Epstein Barr
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Microbiologie générale 1. Introduction a. La microbiologie i. références ii. objectifs iii. définitions iv. les bactéries vs l’homme sur la terre b. La relation microbe-hôte c. Abrégé d’histoire 2. les maladies infectieuses a. Eléments d’épidémiologie i. transmission ii. mortalité iii. modifications séculaires d’incidence iv. infections émergentes et ré-émergentes b. Les infections nosocomiales 3. les bactéries a. Cellule i. cellules pro- eucaryotes ii. structure cellulaire o forme o nucléoïde o cytoplasme o membrane plasmique o paroi o capsule o glycocalyx o couche S o flagelles o fimbriae o pili iii. mobilité iv. vie pluricellulaire : o quorum sensing, o biofilm v. différenciation cellulaire o essaimage o sporogénèse -endospores b. Croissance i. Division bactérienne, courbe de croissance ii. Conditions de croissance iii. Métabolisme iv. Cycle cellulaire v. Cultures bactériennes vi. Mesure de la croissance c. Génétique i. Généralités ii. Variations bactériennes o Variations phénotypiques o Variations génotypiques iii. Modifications de l’ADN, variations génotypiques o mutations o recombinaisons/transpositions o transferts de gènes i. transformation ii. conjugaison iii. plasmides iv. transposons v. intégrons 1 vi. bactériophages, transduction 4. la relation bactérie-hôte a. bactéries pathogènes / bactéries opportunistes b. facteurs de défense contre les bactéries i. les barrières ii. immunité innée, réponse inflammatoire c. facteurs de résistance des bactéries aux défenses de l’hôte d. facteurs de pathogénicité des bactéries i. généralités ii. colonisation iii. invasion iv. expression du pouvoir pathogène o exotoxines o endotoxine et hyperstimulation de la réponse inflammatoire o Inflammation au niveau de la porte d'entrée secondaire à la multiplication bactérienne o Dissémination des microorganismes à partir de la porte d'entrée 5. les agents antibactériens a. principes généraux i. définitions ii. concepts théoriques iii. activité des antibactériens iv. cibles des antibactériens v. résistance bactérienne vi. efficacité in vitro des antibiotiques, antibiogramme o CMI/CMB o antibiogramme par diffusion o E-Test vii. efficacité des antibactériens o pharmacocinétique o pharmacodynamique b. les familles d’antibiotiques i. inhibiteurs de la paroi o -lactamines o glycopeptides ii. Inhibiteurs des synthèses protéiques o macrolides o lincosamines o aminoglycosides o tétracyclines iii. Inhibiteurs des acides nucléiques o F-quinolones o rifamycines o nitro-imidazoles iv. Antimétabolites v. Antituberculeux vi. Nouveaux antibiotiques 6. les virus a. historique b. définitions c. structure virale i. le génome ii. la capside iii. l’enveloppe iv. classification d. biologie, multiplication i. reconnaissance, attachement ii. évolution des infections virales 2 iii. pénétration, entrée iv. décapsidation v. multiplication o virus à ADN o virus à ARN vi. voyage des proteines de structure vii. assemblage, maturation viii. libération e. conséquences des infections virales f. interférons g. cancerogénèse h. techniques de laboratoire i. cultures de virus ii. microscopie électronique iii. techniques de biologie moléculaire iv. détection d’antigènes v. détection d’anticorps i. agents antiviraux 7. stérilisation 1. Introduction A. La microbiologie Objectifs du cours les caractères des micro-organismes (µo) les relations hôte-µo comment identifier les µo comment protéger l’hôte contre les µo agressifs Microbiologie: définition Etude des micro-organismes = bactériologie + virologie + mycologie + protozoologie + helminthologie + prions les microbiologies: industrielle, alimentaire, de la terre, bio-terrorisme, Médicale Microbiologie Médicale ou clinique : micro-organismes + Hôte = Maladie Infectieuse: parfois vrai, le plus souvent faux. micro-organismes + Hôte = Relation complexe dont le résultat dépend des caractères des 2 intervenants et des circonstances de leur rencontre Différenciation des micro-organismes : Selon le mode de vie: macro ou micro-parasites extra ou intra-cellulaires Selon la structure acellulaires: virus, prions 3 cellulaires: procaryotes: bactéries eucaryotes: champignons, protozoaires Microbiologie : quelle histoire : Liée à l’histoire du microscope 1673, van Leeuwenhoek, visualisation de µo. 1861, Pasteur, la génération spontanée n ’existe pas. 1876, Koch, B. anthracis provoque le charbon. 1884, postulat de Koch et coloration Gram 1. Le µo doit toujours se retrouver dans des animaux présentant la même maladie mais pas dans les animaux sains. 2. Le µo doit être isolé d’un animal et mis en culture dans un environnement pur. 3. Le µo isolé doit causer la maladie d’origine quand il est inoculé à un animal susceptible. 4. Le µo peut-être ré-isolé de l’animal infecté par l’expérience. 2. Les maladies infectieuses Les maladies infectieuses : la situation actuelle : 1. Mode de transmission des µo: Réservoir = homme, animaux, environnement, aliment, eau, air, … Sites d’entrée = peau, conjonctives, oro-pharynx, voies respiratoires, muqueuses,… =>par contact direct ou agent intermédiaire : Vecteur : animaux, insecte, homme Véhicule : eau, aliment, instruments 2. Principales causes de mortalité dans le monde : Mortalité globale 57,03 Affections cardio-vasculaires 16.7 Maladies infectieuses 10,9 Cancers 7,25 Maladies respiratoires 3,7 Mortalité périnatale 2,46 * OMS, exprimée en millions, pour 2002 3. Principales causes infectieuses de mortalité dans le monde : Infections respiratoires 3,96 SIDA 2,78 Maladies diarrhéiques 1,79 Tuberculose 1,56 Paludisme 1,27 *OMS, exprimée en millions, pour 2002 4 4. Modifications de l’incidence de maladies infectieuses: Diminution de la sensibilité de l’hôte: Meilleure nutrition Antibiotiques Vaccination Diminution de la transmission : Qualité des habitations et de l’environnement Vaccination Assainissement du milieu Sécurité alimentaire et de l’eau Augmentation de la vulnérabilité de l’hôte : Changement démogr/comportement Pauvreté Malnutrition Augmentation de la transmission : Adaptation microbienne ou vectorielle Voyages internationaux Nouvelles technologies Changements environnementaux 5. Infections nocosomiales : Ventilation artificielle, sonde, cathéter, matériel étranger => flore commensale patients immuno-déprimés => germes opportunistes pression antibiotique => germes multi-résistants 3. Les bactéries A. Cellules Cellules eucaryotes Cellules procaryotes Chromosomes multiples, dans une membrane nucléaire, nucléole ADN associé à histones paroi: rare, simple mitochondries, reticulum endoplasmique,… 2 types de ribosomes membrane plasmique: glucides et stérols cytosquelette si flagelles, complexes taille: 10division: mitose méiose chromosome unique, pas de membrane nucléaire ni nucléole structure ADN simple paroi: complexe, peptidoglycane organites absents 1 type de ribosome membrane plasmique: pas glucides, ni stérols pas de cytosquelette si flagelles, simples taille: 0,2division: scissiparité absence de méiose Cellule bactérienne : Formes: coques, bacilles (parfois ramifiés), incurvés (vibrions, spirilles) Taille: 0,2 à 250 µm (1-10 µm) Associations: chaînette, paire, amas Structure: ultrastructure et composition très variable 5 Structure cellulaire bactérienne : Nucléoïde ~ chromosome: le plus souvent unique et circulaire: boucle d’ADN bicaténaire repliée super-enroulée, avec une zone centrale condensée -gènes inactifs- et zones périphériques formées de boucles d’ADN -gènes actifs recouverts de polysomesCytoplasme eau, ribosomes, ions, enzymes, déchets, plasmides Ribosomes 0,025 µm , ARN + 30% de protéines, 50S + 30S (70S), Sous forme de polysomes ARNr : séquence stable, spécifique d’espèce Granules de réserve Poly-B-hydroxybutyrate Polyphosphate (granules métachromatiques) Membrane plasmique barrière hydrophobe et osmotique limitant le cytoplasme double couche (7-8 nm) P-lipidique fluide associée à des protéines: enzymes (perméases) + systèmes transporteurs +systèmes convertisseurs d’énergie + protéines réceptrices Paroi Enveloppe semi-rigide Forme de la bactérie protection mécanique et osmotique tamis moléculaire régulation de l’accès à la cellule coloration de Gram Composition commune: réseau de peptidoglycane. Toutes les bactéries possèdent une paroi sauf les mycoplasmes Périplasme : Espace entre membrane plasmique et: membrane externe (BGN) ou paroi (BGP) Capsule: Présente chez certaines bactéries, inconstante Fixée à la paroi, couche régulière composée de polysaccharides acides (sucres sous fome d’acides uroniques -ex, acide galacturonique- ou sous forme de sucres phosphorés) Rôle:facteur déterminant de pathogénicité: résistance à la phagocytose et à la dessiccation, barrière, réserve nutritive, adhésion Typage intraspécifique par immunsérum Mise en évidence par coloration négative Polymères capsulaires purifiés: base de certains vaccins Ag solubles pour diagnostic