Système HS (heat shoc)

TP 1 de génétique appliquée :
Recombinaison mitotique
Introduction
La recombinaison mitotique est un phénomène qui a lieu dans les cellules somatiques, entre deux
chromosomes homologues (après la réplication). Dans ce TP, nous allons étudier différents
phénotypes issue de la recombinaison mitotique. Celle-ci peut être induite par une enzyme
particulière, la flippase, ainsi que des séquences particulières appelées frt, au niveau desquelles la
flippase va induire des recombinaisons (système flp/frt). En croisant différentes souches
transgéniques de drosophiles, on va créer des individus, au niveau desquels la flippase va s’exprimer
et initier des recombinaisons mitotiques, que l’on pourra identifier grâce à phénotypes particuliers
observables (mosaïque).
Pour chaque croisement, on connait le génotype des parents. On peut alors en déduire le génotype
de la descendance, et alors prédire les phénotypes de celle-ci. On s’intéressera alors aux descendants
au niveau desquels les recombinaisons mitotiques sont possibles grâce à l’expression de la flippase.
On observera leur phénotype puis on l’interprétera d’après leur génotype. On dégagera également
l’intérêt des techniques d’induction de la recombinaison mitotique employées, et de leur utilité en
génétique.
L’expérience est séparée en deux parties, d’une part, un travail sur le phénotype des yeux, d’autre
part sur les soies. Pour le travail sur les yeux, on induit les recombinaisons grâce au promoteur
eyeless et au système GAL4-UAS. Eyeless n’est actif que dans les yeux, ce qui nous permet de réaliser
des recombinaisons mitotiques juste dans les yeux, le système GAL4-UAS permet la révélation de
l’action de la flippase. La deuxième partie sur le phénotype des soies utilise des promoteurs HS (heat
choc). On induit alors les recombinaisons mitotiques, cette fois sur toute la drosophile, par simple
incubation à 37°C.
Pour les deux expériences, on cherche à faire exprimer la flippase pour qu’elle initie des
recombinaisons entre les séquences frt. Les recombinaisons vont engendrer un phénotype
particulier, et ceci grâce à l’introduction de gènes particuliers de façon a ce que les recombinaisons
mitotiques les touches. On élabore des structures sur les chromosomes, qui vont permettre, plus ou
moins directement, l’élaboration d’un phénotype particulier.
Système GAL4-UAS
On utilise le système GAL4 et le gène lacZ précédé par un promoteur de type AUS (induit par GAL4).
Gal 4 est sur le chromosome qui contient les séquences FPS, et ne se verra transcrit que s’il y a
recombinaison mitotique au niveau de ces séquences. S’il est transcrit, Gal4 ira activer la
transcription de lacZ grâce au promoteur AUS, situé sur un autre chromosome.

Sur le chromosome 2, le promoteur de l’actine est un promoteur constitutif. La transcription a lieu
continuellement. La transcription est cependant stoppée très rapidement au niveau du terminateur
situé entre les deux séquences FRT. Dans les yeux, la flipase va s’exprimer, grâce au promoteur
eyeless, et va agir au niveau des séquences FRT, situées sur le chromosome 2, en effectuant des
crossing-over. La partie du génome situé entre les 2 FRT est alors remplacé par un fragment sans
séquence terminatrice (fragment correspondant de l’autre chromosome 2). La transcription n’est
alors pas stoppée et on va alors avoir transcription du gène Gal4. GalA va alors activer sur le
chromosome le portant, la transcription du gène lacZ : on va alors avoir production de la
βgalactosidase. On aura production de Bgal exclusivement dans les cellules où il y aura eu
recombinaison mitotique, donc dans les cellules des yeux. Dans les autres cellules, la Bgal ne sera pas
synthétisée.
Premier croisement : 4410 x 5618
Souche 4410 : Chromosome X : (w, P {ey-Gal4})
Chromosome 2 : (P {UAS-lacZ) / Cyo (balanceur))
Souche 5618 : Chromosome X : (w, P {ey-FLP3})
Chromosome 2 : +
CROISEMENT 1a:
CROISEMENT 1b :
P(actine)
FRT
FRT
Facteur de
terminaison
Gal4
Chromosome 2
Eyeless
Flippase
AUS
LacZ
4410
5618

