electrophorese capillaire

Anne-Lise FABRE
Sophie LAFON
Gilles MONTGAILLARD
Cédric FREJEBISE
Carole LOUIS
Caroline SOLA
IUP Bioingénierie
Université Paul Sabatier
Mai 2000
INTRODUCTION
Au cours de ce TP nous avons mis en pratique une technique de séparation basée sur la charge
des composés: l'Electrophorèse Capillaire. En effet les molécules chargées positivement ou
négativement sont entraînées dans un capillaire de silice rempli d'électrolyte aqueux. Elles
sont détectées par un système UV indirect nécessitant un chromophore dans le tampon, ou
direct, à ce moment là le composé absorbe.
Nous verrons donc comment obtenir les meilleurs résultats et résoudre les problèmes
rencontrés afin de séparer correctement un mélange de différents sucres.
I BUT
Nous allons réaliser la séparation d'un mélange de sucres après avoir optimiser les paramètres
comme la sensibilité, la résolution, le nombre de plateaux théoriques.
II PRINCIPES
Pour cela nous allons observer l'influence de la variation de la tension sur l'intensité au cours
du temps. Nous pourrons ainsi dresser les courbes I=f(V) et I=f(t) pour une tension donnée.
Nous regarderons aussi l'incidence de cette variation sur le temps d'analyse, l'épaisseur des
pics et le nombre de plateaux théoriques.
Nous utiliserons pour ces différentes analyses le Toluène. C'est un composé neutre qui
absorbe à 280nm.
1. L’ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
Les molécules sont soumises à 2 flux:
Le flux électrophorétique: sous l'influence d'un champ électrique les molécules
chargées se déplacent à une vitesse caractéristique qui est fonction de leur charge et de leur
taille. Les molécules chargées positivement se déplaceront vers la cathode alors que celles
chargées négativement seront attirées vers l'anode. Les molécules neutres ne sont pas
soumises à ce phénomène. La vitesse de ce flux est notée Ve.
Le flux électroosmotique: c'est un phénomène particulier au capillaire de silice, en
effet les groupements silanol sont très acides et donnent facilement S-O2- , ce qui confère au
capillaire une charge interne négative. Dans le tampon les molécules chargées positivement
vont venir s'adsorber à la paroi interne et lorsqu'un courant est imposé, elles vont être
entraînées vers la cathode créant ainsi un flux comparable à un tapis roulant. La vitesse de ce
flux est notée Veo.
La vitesse totale d'une molécule est la somme de ces deux vitesses:
Vt=Ve+Veo
La migration se fait dans un capillaire constitué de polymères de silicate d'un diamètre
inférieur à 100µm (ici 50µm). Il est rempli d'une solution tampon; on injecte à l'anode et on
détecte à la cathode. On applique une tension aux bornes du capillaire et le déplacement des
espèces est régi par les deux phénomènes que sont l'électromigration et l'électro-osmose.
1
+
+++++++++++++++++++++++++
+Ve
Ve -
_
Veo
+++++++++++++++++++++++++
Le Toluène étant neutre, Ve=0, donc sa vitesse de migration est égale à la vitesse du flux
électroosmotique. Nous pourrons donc obtenir la vitesse Veo et tracer la courbe Veo=f(V).
2. LA DÉTECTION:
Sur le type d'appareil utilisé en TP, la détection se fait par spectrophotométrie UV-visible.
La mesure s'effectue directement à travers le capillaire de silice dénudé de sa gaine flexible. Il
est utilisé comme cellule de détection avec un trajet optique de l'ordre de 50µm.
La détection directe utilise l'absorbance naturelle du composé, c'est le cas du Toluène. Il
donnera un pic positif sur l'enregistreur.
La détection indirecte utilise l'absorbance d'un chromophore rajouté au tampon. Il servira à
détecter les composés qui n'absorbent pas, c'est le cas des sucres, ceci donnera un pic négatif
car ils vont diminuer l'absorption du chromophore.
III MATÉRIEL
1. L'APPAREILLAGE
Capillaires
Electrodes
d
Tampon
Enregistreur
Echantillons
2. LES PRODUITS
2.1 Les sucres:
D-Glucose
D-Galactose
Fructose
Saccharose
Masse
180.20
180.20
180.20
342.30
2
pKa
12.35
12.35
12.03
2.2 Le Toluène:
Composé neutre absorbant à 280nm.
2.3 Le tampon:
Na3PO4 pH:12.6, il crée le flux électroosmotique grâce aux ions Na+
2.4 Le chromophore:
L'acide sorbique pour la séparation des sucres.
