histologiques sont peu discriminants de l’apoptose.
Modèles animaux :
Suite à une invalidation du gène Bax (pro apoptotique) on observe une persistance de tissu
neuronal. On pense donc que l'apoptose intervient bien dans la mort cellulaire induite par les
maladies neurodégénératives.
=> L’alpha-synucléine, (maladie de Parkinson) induit l'apoptose en inhibant la chaîne
respiratoire dans la mitochondrie, ce qui entraîne la production de ROS. Cela induit une
perméabilisation membranaire mitochondriale, avec relargage du cytochrome C menant à
l’induction de l’apoptose.
- Pourquoi la piste thérapeutique de la mort cellulaire est-elle peu exploitée ?
On a voulu pendant longtemps inhiber la mort cellulaire des neurones, mais les résultats sont
controversés chez l'homme et on est confronté à l’obstacle du passage de la barrière
sang/cerveau. De plus, l'inhibition de la mort cellulaire de façon prolongée peut favoriser
l'apparition de cancers. Dans tous les cas, la protection vis à vis de l'apoptose n'est pas totale car
il existe un passage possible de la voie de l'apoptose vers celle de la nécrose, ce qui s'observe
lors d'une inhibition par la rasagiline (qui inhibe l'ouverture du PTP).
SIDA et mort cellulaire
Lors de l’infection des lymphocytes T CD4 par le HIV, le virus se reproduit à l'intérieur de ces
cellules et induit la mort cellulaire par apoptose. Mais chez certains, on trouve un virus dormant
qui a tendance à inhiber l'apoptose.
Plusieurs possibilités de thérapies :
1) On peut envisager l’inhibition de l'apoptose des lymphocytes affectés afin de préserver le
système immunitaire, mais les virus continuent alors de se répliquer. Une thérapie
antirétrovirale (ART) est alors nécessaire pour limiter cette réplication.
Le patient sera donc TOUJOURS infecté et aura un traitement à vie, ce qui est insuffisant, et
extrêmement coûteux (30 000 euros par an).
2) On peut aussi induire la mort cellulaire dans toutes les cellules infectées. Le patient est donc
en immuno-déficience, mais on reconstitue par la suite le système immunitaire, par
transplantation de moelle osseuse (et avec prise d’un traitement immunosuppresseur pour
éviter le rejet de greffe).
Le patient ne sera alors plus porteur du virus.
Ce type de stratégie a déjà été effectué, un patient qui avait aussi une leucémie, fut traité et
possède depuis 2009 ans un virus indétectable et ce sans thérapie rétro-virale.
1. phase de destruction avec radiations et chimiothérapies
2. mort cellulaire immunitaire => immunodéficience
3. transplantation de cellules souches de moelle osseuse => reconstruction de son système
immunitaire.
Le problème de cette stratégie est le fait de trouver un donneur compatible.
Mort cellulaire et maladies auto immunes
Seuls les lymphocytes capables de reconnaitre le CMH survivent = sélection positive.
Les lymphocytes qui reconnaissent un antigène du soi sur les dendrocytes sont détruits =
sélection négative.
A priori, la signalisation apoptotique serait compromise dans les lymphocytes T auto immuns :
d’une part lors de la sélection dans le thymus et d’autre part au moment de la contraction
(régression) du système immunitaire après l’infection.
Chez des souris KO pour les gènes BAX et BAK, il y aurait développement de maladie auto
immunes… Idem pour des souris avec surexpression de Bcl-2.
Il existe des traitements expérimentaux par des mimétiques des BH3-only qui viennent inhiber
les protéines anti-apoptotiques.
Questions :
a) L’inhibition de l’apoptose est une option thérapeutique durable dans les maladies
neurodégénératives
b) Les chimiothérapies cytotoxiques peuvent être appliquées au traitement du VIH
c) L’apoptose n’intervient qu’au cours de la sélection positive des thymocytes dans la zone
corticale du thymus
d) Les mimétiques de BH3 pourraient être exploités pour bloquer l’apoptose dans les
cellules immunitaires auto-immunes
a)Faux b)Vrai c)Faux d)Faux(c’est l’inverse, elles permettent de débloquer l’apoptose)
Mort cellulaire et cancer
Cette figure récapitule toutes les conditions nécessaires aux cellules cancéreuses.
L'apoptose constitue une barrière importante face au cancer.
