electrophorese capillaire

Anne-Lise FABRE Cédric FREJEBISE
Sophie LAFON Carole LOUIS
Gilles MONTGAILLARD Caroline SOLA

IUP Bioingénierie Mai 2000
Université Paul Sabatier

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INTRODUCTION
Au cours de ce TP nous avons mis en pratique une technique de séparation basée sur la charge
des composés: l'Electrophorèse Capillaire. En effet les molécules chargées positivement ou
négativement sont entraînées dans un capillaire de silice rempli d'électrolyte aqueux. Elles
sont détectées par un système UV indirect nécessitant un chromophore dans le tampon, ou
direct, à ce moment là le composé absorbe.
Nous verrons donc comment obtenir les meilleurs résultats et résoudre les problèmes
rencontrés afin de séparer correctement un mélange de différents sucres.
I BUT
Nous allons réaliser la séparation d'un mélange de sucres après avoir optimiser les paramètres
comme la sensibilité, la résolution, le nombre de plateaux théoriques.
II PRINCIPES
Pour cela nous allons observer l'influence de la variation de la tension sur l'intensité au cours
du temps. Nous pourrons ainsi dresser les courbes I=f(V) et I=f(t) pour une tension donnée.
Nous regarderons aussi l'incidence de cette variation sur le temps d'analyse, l'épaisseur des
pics et le nombre de plateaux théoriques.
Nous utiliserons pour ces différentes analyses le Toluène. C'est un composé neutre qui
absorbe à 280nm.
1. L’ÉLECTROPHORÈSE CAPILLAIRE
Les molécules sont soumises à 2 flux:
Le flux électrophorétique: sous l'influence d'un champ électrique les molécules
chargées se déplacent à une vitesse caractéristique qui est fonction de leur charge et de leur
taille. Les molécules chargées positivement se déplaceront vers la cathode alors que celles
chargées négativement seront attirées vers l'anode. Les molécules neutres ne sont pas
soumises à ce phénomène. La vitesse de ce flux est notée Ve.
Le flux électroosmotique: c'est un phénomène particulier au capillaire de silice, en
effet les groupements silanol sont très acides et donnent facilement S-O2- , ce qui confère au
capillaire une charge interne négative. Dans le tampon les molécules chargées positivement
vont venir s'adsorber à la paroi interne et lorsqu'un courant est imposé, elles vont être
entraînées vers la cathode créant ainsi un flux comparable à un tapis roulant. La vitesse de ce
flux est notée Veo.
La vitesse totale d'une molécule est la somme de ces deux vitesses:
Vt=Ve+Veo
La migration se fait dans un capillaire constitué de polymères de silicate d'un diamètre
inférieur à 100µm (ici 50µm). Il est rempli d'une solution tampon; on injecte à l'anode et on
détecte à la cathode. On applique une tension aux bornes du capillaire et le déplacement des
espèces est régi par les deux phénomènes que sont l'électromigration et l'électro-osmose.

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+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
+Ve
+ Ve - _
Veo
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
Le Toluène étant neutre, Ve=0, donc sa vitesse de migration est égale à la vitesse du flux
électroosmotique. Nous pourrons donc obtenir la vitesse Veo et tracer la courbe Veo=f(V).
2. LA DÉTECTION:
Sur le type d'appareil utilisé en TP, la détection se fait par spectrophotométrie UV-visible.
La mesure s'effectue directement à travers le capillaire de silice dénudé de sa gaine flexible. Il
est utilisé comme cellule de détection avec un trajet optique de l'ordre de 50µm.
La détection directe utilise l'absorbance naturelle du composé, c'est le cas du Toluène. Il
donnera un pic positif sur l'enregistreur.
La détection indirecte utilise l'absorbance d'un chromophore rajouté au tampon. Il servira à
détecter les composés qui n'absorbent pas, c'est le cas des sucres, ceci donnera un pic négatif
car ils vont diminuer l'absorption du chromophore.
III MATÉRIEL
1. L'APPAREILLAGE
Capillaires
Electrodes
Tampon
Enregistreur
Echantillons
2. LES PRODUITS
2.1 Les sucres:
Masse
pKa
D-Glucose
180.20
12.35
D-Galactose
180.20
12.35
Fructose
180.20
12.03
Saccharose
342.30
d

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2.2 Le Toluène:
Composé neutre absorbant à 280nm.
2.3 Le tampon:
Na3PO4 pH:12.6, il crée le flux électroosmotique grâce aux ions Na+
2.4 Le chromophore:
L'acide sorbique pour la séparation des sucres.
IV MÉTHODE
1. FONCTIONNEMENT DE L’APPAREIL
Avant la première utilisation, il faut effectuer plusieurs lavages:
Soude 1N
Soude 0.1N 3 min chacun
Eau
Ensuite une injection des solutions dont on veut séparer les composés est réalisée pendant 3
secondes et on replace l'électrode dans la tampon pendant la durée de l'analyse.
Plusieurs paramètres peuvent être changés au cours des différentes manipulations directement
sur la machine, comme la longueur d'onde ou la tension. On peut aussi y observer la variation
de l'intensité.
2. PRÉPARATION DES SOLUTIONS
Pour le Toluène, diluer une goutte dans un volume d'eau. Cela suffit pour l'analyse.
Pour les sucres, réaliser une pesée de chacun des quatre sucres en fonction de leur masse afin
d'obtenir des solutions à 10mM.
On veut 5ml à 10mM soit 10 mmol/l soit un nombre de moles de :
(5.10-3 x 10.10-3)/1= 5.10-5
Sucres
Nombre de moles(n)
Masse molaire(M)
Masse à peser
(n x M)(mg)
D-Glucose
5
198.17
10
D-Galactose
5
198.17
10
Fructose
5
180.16
9
Saccharose
5
342.30
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Les sucres ne sont pas chargés et de même n'absorbent pas en UV direct, il faut donc utiliser
un tampon dans lequel les sucres sont ionisés. Pour cela , nous allons utiliser un tampon à pH
12.6 afin d'être au dessus des pKa de chacun des sucres. Pour la détection nous allons choisir
un chromophore ayant la même mobilité que le tampon et qui soit soluble dans l'eau.
Calcul de la mobilité du tampon: Veo=µeoE soit µeo=Veo/E
E=U/l E:champ électrique
U:tension =20000V
l:longueur de la colonne=85cm