Microcapsule Glycocalyx: polymère visqueux à l’extérieur de la paroi (polysaccharides ou polypeptides ou les 2) il peut former un feutrage englobant de nombreuses bactéries –micro-colonies- pour former un bio film : les biofilms permettent l’adhésion des bactéries à des supports solides (dents) ou cellulaires (voies respiratoires), ils protègent les bactéries de la dessiccation et des produits biocides et incluent des substances nutritives Couches S: sous-unités protéiques répétitives en carré ou en hexagone couvrant la membrane externe (BGN) ou le peptido glycane (BGP) Flagelles organe de mobilité hélicoïdal, tresse de 11 fibrilles faits de flagelline, filament, crochet, corps basal spirochètes:flagelles périplasmiques Fimbriae 1 x 0,01 µm, constitués de sous-unités protéiques identiques quelques uns à plusieurs centaines 6 facteurs d’adhésion Pili structures protéiques allongées de taille et de forme variées, uniques ou peu nombreuses assure le transfert d’ADN par conjugaison Peptidoglicanes Structure tridimensionnelle (rôle des PBP) Hétéropolymère fait de grandes chaînes de glycane (alternance de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétyl muranique) associées par des ponts peptidiques courts = macromolécule réticulée tridimensionnelle Coloration Gram : Il est possible de colorer les bactéries différemment. Après avoir mis un solvant organique, certaines, bactéries = violettes et d’autres transparentes après rinçage. Ajout de Safranine pour que les transparentes deviennent rouges. Violette = gram + (répond positivement au coloration gram) Rouge = gram - Paroi cellulaire : B. Gram positives épaisse, 30-100 nm aspect uniforme 40 à 80 % de peptidoglycane multicouche acides teichoïques, HC B. Gram négatives mince, 20-30 nm feuilletée 1 à 10 % de peptidoglycane monocouche (gel périplasmique) périplasme couche ext.: membrane externe Acides technoïdes : ils n'existent que dans les Gram +, ils sont liés de manière covalente au peptidoglycane ou aux lipides de la membrane plasmique (ac. lipoteichoïques); ils régulent l'activité d'amidases et de glycosidases qui participent à la synthèse cellulaire comme autolysines; ils joueraient un rôle dans le transport du Mg, dans la résistance de certaines bactéries au lysozyme, dans la captation de fragments d'ADN dans l'environnement; comme ils atteignent la surface du peptidoglycane et qu'ils sont chargés négativement, ils donnent une charge négative aux BGP; ils maintiennent la structure de la paroi; ils participent à l'adhésivité, ce sont des antigènes de surface importants; comme les lipopolysaccharides des BGN, mais moins efficacement, ils sont capables d'activer le largage des médiateurs de l'inflammation et d'induire un choc septique Membrane externe : Bicouche lipidique contenant des protéines: phospholipides internes/lipopolysaccharides externes: Partie proximale insérée dans la membrane externe: glycolipide -lipide A- = endotoxine oligosaccharide basal = core chaînes externes -chaînes spécifiques O- d’oligosaccharides linéaires ou ramifiés s’étendant dans le milieu externe Protéines (50% de la masse): lipoprotéines de Braun: lien covalent avec PG porines: association de 3 molécules en pores transmembranaire protéines de transport et de captation (fer, facteur de croissance) Rôle: contact avec l’environnement et protection : protection contre la phagocytose (par LPS et chaînes polysaccharidiques chargées négativement), 7 exclusion de composés hydrophobes et de composés de haut poids moléculaire, protection contre des changement brutaux de pression osmotique dans le milieu extérieur, variation dans le système antigénique qui est perçu par le système immunitaire de l’hôte, ancrage des adhésine, fimbriae et capsules … Mobilité bactérienne : Flagelles rotation du flagelle sur son corps basal mouvements de «nage-culbute» mouvements en vis des spirochètes Mobilité non-flagellaire glissement mobilité saccadée en intracel: actine Chimiotactisme Vie pluricellulaire des bactéries Quorum sensing : échanges de signaux chimiques (quoromone) entre bactéries permettant des comportements différenciés. Pouvoir pathogène, flagelles, transfert de plamides Biofilm Différenciation cellulaire Définition d’un biofilm : Un biofilm est une communauté de microorganismes (bactéries, champignons etc.) adhérant entre eux, fixée à une surface ( bactéries dites sessiles) , et caractérisée par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice. Ils sont naturellement résistants aux antibiotiques Ils sont à l’origine de nombreuses infections chroniques Les biofilms : Le mode de vie en biofilm est l'une des deux modalités de vie des organismes unicellulaires, ce serait le mode de vie naturel de la plupart des microorganismes, notamment en milieu hostile L'autre mode de vie est la flottaison libre de type dit «planctoniques» dans un milieu liquide. La structure et la physiologie du biofilm donne aux bactéries ce que l’organisation tissulaire apporte aux cellules des êtres supérieurs. Un aspects majeurs des biofilms est le changements dans les phénotypes correspondant au changement du mode de vie de «planctonique et individuel», à celui de «fixé et communautaire». 3 Des groupes de gènes (>10 ) changent leurs mécanismes d'activation pour assurer cette permutation de style de vie (en quelques minutes). L'environnement particulier du biofilm permet (ou oblige) les bactéries à coopérer ensemble ce qui n’est pas le cas dans un environnement libre. Les bactéries vivant dans un biofilm ont des propriétés très différentes de celles des bactéries isolées de la même espèce. 8 ¨ Protection des bactéries dans un biofilm : Protection passive : La matrice protège physiquement les bactéries contre l'entrée des agents antimicrobiens, les détergents et les antibiotiques. Protection métabolique : les bactéries entourées de biofilm sont moins actives métaboliquement, donc moins réceptives aux agents antimicrobiens Protection active : La résistance de P. aeruginosa aux antibiotiques a été attribuée à des pompes d’efflux du biofilm expulsant activement les composants antimicrobiens. Protection génétique : lors de leur implantation dans un biofilm l'expression génétique des bactéries peut être est modifiée. L’environnement du biofilm est propice aux échanges de matériel génétique et permet le transfert de caractères de résistance. Différentiation bactérienne : Essaimage: certaines bactéries (Proteus, Serratia) sont capables de produire des cellules migratrices Cellules quiescentes: production de formes jouant un rôle de dissémination ou de survie: ex., les endospores Sporogenèse : 9 Endospores : Bactéries à Gram + (Bacillus, Clostridium): endospores = cellules « dormantes » résistantes Sporulation (6-8h) en cas d’environnement hostile Caractères: déshydratées, thermorésistantes, volatiles, résistance aux rayons et aux biocides Composants: acide dipicolinique, ions Ca, ADN, ARN, ribosomes, enzymes Germination lors de conditions favorables Croissance bactérienne : Division bactérienne: la bactérie grandit puis se divise en 2 cellules filles identiques (fission binaire) séparé par un septum formé par la paroi Croissance bactérienne : accroissement des composants de la bactérie =>division => augmentation du nombre de bactéries B. Croissance Courbe de croissance en milieu liquide fermé : Conditions de croissance : t°: mésophiles* pH: 7* Pression osmotique: bactéries osmotolérantes Présence de sels: bactéries halophiles oxygène: aérobies, anaérobies facultatifs, aérobies facultatifs, anaérobies strictes, microaérophiles CO2: capnophiles substances nutritives: C,N,P,S,…hétérotrophes* énergie: chimiotrophes* Oligoéléments, facteurs organiques de croissance eau: 80% de la cellule adaptations possibles par l’(a) (dés-) activation de gènes Métabolisme : l’énergie : Besoins d’énergie: voies métaboliques locomotion absorption Origine de l’énergie (bactéries pathogènes) composés organiques: bactéries chimio-organotrophes Processus convertisseurs d’énergie 10 Fermentation: métabolisation du substrat sans intervention d’agent oxydant exogène: dégradation incomplète du glucose et formation de composés organiques (acides) Respiration – oxydation Dégradation du glucose par le cycle de Krebs, accpeteur final d’électrons: oxygène Métabolisme : le carbone : Bactéries autotrophes: CO = source de C 2 Bactéries «médicales»: hétérotrophes, besoin de composés carbonés complexes provenant d’autres organismes Les bactéries en fonction de leur rapport avec l’oxygène : 1. B. aérobies strictes: ne se développent qu'en présence d'air source d'énergie: respiration. L'oxygène moléculaire, ultime accepteur d'électron, est réduit en eau (Pseudomonas, Acinetobacter, Neisseria) 2. B. microaérophiles se développent mieux ou exclusivement lorsque la pression partielle d'oxygène est inférieure à celle de l'air (Campylobacter, Mycobacteriaceae). 