La cytogénétique est l`étude des phénomènes génétiques au niveau

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Diagnostic cytogénétique du caryotype classique à la CGH Array
SCHEMAS
La cytogénétique est l’étude des phénomènes génétiques au niveau de la cellule, c’est-à-dire au niveau des
chromosomes sans la nécessité d’extraire l’ADN : anomalies chromosomiques (de nombre et de structure),
recombinaison de chromosomes etc.
Les techniques utilisées sont principalement la réalisation du caryotype, les méthodes de FISH (fluorescent in
situ Hybridation : hybridation in situ par des sondes fluorescentes), l’utilisation de puces à ADN.
Homme 46XX : phénotype masculin mais a perdu les gènes responsables de la spermatogenèse.
Cellule prélevée, mise en culture, on bloque l’ADN sous forme de chromosome (double hélice d’ADN) et soit on
s’arrête à l’analyse au niveau chromosomique ou on pousse l’investigation : on déroule l’ADN.
Après les premières observations de chromosomes en 1880 par Flemming, la génétique est longtemps restée
une science marginale, c’est pourquoi ce n’est qu’en 1956 que le nombre de chromosomes de l’espèce
humaine a été correctement établi à 46 par Tjio et Levan.
La cytogénétique permet d’évaluer la constitution chromosomique d’un individu, soit la composition en
chromosomes des cellules d‘un individu. Par exemple, un homme normal est 46, XY, c’est-à-dire qu’il a :
- 46 chromosomes par cellules (23 paires) = 44 autosomes + 2 gonosomes
- dont 2 gonosomes (X et Y) : ce sont les deux chromosomes sexuels
Pour mieux identifier un remaniement quelconque, on a fait plusieurs marquages (sorte de digestion de l’ADN)
par digestion chimique (= bande G : chromosomes digérés) ou par digestion thermique (bande R). Ces
techniques de marquage permettent une meilleure appréciation du profil chromosomique.
Mais ne permet de diagnostiquer que des anomalies de nombre.
En mieux caractérisant les chromosomes, on peut diagnostiquer les anomalies de structure.
Depuis : association rapide entre syndrome et anomalie chromosomique spécifique.
En 1959, a été décrite par Jérôme Lejeune et ses collaborateurs la première anomalie chromosomique liée à
une pathologie, la trisomie 21 (3 chromosomes 21 au lieu de 2).
Elle a été suivie, la même année, par la description par Jacobs et Strong de la première anomalie des
chromosomes sexuels, avec une formule 47 XXY, dans le syndrome de Kinefelter. Hommes azoospermiques ou
avec une spermatogenèse perturbée.
Chez les femmes avec un syndrome de Turner (petite taille, règles perturbées), leur formule chromosomique
est 45 X.
En 1960, a été établie à Denver la première nomenclature internationale pour la classification des
chromosomes, basée sur leur taille et la position de leur centromère. Ils ont alors établi un caryotype dit
normal.
Parler du caryotype, c’est établir un classement des chromosomes 1 à 22 en mettant la formule
chromosomique (XX ou XY).
Quand on rend un caryotype, on précise que sur les techniques actuellement utilisées en laboratoire, on n’a
pas observé d’anomalie chromosomique pour se protéger judiciairement.
Caryotype à haute résolution : 800 bandes, essentiellement en pédiatrie. Permet de diagnostiquer des micro-
remaniements chromosomiques.
Un caryotype de base a un niveau de résolution à 400-460 bandes.
Les causes des syndromes malformatifs chromosomiques les plus fréquents ont été découvertes très
rapidement ensuite : syndrome de Turner, trisomies 14, 18 et 21…
En 1960, a été identifiée aussi, par Nowell et Hungerford, la première anomalie chromosomique dans une
affection maligne, donc acquise, le chromosome de Philadelphie, initialement décrit comme un 22 délété, dont

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Rowley a démontré par la suite qu’il était le résultat d’une translocation t(9 ; 22)  leucémie myéloïde
chronique.
Il existe des anomalies qu’on ne verra jamais car empêchent la naissance.
Technique cytogénétique et chromosomique
Depuis 1970 : amélioration des techniques : niveau de résolution pour une meilleure analyse des
remaniements chromosomiques.
Le but est d’avoir un maximum de cellules bloquées au stade métaphasique.
Pour établir un caryotype sanguin, on prend les lymphocytes qu’on cultive pendant 48-72h et on étale les
chromosomes sur une lame de verre pour observer.
