1. Techniques du diagnostic direct

Virologie.
METHODES DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
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Intérêt diagnostic :
o Preuve de l’origine virale de l’infection.
o Suivi de l’évolution biologique de l’infection.
o Evaluation de l’état immunitaire d’un patient.
o Appréciation de la réponse vaccinale.
o Eviter la transmission de virus au cours de dons d’organes.
o Etude vu virus en cause et de ses variants.
I. Phase pré-analytique
1. Prescription médicale
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Prescripteur obligatoire.
Patient : nom – prénom – sexe – date de naissance – etc.
Renseignements complémentaires.
But de l’analyse.
Nature des principales manifestations pathologiques :
o Date d’apparition.
o Localisation des lésions infectieuses.
Etat d’immunodépression.
o Pris d’antiviraux, ATB.
o Femme enceinte / date de début de grossesse.
Voyage récent.
Vaccination datée.
2. Exécution du prélèvement
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La fiabilité du diagnostic dépend de la qualité du prélèvement (nécessité de présence de cellules
dans le prélèvement).
Le préleveur doit être clairement identifié : responsable de l’étiquetage des récipients contenant
l’échantillon biologique.
3. Récipients contenant les prélèvements
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Transport dans un sac en plastique.
Prescription jointe dans un compartiment séparé.
4. Moment du prélèvement
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Infection aigue : début des manifestations cliniques.
Infection qui ont des durée d’incubation longue (exemple : hépatite B) : si on prescrit une
recherche d’hépatite B durant cette période d’incubation, elle sera négative car absence
d’anticorps anti-hépatite B.
Mise en évidence d’une primo-infection : période d’incubation habituelle.
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Virologie.
5. Site du prélèvement
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En théorie : toute lésion accessible doit être prélevée.
Utilise de prélever différents sites, correspondant à la porte d’entrée habituelle du virus, et sa
voie d’élimination.
Détection rapide de virus, culture de virus, recherche de génomes viraux (ARN++) : transport
SANS DELAI au laboratoire. Congélation sous 4h du plasma ou sérum.
Mauvaises conditions de transport du prélèvement :
o Risque d’altération des cellules infectées.
o Perte de pouvoir infectieux du virus (cultures faussement négatives).
o Dégradation des génomes viraux (PCR faussement négative, sous-estimation de la charge
virale).
o Risque de prolifération bactérienne ou mycosique.
6. Circonstances justifiant un refus d’analyse par le laboratoire
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Le biologiste est responsable des échantillons biologiques acceptés au laboratoire.
Principales situation de refus :
o Echantillon non étiqueté ou improprement étiqueté.
o Echantillon inapproprié aux analyses prescrites.
o Echantillon reçu dans un récipient endommagé et/ou non étanche.
o Echantillon reçu trop tardivement après avoir été prélevé.
o Echantillon identique à un autre échantillon reçu le même jour.
II. Principes du diagnostic virologique
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Diagnostic direct : mise en évidence du virus.
o De la particule complète.
o D’antigènes viraux.
o De génomes viraux.
o D’une propriété virale.
Diagnostic indirect : mise en évidence de la réponse spécifique de l’hôte.
o Des anticorps (IgG ou IgM).
o La synthèse d’Interféron. L’interféron est une cytokine particulière produite de façon
systématique lorsqu’une cellule est infectée par un virus.
1. Techniques du diagnostic direct
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Il est réalisé :
o Sur l’échantillon biologique.
o Ou après mise en culture cellulaire. La culture cellulaire permet d’amplifier le virus
présent dans l’échantillon (mais couteuse donc de moins en moins utilisée).
Les trois types d’analyse en diagnostic direct :
o Recherche de virions.
o Recherche d’antigènes viraux.
o Recherche de génome.
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Recherche de virions au microscope électronique (très cher et long, intéressant pour la recherche
mais pas en diagnostic direct).
Recherche d’antigènes viraux :
o Immunofluorescence (antigène associés aux cellules).
o Enzyme immuno-Assay, agglutination (antigène solubles).
Recherche de génomes viraux : PCR, hybridation moléculaire, TMA, bDNA, etc.
a. Type de prélèvements – virus concernés
Prélèvements
Virus
Selles
Rotavirus ; enterovirus
Adenovirus ; astrovirus
Sécrétions respiratoires
Virus grippaux
VRS ; parainfluenza
Adénovirus
Lésions cutanéo-muqueuses
HSV 1,2
VZV
Sang polynucléaires sérum
CMV
Ag HBs
Ag Hbe
Ag delta
Ag p24 (antigène du VIH)
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b. Intérêt et limites de la détection d’antigènes viraux
Détection directe d’antigènes viraux ne nécessite pas le maintien de l’infectiosité (IF,
agglutination latex).