3. B. aéro-anaérobies facultatives se développent avec ou sans air. = majorité des bactéries rencontrées en pathologie médicale entérobactéries (Escherichia, Salmonella), streptocoques, staphylocoques. L'énergie provient de l'oxydation des substrats et de la voie fermentaire. 4. Les bactéries anaérobies strictes ne se développent qu'en absence totale ou presque d'oxygène qui est le plus souvent toxique. Ces bactéries doivent se cultiver sous atmosphère réductrice. La totalité de l'énergie est produite par fermentation. bactéries intestinales (Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium) et bactéries présentes dans les flores normales de l'organisme. Bactérie anaérobie : En présence d’oxygène, formation de radicaux superoxydes qu’elles ne peuvent pas détruire faute de superoyde dismutase, catalase ou peroxydase Cycle cellulaire : Dimensions de la cellule: à vitesse constante de croissance, la cellule augmente en longueur Synthèse de l’enveloppe cellulaire : processus continu avec accumulation de peptidoglycane aux pôles Réplication du chromosome Séparation des copies par topoisomérases et condensation en nucléoïdes par lien protéique Formation d’un septum Séparation, parfois association Définitions : culture = milieu + bactéries bactéries en croissance (ou ayant crû) incubation = maintien d’une culture à t° définie pour assurer sa croissance inoculation = addition de bactéries à un milieu de croissance temps de génération = temps de doublement d’une population bactérienne Milieux de cultures : Milieux solides => formation de colonies => isolement des bactéries support: gélose = solution liquide gélifiée avec 1,5 % d’agar milieux sélectifs 11 milieux d’enrichissement milieux enrichis milieux différentiels milieux de transport Milieux liquides: bouillon => apparition de «trouble», parfois grains, pellicule milieux d’enrichissement milieux d’identification Mesure de la croissance bactérienne : Comptage des cellules compte total: en cellules, sur filtre compte de cellules viables: par étalement , par colorant néphélomètrie mesure de la diffraction d’un rayon lumineux absorbtion ou rejet de substances augmentation de la biomasse Adaptatibilité des bactéries : Super reproductrices Génome modulable (éléments variables et mobiles) Multitude (des milliers d’espèces) Ubiquité Plasticité du génome bactérien : C’est l’imagination des bactéries pour trouver des solutions à des pressions environnementales de sélection C. Génétique Génétique bactérienne : Génétique: Science de la variation et de l'hérédité Croissance bactérienne: reproduction asexuée par scission binaire ou de scissiparité en l'absence de toute recombinaison génétique (pas de zygote). La bactérie est généralement haploïde (1 chromosome). Génétique bactérienne: Les bactéries sont devenues un matériel de choix de l’étude de la génétique à cause de leur division rapide ADN bactérien peut exister sous 3 formes topologiques (superenroulée, relachée, linéaire) Forme linéaire: obtenue par coupure, par ex enzymatique (enzymes de restriction). Les 2 chaines maintenues entre elles (A-T, C-G) par liaisons "hydrogène". Chauffage permet leur séparation en brins monocaténaires = fusion ou dénaturation. Hydrolyse ou restriction : L'ADN double brin peut être coupé par des enzymes de restriction, dénommées endonucléases => Génome bactérien réduit à une série de fragments caractéristiques isolables et mesurables, par ex par électrophorèse en gel d'agarose. Les endonucléases permettent d'établir des profils de restriction intérêt en épidémiologie Les variations bactériennes : aspect de la colonie dépigmentation de la culture perte de la capsule (virulence) chez le pneumocoque caractère de fermentation (lactose) acquisition de la résistance à un antibiotique... 2 types de variations: génotypique et phénotypique 12 Variation phénotypique : adaptation rapide de l'ensemble de la population bactérienne ayant le même génotype à diverses conditions extérieures, induite, réversible, non transmissible à la descendance mais spécifique. Le mécanisme est en relation avec l'activité ou l'expression des gènes et la découverte de systèmes de régulation Variation génotypique : modification du génome bactérien (ADN) par mutation, recombinaison, transfert de gènes,… Mutations : événement le + souvent silencieux, souvent nocif, parfois favorable = mutation modification Spontanée ou Induite (UV ou produits mutagènes) Discontinue (tout ou rien) Stable (caractère acquis héréditaire) Rare : taux de mutation = probabilité pour une bactérie de muter pendant une unité de temps définie Modification spécifique - indépendante: la probabilité de subir simultanément deux mutations distinctes = produit des probabilités individuelles de ces mutations. Recombinaison: réarrangement d’une ou plusieurs molécules d’acides nucléiques: association, séparation, échanges de brins, perte ou inversion de séquences Transposition: transfert d’un petit élément spécialisé d’ADN (élément transposable ou gène sauteur) dans un duplex, dans une cellule ou entre cellules Élément transposable = transposon + séquences d’insertion Transfert de gènes : Devenir de l’ADN transféré: intégration (=> génome recombinant) persistance +/- réplication dégradation par les nucléases (Restriction) Transformation Conjugaison Transduction Transfert de gène : transformation : ADN libéré d'une bactérie (exogénote) => fixé sur une bactérie réceptrice absorption suivie d'une recombinaison génétique avec acquisition de nouveaux caractères génétiques stables, transmissibles (descendance = recombinants ou transformants) transfert naturel limité à quelques espèces telles Streptococcus, Neisseria, Haemophilus..... Il est partiel : une partie de l'exogénote (1-2% du génome) pénètre et se recombine (si homologie suffisante) Transfert de gènes : conjugaison : Appariement entre bactéries de sexe différent, formation d'un pont cytoplasmique permettant les échanges bactériens (chromosome/plasmide) facteur de sexualité ou de fertilité (F) permet la synthèse de pilis sexuels chez la bactérie donatrice ou mâle Transfert de gènes : plasmides : ADN à double brin, circulaire, cytoplasmique, réplication autonome et de taille variable. permettant une meilleure adaptation des bactéries, 13 non indispensables au métabolisme normal de la cellule-hôte transmission naturelle par conjugaison Plasmides de fertilité : rendent la bactérie plus fertile Plasmides de résistance : codent pour mécanismes de résistance aux antibio Plasmides de virulence : codent pour les propriétés agressives Plasmides col : mécanisme de défense-attaque Transposons : Éléments d’ADN pouvant se déplacer le long du génome, faits de séquences d’insertion entourant les gènes «phénotypiques» Jamais libres Echanges entre chromosomes et plasmides Séquelles imprévisibles des recombinaisons par transposons: mutation, délétion, arrêt de transcription,... Intégrons : Îlots génomiques: information génétique d’origine étrangère, acquise au cours d’échanges génétiques par transformation, transduction et/ou conjugaison, et intégrée de manière plus ou moins stable dans le chromosome bactérien, ou sur un plasmide: îlots de pathogénicité et îlots de résistance(= intégrons) système de capture et d'expression de gènes sous forme de cassettes. cassettes: éléments mobiles capables d'être intégrés ou excisés par un mécanisme de recombinaison spécifique de site médié par une intégrase. obligatoirement portés par un réplicon (plasmide ou chromosome) ou véhiculés par un élément transposable. jouent un rôle important dans l'acquisition et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Bactériophages : Bactériophages: virus spécialisés des bactéries Spécificité de genre ou d’espèce Phages virulents provoquant la lyse bactérienne Phages tempérés s’établissant en relation stable: lysogénie Conversion lysogénique acquisition par une bactérie d'un caractère somatique particulier par phage spécifique. Son expression est lié à l'état lysogène. Les bactéries infectées présentent des caractères absents chez les non-infectés: soit expression de gènes du phage dans la cellule, soit inactivation de gènes chromosomiques toxine du bacille diphtériquetoxine érythrogène de Streptococcus pyogenes certaines cytotoxines (vérotoxines) chez E.coli Transduction Transfert d’ADN bactérien par un phage virulent (vecteur passif) Multiplication du phage dans la bactérie incorporation d'ADN bactérien fragmenté lors de l'encapsidation 14 4. Relations bactéries/hôte A. bactéries pathogènes / bactéries opportunistes Colonisation Infection Maladie infectieuse Bactérie pathogènes : bactéries pouvant provoquer une maladie même chez le sujet " sain " (ex typhoïde, choléra, tuberculose, méningocoques...). Pathogénicité: capacité de pouvoir provoquer une infection Virulence: mesure de la pathogénicité Pathogénèse: mécanisme du développement de la maladie Bactéries opportunistes : habituellement pas de maladie chez les sujets sains peuvent