Avril n°194

Avril 2002 n°194
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Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires
additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF
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Concepts et Techniques
1. On trouvera dans F Hediger et al.; Nature Cell
Biology 4 (MAR02) E53-E55, un commentaire sur les
relations entre transcription et localisation dans
certains domaines spatiaux (régions) du noyau.
On sait que les télomères, au moins ceux de la
levure Saccharomyces cerevisiae, sont positionnés en
paquets au contact de l'enveloppe nucléaire. Le
positionnement de gènes, normalement transcrits,
dans cette zone entraîne la suppression de leur
expression.
Le mécanisme d'ancrage a, progressivement, était
révélé. On a pu montrer, en 1998, que l'hétérodimère
Ku70p, une protéine qui reconnaît et lie les cassures
ADNs, se lie aux télomères. S'il est défectif, les
télomères ne se rassemblent pas à la périphérie et ceci
compromet la répression des sites HM contenant les
types sexuels réprimés. Ils ne sont pas les seuls
responsables de la localisation. Le facteur Mlp2p, qui
se lie à Ku, et qui ressemble à la myosine, participe à
la localisation car, quand il est muté, les télomères se
dispersent (voir F Feuerbach F. et al. Nature Cell
Biology 4 (JAN02) 214-221). Ces derniers auteurs
montrent, par ailleurs, que les nucléoporines des pores
nucléaires, Nup60 et Nup145, pourraient bien
également intervenir. Il existe donc au moins trois
sites fonctionnellement différents dans l'enveloppe
nucléaire, les pores, les sites d'attachement des
télomères et les sites d'ancrage de la chromatine où se
concentre l'hétérochromatine..###
2. Une nouvelle revue sur les ARNs interférants
(post-transcriptional gene silencing ou PTGS et RNA
interference ou RNAi) est parue avec NJ Caplen;
Trends in Biotechnology 20(FEB02) 49-51. Ces
mécanismes (probablement très voisins), quoique
découverts de façon indépendante (PTGS chez plantes
et champignons, et RNAi chez Caenorhabditis
elegans et Drosophila), présentent de fortes analogies,
comme le signalent les articles déjà analysés dans ce
bulletin (par exemple le bulletin d'Août 2001 §58). On
a également démontré son existence chez les
mammifères, mais les fonctions physiologiques
assurées in vivo , principale question à ce sujet, restent
à élucider. On s'en sert, cependant, et dès maintenant,
pour établir rapidement la fonction de gènes. La revue
revient sur le rôle de la RNase Dicer qui découpe les
ARNs en polynucléotides courts de ~21–23
nucléotides correspondant aux ARNs doubles brins
inducteurs. Dicer a probablement une activité
hélicase.
Une revue de EG Moss; Current Biology 12
(19FEB02) R138-R140, porte à nouveau sur les
microARNs de 21-24 nucléotides codés directement
dans le génome par plus d'une centaine de gènes (dont
deux, chez Caenorhabditis, lin-4 et let-7, jouent un
rôle dans le développement) et qui ont fait l'objet
d'une rafale d'articles l'an passé (voir également les
Bulletins de Février §8 et Mars §5).

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3. On peut utiliser l'interférence ARN en
provoquant une expression symétrique des deux
brins de l'ADN chez la Drosophile. C'est plus simple à
réaliser qu'avec des séquences contenant des
répétitions inversées qui engendrent le même
phénomène maispeuvent provoquer, par ailleurs, des
remaniements génomiques. E Giordano et al.;
Genetics 160 (FEB02) 637-648. Les auteurs ont utilisé
deux batteries convergentes d'UAS (Upstream
Activating Sequences de la levure) dépendantes de
Gal4 flanquant des séquences des ARNs à éliminer.
L'induction tissu-spécifique de la construction permet
une déplétion des messagers dans ces tissus.
4. Un nouveau système d'exhibition de peptides
sur les formes L (sans paroi) d'Escherichia coli et
Proteus mirabilis est décrit dans C Hoischen et al.;
Applied & Environmental Microbiology 68 (FEB02)
525-531. On obtient ainsi des formes actives
d'enzymes exprimées de cette façon.