Limites : manque de sensibilité ; nécessité de quantités importantes de virus.
Champs d’application : restreint aux prélèvements riches en matériel infectieux, intérêt : bonne
conservation des structures antigéniques, le prélèvement peut être conservé à 4°C.
c. Techniques de diagnostic direct – méthodes de diagnostic rapide
Immunofluorescence (IFD directe ou IFI indirecte)
o IFD directe : anticorps primaires spécifiques marqué à la fluorescéine.
o IFD indirecte : anticorps secondaires marqués à la fluorescéine.
Immunochromatographie :
o Très utilisé pour : le virus de la grippe (influenza virus), virus respiratoire syncytial, etc.
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d. Isolement sur culture cellulaire
Isolement du virus sur culture cellulaire : technique de référence.
o Identification virale : lecture de l’effet cytopathique (ECP). Quand un virus se multiplie
dans une cellule, il crée des désordres dans celle-ci et modifie sa structure. A
l’observation microscopique il est possible de repérer ces modifications morphologiques
de la cellule (vacuoles, forme, etc.).
o Typage du virus (entérovirus, Herpes, simplexvirus).
Obstacles limitant l’intérêt de la culture :
o Délai de la réponse important.
o Nécessité de disposer de nombreuses lignées cellulaire (coût).
o Prélèvements riches en virus infectieux (acheminement rapide).
Inoculation de cellules permissives :
o Cellules diploïdes (MRC5).
o Lignées continues (vero, hela, Hep2, MDCK, etc.).
o Historique : souriceau, œuf embryonné, etc.
Manipulation stérile :
o Matériel adapté.
o Manipulateur expérimenté.
En pratique
Acheminement rapide.
Traitement de l’échantillon :
o Directe si stérile.
o Traitement : filtration, isolement cellulaire, broyage, antibiotiques, etc.
Inoculation d’un panel adapté de cellules.
± centrifugation.
Incubation 37°C (33°C) dans une atmosphère de CO2.
Mise en évidence de la multiplication virale :
o Recherche d’un effet cytopathique (ECP) :
o Contraste de phase.
o Coloration.
o Immunofluorescence (IF), immunoperoxydase (IP) sur les cellules.
o Biologie moléculaire.
Culture du cytomégalovirus : ECP lent 15 à 21 jours. Déformation de la nappe en banc de
poisson.
Intérêts et limites de la culture cellulaire
Isolement viral : intérêt.
o Faire la preuve du caractère infectieux des virus présents dans le prélèvement.
o Pour établir le diagnostic étiologique de certaines infections virales.
o Etudier leu résistance phénotypique aux antiviraux disponibles.
o Réaliser des enquêtes épidémiologiques.
Quand prélever : le plus précocement possible.
Ou prélever : au niveau de l’organe cible quand les lésions sont accessibles.
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e. Recherche des génomes viraux
Détection des génomes.
Quantification des génomes.
Séquençage des génomes.
Techniques automatisées +++.
Très sensibles et rapides.
Techniques de biologique moléculaire
Mise en évidence du génome viral :
o Techniques d’hybridation.
o Amplification du signal : bDNA (ADN branché).
o Amplification de la cible : PCR.
o TMA (Transcription Mediated Amplification).
o Quantification en temps réel.
Etudes génotypiques :
o Génotypage de la souche virale : exemple du VHC (LiPA, séquençage, etc.).
o Génotypage de résistance : exemple du VIH, du VHB.
Principes de l’hybridation
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Techniques d’amplifications
Basées sur la réplication : BCR, etc.
Basées sur la transcription : TMA, etc.
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Intérêts et limites de la virologie moléculaire
La détection des acides nucléiques n’est pas synonyme d’infectiosité stricto sensu.
Avantages
Grande sensibilité
Grandes spécificité
Quantification de la charge virale
Nombreux tests commercialisés
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Inconvénients
Equipement
Temps de réalisation
Risque d’inhibiteurs
PCR quantitative en temps réel
La mesure se fait en phase exponentielle.