devenir pathogènes chez les sujets aux défenses immunitaires altérées. souvent des bactéries commensales de la peau ou des muqueuses de l'homme ou des bactéries de l’environnement B. Facteurs de défense contre les bactéries : Facteurs non spécifiques Les barrières Immunité innée Réponses adaptatives Anticorps Immunité cellulaire Les barrières : Les barrières qui s'opposent à l'implantation des bactéries: - flores saprophytes/commensales: la composition de cette flore varie en fonction de l'âge, de l'alimentation, de l'administration d'antibiotiques... - substances microbicides des revêtements cutanéo-muqueux: acides gras, HCl, sels biliaires, mucus... - facteurs mécaniques : desquamation, péristaltisme intestinal, cellules ciliées. Les barrières qui s'opposent à la croissance bactérienne : - La disponibilité en nutriment pourrait être le facteur limitant. - Le seul réel nutriment qui fait défaut in vivo est le Fe Immunité innée : Réponse inflammatoire qui permet l'élimination du microorganisme lorsqu'il se trouve dans un tissu habituellement stérile Les acteurs de l'immunité innée - Le complément activation du complément => bactériolyse, opsonisation chimiotactisme (C3a, C5a) Les cellules phagocytaires: 2 types : les polynucléaires et les macrophages L'immunité innée recrute ces éléments au siège de l'effraction bactérienne pour éliminer l'agent pathogène. => réaction inflammatoire = diapédèse - margination des leucocytes et extravasation des protéines plasmatiques (complément et anticorps). 15 Composants bactériens activant l’immunité innée : lipide A du lipopolysaccharide des bactéries à Gram-négatif peptidoglycane acide lipotéichoïque des bactéries à Gram-positif lipoarabinamananne des mycobactéries mannanes des levures Voie d’activation de l’immunité innée, les cytokines : IL-1 produit par les macrophages et les cellules endothéliales rôle dans la fièvre, la margination et la diapédèse leucocytaire stimule la production de prostaglandine IL-6produit par les macrophages, production induite par l'IL-1 IL-8produit par les macrophages et les cellules endothéliales, rôle capital dans la margination leucocytaire. Si immunité innée excessive, il y a sepsis (choc septique). C. Résistance aux défenses immunitaires de l’hôte capsule vie intra-cellulaire homologie protéines du µorganisme et de de l’hôte couverture de molécules de l’hôte infections fœtales Immuno suppression variations antigéniques leucocidines, destruction de cellules phagocytaires inhibition de la phagocytose, du chimiotactisme inhibition de la fusion du phagolysosome D. Facteurs de pathogénicité Comment entrer dans l’hôte ? Colonisation Résistance aux défenses immunitaires Comment provoquer des lésions? Invasion et destruction tissulaire Production de produits toxiques Conséquences pathologiques de la réponse immunitaire Facteurs de colonisation : Adhérence par Adhésines fimbriae, protéines de membrane externe, acides lipoteichoiques Interactions avec récepteur de l’hôte Biofilms Mobilité et chimiotactisme Invasion médiée par des protéines de surface, les invasines qui provoquent une modification de l’arrangement des filaments d’actine au contact de la paroi ; ces filaments vont se condenser pour entraîner la bactérie dans la cellule Expression du pouvoir pathogène : diffusion d'une toxine à distance de la porte d'entrée inflammation au niveau de la porte d'entrée dissémination du microorganisme à partir de la porte d'entrée 16 Toxines bactériennes : protéines actives à faibles concentrations parfois, seule la toxine est pathogène et la multiplication des bactéries ne provoque pas de lésions (tétanos et botulisme). processus: Colonisation de la muqueuse de la porte d'entrée (peut provoquer une inflammation à ce niveau) production d'une toxine dont les effets peuvent s'exercer à distance de la porte d'entrée Exemples:Vibrio cholerae (choléra), Escherichia coli entérotoxinogène, Bordetella pertussis (coqueluche) Staphylococcus aureus producteur de TSST (syndrome de choc toxique)..Corynebacterium diphtheriae Types de toxines bactériennes : Toxines A-B : 2 composants: sous-unité B, responsable de l'interaction avec les cellules de l'hôte, sous-unité A qui contient l'activité enzymatique (toxique). Type d’activité: toxine ADP ribosylante (toxine cholérique, toxine pertussique et toxine diphtérique) toxine protéolytique (toxine tétanique ou toxine botulinique). Toxines formant des pores qui conduisent à la lyse cellulaire: hémolysine d'Escherichia coli, de la listériolysine (hémolysine) de Listeria monocytogenes. Enzymes hydrolytiques : protéases, DNAses, collagénases qui vont participer à la formation des lésions au siège de la multiplication bactérienne. Ex: Infection à S.aureus Comparaison endo et exo- toxines. Caractères Bactéries Gram Nature Fonction Diffusion Spécificité Thermosensibilité Toxicité Immunogénicité Fièvre Exotoxine Endotoxine + Peptide, protéine Métabolique +++ +++ ++ +++ +++ - LPS Structurelle +/+ + +++ Inflammation au niveau de la porte d’entrée : bactéries pathogènes souvent à multiplication extra-cellulaire complication: diffusion à distance de la porte d'entrée (infections urinaires et les abcès souscutanés). certains de ces pathogènes doivent franchir une muqueuse pour atteindre le secteur extra-cellulaire (Shigella, Salmonella, et Neisseria gonorrhoeae) cet envahissement nécessite une étape de multiplication à l'intérieur des cellules épithéliales (invasion). Exemples : Neisseria gonorrhoeae responsable de la blennorhagie, Salmonella typhimurium (diarrhée), Shigella responsable d'une dysenterie Abcès cutanés / furoncles dus à une multiplication localisée de Staphylococcus aureus Angines, sinusites, otites, bronchites le plus souvent dues à des bactéries de la flore commensale du nasopharynx qui deviennent pathogènes (streptocoques, pneumocoques, Haemophilus, anaérobies..). Infections urinaires, basses le plus souvent, ou encore atteinte du rein dues à Escherichia coli 17 Dissémination du µo au niveau de la porte d’entrée : 1. Les bactéries à multiplication intra-cellulaire : - Le plus souvent dans les macrophages. Ex.:Mycobacterium tuberculosis (tuberculose), Salmonella typhi (typhoïde) - les bactéries intra-cellulaires doivent éviter d'être dégradées par les macrophages: soit elles inhibent la fusion phagolysosomale et se répliquent dans la vacuole (Salmonella), soit elles sortent de la vacuole de phagocytose et se répliquent dans le cytosol,(Listeria, Rickettsia)soit elles ne sont pas dégradées dans le phagolysosome. 2. Les bactéries à multiplication extra-cellulaire : pouvoir pathogène le plus fréquent: résistance à l'activité bactéricide du complément et à la phagocytose par les polynucléaires Exemples: septicémies (Escherichia coli, Staphylococcus aureus…) Pneumonies (Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae...)Pyélonéphrites (Escherichia coli, Proteus mirabilis..)Méningites (Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae)Endocardites (Streptococcus, Enterococcus...) Ces bactéries à multiplication extra-cellulaire ont des facteurs de virulence comme une capsule, la chaine latérale du lipopolysaccharide, les systèmes de captation du fer afin de se procurer le fer ferrique, la production de certaines toxines Expression de la pathogénicité : Colonisation à la porte d’entrée Pouvoir pathogène Diffusion d’une toxine à distance Inflammation à la porte d’entrée Dissémination à partir de la porte d’entrée Bactéries intracellulaires Bactéries extracellulaires 5. Agents antibactériens : A. Principes généraux Agents antibactériens : les antibiotiques mais aussi antiseptiques et désinfectants Stérilisation, désinfection Vaccins, immunoglobulines Amélioration de l’hygiène, de la nutrition, de l’éducation, des conditions socio-économiques Historique des substances antimicrobiennes : écorce de quinquina mercure (aussi toxique pour l’homme que pour les tréponèmes: importance de la toxicité sélective) arsenic sulfamide pénicilline G découverte en 1929 mais seulement isolée et purifiée en 1939. Les agents antibactériens : concept : Idéalement: produits à toxicité sélective, bien tolérés, ne sélectionnant pas de résistance, actifs sur les bactéries au site de l’infection, faciles à administrer, sans interférence avec d’autres drogues, bon marché «Antibiotiques» vs produits de synthèse Bactériostase-bactéricidie = action ré- versus irré-versible 18 Activité des antibiotiques : Antibiotiques bactériostatiques peu efficaces chez sujets immunodéprimés ou dans les sites «immunodéficients» (LCR) Effet bactéricide parfois lié à la concentration d’AB Spectre étroit vs spectre large: => si déséquilibre de la flore : - spectre large = bcp d’effets négatifs - spectre étroit = bcp moins de dégâts Association d’antibiotiques infection chronique : toutes les bactéries ne se multiplient pas donc il y a un effet bloquant le métabolisme de celles-ci qui sont peu vulnérables aux