5. Le génome des eucaryotes est fragmenté en
domaines (ADN) dont l'expression est
coordonnée par des "enhancers" (séquences
activatrices de transcription) dont l'action se fait
sentir sur des distances considérables au sein du
domaine. (Voir également le § )Ils contiennent
des domaines chromatiniens condensés qui
peuvent perturber l'expression dans des
domaines immédiatement adjacents. La cellule
dispose, cependant, de moyens pour éviter ces
débordements, dont les "isolateurs". Ce sont des
séquences reconnues par des protéines
spéciales qui spécifient de façon stable les
frontières d'un domaine, et limitent les
perturbations d'origine extérieures.
Une revue sur ces "isolateurs" "est parue
avec AG West et al.; Genes & Development 16
(15FEB02) 271-278. Elle traite, en fait aussi bien des
"enhancers "que des isolateurs. Elle est nettement
touffue. ###
Ils peuvent intervenir de deux façons différentes;
soit par blocage l'action d'une enhancer en
s'interposant entre l'enhancer et le promoteur, soit en
empêchant la chromatine de se condenser à partir d'un
domaine voisin.
Certains isolateurs sont capable des deux. D'autres,
particulièrement chez la levure, jouent surtout le rôle
de barrière. On a pu montrer, au moins dans le cas de
l'élément HS4 du gène de ß-globine que l'isolateur
joue les deux rôles, mais les activités sont séparables.
Mais il semble bien qu'il n'existe pas de modèle
universel du mécanisme.
Au moins un des isolateurs caractérisés
intervient sur la formation de boucles de la
chromatine empêchant les interactions enter
éléments situés de part et d'autre de l'isolateur.
6. Lors de l'empreinte parentale un seul des deux
allèles parentaux d'un autosome de mammifères est
inactivé pour assurer un dosage génique convenable.
Ceci s'opère par un mécanisme épigénétique
fonctionnant en cis (sur le même ADN). La plupart
des gènes à empreinte des mammifères sont regroupés
par paquets et associés à des gènes codant des ARNs
non traduits. Dans le cas des gènes Igf2/Ins2 du
chromosome 7, associés au gène H19, codant l'ARN
non traduit, l'empreinte est gérée par un "silencer" et
un isolateur. L'empreinte est liée à la méthylation de
l'isolateur.
Dans le cas des gènes Igf2r/Slc22a2/Slc22a, situés
dans une région de 400 kb du chromosome 17, et
uniquement exprimés chez la femelle, un "silencer"
bidirectionnel de 3,7 kb contient également le gène
Air, exprimé chez le mâle et donnant un ARN non
traduit. Son promoteur est localisé dans cette
séquence de 3,7kb appelée imprint control element
(ICE) et qui est localisée entre Slc22a2 et Slc22a3 en
amont et Igf2r en aval.
Air recouvre, en antisens, l'un des trois gènes et son
promoteur est localisé dans l'intron 2 de Igf2r. On
savait que l'expression d'Air est corrélée avec la
répression des trois autres gènes dans le génome mâle,
et qu'il entraîne une méthylation du promoteur. On
vient de montrer que cet ARN d'Air est indispensable
à la répression des trois gènes.
Une troncature de 96% de l'ARN Air, entraîne un
maintien de l'empreinte et la méthylation du
promoteur d'Air, mais la perte de la répression des
trois gènes et donc de leur empreinte. Cet ARN
intervient donc directement dans l'empreinte,
contrairement à ce qui se passe pour H19, et ICE a
une action bidirectionnelle. F Sleutel et al.; Nature
415 (14FEB02) 810-813.
7. Ce que l'on appelle la co-suppression, c'est à dire
la répression de gènes, que la cellule estime en trop
grand nombre, est probablement une défense contre
les acides nucléïques envahisseurs :virus, transposons
etc. Elle fait intervenir une reconnaissance par
homologie et n'impliquent apparemment pas de
destruction des messager comme dans le PTGS ou
RNAi (voir le §2).
Les nombreux exemplaires des rétrotransposons
Ty1 (une trentaine) sont dispersés dans le génome de
Saccharomyces cerevisiae, et sont fortement exprimés
(10% des messagers). On pourrait donc penser qu'il
n'y a pas de co-suppression. On vient de montrer, en
utilisant un transposon reporteur Ty1-URA3 associé à
une sélection négative par le 5-fluoroorotate, qu'il peut
sibir une telle co-suppression indépendante de la
méthylation de l'ADN (la levure n'utilise pas cette
méthylation) et de l'intervention des gènes polycomb
impliqués, chez la drosophile, dans la répression de
l'expression des gènes homéotiques via la chromatine.