Les signaux de mort induits par le cancer au cours de l'oncogenèse (sur-prolifération cellulaire,
limitation du facteur trophique, stress métabolique et hypoxique, immunogénicité, contraintes
rhéologiques (déformation, écoulement)) sont largement supérieurs aux signaux de survie.
Cependant, le cancer va quand même réussir à progresser et éviter la mort cellulaire, et ce :
- en sur-activant les voies de survie (ex : la voie Akt/mTor dans le glioblastome)
- en activant des voies anti-apoptotiques (ex : surexpression de Bcl-2 dans la leucémie de
Burkitt)
- ou encore en inhibant les voies pro-apoptotiques (ex : mutation de Bax dans le cancer du
côlon).
Des essais thérapeutiques ont été entrepris: pour activer la mort cellulaire, on peut donc :
-supprimer les voies de survie notamment par l’utilisation de la herceptine (AC -inhibition du
récepteur HER) qui est un anticorps utilisé dans le cancer du sein
- utiliser des inhibiteurs des PI3kinase qui vont permettre l'inhibition d'Akt.
- inhiber les inhibiteurs de l'apoptose (ex des IAP)
- activer les récepteurs de mort (ex Trail)
Mais, toutes ces thérapies ne peuvent fonctionner pour tous les cancers, on va donc les
sélectionner par la caractérisation de la tumeur au niveau génomique et protéique. Médecine
personnalisée => qui exploite à la fois les données de la biologie moléculaire et celles
génomiques et protéiques du patient.
Ancien vs nouveau consensus dans les traitements anticancéreux : au début, pour soigner le
cancer, on pensait à une molécule très active et très spécifique. Mais ce consensus a été oublié.
On penche aujourd’hui vers des thérapies combinatoires afin que les molécules se potentialisent
ou pour activer différentes voies en même temps.
Attention il est important de noter que la séquence d’utilisation de ces molécules (donc dans le
contexte d’une thérapie combinatoire) est primordiale :
Par exemple dans le cadre d’une thérapie combinatoire :
- Inhibiteurs de PI3k (inhibition des voies de survie par blocage de la protéine Akt) + traitement
par radiothérapie (dommages à l’ADN qui vont activer BCL 2 et favoriser la mort cellulaire) :
- Or la quantité de dommage à l’ADN est proportionnelle à la capacité proliférative des cellules
(plus il y aura de prolifération, plus il y aura de dommage et plus il y aura stimulation de p53)
- En utilisant les inhibiteurs de PI3k, on réprime la protéine Akt qui est aussi impliquée dans la
progression du cycle cellulaire. On diminue alors la quantité de dommage faite à l’Adn avec la
radiothérapie.
- Il est donc plus logique de faire la radiothérapie dans un premier temps, afin de causer un
maximum de dommages à l’ADN pour ensuite causer la mort cellulaire grâce aux inhibiteurs de
PI3K.
La mort cellulaire immunogénique dans la thérapie anti-cancéreuse
Durant un moment, le rôle du système immunitaire a été négligé dans le cancer.
Cependant des modèles expérimentaux permettent désormais l’émergence du concept de
surveillance immunologique dans le cancer.
- Des souris immuno-déficientes à qui l’on injecte des cellules tumorales développeront plus de
tumeurs que des souris immuno-compétentes.
- Réponse abscopale (= à distance de la cible) à la radiothérapie ou à la thérapie
photodynamique : des zones tumorales non irradiées sont résorbées après une radiothérapie
localisée à un autre endroit. Le système immunitaire a donc été activé après la radiothérapie.
- Corrélation entre pronostic et infiltration des tumeurs par le système immunitaire : de manière
générale la présence de lymphocytes Treg est associée à un mauvais pronostic contrairement à
la présence de lymphocytes CD8 ou TH1.
- Régression tumorale plus efficace chez la souris immunocompétente que chez la souris
immuno-déficiente après traitement.
- Rupture de la tolérance tumorale par la mort cellulaire immunogénique :
certaines thérapies – celles à base d’anthracyclines - sont capables d’entrainer une apoptose
immunogénique des cellules cancéreuses -> activation des cellules dendritiques qui activent
elles-mêmes les lymphocytes CD4+ et CD8+ qui contribuent à l’élimination des cellules
cancéreuses et ainsi de suite.