antibiotiques infection à plusieurs agents infection due à une grande population microbienne Synergie vs antagonisme Cibles des agents antibactériens : Synthèse de la paroi Synthèse des protéines Synthèse des acides nucléiques Membrane plasmique Synthèse de métabolites essentiels Limites de l’efficacité des agents antibactériens : nature de la bactérie responsable localisation de l’infection caractères de l’agent caractères du patient Les résistances aux AB : Naturelle Imperméabilité : pas de porines assez larges Absence de cible Acquise Diminution deperméabilité Différence de cible Ribosome Enzymes Enzymes B lactamases Acétylases… Augmentation du n° de cibles Efflux 19 Conséquence de la résistance aux antibiotiques (AB): Mortalité: infections résistantes plus souvent mortelles Morbidité: durée prolongée donc plus de chance de diffusion des bactéries-R Coûts: augmente car plus d’AB et nouveaux AB Peu de solutions: peu de nouvelles drogues Traiter une tuberculose multi résistante = traiter 100 tuberculoses sensibles. Donc le problème de la résistance influence nos budgets. La dynamique de la résistance des bactéries aux antibiotiques : 1. En présence d’antibiotiques: sélection de populations bactériennes résistantes (pression sélective) induction de mécanismes de résistance: augmentation des espèces bactériennes résistantes Augmentation de la sélection si dosage faible, si traitement long 2. Si levée de la pression antibiotique: avantage sélectif des souches sensibles: diminution de la résistance labilité des gènes de résistance: diminution de la résistance Mais stabilité des gènes de résistance sans conséquence sur la croissance: persistance des populations résistantes =>jamais de retour complet au niveau de résistance de départ Origine de la pression antibiotique : Prescription médicale quantité durée nature Prescription vétérinaire (ou à usage vét.) promotion de croissance prévention Usage dans l’environnement Evaluation de l’efficacité in vitro d’un antibiotique : l’antibiogramme : Définition: détermination de la sensibilité d'une bactérie aux antibiotiques.. Méthodologies: détermination directe de la CMI en milieu liquide ou solide - méthode des disques ou de diffusion ou de Kirby Bauer E- test- antibiogramme automatisé ou automates 20 Interprétation de l’antibiogramme : 1/ SENSIBLE: Les souches S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique est acceptable. 2/ RESISTANT: Les souches R sont celles pour lesquelles il existe une forte probabilité d'échec thérapeutique. 3/ INTERMEDIAIRE: Les souches I sont celles pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible. Elles forment un ensemble hétérogène pour lequel la seule valeur de la CMI n'est pas prédictive Evolution de l’éfficacité d’un antibiotique : paramètres pharmacocinétiques : évaluent le devenir de l’antibiotique dans l’organisme: effet vs temps absorption distribution lien protéique métabolisme excrétion Evolution de l’éfficacité d’un antibiotique : paramètres pharmacodynamiques : étudient la relation entre la concentration de l’agent et son effet pharmacologique: concentration vs effet activités: concentration dépendante temps-dépendante Aire sous la courbe*/CMI: employé pour les AB dont l’efficacité est liée à la concentration obtenue Temps supérieur à la CMI: intéressant pour les AB dont l’efficacité est peu liée à la concentration 21 B. Les familles d'antibiotiques 1. Principaux agents antibactériens : les inhibiteurs de la paroi B-lactamines Glycopeptides B-lactamines action (en phase de croissance): blocage des transpeptidations et activité autolytique; chaque B-lactamine se lie préférentiellement à certaines PBP’s; chaque espèce bactérienne possède sa propre composition de PBP’s => spécificité de chaque type de B-lactamines Résistance Imperméabilité Modification des PBP’s B-lactamases Pénicillines Carbapénèmes monobactames Céphalosporines B-lactamine : pénicilline naturelles (G,V) anneau B -lactame + anneau thiazidine activité anti-BGP inactivation par pénicillinases (un des groupes de B-lactamases) 1-5 % sujets allergiques Pénicillines semi-synthétiques résistantes à la pénicillinase: oxacilline, méthicilline à activité anti-staphylococcique à spectre élargi: aminopéncillines: ampicilline, amoxicilline, activité sur les BGN non producteurs de B-lactamases antipseudomonas: carboxypénicillines: ticarcilline, anti-BGN, piperacilline, anti- BGP et BGN mais sensibles aux B-lactamases Dérivés de la pénicilline Analogues : acide clavulanique, tazobactam pénicilline-like à faible activité mais inactivatrices de B-lactamases emploi en association comme inhibiteurs Carbapénèmes imipenem et meropenem: CMI très basses vis-à-vis de la majorité des Gram (+), des Gram (-) et des anaérobes, y compris souches productrices de beta- lactamases. traitement d'infections nosocomiales sévères Voie parentérale Monobactames 22 Les céphalosporines ère 1 céfazoline 2ème céfuroxime céfamandole 3ème ceftazidime céfotaxime ceftriaxone 4ème céfépime cefpirone Action sur BGP Action sur BGN Administration ++ sauf entéroC, MRSA, listeria + entériques sensibles Voie orale ++ +(+) idem ++ peu actifs sur BGN résistants Voie orale + Voie IV +++ + +++ -lactamaseR Voie IV +++ ++ ~C1 +++(+) Voie IV +++ Glycopeptides Vancomycine, teïchoplanine: grandes molécules incapables de franchir la paroi des BGN attachement aux chaînes de peptidoglycane rendant le substrat réfractaire aux enzymes (transpeptidase par ex) Anti Gram + (MRSA!) faible index thérapeutique résistance rare (modification de cible: protéine Van A) Administration parentérale Autres inhibiteurs de la paroi: bacitracine, cyclosérine Agents lysant la membrane externe: polymyxines 2. Antimicrobiennes inhibants la synthèse protéique : Sélectivité: ribosomes humains différents des ribosomes bactériens Activité souvent bactériostatique 3 groupes: inhibiteurs de la fraction 50S des ribosomes inhibiteurs de la fraction 30S des ribosomes mupirocine : anti BGP local 1. Antimicrobiennes actifs sur la fraction 50S des ribosomes : Macrolides : éry-, azi-, clarithromycine bactériostatiques à basses concentrations activité ~ pen. G sans inhibition par B-lactamases Biodisponibilité orale maltolérance digestive forte concentration intracellulaire Elimination biliaire R: difference de la cible, inactivation, efflux 2.Antimicrobiennes actifs sur la fraction 50S des ribosomes : Lincosamines : clindamycine Bonne biodisponibilité orale activité anti Gram + et anaérobies Élimination biliaire toxicité: colite pseudomembraneuse R: ~ macrolides 23 3. Antimicrobiens actifs sur la fraction 30S des ribosomes : Aminoglycosides : (gentamicine, amikacine) altèrent l’ARNm Activité liée à la dose, très bactéricide Effet post-antibiotique activité liée à: synthèse protéique, aérobiose, concentration, pH synergie avec B-lactamines activité extra-cellulaire sur BGN, staph. faible index thérapeutique Élimination rénale Toxicité rénale: lien avec les cellules tubulaires. Toxicité auditive Administration parentérale souvent en association pour les infections graves R: inactivation enzymatique, perméabilité, différente cible Autre inhibiteur de synthèse protéique: mupirocine: agent bactéricide local très rapidement métabolisé; actif sur les staphylocoques 4. Antimicrobiens actifs sur la fraction 30S des ribosomes : Tétracyclines : (tétracycline, doxycycline) bactériostatiques fortes concentrations intracellulaires très lipophiles actives per os large spectre mais R multiple par efflux, activité sur bactéries intracellulaires toxicité: dvpt os, coloration émail dentaire 3. Antimicrobiens inhibant les acides nucléiques : Fluoroquinolones : Structure chimique: obtenues par synthèse chimique. structure bicyclique, avec un azote en position 1, un carboxylate en position 3, un carbonyle en position 4, et un fluor en position 6 (d'où le nom de fluoroquinolones). Mécanisme d'action: surtout bactéries à Gram (-). Inhibent 2 enzymes de la classe des topoisomérases, l'ADN-gyrase et la topoisomérase IV. bactéricides et effet post-antibiotique. Résistance: chromosomique par imperméabilisation de la bactérie, mutation du gène codant pour une sous-unité de l'enzyme cible, et acquisition ou surexpression d'une pompe à efflux. L'usage clinique important favorise la sélection de souches résistantes. Spectre: AB à large spectre. ère 1 génération (norfloxacine, ciprofloxacine, péfloxacine, ofloxacine, lévofloxacine) actives contre BGN ème 2 génération (moxifloxacine): 'activité plus large que celles de première génération, couvrant les germes Gram (+) et les anaérobes. Pharmacocinétique: très bonne biodisponibilité orale; très bonne diffusibilité tissulaire et intracellulaire,. élimination rénale et/ou hépatique. Indications: infections génitales, urinaires, gastro-intestinales, ostéo-articulaires. Toxicité: lien aux cartilages:=>CI femmes enceintes / enfants diminution du cytochrome P450 =>augmentation du taux