Seuls les individus marqués d’un point rouge nous intéressent : on a le gène FLP, précédé par eyeless,
qui permettra des recombinaisons mitotiques seulement dans l’œil. On a le gène gal4 qui va pouvoir
être transcrit grâce aux recombinaisons mitotiques, qui vont supprimer les terminateurs de
transcription. Gal4 pourra induire la transcription du promoteur UAS, ce qui permettra la
transcription de LacZ et donc de repérer l’emplacement des clones cellulaires concernée par la
recombinaison mitotique, en ajoutant du Xgal.
On observe les larves issues de ces croisements. On va révélée la présence de recombinaisons
mitotiques en révélant la présence de βgalactosidase, en « colorant » au Xgal. Pour ce faire, on suit
un protocole particulier, permettant cette révélation.
On constate une coloration au niveau des disques imaginaux des yeux. Seulement les yeux sont
colorés : on a orienté les recombinaisons dans l’œil grâce au promoteur eyeless : FLP est activée, la
recombinaison entre les deux FRT a lieu, ce qui permet la transcription de Gal4. Gal4 va induire la
transcription de LacZ.
Remarque : on utilise un balanceur pour inhiber les recombinaisons méiotiques. Ici, cette
caractéristique n’est pas utile, mais la souche utilisée la possède.
Deuxième croisement : 5618 x 2296
Souche 5618 : Chromosome X : w, P (ey-FLP)
Chromosome 2 : P(FRT en 80B)
Souche 2296 : Chromosome X : w
Chromosome 2 : P(white) 70C (= mini white w+), P{FRT}80B / Tm6 (Balanceur)
Mâle 5618 (w, ey-FLP / Y ; FRT80 / FRT80) x Femelle 2296 (w / w ; w+, FRT80 / Tm6)
[œil blanc] [œil rouge]
F1 : Mâles : (w / Y ; FRT80 / TM) et (w / Y ; FRT80 / FRT80, w+)
[œil blanc] [œil rouge]
Femelle : (w / eyFLP ; FRT80 / TM) et (w / w, eyFLT ; w+, FRT80 / FRT80)
[œil blanc] [œil rouge]*

FRT w+ Après la réplication, voici le génotype de la
cellule de l’œil. Chaque chromosome s’est
Chr 2 répliqué, on a alors 2 chromatides
FRT appareillées avec w+ et 2 autres sans w+.
Chr 2 La cellules exprime la flippase.
Pendant la mitose, les centromères se retrouvent sur la plaque équatoriale et chaque chromatides
ira dans l’une ou l’autre des cellules. On aura donc formation de cellules filles hétérozygotes comme
la cellule mère.
Dans le cas de CO mitotique, on va avoir un échange au niveau des séquences FRT, entre les
chromatides sœurs.
FRT w+
FRT w+
Lors de l’anaphase, on aura alors 1 chance sur 2 d’avoir formation de 2 cellules filles différentes et
homozygotes : une sera w+ et l’autre ne portera pas l’allèle w+. On a alors, dans le cas de CO
mitotiques, formation d’une cellule rouge (qui ne redonnera que des rouges par la suite) et d’une
cellule blanche (qui ne donnera que des blanches par la suite) après la mitose. La séparation des
chromatides à l’anaphase peut redonner des hétérozygotes, qui auront alors le phénotype rouge (dû
à w+). Statistiquement, on doit trouver ¾ de cellules rouges et ¼ de cellules blanches.
Refaire schéma pour ca
Observation des mouches : Quand on observe les yeux des drosophiles femelles, on constate alors
que l’œil est principalement rouge, mais que certaines zones sont blanches. On confirme plus ou
moins l’hypothèse, car la majorité de l’œil est rouge et une petite partie est blanche. Cependant il
semble y avoir plus de facettes rouges que prévu. On peut penser qu’il n’y pas eu recombinaison
mitotique dans toute les cellules, les cellules sont donc restées rouges, ce qui expliquerait le nombre
plus important que prévu de facettes rouges.
Croisement 3 : 5621 x 1988
On veut ici contre-sélectionner les clones rouges issus de la recombinaison mitotique. On associe à
l’allèle w+, un allèle létal à l’état homozygote. Lors d’un CO mitotique, on aura alors formation
d’homozygote sans w+ et d’homozygote w+/w+. w+ étant associé de très près au gène létal, il n’y
aura pas de clone rouge visible, les cellules mourant. Le gène létal est le gène rps.

Les seuls qui nous intéressent sont marqués d’un point rouge. Il présente le promoteur eyeless qui
permet l’expression dans les yeux, le gène white à l’état homozygote qui va donc s’exprimer, frt80 à
l’état homozygote qui permet la recombinaison par la flippase. Il contient aussi le gène rps, associé à
w+ (miniwhite). Les clones cellulaires issus de la recombinaison mitotique ayant l’allèle rps
homozygote et donc de phénotype [rouge] (car homozygote W) moment. On ne les observera donc
pas, au profit des clones mitotiques [blancs].
F1