Quand on traite les cellules avec un traitement immuno-thérapeutique ou immuno-génique, on
va induire une mort immunogène avec comme caractéristiques la présence de signaux de
phagocytose « eat me » ou encore la production de signaux de danger (DAMPs).
Trois stratégies (hypothétiques) pour l’homme :
1) résection tumorale puis chimiothérapie ou radiothérapie ex-vivo pour induire la mort
cellulaire et enfin réinjection des cellules mortes immunogéniques chez l’individu.
2) prélèvement puis éducation ex-vivo / in-vitro des cellules dendritiques à réinjecter une fois
chargées en antigènes tumoraux
3) immunisation endogène avec un traitement immunogénique directement sur l’homme
Questions :
a) Le stress oncogénique est généralement contrebalancé par l’inhibition des voies de mort
cellulaire dans le cancer
b) Les traitements combinatoires cytotoxiques ne sont pas affectés par la séquence des
traitements
c) L’apoptose est strictement non immunogénique
d) Il existe un type de mort cellulaire pro-inflammatoire anti-cancéreuse
e) Non traité
f) Le pronostic du cancer est corrélé à la qualité de l’infiltrat immunitaire dans la tumeur
g) Seules les radiothérapies peuvent induire une mort immunogène
h) La mort cellulaire immunogène dépend de l’émission non-séquentielle de signaux
immunogènes
a)Faux b)faux c)faux d)faux f)faux g)faux h)vrai
FICHE RECAPITULATIVE
AUTOPHAGIE
= processus régulé d’autodégradation
vésiculaire et de recyclage des constituants
intracellulaires et exogènes
- Inhibée par les signaux de survie
(nutriments, facteurs de croissance) :
PI3Kinase de classe 1, Akt et mTOR inhibent
la formation de complexes responsables
de l’autophagie (ATGs; Beclin-1/PIKinase
de classe 3)
- Activée par les signaux de stress (ROS,
AMPc…) qui lèvent l’inhibition formée par
PI3Kinase de classe 1, Akt et mTOR.
Molécules pharmaceutiques non spécifiques
de l’autophagie, problèmes d’effets
secondaires.
--- Implications physiologiques et
pathologiques de l’autophagie :
Obésité : pas de relation simple : si on
induit l’autophagie pour diminuer la
stéatose, on entraîne un développement de
TA blanc.
Immunité :
-Déclenchement de l’immunité
adaptative par recyclage et présentation de
l’antigène à la surface de la cellule
- Inhibition de l’immunité innée par
mitophagie
Maladies neurodégénératives : rôle qui
MORT CELLULAIRE
-- nécrose : perméabilisation
membranaire -> rejet du contenu dans le
MEC-> inflammation
-- apoptose : intégrité membranaire et
dégradation de l’ADN
- voie extrinsèque : FASR + FASL -> DISC ->
caspase 8)
- voie intrinsèque : cytochrome c ->
apoptosome -> procaspases 9 -> caspases
3, 7
- piddosome (caspase 2)
- IAP = inhibiteurs de caspases
- inhibiteurs d’IAP : Smac/diablo et
Omi/Htra
anti-apoptotiques : Bcl-2, Bcl-XL,Mcl-1
pro-apoptotiques : Bax, Bak, Bad, Puma,
Noxa, Bid et Bim,
--- Stratégies thérapeutiques exploitant la
mort cellulaire :
Maladies neurodégénératives: peu exploitée
SIDA :
- inhibition de l'apoptose des lymphocytes
affectés + thérapie antirétrovirale
- immuno-déficience provoquée puis
transplantation de moelle osseuse
Maladies auto immunes : inhibition de
protéines pro-apoptotiques par des
dépend du stade de la maladie et de la
maladie elle-même
traitements expérimentaux par des
mimétiques des BH3-only
Cancer : rôles pro-tumoral par la résistance
Cancer :
- inhibition des voies de survie : herceptine
ou inhibiteurs des PI3kinase
- inhibition des IAP
- activation des récepteurs de mort
- thérapie combinatoire avec radiothérapie
aux stress nutritifs et hypoxiques et antitumoral par la protection contre l’instabilité
génomique
Mort cellulaire : inductrice ou inhibitrice,
dépend du contexte cellulaire, de la durée
et de l’intensité de l’activité autophagique.
PUIS inhibiteurs de Pl3k
- thérapies immunogéniques