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Les gènes de Ty1 sont, soit tous exprimés, soit tous
réprimés. YW Jiang; Genes & Development 16
(15FEB02) 467-478.
Le basculement d'un état vers l'autre est rapide. Il
faut un grand nombre de copies de Ty1 pour que la
co-suppression soit déclenchée, ce qui suggère que les
gènes de Ty1 sont sous une commande en boucle
négative. Les répresseurs transcriptionnels de Ty1
facilitent la co-suppression et les promoteurs de Ty1
sont indispensables, ce qui indique que cette co-
suppression se situe bien au niveau transcriptionnel.
La transcription des éléments Ty1 est régulée par le
type sexuel et la voie des MAP kinases Ste11, Ste7 et
Kss1 (impliquées dans la filamentation). On repère le
rôle du système de type sexuel chez les haploïdes où
l'expression est plus forte du fait de la présence du
répresseur hétérodimérique a1/2 chez les diploïdes.
La voie des MAP kinases (celle fonctionnant en
carence d'azote) permet d'activer la transcription en
stimulant les facteurs de transcription Ste12 et Tec1.
8. Il existe bien d'autres petits ARNs dans les
cellules. Parmi eux on trouve les ARNs nucléaires
riches en uracyle (U snRNAs). L'ARN 7SK est connu
depuis longtemps, mais son rôle était resté
énigmatique. On a récemment montré que c'est un
régulateur négatif du facteur d'élongation P-TEFb
(pour Positive-Transcription Elongation Factor)
associé à l'ARN-polymérase II (la transcriptase),
lors de la transcription. P-TEFb est un hétérodimère
associant une kinase (Cdk9) qui phosphoryle la
queue C-terminale de la polymérase II d'une part, à
l'une des sous-unités de cyclines (T1, T2 ou K) d'autre
part. Cette phosphorylation active l'activité des
complexes de transcription lors de l'élongation. On
constate, lors d'un stress, une séparation entre P-
TEFb et 7SK, ce qui augmente la population de P-
TEFb actif (Z Yang et al.; Nature 414 (15NOV01)
317-322 et VT Nguyen et al.; p.322-325). Un
commentaire de BJ Blencowe; Current Biology 12
(19FEB02) R147-R149, discute les implications de
cette révélation. Ce dernier souligne que dans les
complexes actifs que l'on étudie actuellement pour
révéler des interactions, des bandes anormales
peuvent fort bien être constituées d'acides nucléïques.
11. La transposition de l'élément Mu a lieu au sein
d'un complexe ADN-protéines appelé
transpososome. Il comprend les quatre sous-unités de
la transposase MuA qui reconnaissent chacune un site
de 22 pb situé près de l'extrémité du transposon. Les
six sites existants ne sont pas tous utiles, mais
plusieurs sont indispensables à l'assemblage du
transpososome. Il y en a trois d'un côté de la boucle
reliant les deux sites de clivage et trois de l'autre (L1 à
L3 et R1 à R3). Trois des sous-unités se lient à R1, L1
et R2, tandis que la quatrième se lie probablement à
L2, mais de façon assez labile. R3 et L3 sont reconnus
par des sous-unités additionnelles non catalytiques.
On peut utiliser ces sites pour une transposition. Il en
suffit de deux voire un seul. I Goldhaber-Gordon et
al.; Journal of Biological Chemistry 277 (08MAR02)
7694-7702. La structure des sites reconnus est
analysée dans un second article du même groupe avec
ses éléments I Goldhaber-Gordon et al.; p.7703-
7712. Il est vraisemblable que les sites multiples

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permettent le positionnement des sous-unités de la
transposase chaque site activant allostériquement la
transposase. Chaque sous-unité reconnaît un site sur
l'ADN et un site de clivage de l'autre côté de la
boucle. Un schéma clair est donné.