sérique de médicaments métabolisés par cet enzyme. Phototoxicité, neuroexcitation: antagonisme de GABA, lâchage tendineux. Rifamycines: Famille des ansamycines: Rifamycines (ex.: rifampicine) inhibe la transcription ADN => ARN biodisponibilité orale accrue à pH acide; grande diffusion; très liposoluble R par mutation (fréquente) du gène de l’ARN polymérase large spectre us.tjrs en association; mycobactéries 24 Nitro-imidazoles : Nitro-imidazoles (métronidazole, tinidazole, ornidazole) réduction intra-cellulaire, si potentiel rédox bactérien bas => intermédiaires instables se fixant sur l’ADN et cassant le X et diminue enzymes réduits Bactéricides, activité sur les protozoaires et les anaérobies stricts (C. difficile) et quelques µ-aérophiles bonne biodisponibilité orale, bonne diffusibilité Faible toxicité intolérance digestive, effet antabuse, diminue métabolisme d’anticoagulants Peu de résistance sauf Helicobacter pylori 4. Antimicrobiens antimétabolites : = analogues de substrats bactériens (non humains) Sulfonamides bactériostatiques inhibant la synthèse d’acide folique (substrat alternatif pour la déhydroptéroate synthétase) activité limitée, résistance importante Triméthoprime bloque la déhydrofolate réductase et la synthèse d’ac. folique une étape plus loin que les sulfamidés => synergie activité limitée, employé comme les sulfamidés dans le traitement des inf. urinaires Triméthoprime + Sulfamétoxazole association efficace sur de nombreux BGN, BGP et protozoaires us oral et parentéral, très bon marché 5. Agents antituberculeux : 1ère ligne Rifampicine Isoniazide (INH: IsoNicotinic acid Hydrazide) antimétabolite bactéricide interfère avec la synthèse d’acide mycolique; toxicité neurologique et hépatique Ethambutol: mycobactériostatique; interfère avec la synthèse d’ARN; adm. Orale; ES: névrite optique Pyrazinamide: actif sur M. tuberculosis; ES hépatite hyperuricémie 2ème ligne Ethionamide: voisin de l’INH Cyclosérine, acide para-aminosalicylique, ... 6. Nouveaux antibiotiques : 2000-2005 Linézolide (Zyvoxid) Nouvelle classe d’AB, Oxazolidinones, anti BGP, bactériostatique ↓ assemblage 50S-30S des ribosomes Pas de R croisée avec d’autres AB Hospitalier, po/ IV Télithromycine (Ketek) Kétolide, 3-kéto érythromycine, anti BGP Voie orale une prise par jour Ertapénème (Invanz) pas en Belgique Pénème Large spectre sf entérocoques et Pseudomonas aeruginosa Longue ½ vie Dalfopristine-quinupristine (Synercid) pas en Belgique Streptogramines, association active sur la fraction 50S du ribosome Anti-BGP 2005-2007 Daptomycine (commercialisé aux USA) Lipopeptide, bactéricide, anti-BGP Altère la membrane plasmique Tygécycline (Tygacil) Dérivé de la minocycline, actif sur les bactéries tetra-R Anti-BGP, bactériostatique IV, longue ½ vie Télavancin, oritavancin, dalbavancin Nouveaux glycopeptides Céftobiprole Céphalosporine injectable 25 Bactéricide incluant les BGP résistants Principaux mécanismes de résistance: Déterminants génétiques: C, chromosome, P, plasmide, B, les 2 lactames Glycopeptides Aminosides Macrolides Quinolones Tétracyclines B - B P - - perméabilité C C C - C B Efflux - - - C C B cible : -ribosome -paroi -enzyme C C - C - B - C B - Enzymes 6. Les virus Histoire de … 1892: D. Ivanovski démontre que l’agent de la mosaïque du tabac est filtrable 1935: W.M. Stanley en montre la structure protéique cristallisable Depuis les années 50, aspects structurels mis en évidence en µscopie électronique 1953, Lwoff: définition du virion: Un seul type d’acide nucléique Reproduction à partir de son propre matériel génétique Incapacité à croître et à se diviser Parasite absolu de la cellule-hôte Définitions Virus: formes intra- et extracellulaires Virion ou particule virale: forme extracellulaire structurée porteuse de l’infectivité Viroïde: molécule infectieuse d’ARN nu et…prions: «protéines anormales» infectieuses (≠ virus) Virus non-vivants, ≠ µorganismes A. Structures virales Structure des virus : acides nucléiques virals Un seul type d’acides nucléiques / virus Taille variable de quelques kb à des centaines de kb (± 1kb/gène) Totalité de l’information génétique Structures des génomes: ADN Bicaténaire linéaire (svt) Adenoviridae Bicaténaire circulaire (svt) Polyomaviridae Monocaténaire linéaire (rare) Parvoviridae Partiellement bicaténaire circulaire (rare) Hepadnaviridae ARN Monocaténaire linéaire (svt) Picornaviridae Monocaténaire segmenté (svt) Orthomyxoviridae Bicaténaire segmenté (rare) Reoviridae 26 Virus à ADN/virus à ARN génome des virus à ADN génome virus à ARN de 3 à 280 kb taille moyenne de 15 kb l'ADN polymérase dispose d'une fonction de ARN monocaténaire fragile relecture ARN-polymérases imprécises et n'ont pas la cellule est en outre dotée de nombreux de fonction de relecture. systèmes de réparation de l'ADN la cellule ne possède pas de système de taux de mutation extrêmement faibles réparation de l'ARN taux de mutation très élevés Structures des virus : capside virale coque protéique 2 types de symétrie: forme hélicoïdale ou icosaédrique nombre limité de virus: symétrie mixte complexe composée de milliers d’exemplaires de quelques sous-unités protéiques différentes capside icosaédrique: réseau de capsomères = assemblage non-covalent de sous-unités protéiques structure quasi-cristalline s’auto assemblant boîte compacte contenant le génome, des protéines de liaison, des enzymes éventuellement structures d’attachement (spicules) Structures Fonctions sous-unité protéique sous-unité de structure capsomère unité morphologique formée par capside revêtement protéique du génome Les virus complexes 2 groupes de virus à ADN bicaténaire: génome de grande taille => capacités de codage étendues morphologies complexes ≠ virus à symétrie hélicoïdale ou icosaédrale Poxvirus Les plus gros virus connus En coupe , un nucléoïde central entouré d'une coque protéique déprimée au centre par 2 corps latéraux. Membrane externe recouverte d'une série de tubes composés de 2 rangée de sous unités sphériques réparties au hasard (virus de la variole k ) ou sous forme d'u, filament continu encerclant la particule (virus Orf dumouton). Phages caudés virus des bactéries, à symétrie binaire Tête: symétrie icosaédrale abritant le génome Queue: rigide, symétrie hélicoïdale = un tube creux entouré d'une gaine contractile et terminé par des fibres responsables de la fixation à la bactérie. Fixation => contraction de la gaine => pénétration du tube dans le cytoplasme => injection du génome dans la bactérie La queue du phage = seringue à injection 27 Les virus à symétrie non déterminée les lentivirus: sous-famille des rétrovirus (virus du sida) capside à aspect en "tronc de cône” mimivirus Enveloppe : Structure Nature Fonction Enveloppe Dble couche lipidique Support des spicules Spicules Glycoprotéines Fixation du virus aux récepteurs cellulaires Fusion de l'enveloppe avec la mb, activité enzymatique Pores ioniques Protéines Échanges Matrice Protéines (M) assemblage du virion, renforcement de l'enveloppe Structures des virus : enveloppe structure facultative Une quinzaine de familles de virus possèdent une enveloppe => virus enveloppé (par opposition aux virus nus) dérivée des membranes cellulaires Nucléaire (Herpesviridae) Cytoplasmique (Orthomyxoviridae) Reticulum endoplasmique (Bunyaviridae) associant phospholipides de la cellule hôte glycoprotéines protéines matricielles 28 Structure des adénovirus Virus d'Ebola Virus à génome fragmenté : virus influenza Structure du phage T4 Taxinomie virale : Classification selon le type de génome, la stratégie de réplication, la présence éventuelle d’une enveloppe, la symétrie de capside, les similitudes de séquences famille: «viridae», genre: «virus», espèce ex .: Picornaviridae, Enterovirus, poliovirus B. Biologie, multiplication des virus Les virus , inertes sous forme de virions, actifs sous forme d’acides nucléiques intracellulaires Cycle de multiplication ou cycle viral attachement à la cellule-hôte pénétration décapsidation synthèse des protéines virales nécessaires à la production du génome et des protéines structurelles multiplication: réplication du génome, synthèse des composants, assemblage sortie des virions Reconnaissance de la cellule hôte : attachement : Rencontre «au hasard» phase d’adsorbtion: interaction électrostatique => si la cel. est sensible, lien entre un anti-récepteur viral (protéine de capside ou glycoprotéine d’enveloppe) et un récepteur cellulaire récepteur: glycoprotéines membranaires le plus souvent 29 cellule sensible: présence de récepteur => tropisme du virus le récepteur peut être spécifique d’un ou plusieurs types de cellules, d’une ou plusieurs espèces animales cel. permissive si évolution vers un cycle productif, cel. restrictive si cycle peu productif ou productif de virus déficients Exemples de protéines de surface des cellules-hôtes servant de récepteurs viraux : Virus Récepteur Epstein Barr CD 21 sur les