IV MÉTHODE
1. FONCTIONNEMENT DE L’APPAREIL
Avant la première utilisation, il faut effectuer plusieurs lavages:
Soude 1N
Soude 0.1N 3 min chacun
Eau
Ensuite une injection des solutions dont on veut séparer les composés est réalisée pendant 3
secondes et on replace l'électrode dans la tampon pendant la durée de l'analyse.
Plusieurs paramètres peuvent être changés au cours des différentes manipulations directement
sur la machine, comme la longueur d'onde ou la tension. On peut aussi y observer la variation
de l'intensité.
2. PRÉPARATION DES SOLUTIONS
Pour le Toluène, diluer une goutte dans un volume d'eau. Cela suffit pour l'analyse.
Pour les sucres, réaliser une pesée de chacun des quatre sucres en fonction de leur masse afin
d'obtenir des solutions à 10mM.
On veut 5ml à 10mM soit 10 mmol/l soit un nombre de moles de :
(5.10-3 x 10.10-3)/1= 5.10-5
Sucres
Nombre de moles(n)
Masse molaire(M)
D-Glucose
D-Galactose
Fructose
Saccharose
5
5
5
5
198.17
198.17
180.16
342.30
Masse à peser
(n x M)(mg)
10
10
9
17
Les sucres ne sont pas chargés et de même n'absorbent pas en UV direct, il faut donc utiliser
un tampon dans lequel les sucres sont ionisés. Pour cela , nous allons utiliser un tampon à pH
12.6 afin d'être au dessus des pKa de chacun des sucres. Pour la détection nous allons choisir
un chromophore ayant la même mobilité que le tampon et qui soit soluble dans l'eau.
Calcul de la mobilité du tampon:
Veo=µeoE soit µeo=Veo/E
E=U/l E:champ électrique
U:tension =20000V
l:longueur de la colonne=85cm
3
soit E=23529V/m
avec le Toluène on remarque que à 20000V, Veo=6.1cm/min.
soit µeo=43.10-9m2/s/v
D'après ce calcul, nous avons le choix entre trois chromophores: l'acide sorbique, l'acide p
aminosalicylique et l'acide benzoïque ( de plus la riboflavine, 4ème BGE disponible est
insoluble dans l'eau). Car l'acide benzoïque présente une limite de détection (LOD) inférieure
aux deux autres, le choix entre l'acide sorbique et l'acide p aminosalicylique se fait selon deux
critères:
l'acide sorbique a une mobilité plus faible, donc il créera moins de
bruit de fond.
le Logmax est supérieur à celui de l'acide p aminosalicylique.
Pour ces raisons nous choisissons dons l'acide sorbique comme chromophore afin d'observer
les différents sucres.
V. RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION
1. INFLUENCE DE LA TENSION SUR L’INTENSITÉ DU
COURANT
On trace la courbe I=f(U).
Celle-ci a l’allure d’une droite donc l’intensité est proportionnelle à la tension. D’après la loi
d’ohm, U=RI, nous pouvons déduire la résistance R du capillaire. Cette dernière correspond à
l’inverse de la pente de la droite.
Si nous appliquons une tension supérieure à 25 kV, nous pouvons constater que la relation
n’est plus linéaire. Ceci est la conséquence de l’effet Joule. En effet, la température augmente
dans le capillaire, ce qui conduit à une diminution de la viscosité de l’électrolyte et donc à une
diminution de la résistance. Ceci provoque un énorme bruit de fond. De ce fait, la pente de la
droite I=f(U), augmente.
Cet effet joule est contraire aux avantages de l’électrophorèse capillaire. En effet, cette
technique, grâce à l’utilisation d’un capillaire de faible diamètre et à une grande surface de
contact permet une bonne dissipation de la chaleur.
Cette expérience permet donc de déterminer les conditions optimales suivantes, conciliant :
un intervalle de tension dans lequel l’effet joule n’est pas pénalisant (partie
linéaire de 0 à 25 kV),
une tension la plus élevée possible afin de réduire le temps de rétention des
composés.
Calcul de la résistance R du capillaire
U=RI
R=U/I avec U en volt et A en ampère
R=(20-10).10³/20.10-6=0,5.109=5.108ohms
Etude de I=f(t)
Dès que nous imposons la tension, nous pouvons noter que l’intensité augmente avec le
voltage pendant environ 1 minute (cf. graphes I=f(t)).