12.Lors de la Genome Tri-Conference du
Cambridge Healthtech Institute du 26 Février, Open
Channel Software et des chercheurs de Wayne State
University ont dévoilé leur nouveau logiciel
d'identification de fonctions qui est sensé corréler
automatiquement les données de microréseaux
d'expression avec des fonctions des gènes révélés. Il
s'agit de Onto-Express™.
Il permettrait de déterminer, à partir d'UniGene,
GenBank et Ensembl, la fonction structurale ou
régulatrice des protéines dont l'expression est
modifiée, leurs rôles connus dans une fonction
biologique, la localisation de leur activité dans les
cellules et la localisation chromosomique des gènes
identifiés en quelques minutes. Une version de base
gratuite est disponible à http://www.onto-express.org.
La version commerciale ajoute des algorithmes
permettant notamment d'indiquer l'indice de confiance
(p value) des résultats. PRNewswire (26FEB02).
Open Channel Software (OCS) est une organisation
Internet qui distribue des logiciels triés utiles aux
sciences de la vie.
13. Bien que l'on n'ait identifié qu'une quarantaine
de milliers de gènes chez l'homme, on estime qu'ils
codent probablement beaucoup plus de protéines et
cette dernière diversité est probablement la plus
importante. Il est donc difficile de dire qu'on a
identifié le gène d'une protéine. Les fonctions peuvent
être fort diverses, et il suffit parfois de peu de
modifications post-transcriptionnelles pour assurer
cette diversité, parfois sans qu'on puisse facilement
détecter ces légères différences. C'est ce que soutient
un commentaire de J Rappsilber et al.; Trends in
Biochemical Sciences 27 (FEB02) 74-78. La
spectrométrie de masse porte sur des peptides
relativement courts qui sont ensuite confrontés avec
des protéines connues de banques de données. La
technique de spectrométrie de masse, du fait qu'elle
fait largement intervenir les données de banques de
données peut fort bien ignorer les (ou des) isoformes.
Ceci permet de caractériser les protéines, puis de les
identifier à une fonction, les banques de données
remplissant les trous, mais ceci risque de faire passer à
côté de modifications fines non répertoriées, et donc
d'autres fonctions. Elle est capable d'identifier une
protéine, par recours à une banque, à partir d'un
peptide de 7 acides aminés qui est généralement
unique dans l'espèce humaine, par exemple. Par
conséquent plusieurs peptides permettent d'obtenir
une quasi-certitude. Ceci encourage à la paresse. Les
anticorps ont été largement utilisés dans
l'identification des protéines, mais l'idée qu'un gène
correspond à une protéine et donc à une fonction est
implicite dans ces procédés. Il y a donc une
insuffisance notoire de la protéomique sous ses
formes actuelles.
Il existe d'autres sources d'erreurs. Ainsi un
anticorps est dirigé contre un épitope limité de la
protéine dépend de l'organisation tridimensionnelle de
charges, et de l'hydrophilie ou hydrophobie de
l'épitope reconnu. Elle n'est pas toujours spécifique
d'une séquence (antigénicité croisée). C'est plus
particulièrement vrai pour les anticorps polyclonaux
qui sont, de fait, un mélange d'anticorps monoclonaux.
Inversement on peut les utiliser pour détecter des
homologues protéïques dans une espèce différente.
Le fait qu'un anticorps reconnaisse un motif donné fait
qu'il ignore une grande partie du reste. On a ainsi
détecté chez l'homme l'homologue d'un facteur
d'épissage de la levure en utilisant un anticorps
contre la sous unité p65 du facteur NF-kB qui
intervient, comme nous l'avons souvent vu, dans les
cascades de signaux chez les mammifères, donc avec
une toute autre fonction. Il faut donc beaucoup
d'autres données d'origines différentes pour trier les
résultats.
14. Une méthode de détection de la fixation de
protéines sur l'ADN en mesurant les changements de
charge sur l'ADN est décrite dans EM Boon et al.;
Nature Biotechnology 20 (MAR02) 282-286. Les
auteurs ont effectué la démonstration avec la protéine
se liant à la boîte TATA ou la méthylase HhaI ou
l'uracil DNA glycosylase, ainsi qu'une enzyme de
restriction face à son substrat méthylé ou non.
