Complexes de pré-réplication et post

Complexes de pré-réplication et post-réplication
Cours du 02 Octobre 2008 : SK4
Complexes de pré-réplication : ORC & Cdc6
Complexes de post-réplication : ORC
Une autre équipe a fait des mutagénèses avec EMS. Et ils s'intéressent directement au phénotype
Cdc.
Il constate un arrêt CDC des cellules en phase S à 38 degrés avec une instabilité mitotique.
Isolement du gène par complémentation.
Banque de plasmides => transformations => sélection des levures => isolement des
suppresseurs de phénotype arrêt de phase S.
Isolement des gènes Mcm 2, 3, 4, 5.
Homologie de séquence des protéines mcm.
On trouve un abdomen de utile sont communs à l’ATP. On ne peut pas échanger une
protéine ou gène mcm avec un autre. Sur le schéma, en gris clair : homologie des séquences avec les
eucaryotes supérieurs.
Recrutement des mcm sur la chromatine.
En mitose, on n'a pas de Mcm7 sur la chromatine. Ils ne sont recrutés qu'en phase G1.
On fait une co-imunoprécipitaion de la chromatine pour savoir à quel endroit de la chromatine se
fixent les protéines.
La réversion de pontage (agent dénaturant) va permettre la modification tridimensionnelle des
protéines, qui vont se détacher de l'ADN. On récupère l'ADN double bras. On fait une PCR avec des
amorces et on regarde si oui ou non on a une amplification.
Complexes pré-réplicatif : ORC & Cdc6 <==== Mcm peuvent s’y fixer.
Découverte de Cdt1.
Chez la levure.
On observe une accumulation de cellules en phase G1 dont le milieu en présence de thiamine. Elles
ont le même phénotype que Cdt1. Le recrutement de Mcm4 est très affecté. Pour Cdc6, il y ajuste
une légère diminution. Pour que les Mcm soient recrutées sur la chromatine, il faut du Cdt1.
Découverte de Cdc45.
Ce gène intervient au niveau du complexe initial. En croissant ORC avec Cdc25, les cellules sont
létales. Hypothèse : Cdc45 intervient dans l'initiation de la réplication de l'ADN.
Initiation de la réplication de l'ADN au niveau de l’ARS1.
Cdc45 intervient dans l'initiation de la réplication mise en évidence par gel à deux dimensions.
Recrutement de Cdc45 et Mcm.
Ils font des co-imunoprécipitaion de la chromatine.
En G1 : Cdc45 se lie sur l’ARS1 et 305.
En G2/M : Cdc45 intervient pas sur l’ARS1 et 305.
Recherche de protéines par simple hybride.
Étape numéro 1 : on construit une banque et ont fragmente en très petits morceaux l'ADN. On peut
placer le gène dans le même cadre de lecture et proche du gène Gal4 qui servira d’activateur.
Étape numéro 2 : activation. Cf polycopiés.
On regarde les colonies bleues car celles-ci auront été transformées et auront exprimées une
protéine capable de se lier à l’ARS de manière directe ou indirecte. Puis on analyse la séquence
codante. Ils ont isolé cinq clones correspondant à DBF4
Découverte de Cdc7-DBF4.
Chez le double mutant mcm2-1 DBF4-6, on retrouve une initiation de la réplication à 38 degrés :
DBF4-6 restaure l'initiation de la réplication. Cette kinase interviendrait dans la régulation des mcm.
Chez le système xénope.
On passe un extrait cellulaire sur une colonne qui permet de capter Cdc7. On récupère les protéines
qui sont passées (c'est-à-dire toutes les protéines excepté Cdc7 qui est restée accrochée à la
colonne) : c'est une déplétion. On mélange cet extrait à l'ADN, on centrifuge, on élimine le
surnageant, on sépare les protéines collées à l'ADN puis on fait un western Blot.
On observe que dans l'extrait déplété, Cdc7 et Cdc45 ne se fixent plus à la chromatine.
Rôle des CDK (Cyclines dépendantes kinases).
Cf polycopié : rôle de la kinase Cdc28-Clb5,6.
Le complexe mcm peut former un anneau capable d'encercler de l'ADN simple brin. En note une
activité hélicase pour mcm3, 4 & 7. (Activité très faible) : ce sont les hélicases de la réplication. Le
complexe avec les six sous unités n'a aucune activité hélicases. Cdc45 aurait un lien avec le complexe
mcm et serait le signal de recrutement pour les polymérases...
Après la phosphorylation, il y a une réorganisation du complexe d’initiation en phase S. On passe
alors au complexe post-réplicatif avec l'activité hélicase.
On retrouve exactement les mêmes protéines chez les eucaryotes supérieurs, avec les mêmes
séquences (importantes homologies) ce qu'il n'y a pas d’ARS.
Cdc28-Cln = Cdk2-CycA chez les eucaryotes.
Cdc7-Dbf4 = cdk2-CycE chez les eucaryotes.