lymphos B Hépatite A alpha 2 macroglobuline Herpès simplex 1 Héparane sulfate Poliovirus Molécule d’adhésion cellulaire neuronale, intégrine VIH CD4 des lymphos T Evolution des infections virales Cycle abortif élimination du virus dans certains cycles abortifs: intégration ds le génome de la cellule et « transformation » Cycle productif infection aiguë: libération de virions => lyse des cel. de l’hôte puis maîtrise de l’infection par l’immunité infection persistante: la réponse immunitaire n’élimine pas toutes les cellules infectées Infection latente: le génome viral est intégré dans le génome cellulaire sans réplication; il peut être réactivé => récurrence de l’infection infection chronique: la réplication virale se poursuit l’immunité est insuffisant Cycle productif inductible Latence: Après intégration dans une cellule permissive, le virus peut avoir intégré son génome dans le chromosome, interrompre son cycle lytique, entrer en phase de latence (=> virus latent) => résistance aux défenses immunitaires Activation enclenchement d’un cycle productif sous l’effet d’un stimulus (cytokine, stress, fatigue, co-infection, immunosuppression) => mort cellulaire => nouvelles cellules infectées => récurrence de l’infection Cinétiques des cycles viraux (variations selon la taille des virions et la nature du génome) 30 Cycle de multiplication ( cycle productif ) : reconnaissance-adsorption pénétration - entrée décapsidation (éclipse) multiplication virale assemblage sortie La pénétration : Selon que le virus est nu ou enveloppé, plusieurs mécanismes sont possibles : a/ pénétration directe du génome peu courant, utilisé par les Picornavirus : la fixation au récepteur cellulaire déstabilise la capside fermement attachée à la membrane plasmique. le génome s'en échappe et pénètre directement dans le cytoplasme. b/ endocytose seule mécanisme commun aux virus nus et enveloppés. Le virion se fixe à ses récepteurs puis est endocyté il est à l'intérieur d'une vésicule dont il doit s'échapper, soit par rupture de l'endosome, soit par franchissement de la membrane vésiculaire par le génome (cas du virus poliomyélitique). c/ fusion avec la membrane plasmique mécanisme propre aux virus enveloppés (intervention d'une glycoprotéine virale : la protéine de fusion) : récepteur = structure cellulaire d'attachement primaire Corécepteur = la structure cellulaire d'attachement secondaire nécessaire pour l'étape de fusion. L'enveloppe fusionne avec la membrane cytoplasmique et libère la nucléocapside dans le cytoplasme. d/ endocytose puis fusion avec la membrane de l'endocyte propre aux virus enveloppés. fixation du virus aux récepteurs cellulaires => endocytose Implantation des spicules dans la membrane vésiculaire => fusion de l'enveloppe et de la membrane => libération de la nucléocapside dans le cytoplasme. 31 Entrée d'un virus non enveloppé : Pénétration d'un virus enveloppé : 32 Récepteur cellulaire et peptide de fusion de VIH-1 La décapsidation : Etape indispensable : la capside doit se désolidariser du génome viral pour son expression Etape mal connue: on sait seulement que des protéases cellulaires interviennent dans la décapsidation. Picornavirus: décapsidation en même temps que pénétration, la capside restant à l'extérieur de la cellule ou dans la vésicule. virus à ADN: la nucléocapside est souvent prise en charge par une MAP motrice (Microtubule Associated Protein: kinésine, dynéine), liée aux microtubules du cytosquelette cellulaire, qui la transporte vers la membrane nucléaire. si génome libéré dans le cytosol, lien à des protéines cellulaires et/ou virales et prise en charge par les MAP motrices et les microtubules. signal de localisation nucléaire (NLS) des protéines virales => mobilisation des facteurs cytosoliques => approche de la membrane nucléaire => entrée du complexe nucléoprotéique dans le noyau autravers d'un pore nucléaire. Une fois décapsidé, le virus a cessé d'exister en tant que particule organisée : on ne voit plus de virion, il s'est éclipsé...L'éclipse commence. Ces 3 étapes, fixation, pénétration et décapsidation échouent très souvent parce que : - fixation sans endocytose ou sans fusion - endocytose sans libération de nucléocapside - destruction du génome viral par des nucléases Mais une cellule possède, selon les récepteurs, de 10.000 à 500.000 récepteurs, => de nombreuses particules virales peuvent se fixer à une cellule, => de nombreux génomes sont introduits à l'intérieur de la cellule infectée. 33 Multiplication virale : phase d'éclipse = multiplication virale 2 étapes ± distinctes : 1. réplication du génome 2. transcription des nouveaux génomes en ARN-m => protéines nécessaires à la capside et à l'enveloppe. Cette multiplication s'accompagne le plus souvent d'une inhibition des fonctions cellulaires Réplication : Le génome doit être transcrit, traduit et répliqué Le génome viral va dirigé un détournement de la machinerie cellulaire La cellule va produire des répliques des constituants du virus Multiplication des virus à ADN : Une première transcription conduit à la synthèse de protéines dites précoces, qui interviennent en particulier dans la réplication du génome viral : en général, les protéines précoces ne sont pas incorporées dans les futurs virions, ce sont des protéines non structurales, intervenant dans la réplication du génome. le génome est répliqué. une transcription de ces répliques conduit à la synthèse des protéines tardives : ce sont les protéines de structure, c'est à dire les protéines de capside et d'enveloppe. c'est dans le noyau s'effectue : - la transcription du génome viral - sa réplication Phase précoce: transcription précoce (dépend de l’ARN polymérase cellulaire) d’une partie du génome viral => ARNm migrent vers les ribosomes, traduits en protéines régulatrices et enzymes nécessaires à la synthèse de l’ADN => réplication de l’ADN viral (ADN polymérase virale ou cellulaire) => grand nombre de copies Phase tardive transcription des ADN néoformés => ARNm tardifs traduits en protéines de structure, d’assemblage, d’enzymes Herpesviridae => synthèse des protéines en 3 phases très précoce, précoce et tardive Transcription de gènes très précoces => protéines α contrôlent les gènes précoces et tardifs Protéines précoces β => réplication ADN viral Activent transcription des gènes tardifs Désactivent les gènes précoces Protéines tardives γ = protéines de structure Multiplication des virus à ARN : Le processus diffère selon la nature de l'ARN génomique : ARN + , se comporte comme un ARN-messager, immédiatement traduit en protéines. Parmi ces protéines, une réplicase permet la synthèse de l'ARN complémentaire (ARN - ) qui servira de matrice pour la synthèse des nouveaux génomes. C'est à partir de ces nouveaux génomes que les protéines de structure sont synthétisées. ARN - , il ne peut être traduit directement par les ribosomes et doit donc être préalablement transcrit en ARN-messagers par une transcriptase virale associée au génome. c'est dans le cytoplasme que s'effectue : la transcription du génome viral sa réplication 34 Multiplication des virus à ARN à simple brin à polarité positive : ARN viral sert de messager et est traduit sans transcription (poliovirus) La réplication du génome requiert des ARN polymérases virales => Grande protéine => 3 protéines: => P1: protéines de capside => P2 P3: protéines non structurelles => ARN polymérase => brin à polarité - => brins + => encapsidation de de l’ARN Multiplication des virus à ARN à simple brin à polarité négative : Génome segmenté ou non ARN polymérase virale: ARN- => ARNm Certains virus possèdent une transcriptase inverse ou rétrotranscriptase: ARN => ADN => ARNm Réplication des génomes viraux : Étapes de réplication liées à la diversité des génomes différentes des pro et eukaryotes dépendantes d’enzymes viraux spécifiques Génomes ADN initiation par ADN polymérases virales (grands virus) ou cellulaire + acteurs viraux (petits virus) certains virus (hépatite B) à transcriptase inverse Génomes ARN soit pas d’ADN intermédiaire: initiation par ARN polymérase virale (réplicase) soit formation d’ADN intermédiaire par transcriptase inverse Le voyage des protéines de structure : Une fois synthétisées, les protéines de structure sont acheminées vers les régions cellulaires adéquates grâce à des signaux d'adressage - une sorte de code postal : les protéines de capside - migrent vers le noyau pour la plupart des virus à ADN - restent dans le cytoplasme pour la plupart des virus à ARN. la protéine de matrice va s'apposer sur la face interne de la membrane les glycoprotéines d'enveloppe synthétisées par les ribosomes liés au réticulum endoplasmique (RE). Elles sont insérées, par une séquence hydrophobe, dans la membrane du RE. Elles sont glycosylées, puis transportées à l'appareil de Golgi où certaines spicules subissent un clivage protéolytique indispensable à leurs fonctions (virus de la grippe, virus du Sida). Une vésicule les achemine enfin vers une membrane cellulaire : la vésicule fusionne avec la membrane. 