Technique chimie Taqman :
o Activité 5’ nucléase de l’ADN polymérase.
o Utilisation d’une sonde doublement marquée (récepteur et quencher). Lorsqu’ils sont
présent l’un à côté de l’autre, ils se « neutralisent ».
o Mesure de fluorescence : étape d’élongation.
o Lorsque la polymérase rencontre la sonde doublement fluorescente elle :
o Hydrolyse d’abord le récepteur qui est libéré et émet sa fluorescence.
o Puis le Quencher est libéré.
o A chaque cycle, de plus en plus de récepteur fluorescent sont libérés, la fluorescence
augmente donc de façon exponentielle.
Applications de la biologie moléculaire
Diagnostic :
o Rapide – urgent.
o Pas de culture possible.
o Recherche d’anticorps inutile e(n-né).
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o Cas difficile.
Suivis thérapeutiques / évolutifs : quantification.
Autres : typage / génotypage de résistance.
Variabilité virale.
Interprétation des résultats
Faux négatifs :
o Mauvais prélèvement.
o Mauvaise excraction.
o Inhibiteurs (héparine, hémoglobine, etc.).
Faux positifs : contaminations par des amplicons.
Orientation clinique.
2. Diagnostic indirect
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Mise ne évidence de la réaction immune de l’hôte :
o Anticorps.
o Sérum ou autres liquides (LCS, etc.).
Recherche :
o Séroconversion : apparition d’anticorps qui n’était pas présent au départ chez les
patients.
o Augmentation des IgG.
o Présence d’IgM.
o Avidité des IgG : technique qui mesure la force qui lie l’antigène à l’anticorps, intérêt
quand on veut dater l’infection.
a. Recherche des anticorps totaux
Techniques de référence de moins en moins utilisées :
o Séroneutralisation.
o Agglutination.
o Hémagglutination.
o Inhibition de l’hémagglutination.
o Immuno-fluorescence indirecte.
Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (ELISA) :
o Simple.
o Compétitifs.
o Sandwich.
o Immunocapture.
b. Intérêt et limites de la sérologie virale
Recherche des anticorps synthétisés par l’hôte en réponse à une infection virale aigue,
persistante ou ancienne.
Méthodes utilisées : techniques sérologiques basées sur la spécificité antigène-anticorps.
Technique ELISA classique.
Echantillons : sérum, plus rarement plasma, LCR, liquide amniotique.
Transport des échantillons ne demande pas de conditions particulières sauf une décantation
dans un délai de 34-48heures pour éviter la survenue d’une hémolyse.
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c. Prélèvements biologiques
Prélèvements pour la recherche des anticorps : sérodiagnostic/sérum (sur tube sec).
Il faut recherche les IgM dans une primo-infection virale (car les IgG apparaissent plus
tardivement).
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Cinétique des anticorps :
o La présence d’IgM pose la question d’une réactivation ou réinfection.
o Pour cela on regarde le taux d’IgG : s’il y a une augmentation de l’IgG (dans un second
prélèvement) c’est une réactivation.
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Techniques immuno-enzymatique : ELISA, technique très sensible et reproductible.
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Immunoblot, western-blot VIH :
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d. Intérêt et limite de la sérologie virale
Circonstances cliniques :
o Détermination du statut immunitaire vis-à-vis d’un virus donné.
o Evaluation de l’immunité résiduelle après infection naturelle ou vaccinale.
o Diagnostic d’une infection en cours ou récente par la mise en évidence d’une
augmentation significative du titre d’anticorps ou d’une séroconversion (recherche
d’IgM).
Inconvénients :
o Fenêtre sérologique (HCV <70jours ; HIV < 22jours, etc.). Impossibilité d’exclure une
étiologie virale.
o Réactions faussement positives (sensibilité des tests, mécanismes immunitaires).
o Situations compliquant d’interprétation :
o Administration passive de gammaglobulines.
o Administration passive de gammaglobulines.
o Hémodilution.
o Etats dysimmunitaires.
e. Avidité des IgG
Les IgM apparaissent touts en premier, après les IgG apparaissent.
Plus on avance dans le temps, plus l’avidité augmente chez le patient. L’avidité témoigne entre la
force d’attache entre l’immunoglobuline et l’antigène viral.
o 0,3 : 1mois.
o Entre 0,3 et 0,8 : infection inférieure à trois mois.
o Plus de 0,8 : supérieure à trois mois.
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III. Conclusion
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Toujours privilégier le diagnostic direct.
Conditions de prélèvement sont importantes.
Renseignements cliniques.
Automatisation :
o Sérologie +++.
o Biologie moléculaire +.
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