15. Les protéines kinases constituent une famille
étoffée (plus de 2000 d'entre elles sont connues). On
admet, par ailleurs, qu'au moins 30% des protéines
cellulaires ont une version phosphorylée. Il est,
cependant, difficile de localiser les sites de
phosphorylation et d'essayer d'en déduire les
domaines fonctionnels. On trouvera dans SB Ficarro
et al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 301-305,
une technique pouvant permettre d'identifier, d'un seul
coup, toutes les protéines cellulaires phosphorylées
sans les isoler, ni les purifier.
On peut, par ailleurs, visualiser la phosphorylation
de protéines dans une seule cellule (M Sato et al.;
Nature Biotechnology 20 (MAR02) 287-294). On peut
ainsi visualiser les cascades de transduction de
signaux dans une cellule. On fusionne des versions de
la GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescent
différemment avec un segment de liaison flexible
(linker) comprenant un domaine substrat de la kinase
à étudier, lié à un domaine reconnaissant sa version
phosphorylée. Le rapprochement des deux va modifier
la conformation générale et influer, ainsi, sur la
résonance de fluorescence entre les deux GFPs.
Des puces pour l'analyse quantitative de l'activité
des kinases sont, elles, décrites dans BT Houseman et
al.; Nature Biotechnology 20 (MAR02) 270-274. Elles
utilisent des peptides dont la phosphorylation est
détectée par SPR (Surface Plasmon Resonance, c'est à
dire un système de détection et de quantification basé
sur les changements de réfraction de la surface quand
la masse des peptides est modifiée), ou fluorescence.

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Le problème avec les puces de peptides résident dans
la mauvaise maîtrise du processus chimique de
fixation sur le support. Dans ce cas, un procédé de
fixation pour la kinase c-Src est décrit.
16. L'un des gènes codés par l'ADN mitochondrial
chez la quasi-totalité des eucaryotes est celui de la
sous-unité 6 de l'ATP synthase (ATP6). Il existe
cependant des exceptions: Plasmodium (agent du
paludisme), les ciliés Tetrahymena et Paramecium,
ainsi que l'algue verte unicellulaire Chlamydomonas
reinhardtii. On connait la séquence complète des
génome mitochondriaux chez ces organismes, et on y
a recherché, en vain, des gènes cryptiques codant cette
protéine. On en a déduit que le gène devait être
nucléaire. On vient de le démontrer chez
Chlamydomonas. S Funes et al.; Journal of Biological
Chemistry 297 (22FEB02) 6051-6058. La protéine a
dû être modifiée au cours de l'évolution pour pouvoir
retourner dans la mitochondrie. Les ATP synthases,
comme les autres protéines des systèmes
membranaires de la membrane interne assurant la
chaîne respiratoire et la phosphorylation oxydative,
sont très hydrophobes avec, dans le cas de l'enzyme
mitochondriale humaine, cinq domaines
transmembranaires. Ceci a été partiellement corrigé
dans le cas des enzymes à codage nucléaire. La
protéine est, alors, moins hydrophobe. Trois des
domaines transmembranaires qui n'interviennent pas
directement dans la translocation des protons sont, en
effet, moins hydrophobes. Le dispositif de retour à la
mitochondrie est complété par une longue séquence
(107 aa) de ciblage rajoutée. On retrouve ce dispositif
pour les gènes nucléaires de cytochrome oxydases
COXII et COXIII. Voir également le commentaire de
H Jacobs; Trends in Genetics 18 (MAR02) 120.
17. On sait depuis un certain temps qu'un stress
permet un accroissement de la fréquence des
mutations. Ce qui est toujours resté plus ou moins
mystérieux est que tout paraît indiquer, par exemple
dans le cas d'une mutation d'utilisation du lactose, que
ces mutations semblent se concentrer
particulièrement dans l'opéron lactose. On vient de
suggérer que ce ciblage des mutations est
probablement un mécanisme purement darwinien, au
cours duquel la sélection naturelle agit en trois étapes:
la première est une amplification de lac, puis on a
sélection des allèles lac+ dans la batterie de gènes
amplifiés, enfin les lac mutants sont progressivement
éliminés et les possesseurs des seuls lac+ ségrègent.
H Hendrickson et al.; Proceedings of the National
Academy of Sciences USA 99 (19FEB02) 2164-2169.