35 L'assemblage : La phase d'assemblage marque la fin de la période d'éclipse commencée avec la décapsidation. Les protéines de capside s'assemblent autour des nouveaux génomes, ou forment une procapside perméable à l'acide nucléique génomique, le plus souvent par un processus d'auto-assemblage: pas de dépense d’énergie, parfois à l’aide de protéases ou de protéines «d’échafaudage» dans le cytoplasme (virus ARN) ou dans le noyau (virus ADN) l'adressage des protéines d'enveloppe et de matrice est remarquable : soit vers le pôle apical, soit vers le pôle basolatéral. Libération : a/ lyse de la cellule : les virus nus L'assemblage a lieu dans le cytoplasme (Picornavirus, Reovirus) ou dans le noyau (Adenovirus, Papovavirus, Parvovirus). La libération des virions dépend totalement de la lyse cellulaire; celle-ci est due aux virions ou destruction de la cellule «d’elle-même» par anomalies métaboliques b/ le bourgeonnement : les virus enveloppés c'est le mode habituel de sortie des virus enveloppés : assemblage et libération sont étroitement associés. le bourgeonnement des nucléocapsides a lieu au niveau des membranes modifiées (d’origine nucléaire, cellulaire ou plasmique), ce qui indique des interactions spécifiques entre la nucléocapside et les protéines d'enveloppe (spicules ou protéines de matrice). formation d’une vésicule d’exocytose Une fois libérées, des phénomènes de maturation sont souvent nécessaires pour que les particule deviennent infectieuses (retrovirus). c/ transport : les Herpesvirus (virus enveloppés) Le nucléocapside des Herpesvirus est assemblée dans le noyau. Le virus acquiert son enveloppe par bourgeonnement à travers la membrane nucléaire et se retrouve dans la lumière du réticulum endoplasmique les Herpesvirus assemblés s'accumulent entre les membranes nucléaires ou dans le réticulum endoplasmique. Enveloppés dans des vésicules ils sont enfin transportés du noyau vers la membrane cytoplasmique. La fusion des membranes vésiculaire et cytoplasmique libère les particules virales à l'extérieur. Le bourgeonnement n'implique pas la destruction de la cellule. Certains virus enveloppés sont peu cytocides (ainsi le virus de la rage), et la libération se poursuit pendant d'assez longues périodes. Cycle lytique d’un virus nu à ADN (polyomavirus) 36 Cycle productif d’un virus enveloppé (ARN+) Cycle d'un rétrovirus 37 Bourgeonnement viral Bourgeonnement et maturation des virus 38 Courbe de multiplication virale C. Conséquences des infections virales : Effets sur les cellules Effets sur l'hôte effets cytopathogènes lyse fusion lésions du génome inhibition du métabolisme produits cytotoxiques vacuoles, inclusions activation des lysosomes transformation cellulaire => Majorité des virus: non pathogènes effets directs 39 libération de toxiques et de pyrogènes disparition des types cellulaires infectés effets indirects réactions inflammatoires et immunitaires de l’hôte D. Interférons : Petites protéines antivirales: interférons alpha, bêta et gamma Produites par les cellules infectées (alpha et bêta) , elles diffusent vers les cellules voisines et provoquent la synthèse de protéines antivirales (enzymes dérégulateurs de la réplication virale) L’IFN gamma est produit par les lymphocytes; il active des granulocytes neutrophiles . E. Cancérogenèse virale : Gènes impliqués: proto-oncogènes: activateurs de la division cellulaire (mutation ou dérégulation => oncogènes) suppresseurs de tumeurs: antagonistes des premiers Processus: acquisition de la capacité de division à l’infini (immortalisation) transformation: perte de l’inhibition de contact indépendance des cellules du substrat et des facteurs de croissance abolition des processus de contrôle de la division Mécanisme virus à ADN (cycle abortif) en général intégration du génome viral dans la cellule-hôte production de protéines virales immortalisantes parfois production de protéines transformantes rétrovirus (cycle productif + transformation) F. Techniques de laboratoire utilisées pourle diagnostic des infections virales : Culture cellulaire cytologie histopathologie µscopie électronique détection d’antigènes détection d’acides nucléiques Culture cellulaire : Très sensible nombreux virus identifiables infection mixte détectable caractérisation virale possible (antivirogramme) mais chère lente virus non (difficilement) cultivable fragilité (transport des échantillons) Lignées cellulaires: culture de cellules primaires (rein de singe, amniotiques...) cellules diploïdes (MRC-5): 50-100 passages lignées cellulaires continues (Hep-2, HeLa) temps de détection c 1 - 20 j. détection effets cytopathogènes hemadsorption 40 Effets cytopathogènes : HSV / rein de lapin CMV / fibroblastes RSV / HEp-2 Mise en évidence du génome : Hybridation moléculaire Détection d’ADN ou d’ARN par une sonde spécifique Amplification génique ou PCR à partir d’un prélèvement, extraction de l’ADN/ARN, puis amplification Séquençage nucléotidique Caractérisation d’un nouvel agent Comparaison de souches Recherche de mutations Techniques de biologie moléculaire : Indications Techniques qualitatives: présence d’un virus Techniques quantitatives : suivi des patients sous traitement anti-viral (HIV, HVC, CMV, HVB). Séquençage : détection de mutations nucléotidiques associées à la résistance aux anti-viraux (HIV, HVB), caractéristiques des génotypes des virus (HVC, HVB). Intérêts Sensibilité Automatisation possible Limites Risques de contamination pour les techniques de PCR. Absence de preuve du caractère infectieux du virus détecté Caractérisation phénotypique de la souche impossible. Coût élevé. Techniques directes : mise en évidence d'antigènes viraux : Principe: incubation du prélèvement avec un anticorps spécifique d’un antigène du virus recherché: révélation de la réaction AG-AC Agglutination de particules de latex Rotavirus dans les selles Immunofluorescence Virus dans les sécrétions respiratoires EIA (enzymo-immuno-assay) Antigène p24, antigène HBs Avantages rapidité: 20 min à 4 h 41 simplicité Limites Manque de sensibilité (résultat négatif n'exclut pas le diagnostic) Immunofluorescence : lecture fonction de l'expérience du microscopiste Techniques indirectes : détection d'anticorps : ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ème Spécificité du 2 AC permet d’identifier IgG/IgA/IgM Sérologies « traditionnelles », comme la fixation du complément Tests rapides (sensibilité variable) Tests de confirmation HIV (western blot) et HVC (immunoblot) : les différentes protéines du virus sont présentes, séparément, sur la membrane qui sert de support de réaction. Ces tests permettent de préciser contre quelles protéines virales sont dirigés les anticorps. Indication Mise en évidence d’un contact plus ou moins récent avec un virus. Avantages Automatisation Rapidité: 4 h Bonne sensibilité, excellente spécificité (ELISA IgG) Limites Sensibilité moindre chez certains patients : nourrissons et personnes immunodéprimées Interprétation délicate parfois. Exemple : pour tous les herpesviridae (HHV, CMV, EBV …) les IgM peuvent être présentes ou non lors des réactivations. G. Agents employés pour la maîtrise des virus : A. anti-viraux : inhibiteurs des cycles productifs A. immunomodulateurs : remplacent ou stimulent la réponse de l’hôte A. virucides : inactivation de virions: antiseptiques, agents physiques Chimiothérapie antivirale : Difficulté de contrôler des éléments intra-cellulaires Confusion entre métabolisme cellulaire et viral Réplication virale intense pendant la période d’incubation Pas d’action in vivo possible sur les formes non-réplicatives Variabilité génétique des virus peu de molécules antivirales, peu de traitements spécifiques Forte stimulation de la recherche depuis la diffusion du SIDA Résistance aux agents antiviraux : Conséquences de mutation(s): substitution critique d’acides aminés de la protéine cible Facteurs favorisants: taux élevé de réplication charge virale élevée pression sélective virus ARN > ADN circonstances épidémiologiques Sous-populations naturellement résistantes Peu de transmission de souches résistantes mais émergence fréquente sous traitement 42 Sites d'activité des agents antiviraux : Etapes du cycle Drogues disponibles Adsorption Pénétration et décapsidation Synthèse d’ADN et ARN amantadine acyclovir, ribavirine, Synthèse des protéines Assemblage Sortie interférons inhibiteurs des protéases zanamavir Agents antiviraux, modes d'action : Inhibiteurs de l’ADN polymérase acyclovir, ganciclovir, ribavirine = analogues de nucléosides Inhibiteurs de la transcriptase inverse zidovudine (AZT), didanosine (ddl), lamivudine (3TC) = analogues de nucléosides nevirapine Bloqueurs des ions Ca amantadine, rimantadine Inhibiteurs de protéases indinavir, ritonavir pleconaril Inhibiteurs de neuraminidases zanamavir 43
