CHAPITRE 3 : LES PUCES À ADN

CHAPITRE 3 : LES PUCES À ADN
I) Les différents types de puces à ADN
1.1. Puces génomique et puces à expression de gènes
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
1.2. Densité des puces et applications
-
Puces basse densité : 5 à 100 sondes par puces, puces génomiques utilisées en
diagnostic
Puces moyenne densité : 100 à 1000 sondes par puce, utilisées pour des études très
ciblées comme la mutation d’un gène (délétion…)
Puces haute densité : jusqu’à une centaine de milliers de sondes, pour les études de
transcriptomes
1.3. Différents types de puces à ADN haute densité
Plusieurs types en fonction :
- du support utilisé (membrane de nylon, lame de verre)
- de la nature des sondes de capture (PCR, oligos)
- de la façon de fixer (« spotter ») les sondes au support (robot, photolithographie)
- du type de marquage des cibles (élément radioactif, dUTP biotinylé permettant une
détection colorimétrique ou fluorescente, dUTP couplé au Cy3 ou Cy5 =
carbocyanines fluorescente)
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
Ces expériences sont faites pour l’analyse des facteurs de transcription, on veut savoir où
ils se fixent et donc quels gènes ils vont réguler. On traite les cellules vivantes au
formaldéhyde, ce qui crée des liaisons covalentes entre le facteur de transcription et l’ADN.
Après ce traitement, on extrait l’ADN des cellules et on le coupe en morceau, puis on va
réaliser une immunoprécipitation. On ajoute l’anticorps lié directement ou indirectement au
gel d’agarose puis on fait une centrifugation à basse vitesse, dans le culot la bille est liée à
l’Ac qui est lié au facteur de transcription qui est lié à l’ADN d’intérêt, le surnageant va être
jeté et on va analyser le culot. On se débarrasse des protéines fixées à l’ADN puis on réalise
plusieurs PCR pour tester plusieurs gènes, on peut ainsi savoir si le facteur de transcription est
lié au promoteur d’un gène.
Dans le Chip-on-chip, on fait une PCR multiplexe puis on passe les produit sur une puce au
lieu de les passer sur un gel, les spots s’allument et on sait où le facteur de transcription s’est
fixé.
CGH : hybridation génomique comparative :
CGH : utilisée pour regarder le
génome de cellules cancéreuses et voir
s’il y a des amplifications de séquences
ou des pertes de séquences.
On marque l’ADN tumoral et l’ADN
d’une cellule normale, on prend des
chromosomes en métaphase et les
fragments d’ADN des deux cellules
vont s’hybrider sur le chromosome, on
va ensuite rajouter un fluorochrome
vert
lié
par
exemple
à
la
steptavidibiotine. La steptavidine et la
biotine ont une forte affinité entre elles,
on peut incorporer un nucléotide lié à la
biotine qui ne gène pas l’hybridation
puis une vidine déjà liée à un ou des
flurochromes (la vidine comportant 4
sites de fixation à la biotine).
On ajoute ensuite un Ac antidioxygénine couplé à un fluorochrome
rouge pour reconnaître l’ADN normal.
Si les deux ADN se sont fixés, on va
avoir une fluorescence orange. Si la
fluorescence est entièrement verte, il y
a peut-être plusieurs chromosomes dans
l’ADN tumoral. Si le bras long est
rouge, il y a une délétion des bras longs
dans les cellules tumorales. Si une
bande apparaît en vert, il y a une
amplification de ce fragment tumoral.
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
SNP : Single Nucleotide Polymorphism.
Sur une séquence, un nucléotide peut être variable d’un individu à l’autre, on peut donc
faire une carte SNP.
II) Les étapes de l’analyse par puces à ADN
2.1. Fabrication de la puce
La synthèse des ADN de capture se fait par PCR ou par oligonucléotides en plaques 96
puits, puis cet ADN est déposé par un robot sur une lame de verre, par une synthèse
d’oligonucléotides in situ ou directement sur une lame par photolithographie.
Technologie d’Affymétrix, synthèse in situ d’oligonucléotides sur les puces :
2.2. Préparation et marquage de l’ADN cible
Puce génomique : on extrait l’ADN de l’échantillon et on amplifie les séquences
d’intérêt par PCR
- Puce à expression de gènes : on extrait les ARN de l’échantillon et on les
rétrotranscrit en ADNc
Le marquage se fait par incorporation d’un dNTP marqué par un élément radioactif ou par
un fluorochrome ou par de la biotine.
-
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
2.3. Hybridation des ADN cibles aux ADN de capture fixés sur la puce
Cette hybridation est suivie d’un lavage.
2.4. Détection lecture par un scanner (adapté au type de marquage de
l’échantillon) relié à un ordinateur qui analyse les données
QuickTime™ et un
décompresseur
sont requis pour visionner cette image.
III) Applications des puces
3.1. Puces génomiques
3.1.1. Applications agro-alimentaire/environnement
-
détection d’OGM
analyse microbiologique de l’eau de consommation, d’aliments
compositions d’aliments (quel type de viande : port, bœuf, dinde)
3.1.2. Applications médicales
-
-
Diagnostic biologique de maladies infectieuses et recherche de résistance (par
exemple due à des polymorphismes pour les rétrovirus qui sont résistants aux
antiviraux ciblant la transcriptase inverse), par exemple une puce basse densité
dédiée à la détection des pathogènes responsable de mammites chez la vache
Analyse de mutations génétiques (maladies génétiques)
Recherche pharmaceutique (pharmacogénomique) pour s’adapter au profil de
chaque individu, exemple des cytochromes P450 (au niveau du foie) qui diffèrent
selon les individus
3.2. Puces à expression de gènes
3.2.1. Applications médicales
-
Identifier des gènes spécifiquement actifs ou inactifs dans les tissus malades
Recherches pharmaceutiques (pharmacogéniques) pour mieux comprendre l’action
des médicaments, pour réaliser un criblage médicamenteux ou pour identifier
rapidement de possibles effets secondaires ou toxiques