Avec l’imagerie médicale, une fois qu’on a les chromosomes sur la lame, il y a une caméra au microscope qui
capte les images et fait une classification semi-automatique en se basant sur la taille et la position du
centromère. On utilise plusieurs techniques d’identification des chromosomes.
Sur le plan médical, il faut être prudent : on demande l’analyse qui aide à prendre la meilleure décision
médicale.
Ces noyaux et chromosomes sont ensuite fixés sur la lame avec du méthanol (déshydrate et aplatit les noyaux)
ou du paraformaldéhyde (qui maintient la forme du noyau).
On utilise une culture cellulaire de synchronisation pour bloquer l’ADN au stade chromosomique et non au
stade interphasique.
Il existe un diagramme pour classer les chromosomes selon leur taille et la position de leur centromère.
Centromère = séquence hautement répétée et séquences non codantes qui protège l’ADN.
Les chromosomes ont été classés de 1 à 22 + X et Y.
22 paires : ½ vient du père, ½ vient de la mère.
Un X vient toujours de la mère, puis soit 2e X soit Y selon le père.
Caryotype
Banding chromosomique : possibilité de classer les chromosomes : morphologie, taille, position du centromère.
On dénature l’ADN avec de la chaleur : dénaturation thermique en France pour établir le caryotype = bande R.
On dénature l’ADN avec une digestion enzymatique en Angleterre et Etats-Unis pour établir le caryotype = bande G.
La nomenclature internationale autorise les 2 techniques.
Si par exemple on voit que les 2 chromosomes 10 ne sont pas les mêmes, il faut faire des analyses
complémentaires pour voir si c’est un remaniement, une translocation (échange du 10 avec un autre
chromosome) ou si anomalie de structure etc.
Translocation t(11 ;14)(q14 ; q32) du myélome : les chromosomes 11 et 14 ont échangé un fragment, il s’agit
d’un remaniement chromosomique.
Caryotype de base : +++ Remaniements chromosomiques simples ou multiples sont recherchés
Anomalie de nombre (1 ou pls chromosomes en plus ou en moins) = aneuploidies chromosomiques
Anomalie de structure = translocations (réciproques ou robertsoniennes, équilibrées ou non) qui
aboutissent à des micro-remaniements : Inversions, insertions, délétions, duplications
Les syndromes microdélétionnels et malformatifs sont causés par des remaniements de structure et durant ces
échanges, on peut avoir des pertes de séquence, des insertions de séquence, des délétions ou des duplications.
Un couple a consulté pour une grossesse, sachant qu’un de leurs enfants est né avec un syndrome micro-
délétionnel, en établissant le caryotype, on voit qu’il y a une translocation entre les chromosomes 4 et 5.

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Technique FISH : Fluorescence in situ hybridisation
Quand la biologie a évolué, on a réussi à intégrer une séquence d’ADN du génome humain dans des vecteurs :
on est capable de couper une séquence d’ADN humain de 2 à 3 kbases et de la mettre dans un plasmide ou un
cosmide.
Un cosmide fait 50 à 60 kilobases.
On a réussi à faire des chromosomes humains artificiels.
Puis on prend un plasmide ou un cosmide, on insère une séquence d’ADN humain et on réinjecte ce
plasmide/cosmide dans des bactéries (E. Coli). On cultive ensuite la bactérie et on marque l’ADN avec une
molécule fluorescente. On fait une hybridation de cette sonde avec un ADN compétiteur sur la lame.
La FISH révèle la séquence que l’on a hybridée et donne une information sur la région que l’on cherche à
analyser.
L’avantage de cette technique, c’est sa rapidité et on n’a plus besoin de la plaque métaphasique. Cette
technique permet de rendre le résultat en 24 heures.
On utilise cette technique pour un diagnostic bien ciblé (par exemple pour diagnostiquer une trisomie 21 ou 18
quand on a un doute à partir du phénotype).
Par exemple pour diagnostiquer une trisomie 21, on marque aussi le chromosome 18 pour en fait faire un
contrôle interne et vérifier que la technique fonctionne.
On peut aussi faire un FISH d’un centromère. Sur la diapo, la patiente a 2 chromosomes X + un fragment
supplémentaire qui vient du X. Soit on arrête là parce que la patiente n’a pas de pathologie connue, soit on fait
des recherches complémentaires.