4
Représentation schématique du capillaire
Tampon
zone 1
Toluène dans eau
Tampon Na+,PO4-
zone 2
zone 3
Explications
Dans la zone 2, où se trouve le toluène, il y a peu d’ions donc la résistance dans cette zone est
grande.
De part et d’autre de cette zone, la présence des nombreux ions du tampon créé une résistance
faible.
De plus, le champ électrique E est tel que E=U/L=Ri/L
avec L=longueur du compartiment,
donc, dans le compartiment 1, E est grand et dans le compartiment 2, E est
faible.
Au cours de la manipulation, lorsque les ions du tampon passent du compartiment 1 au
compartiment 2, ils sont accélérés. En effet, ils passent d’une zone à champ fort à une zone à
champ faible. Ils sont par contre ralentis durant leur passage du compartiment 2 au 3.
La concentration en ions dans le compartiment 2 augmente jusqu’à ce qu’elle soit égale dans
les différentes zones.
De ce fait, l’intensité augmente jusqu’à ce que la concentration des ions soit la même dans le
toluène et dans le tampon.
Intensité
Représentation théorique de l’intensité
Temps
Il se peut que I recommence à augmenter au bout d’un certain temps. Ceci est du à une
saturation provoquée par l’effet Joule.
2. INFLUENCE DE LA TENSION SUR LA VITESSE
ÉLECTROOSMOTIQUE
2.1 Calcul de vitesse du flux électroosmotique (Veo)
Formule
Veo=distance entre injecteur et détecteur/temps de rétention du toluène
Veo=longueur efficace/Tr
La longueur efficace est de 45 cm.
5
Courbe Veo=f(u)
Veo
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
Tension (U)
2.2 Interprétation
Nous constatons que Veo=f(U) est une droite de la forme y=ax. La vitesse électroosmotique
est donc directement proportionnelle à la tension appliquée.
Quand nous augmentons la tension, nous pouvons constater que l’efficacité augmente. Nous
nous attendrions donc à une augmentation de la résolution, qui dépend de ce facteur.
Cependant, la résolution diminue. Ceci peut s’expliquer par les résultats observés ci-dessus.
Quand la tension augmente, Veo augmente donc le temps de rétention diminue ce qui entraîne
une diminution de la sélectivité, second facteur intervenant dans la résolution.
2.3 Remarques
Normalement, en détection directe, l’eau ne peut pas être détectée.
Sur nos électrophérogrammes, nous avons constaté la présence d’un pic non caractéristique du
toluène. Nous avons voulu chercher à quoi correspondait ce pic. Nous avons injecté
uniquement de l’eau afin de déterminer la spécificité du pic. Notre pic persistant sous ces
conditions, nous avons pu en déduire qu’il correspond à une impureté présente dans l’eau.
Cette eau a sûrement été mal filtrée.
3. SÉPARATION DES SUCRES
3.1 Résultats
Nous avons obtenu l’ordre d’élution suivant :
saccharose (pKa 12.51 et PM=342.3)
D-Glucose (pKa 12.35 et PM=180.2)
galactose (pKa 12.35 et PM=180.2)
fructose (pKa 12.03 et PM=180.2)
3.2 Interprétation
Nous pouvons tout d’abord noter que le PM du saccharose, qui est un disaccharide, est bien
plus important que celui des autres composés. Le saccharose a donc un µélectrophorétique
plus faible que les autres. Il sera donc élué en premier.
6
Soit la relation : pH=pKa+log [B]/[A]
Un sucre est un acide très faible (pKa très haut).
pH
acide OH
base O-
Pour le glucose : pKa=12.35
A pH= 12.6; log [B]/[A]=0.25 donc [B]/[A]=1.8 et [B]=1.8[A]
[O-]=1.8[OH]
Pour le fructose : pKa=12.03
Log [B]/[A]=0.57 donc [B]/[A]=3.7
[O-]=3.7[OH]
Il y a donc plus de fructose chargé que de glucose. Quand ils sont chargés négativement, les
composés sont élués plus tard.
L’ordre d’élution est donc saccharose, glucose, fructose.
Le glucose et le galactose ont des pKa identiques mais nous arrivons tout de même à les
séparer. Ceci s’explique par la différence du rayon de l’ion solvaté. En effet, le
μélectrophorétique dépend de ce rayon et de la densité de charge.
En effet, plus l’ion est solvaté, moins il est mobile et plus il est vite élué (car il doit remonter
le flux positif). Le galactose est plus solvaté que le glucose et est donc élué en premier.
VI CONCLUSION
7