On sait que c’est un dérivé venant de X. On se demande ce qu’il y a comme gène sur cette séquence d’ADN, on
fait un séquençage et une analyse de ce fragment pour voir s’il code pour quelque chose, s’il donne des
transcrits etc.
Il faut associer le tableau clinique au tableau génétique et génomique.
Syndromes de Williams
Syndrome causé par une microdélétion d’une séquence d’ADN sur le chromosome 7 pour la synthèse de
l’élastine.
Le pédiatre envoie la photo et demande un caryotype.
Donc on établit le caryotype en cherchant un remaniement de structure majeur. Puisque le tableau clinique
évoque un syndrome de Williams, on regarde surtout le chromosome 7 : on prend un marqueur pour le
chromosome 7 (son centromère) et on utilise une sonde par fiche qui s’hybride sur la séquence qui couvre le
gène de l’élastine. On voit alors que sur le 2e chromosome 7, le gène est délété  on confirme le diagnostic.
On teste en parallèle la sonde sur un caryotype normal.
L’enfant est donc porteur d’une microdélétion sur l’un des 2 chromosomes 7.
Microdélétion di George
Malformation cardiaque.
Dans ce syndrome, il y a une délétion d’une séquence d’ADN sur le bras long du chromosome 22.
FISH permet également de voir s’il y a eu des échanges de fragments de chromosomes (translocation chromosomique).
CGH ou profils génomiques de gains et de pertes
Si il y a un remaniement entre plusieurs chromosomes (hybridation génomique comparative), on fait un
caryotype en multicouleurs.
Hybridation génomique comparative ou CGH : on hybride l’ADN d’un malade avec l’ADN d’un patient normal
utilisé comme ADN témoin et on compare. Permet d’identifier s’il y a une perte ou un gain d’ADN.
Principe : cohybridation sur métaphases normales.
1- ADN modifié (tumoral) marqué par un fluorochrome vert
2- ADN normal marqué par un autre fluorochrome rouge

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Par analyse d’image, calcul du ratio d’hybridation de chacun de 2 ADN le long de chaque chromosome.
 Etablissement XXX diapo
CGH :
 Recherche de gain ou de perte de segment de chromosome
 Technique essentiellement utilisée en onco-hémato :
- gain ou perte d’oncogènes
- gain ou perte de gènes suppresseurs de tumeurs
Toute tumeur solide en cancéro en se déclarant manifeste des remaniements chromosomiques. Plus la tumeur
évolue, plus les remaniements chromosomiques s’intensifient.
HYBRIDATION GENOMIQUE COMPARATIVE :
On prend un ADN de référence et un ADN test et on les mélange sur une plaque métaphasique.
Quand il y a un gain d’ADN, c’est l’ADN test qui sort en excès, quand il y a une délétion c’est l’ADN référence
qui sort en excès.
La nanotechnologie (NT) = technologie miniature.
Les puces : peuvent être de cellule, à ADN ou d’expression.
La NT a été développé au début des années 90.
NT : on prend des séquences d’ADN de génome humain et on les place alignées sur les chromosomes. Par
exemple, le gène de l’élastine, on sait où il est sur le chromosome 7  on prend un fragment d’ADN qui
connaît cette séquence et on l’utilise comme marqueur. En fait, on analyse le génome d’une manière inversée.
Les techniques d’hybridation in situ deviennent des techniques de confirmation.
On a alors imprimé des puces en fonction des diagnostics (post-natal, onco etc.). Chaque spot est spécifique
d’une séquence précise sur le génome.
A partir de là, cela devient de la CGH sur une puce.
On mélange de l’ADN témoin et de l’ADN malade qu’on hybride sur une puce imprimée : on fait de
l’hybridation génomique comparative sur une puce.
Cela a changé les méthodes de travail : on est capable de prélever l’ADN ou l’ARN de n’importe quelle source.
Puis on peut amplifier (PCR) si besoin. Puis on marque avec plusieurs fluorochromes. Puis on fait une pré-
hybridation, une hybridation, un lavage et une décontamination puis scan des données et analyse des résultats.
 Au lieu de rendre un caryotype avec « photo des chromosomes », on rend un caryotype moléculaire.
Caryotype moléculaire : chaque spot (= point) correspond à une séquence du génome humain.
Pour le syndrome d’insuffisance ovarienne, il peut y avoir perte ou gain d’ADN mais si gain d’ADN, le gain ne
s’exprime pas à cause d’une méthylation.